WO2019230860A1 - トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法 - Google Patents

トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下しているトリコデルマ属糸状菌の変異株および当該変異株を用いてタンパク質を高生産する方法である。

Description

トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法
　本発明は、タンパク質製造能が向上したトリコデルマ属糸状菌の変異株および当該変異株を用いたタンパク質の製造方法に関する。
　トリコデルマ属糸状菌は、高いタンパク質製造能を有していることが知られており、これまで同糸状菌を用いたタンパク質の製造の検討が行われてきた。トリコデルマ属糸状菌は、セルロース、ラクトース、セロビオースなどを誘導剤として、タンパク質の中でも特に糖化酵素に分類されるセルラーゼを製造する。
　セルラーゼ製造量のさらなる向上、特に糖化酵素の中でも占める割合の低いβ－グルコシダーゼ製造量を強化するため、遺伝子の改変による検討が行われている。その中で、セルラーゼ製造を制御する因子の過剰発現や欠損が行われている。
　非特許文献１では、トリコデルマ属糸状菌のセルラーゼの製造を制御する因子の中でも、セルラーゼの製造を抑制する転写因子であるＣｒｅ１の機能を低下させることにより高いセルラーゼ製造能を有するトリコデルマ属糸状菌の変異株が取得されている。
　一方で、遺伝子の改変は、セルラーゼの生産量を低下させることも知られており、非特許文献２にはトリコデルマ・リーセイの糖トランスポーターを欠損させた場合、ラクトースやセルロースを誘導剤として使用した際のセルラーゼの生産量が低下することが記載されている。
Ｊｕｌｉａｎｏ　Ｐ，Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｈｙｐｅｒ－ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　ｍｕｔａｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　Ｊａｐａｎ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,　Ｖｏｌｕｍｅ ７７，　２０１３，　Ｉｓｓｕｅ　３，　Ｐ５３４－５４３ Ｐｏｒｃｉｕｎｃｕｌａ　Ｊｄｅ，　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｊｏｒ　Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　Ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｌａｃｔｏｓｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＰＣ－３－７．　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　７７，　１０１４－１０２２　（２０１３）．
　上記のとおり、トリコデルマ属糸状菌のタンパク質製造を制御する転写因子が解明されているが、これは、制御機構の一部にすぎないと考える。そこで本発明では、トリコデルマ属糸状菌のタンパク質製造を制御する新規機構を探索し、タンパク質製造能が強化されたトリコデルマ属糸状菌の変異株の取得および当該トリコデルマ属糸状菌の変異株を用いたタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、遺伝子の改変によりタンパク質の生産量を増やすことが可能な遺伝子を特定できれば、トリコデルマ属糸状菌のタンパク質の製造量をさらに向上させることができると考え、鋭意検討した結果、遺伝子の改変により配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下させたトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養することにより、タンパク質製造性やβ－グルコシダーゼ製造性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（６）で構成される。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下している、トリコデルマ属糸状菌の変異株。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともＮ末端側から４１３番目以降のアミノ酸残基が欠損している請求項１に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株。
（３）（１）または（２）に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（４）（１）または（２）に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
（５）（１）または（２）に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を、ラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導剤を含む培地で培養する工程を含む、（４）に記載のセルラーゼの製造方法。
（６）セルロース含有バイオマスから糖を製造する方法であって、以下の工程：
　工程ａ：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下しているトリコデルマ・リーセイの変異株を培養し、セルラーゼを製造する工程
　工程ｂ：工程ａで得られたセルラーゼを用いて、前記バイオマスを糖化する工程
を含む、糖の製造方法。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ属糸状菌の変異株は、当該ポリペプチドの機能が低下していないトリコデルマ属糸状菌と比較してタンパク質の製造能が向上する。さらに製造されるタンパク質が特にセルラーゼの場合には、セルラーゼの各種比活性も向上するという予想外の効果も得られる。
　本発明は、もともとタンパク質の製造能に優れる微生物であるトリコデルマ属糸状菌の親株に変異を導入することによって、さらにタンパク質製造能を高めることを特徴としている。従って、本発明で用いるトリコデルマ属糸状菌の親株は野生株には制限されず、タンパク質製造能が高まるように改良されたトリコデルマ属糸状菌の変異株も親株として好ましく用いることができ、例えば、トリコデルマ属糸状菌の変異株には、変異剤や紫外線照射などで変異処理を施し、タンパク質の製造性が向上した変異株を上記親株として利用することができる。上記親株として用いる変異株の具体例は、トリコデルマ・リーセイの先祖にあたるトリコデルマ・パラリーセイ（ＡＴＣＣ　ＭＹＡ－４７７７）、トリコデルマ・リーセイに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ－８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１－３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８，　８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１－４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ－３－７株、ＲｕｔＣ－３０株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ属糸状菌が有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎでは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４４４１９）としても登録されている。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から２６番目～４９９番目のアミノ酸残基はＳｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインを有すると開示されている。この記載により配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも菌体の内側と外側の間における糖の輸送に関与していると推定される。本発明において、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下しているとは、ＥＧＲ４４４１９をコードする遺伝子に変異を持つことをいう。
