BR112020003088A2 - polipeptídeo, polinucleotídeos, vetor de expressão, transformante, fungo filamentoso transformado, métodos para produzir uma composição enzimática e para produzir uma solução de açúcar, ß-glucosidase e composição enzimática - Google Patents

Abstract

  O objetivo da presente invenção é separar e fornecer um gene ß-glucosidase que possui o efeito de promover de maneira eficiente a sacarificação na hidrólise de biomassa contendo celulose a partir de uma comunidade de protistas simbióticos dificilmente cultivável de Coptotermes formosanus, e a presente invenção refere-se de maneira específica à ß-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1.

Description

“POLIPEPTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEOS, VETOR DE EXPRESSÃO, TRANSFORMANTE, FUNGO FILAMENTOSO TRANSFORMADO, MÉTODOS

PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA E PARA PRODUZIR UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR, β-GLUCOSIDASE E COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma nova β-glucosidase, uma composição enzimática contendo a β-glucosidase e um método para produzir uma solução de açúcar a partir de biomassa contendo celulose utilizando as mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Estudos consideráveis foram feitos no país e no exterior sobre tentativas de produzir por vias fermentativas uma matéria-prima de biocombustível ou biopolímero como recurso alternativo ao petróleo bruto, degradando a biomassa renovável contendo celulose e utilizando um açúcar obtido a partir dela.

[003] Embora existam vários métodos para sacarificar a celulose, os métodos de sacarificação enzimática com menor quantidade de energia e maior rendimento de açúcar tornaram-se a principal fonte para desenvolvimento.

Uma pluralidade de espécies enzimáticas está envolvida na degradação enzimática da celulose, e elas são classificadas aproximadamente em três espécies, celobiohidrolase, endoglucanase e β-glucosidase. A celobiohidrolase é uma enzima que se caracteriza pela hidrólise da celulose a partir de sua porção final e é capaz de degradar uma região cristalina da celulose. Por outro lado, a endoglucanase é uma enzima que se caracteriza pela hidrólise de uma cadeia molecular de celulose a partir de sua região interna e promove uma diminuição no peso molecular através da degradação da celulose.

[004] A β-glucosidase é uma enzima que degrada principalmente a celobiose de dois açúcares produzidos pela ligação β-1,4 de glicose e catalisa a produção de glicose como um produto final da degradação, e é uma enzima essencial para obter glicose útil suficientemente como matéria-prima para a fermentação. Além disso, sabe-se que a inibição da reação da celobiohidrolase ou endoglucanase é causada pelo acúmulo de celobiose produzida pela degradação da celulose. Ou seja, a β-glucosidase é capaz de reduzir significativamente o acúmulo de celobiose produzida pela degradação da celulose, e assim, tem um efeito de melhorar significativamente a eficiência de degradação da celulose.

[005] Os fungos filamentosos são conhecidos como micro- organismos que produzem celulase. Entre os fungos filamentosos, o gênero Trichoderma é conhecido por produzir extracelularmente grandes quantidades de endo- e exocelulase em uma solução de cultura. A celulase derivada do Trichoderma é a mais frequentemente utilizada para degradação enzimática da biomassa contendo celulose. Entretanto, parte da β-glucosidase produzida por Trichoderma está localizada na parede celular bacteriana (Literatura Não Patentária 1), e a celulase preparada a partir de uma solução de cultura de Trichoderma exibe uma desvantagem, pois a quantidade e a atividade da β- glucosidase nela contida não foram adequadas. Além disso, sabe-se que muitas β-glucosidases derivadas de fungos filamentosos sofrem inibição da atividade da β-glucosidase pela glicose; e, portanto, na sacarificação de biomassa contendo celulose, elas têm uma desvantagem na qual a glicose produzida em uma solução de reação sacarificada por degradação da celulose causa inibição da atividade da β-glucosidase, impedindo, assim, um aumento na quantidade acumulada de glicose na solução de reação sacarificada (Literatura Não Patentária 2).

[006] Assim, existe uma busca por uma β-glucosidase eficiente que possua um efeito de implementar a sacarificação eficiente na hidrólise de biomassa contendo celulose, e o isolamento da β-glucosidase derivada de micro- organismo tem sido convencionalmente realizada.

[007] Sabe-se que uma comunidade simbiótica protista de cupins que utiliza apenas madeira como fonte de nutrientes tem uma eficiência de degradação da celulose extremamente alta. Entretanto, as análises dos protistas simbióticos não foram realizadas porque são dificilmente cultiváveis. Mesmo nos últimos anos, assistimos a um pequeno volume de estudos sobre protistas simbióticos e celulase (Literatura Patentária 1), e até agora não foi encontrado nenhum caso sobre a obtenção de um gene β-glucosidase derivado de um protista simbiótico de cupins.

LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA PATENTÁRIA

[008] Literatura patentária 1: Publicação de Patente Japonesa JP 2003-70475.

LITERATURA NÃO PATENTÁRIA

[009] Literatura não patentária 1: Messner, R et al., “Evidence for a single, specific β-glucosidase in cell wall from Trichoderma QM9414”, Enzyme Microb. Technol., 1990, Vol. 21, páginas 685 a 690.

[010] Literatura não patentária 2: Andric, P, et al., “Reactor design for minimizing product inhibition during enzymatic lignocellulose hydrolysis: I.

Significance and mechanism of cellobiose and glucose inhibition on cellulolytic enzymes”, Biotechnol. Adv., 2010, Vol. 28, págs. 308 a 324.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[011] O problema a ser resolvido pela presente invenção é separar e fornecer, a partir de uma comunidade protista simbiótica dificilmente cultivável de Coptotermes formosanus, um gene β-glucosidase que possui um efeito de promoção eficiente de sacarificação na hidrólise da biomassa contendo celulose.

SOLUÇÃO DO PROBLEMA

[012] Para resolver o problema acima, os presentes inventores fizeram estudos intensivos e descobriram que uma nova β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha pode ser aplicada à degradação de biomassa contendo celulose por: observação da expressão de um gene de a partir de uma pequena quantidade de RNA de um protista simbiótico dificilmente cultivável de Coptotermes formosanus usando a análise de transcriptoma de célula única; obtenção de uma sequência candidata de β-glucosidase a partir da informação de sequência de uma biblioteca de cDNA obtida; investigação dos efeitos de um transformante contendo a sequência candidata de β-glucosidase na atividade de β-glucosidase e sacarificação de biomassa contendo celulose; e seleção de uma sequência possuindo atividade de β-glucosidase, completando assim a presente invenção.

[013] Ou seja, a presente invenção inclui o seguinte: (1) Um polipeptídeo de qualquer um dos seguintes itens de (A) a (C): (A) um polipeptídeo que é uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1; (B) um polipeptídeo obtido por substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e possuindo atividade de β-glucosidase; e (C) um polipeptídeo possuindo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e possuindo atividade de β-glucosidase.

(2) Um polinucleotídeo que é qualquer um dos seguintes de (a) a (d): (a) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2;

(b) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos obtida por substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou vários nucleotídeos na sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2 e codificando um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2, e que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; e (d) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com (1).

(3) Um polinucleotídeo que é qualquer um dos seguintes de (a) a (d): (a) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2; (b) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos obtida por substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou vários nucleotídeos na sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2 e codificando um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2, e que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; e (d) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com (1).

(4) Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo de acordo com (2) ou (3).

(5) Um transformante compreendendo o polinucleotídeo de acordo com (2) ou (3) ou o vetor de expressão de acordo com (4).

(6) Um fungo filamentoso transformado do gênero Trichoderma que compreende o polinucleotídeo de acordo com (2) ou (3), ou o vetor de expressão de acordo com (4).

(7) Um método para produzir uma composição enzimática que compreende a etapa de cultura do transformante de acordo com (5) ou do fungo filamentoso transformado do gênero Trichoderma de acordo com (6).

