CN110892072A - 新的β-葡糖苷酶、包含该酶的酶组合物和使用它们的糖液的制造方法 - Google Patents

新的β-葡糖苷酶、包含该酶的酶组合物和使用它们的糖液的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于，提供从难培养性的家白蚁共生原生生物群提取出的具有在含纤维素的生物质的水解中有效地促进糖化的效果的β‑葡糖苷酶基因，具体而言涉及由序列号1所记载的氨基酸序列组成的源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β‑葡糖苷酶。

Description

新的β-葡糖苷酶、包含该酶的酶组合物和使用它们的糖液的 制造方法
技术领域
本发明涉及新的β-葡糖苷酶、包含该β-葡糖苷酶的酶组合物及使用它们由含纤维素的生物质制造糖液的方法。
背景技术
利用将可再生的含纤维素的生物质分解而获得的糖来发酵生产生物燃料或生物聚合物原料作为原油代替资源的尝试正在国内外积极研究。
纤维素的糖化有各种各样的方法，能源使用量少且糖收率高的酶糖化法成为开发的主流。纤维素的酶分解与多个酶种类相关，大致可以分成纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶三种。纤维二糖水解酶是以从纤维素的末端部分水解为特征，能够分解纤维素的结晶区域的酶。另一方面，内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的内部区域水解为特征，通过纤维素分解来促进分子量降低的酶。
β-葡糖苷酶是主要将作为葡萄糖经β-1,4键合而成的二糖的纤维二糖分解，催化作为最终分解产物的葡萄糖的生成的酶，是为了充分获得作为发酵原料有用的葡萄糖而必须的酶。另外，已知纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶由于由纤维素分解生成的纤维二糖的蓄积而引起反应抑制。即，β-葡糖苷酶能够大幅降低由纤维素分解生成的纤维二糖的蓄积，因而具有使纤维素分解效率大幅提高的效果。
另一方面，作为生产纤维素酶的微生物，已知丝状菌。丝状菌中尤其已知木霉属(Trichoderma)在菌体外培养液中大量生产大量的内切型和外切型纤维素酶。源自木霉属(Trichoderma)的纤维素酶是含纤维素的生物质的酶分解中最多使用的酶。然而，木霉属(Trichoderma)产生的一部分β-葡糖苷酶局部存在于菌体细胞壁(非专利文献1)，由木霉属(Trichoderma)培养液制备的纤维素酶存在其中所含的β-葡糖苷酶量和活性不足的课题。另外，已知许多源自丝状菌的β-葡糖苷酶受到由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制，在含纤维素的生物质的糖化中，存在由纤维素分解在糖化反应液中生成的葡萄糖导致β-葡糖苷酶活性抑制，从而妨碍糖化反应液的葡萄糖蓄积量增加的课题(非专利文献2)。
因此，需要在含纤维素的生物质的水解中具有有效地促进糖化的效果的优质的β-葡糖苷酶，一直以来进行了源自微生物的β-葡糖苷酶的分离。
已知以木材为唯一营养源的白蚁的共生原生生物群的纤维素分解效率非常高。但是由于其共生原生生物的难培养性没有进行分析，即便近年来关于共生原生生物及其纤维素酶的研究也仅仅进行了一点(专利文献1)，对于源自白蚁的共生原生生物的β-葡糖苷酶基因，目前为止仍没有其获得例。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-70475号公报
非专利文献
非专利文献1：Messner,R等“Evidence for a single,specificβ-glucosidazein cell wall from Tricoderma QM9414”Enzyme Microb.Technol.1990年21卷685-690
非专利文献2：Andric,P等“Reactor design for minimizing productinhibition during enzymatic lignocellulose hydrolysis：I.Significance andmechanism of cellobiose and glucose inhibition on cellulolytic enzymes”Biotechnol.Adv.2010年28卷308-324
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题是提供从难培养性的家白蚁共生原生生物群提取出的具有在含纤维素的生物质的水解中有效地促进糖化的效果的β-葡糖苷酶基因。
用于解决课题的方法
本发明者们为了解决上述课题而反复进行了深入研究，通过利用单细胞转录物组分析法，由难培养性的家白蚁共生原生生物的微量RNA观测表达基因，由得到的cDNA库的序列信息获得β-葡糖苷酶候选序列，研究包含β-葡糖苷酶候选序列的转化体的β-葡糖苷酶活性和在含纤维素的生物质的糖化中的效果，筛选具有β-葡糖苷酶活性的序列，由此发现源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的新的β-葡糖苷酶能够适用于含纤维素的生物质的分解，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下的构成。
[1]下述(A)～(C)中的任一多肽，
(A)由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽，
(B)由在序列号1所记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有β-葡糖苷酶活性的多肽，
(C)由与序列号1所记载的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列组成、且具有β-葡糖苷酶活性的多肽。
[2]下述(a)～(d)中的任一多核苷酸，
(a)由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸，
(b)由在序列号2所记载的碱基序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个碱基的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(c)由与序列号2所记载的碱基序列具有至少60％的序列同一性的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(d)编码[1]所述的多肽的多核苷酸。
[3]下述(a)～(d)中的任一多核苷酸，
(a)由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸，
(b)由在序列号2所记载的碱基序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个碱基的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(c)由与序列号2所记载的碱基序列具有至少50％的序列同一性的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(d)编码[1]所述的多肽的多核苷酸。
[4]表达载体，包含[2]或[3]所述的多核苷酸。
[5]转化体，具有[2]或[3]所述的多核苷酸或[4]所述的表达载体。
[6]转化木霉属(Trichoderma)丝状菌，具有[2]或[3]所述的多核苷酸或[4]所述的表达载体。
[7]酶组合物的制造方法，包括培养[5]所述的转化体或[6]所述的转化木霉属(Trichoderma)丝状菌的工序。
[8]糖液的制造方法，包括制造[7]所述的酶组合物的工序，利用由该工序得到的酶组合物，由含有纤维素的生物质制造糖液。
[9]源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶，其特征在于，设葡萄糖不存在下的β-葡糖苷酶的活性为1时，在葡萄糖浓度为8g/L的条件下的β-葡糖苷酶活性为0.5以上。
[10]酶组合物，包含源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶、和源自丝状菌的纤维素酶。
[11]根据[10]所述的酶组合物，其特征在于，所述丝状菌是木霉属(Trichoderma)丝状菌。
[12]糖液的制造方法，利用[10]或[11]所述的酶组合物，由含有纤维素的生物质制造糖液。
[13]根据[12]所述的糖液的制造方法，包括从所述糖液中回收[10]或[11]所述的酶组合物的工序。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2017-165787号的公开内容。
发明的效果
根据本发明，能够提供具有在含纤维素的生物质的水解中有效地促进糖化的效果的β-葡糖苷酶。本发明的β-葡糖苷酶能够适合在通过含纤维素的生物质的水解来进行的糖液的制造中使用。
附图说明
图1：是实施例7中的由大肠杆菌表达且经纯化的本发明所涉及的β-葡糖苷酶(包含序列号1所记载的氨基酸序列的β-葡糖苷酶)的SDS-PAGE的照片。
图2：是实施例10中的由木霉属(Trichoderma)丝状菌表达的本发明所涉及的β-葡糖苷酶(包含序列号1所记载的氨基酸序列的β-葡糖苷酶)的SDS-PAGE的照片。
图3：是实施例14中的糖化上清的SDS-PAGE的照片。
图4：是比较例1中的由木霉属(Trichoderma)丝状菌表达的源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶(包含序列号10所记载的氨基酸序列的β-葡糖苷酶)的SDS-PAGE的照片。
图5：是实施例18中的本发明的β-葡糖苷酶和本发明的β-葡糖苷酶突变体的、由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制作用测定结果的图。
具体实施方式
以下，对于本发明的实施方式，详细地进行说明。