　本発明において、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能の低下は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列が変異して、当該ポリペプチオドの機能が低下したり、機能が欠失したりする状態を表す。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列以外の塩基配列が変異して、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下または発現の消失が引き起こされる場合も、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能の低下に含まれる。塩基配列の変異は、塩基の置換、欠失、挿入、重複等によって起こる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下させる方法としては、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの全欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの一部欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの立体構造の変化、または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全欠損させるような変異を導入する方法が挙げられる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下または発現の消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させることができる。
　Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの欠損とは、そのドメインが全てなくなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には配列番号２で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＳｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
　本発明において、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメイン内に位置するアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下する具体例としては、配列番号１で表される塩基配列において、１４１５番目に１１塩基が挿入するフレームシフト変異が挙げられる。当該変異により、配列番号２で表されるアミノ酸配列の４１９番目で翻訳は終了し、それによりＳｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインを構成するアミノ酸配列が短くなり、本来の機能が低下すると推測される。
　Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの全欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの一部欠損、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全欠損は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによるフレームシフトやストップコドン変異により行われる。
　また、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下または発現の消失は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異により行われる。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当し、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写に関与するプロモーターとターミネーターを含む塩基配列の具体例としては、配列番号７で表される塩基配列が挙げられる。
　上記の遺伝子の変異導入は、当業者にとって公知の変異剤または紫外線照射などによる変異処理、選択マーカーを用いた相同組換えなどの遺伝子組換え、あるいはトランスポゾンによる変異など、既存の遺伝子変異方法を用いることができる。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下していないトリコデルマ属糸状菌と比較してタンパク質の製造能が向上する。本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養すると、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下していないトリコデルマ属糸状菌の培養液と比較して、タンパク濃度が増加する。また、タンパク質が酵素の場合には、酵素の比活性が増加する。ここで、タンパク質濃度の増加率や酵素の比活性の増加率は、増加していれば特に限定はされないが、２０％以上であることが好ましい。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能低下以外にも、タンパク質製造量が向上する遺伝子変異を有していてもよい。具体的には、配列番号８で表されるポリペプチドの機能が低下する遺伝子変異が挙げられる。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎでは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ５０６５４として登録されている。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から９５番目～２７７番目のアミノ酸残基は「Ｍｉｄｄｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　４Ｇドメイン」（以降ＭＩＦ４Ｇドメインと記載する。）、Ｎ末端側から３８０番目～４８５番目のアミノ酸残基はＭＡ－３ドメインを有すると開示されている。ＭＩＦ４ＧおよびＭＡ－３の両ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する機能を有することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，１２２６５－１２２７２（２００５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，１４７－１５６（２００７））。これらの記載により配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくともＤＮＡおよび／またはＲＮＡに結合する機能を有すると推定される。
