BR112020024153A2 - Cepa mutante e métodos de produção de proteína, celulase e açúcar - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma cepa mutante do fungo filamentoso trichoderma que possui funcionalidade reduzida de um polipeptídeo formado por uma sequência de aminoácidos de seq id no: 2; e um método de alta produção de proteína usando a referida cepa mutante.

Description

“CEPA MUTANTE E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA, CELULASE E AÇÚCAR” CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção refere-se a uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, a cepa mutante possui uma capacidade aumentada de produção de proteína e um método de produção de proteína usando a referida cepa mutante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[02] Os fungos filamentosos do gênero Trichoderma são conhecidos por terem uma alta capacidade de produção de proteínas, e até o momento foram feitos diversos estudos sobre a produção de proteínas usando estes fungos filamentosos. Os fungos filamentosos do gênero Trichoderma são especialmente utilizados para a produção de uma celulase classificada como enzima de sacarificação entre proteínas que utilizam celulose, lactose, celobiose ou similares como indutor.

[03] Estão sendo investigadas modificações genéticas que visam aumentar a quantidade de produção de celulase, particularmente, aumentar a quantidade de produção de β-glucosidase, que é responsável por uma pequena proporção das enzimas de sacarificação. Essas investigações incluem a superexpressão ou deleção de um fator que controla a produção de celulase.

[04] A literatura não patentária 1 descreve que um fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi modificado pela redução da função de Cre1, que é um fator de transcrição que reprime a produção de celulase entre os fatores que controlam a produção de celulase, adquirindo assim uma cepa mutante do fungo filamentoso do gênero Trichoderma que possui uma alta capacidade de produção de celulase.

[05] Entretanto, sabe-se que modificações genéticas resultam em uma diminuição na quantidade de produção de celulase. A literatura não patentária 2 descreve que nos casos em que um transportador de açúcar foi deletado de fungos Trichoderma reesei juntamente com o uso de lactose ou celulose como um indutor, a quantidade de produção de celulase diminuiu.

LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA NÃO PATENTÁRIA

[06] Literatura Não Patentária 1: Juliano P, Single nucleotide polymorphism analysis of a Trichoderma reesei hyper-cellulolytic mutant developed in Japan, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Volume 77, 2013, edição 3, P534-543.

[07] Literatura Não Patentária 2: Porciuncula Jde, Identification of Major Facilitator Transporters Involved in Cellulase Production during Lactose Culture of Trichoderma reesei PC-3-7, Biosci Biotechnol Biochem. 77, 1014-1022 (2013).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[08] Conforme descrito acima, foi identificado um fator de transcrição de controle da produção de proteína em um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, mas isso é considerado apenas uma parte do mecanismo de controle. Então, um objetivo da presente invenção é adquirir uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma que tem capacidade de produção de proteína aprimorada, fazendo uma busca por um novo mecanismo de controle da produção de proteínas do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, e fornecer um método de produção de proteína utilizando a cepa mutante do fungo filamentosos do gênero Trichoderma.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[09] Os presentes inventores consideraram que se um gene de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma que pode causar um aumento na produção de proteínas quando modificado pode ser especificado, então a quantidade de proteínas que podem ser produzidas pelo fungo filamentoso do gênero Trichoderma pode ser aumentada. Os inventores fizeram investigações diligentes e, como resultado, descobriram que melhorias na propriedade de produção de proteína e propriedade de produção de β-glucosidase podem ser alcançadas cultivando uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, cuja cepa mutante teve a função de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 reduzida por uma modificação genética. A presente invenção foi realizada com base nesta descoberta.

[10] Mais especificamente, a presente invenção consiste nos seguintes itens de (1) a (6): (1) Uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, possuindo função reduzida de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2; (2) A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, de acordo com a reivindicação 1, na qual pelo menos o 413º e resíduos de aminoácidos sucessivos do lado N-terminal na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 são deletados; (3) Um método de produção de uma proteína, cujo método inclui uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com (1) ou (2); (4) Um método de produção de uma celulase, cujo método inclui uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com (1) ou (2); (5) O método de produção de uma celulase de acordo com (4), cujo método inclui uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com (1) ou (2) em um meio de cultura que inclui um ou mais tipos de indutores selecionados a partir do grupo que consiste em lactose, celulose e xilano; (6) Um método de produção de um açúcar a partir de uma biomassa contendo celulose, cujo método inclui: - etapa a de produção de uma celulase pelo cultivo de uma cepa mutante de Trichoderma reesei possuindo função reduzida de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2; e - etapa b de sacarificação de biomassa usando a celulase obtida na etapa a.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[11] A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma que teve a função reduzida de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 exibiu melhor capacidade de produção de proteína em comparação com o fungo filamentoso do gênero Trichoderma no qual a função do polipeptídeo não foi reduzida. Além disso, especialmente no caso em que a proteína produzida é a celulase, também é obtido um efeito inesperado de que a celulase apresentou várias atividades específicas melhoradas.

DESCRIÇÃO DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

[12] A presente invenção caracteriza-se pelo fato de que é introduzida uma mutação em uma cepa parental de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, que é um micro-organismo que originalmente possui uma excelente capacidade de produção de proteínas, de modo a aumentar ainda mais a capacidade de produção de proteínas. Consequentemente, a cepa parental de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma a ser usado na presente invenção não está limitada as cepas selvagens, também podendo ser favoravelmente usada como cepa parental cepas mutantes de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma que já foram melhoradas de modo a ter uma capacidade de produção de proteína aumentada. Por exemplo, uma cepa mutante com uma propriedade de produção de proteína melhorada ao realizar um tratamento de mutação com um mutagênico, irradiação UV, etc. pode ser utilizada como a cepa parental de uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma. Exemplos específicos de cepas mutantes utilizáveis como cepa parental incluem: Trichoderma parareesei (ATCC MYA-4777), que é um ancestral da Trichoderma reesei; cepa QM6a (NBRC31326), cepa QM9123 (ATCC24449), cepa QM9414 (NBRC31329), cepa PC-3-7 (ATCC66589), cepa QM9123 (NBRC31327), cepa RutC-30 (ATCC56765), cepa CL-847 (Enzyme, Microbiol. Technol. 10, 341-346 (1988)), cepa MCG77 (Biotechnol. Bioeng.

Symp. 8, 89 (1978)), e cepa MCG80 (Biotechnol. Bioeng. 12, 451-459 (1982)), que são cepas mutantes conhecidas derivadas de Trichoderma reesei; e cepas derivadas das mesmas. A cepa QM6a, cepa QM9414, e cepa QM9123 estão disponíveis a partir NBRC (NITE Biological Resource Center), e a cepa PC-3-7 e cepa RUTC-30 estão disponíveis a partir da ATCC (American Type Culture Collection).