(8) Um método para produzir uma solução de açúcar a partir de uma biomassa contendo celulose, compreendendo a etapa de produção da composição enzimática de acordo com (7), em que a composição enzimática obtida pela etapa é usada para produzir a solução de açúcar.

(9) Uma β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha, em que uma atividade da β-glucosidase é 0,5 ou mais sob uma condição de uma concentração de glicose de 8 g/L quando uma atividade de β-glucosidase na ausência da glicose é tomada como unidade.

(10) Uma composição enzimática compreendendo uma β- glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha e uma celulase derivada de um fungo filamentoso. (11) A composição enzimática de acordo com (10), em que o fungo filamentoso é um fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

(12) Um método para produzir uma solução de açúcar a partir de uma biomassa contendo celulose usando a composição enzimática de acordo com (10) ou (11).

(13) O método para produzir uma solução de açúcar de acordo com [12], compreendendo a etapa de recuperação da composição enzimática de acordo com [10] ou [11] a partir da solução de açúcar.

[014] O relatório descritivo incorpora o conteúdo divulgado no Pedido de Patente JP 2017-165787, com base no qual este pedido reivindica a prioridade.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[015] A presente invenção pode fornecer uma β-glucosidase que tem um efeito de promover a sacarificação eficientemente na hidrólise de biomassa contendo celulose. A β-glucosidase da presente invenção pode ser adequadamente usada para a produção de uma solução de açúcar por hidrólise de biomassa contendo celulose.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] A Figura 1 é uma fotografia de SDS-PAGE da β-glucosidase (β-glucosidase incluindo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1) de acordo com a presente invenção, que foi expressa em E. coli e purificada no Exemplo 7.

[017] A Figura 2 é uma fotografia de SDS-PAGE da β-glucosidase (β-glucosidase incluindo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1) de acordo com a presente invenção, que foi expressa no fungo filamentoso do gênero Trichoderma no Exemplo 10.

[018] A Figura 3 é uma fotografia de SDS-PAGE de sobrenadantes sacarificados no Exemplo 14.

[019] A Figura 4 é uma fotografia de SDS-PAGE da β-glucosidase derivada do fungo filamentoso Aspergillus (β-glucosidase incluindo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10) expressa no fungo filamentoso do gênero Trichoderma no Exemplo Comparativo 1.

[020] A Figura 5 é um gráfico dos resultados de medição da ação inibidora da glicose sobre a atividade da β-glucosidase na β-glucosidase da presente invenção e na β-glucosidase mutante da presente invenção no Exemplo 18.

DESCRIÇÃO DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

[021] A seguir, os exemplos de realização da presente invenção serão descritos em detalhes.

[022] Na presente invenção, “β-glucosidase” significa uma enzima que catalisa uma reação para degradação por hidrólise de uma ligação β- glucosídeo de açúcar. Na presente invenção, um método para medir uma atividade β-glucosidase utiliza uma reação utilizando p-nitrofenil-β-D- glucopiranosídeo (pNP-Glc) como um substrato. Especificamente, um líquido de enzima é adicionado a uma solução de substrato preparada por dissolução de pNP-Glc em solução tampão de 50 mM de ácido acético - acetato de sódio (pH 5,0) e a mistura é reagida a 30ºC durante 10 minutos; e a reação é parada misturando bem com carbonato de sódio 2M em uma quantidade equivalente a um décimo do volume do sistema de reação para medir um aumento da absorbância a 405 nm. Quando o p-nitrofenol é liberado e a absorbância a 405 nm é aumentada após a reação acima, determina-se que a atividade da β- glucosidase está presente.

[023] A β-glucosidase da presente invenção é caracterizada por ser derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha, e exemplos específicos dos mesmos incluem um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 e um homólogo do mesmo.

[024] Mais especificamente, a β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha da presente invenção é qualquer um dos polipeptídeos dos seguintes (A) a (C).

(A) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1; (B) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos obtida substituindo, deletando, inserindo e/ou adicionando um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e possuindo atividade de β-glucosidase; e (C) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e possuindo atividade de β-glucosidase.

[025] Contanto que um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 ou um homólogo do mesmo possa ser preparado por um método conhecido e o polipeptídeo possua atividade β-glucosidase, o método para prepará-lo não é particularmente limitado. O polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 ou um homólogo do mesmo pode ser extraído de um produto natural por um método conhecido ou preparado por um método conhecido como um método de síntese de peptídeos; ou pode ser preparado por tecnologia de recombinação genética usando um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo.

[026] Desde que o homólogo do polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 seja um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase, ele pode ser, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos obtida por substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou vários aminoácidos, preferencialmente de 1 a 10 aminoácidos, mais preferencialmente de 1 a 5 aminoácidos, e ainda preferencialmente 1 ou 2 aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1.

[027] Além disso, desde que o homólogo do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 1 seja um polipeptídeo com atividade de β- glucosidase, ele pode ser um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1. Exemplos de um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 inclui um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 6. Além disso, exemplos de um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 inclui um polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 8. Observe que em relação à identidade de sequência entre a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos de uma β-glucosidase conhecida, por exemplo, β-glucosidase I (BGL I) derivada de Trichoderma reesei, compreendendo 744 aminoácidos, sua identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 é de 29%.

[028] Contanto que o homólogo do polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 seja um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase, ele pode ser um polipeptídeo derivado de um protista do gênero Pseudotrichonympha, preferencialmente Pseudotrichonympha hertwigi, Pseudotrichonympha paulistana, ou Pseudotrichonympha grassii do gênero Pseudotrichonympha.

[029] A β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha da presente invenção pertence preferencialmente a uma família GH3. Na presente invenção, “família GH3” significa um polipeptídeo que inclui o sítio ativo da família das Glicosil-hidrolases 3. O sítio ativo da família das Glicosil-hidrolases 3 é definido pela seguinte sequência de aminoácidos que compreende 18 aminoácidos. Ou seja, o sítio ativo da família Glicosil hidrolases 3 é definido por uma sequência de 18 aminoácidos: aabxcxxxxGdefgDxxh que compreende os seguintes aminoácidos a, b, c, d, e, f, g, h e x, e aminoácidos G (glicina) e D (ácido aspártico), em que a representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer um dentre L (leucina), I (isoleucina), V (valina) e M (metionina); b representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer um dos aminoácidos K (lisina) e R (arginina); c representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer um dos aminoácidos E (ácido glutâmico), Q (glutamina), K (lisina), R (arginina) e D (ácido aspártico); d representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer dos aminoácidos L (leucina), I (isoleucina), V (valina), M (metionina), F (fenilalanina), T (treonina) e C (cisteína); e representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer um dos aminoácidos L (leucina), I (isoleucina), V (valina) e T (treonina); f representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer um dos aminoácidos L (leucina), I (isoleucina), V (valina), M (metionina) e F (fenilalanina); g representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer um dos aminoácidos S (serina) e T (treonina); h representa um aminoácido selecionado a partir de qualquer um dos aminoácidos S (serina), G (glicina), A (alanina), D (ácido aspártico), N (asparagina), I (isoleucina) e T (treonina); e x representa qualquer aminoácido.

Observe que o sítio ativo da família das glicosil-hidrolases 3 em um polipeptídeo pode ser facilmente investigado por qualquer pessoa no website PROSITE (Banco de dados de domínios de proteínas, famílias e sítios funcionais) (http://prosite.expasy.org/) como um banco de dados (Christian, et al., 2002, Briefings in Bioinfomatics, Vol. 3, No. 3, páginas 265 a 274). O polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, 6 ou 8 pertence à família GH3.