　配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号９で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ５０６５４の機能が低下する遺伝子変異とは、ＥＧＲ５０６５４が有するＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ－３ドメインの全欠損、ＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ－３ドメインの一部欠損、ＭＩＦ４ＧドメインとＭＡ－３ドメインとの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させることができる。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号９で表される塩基配列において、１０３９番目から１０４４番目のいずれかの塩基が欠失する変異が挙げられる。
　また、本発明は前記配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含むタンパク質の製造方法に関する。
　本発明で製造するタンパク質は特に制限はないが、菌体外に分泌されるタンパク質を効率的に製造することができ、中でも好ましくは酵素であり、より好ましくはセルラーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ等の糖化酵素であり、とくに好ましくはセルラーゼである。
　本発明で製造されるセルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ　３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．３７）などが挙げられる。前述の通り、本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株のタンパク質製造能の向上を確認するためのセルラーゼの比活性の向上の確認は、これらの加水分解酵素の比活性のいずれかが向上していることにより確認する。本発明で製造されるセルラーゼではこれらの酵素のうち、特にβ－グルコシダーゼ活性が向上する。
　β－グルコシダーゼ比活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させる。次に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとし、これをタンパク質の量で割ることで、比活性を算出する。
　β－キシロシダーゼ比活性は以下の方法で測定する。まず、１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させる。次に、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。
　セロビオハイドロラーゼ比活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で６０分間反応させる。次にその後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に、１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとし、これをタンパク質の量で割ることで、比活性を算出する。
　培養工程の培地組成は、トリコデルマ・リーセイがタンパク質を製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、トリコデルマ属細菌の周知の培地組成を採用することができる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを用いることができる。また、培地には、タンパク質を製造させるための誘導物質を添加してもよい。
　本発明によりセルラーゼを製造する場合には、培地にラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導剤を含む培地で培養することができる。また、セルロースやキシランは、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導物質として添加してもよい。セルロールやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類されるが、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としては、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが好ましく用いられる。
　また、セルロースやキシランを含むバイオマスは、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロールやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。
　なお、非特許文献２では、トリコデルマ・リーセイの糖トランスポーターを欠損させた変異株を培養する際に、ラクトースを誘導剤として使用すると、セルラーゼの生産量が低下すると記載されているが、本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異株は、ラクトースを誘導剤として培養した場合、タンパク質の生産量が向上し、セルラーゼの各種比活性も向上する。
　本発明のトリコデルマ属糸状菌の変異体の培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ・リーセイは、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１～２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３～１．５ｖｖｍがより好ましく０．５～１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５～３５℃程度が好ましく、２５～３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０～７．０が好ましく、ｐＨ４．０～６．０がより好ましい。培養時間は、タンパク質が生産される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで行う。通常、２４～２４０時間程度であり、３６～１９２時間がより好ましい。
　トリコデルマ属糸状菌の変異体を培養した培養液に含まれるタンパク質を回収する方法は特に限定されないが、トリコデルマ属糸状菌の菌体を培養液から除去し、タンパク質を回収することができる。菌体の除去方法としては、遠心分離法、膜分離法、フィルタープレス法などが例として挙げられる。
　また、トリコデルマ属糸状菌の変異体を培養した培養液から菌体を除去せずに、タンパク質の溶解液として利用する場合には、培養液中でトリコデルマ属糸状菌の菌体が生育できないように処理することが好ましい。菌体が生育できないように処理する方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。
　タンパク質が酵素の場合には、上記のように菌体を除去又は生育していないように処理した培養液を、そのまま酵素液として利用することができる。