[13] O polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo possuído por fungos filamentosos do gênero Trichoderma, e no National Center for Biotechnology Information, este polipeptídeo é registrado também como uma proteína prevista (EGR44419) que a cepa de Trichoderma reesei QM6a possui.

O polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo cuja função não é conhecida, mas a ferramenta Censerved Domain Architecture Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information divulga que os resíduos de aminoácidos 26º ao 499º do lado N-terminal tem um domínio transportador de açúcar (e outro). Presume-se partir da divulgação que o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 participa pelo menos do transporte de açúcar entre o interior e o exterior dos corpos do fungo. Na presente invenção, o texto “reduzido na função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2” significa que um gene que codifica EGR44419 tem uma mutação.

[14] Na presente invenção, uma diminuição da função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 indica um estado no qual uma sequência de bases que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi submetida a um mutação, resultando em uma diminuição ou eliminação da função do polipeptídeo. Além disso, também se inclui na diminuição da função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 o caso em que uma sequência de bases diferente de uma sequência de base que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 tenha sofrido uma mutação que resultou em uma diminuição ou eliminação da expressão do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2. Uma mutação na sequência de bases é causada por substituição, deleção, inserção, duplicação de uma base, etc.

[15] Exemplos específicos do gene que codifica o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 incluem a sequência de base representada pela SEQ ID NO: 1.

[16] Os exemplos de métodos para reduzir a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 incluem um método de introdução de uma mutação que causa uma deleção total de um açúcar (e outros) do domínio do transportador, uma deleção parcial de um domínio transportador de açúcar (e outro), uma alteração na conformação de um domínio transportador de açúcar (e outro) ou uma deleção total do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.. É possível reduzir a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, também pela introdução de uma mutação que causa uma diminuição ou eliminação da expressão do polipeptídeo.

[17] A redação “deleção de um domínio transportador de açúcar (e outro)” significa uma perda total ou parcial do domínio, uma mudança de todo ou de parte do domínio em um aminoácido(s) diferente(s) ou uma combinação deles. Mais especificamente, significa que a identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do domínio do transportador de açúcar (e outro) torna-se 80% ou menos, de preferência 50% ou menos, mais preferencialmente 20% ou menos, mais preferencialmente 10% ou menos, mais preferencialmente 5% ou menos, mais preferencialmente 3% ou menos, mais preferencialmente 1% ou menos, e mais preferencialmente 0%.

[18] Na presente invenção, os exemplos específicos de cada caso em que a função de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é reduzida por uma mutação, tal como deleção, substituição ou adição, que tenha ocorrido na sequência de aminoácidos localizada em um domínio transportador de açúcar (e outro) inclui uma mutação por alteração da fase de leitura (frame shift mutation) de bases representada pela SEQ ID NO: 1 na qual 11 bases foram inseridas na posição

1.415º. Presume-se que a mutação faz com que a tradução termine na posição 419ª na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 e isso encurtou a sequência de aminoácidos que constitui o domínio transportador de açúcar (e outro), resultando em uma diminuição na função original.

[19] A deleção total de um domínio transportador de açúcar (e outro), a deleção parcial de um domínio transportador de açúcar (e outro) e a deleção total de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 são alcançadas fazendo com que uma sequência gênica que codifica o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 passe por uma mutação de deslocamento da fase de leitura ou códon de parada, devido à deleção, inserção, substituição de bases, etc.

[20] A diminuição ou eliminação da expressão de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é obtida causando uma mutação no promotor ou região terminadora do gene que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

Em geral, as regiões promotoras e terminadoras correspondem a uma região de centenas de bases de comprimento antes e depois do gene que participa da transcrição. Exemplos específicos da sequência de bases contendo um promotor e um terminador que participa na transcrição do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 incluem a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 7.

[21] Para a introdução de tais mutações genéticas, pode ser feito o uso de métodos de mutação genética existentes, como um tratamento de mutação com um mutagênico conhecido por um versado na técnica ou por irradiação UV, etc., recombinação de genes, como a recombinação homóloga usando um marcador de seleção, e uma mutação por um transposon.

[22] A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção tem uma capacidade de produção de proteína aumentada em comparação com o fungo filamentoso do gênero Trichoderma no qual a função do polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 não foi reduzida. No caso em que a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção é cultivada, uma concentração de proteína aumentada é obtida em comparação com uma solução de cultura de fungo filamentoso do gênero Trichoderma no qual a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 não foi reduzida. Além disso, no caso em que a proteína é uma enzima, a enzima tem atividade específica aumentada. Aqui, a taxa de aumento na concentração de proteína ou a taxa de aumento da atividade específica da enzima não é particularmente limitada, desde que a concentração ou a atividade específica tenha aumentado, mas a taxa de aumento é preferencialmente de 20% ou mais.

[23] Além de ter sido reduzida na função do polipeptídeo constituído pela sequência de aminoácidos representada pelo SEQ ID NO: 2, a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção pode ter uma mutação genética que traz melhoria na quantidade de produção de proteínas. Exemplos específicos das mesmas incluem uma mutação genética que reduz a função de um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 8. O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 é um polipeptídeo do Trichoderma reesei, e no National Center for Biotechnology Information, este polipeptídeo está registrado como uma proteína prevista EGR50654 cuja cepa QM6a de Trichoderma reesei possui. O polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 é um polipeptídeo cuja função não é conhecida, mas a Censerved Domain Architecture Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information divulga que do 95º ao 277º resíduo de aminoácidos da extremidade N-terminal tem o “Domínio médio do fator de iniciação eucariótico 4G” (doravante referido como “domínio MIF4G”) e que do 380º ao 485º resíduo de aminoácidos do lado N-terminal têm o domínio MA-3. Os dois domínios, MIF4G e MA-3, são conhecidos por terem a função de ligação aos DNAs ou RNAs (Biochem. 44, 12265-12272 (2005); Mol. Cell. Biol. 1, 147-156 (2007)). Presume-se a partir dessas divulgações que o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 tenha pelo menos a função de ligação a um DNA e/ou RNA.

[24] Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 incluem a sequência de base representada pela SEQ ID NO: 9.

Exemplos da mutação do gene que reduz a função de EGR50654 incluem uma deleção total do Domínio MIF4G e/ou domínio MA-3 possuído por EGR50654, uma deleção parcial do domínio MIF4G e/ou domínio MA-3 e uma mutação do gene que altera a relação de configuração entre o domínio MIF4G e o domínio MA-3. Além disso, a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 pode ser reduzida também pela introdução de uma mutação que diminui ou elimina a expressão do polipeptídeo.

Exemplos específicos da deleção da função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 incluem uma mutação na sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 9 que deleta qualquer uma das bases de 1.039ª a 1.044ª.