在本发明中，所谓“β-葡糖苷酶”是指催化将糖的β-糖苷键水解的反应的酶。在本发明中，β-葡糖苷酶活性的测定方法通过以对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(pNP-Glc)为底物的反应来测定。具体而言，在50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)中溶解的pNP-Glc的底物溶液中添加酶液，30℃下使其反应10分钟后，加入反应体系体积的十分之一量的2M碳酸钠混合均匀而停止反应，测定405nm下的吸光度的增加。上述反应后，如果硝基苯酚游离，405nm下的吸光度增加，则判断有β-葡糖苷酶活性。
本发明的β-葡糖苷酶的特征在于，源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物，作为具体例，可以列举由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽或其同源物。
进一步具体而言，本发明的源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶是下述(A)～(C)中的任一多肽。
(A)由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽，
(B)由在序列号1所记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有β-葡糖苷酶活性的多肽，
(C)由与序列号1所记载的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列组成、且具有β-葡糖苷酶活性的多肽。
由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽或其同源物只要是能够由公知的方法制备、并具有β-葡糖苷酶活性的多肽，其制备方法就没有特别限制。由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽或其同源物可以通过公知的方法天然提取，或利用作为肽合成法已知的公知的方法制备，另外，也可以使用编码该多肽的氨基酸序列的多核苷酸，通过基因重组技术制备。
由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽的同源物只要是具有β-葡糖苷酶活性的多肽，就可以是例如由在序列号1所记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个、优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1或2个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽。
另外，序列号1所记载的多肽的同源物只要是具有β-葡糖苷酶活性的多肽，就可以是由与序列号1所记载的氨基序列具有至少70％、优选为至少80％、更优选为至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成的多肽。例如，作为由与序列号1的序列同一性为88％的氨基酸序列组成的多肽，可以列举序列号6所记载的多肽。另外，作为由与序列号1的序列同一性为80％的氨基酸序列组成的多肽，可以列举序列号8所记载的多肽。此外，作为序列号1所记载的氨基酸序列与公知的β-葡糖苷酶的氨基酸序列的序列同一性，例如，源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的β-葡糖苷酶I(BGLI)由744个氨基酸组成，与序列号1的序列同一性为29％。
由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽的同源物只要是具有β-葡糖苷酶活性的多肽，就可以是源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物、优选为源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)的Pseudotrichonympha hertwigi、Pseudotrichonymphapaulistana、Pseudotrichonympha grassii的多肽。
本发明的源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶优选属于GH3家族。本发明中所谓“GH3家族”，是指包含糖基水解酶家族3活性位点(Glycosylhydrolases family 3active site)的多肽。糖基水解酶家族3活性位点通过由以下18个氨基酸组成的氨基酸序列定义。即，对于糖基水解酶家族3活性位点，以选自L(亮氨酸)、I(异亮氨酸)、V(缬氨酸)、M(蛋氨酸)中的任意一个氨基酸为a，以选自氨基酸K(赖氨酸)、R(精氨酸)中的任意一个氨基酸为b，以选自氨基酸E(谷氨酸)、Q(谷氨酰胺)、K(赖氨酸)、R(精氨酸)、D(天冬氨酸)中的任意一个氨基酸为c，以选自氨基酸L(亮氨酸)、I(异亮氨酸)、V(缬氨酸)、M(蛋氨酸)、F(苯丙氨酸)、T(苏氨酸)、C(半胱氨酸)中的任意一个氨基酸为d，以选自氨基酸L(亮氨酸)、I(异亮氨酸)、V(缬氨酸)、T(苏氨酸)中的任意一个氨基酸为e，以选自氨基酸L(亮氨酸)、I(异亮氨酸)、V(缬氨酸)、M(蛋氨酸)、F(苯丙氨酸)中的任意一个氨基酸为f，以选自氨基酸S(丝氨酸)、T(苏氨酸)中的任意一个氨基酸为g，以选自氨基酸S(丝氨酸)、G(甘氨酸)、A(丙氨酸)、D(天冬氨酸)、N(天冬酰胺)、I(异亮氨酸)、T(苏氨酸)中的任一个氨基酸为h，以任意氨基酸为x来表示，通过由上述氨基酸a、b、c、d、e、f、g、h、x和氨基酸G(甘氨酸)、D(天冬氨酸)组成的18个氨基酸序列aabxcxxxxGdefgDxxh来定义。此外，任何人均可以在作为数据库的PROSITE(蛋白结构域数据库，家族和功能位点，Database of proteindomains,families and functional sites)的网站(http://prosite.expasy.org/)容易地研究多肽所含有的糖基水解酶家族3活性位点(Christian,et al.2002,Briefings inBioinfomatics.VOL3.NO3.265-274)。由序列号1、6、或8所记载的氨基酸序列组成的多肽属于GH3家族。
本发明的源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶优选不易因葡萄糖而导致β-葡糖苷酶活性受到抑制。具体而言，设葡萄糖不存在下的β-葡糖苷酶的活性为1时，在葡萄糖浓度为8g/L的条件下(或8g/L的葡萄糖存在下)的β-葡糖苷酶活性优选为0.5以上，更优选为0.6以上，更优选为0.7以上，更优选为0.8以上，更优选为0.9以上，更优选为1.0以上，更优选为1.1以上，更优选为1.2以上，更优选为1.3以上，特别优选为1.4以上。另外，除在所述葡萄糖浓度为8g/L的条件下的β-葡糖苷酶的活性以外，设葡萄糖不存在下的β-葡糖苷酶的活性为1时，葡萄糖浓度20g/L的条件下(或20g/L的葡萄糖存在下)的β-葡糖苷酶活性优选为0.5以上，更优选为0.6以上，特别优选为0.7以上。在此，对于β-葡糖苷酶活性的测定方法，除在测定时添加8g/L或20g/L的葡萄糖以外，使用通过与前述同样的方法测定而得的结果。
不易因葡萄糖而导致β-葡糖苷酶活性受到抑制的β-葡糖苷酶，即使在含纤维素的生物质的糖化中由于纤维素分解而在糖化反应液中生成葡萄糖，也可以将β-葡糖苷酶活性保持得较高，因而优选。
由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸或其同源物只要是编码由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽或其同源物的多核苷酸，就可以不特别限制其来源。在此，“多核苷酸”为cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、合成RNA、复制子RNA等，虽然不限制其来源，但优选DNA。另外，可以为单链，也可以为具有其互补链的双链。另外，可以含有天然的或人工的核苷酸衍生物。
序列号2所记载的多核苷酸的同源物只要是编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，就可以是例如由在序列号2所记载的碱基序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个、优选为1～40个、更优选为1～30个、进一步优选为1～20个、特别优选为1～10个、最优选为1～5个碱基的碱基序列组成的多核苷酸。
另外，序列号2所记载的多核苷酸的同源物只要是编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，就可以是与由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸或者其互补链的全部或其一部分在严格的条件下杂交的多核苷酸。在此，所谓“在严格的条件下杂交的多核苷酸”，例如，以选择一个或多个原本的碱基序列的任意至少20个、优选至少25个、更优选至少30个连续序列而得的多核苷酸作为探针，利用公知的杂交技术(Current Protocols IMolecular Biology edit.Ausubel et al.,(1987)Publish.John Wily&SonsSectoin6.3-6.4)等杂交的多核苷酸。在此作为严格的条件，例如可以如下实现：在50％甲酰胺存在下杂交温度为37℃、作为更严格的条件为42℃，作为进一步严格的条件为65℃，用0.1～2倍浓度的SSC(saline-sodium citrate)溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)洗涤。
另外，序列号2所记载的多核苷酸的同源物只要是编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，就可以是由相对于序列号2所记载的碱基序列具有至少50％、优选至少60％、更优选至少80％、进一步优选至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的序列同一性的碱基序列组成的多核苷酸。例如，作为由与序列号2的序列同一性为66％的碱基序列组成的多核苷酸，可以列举序列号3所记载的多核苷酸。另外，作为由与序列号2的序列同一性为53％的碱基序列组成的多核苷酸，可以列举序列号7或9所记载的多核苷酸。