　本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下しているトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養して得られたセルラーゼは、当該ポリペプチドの機能が低下していないトリコデルマ属糸状菌を培養して得られるセルラーゼと比べて、セルラーゼの各種比活性が高く、特にβ－グルコシダーゼの比活性が高いため、効率的にセルロース含有バイオマスを分解して、グルコース濃度の高い糖化液を得ることができ、より多くの糖を得ることができる。なお、セルロース含有バイオマスを糖化し、糖を製造する方法は特に限定されない。糖化反応はバッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
　糖化反応の条件は、特に限定されないが、糖化反応の温度は、２５～６０℃の範囲であることが好ましく、特に３０～５５℃の範囲であることがより好ましい。糖化反応の時間は、２時間～２００時間の範囲であることが好ましい。糖化反応のｐＨは、ｐＨ３．０～７．０の範囲が好ましく、ｐＨ４．０～６．０の範囲であることがさらに好ましい。トリコデルマ属由来セルラーゼの場合、その反応最適ｐＨは５．０である。さらに、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。
　また、セルロース含有バイオマスの糖化で得られた糖化液から、使用した酵素組成物を分離して回収することができる。酵素組成物を分離回収する方法は、特に限定されないが、糖化液を限外濾過膜などでろ過し、非透過側に回収することができる。必要に応じてろ過の前工程として、糖化液から固形分を取り除いておいてもよい。回収したセルラーゼは、再び糖化反応に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
　＜参考例１＞タンパク質濃度測定方法
　タンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した糸状菌の培養液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてＢＳＡを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
　＜参考例２＞セルラーゼの比活性の測定方法
　（β－グルコシダーゼ比活性測定方法）
　１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させた。その後２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義し、これをタンパク質の量で割ることで比活性を算出した。
　（β－キシロシダーゼ比活性測定方法）
　１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義し、これをタンパク質の量で割ることで比活性を算出した。
　（セロビオハイドロラーゼ比活性測定方法）
　１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で６０分間反応させた。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義し、これをタンパク質の量で割ることで比活性を算出した。
　＜参考例３＞セルロース含有バイオマスの糖化試験
　糖化対象のバイオマスとしては、木材原料粉末セルロースＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）Ｂ８００（レッテンマイヤー社製）または平均粒径１００μｍに粉末化したバガスを使用した。酵素液としては、トリコデルマ・リーセイまたはトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液を１ｍＬ採取して遠心分離し、菌体を除去した上清を回収し、さらに０．２２μｍのフィルターでろ過したろ液を用いた。なお、木材原料粉末セルロースＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）　Ｂ８００（レッテンマイヤー社製）は、以降Ａｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００と記載する場合がある。
　（糖化反応）
　糖化反応は以下のようにして行った。２ｍＬチューブの中にＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）Ｂ８００もしくは平均粒径１００μｍに粉末化したバガスと、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）を終濃度０．１Ｍになるように添加し、固形分濃度が反応開始時にＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標)Ｂ８００を用いた際には８重量％、バガスを用いた際には１０重量％となるように純水を加えた。さらに、酵素液を添加し、ヒートブロックローテーターを用いて、５０℃の反応条件で反応を開始した。２４時間糖化反応後のサンプルを１０，０００×ｇの条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を分取し、上清のボリュームの１０分の１量の１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を添加し、糖化反応を停止させた。反応停止後の糖化液中の糖濃度を下記に示すＵＰＬＣによる糖分析に供した。糖化反応に用いる酵素液は、培養液のタンパク質濃度と、比活性から各実施例または比較例の条件に合うように添加量を算出して用いた。
　（糖濃度の測定）
　グルコース、キシロース、セロビオースは、ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ　システム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、以下の条件で定量分析した。
グルコース、キシロース、セロビオースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。セロビオースが１ｇ／Ｌより低い値の場合は、検出限界以下とした。
カラム：ＡＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７μｍ２．１×１００ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ
分離法：ＨＩＬＩＣ
移動相：移動相Ａ：８０％アセトニトリル、０．２％ＴＥＡ水溶液、移動相Ｂ：３０％アセトニトリル、０．２％ＴＥＡ水溶液とし、下記グラジエントに従った。グラジエントは下記の時間に対応する混合比に到達する直線的なグラジエントとした。
開始条件：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）、開始２分後：（Ａ９６．７０％、Ｂ３．３０％）、開始３．５分後：（Ａ９５．００％、Ｂ５．００％）、開始３．５５分後：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）、開始６分後：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）。
検出方法：ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）
流速：０．３ｍＬ/ｍｉｎ
温度：５５℃。
　＜実施例１＞配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４変異株Ｉの作製