[030] A β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha da presente invenção é preferencialmente menos provável de sofrer inibição pela glicose na atividade da β-glucosidase. Especificamente, quando a atividade da β-glucosidase na ausência de glicose é utilizada como unidade, a atividade da β-glucosidase sob uma condição de uma concentração de glicose de 8 g/L (ou na presença de 8 g/L de glicose) é preferencialmente de 0,5 ou mais, mais preferencialmente de 0,6 ou mais, mais preferencialmente de 0,7 ou mais, mais preferencialmente de 0,8 ou mais, mais preferencialmente de 0,9 ou mais, mais preferencialmente de 1,0 ou mais, mais preferencialmente de

1,1 ou mais, mais preferencialmente de 1,2 ou mais, mais preferencialmente de 1,3 ou mais, e, em particular, é preferencialmente de 1,4 ou mais. Além disso, além da atividade da β-glucosidase sob a condição de concentração de glicose de 8 g/L, quando a atividade da β-glucosidase na ausência de glicose é tomada como unidade, a atividade da β-glucosidase sob uma condição de glicose na concentração de 20 g/L (ou na presença de 20 g/L de glicose) é preferencialmente de 0,5 ou mais, mais preferencialmente de 0,6 ou mais e, em particular, preferencialmente de 0,7 ou mais. O método utilizado na presente invenção para a medição da atividade da β-glucosidase é o mesmo que o método descrito acima, exceto que 8 g/L ou 20 g/L de glicose é adicionada no momento da medição; e os resultados obtidos são utilizados.

[031] A β-glucosidase, que é menos provável de sofrer inibição da atividade da β-glucosidase pela glicose, é preferível, pois ela pode manter uma alta atividade da β-glucosidase, mesmo quando a glicose é produzida em uma solução de reação sacarificada por degradação da celulose na sacarificação de biomassa contendo celulose.

[032] Desde que o polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2 ou um homólogo deste seja um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 ou no seu homólogo, sua origem não é particularmente limitada. O “polinucleotídeo” utilizado na presente invenção é preferencialmente DNA, embora possa ser originado de qualquer dentre cDNA, DNA genômico, DNA sintético, mRNA, RNA sintético ou RNA replicon. Além disso, ele pode ser um ácido nucleico de fita simples ou de fita dupla possuindo uma cadeia complementar da mesma. Além disso, ele pode incluir um derivado de nucleotídeo natural ou artificial.

[033] Contanto que o homólogo do polinucleotídeo representado pela SEQ ID NO: 2 seja um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase, ele pode ser, por exemplo, um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos obtida por substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou vários nucleotídeos, preferencialmente de 1 a 40 nucleotídeos, mais preferencialmente de 1 a 30 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente de 1 a 20 nucleotídeos, em particular preferencialmente de 1 a 10 nucleotídeos, e de maneira otimamente preferida de 1 a 5 nucleotídeos na sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2.

[034] Além disso, desde que o homólogo do polinucleotídeo representado pela SEQ ID NO: 2 seja o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase, ele pode ser um polinucleotídeo hibridizável, sob uma condição estringente, com o todo ou parte do polinucleotídeo que compreende a sequência nucleotídica representada pela SEQ ID NO: 2 ou uma cadeia complementar da mesma. Um “polinucleotídeo hibridizável sob uma condição estringente” usado na presente invenção é um polinucleotídeo que é hibridizável ao ser usado como sonda, por exemplo, um ou mais polinucleotídeos selecionados a partir de pelo menos 20, de preferência pelo menos 25, mais preferencialmente pelo menos 30 sequências contínuas da sequência nucleotídica original utilizando uma tecnologia de hibridização conhecida (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons; Seções 6.3–6.4). A condição estringente mencionada na presente invenção pode ser implementada por lavagens usando solução SSC (salina-citrato de sódio) concentrada de 0,1 a 2 vezes (concentração de 1 vezes da composição da solução SSC: cloreto de sódio 150 mM e citrato de sódio 15 mM), por exemplo, em a presença de 50% de formamida a uma temperatura de hibridização de 37ºC, 42ºC como uma condição mais estringente (rigorosa), e 65ºC como uma outra condição mais estringente.

[035] Além disso, desde que o homólogo do polinucleotídeo representado pela SEQ ID NO: 2 seja um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase, ele pode ser um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda preferencialmente pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência em relação à sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2. Um exemplo de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos com 66% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 inclui um polinucleotídeo representado pela SEQ ID NO: 3. Além disso, exemplos de polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos com 53% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 incluem os polinucleotídeos representados pela SEQ ID NO: 7 ou 9.

[036] O termo “identidade” usado no presente relatório descritivo representa um grau de concordância entre duas sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas diferentes quando elas são submetidas a comparação de alinhamento usando um programa de alinhamento de sequência, que é especificamente uma razão (%) do número de idênticos aminoácidos em relação ao número total de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma razão (%) do número de nucleotídeos idênticos em relação ao número total de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2. Como programa de alinhamento de sequência usado para o alinhamento de comparação de duas sequências é utilizado o BLAST (blastn, blastp), que é um software geralmente usado nesse campo. O BLAST está disponível para qualquer pessoa através do site do NCBI (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia), e a identidade pode ser facilmente investigada usando os parâmetros padrão.

[037] Desde que o homólogo do polinucleotídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 seja um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase, ele pode ser um polinucleotídeo/polipeptídeo derivado de um protista do gênero

Pseudotrichonympha, preferencialmente Pseudotrichonympha hertwigi, Pseudotrichonympha paulistana, ou Pseudotrichonympha grassii do gênero Pseudotrichonympha.

[038] O polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2 pode ser preparado por clonagem de um protista do gênero Pseudotrichonympha, ou pode ser quimicamente sintetizado. A clonagem de um protista do gênero Pseudotrichonympha permite o isolamento através do uso de um método geralmente conhecido, por exemplo, usando um método que inclui a determinação de toda a sequência ORF do cDNA transcrito reversamente a partir do RNA isolado das células protistas do gênero Pseudotrichonympha e amplificando este cDNA por PCR, ou pode ser quimicamente sintetizado diretamente por um dispositivo de síntese de DNA.

[039] O polinucleotídeo é ligado à jusante de um promotor que pode ser expresso em uma célula hospedeira usando uma enzima de restrição e uma DNA ligase e, desse modo, um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo pode ser produzido. Na presente invenção, desde que o vetor de expressão seja um vetor que introduza um gene alvo em uma célula hospedeira de maneira que possa ser expressa, ele pode ser qualquer vetor. Ele pode ser um plasmídeo que seja replicável autonomamente de tal forma que o gene alvo seja introduzido fora do genoma do hospedeiro, embora ele possa ser um fragmento de DNA de tal forma que o gene alvo seja introduzido dentro do genoma do hospedeiro. Exemplos do vetor de expressão incluem um plasmídeo bacteriano, um plasmídeo de levedura, um DNA de fago como um fago lambda, um DNA de vírus como um retrovírus, um baculovírus, um vírus vacina e um adenovírus e Agrobacterium como vetor. Por exemplo, quando uma célula hospedeira é Escherichia coli, seus exemplos incluem pUC, pET e pBAD. Desde que o promotor seja um promotor adequado correspondente a uma célula hospedeira utilizada para a expressão de um gene, ele pode ser qualquer promotor. Por exemplo, quando a célula hospedeira é Escherichia coli, seus exemplos incluem promotor lac, um promotor Trp, um promotor PL e um promotor PR. Quando a célula hospedeira é um fungo filamentoso produtivo de celulase, ele é preferencialmente um promotor induzível por celulose e exemplos mais preferidos incluem um promotor cbh, um promotor egl, um promotor bgl, um promotor xyn e um promotor bxl.