本说明书中使用的“同一性”的术语，表示将不同的两个氨基酸序列或碱基序列利用序列比对程序进行排比比较时两个序列的一致程度。具体而言，是相对于序列号1的全部氨基酸数的同一氨基酸数的比例(％)或相对于序列号2的全部碱基数同一碱基数的比例(％)。作为为了排比比较两个序列使用的序列比对程序，利用作为该领域中通用的软件的BLAST(blastn、blastp)进行。关于BLAST，任何人均可以在NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)的主页中利用，可以使用默认的参数容易地调查同一性。
由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸的同源物只要是编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，就可以是源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物、优选为源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)的Pseudotrichonympha hertwigi、Pseudotrichonympha paulistana、Pseudotrichonympha grassii的多核苷酸。
由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸可以通过由伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物克隆来制备，也可以以化学方式合成。由伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的克隆可以利用通常公知的方法分离，作为这样的方法，例如可以由从伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物细胞中分离到的RNA经逆转录而得的cDNA确定全部ORF序列，其后通过PCR来扩增，也可以将其直接在DNA合成装置中化学合成。
通过利用限制酶和DNA连接酶将所述多核苷酸连接在能在宿主细胞中表达的启动子下游，由此可以制造包含该多核苷酸的表达载体。在本发明中表达载体只要是以能够表达的方式在宿主细胞中导入目标基因的载体，就可以是任意载体。可以是将目标基因导入到宿主基因组外的方式的能够自主复制的质粒，也可以是将目标基因导入到宿主基因组内的方式的DNA片段。作为表达载体，例如可以列举细菌质粒、酵母质粒、λ噬菌体等噬菌体DNA，反转录病毒、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒等病毒DNA，作为载体的农杆菌等。例如宿主细胞是大肠杆菌的情况下，可以例示pUC、pET、pBAD等。作为所述启动子，只要是与用于基因表达的宿主细胞相对应合适的启动子，就可以是任何启动子。例如宿主细胞是大肠杆菌的情况下，可以列举lac启动子、Trp启动子、PL启动子、PR启动子等。宿主细胞是纤维素酶生产性的丝状菌的情况下，优选列举能由纤维素诱导的启动子，更优选列举cbh启动子、egl启动子、bgl启动子、xyn启动子、bxl启动子。
作为在具有本发明的所述多核苷酸或表达载体的转化体中的宿主细胞，优选大肠杆菌、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等。作为酵母细胞，例如可以列举毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等。作为昆虫细胞，可以列举Sf9等，作为植物细胞，可以列举双子叶植物等，作为动物细胞，可以列举CHO、HeLa、HEK293等。进一步优选列举作为丝状菌的真菌细胞，更优选列举曲霉属(Aspergillus)丝状菌，更优选列举木霉属(Trichoderma)丝状菌。通过使用木霉属(Trichoderma)丝状菌作为宿主细胞，能够更多地生产本发明的β-葡糖苷酶。
转化或转染可以通过磷酸钙法、电穿孔法、农杆菌法等公知的方法进行。
本发明的β-葡糖苷酶可以在如上所述地被转化或转染的宿主细胞中在启动子的控制下表达，回收产生物从而获得。在表达时，使宿主细胞增殖或生长到合适的细胞密度后，通过温度变化或利用培养基成分的化学诱导手段等使启动子触发，进一步将细胞培养一定时间。
本发明中，所谓酶组合物，是指源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶与其它一种以上酶的混合物。酶组合物可以是将所述β-葡糖苷酶与其它一种以上酶分别生产后混合而成的，也可以是含有编码具有所述β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸或表达载体的转化体的培养物，该培养物中包含所述β-葡糖苷酶与源自宿主细胞的一种以上酶。所谓培养物，除培养上清以外，包含转化体或转化体的裂解物。
作为与所述β-葡糖苷酶混合的酶，优选纤维素酶。在此所说的纤维素酶，只要是具有分解纤维素的活性的酶，就没有特别限定，可以是两种以上酶的混合物。作为这样的酶，例如可以列举纤维素酶、半纤维素酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等。纤维素酶所含的纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的活性是以对硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷(pNP-Lac)为底物来测定的，β-木糖苷酶的活性是以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNP-Xyl)为底物来测定的。具体而言，在50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)中溶解的pNP-Lac的底物溶液中添加酶液，30℃下使其反应10分钟后，加入反应体系体积的十分之一量的2M碳酸钠混合均匀停止反应，测定405nm下的吸光度的增加。如果上述反应后，对硝基苯酚游离，405nm下的吸光度增加，则判断有纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的活性。β-木糖苷酶的活性与上述同样地以pNP-Xyl为底物进行反应，如果反应后，对硝基苯酚游离，405nm下的吸光度增加，则判断有β-木糖苷酶活性。
所述纤维素酶优选是源自丝状菌的纤维素酶。源自丝状菌的纤维素酶，是至少包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶二者而成的混合物。作为生产所述源自丝状菌的纤维素酶的微生物，可以列举木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单细胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐殖霉属(Humicola)、支顶孢属(Acremonium)、耙菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)等微生物。为了在培养液中产生纤维素酶，这些微生物可以直接将其培养液作为未纯化的源自丝状菌的纤维素酶使用，另外也可以将培养液经纯化、制剂化而得的物质作为源自丝状菌的纤维素酶混合物使用。
上述源自丝状菌的纤维素酶优选是源自木霉属(Trichoderma)的纤维素酶。木霉属(Trichoderma)能够在培养液中产生包含至少两种内切葡聚糖酶、以及至少两种纤维二糖水解酶而成的纤维素酶，由这样的培养液制备的纤维素酶可以优选在本发明中使用。即，本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)的纤维素酶一起作为酶组合物使用时，能够在含纤维素的生物质的糖化中使糖产量增加。
使用本发明的β-葡糖苷酶对含纤维素的生物质进行酶处理的情况下，能够从经酶处理得到的糖化液中回收具有高残留活性的本发明的β-葡糖苷酶。另外，从使用包含本发明的β-葡糖苷酶与上述源自丝状菌的纤维素酶的酶组合物对含纤维素的生物质进行酶处理而得的糖化液中，也能够回收具有高残留活性的本发明的β-葡糖苷酶。并且，对于源自丝状菌的酶组合物，从使用包含本发明的β-葡糖苷酶与上述源自丝状菌的纤维素酶的酶组合物对含纤维素的生物质进行酶处理而得的糖化液中，与仅使用源自丝状菌的纤维素酶对含纤维素的生物质进行酶处理而得的糖化液相比，也能够回收具有更高残留活性的源自丝状菌的纤维素酶。作为上述源自丝状菌的纤维素酶，优选源自木霉属(Trichoderma)的内切葡聚糖酶、纤维素二糖水解酶、β-木糖苷酶等，特别优选β-木糖苷酶。
这样的木霉属(Trichoderma)之中更优选源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。作为源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶混合物，可以列举源自里氏木霉QM9414(Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(Trichoderma reeseiQM9123)、里氏木霉Rut-30(Trichoderma reesei Rut-30)、里氏木霉PC3-7(Trichodermareesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reesei CL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿色木霉QM9123(Trichoderma viride QM9123)的纤维素酶混合物。另外，也可以是源自所述木霉属(Trichoderma)，经突变剂或紫外线照射等实施突变处理，从而纤维素酶生产性提高了的突变株来源的纤维素酶混合物。
在本发明中，包括将导入了编码具有所述β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸或表达载体的转化体进行培养的工序的酶组合物的制造方法，只要是包括能表达所述β-葡糖苷酶的培养工序的方法，就可以是任意方法。培养所述转化体时，在该转化体内具有β-葡糖苷酶活性的多肽的表达被新赋予或增强，其结果从培养物中获得包含所述β-葡糖苷酶与源自宿主细胞的一种以上酶的酶组合物。所谓培养物，除培养上清以外，可以是转化体或转化体的裂解物的任意者。