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイの変異株は以下のとおり作製した。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下した配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片として、配列番号３で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株に形質転換することで作製した。この方法により、配列番号１において、１４１５番目に１１塩基が挿入し、配列番号２において、４１９番目で翻訳が終了するポリペプチドを有するトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ＤＮＡ断片導入のための選択マーカーとしてアセトアミドおよびアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ（ＡｍｄＳ）遺伝子（ａｍｄＳ）を使用した。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製した。
　具体的には、配列番号４で示す合成したＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とした。また、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号５および６で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｗａＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とし、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｗａＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築した。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＰａｃＩとＡｓｃＩで処理し、配列番号３で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ＃３１３２９）を形質転換した。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行った。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）の記載通りに行った。得られたトリコデルマ・リーセイ変異株をＱＭ９４１４変異株Ｉとして以下の実験に用いた。
　＜実施例２＞ＱＭ９４１４変異株Ｉを用いたタンパク質の製造試験
　（フラスコ培養）
　実施例１で作製したＱＭ９４１４変異株Ｉの胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液０．１ｍＬを表１または表２に示した５０ｍＬバッフル付フラスコへ入れた１０ｍＬのフラスコ培地へ接種させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて１２０時間培養を行った。培養液中に含まれるタンパク質濃度を参考例１に記載の方法で、セルラーゼの各種比活性を参考例２に記載の方法で測定した。表１の培地で培養した際の結果を表３に、表２の培地で培養した際の結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（培養液の採取）
　培養開始１２０時間後に１ｍＬ培養液を採取した。培養液を１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いた。
　（タンパク質濃度とセルラーゼの各種比活性の測定）
　参考例１で記載した手法を用い、培養開始１２０時間目の培養液におけるタンパク質濃度を測定し、続いて参考例２に記載の方法でセルラーゼの比活性を測定した。結果を表３と表４に示す。
　＜実施例３＞配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４変異株ＩＩの作製
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号１０で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株に形質転換することで作製した。この方法により、配列番号１において、４３５番目と４３６番目の間にａｍｄＳが挿入され、配列番号２の機能が低下したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製した。
　具体的には、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号１１および１２で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流断片とした。また、ゲノムＤＮＡと配列番号１３および１４で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｈＩで処理したＤＮＡ断片を下流断片とし、上流および下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｈＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築した。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｈＩで処理し、配列番号１０で示す得られたＤＮＡでトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を実施例１の記載通りに形質転換を行った。得られたトリコデルマ・リーセイ変異株をＱＭ９４１４変異株ＩＩとして以下の実験に用いた。
　＜実施例４＞ＱＭ９４１４変異株ＩＩを用いたタンパク質の製造試験
　実施例１で作製したＱＭ９４１４変異株Ｉの代わりにＱＭ９４１４変異株ＩＩを用いた以外は、実施例２と同様の操作・条件で培養を行い、培養液中に含まれるタンパク質濃度と、セルラーゼの各種比活性を測定した。結果を表３と表４に示す。
　＜比較例１＞トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を用いたタンパク質の製造試験
　実施例１で作製したＱＭ９４１４変異株Ｉの代わりにトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を用いた以外は、実施例２と同様の操作・条件で培養を行い、実施例２と同様の方法で培養液中に含まれるタンパク質濃度とセルラーゼの各種比活性を測定した。表１の培地で培養した際の結果を表３に、表２の培地で培養した際の結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例２、実施例４および比較例１の結果から、表１に示す培地を用いた培養では、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を培養した培養液に含まれるタンパク質濃度を１とした場合、ＱＭ９４１４変異株Ｉの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は１．５、ＱＭ９４１４変異株ＩＩの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は１．３であった。これらの結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下させたトリコデルマ・リーセイを培養することによって、当該ポリペプチドの機能を低下させない場合と比べてタンパク質の製造量を向上できることがわかった。