[040] Como célula hospedeira para um transformante possuindo o polinucleotídeo ou vetor de expressão da presente invenção, são preferidas; Escherichia coli, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula fúngica, uma célula de inseto, uma célula vegetal e uma célula animal. Exemplos da célula de levedura incluem o gênero Pichia, o gênero Saccharomyces e o gênero Schizosaccharomyces. Exemplos da célula de inseto incluem Sf9; exemplos da célula vegetal incluem uma célula vegetal dicotiledônea; e exemplos da célula animal incluem CHO, HeLa e HEK293. São ainda exemplificados células fúngicas de um fungo filamentoso, mais preferencialmente um fungo filamentoso do gênero Asperigillus e mais preferencialmente um fungo filamentoso do gênero Trichoderma. O uso de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma como célula hospedeira pode produzir muito mais β-glucosidase da presente invenção.

[041] A transformação ou transfecção pode ser realizada por um método conhecido, como o método de fosfato de cálcio, método de eletroporação e método de Agrobacterium.

[042] A β-glucosidase da presente invenção pode ser obtida expressando-a em uma célula hospedeira transformada ou transfectada como descrito acima sob o controle do promotor e coletando o produto resultante. Para a expressão, as células hospedeiras são proliferadas ou cultivadas até uma densidade celular adequada; então, o promotor é induzido por uma mudança de temperatura ou por indução química com um componente no meio; e as células são adicionalmente cultivadas por certo período.

[043] Na presente invenção, uma composição enzimática indica uma mistura de β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha e uma ou mais enzimas diferentes. A composição enzimática pode ser preparada produzindo a β-glucosidase e uma ou mais enzimas diferentes separadamente e depois misturando-as; e pode ser uma cultura de um transformante possuindo um polinucleotídeo ou um vetor de expressão que codifica o polipeptídeo com atividade de β-glucosidase, em que a cultura contém a β-glucosidase e uma ou mais enzimas derivadas de células hospedeiras. A cultura inclui, além de um sobrenadante de cultura, um transformante ou um homogenato do transformante.

[044] A enzima a ser misturada com a β-glucosidase preferida é a celulase. Desde que a celulase aqui mencionada seja uma enzima com atividade para degradar a celulose, ela não é particularmente limitada e pode ser uma mistura de duas ou mais enzimas. Exemplos de tais enzimas incluem celulase, hemicelulase, celobiohidrolase, endoglucanase, exoglucanase, xilanase e mananase. A atividade da celobiohidrolase e endoglucanase incluídas na celulase é medida pelo uso de p-nitrofenil-β-D-lactopiranosídeo (pNP-Lac) como um substrato; e a atividade da β-xilosidase é medida pelo uso de p-nitrofenil-β- D-xilopiranosídeo (pNP-Xil) como um substrato. Especificamente, um líquido de enzima é adicionado a uma solução de substrato preparada por dissolução de pNP-Lac em solução tampão de 50 mM de ácido acético - acetato de sódio (pH 5,0) e a mistura é reagida a 30ºC durante 10 minutos; e a reação é parada misturando bem com carbonato de sódio 2M em uma quantidade equivalente a um décimo do volume do sistema de reação para medir um aumento da absorbância a 405 nm. Se o p-nitrofenol é liberado e a absorbância a 405 nm é aumentada após a reação acima, é determinado que as atividades de celobiohidrolase e endoglucanase estão presentes. Com relação à atividade de β-xilosidase, é realizada a mesma reação descrita acima usando pNP-Xil como um substrato. Se o p-nitrofenol é liberado e a absorbância a 405 nm é aumentada após a reação acima, é determinado que a atividade da β-xilosidade está presente.

[045] A celulase é preferencialmente celulase derivada de um fungo filamentoso. A celulase derivada de um fungo filamentoso é uma mistura que contém pelo menos a endoglucanase quanto a celobiohidrolase. Exemplos de micro-organismos capazes de produzir a celulase derivada de fungos filamentosos incluem micro-organismos do gênero Trichoderma, do gênero Asperigillus, do gênero Cellulomonas, do gênero Clostridium, do gênero Streptomyces, do gênero Humicola, do gênero Acremonium, do gênero Irpex, do gênero Mucor e o gênero Talaromyces. Esses micro-organismos produzem celulase em uma solução de cultura e, portanto, essa solução de cultura pode ser usada diretamente como celulase derivada de fungo filamentoso não purificado. Alternativamente, a solução de cultura é purificada e formulada, a qual pode ser usada como uma mistura de celulase derivada de fungo filamentoso.

[046] A celulase derivada de fungo filamentoso é preferencialmente celulase derivada do gênero Trichoderma. O gênero Trichoderma produz celulase contendo pelo menos dois tipos de endoglucanase e pelo menos dois tipos de celobiohidrolase em uma solução de cultura, e a celulase preparada a partir dessa solução de cultura pode ser preferencialmente utilizada para a presente invenção. Ou seja, quando a β-glucosidase da presente invenção é usada como uma composição enzimática juntamente com a celulase derivada do gênero Trichoderma, isso pode aumentar o rendimento de açúcar na sacarificação de biomassa contendo celulose.

[047] Quando a biomassa contendo celulose é tratada enzimaticamente com β-glucosidase da presente invenção, a β-glucosidase da presente invenção possuindo uma atividade remanescente alta pode ser recuperada a partir de uma solução sacarificada obtida por tratamento enzimático. Além disso, a β-glucosidase da presente invenção que possui alta atividade remanescente pode ser recuperada a partir de uma solução sacarificada obtida por tratamento enzimático da biomassa contendo celulose com a composição enzimática que contém a β-glucosidase da presente invenção e a celulase derivada do fungo filamentoso. Além disso, em relação a uma composição enzimática derivada de um fungo filamentoso, a celulase derivada de fungo filamentoso possuindo atividade remanescente alta pode ser recuperada a partir de uma solução sacarificada obtida por tratamento enzimático da biomassa contendo celulose com a composição enzimática contendo a β-glucosidase da presente invenção e a celulase derivada de fungo filamentoso de maneira comparável com a recuperação quando feita com uma solução sacarificada obtida por tratamento enzimático de biomassa contendo celulose apenas com celulase derivada de fungo filamentoso. Como celulase derivada de fungos filamentosos, são preferidas as enzimas endoglucanase, celobiohidrolase, β-xilosidase e outras enzimas derivadas do gênero Trichoderma, e em particular, é preferida a β-xilosidase.

[048] As celulases mais preferidas dentre o gênero Trichoderma acima são as derivadas de Trichoderma reesei. Exemplos de uma mistura de celulase derivada de Trichoderma reesei incluem misturas de celulase derivadas de Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei Rut-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77 e Trichoderma reesei MCG80 e Trichoderma viride QM9123. Além disso, a mistura de celulase pode ser uma mistura de celulase derivada de mutantes melhorados em produtividade da celulase derivados do gênero Trichoderma descritos acima, que foram mutados por mutagênese ou irradiação ultravioleta.

[049] Na presente invenção, pode-se utilizar qualquer método desde que o método para produzir uma composição enzimática inclua uma etapa de cultura de um transformante possuindo um polinucleotídeo ou um vetor de expressão nele introduzido, em que ele codifica um polipeptídeo com atividade β-glucosidase, e seja um método que inclua uma etapa de cultura capaz de expressar a β-glucosidase. Quando o transformante é cultivado, a expressão do polipeptídeo com atividade da β-glucosidase é aumentada ou recentemente adicionada no transformante e, como resultado, uma composição enzimática incluindo a β-glucosidase e uma ou mais enzimas derivadas de células hospedeiras é obtida a partir da cultura. A cultura pode ser, além de um sobrenadante de cultura, um transformante e um homogenato do transformante.

[050] O método para cultivar o transformante não é particularmente limitado e é adotado um método conhecido. Para a cultura, vários métodos de cultura podem ser adotados, como a cultura com vibração, cultura com agitação, cultura de vibração e agitação, cultura parada (imóvel) e cultura contínua. Como meio de cultura do transformante, qualquer meio natural e sintético pode ser usado, desde que seja um meio que contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e outros assimiláveis pelo transformante e nos quais o transformante seja eficientemente cultivado.