[25] A presente invenção refere-se ainda a um método de produção de proteína incluindo uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, sendo a cepa mutante reduzida em função de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

[26] A proteína a ser produzida na presente invenção não é particularmente limitada, mas as proteínas a serem secretadas pelo corpo do fungo podem ser produzidas de forma eficiente. As enzimas são preferidas entre estas. São mais preferidas as enzimas sacarificantes, como celulases, amilases, invertases, quitinases e pectinases. Ainda mais preferidas são as celulases.

[27] As celulases que podem ser produzidas na presente invenção incluem várias hidrolases, que incluem enzimas com atividade de decomposição contra xilano, celulose e hemicelulose. Exemplos específicos destas enzimas incluem celobiohidrolase (EC 3.2.1.91), que produz celobiose por hidrólise de cadeias de celulose, endoglucanase (EC 3.2.1.4), que hidrolisa cadeias de celulose de porções centrais das mesmas, β-glucosidase (EC

3.2.1.21), que hidrolisa celo-oligossacarídeo e celobiose, xilanase (EC 3.2.1.8), que se caracteriza por atuar na hemicelulose e, em particular, no xilano, e β-xilosidase (EC 3.2.1.37), que hidrolisa o xilo-oligossacarídeo. Como afirmado acima, se a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção tem uma atividade de produção de proteína aumentada, isso é determinado pela verificação de uma melhora na atividade específica da celulase, verificando se a atividade específica de qualquer uma dessas hidrolases melhorou. As celulases produzidas na presente invenção têm uma atividade melhorada, particularmente, de β-glucosidase entre essas enzimas.

[28] A atividade específica da β-glucosidase é determinada pelo seguinte método. Primeiro, 10 μL de uma diluição de enzima são adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-glucopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura é deixada reagir a 30ºC por 10 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M são adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm é medido. Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto é definida como 1 U de atividade, e a atividade específica é calculada dividindo-a pela quantidade de proteína.

[29] A atividade específica da β-xilosidase é determinada pelo seguinte método. Primeiro, 10 μL de uma diluição de enzima são adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura é deixada reagir a 30ºC por 30 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M são adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm é medido. Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto é definida como 1 U de atividade, e assim a atividade específica é calculada.

[30] A atividade específica da celobiohidrolase é determinada pelo seguinte método. Primeiro, 10 μL de uma diluição de enzima são adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-lactopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura é deixada reagir a 30ºC por 60 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M são adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm é medido. Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto é definida como 1 U de atividade, e a atividade específica é calculada dividindo-a pela quantidade de proteína.

[31] A composição do meio de cultura, na etapa de cultivo não é particularmente limitada, desde que seja uma composição de meio de cultura onde o fungo Trichoderma reesei possa produzir a proteína, e pode ser empregada uma composição de meio de cultura conhecida para micro-organismos do gênero Trichoderma. Como fonte de nitrogênio, pode-se utilizar, por exemplo, polipeptona, caldo, CSL ou torta de soja. Um indutor para a produção de proteína pode ser adicionado ao meio de cultura.

[32] No caso da produção de celulases pela presente invenção, a cepa mutante pode ser cultivada em um meio de cultura contendo um ou mais indutores selecionados a partir do grupo que consiste em lactose, celulose e xilano. Para a introdução de celulose ou xilano, pode ser adicionada biomassa contendo celulose ou xilano como um indutor. Os exemplos específicos da biomassa contendo celulose ou xilano incluem não vegetais, tais como plantas de semente, pteridófitas, briófitas, algas, e planta aquáticas, mas também resíduos de materiais de construção. As plantas com sementes são classificadas em gimnospermas e angiospermas, e ambas podem ser utilizadas de maneira favorável. As angiospermas são ainda classificadas em monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos específicos das monocotiledôneas preferencialmente utilizadas incluem bagaço, swichgrass (Panicum virgatum), capim-elefante

(Pennisetum purpureum), Erianthus, palha de milho, sabugo de milho, palha de arroz, e palha de trigo, e exemplos específicos de dicotiledôneas preferencialmente utilizadas incluem polpa de beterraba, e eucalipto, carvalho, e vidoeiro branco.

[33] Quanto à biomassa contendo celulose ou xilano, pode-se utilizar um produto pré-tratado. O método de pré-tratamento não é particularmente limitado, mas podem ser utilizados métodos conhecidos como, por exemplo, tratamento com ácido, tratamento com ácido sulfúrico, tratamento com ácido sulfúrico diluído, tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico, tratamento subcrítico, tratamento de moagem fina e tratamento com vapor. A polpa pode ser usada como a biomassa pré-tratada contendo celulose ou xilano.

[34] A literatura não patentária 2 descreve que, nos casos em que é cultivada uma cepa mutante obtida pela deleção de um transportador de açúcar a partir do Trichoderma reesei, o uso de lactose como indutor resulta em uma diminuição na quantidade de produção da celulase. Entretanto, nos casos em que a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção é cultivada usando lactose como indutor, não apenas uma melhora na quantidade de produção de proteína é atingida, como também várias atividades específicas da celulase são melhoradas.

[35] Os métodos para cultivar a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção não são particularmente limitados, e o mutante pode ser cultivado, por exemplo, em cultura líquida usando um tubo de centrifugação, um frasco, um recipiente fermentador, um tanque, etc. ou em cultura sólida usando uma placa, etc. O Trichoderma reesei é preferencialmente cultivado em condições de aerobiose, e dentre estes métodos de cultura, é preferido o método de cultura submerso usando um frasco fermentador ou enquanto a aeração e agitação são submetidas em um tanque. A taxa de aeração é preferencialmente de aproximadamente 0,1-2,0 vvm (volume de ar por volume de meio), mais preferencialmente 0,3-1,5 vvm, particularmente preferencialmente 0,5-1,0 vvm.

A temperatura da cultura é preferencialmente de cerca de 25-35ºC, mais preferencialmente 25-31ºC. A condição de pH durante a cultura é preferencialmente de pH 3,0 a pH 7,0, mais preferencialmente de pH 4,0 a pH 6,0. Como período de cultura, a cultura é realizada sob condições que permitam a produção de proteína até que uma quantidade recuperável de proteínas seja acumulada. Normalmente, o período de cultura é de aproximadamente 24-240 horas, mais preferencialmente de 36-192 horas.

[36] Os métodos para a recuperação de uma proteína contida na solução de cultura, onde o mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi cultivado não estão particularmente limitados, mas a proteína pode ser recuperada por remoção dos corpos dos fungos filamentosos do gênero Trichoderma a partir da solução de cultura. Exemplos de métodos para remover os corpos de fungos incluem centrifugação, separação por membrana e filtro-prensa.