　さらに、実施例２、実施例４および比較例１で得られた培養液について、参考例２に記載の方法でセルラーゼの比活性を測定した。その結果、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を培養した培養液の各種比活性を１とした場合、β－グルコシダーゼ比活性は、ＱＭ９４１４変異株Ｉ：１．９、ＱＭ９４１４変異株ＩＩ：１．７であり、β－キシロシダーゼ比活性は、ＱＭ９４１４変異株Ｉ：１．３、ＱＭ９４１４変異株ＩＩ：１．９、セロビオハイドロラーゼ比活性は、ＱＭ９４１４変異株Ｉ：１．３、ＱＭ９４１４変異株ＩＩ：１．１であった。これらの結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイ変異株を培養して得られたセルラーゼは、当該ポリペプチドの機能を低下させない場合と比べて、生産されるタンパク質の量が向上するだけでなく、セルラーゼの各種比活性も向上するという予想外の効果が得られることがわかった。
　また、表２に示すラクトースを用いた培地による培養では、ＱＭ９４１４株を培養した培養液に含まれるタンパク質濃度を１とした場合、ＱＭ９４１４変異株Ｉの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は１．７、ＱＭ９４１４変異株ＩＩの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は１．４であった。これらの結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下させたトリコデルマ・リーセイを培養することによって、当該ポリペプチドの機能を低下させない場合と比べてタンパク質の製造量を向上できることがわかった。
　さらに、それぞれ得られた培養液について、参考例２に記載の方法でセルラーゼの比活性を測定した。その結果、ＱＭ９４１４株を培養した培養液の各種比活性を１とした場合、β－グルコシダーゼ比活性は、ＱＭ９４１４変異株Ｉ：４．３、ＱＭ９４１４変異株ＩＩ：１．６であり、β－キシロシダーゼ比活性は、ＱＭ９４１４変異株Ｉ：２．５、ＱＭ９４１４変異株ＩＩ：１．２、セロビオハイドロラーゼ比活性は、ＱＭ９４１４変異株Ｉ：３．５、ＱＭ９４１４変異株ＩＩ：１．１であった。これらの結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ・リーセイ変異株を培養して得られたセルラーゼは、当該ポリペプチドの機能を低下させない場合と比べて、生産されるタンパク質の量が向上するだけでなく、セルラーゼの各種比活性も向上するという予想外の効果が得られることがわかった。また、これらの結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したＱＭ９４１４変異株Ｉを、ラクトースを添加した培地で培養を行うと、セルロースを添加した培地で培養を行う場合と比べて、セルラーゼの各種比活性がさらに向上することがわかった。
　＜実施例５＞ＱＭ９４１４変異株Ｉのセルラーゼを用いた糖化反応試験
　実施例２で得られたＱＭ９４１４変異株Ｉの表１に示す培地を用いた培養開始から１２０時間目の培養液を用いて、表５および参考例３に記載の操作・条件に従って、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。セルロース含有バイオマスとして、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）Ｂ８００または粉末バガスを用いた。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　＜実施例６＞ＱＭ９４１４変異株ＩＩのセルラーゼを用いた糖化反応試験１
　実施例４で得られたＱＭ９４１４変異株ＩＩの培養液のうち、表１に記載の培地で培養した際の培養開始から１２０時間目の培養液を用いて、参考例３に記載の操作・条件に従って、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）Ｂ８００の糖化反応は、表７に、粉末バガスの糖化反応は表８にそれぞれ反応条件を示す。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　＜比較例２＞トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株のセルラーゼを用いた糖化反応試験１
　比較例１で得られたトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の培養液のうち、表１に記載の培地で培養した際の培養開始から１２０時間目の培養液を用いた以外は、実施例５または６と同様の操作・条件でセルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。結果を表６と９に示す。
　＜実施例７＞ＱＭ９４１４変異株ＩＩのセルラーゼを用いた糖化反応試験２
　実施例４で得られたＱＭ９４１４変異株ＩＩの培養液のうち、表２に記載の培地で培養した際の培養開始から１２０時間目の培養液を用いて、表６および参考例３に記載の操作・条件に従って、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）Ｂ８００の糖化反応は、表１０に、粉末バガスの糖化反応は表１１にそれぞれ反応条件を示す。結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　＜比較例３＞トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株のセルラーゼを用いた糖化反応試験２
　比較例１で得られたトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の培養液のうち、表２に記載の培地で培養した際の培養開始から１２０時間目の培養液を用いた以外は、実施例７と同様の操作・条件でセルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。結果を表１２に示す。
　＜まとめ＞
　実施例５と比較例２の結果から、表１に記載の培地の培養にて得られた培養液を用いたＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）　Ｂ８００の糖化反応において、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株のセルラーゼを用いた場合の糖化液に含まれるグルコース濃度は３．３ｇ／Ｌであるのに対し、ＱＭ９４１４変異株Ｉを用いた場合では４．８ｇ／Ｌであった。また、糖化液に含まれるキシロース濃度は、ＱＭ９４１４株を用いた場合では３．９ｇ／Ｌであるのに対し、ＱＭ９４１４変異株Ｉを用いた場合では４．９ｇ／Ｌであった。
　また、粉末バガスの糖化反応においては、ＱＭ９４１４株ではグルコース遊離量は１．４ｇ／Ｌであるのに対し、変異株Ｉでは１．７ｇ／Ｌ、キシロース遊離量は、ＱＭ９４１４株で２．３ｇ／Ｌ、変異株Ｉでは２．５ｇ／Ｌであった。
　実施例６と比較例２の結果から、表１に記載の培地の培養にて得られた培養液を用いたＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）　Ｂ８００の糖化反応において、ＱＭ９４１４株ではグルコース遊離量は１３ｇ／Ｌであるのに対し、ＱＭ９４１４変異株ＩＩは１４．３ｇ／Ｌであった。キシロース遊離量は、ＱＭ９４１４株では８．５ｇ／Ｌであるのに対し、変異株ＩＩでは９．１ｇ／Ｌであった。また、粉末バガスの糖化反応においては、ＱＭ９４１４株ではグルコース遊離量は６．１ｇ／Ｌであるのに対し、変異株ＩＩでは６．５ｇ／Ｌであった。キシロース遊離量は、ＱＭ９４１４株と変異株ＩＩの両者共に４．１ｇ／Ｌであった。