Quando o transformante é um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, é preferido cultivar em um meio contendo biomassa contendo celulose. A celulase derivada de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma é expressa através da cultura de um fungo filamentoso transformado do gênero Trichoderma, que possui um polinucleotídeo ou vetor de expressão que codifica a β-glucosidase da presente invenção introduzida em um meio contendo biomassa contendo celulose, permitindo assim a produção de uma composição enzimática contendo celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma e β-glucosidase.

[051] Na presente invenção, a biomassa contendo celulose não é limitada desde que contenha pelo menos celulose. Especificamente, exemplos disso incluem bagaço, paleta de cone, espiga de milho, capim-arroz, palhas de arroz, palhas de trigo, árvores, materiais de madeira, resíduos de materiais de construção, jornal, papel usado e polpa. Esses tipos de biomassa contendo celulose contêm impurezas, como um composto aromático de alto teor de molécula lignina ou hemicelulose; no entanto, eles também podem ser usados como biomassa contendo celulose quando a lignina ou a hemicelulose é total ou parcialmente degradada ou removida como um pré-tratamento usando ácido, álcalis, água quente pressurizada ou tratamentos semelhantes.

[052] O método para produzir uma solução de açúcar a partir de biomassa contendo celulose usando a composição enzimática não é particularmente limitado. A produção de uma solução de açúcar utilizando a composição enzimática pode ser realizada em modo descontínuo (batch) ou contínuo. Além disso, a composição enzimática utilizada pode ser separada e recuperada a partir de uma solução sacarificada obtida por tratamento enzimático de biomassa contendo celulose. Um método para separar e recuperar uma enzima não é particularmente limitado; entretanto, a solução sacarificada é filtrada por uma membrana de ultrafiltração ou similar e a coleta é implementada no lado da não permeação. Os sólidos podem ser removidos da solução sacarificada como pré-tratamento da filtração, se necessário. A composição enzimática recuperada pode ser usada novamente para a reação de sacarificação.

EXEMPLOS EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

MÉTODO PARA MEDIR A CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA

[053] Foi utilizado um reagente de medição de concentração de proteína comercialmente disponível (Quick Start Bradford protein assay, fabricado pela Bio-Rad). Em 250 µL de reagente de medição da concentração de proteína que foi trazido de volta à temperatura ambiente, foram adicionados

5 µL de solução de celulase derivada de fungo filamentoso diluído. A mistura foi deixada repousar em temperatura ambiente durante 5 minutos e, em seguida, a absorbância a 595 nm foi medida usando um leitor de microplacas. A BSA foi usada como uma preparação padrão e a concentração de proteína foi calculada consultando uma curva de calibração.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE DA β-GLUCOSIDASE

[054] 10 μL de uma solução diluída de enzima foi adicionada e reagida com 90 μL de tampão de ácido acético 50 mM contendo 1 mM de p- nitrofenil-β-glucopiranosídeo (fabricada pela Sigma-Aldrich Japão) a 30ºC durante 10 minutos. Em seguida, foram adicionados 10 μL de carbonato de sódio a 2M e misturados para interromper a reação, e o aumento da absorbância foi medido a 405 nm. A atividade para liberar 1 μmol de p-nitrofenol por minuto foi definida como 1U. Para um branco, 10 μL de carbonato de sódio 2M foram adicionados e misturados com 90 μL de tampão acetato de sódio 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil–β-glucopiranosídeo e, em seguida, foram adicionados 10 μL de uma solução diluída de enzima e a mistura reagiu a 30ºC por 30 minutos. Em seguida, um aumento da absorbância a 405 nm foi mensurado. Nesse momento, o líquido de enzima foi diluído para não exceder uma absorbância a 405 nm de 1. Além disso, uma curva de calibração foi criada com base nas absorbâncias medidas pela preparação de soluções de p- nitrofenol em concentrações de 0,1 mM, 0,2 mM, 1 mM e 2 mM; usando 10 μL deles em vez de uma solução diluída de enzima; e adicionando e misturando bem 10 µL de carbonato de sódio 2M para o desenvolvimento de cor.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE DA β-XILOSIDASE

[055] 10 μL de uma solução diluída de enzima foi adicionada e reagida com 90 μL de tampão de ácido acético 50 mM contendo 1 mM de p-

nitrofenil-β-xilanopiranosídeo (fabricada pela Sigma-Aldrich Japão) a 30ºC durante 30 minutos. Em seguida, foram adicionados 10 μL de carbonato de sódio a 2M e misturados para interromper a reação, e o aumento da absorbância foi medido a 405 nm. A atividade para liberar 1 μmol de p-nitrofenol por minuto foi definida como 1U. Para um branco, 10 μL de carbonato de sódio 2M foram adicionados e misturados com 90 μL de tampão de ácido acético 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil–β-xilanopiranosídeo e, em seguida, foram adicionados 10 μL de uma solução diluída de enzima e a mistura reagiu a 30ºC por 30 minutos. Em seguida, um aumento da absorbância a 405 nm foi mensurado. Nesse momento, o líquido de enzima foi diluído para não exceder uma absorbância a 405 nm de 1. Além disso, uma curva de calibração foi criada com base nas absorbâncias medidas pela preparação de soluções de p- nitrofenol em concentrações de 0,1 mM, 0,2 mM, 1 mM e 2 mM; usando 10 μL deles em vez de uma solução diluída de enzima; e adicionando e misturando bem 10 µL de carbonato de sódio 2M para o desenvolvimento de cor.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4 MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE DA CELOBIOHIDROLASE/ENDOGLUCANASE

[056] 10 μL de uma solução diluída de enzima foi adicionada e reagida com 90 μL de tampão de ácido acético 50 mM contendo 1 mM de p- nitrofenil-β-lactopiranosídeo (fabricada pela Sigma-Aldrich Japão) a 30ºC durante 60 minutos. Em seguida, foram adicionados 10 μL de carbonato de sódio a 2M e misturados para interromper a reação, e o aumento da absorbância foi medido a 405 nm. A atividade para liberar 1 μmol de p-nitrofenol por minuto foi definida como 1U. Para um branco, 10 μL de carbonato de sódio 2M foram adicionados e misturados com 90 μL de tampão de ácido acético 50 mM contendo 1 mM de p-nitrofenil–β-lactopiranosídeo e, em seguida, foram adicionados 10 μL de uma solução diluída de enzima e a mistura reagiu a 30ºC por 30 minutos. Em seguida, um aumento da absorbância a 405 nm foi mensurado. Nesse momento, o líquido de enzima foi diluído para não exceder uma absorbância a 405 nm de 1. Além disso, uma curva de calibração foi criada com base nas absorbâncias medidas pela preparação de soluções de p- nitrofenol em concentrações de 0,1 mM, 0,2 mM, 1 mM e 2 mM; usando 10 μL deles em vez de uma solução diluída de enzima; e adicionando e misturando bem 10 µL de carbonato de sódio 2M para o desenvolvimento de cor.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5

MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCAR

[057] A glicose e a celobiose foram analisadas quantitativamente usando um sistema ACQUITY UPLC (Waters) nas seguintes condições.

[058] A análise quantitativa foi feita referindo-se a uma curva de calibração criada por preparações autênticas de glicose e celobiose. Quando a concentração de celobiose foi menor que 1 g/L, ela foi determinada como limite de detecção ou inferior.

- Coluna: Coluna AQUITY UPLC BEH Amide 1,7 μm 2.1  100 mm - Método de separação: HILIC - Fase móvel: uma solução aquosa de acetonitrila a 80% e TEA a 0,2% (trietilamina) foi usada como fase móvel A e uma solução aquosa de acetonitrila a 80% e TEA a 0,2% (trietilamina) foi usada como fase móvel B. O gradiente descrito abaixo foi adotado. O gradiente foi linear de modo a atingir proporções de mistura correspondentes para os seguintes tempos.