[37] Além disso, no caso em que a solução de cultura na qual o fungo filamentoso mutante do gênero Trichoderma foi cultivado é utilizada como solução de proteína sem remover o corpo do fungo da mesma, a solução de cultura é preferencialmente tratada de modo que os corpos de fungos dos fungos filamentosos mutantes do gênero Trichoderma não possam crescer na referida solução. Exemplos de métodos de tratamento para prevenir o crescimento dos fungos incluem tratamento com calor, tratamento químico, tratamento ácido/alcalino, e tratamento com UV.

[38] No caso em que a proteína é uma enzima, a solução de cultura a partir da qual os corpos do fungo foram removidos ou quando a solução foi tratada de modo que o corpo do fungo não possa crescer como mencionado acima, pode ser usada diretamente como uma solução de enzima.

[39] As celulases obtidas pelo cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção, em que a função de um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi reduzida, são elevadas em várias atividades específicas da celulase, em particular na atividade específica da β-glucosidase, em comparação com as celulases obtidas pelo cultivo do fungo filamentoso do gênero Trichoderma no qual a função do polipeptídeo não foi reduzida.

Consequentemente, as celulases podem decompor de forma eficiente a biomassa contendo celulose para fornecer uma solução sacarificada com alta concentração de glicose, tornando possível obter uma maior quantidade de açúcar. Métodos para sacarificar a biomassa contendo celulose para produzir açúcar não são particularmente limitados. A reação de sacarificação pode ser realizada em um método descontínuo (em batelada) ou método contínuo.

[40] As condições para a reação de sacarificação não são particularmente limitadas. A temperatura da reação de sacarificação está preferencialmente no intervalo de 25-60ºC, mais preferencialmente no intervalo de 30-55ºC. O tempo de reação de sacarificação está preferencialmente no intervalo de 2-200 horas. O pH na reação de sacarificação está preferencialmente no intervalo de 3,0-7,0, mais preferencialmente no intervalo de 4,0-6,0. No caso de celulases derivadas do gênero Trichoderma, o pH ótimo para a reação é pH 5,0. Além disso, uma vez que o pH muda durante a hidrólise, é preferível adicionar um tampão à solução de reação ou conduzir a reação enquanto mantém o pH constante usando um ácido ou um álcali.

[41] A composição enzimática assim usada pode ser separada e recuperada da solução sacarificada obtida por sacarificação de biomassa contendo celulose. Os métodos para separar e recuperar a composição enzimática não são particularmente limitados. Pode ser feito uso de um método em que a solução sacarificada é filtrada com uma membrana de ultrafiltração ou semelhante para recuperar a composição de enzima no lado de não permeação.

De acordo com a necessidade, uma etapa de remoção de matéria sólida da solução sacarificada pode ser realizada antes da filtração. As celulases recuperadas podem ser novamente utilizadas para uma reação de sacarificação.

EXEMPLOS

[42] A presente invenção é descrita de forma específica a seguir, com referência aos Exemplos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

MÉTODO PARA MEDIR A CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA

[43] Foi utilizado um reagente para medir a concentração de proteína (ensaio de proteína Quick Start Bradford, produzido pela Bio-Rad Laboratories, Inc.). 5 μL de uma solução diluída de cultura de fungo filamentoso foram adicionados a 250 μL do reagente de medição da concentração de proteína retornado à temperatura ambiente. Após deixar a mistura em repouso em temperatura ambiente durante 5 minutos, a absorbância a 595 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas. Usando BSA como padrão, a concentração de proteína foi calculada com base na curva de calibração.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE ESPECÍFICA DAS CELULASES (MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE ESPECÍFICA DA Β-GLUCOSIDASE)

[44] Primeiro, 10 μL de uma diluição de enzima foram adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-glucopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura foi deixada reagir a 30ºC por 10 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M foram adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm foi medido. Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto foi definida como 1 U de atividade, e a atividade específica foi calculada pela divisão desse valor pela quantidade de proteína.

(MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE ESPECÍFICA DA Β-XILOSIDASE)

[45] Primeiro, 10 μL de uma diluição de enzima foram adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura foi deixada reagir a 30ºC por 30 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M foram adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm foi medido. Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto foi definida como 1 U de atividade, e a atividade específica foi calculada pela divisão desse valor pela quantidade de proteína.

(MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE ESPECÍFICA DA CELOBIOHIDROLASE)

[46] 10 μL de uma diluição de enzima foram adicionados a 90 μL de tampão acetato a 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-lactopiranosídeo (produzido pela Sigma-Aldrich, Japão), e a mistura foi deixada reagir a 30ºC por 60 minutos. Em seguida, 10 µL de carbonato de sódio 2 M foram adicionados e bem misturados para interromper a reação, e o aumento na absorbância a 405 nm foi medido. Finalmente, a liberação de 1 μmol de p-nitrofenol por minuto foi definida como 1 U de atividade, e a atividade específica foi calculada pela divisão desse valor pela quantidade de proteína.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3

TESTE DE SACARIFICAÇÃO DE BIOMASSA CONTENDO CELULOSE

[47] Como biomassa a ser sacarificada, utilizou-se celulose em pó derivada da madeira Arbocel (marca registrada) B800 (produzida pela J.

Rettenmaier & Sohne) ou bagaço em pó com um diâmetro médio de partícula de 100 μm. Como solução enzimática, utilizou-se um filtrado obtido pela coleta de uma porção de 1 mL de uma solução de cultura de Trichoderma reesei ou da cepa mutante de Trichoderma reesei, centrifugando a solução de cultura coletada, recuperando um sobrenadante a partir do qual os corpos dos fungos foram removidos, e filtração do sobrenadante utilizando um filtro de 0,22 μm. A celulose em pó derivada de madeira Arbocel (marca registrada) B800 (produzida pela J. Rettenmaier & Sohne) é doravante referida como “Arbocel B800”.

(REAÇÃO DE SACARIFICAÇÃO)

[48] Uma reação de sacarificação foi conduzida da seguinte maneira. Em um tubo de 2 mL foram introduzidos Arbocel (marca registrada) B800 ou bagaço em pó com um diâmetro médio de partícula de 100 μm e um tampão de acetato de sódio (pH 5,2) de modo a resultar em uma concentração final de 0,1 M. Foi adicionada água pura em quantidade que resultou em uma concentração sólida no momento do início da reação de 8% em peso no caso do uso de Arbocel (marca registrada) B800 ou de 10% em peso no caso do uso do bagaço. A solução de enzima adicionada para iniciar a reação sob as condições de reação de 50ºC usando um rotador de bloco de calor. Uma amostra obtida após a realização da reação de sacarificação por 24 horas foi centrifugada por 10 minutos nas condições de 10.000 × g e o sobrenadante foi retirado. A reação de sacarificação foi concluída pela adição de solução aquosa de hidróxido de sódio 1N ao sobrenadante em uma quantidade de um décimo do volume do sobrenadante. A concentração de açúcar na solução sacarificada após o término da reação foi determinada submetendo a solução sacarificada à análise de açúcar por UPLC mostrado abaixo. Assim, para a solução de enzima a ser usada na reação de sacarificação, a quantidade de adição da mesma foi calculada a partir da concentração de proteína da solução de cultura e da atividade específica, de modo a ser adequada para as condições utilizadas em cada um dos Exemplos e Exemplos Comparativos.

(DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE AÇÚCAR)

[49] A solução sacarificada foi analisada quantitativamente para glicose, xilose e celobiose sob as seguintes condições usando ACQUITY (marca registrada) UPLC System (Waters).

[50] A análise quantitativa foi realizada com base em curvas de calibração preparadas com amostras padrão de glicose, xilose e celobiose. As concentrações de celobiose inferiores a 1 g/L foram consideradas como abaixo do limite de detecção: - Coluna: Coluna AQUITY™ UPLC BEH Amide 1,7 μm 2,1100 mm; - Método de separação: HILIC; - Fase móvel: fase móvel A: 80% de acetonitrila, solução aquosa de TEA a 0,2 % , e fase móvel B: 30% de acetonitrila, uma solução aquosa de TEA a 0,2%, de acordo com o seguinte gradiente. O gradiente usado foi um gradiente linear atingindo a proporção de mistura correspondente ao tempo abaixo; - Condição de iniciação: (A 99,90%, B 0,10%), 2 minutos após o início: (A 96,70%, B 3,30%), 3,5 minutos após o início: (A 95,00%, B 5,00%), 3,55 minutos após o início: (A 99,90%, B 0,10%), 6 minutos após o início: (A 99,90%, B 0,10%); - Método de detecção: ELSD (detector evaporativo de espalhamento de luz); - Velocidade de fluxo: 0,3 mL/minuto; e - Temperatura: 55ºC.

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DA CEPA MUTANTE I DE TRICHODERMA REESEI QM9414 COM FUNÇÃO

REDUZIDA DO POLIPEPTÍDEO QUE CONSISTE NA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS REPRESENTADA PELA SEQ ID NO: 2:

[51] Uma cepa mutante I de Trichoderma reesei QM9414 com função reduzida do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi preparada pela preparação de um fragmento de DNA consistindo na sequência do gene representado pela SEQ ID NO: 3 como um fragmento de DNA contendo um gene codificante do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, na qual a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi reduzida, e, em seguida, transformando a cepa QM9414 de Trichoderma reesei com o fragmento de DNA. Por este método, uma cepa mutante de Trichoderma reesei é obtida em que 11 bases foram inseridas na posição 1.415 da SEQ ID NO: 1, para ter um polipeptídeo no qual a tradução termina na posição 419 na SEQ ID NO: 2. O gene da acetamida e acetamidase (AmdS) (amdS) capaz de decompor a acetamida foi utilizado como marcador de seleção para a introdução do fragmento de DNA. Para permitir que o fragmento de DNA que consiste na sequência de base representada pela SEQ ID NO: 3 seja introduzido a montante e a jusante da sequência de DNA contendo amdS, um plasmídeo para introdução de mutações foi preparado de modo a adicionar uma porção homóloga à sequência do gene da cepa de Trichoderma reesei, QM94 14.

[52] Especificamente, um fragmento de DNA obtido pelo tratamento de um fragmento de DNA sintetizado mostrado pela SEQ ID NO: 4 com as enzimas de restrição AflII e NotI foi usado como o fragmento de DNA a montante. Além disso, a PCR foi realizada usando DNA genômico extraído de maneira usual da cepa QM9414 de Trichoderma reesei e oligos DNAs representados pelas SEQ ID NOs: 5 e 6, e um fragmento de DNA obtido pelo tratamento do fragmento amplificado resultante com enzimas de restrição MluI e SwaI foi usado como o fragmento de DNA a jusante. Os fragmentos de DNA a montante e a jusante foram introduzidos em um plasmídeo amdS-inseridos usando as enzimas de restrição AflII e NotI e as enzimas de restrição MluI e Swal, respectivamente, para a construção de um plasmídeo para a introdução de mutações. O plasmídeo para a introdução da mutação foi então tratado com as enzimas de restrição PacI e Ascl, e a cepa QM9414 de Trichoderma reesei (NBRC # 31329) foi transformada com o fragmento de DNA obtido mostrado pela SEQ ID NO: 3. As manipulações envolvendo a técnica de biologia molecular foram realizadas como descrito em Molecular cloning,

laboratory manual, 1, 2, 3 (1989). Além disso, a transformação foi realizada usando uma técnica padrão, ou seja, um método de PEG de protoplasto e, especificamente, foi realizada como descrito em Gene, 61, 165-176 (1987). A cepa mutante de Trichoderma reesei obtida foi utilizada como cepa QM9414 mutante I nos experimentos seguintes.

EXEMPLO 2 TESTE DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA USANDO A CEPA QM9414 MUTANTE I (CULTIVO EM FRASCO)

[53] Após os esporos da cepa QM9414 mutante I preparada no Exemplo 1 serem diluídos com soro fisiológico para estarem na concentração de 1,0x107/mL, 0,1 mL da solução de esporos diluída foi inoculada em 10 mL de um meio mostrado na Tabela 1 ou 2, que foi colocada em um balão com saliências/reentrâncias no fundo (baffled) de 50 mL, e incubada em um agitador sob as condições de 28ºC e 120 rpm durante 120 horas. A concentração de proteína na solução de cultura foi determinada pelo método descrito no Exemplo de Referência 1, e as diversas atividades específicas da celulase foram determinadas pelos métodos descritos no Exemplo de Referência 2. Os resultados obtidos após o cultivo no meio de cultura mostrado na Tabela 1 são fornecidos na Tabela 3, e os resultados obtidos após o cultivo no meio de cultura mostrado na Tabela 2 são fornecidos na Tabela 4.

TABELA 1 Arbocel B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) 20 g 5 Solução de Mandel* 200 mL 10 solução de tartarato de amônio ** 100 mL Efluente de milho 50 g Solução de elementos vestigiais (traço)*** 1 mL Tween 80 0,5 mL PE-M 1 mL

(para 1 L) * A solução de Mandel 5 contém 7 g/L de (NH4)2SO4, 10 g/L de KH2PO4, 2 g/L de CaCl2  2H2O e 1,5 g/L de MgSO4  7H2O.