对于所述转化体的培养方法没有特别限定，可采用公知的方法。培养可以采用振荡培养、搅拌培养、搅拌振荡培养、静置培养、连续培养等各种各样的培养方式。作为培养所述转化体的培养基，只要是含有能将该转化体同化的碳源、氮源、无机盐类等，能够高效地进行该转化体的培养的培养基，就可以使用天然培养基、合成培养基的任意者。所述转化体是木霉属(Trichoderma)丝状菌的情况下，更优选用含有含纤维素的生物质的培养基进行培养。通过用含有含纤维素的生物质的培养基培养导入了编码本发明的β-葡糖苷酶的多核苷酸或表达载体的转化木霉属(Trichoderma)丝状菌，源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶表达，从而能够生产包含源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶与所述β-葡糖苷酶的酶组合物。
在本发明中所谓含纤维素的生物质，只要至少包含纤维素，就没有限定。具体而言为甘蔗渣、玉米秸秆、玉米芯、柳枝稷、稻秸、麦秸、树木、木材、废建材、报纸、废纸、纸浆等。这些含纤维素的生物质包含高分子芳香族化合物木质素、半纤维素等杂质，作为前处理，用酸、碱、加压热水等全部或部分地分解或除去木质素、半纤维素而得的物质也可以作为含纤维素的生物质使用。
用所述酶组合物由含纤维素的生物质制造糖液的方法没有特别限定。利用该酶组合物的糖液制造可以分批式进行，也可以连续式进行。另外，可以从含纤维素的生物质经酶处理而得的糖化液中分离所使用的酶组合物并回收。分离回收酶的方法没有特别限定，可以用超滤膜等过滤糖化液，在非透过侧回收。作为根据需要的过滤的前工序，可以预先从糖化液中除去固体成分。回收而得的酶组合物可以再次用于糖化反应。
实施例
(参考例1)蛋白质浓度测定方法
使用市售的蛋白质浓度测定试剂(Quick Start Bradford Protein assay，Bio-Rad制造)。在250μL的恢复到室温的蛋白质浓度测定试剂中添加5μL稀释了的源自丝状菌的纤维素酶溶液，室温下静置5分钟后用酶标仪测定595nm的吸光度。使用BSA作为标准品，对照标准曲线计算蛋白质浓度。
(参考例2)β-葡糖苷酶活性测定方法
在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃葡糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制造)的50mM乙酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，30℃下使其反应10分钟。其后加入10μL的2M碳酸钠混合均匀停止反应，测定405nm下的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性定义为1U。空白为在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃葡糖苷的50mM乙酸钠缓冲液90μL中加入10μL的2M碳酸钠混合均匀，其后添加酶稀释液10μL，30℃下使其反应30分钟。其后，测定405nm下的吸光度的增加。此时预先稀释酶液以使405nm下的吸光度不超过1。另外，对于标准曲线，以浓度为0.1mM、0.2mM、1mM、2mM的方式制备对硝基苯酚溶液，加入10μL代替酶稀释液，加入10μL的2M碳酸钠混合均匀使其显色，由测定的吸光度制成。
(参考例3)β-木糖苷酶活性测定方法
在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制造)的50mM乙酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，30℃下使其反应30分钟。其后加入10μL的2M碳酸钠混合均匀停止反应，测定405nm下的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性定义为1U。空白为在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃木糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL中加入10μL的2M碳酸钠混合均匀，其后添加酶稀释液10μL，30℃下使其反应30分钟。其后，测定405nm下的吸光度的增加。此时预先稀释酶液以使405nm下的吸光度不超过1。另外，对于标准曲线，以浓度为0.1mM、0.2mM、1mM、2mM的方式制备对硝基苯酚溶液，加入10μL代替酶稀释液，加入10μL的2M碳酸钠混合均匀使其显色，由测定的吸光度制成。
(参考例4)纤维二糖水解酶/内切葡聚糖酶活性测定方法
在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制造)的50mM乙酸缓冲液90μL中添加酶稀释液10μL，30℃下使其反应60分钟。其后加入10μL的2M碳酸钠混合均匀停止反应，测定405nm下的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性定义为1U。空白为在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃乳糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL中加入10μL的2M碳酸钠混合均匀，其后添加酶稀释液10μL，30℃下使其反应30分钟。其后，测定405nm下的吸光度的增加。此时预先稀释酶液以使405nm下的吸光度不超过1。另外，对于标准曲线，以浓度为0.1mM、0.2mM、1mM、2mM的方式制备对硝基苯酚溶液，加入10μL代替酶稀释液，加入10μL的2M碳酸钠混合均匀使其显色，由测定的吸光度制成。
(参考例5)糖浓度的测定
葡萄糖、纤维二糖用ACQUITY UPLC系统(Waters)在以下条件下定量分析。
以由葡萄糖、纤维二糖的标准品制作的标准曲线为基础来定量分析。纤维二糖是低于1g/L的值的情况为检测限以下。
柱：AQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1×100mm Column
分离法：HILIC
流动相：流动相A：80％乙腈、0.2％TEA(三乙胺)水溶液，流动相B：30％乙腈、0.2％TEA(三乙胺)水溶液，按照下述梯度。梯度为达到与下述时间相对应的混合比的线性梯度。
开始条件：(A99.90％，B0.10％)，开始2分钟后：(A96.70％，B3.30％)，开始3.5分钟后：(A95.00％，B5.00％)，开始3.55分钟后：(A99.90％，B0.10％)，开始6分钟后：(A99.90％，B0.10％)。
检测方法：ELSD(蒸发光散射检测器)
流速：0.3mL/min
温度：55℃
(参考例6)SDS-PAGE
SDS-PAGE使用15％聚丙烯酰胺凝胶e-PAGEL(アトー)。将该β-葡糖苷酶转化木霉株酶5μg与等体积的样品缓冲液Ez-apply(アトー)混合，95℃加热10分钟，作为电泳样品。分子量标志物使用精确分子量双色预染标准品(Precision Plus Protein Dual ColorStandards，生物ラッド)。电泳缓冲液为25mM的Tris、192mM的甘氨酸、0.1％SDS水溶液，在20mA恒定电流下进行90分钟电泳。电泳后的凝胶利用Bio-Safe Comassie G-250Stain(生物ラッド)染色，用纯水脱色。
(参考例7)通过培养木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶生产
用生理食盐水稀释木霉属(Trichoderma)丝状菌的孢子并使其为1.0×107/mL，将2.5mL该稀释孢子溶液接种到装在1L带挡板的烧瓶中的以表1中记载的组成构成的250mL培养液中，以28℃、160rpm的培养条件进行3天培养(预培养)。主培养是使250mL预培养液分别接种到装在5L体积的小罐中的表2所示的2.5L主培养液中，以28℃、700rpm、1vvm、pH5的培养条件进行4天培养。中和使用10％氨和1N硫酸。将培养开始4天后的培养液离心分离后，用超滤膜过滤上清，进行菌体除去，由此获得源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶。
[表1]
成分 每1L
D-葡萄糖 20g
5×Mandel’s<sup>**</sup> 200mL
10×酒石酸铵 100mL
玉米浆 15g
微量元素<sup>*</sup> 1mL
Tween80 0.5mL
消泡剂(PE-M) 1mL
*微量元素溶液包含0.3g/L H3BO3、1.3g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O、5g/L FeCl3·6H2O、2g/L CuSO4·5H2O、0.4g/L MnCl2·4H2O、10g/L ZnCl2。
**Mandel’s包含7g/L(NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4·7H2O。
[表2]
成分 每1L
生物质<sup>***</sup> 100g
5×Mandel’s<sup>**</sup> 200mL
玉米浆 25g
微量元素<sup>*</sup> 1mL
Tween80 0.5mL
消泡剂(PE-M) 1mL
*微量元素溶液包含0.3g/L H3BO3、1.3g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O、5g/L FeCl3·6H2O、2g/L CuSO4·5H2O、0.4g/L MnCl2·4H2O、10g/L ZnCl2。
**Mandel’s包含7g/L(NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4·7H2O。
***生物质使用Arbocel(注册商标)(J.Rettenmaier&Sohne)。生物质在混合其他成分、定容之后添加。
(参考例8)由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制作用测定方法