　実施例７と比較例３の結果から、表２に記載の培地の培養にて得られた培養液を用いたＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）　Ｂ８００の糖化反応において、ＱＭ９４１４株ではグルコース濃度は５．９ｇ／Ｌであるのに対し、変異株ＩＩは７．２ｇ／Ｌであった。キシロース濃度は、ＱＭ９４１４株では３．４ｇ／Ｌであるのに対し、変異株ＩＩでは４．５ｇ／Ｌであった。また、粉末バガスの糖化反応においては、ＱＭ９４１４株ではグルコース濃度は２．９ｇ／Ｌであるのに対し、変異株ＩＩでは３．９ｇ／Ｌであった。キシロース濃度は、ＱＭ９４１４株では２．５ｇ／Ｌであるのに対し、変異株ＩＩでは３．０ｇ／Ｌであった。これらの結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下したトリコデルマ属糸状菌の変異体が生産するセルラーゼは、ＱＭ９４１４株が生産するセルラーゼよりも多くの糖を製造出来ることがわかった。

Claims (6)

  1. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下している、トリコデルマ属糸状菌の変異株。
  2. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列において、少なくともN末端側から４１３番目以降のアミノ酸残基が欠損している、請求項１に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株。
  3. 　請求項１または２に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
  4. 　請求項１または２に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
  5. 　請求項１または２に記載のトリコデルマ属糸状菌の変異株を、ラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導剤を含む培地で培養する工程を含む、請求項４に記載のセルラーゼの製造方法。
  6. 　セルロース含有バイオマスから糖を製造する方法であって、以下の工程：
    　工程ａ：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下しているトリコデルマ・リーセイの変異株を培養し、セルラーゼを製造する工程
    　工程ｂ：工程ａで得られたセルラーゼを用いて、前記バイオマスを糖化する工程
    を含む、糖の製造方法。
    　
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011075677A2 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Novozymes, Inc. Methods for producing polypeptides in protease-deficient mutants of trichoderma
CN102311951B (zh) * 2011-07-13 2013-03-20 深圳大学 里氏木霉组成型表达盒、表达载体、重组菌株及其应用
JP2013220069A (ja) * 2012-04-17 2013-10-28 Nagaoka Univ Of Technology 植物性多糖の分解活性が増強された糸状菌及び該糸状菌の使用
JP2014150745A (ja) * 2013-02-06 2014-08-25 Nagaoka Univ Of Technology トリコデルマ属に属する微生物の変異株および該変異株の使用
WO2014202616A2 (en) * 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
JP2016106538A (ja) * 2014-12-03 2016-06-20 東レ株式会社 トリコデルマ・リーセイ変異株およびそれを用いたセロビオハイドラーゼの製造方法
EP3438263A4 (en) 2016-03-31 2019-09-11 Toray Industries, Inc. TRICKODERMAPILT WITH MUTANT BXL1 GENE AND PROCESS FOR PREPARING XYLOOLIGOSACCHARIDE AND GLUCOSE THEREWITH

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM., vol. 44, 2005, pages 12265 - 12272
BIOTECHNOL. BIOENG. SYMP., vol. 8, 1978, pages 89
BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 12, 1982, pages 451 - 459
DATABASE Protein [online] 25 July 2016 (2016-07-25), XP055662386, retrieved from NCBI Database accession no. EGR44419 *
ENZYME, MICROBIOL. TECHNOL., vol. 10, 1988, pages 341 - 346
GENE, vol. 61, 1987, pages 165 - 176
JULIANO P: "Single nucleotide polymorphism analysis of a Trichoderma reesei hyper-cellulolytic mutant developed in Japan, Bioscience", BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 77, 2013, pages 534 - 543
MARTINEZ, DIEGO ET AL.: "Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecornia", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 26, no. 5, 2008, pages 553 - 560,1193, XP055543911 *
MOL. CELL. BIOL., vol. 1, 2007, pages 147 - 156
PORCIUNCULA JDE: "Identification of Major Facilitator Transporters Involved in Cellulase Production during Lactose Culture of Trichoderma reesei PC-3-7", BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM., vol. 77, 2013, pages 1014 - 1022
See also references of EP3805365A4
ZHANG, WEIXIN ET AL.: "Two Major Facilitator Superfamily Sugar Transporters from Trichoderma reesei and Their Roles in Induction of Cellulase Biosynthesis", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 288, no. 46, 2013, pages 32861 - 32872, XP055662384 *

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