- Condição inicial: (A: 99,90%, B: 0,10%), 2 minutos após o início (A: 96,70%, B: 3,30%), 3,5 minutos após o início (A: 95,00%, B: 5,00%), 3,55 minutos após o início (A: 99,90%, B: 0,10%), 6 minutos após o início (A: 99,90%, B: 0,10%).

- Método de detecção: ELSD (detector evaporativo de espalhamento de luz)

- Velocidade de fluxo: 0,3 mL/min - Temperatura: 55ºC EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6 SDS-PAGE

[059] Para SDS-PAGE, foi utilizado gel de poliacrilamida a 15%, e-PAGEL (Atto Corporation). 5 μg da enzima β-glucosidase a partir da cepa de Trichoderma transformada foram misturado com um volume igual de um tampão de amostra, Ez-apply (Atto Corporation) e aquecida a 95ºC durante 10 minutos; e o resultado foi utilizado como amostra de eletroforese. Como marcador de peso molecular, foi utilizado o Precision Plus Protein Dual Color Standards (BioRad).

Uma solução aquosa (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS a 0,1%) foi usada como tampão de eletroforese e a eletroforese foi conduzida a uma corrente constante de 20 mA por 90 minutos. O gel após eletroforese foi corado com o corante Bio- Safe Comassie G-250 Stain (BioRad) e descolorido com água pura.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7

PRODUÇÃO DE CELULASE PELO CULTIVO DE FUNGOS FILAMENTOSOS DO GÊNERO TRICHODERMA

[060] Os esporos dos fungos filamentosos do gênero Trichoderma foram diluídos com uma solução salina fisiológica, de modo a obter uma concentração de esporos de 1,0 ± 107/mL. 2,5 mL da solução de esporos diluída foram inoculados em 250 mL de uma solução de cultura com uma composição descrita na Tabela 1 em um balão de 1L com saliências/reentrâncias no fundo (baffled); e cultivadas (pré-cultivadas) durante 3 dias sob condições de cultura de 28ºC e 160 rpm. Para uma cultura principal, 250 mL da solução de pré-cultura foram inoculados em 2,5 L de uma solução de cultura principal indicada na Tabela 2 em uma mini jarra de 5 L; e cultivadas durante 4 dias sob condições de cultura de 28ºC, 700 rpm, 1 vvm e pH 5. Para a neutralização, 10% de amoníaco e ácido sulfúrico 1N foram utilizados. A solução de cultura a partir 4 dias após o início da cultura foi centrifugada; um sobrenadante foi filtrado por uma membrana de ultrafiltração para remoção de corpos de fungos; e, assim, foi obtida a celulase derivada de fungos filamentosos do gênero Trichoderma.

TABELA 1 Componente Para 1L D-glicose 20g Mandel 5x ** 200mL Tartarato de amônio 10x 100mL Água de maceração de milho 15g Elementos traços* 1mL Tween 80 0,5mL Agente antiespumante (PE-M) 1mL * A solução de elementos traços contém 0,3 g/L H3BO3, 1,3 g/L (NH4)6Mo7O24-4H2O, 5 g/L FeCl3-6H2O, 2 g/L CuSO4-5H2O, 0,4 g/L MnCl2- 4H2O e 10 g/L ZnCl2 ** Mandel's contém 7 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L KH2PO4, 3 g/L CaCl2 e 3 g/L MgSO4-7H2O.

TABELA 2 Componente Por 1L Biomassa *** 100g Mandel's 5x** 200mL Água de maceração de milho 25g Elementos traços* 1mL Tween 80 0,5mL Agente antiespumante (PE-M) 1mL * A solução de elementos traços contém 0,3 g/L H3BO3, 1,3 g/L (NH4)6Mo7O24-4H2O, 5 g/L FeCl3-6H2O, 2 g/L CuSO4-5H2O, 0,4 g/L MnCl2- 4H2O e 10 g/L ZnCl2.

** Mandel's contém 7 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L KH2PO4, 3 g/L CaCl2 e 3 g/L MgSO4-7H2O.

*** A biomassa usada aqui foi Arbocel (marca registrada) (J.

Rettenmaier & Sohne). A biomassa foi adicionada após a mistura de outros componentes e a diluição na mini-jarra.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 8 MÉTODO PARA MEDIR A AÇÃO INIBITÓRIA DA GLICOSE SOBRE A ATIVIDADE DA β-

GLUCOSIDASE

[061] Uma solução enzimática foi adicionada a uma solução de mistura contendo 1 mM de p-nitrofenil-β-glucopiranosídeo (fabricado pela Sigma- Aldrich Japão), 50 mM de tampão de ácido acético e 0, 4, 8 ou 20 g/L de glicose, de modo que a quantidade total da solução de reação tornou-se 100 μL, e a mistura reagiu a 30ºC por 100 minutos. Em seguida, foram adicionados 10 μL de carbonato de sódio a 2M e misturados para interromper a reação, e o aumento da absorbância foi medido a 405 nm. A atividade para liberar 1 μmol de p- nitrofenol por minuto foi definida como 1U. Para um branco, 10 μL de carbonato de sódio 2M foram adicionados a uma quantidade equivalente à da solução de mistura acima para a solução de reação antes da adição da solução enzimática, de uma solução de mistura contendo 1mM de p-nitrofenil-β -glucopiranosídeo, 50 mM de tampão de acetato de sódio e 0, 4, 8 ou 20 g/L de glicose, e bem misturados; e, em seguida, a solução de enzima foi adicionada de tal modo que a quantidade total da solução de branco perfez 110 μL, e a mistura reagiu a 30ºC durante 30 minutos. Em seguida, um aumento da absorbância a 405 nm foi mensurado.

EXEMPLO 1 ANÁLISE DE RNA-SEQ A PARTIR DE UMA ÚNICA CÉLULA DIFICILMENTE CULTIVÁVEL DE SIMBIONTE COPTOTERMES FORMOSANUS E ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DA β-

GLUCOSIDASE CANDIDATA

[062] As células de Pseudotrichonympha grassii foram selecionadas da comunidade protista simbiótica dificilmente cultivável de cupins contidas em extratos do trato intestinal de Coptotermes formosanus e fracionadas por um microcapilar; e a extração de RNA a partir de uma única célula, a transcrição reversa, a amplificação de cDNA, a conversão em uma biblioteca e o sequenciamento foram realizadas pelo método Quartz-seq de Sasagawa, et al. (Sasagawa, Y., et al.: Genome Biol., 14: R31, 2013). A partir dos resultados do sequenciamento, as sequências nucleotídicas que codificam as β-glucosidases candidatas foram selecionados. Uma ferramenta, SignalP (http: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) capaz de prever uma sequência de sinal de uma proteína foi usada para prever uma porção da sequência de sinal de uma sequência de aminoácidos conforme codificado pela sequência de nucleotídeos. Como resultado, foi obtida uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 como sequência da β-glucosidase candidata excluindo uma sequência sinal; e foi obtida uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 2 como uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos. Em seguida, uma família da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 foi investigada pelo PROSITE e verificou-se que as posições 259 a 276 da SEQ ID NO: 1 têm uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 correspondente ao sítio ativo da família das glicosil-hidrolases

3.

EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE E. COLI TRANSFORMADA COM O GENE β-GLUCOSIDASE

[063] Um plasmídeo em que o polinucleotídeo representado pela SEQ ID NO: 2 (sequência de nucleotídeos que codifica um gene candidato da β- glucosidase derivado de um protista do gênero Pseudotrichonympha), obtido no Exemplo 1, foi ligado aos sítios das enzimas de restrição Ndel e Xhol de pET14b, foi sintetizado por um serviço artificial de síntese genética (Genscript). A constituição da sequência do plasmídeo aqui utilizado foi concebida para expressar β-glucosidase tendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, possuindo um marcador His-tag adicionado ao N-terminal no transformante. O plasmídeo foi transformado na cepa de E. coli (Rossetta2 (DE3)).

EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DE EXTRATO LIVRE DE CÉLULAS DE E. COLI TRANSFORMADA COM O GENE β-GLUCOSIDASE

[064] As células de E. coli transformadas com o gene β- glucosidase produzida no Exemplo 2 foram inoculadas em 10 mL de um meio LB contendo ampicilina, e submetidas a cultura sob agitação (pré-cultura) a 37ºC durante a noite. Como cultura principal, micróbios obtidos na pré-cultura foram inoculado em um meio LB contendo ampicilina e submetidos a cultura com agitação a 37ºC até uma OD600 em um comprimento de onda de 600 nm atingir 0,8. Em seguida, isopropil-1-tio-β-D-galactosídeo (IPTG) foi adicionado de tal modo que a concentração final foi de 0,1 mM, e a mistura foi cultivada de um dia para o ouro a 16ºC. Após a cultura, os micróbios foram recolhidos por centrifugação e resuspensos em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,6). Esta solução foi homogeneizada por ultrassom enquanto estava gelada e um sobrenadante foi coletado como um extrato livre de células por centrifugação. A atividade da β- glucosidase medida no extrato livre de células de E. coli transformada com genes candidatos de β-glucosidase foi de 0,14 L por 1 mg de proteína contida no extrato livre de células. Além disso, toda a atividade da β-glucosidase obtida a partir de 1L da solução de cultura do E. coli transformada com o gene β-glucosidase foi de 21,6 U. Como controle comparativo, um extrato de sem células transformadas contendo um plasmídeo não contendo o gene candidato da β-glucosidase foi preparado da mesma maneira; e quando a atividade de β-glucosidase foi medida, ela não foi detectada. Ou seja, a atividade da β-glucosidase foi detectada apenas a partir do extrato livre de células que expressava um polipeptídeo no qual o marcador His-tag foi adicionado à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1. Verificou-se, portanto, que o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 era uma sequência de β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha. EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE E. COLI TRANSFORMADA COM O GENE β-GLUCOSIDASE MUTANTE

[065] Plasmídeos, em que cada um dos polinucleotídeos representados pelas SEQ ID NOs: 7 e 9, com identidade de sequência de 53% com a SEQ ID NO: 2 foi ligado aos sítios de restrição enzimática Ndel e Xhol do PET14b, foram sintetizados por um serviço de síntese genética (Genscript) da mesma maneira que no Exemplo 2. As constituições da sequência do plasmídeo utilizado foram projetadas para expressar β-glucosidases possuindo sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 6 e 8, respectivamente, tendo o marcador His-tag adicionado ao N-terminal no transformante. O plasmídeo foi transformado na cepa de E. coli (Rossetta2 (DE3)).

EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE EXTRATO LIVRE DE CÉLULAS DE E. COLI TRANSFORMADA COM O GENE β-GLUCOSIDASE MUTANTE

[066] As células de E. coli transformadas com o gene mutante da β-glucosidase produzida no Exemplo 4 foram inoculadas em 10 mL de um meio LB contendo ampicilina, e submetidas a cultura sob agitação (pré-cultura) a 37ºC durante a noite. Como cultura principal, micróbios obtidos na pré-cultura foram inoculado em um meio LB contendo ampicilina e submetidos a cultura com agitação a 37ºC até uma OD600 em um comprimento de onda de 600 nm atingir 0,8. Em seguida, isopropil-1-tio-β-D-galactosídeo (IPTG) foi adicionado de tal modo que a concentração final foi de 0,1 mM, e a mistura foi cultivada de um dia para o ouro a 16ºC. Após a cultura, os micróbios foram recolhidos por centrifugação e resuspensos em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,6). Esta solução foi homogeneizada por ultrassom enquanto estava gelada e um sobrenadante foi coletado como um extrato livre de células por centrifugação. Depois, após a redução do volume do extrato para um décimo segundo por uma unidade de membrana de ultrafiltração, a presença ou não da atividade da β-glucosidase foi investigada. Como controle comparativo, um extrato de sem células transformadas contendo um plasmídeo que não continha o gene candidato da β- glucosidase foi preparado da mesma maneira; e a presença ou ausência da atividade da β-glucosidase foi investigada, e ela não foi detectada. Ou seja, a atividade da β-glucosidase foi detectada apenas a partir do extrato livre de células que expressava um polipeptídeo no qual o marcador His-tag foi adicionado à sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6, com 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 8 com 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Verificou-se, portanto, que os polipeptídeos compreendendo cada uma das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 6 e 8 tinham atividade de β-glucosidase. Os resultados das medições da atividade da β-glucosidase são mostrados na Tabela 3.

TABELA 3 Mutante 1 Mutante 2 Controle comparativo SEQ ID NO: SEQ ID NO: nenhuma Sequência de aminoácidos da β-glucosidase 6 8 (apenas plasmídeo) Limite de detecção Aumento da absorbância (405 nm) 0,307 0,365 ou menos (< 0,075) EXEMPLO 6 PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO: EXTRATO SEM CÉLULAS DE E. COLI TRANSFORMADA COM O GENE β-GLUCOSIDASE; E CELULASE DERIVADA DO FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA, E SACARIFICAÇÃO DE CELULOSE

EM PÓ A PARTIR DE MATERIAL DE MADEIRA

[067] De acordo com o Exemplo de Referência 7, o Trichoderma reesei foi cultivado e a celulase derivada do gênero Trichoderma foi produzida. Uma composição enzimática foi preparada por mistura do extrato sem células de E. coli transformadas com o gene β-glucosidase produzido no Exemplo 3 com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero

Trichoderma, e utilizada para a reação de sacarificação.

A mistura para a composição enzimática foi realizada de modo que, para 1 mL de solução da reação de sacarificação, a concentração de proteína da celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma fosse de 0,2 g/L e a concentração de proteína do extrato livre de células de E. coli transformada com o gene β-

glucosidase fosse de 2,1 g/L.

Como biomassa para sacarificação, foi utilizada a celulose em pó de material de madeira, Arbocel (nome comercial registrado)

(J.

Rettenmaier & Sohne). A reação de sacarificação foi conduzida da seguinte forma. 50 mg da biomassa foram alimentados em um tubo de 2 mL; foi adicionado um tampão de acetato de sódio (pH 5,2) de modo que a concentração final se tornasse de 50 mM; e foi adicionada água pura de modo que o teor sólido de celulose em pó a partir de material de madeira ficasse em 5% em peso no momento do início da reação.

Além disso, a composição enzimática foi adicionada à solução preparada, e um bloco rotor de aquecimento foi utilizado para iniciar a reação sob uma condição de reação de 35ºC.

Uma amostra após 24 horas de reação de sacarificação foi centrifugada sob uma condição de 10.000 x g durante 5 minutos para separar um sobrenadante; uma quantidade, que era um décimo do volume de sobrenadante, de solução de hidróxido de sódio foi adicionada para parar a reação de sacarificação.

O sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,22 μm,

e o filtrado assim obtido foi fornecido para a análise de açúcar, de acordo com o exemplo de referência 5. Para um controle comparativo foi utilizado um extrato livre de células de E. coli transformada apenas com um vetor sem o gene β-glucosidase; de acordo com o mesmo método descrito acima, foi misturado com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero

Trichoderma, de modo que, para 1 mL de solução da reação de sacarificação,

a concentração de proteína ficasse em 2,1 g/L; e a reação de sacarificação e análise de açúcar de um sobrenadante sacarificado foram realizadas.

Em seguida, a composição enzimática contendo o extrato livre de células de E. coli transformada com o gene β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, usada para reação de sacarificação, teve uma atividade da β-glucosidase mais alta de 2,6 vezes em comparação com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma sem o extrato livre de células de E. coli transformada com o gene β-glucosidase. O resultado da reação de sacarificação mostra que, quando a composição enzimática que contém o extrato livre de células de E. coli transformada com o gene β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi adicionada, a quantidade acumulada de glicose aumentou cerca de 2,7 vezes, enquanto a quantidade acumulada de celobiose diminuiu em comparação com o caso em que a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma sem o extrato livre de células de E. coli transformada com o gene β-glucosidase foi adicionada. Os resultados de glicose/celobiose obtidos por análise de açúcar são mostrados na Tabela 4.