在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃葡糖苷(シグマアルドリッチジャパン社制造)、50mM乙酸缓冲液和0、4、8或20g/L的葡萄糖的混合液中添加酶液并制备成反应液合计为100μL，30℃下使其反应100分钟。其后加入10μL的2M碳酸钠混合均匀停止反应，测定405nm下的吸光度的增加。将每1分钟游离1μmol的对硝基苯酚的活性定义为1U。空白为在与上述反应液添加酶液前的混合液等量的含有1mM对硝基苯基-β-吡喃葡糖苷、50mM乙酸钠缓冲液和0、4、8或20g/L的葡萄糖的混合液中加入10μL的2M碳酸钠混合均匀后，添加酶液使空白的总液量为110μL，30℃下使其反应30分钟。其后，测定405nm下的吸光度的增加。
(实施例1)来自难培养性家白蚁共生生物单种细胞的RNA-Seq分析与β-葡糖苷酶候选序列的分析
从家白蚁肠道提取物中所含的难培养性的白蚁共生原生生物群中选定Pseudotrichonympha grassii细胞，用微毛细管分级，根据Sasagawa,Y.等等的Quartz-seq法进行基于单种细胞的RNA提取、逆转录、cDNA扩增、向库的转换、以及测序(Sasagawa,Y.etal.:Genome Biol.,14:R31,2013)。由测序的结果进行编码β-葡糖苷酶候选的碱基序列的选定。利用预测蛋白质的信号序列的工具SignalP(http：www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测所述碱基序列所编码的氨基酸序列的信号序列部分。结果获得了作为除去了信号序列的β-葡糖苷酶候选序列的序列号1所记载的氨基酸序列、作为编码该氨基酸序列的碱基序列的序列号2的碱基序列。用PROSITE调查序列号1所记载的氨基酸序列的家族，结果可知从序列号1的第259位到第276位具有相对于糖基水解酶家族3活性位点(Glycosylhydrolases family 3active site)的序列号5的氨基酸序列。
(实施例2)β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌的制作
通过人工基因合成服务(Genscript社)合成将实施例1中获得的序列号2(编码源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶候选基因的碱基序列)所记载的多核苷酸连接于pET14b的NdeI和XhoI限制酶位点而成的质粒。在此，上述质粒序列的构成以在转化体中表达在N末端添加了His-tag(组氨酸标签)、并具有序列号1所记载的氨基酸序列的β-葡糖苷酶的方式设计。将所述质粒转化大肠杆菌(Rossetta2(DE3))株。
(实施例3)β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌无细胞提取液的制作
将实施例2中制作的β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌接种到10mL的含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下进行一夜振荡培养(预培养)。作为主培养，将经预培养而得的菌体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下进行振荡培养直到波长600nm下的浊度OD600为0.8。其后，加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)并使最终浓度为0.1mM，进一步在16℃下培养一夜。培养后，将菌体通过离心分离回收，再悬浊于50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.6)中。将该溶液在冷却的同时进行超声波裂解，将该上清作为无细胞提取液通过离心分离回收。测定所述β-葡糖苷酶候选基因转化大肠杆菌的无细胞提取液的β-葡糖苷酶活性，结果无细胞提取液所含的蛋白质是每1mg为0.14U。另外，由1Lβ-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌的培养液获得的总β-葡糖苷酶活性为21.6U。作为比较对照，同样地制备不含β-葡糖苷酶候选基因的质粒的转化体的无细胞提取液，测定β-葡糖苷酶活性，结果没有检测到β-葡糖苷酶活性。即，仅由表达在序列号1所记载的氨基酸序列中添加了His-tag的多肽的无细胞提取液检测到β-葡糖苷酶活性，由此可知由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽是源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶序列。
(实施例4)β-葡糖苷酶突变体基因转化大肠杆菌的制作
与实施例2同样地通过人工基因合成服务(Genscript社)合成将与序列号2的序列同一性为53％的序列号7、和与序列号2的序列同一性为53％的序列号9所记载的多核苷酸分别连接于pET14b的NdeI和XhoI限制酶位点而成的质粒。在此，上述质粒序列的构成以分别在转化体中表达在N末端添加了His-tag、并具有序列号6和序列号8所记载的氨基酸序列的β-葡糖苷酶的方式设计。将所述质粒转化成大肠杆菌(Rossetta2(DE3))株。
(实施例5)β-葡糖苷酶突变体基因转化大肠杆菌无细胞提取液的制作
将实施例4中制作的β-葡糖苷酶突变体基因转化大肠杆菌接种到10mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下进行一夜振荡培养(预培养)。作为主培养，将经预培养而得的菌体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下进行振荡培养直到波长600nm下的浊度OD600为0.8。其后，加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)并使最终浓度为0.1mM，进一步在16℃下培养一夜。培养后，将菌体通过离心分离回收，再悬浊于50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.6)中。将该溶液在冰冷却的同时进行超声波裂解，将该上清作为无细胞提取液通过离心分离回收后，用超滤膜元件使提取液体积为十二分之一后，调查有无β-葡糖苷酶活性。作为比较对照，同样地制备不含β-葡糖苷酶候选基因的质粒的转化体的无细胞提取液，调查有无β-葡糖苷酶活性，结果没有检测到β-葡糖苷酶活性。即，仅由表达在与序列号1的序列同一性为88％的序列号6、和与序列号1的序列同一性为80％的序列号8所记载的氨基酸序列中添加了His-tag的多肽的无细胞提取液检测到β-葡糖苷酶活性，由此可知由序列号6和序列号8所记载的氨基酸序列组成的多肽具有β-葡糖苷酶活性。将β-葡糖苷酶活性测定的结果示于表3。
[表3]
Figure BDA0002366222640000201
(实施例6)包含β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌无细胞提取液和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的制备和木材原料粉末纤维素糖化
按照参考例7进行里氏木霉(Trichoderma reesei)的培养，制造源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶。制备将实施例3中制作的β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌的无细胞提取液与源自所述木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶混合成的酶组合物，用于糖化反应。所述酶组合物以每1mL糖化反应液的源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的蛋白浓度为0.2g/L、β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌的无细胞提取液的蛋白浓度为2.1g/L的方式混合。作为糖化对象的生物质，使用木材原料粉末纤维素Arbocel(注册商标)(J.Rettenmaier&Sohne)。糖化反应按以下方式进行。在2mL管中加入50mg分量的生物质，添加乙酸钠缓冲液(pH5.2)使得生物质终浓度为50mM，加入纯水使木材原料粉末纤维素的固体成分浓度在反应开始时为5重量％。进一步将所述酶组合物添加到所述制备液中，用区块恒温转子(Heat Block Rotator)以35℃的反应条件开始反应。将24小时糖化反应后的样品在10,000×g的条件下进行5分钟离心分离，分取上清，添加上清体积的十分之一量的1N氢氧化钠水溶液，停止糖化反应。用0.22μm的过滤器过滤该上清，按照参考例5将该滤液供于糖分析。作为比较对照，使用仅将不含β-葡糖苷酶基因的载体转化而得的大肠杆菌的无细胞提取液，与上述同样地与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶混合使得每1mL糖化反应液的蛋白浓度为2.1g/L，进行糖化反应、以及糖化上清的糖分析。此外，上述糖化反应中使用的包含β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌无细胞提取液和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的β-葡糖苷酶活性，是不含β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌无细胞提取液的源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的活性的2.6倍。糖化反应的结果是，添加了包含β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌无细胞提取液和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的情况，与添加了不含本发明的β-葡糖苷酶的源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的情况相比，葡萄糖蓄积量增加到约2.7倍，纤维二糖的蓄积量减少。将糖分析的葡萄糖和纤维二糖的结果示于表4。