** A solução de tartarato de amônio 10x contém 92 g/L de tartarato de amônio.

*** A solução de elementos vestigiais contém 0,3 g/L de LH3BO3, 1,3 g/L (NH4)6Mo7O24  4H2O, 5 g/L de FeCl3  6H2O, 2 g/L de CuSO4  5H2O, 0,4 g/L de MnCl2  4H2O e 10 g/L de ZnCl2.

TABELA 2 Lactose 20 g 5 Solução de Mandel* 200 mL 10 solução de tartarato de amônio ** 100 mL Efluente de milho 50 g Solução de elementos vestigiais (traço)*** 1 mL Tween 80 0,5 mL PE-M 1 mL (para 1 L) (COLEÇÃO DE SOLUÇÃO DE CULTURA)

[54] Após 120 horas a partir do início do cultivo, foi coletada uma porção de 1 mL da solução de cultivo. A solução de cultura coletada foi centrifugada nas condições de 15.000 x g a 4ºC durante 10 minutos para obter um sobrenadante.

O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm, e o filtrado foi utilizado como uma solução de celulase nos experimentos seguintes.

(DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS E VÁRIAS ATIVIDADES ESPECÍFICAS DE CELULASE )

[55] A concentração de proteína na solução de cultura em 120 horas a partir do início da cultura foi determinada utilizando a técnica descrita no Exemplo de Referência 1, e, subsequentemente, as atividades específicas da celulase foram determinadas pelo método descrito no Exemplo de Referência 2.

Os resultados são mostrados nas Tabelas 3 e 4.

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DA CEPA MUTANTE II DE TRICHODERMA REESEI QM9414COM FUNÇÃO

REDUZIDA DO POLIPEPTÍDEO QUE CONSISTE NA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS REPRESENTADA PELA SEQ ID NO: 2:

[56] A cepa mutante de Trichoderma reesei com função reduzida do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi preparada pela preparação de um fragmento de DNA consistindo na sequência do gene representada pela SEQ ID NO: 10, e, em seguida, transformando a cepa QM9414 de Trichoderma reesei com o fragmento de DNA. Por este método, o amdS é inserido entre as bases 435ª e 436ª na SEQ ID NO: 1, e é obtida uma cepa mutante de Trichoderma reesei com função reduzida do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Para permitir que o fragmento de DNA que consiste na sequência de base representada pela SEQ ID NO: 10 seja introduzido a montante e a jusante da sequência de DNA contendo amdS, um plasmídeo para introdução de mutações foi preparado de modo a adicionar uma porção homóloga à sequência do gene da cepa de Trichoderma reesei, QM94

14.

[57] Especificamente, a PCR foi realizada usando DNA genômico extraído de maneira usual da cepa QM9414 de Trichoderma reesei e oligos DNAs representados pelas SEQ ID NOs: 11 e 12, e um fragmento de DNA obtido pelo tratamento do fragmento amplificado resultante com enzimas de restrição AfIII e NotI foi usado como o fragmento a montante. Além disso, a PCR foi realizada usando DNA genômico e oligos DNAs representados pelas SEQ ID NOs: 13 e 14, e um fragmento de DNA obtido pelo tratamento do fragmento amplificado resultante com enzimas de restrição MluI e SphI foi usado como o fragmento de DNA a jusante. Os fragmentos de DNA a montante e a jusante foram introduzidos em um plasmídeo amdS-inseridos usando as enzimas de restrição AflII e NotI e as enzimas de restrição MluI e Sphl, respectivamente, para a construção de um plasmídeo para a introdução de mutações. O plasmídeo para a introdução da mutação foi então tratado com as enzimas de restrição AflII e SphI, e a cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi transformada com o fragmento de DNA obtido mostrado pela SEQ ID NO: 10 da mesma maneira descrita no Exemplo 1. A cepa mutante de Trichoderma reesei obtida foi utilizada como cepa QM9414 mutante II nos experimentos seguintes.

EXEMPLO 4 TESTE DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA USANDO A CEPA QM9414 MUTANTE II

[58] O cultivo foi realizado pelas mesmas operações e condições como no Exemplo 2, exceto que a cepa QM9414 mutante II foi usada no lugar da cepa QM9414 mutante I preparada no Exemplo 1, e a concentração de proteína na solução de cultura e as diversas atividades específicas da celulase foram determinadas. Os resultados são mostrados nas Tabelas 3 e 4.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 TESTE DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA USANDO TRICHODERMA REESEI CEPA QM9414

[59] O cultivo foi realizado pelas mesmas condições e operações como no Exemplo 2, exceto que a cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi usada no lugar da cepa QM9414 mutante I de Trichoderma reesei preparada no Exemplo 1, e a concentração de proteína na solução de cultura e as diversas atividades específicas da celulase foram determinadas pelos mesmos métodos descritos no Exemplo 2. Os resultados obtidos após o cultivo no meio de cultura mostrado na Tabela 1 são fornecidos na Tabela 3, e os resultados obtidos após o cultivo no meio de cultura mostrado na Tabela 2 são fornecidos na Tabela 4.

TABELA 3 Cultivo com Arbocel B800 Exemplo Comparativo Exemplo 2 Exemplo 4 1

Cepa QM9414 Cepa QM9414 Cepa QM9414 Mutante I Mutante II Valor relativo da concentração 1 1,5 1,3 de proteína Valor relativo da atividade 1 1,9 1,7 específica de -glucosidase Valor relativo da atividade 1 1,3 1,9 específica de -xilosidase Valor relativo da atividade 1 1,3 1,1 específica de celobiohidrolase TABELA 4 Exemplo Comparativo Exemplo 2 Exemplo 4 1 Cultivo com lactose Cepa QM9414 Cepa QM9414 Cepa QM9414 Mutante I Mutante II Valor relativo da concentração de 1 1,7 1,4 proteína Valor relativo da atividade 1 4,3 1,6 específica de -glucosidase Valor relativo da atividade 1 2,5 1,2 específica de -xilosidase Valor relativo da atividade 1 3,5 1,1 específica de celobiohidrolase

[60] Os resultados do Exemplo 2, Exemplo 4 e Exemplo Comparativo 1 revelaram o seguinte em relação ao cultivo no meio mostrado na Tabela 1. Quando a concentração de proteína na solução de cultura onde a cepa de Trichoderma reesei QM9414 foi cultivada foi assumida como sendo 1, o valor relativo da concentração de proteína na solução de cultura da cepa QM9414 mutante I foi de 1,5 e o valor relativo da concentração de proteína na solução de cultura da cepa QM9414 mutante II foi de 1,3. Compreende-se a partir desses resultados que quando o fungo Trichoderma reesei com função reduzida do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é cultivado, a quantidade de produção de proteína pode ser aumentada quando comparada com o caso em que a função do polipeptídeo não foi reduzida.