[表4]
Figure BDA0002366222640000221
(实施例7)β-葡糖苷酶的His-tag粗纯化
进行能够在实施例3中确认酶活性的β-葡糖苷酶基因转化大肠杆菌的无细胞提取液的His-tag纯化。His-tag纯化使用His·Bind Purification Kit(メルクミリポア)按照说明书的分批法进行。按照参考例6进行纯化级分的SDS-PAGE，结果在溶出级分中在分子量75kDa～100kDa之间检测到最浓的带，确认了纯化出理论分子量为83.9kDa的带His-tag的β-葡糖苷酶。将SDS-PAGE凝胶的照片示于图1。使用凝胶过滤柱PD-10(GEヘルスケア)按照说明书的方法，将所述溶出级分的缓冲液交换成20mM的Tris-HCl(PH7.6)，将其作为粗纯化β-葡糖苷酶。测定该粗纯化β-葡糖苷酶的蛋白质浓度和β-葡糖苷酶活性，结果粗纯化β-葡糖苷酶所含的蛋白质是每1mg为3.50U。
(实施例8)包含粗纯化β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的制备和木材原料粉末纤维素糖化
按照参考例7进行里氏木霉(Trichoderma reesei)的培养，制造源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶。制备将实施例7中制作的粗纯化β-葡糖苷酶与源自所述木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶混合成的酶组合物，用于糖化反应。所述酶组合物以每1mL糖化反应液的源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的蛋白浓度为0.2g/L、粗纯化β-葡糖苷酶的蛋白浓度为0.017g/L的方式混合。除酶组合物使用粗纯化β-葡糖苷酶以外，与实施例6同样地进行糖化反应、以及糖化上清的糖分析。作为比较对照，仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，与上述同样地添加源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶使其每1mL糖化反应液的蛋白浓度为2.1g/L，进行糖化反应、以及糖化上清的糖分析。此外，上述糖化反应中使用的包含粗纯化β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的β-葡糖苷酶活性，是仅源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的活性的1.6倍。糖化反应的结果是，添加了在木霉属(Trichoderma)纤维素酶中混合有粗纯化β-葡糖苷酶的酶组合物的情况，与仅添加了源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的情况相比，葡萄糖蓄积量均增加到约1.8倍，纤维二糖的蓄积量减少。将糖分析的葡萄糖和纤维二糖的结果示于表5。
[表5]
Figure BDA0002366222640000231
(实施例9)β-葡糖苷酶基因转化木霉属(Trichoderma)丝状菌的制作
通过人工基因合成服务(Genscript社)合成将与序列号2所记载的碱基序列(编码源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶基因的碱基序列)的序列同一性为66％的序列号3所记载的多核苷酸连接于pET14b的NdeI和XhoI限制酶位点而成的质粒。由所述质粒通过PCR扩增序列号3的碱基序列部分，在源自里氏木霉(Trichodermareesei)的内切葡聚糖酶1启动子的下游，以框内(in-frame)方式连接与棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡糖苷酶的分泌信号序列连接，将该序列和转化体的潮霉素耐药基因克隆到pBI101质粒的T-DNA边界之间。将制作成的质粒的T-DNA边界之间的序列示于序列号4。在此，序列号4以将上述序列导入到宿主细胞的基因组中、并且表达、分泌由下述碱基号978～3161(序列号3)所编码的具有序列号1所记载的氨基酸序列的β-葡糖苷酶的方式设计。下述显示序列号4的构成。
LB＝左T-DNA边界：碱基号1～26
Pegl1＝源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的内切葡聚糖酶1启动子：碱基号27～920
Sbgl＝源自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡糖苷酶分泌信号：碱基号921～977
bgl＝源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶：碱基号978～3161(序列号3)
Tegl1＝源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的内切葡聚糖酶1终止子：碱基号3162～4019
PamdS＝源自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的乙酰胺酶启动子：碱基号4020～5027
hygR＝源自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的潮霉素B磷酸转移酶：碱基号5028～6065
TamdS＝源自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的乙酰胺酶终止子：碱基号6066～6786
RB＝右T-DNA边界：碱基号6787～6810。
将制作的质粒导入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1株中，使该转化农杆菌感染里氏木霉(Trichoderma reesei)，获得β-葡糖苷酶转化木霉株。利用农杆菌(Agrobacterium)的木霉的转化以Marcel等的方法(Marcel,et al.2006,NatBiotechnol 16:839-842)为基础，将用包含葡萄糖和乙酰丁香酮的诱导培养基(Inductionmedium，IM)液体培养基培养了8小时的该转化农杆菌，与里氏木霉(Trichoderma reesei)的孢子溶液混合，在装载在诱导培养基(Induction medium，IM)固体培养基上的玻璃纸上培养3天后，将玻璃纸转移到包含头孢噻肟和潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂板(选择培养基)上，挑选在选择培养基中生长的集落，再将接种在选择培养基上的纯化培养重复2次，获得转化木霉株。
(实施例10)利用β-葡糖苷酶基因转化木霉属(Trichoderma)丝状菌的培养的酶组合物的制造
将实施例9中制作的β-葡糖苷酶基因转化木霉属(Trichoderma)丝状菌用与参考例7同样的方法培养，培养开始4天后将培养液离心分离后，用超滤膜过滤上清，进行菌体除去，由此制备包含由木霉属(Trichoderma)丝状菌表达的本发明的β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物。按照参考例1测定所述酶组合物的蛋白质浓度，按照参考例6进行SDS-PAGE，进行表达蛋白的确认。作为比较对照，仅使用通过培养非转化木霉属(Trichoderma)丝状菌得到的源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，同样地进行培养、上清回收、培养上清过滤以及SDS-PAGE。SDS-PAGE的结果是，所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物中，本发明的β-葡糖苷酶的带作为比能够由SDS-PAGE确认的酶组合物的带合计的十分之一多的带而被观察到，能够确认β-葡糖苷酶基因转化木霉属(Trichoderma)丝状菌中大量表达本发明的β-葡糖苷酶。将SDS-PAGE凝胶的照片示于图2。
进一步按照参考例2进行所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的β-葡糖苷酶活性测定。结果所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的β-葡糖苷酶活性是仅源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的β-葡糖苷酶活性的2.0倍。另外可知，由1L所述β-葡糖苷酶基因转化木霉属(Trichoderma)丝状菌的培养液得到的总β-葡糖苷酶活性为约1.80×103U，木霉属(Trichoderma)丝状菌中的β-葡糖苷酶表达与实施例3的大肠杆菌中的β-葡糖苷酶表达的情况相比，由同体积的培养液获得了约850倍的β-葡糖苷酶，本发明的β-葡糖苷酶的生产性高。
(实施例11)利用包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的微晶纤维素糖化
将实施例10中制备的包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物用于糖化反应。作为糖化对象的生物质，使用作为微晶纤维素的Cellulosemicrocrystalline(Merck社制造)。除使用生物质以外，与实施例6同样地进行糖化反应和糖化上清的糖分析。酶的添加量为8mg/g-生物质。作为比较对照，仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，同样地进行糖化反应和糖化上清的糖分析。结果使用所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的糖化，与仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的糖化相比，葡萄糖蓄积量增加到约1.6倍，纤维二糖的蓄积量减少。将糖分析的葡萄糖和纤维二糖的结果示于表6。
[表6]
Figure BDA0002366222640000261
(实施例12)利用包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的木材原料粉末纤维素糖化
将实施例10中制备的包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物用于糖化反应。作为糖化对象的生物质，使用木材原料粉末纤维素Arbocel(注册商标)(J.Rettenmaier&Sohne)。除使用生物质以外，与实施例11同样地进行糖化反应和糖化上清的糖分析。作为比较对照，仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，同样地进行糖化和糖化上清的糖分析。结果使用所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的糖化，与仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的糖化相比，葡萄糖蓄积量增加到约1.8倍，没有检测到纤维二糖的蓄积。将糖分析的葡萄糖和纤维二糖的结果示于表7。
[表7]
Figure BDA0002366222640000271
(实施例13)利用包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的碱处理甘蔗渣糖化
将实施例10中制备的包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物用于糖化反应。作为糖化对象的生物质，使用进行了碱处理(前处理)的甘蔗渣。除使用生物质以外，与实施例11同样地进行糖化反应和糖化上清的糖分析。作为比较对照，仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，同样地进行糖化和糖化上清的糖分析。结果使用所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的糖化，与仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的糖化相比，葡萄糖蓄积量增加到约1.8倍，没有检测到纤维二糖的蓄积。将糖分析的葡萄糖和纤维二糖的结果示于表8。
[表8]
Figure BDA0002366222640000272
(实施例14)包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的糖化上清残余成分确认
将实施例10中制备的包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物用于糖化反应。作为糖化对象的生物质，使用木材原料粉末纤维素Arbocel(注册商标)(J.Rettenmaier&Sohne)、碱处理甘蔗渣和没有进行前处理的无处理甘蔗渣。以35℃的反应条件与实施例11同样地进行糖化反应，将24小时糖化反应后的样品在10,000×g的条件下进行5分钟离心分离，回收糖化上清。分取该糖化上清3.5μL，与等量的样品缓冲液混合，95℃加热10分钟，按照参考例6进行SDS-PAGE。为了确认供于糖化的酶的带，将与糖化反应液中稀释成同浓度的所述酶组合物也与所述糖化上清同样地进行SDS-PAGE。作为比较对照，仅使用通过培养非转化木霉属(Trichoderma)丝状菌得到的源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，同样地进行糖化和糖化上清的回收、SDS-PAGE。结果木材原料粉末纤维素糖化、碱处理甘蔗渣糖化和无处理甘蔗渣糖化的任何情况下，所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的糖化上清中，都清楚观察到本发明的β-葡糖苷酶的带，确认了本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的其它多种纤维素酶成分相比，更易于作为糖化上清回收。另外，在木材原料粉末纤维素糖化中，在包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的糖化上清中，与仅为源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的糖化上清中相比，可更多观察到源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的多种纤维素酶成分的带，确认了将本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶一起作为酶组合物使用时，源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶也易于作为糖化上清回收。将SDS-PAGE凝胶的照片示于图3。
(实施例15)包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的木材原料粉末纤维素糖化上清残留活性测定
对于实施例14中回收的所述酶组合物的木材原料粉末纤维素糖化上清，按照参考例2、3和4进行酶活性测定。对于实施例14中与糖化反应液中稀释成同浓度的所述酶组合物，也同样地进行酶活性测定。将与糖化反应液中稀释成同浓度的所述酶组合物的酶活性设为100％时的糖化上清的酶活性的比例作为糖化上清中的残留活性示于表9。由β-葡糖苷酶残留活性的结果确认了，本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的β-葡糖苷酶相比，更易于作为糖化上清回收。另外，由β-木糖苷酶残留活性以及纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶残留活性的结果确认了，将本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶一起作为酶组合物使用时，源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶易于作为糖化上清回收。
[表9]
Figure BDA0002366222640000291
(实施例16)包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的无处理甘蔗渣糖化上清残留活性测定
对于实施例14中回收的所述酶组合物的无处理甘蔗渣糖化上清，按照参考例2、3和4进行酶活性测定。对于实施例14中与糖化反应液中稀释成同浓度的所述酶组合物，也同样地进行酶活性测定。将与糖化反应液中稀释成同浓度的所述酶组合物的酶活性设为100％时的糖化上清的酶活性的比例作为糖化上清中的残留活性示于表10。由β-葡糖苷酶残留活性的结果确认了，本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的β-葡糖苷酶相比，更易于作为糖化上清回收。另外，由β-木糖苷酶残留活性以及纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶残留活性的结果确认了，将本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶一起作为酶组合物使用时，源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶易于作为糖化上清回收。
[表10]
Figure BDA0002366222640000301
(实施例17)包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的碱处理甘蔗渣糖化上清残留活性测定
对于实施例14中回收的所述酶组合物的碱处理甘蔗渣糖化上清，按照参考例2、3和4进行酶活性测定。对于实施例14中与糖化反应液中稀释成同浓度的所述酶组合物，也同样地进行酶活性测定。将与糖化反应液中稀释成同浓度的所述酶组合物的酶活性设为100％时的糖化上清的酶活性的比例作为糖化上清中的残留活性示于表11。由β-葡糖苷酶残留活性的结果确认了，本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的β-葡糖苷酶相比，更易于作为糖化上清回收。另外，由β-木糖苷酶残留活性以及纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶残留活性的结果确认了，将本发明的β-葡糖苷酶与源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶一起作为酶组合物使用时，源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶易于作为糖化上清回收。
[表11]
Figure BDA0002366222640000311
(比较例1)源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶基因转化木霉属(Trichoderma)丝状菌的制作和通过培养该转化体的酶组合物的制造
与实施例9同样地制作以将序列号11所记载的碱基序列(编码源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶基因的碱基序列)导入到宿主细胞的基因组中、并且表达、分泌具有序列号10所记载的氨基酸序列的β-葡糖苷酶的方式设计的质粒。将该质粒导入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1株中，使该转化农杆菌感染里氏木霉(Trichoderma reesei)，获得β-葡糖苷酶转化木霉株。与实施例10同样地将上述制作的源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶基因转化木霉属(Trichoderma)丝状菌用与参考例7同样的方法培养，将培养开始4天后的培养液离心分离后，用超滤膜过滤上清，进行菌体除去，由此制备包含由木霉属(Trichoderma)丝状菌表达的源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物。按照参考例6进行所述酶组合物的SDS-PAGE，进行表达蛋白的确认。作为比较对照，仅使用通过培养非转化木霉属(Trichoderma)丝状菌得到的源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，同样地进行培养、上清回收、培养上清过滤和SDS-PAGE。SDS-PAGE的结果确认了源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶表达。将SDS-PAGE凝胶的照片示于图4。按照参考例8，进行该包含源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物的由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制作用测定，将结果用于与实施例18比较。