[61] Além disso, as soluções de cultura obtidas no Exemplo 2, Exemplo 4, e no Exemplo Comparativo 1 foram examinadas quanto a atividade específica da celulase através dos métodos descritos no Exemplo de Referência

2. Como resultado, foi encontrado o seguinte. Quando várias atividades específicas de celulase na solução de cultura onde a cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi cultivada foram assumidas como sendo 1, a atividade específica de β-glucosidase da cepa QM9414 mutante I foi de 1,9, e da cepa QM9414 mutante II foi de 1,7; e a atividade específica da β-xilosidase da cepa QM9414 mutante I foi de 1,3 e da cepa QM9414 mutante II foi de 1,9; e a atividade específica da celobiohidrolase da cepa QM9414 mutante I foi de 1,3, e da cepa QM9414 mutante II foi de 1,1. Entende-se a partir desses resultados que as celulases obtidas pelo cultivo das cepas mutantes de Trichoderma reesei reduzidas na função do polipeptídeo representado pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 não só atingem quantidades melhoradas de produção de proteína, como também trazem um inesperado efeito de melhoria em várias atividades específicas da celulase quando comparadas com o caso em que a função do polipeptídeo não foi reduzida.

[62] Entretanto, com relação ao cultivo em meio de cultura contendo lactose mostrado na Tabela 2, o seguinte foi encontrado. Quando a concentração de proteína na solução de cultura onde a cepa QM9414 foi cultivada foi assumida como sendo 1, o valor relativo da concentração de proteína na solução de cultura da cepa QM9414 mutante I foi de 1,7 e o valor relativo da concentração de proteína na solução de cultura da cepa QM9414 mutante II foi de 1,4. Compreende-se a partir desses resultados que quando o fungo Trichoderma reesei com função reduzida do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é cultivado, a quantidade de produção de proteína pode ser aumentada quando comparada com o caso em que a função do polipeptídeo não foi reduzida.

[63] Além disso, as soluções de cultura obtidas foram examinadas quanto à atividade de celulase específica pelos métodos descritos no Exemplo de Referência 2. Como resultado, foi encontrado o seguinte.

Quando várias atividades específicas de celulase na solução de cultura onde a cepa QM9414 foi cultivada foram assumidas como sendo 1, a atividade específica de β-glucosidase da cepa QM9414 mutante I foi de 4,3, e da cepa QM9414 mutante II foi de 1,6; e a atividade específica da β-xilosidase da cepa QM9414 mutante I foi de 2,5 e da cepa QM9414 mutante II foi de 1,2; e a atividade específica da celobiohidrolase da cepa QM9414 mutante I foi de 3,5, e da cepa QM9414 mutante II foi de 1,1. Entende-se a partir desses resultados que as celulases obtidas pelo cultivo das cepas mutantes de Trichoderma reesei reduzidas na função do polipeptídeo representado pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 não só atingem quantidades melhoradas de produção de proteína, como também trazem um inesperado efeito de melhoria em várias atividades específicas da celulase quando comparadas com o caso em que a função do polipeptídeo não foi reduzida.

Estes resultados revelaram que o cultivo da cepa QM9414 mutante I, que tinha função reduzida no polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, em meio de cultura contendo lactose, atinge melhorias notáveis em diversas atividades de celulase específicas em comparação com o cultivo da mesma cepa em meio de cultura contendo celulose.

EXEMPLO 5

TESTE DE REAÇÃO DE SACARIFICAÇÃO USANDO CELULASES A PARTIR DA CEPA QM9414 MUTANTE I

[64] Utilizando uma solução de cultura coletada em 120 horas após o início do cultivo da cepa QM9414 mutante I obtida no Exemplo 2 no meio de cultura mostrado na Tabela 1, um teste de reação de sacarificação de biomassa contendo celulose foi realizado de acordo com a operação e condições descritas na Tabela 5 e no Exemplo de Referência 3. Como biomassa contendo celulose, foi usado Arbocel (marca registrada) B800 ou bagaço em pó.

Os resultados deste teste são exibidos na Tabela 6.

TABELA 5 Arbocel B800 ou bagaço em pó 80 mg Tampão acetato de sódio 1 M (pH 5,2) 100 μL Quantidade de adição de enzima 0,06 mg (para 1 mL) TABELA 6 Exemplo Comparativo Exemplo 5 Cepa QM9414 Cepa QM9414 Mutante I Concentração de glicose 3,3 4,8 Arbocel (g/L) B800 Concentração de xilose 3,9 4,9 (g/L) Concentração de glicose 1,4 1,7 (g/L) Bagaço Concentração de xilose 2,3 2,5 (g/L) EXEMPLO 6 TESTE DE REAÇÃO DE SACARIFICAÇÃO 1 USANDO CELULASES A PARTIR DA CEPA QM9414 MUTANTE II

[65] Um teste de reação de sacarificação de biomassa contendo celulose foi realizado de acordo com a operação e as condições descritas no Exemplo de Referência 3 usando uma solução de cultura coletada 120 horas após o início do cultivo em meio de cultura mostrado na Tabela 1, das soluções de cultura da cepa QM9414 mutante II obtida no Exemplo 4. As condições de reação para a reação de sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 são mostradas na Tabela 7, e as condições de reação para a reação de sacarificação do bagaço em pó são mostradas na Tabela 8. Os resultados deste teste são exibidos na Tabela 9.

TABELA 7 Arbocel B800 100 mg Tampão acetato de sódio 1 M (pH 5,2) 100 μL Quantidade de adição de enzima 450 μL (para 1 mL) TABELA 8 Bagaço em pó 100 mg Tampão acetato de sódio 1 M (pH 5,2) 100 μL Quantidade de adição de enzima 400 μL (para 1 mL) TABELA 9 Exemplo Comparativo Exemplo 6 Foi usado sobrenadante do meio de cultura do cultivo com Arbocel B800 Cepa QM9414 Cepa QM9414 mutante II Concentração de glicose 13,0 14,3 Sacarificação de (g/L) Arbocel B800 Concentração de xilose 8,5 9,1 (g/L) Concentração de glicose 6,1 6,5 Sacarificação de (g/L) Bagaço Concentração de xilose 4,1 4,1 (g/L) EXEMPLO COMPARATIVO 2 TESTE DE REAÇÃO DE SACARIFICAÇÃO 1 USANDO CELULASES DE TRICHODERMA REESEI CEPA QM9414

[66] Um teste de reação de sacarificação de biomassa contendo celulose foi realizado usando a mesma operação e condições que no Exemplo 5 ou 6, exceto que foi feito uso de uma solução de cultura coletada 120 horas após o início do cultivo no meio de cultura mostrado na Tabela 1, das soluções de cultura da cepa de Trichoderma reesei QM9414 obtida no Exemplo Comparativo

1. Os resultados do teste são mostrados nas Tabelas 6 e 9.

EXEMPLO 7

TESTE DE REAÇÃO DE SACARIFICAÇÃO 2 USANDO CELULASES A PARTIR DA CEPA QM9414 MUTANTE II

[67] Um teste de reação de sacarificação de biomassa contendo celulose foi realizado de acordo com a operação e as condições descritas na Tabela 6 e no Exemplo de Referência 3 usando uma solução de cultura coletada 120 horas após o início do cultivo em meio de cultura mostrado na Tabela 2, das soluções de cultura da cepa QM9414 mutante II obtida no Exemplo 4. As condições de reação para a reação de sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 são mostradas na Tabela 10, e as condições de reação para a reação de sacarificação do bagaço em pó são mostradas na Tabela 11. Os resultados deste teste são exibidos na Tabela 12.