(实施例18)由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制作用测定方法
按照参考例8，进行实施例10中制备的包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物以及实施例5中制作的β-葡糖苷酶突变体基因转化大肠杆菌无细胞提取液的酶组合物的由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制作用测定。作为比较对照，仅使用源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶，同样地测定由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制作用。将设反应液中的葡萄糖浓度为0g/L的条件的β-葡糖苷酶活性为1进行标准化时的、在葡萄糖存在下的相对活性值示于图5。另外，将设反应液中的葡萄糖浓度为0g/L的条件的β-葡糖苷酶活性为1进行标准化时的、葡萄糖为8g/L的条件下的相对活性值示于表12，葡萄糖为20g/L的条件下的相对活性值示于表13。结果所述包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物以及β-葡糖苷酶突变体基因转化大肠杆菌无细胞提取液，与仅为源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶以及比较例1的包含源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物相比较，由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性的降低均更小。即，本发明的包含β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物以及β-葡糖苷酶突变体基因转化大肠杆菌无细胞提取液，均与仅为源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶以及比较例1的包含源自曲霉属(Aspergillus)丝状菌的β-葡糖苷酶和源自木霉属(Trichoderma)丝状菌的纤维素酶的酶组合物相比较，更不易受到由葡萄糖导致的β-葡糖苷酶活性抑制。
[表12]
Figure BDA0002366222640000331
[表13]
Figure BDA0002366222640000341
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过直接引用而包含在本说明书中。
Figure IDA0002366222710000011
Figure IDA0002366222710000021
Figure IDA0002366222710000031
Figure IDA0002366222710000041
Figure IDA0002366222710000051
Figure IDA0002366222710000061
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Figure IDA0002366222710000081
Figure IDA0002366222710000091
Figure IDA0002366222710000101
Figure IDA0002366222710000111
Figure IDA0002366222710000121
Figure IDA0002366222710000131
Figure IDA0002366222710000141
Figure IDA0002366222710000151
Figure IDA0002366222710000161
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Figure IDA0002366222710000181
Figure IDA0002366222710000191
Figure IDA0002366222710000201
Figure IDA0002366222710000211
Figure IDA0002366222710000221
Figure IDA0002366222710000231
Figure IDA0002366222710000241
Figure IDA0002366222710000251
Figure IDA0002366222710000261
Figure IDA0002366222710000271
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Figure IDA0002366222710000301
Figure IDA0002366222710000311
Figure IDA0002366222710000321
Figure IDA0002366222710000331
Figure IDA0002366222710000341
Figure IDA0002366222710000351
Figure IDA0002366222710000361
Figure IDA0002366222710000371
Figure IDA0002366222710000381
Figure IDA0002366222710000391
Figure IDA0002366222710000401
Figure IDA0002366222710000411
Figure IDA0002366222710000421
Figure IDA0002366222710000431
Figure IDA0002366222710000441
Figure IDA0002366222710000451
Figure IDA0002366222710000461
Figure IDA0002366222710000471
Figure IDA0002366222710000481
Figure IDA0002366222710000491

Claims (13)

1.下述(A)～(C)中的任一多肽，
(A)由序列号1所记载的氨基酸序列组成的多肽，
(B)由在序列号1所记载的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有β-葡糖苷酶活性的多肽，
(C)由与序列号1所记载的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列组成、且具有β-葡糖苷酶活性的多肽。
2.下述(a)～(d)中的任一多核苷酸，
(a)由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸，
(b)由在序列号2所记载的碱基序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个碱基的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(c)由与序列号2所记载的碱基序列具有至少60％的序列同一性的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(d)编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸。
3.下述(a)～(d)中的任一多核苷酸，
(a)由序列号2所记载的碱基序列组成的多核苷酸，
(b)由在序列号2所记载的碱基序列中替换、缺失、插入和/或添加了1个或几个碱基的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(c)由与序列号2所记载的碱基序列具有至少50％的序列同一性的碱基序列组成、且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸，
(d)编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸。
4.表达载体，包含权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.转化体，具有权利要求2或3所述的多核苷酸或权利要求4所述的表达载体。
6.转化木霉属(Trichoderma)丝状菌，具有权利要求2或3所述的多核苷酸或权利要求4所述的表达载体。
7.酶组合物的制造方法，包括培养权利要求5所述的转化体或权利要求6所述的转化木霉属(Trichoderma)丝状菌的工序。
8.糖液的制造方法，包括制造权利要求7所述的酶组合物的工序，利用由该工序得到的酶组合物，由含有纤维素的生物质制造糖液。
9.源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶，其特征在于，设葡萄糖不存在下的β-葡糖苷酶的活性为1时，在葡萄糖浓度为8g/L的条件下的β-葡糖苷酶活性为0.5以上。
10.酶组合物，包含源自伪披发虫属(Pseudotrichonympha)原生生物的β-葡糖苷酶、和源自丝状菌的纤维素酶。
11.根据权利要求10所述的酶组合物，其特征在于，所述丝状菌是木霉属(Trichoderma)丝状菌。
12.糖液的制造方法，利用权利要求10或11所述的酶组合物，由含有纤维素的生物质制造糖液。
13.根据权利要求12所述的糖液的制造方法，包括从所述糖液中回收权利要求10或11所述的酶组合物的工序。
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