TABELA 10 Arbocel B800 100 mg Tampão acetato de sódio 1 M (pH 5,2) 100 μL Quantidade de adição de enzima 350 μL (para 1 mL) TABELA 11 Bagaço em pó 100 mg Tampão acetato de sódio 1 M (pH 5,2) 100 μL Quantidade de adição de enzima 400 μL (para 1 mL) TABELA 12 Exemplo Comparativo Exemplo 6 Foi usado sobrenadante do meio de cultura a partir do cultivo com lactose Cepa QM9414 Cepa QM9414 mutante II Concentração de glicose 5,9 7,2 Sacarificação de (g/L) Arbocel B800 Concentração de xilose 3,4 4,5 (g/L) Concentração de Sacarificação de glicose 2,9 3,9 bagaço (g/L)

Exemplo Comparativo Exemplo 6 Foi usado sobrenadante do meio de cultura a partir do cultivo com lactose Cepa QM9414 Cepa QM9414 mutante II Concentração de xilose 2,5 3,0 (g/L) EXEMPLO COMPARATIVO 3 TESTE DE REAÇÃO DE SACARIFICAÇÃO 2 USANDO CELULASES DE TRICHODERMA REESEI CEPA QM9414

[68] Um teste de reação de sacarificação de biomassa contendo celulose foi realizado usando a mesma operação e condições como no Exemplo 7, exceto que foi feito uso de uma solução de cultura coletada 120 horas após o início do cultivo no meio de cultura mostrado na Tabela 1, das soluções de cultura da cepa de Trichoderma reesei QM9414 obtida no Exemplo Comparativo

2. Os resultados deste teste são exibidos na Tabela 12.

CONCLUSÕES

[69] Os resultados do Exemplo 5 e Exemplo Comparativo 2 revelaram o seguinte. No que diz respeito à reação de sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 com as soluções de cultura obtidas pelo cultivo em meio de cultura mostrado na Tabela 1, o uso das celulases obtidas a partir da Trichoderma reesei cepa QM9414 resultou em uma solução sacarificada com uma concentração de glicose de 3,3 g/L, enquanto que o uso da cepa QM9414 mutante I resultou em uma concentração de glicose de 4,8 g/L. Além disso, o uso da cepa QM9414 resultou em uma concentração de xilose na solução sacarificada de 3,9 g/L, enquanto que o uso da cepa QM9414 mutante I resultou em uma concentração de xilose de 4,9 g/L.

[70] Com relação à reação de sacarificação do bagaço em pó, o uso da cepa QM9414 resultou em um teor livre de glicose de 1,4 g/L, enquanto que o uso da cepa mutante I resultou em um teor livre de glicose de 1,7 g/L. A utilização da cepa QM9414 resultou em um teor de xilose livre de 2,3 g/L, enquanto que a utilização da cepa mutante I resultou em um teor de xilose livre de 2,5 g/L.

[71] Os resultados do Exemplo 6 e Exemplo Comparativo 2 revelaram o seguinte. Com relação à reação de sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 com as soluções de cultura obtidas pelo cultivo em meio de cultura mostrado na Tabela 1, o uso da cepa QM9414 resultou em um teor de glicose livre de 13 g/L, enquanto que o uso da cepa QM9414 mutante II resultou em um teor de glicose livre de 14,3 g/L. Além disso, o uso da cepa QM9414 resultou em um teor de xilose livre de 8,5 g/L, enquanto que o uso da cepa mutante II resultou em um teor de xilose livre de 9,1 g/L. Com relação à reação de sacarificação do bagaço em pó, o uso da cepa QM9414 resultou em um teor livre de glicose de 6,1 g/L, enquanto que o uso da cepa mutante II resultou em um teor livre de glicose de 6,5 g/L. Tanto a cepa QM9414 quanto a cepa mutante II deram um teor de xilose livre de 4,1 g/L.

[72] Os resultados do Exemplo 7 e Exemplo Comparativo 3 revelaram o seguinte. Com relação à reação de sacarificação de Arbocel (marca registrada) B800 com as soluções de cultura obtidas pelo cultivo em meio de cultura mostrado na Tabela 2, o uso da cepa QM9414 resultou em uma concentração de glicose de 5,9 g/L, enquanto que o uso da cepa mutante II resultou em uma concentração de glicose de 7,2 g/L. Além disso, o uso da cepa QM9414 resultou em uma concentração de xilose de 3,4 g/L, enquanto que o uso da cepa mutante II resultou em uma concentração de xilose de 4,5 g/L. Com relação à reação de sacarificação do bagaço em pó, o uso da cepa QM9414 resultou em uma concentração de glicose de 2,9 g/L, enquanto que o uso da cepa mutante II resultou em uma concentração de glicose de 3,9 g/L. O uso da cepa QM9414 resultou em uma concentração de xilose de 2,5 g/L, enquanto que o uso da cepa mutante II resultou em uma concentração de xilose de 3,0 g/L. Compreende-se a partir destes resultados que as celulases produzidas pelas cepas mutantes de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, que tiveram a função do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 reduzida, podem produzir uma maior quantidade de açúcar do que as celulases produzidas pela cepa QM9414.

Claims (6)

REIVINDICAÇÕES

1. CEPA MUTANTE de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, caracterizada por possuir função reduzida em um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

2. CEPA MUTANTE de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos o resíduo 413º e resíduos de aminoácidos sucessivos do lado N-terminal na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é(são) deletado(s).

3. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA, caracterizado por incluir uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

4. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CELULASE, caracterizado por incluir uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

5. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CELULASE, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por incluir uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em um meio de cultura compreendendo um ou mais tipos de indutores selecionados a partir do grupo que consiste em lactose, celulose e xilano.

6. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM AÇÚCAR a partir de uma biomassa contendo celulose, caracterizado por compreender: etapa (a) de produção de uma celulase pelo cultivo de uma cepa mutante de Trichoderma reesei possuindo função reduzida de um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2; e etapa (b) de sacarificação de biomassa usando a celulase obtida na etapa (a).