TABELA 4 Composição enzimática contendo o extrato livre de células de E. coli Celulase derivada do fungo transformada com o gene da β- filamentoso do gênero glucosidase e a celulase derivada do Trichoderma (Controle fungo filamentoso do gênero comparativo) Trichoderma Glicose (g/L) 14,58 5,34 Celobiose (g/L) Limite de detecção ou menos 4,76 EXEMPLO 7 PURIFICAÇÃO PARCIAL COM MARCADOR HIS-TAG DA β-GLICOSIDASE

[068] O extrato livre de células de E. coli transformada com o gene β-glucosidase, cuja atividade enzimática foi confirmada no Exemplo 3, foi submetido a purificação Hig-tag. A purificação His-tag foi realizada usando o kit de purificação His Bind (Merck Millipore) seguindo um método descontínuo descrito no manual. De acordo com o Exemplo de Referência 6, quando uma fração purificada foi submetida a SDS-PAGE, a banda mais escura foi detectada nos pesos moleculares de 75 kDa a 100 kDa em uma fração de eluição; foi confirmada a purificação da β-glucosidase marcada com His com um peso molecular teórico de 83,9 kDa. Uma fotografia do gel SDS-PAGE é mostrada na Figura 1. De acordo com o método encontrado no manual, o tampão para a fração de eluição foi trocado por Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) usando uma coluna de filtração em gel PD-10 (GE Healthcare), e o produto resultante foi considerado como uma β-glucosidase parcialmente purificada. Quando a β-glucosidase parcialmente purificada foi medida em termos da concentração de proteína e atividade de β-glucosidase, a atividade foi de 3,50 L por 1 mg de proteína contida na β-glucosidase parcialmente purificada.

EXEMPLO 8 PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO A Β-GLUCOSIDASE

PARCIALMENTE PURIFICADA E A CELULASE DERIVADA DE FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA E SACARIFICAÇÃO DA CELULOSE EM PÓ A PARTIR DE MATERIAL DE MADEIRA

[069] De acordo com o Exemplo de Referência 7, o Trichoderma reesei foi cultivado e a celulase derivada do gênero Trichoderma foi produzida.

Uma composição enzimática foi preparada por mistura da β-glucosidase parcialmente purificada produzida no Exemplo 7 com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, e utilizada para a reação de sacarificação. A mistura para a composição enzimática foi realizada de modo que, para 1 mL de solução da reação de sacarificação, a concentração de proteína da celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma ficasse em 0,2 g/L e a concentração de proteína da β-glucosidase parcialmente purificada ficasse em 0,017 g/L. A reação de sacarificação e a análise de açúcar de um sobrenadante sacarificado foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo 6, exceto que a β-glucosidase parcialmente purificada foi usada na composição enzimática. Para controle comparativo, apenas as celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi adicionada de modo que, para 1 mL de solução de reação de sacarificação, a concentração de proteína fosse de 2,1 g/L, da mesma maneira descrita acima; e a reação de sacarificação e análise de açúcar de um sobrenadante sacarificado foram realizadas. Em seguida, a composição enzimática contendo a β-glucosidase parcialmente purificada e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, usada para a reação de sacarificação, teve uma atividade de β-glucosidase mais alta em 1,6 vezes do que apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma. O resultado da reação de sacarificação mostra que quando a composição enzimática preparada por mistura da β-glucosidase parcialmente purificada com a celulase de Trichoderma foi adicionada, a quantidade acumulada de glicose aumentou em cerca de 1,8 vezes, enquanto que a quantidade acumulada de celobiose diminuiu em comparação com o caso em que apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi adicionada. Os resultados de glicose/celobiose obtidos por análise de açúcar são mostrados na Tabela 5. TABELA 5 Composição enzimática contendo a β- Celulase derivada do fungo glucosidase parcialmente purificada e a filamentoso do gênero celulase derivada do fungo filamentoso do Trichoderma (Controle gênero Trichoderma comparativo) Glicose (g/L) 10,68 5,96 Celobiose (g/L) 2,31 3,54 EXEMPLO 9

PRODUÇÃO DO FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA TRANSFORMADO COM O GENE β-GLUCOSIDASE

[070] Um plasmídeo, no qual um polinucleotídeo representado pela SEQ ID NO: 3 possuindo 66% de identidade de sequência com a sequência nucleotídica representada pela SEQ ID NO: 2 (sequência de nucleotídeos que codifica um gene β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha) foi ligado ao sítios de enzimas de restrição Ndel e Xhol do pET14b, foi sintetizado por um serviço de síntese gênica artificial (Genscript). A partir do plasmídeo, uma porção da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 foi amplificada por PCR e ligada à jusante de um promotor da endoglucanase 1 derivado de Trichoderma reesei, de modo a ficar na fase de leitura (in-frame) com uma sequência sinal de secreção da β-glucosidase de Aspergillus aculeatus, e a sequência e um gene do transformante resistente à higromicina foram clonados entre as bordas do T-DNA do plasmídeo pBl101. A sequência entre as bordas do T-DNA do plasmídeo produzido é mostrada na SEQ ID NO:

4. Nesse sentido, a SEQ ID NO: 4 foi projetada de modo que a sequência fosse introduzida no genoma de uma célula hospedeira, de modo a expressar e secretar a β-glucosidase possuindo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, codificada pelos seguintes nucleotídeos números 978 a 3161 (SEQ ID NO: 3). A constituição da SEQ ID NO: 4 é mostrada abaixo: - LB = borda esquerda do T-DNA: nucleotídeos Nos. 1 a 26 - Pegl1 = promotor da endoglucanase 1 derivado de Trichoderma reesei: nucleotídeos Nos. 27 a 920 - Sbgl = sinal de secreção de β-glucosidase derivada de Aspergillus aculeatus: nucleotídeos Nos. 921 a 977 - bgl = β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha: nucleotídeos Nos. 978 a 3161 (SEQ ID NO: 3) - Tegl1 = terminador da endoglucanase 1 derivada de Trichoderma reesei: nucleotídeos Nos. 3162 a 4019 - PamdS = promotor de acetamidase derivada de Aspergillus nidulans: nucleotídeos Nos. 4020 a 5027 - hygR = higromicina B fosfotransferase de Streptomyces hygroscopicus: nucleotídeos Nos. 5028 a 6065 - TamdS = terminador da acetamidase de Aspergillus nidulans: nucleotídeos Nos. 6066 a 6786 - RB = borda direita do T-DNA: nucleotídeos Nos. 1 a 6810

[071] O plasmídeo produzido foi introduzido em uma cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1; o Trichoderma reesei foi infectado com o Agrobacterium transformado; e foi obtida uma cepa de Trichoderma transformada com β-glucosidase. A transformação de Trichoderma com o Agrobacterium foi conduzida com base no método de Marcel, et al. (Marcel et al. 2006, Nat Biotechnol 16: 839-842), no qual o Agrobacterium transformado cultivado por 8 horas em meio líquido de indução (IM) contendo glicose e acetosiringona foi misturado com uma solução de esporos de Trichoderma reesei e as células foram cultivadas em celofane colocado em meio sólido de meio de indução (IM) por 3 dias; o celofane foi movido para uma placa de ágar dextrose de batata (meio seletivo) contendo cefotaxima e higromicina; a cultura de purificação, incluindo a coleta de colônias cultivadas no meio seletivo e a semeadura no meio seletivo, foi repetida duas vezes; e uma cepa de Trichoderma transformada foi obtida.

EXEMPLO 10

PRODUÇÃO DA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA PELO CULTIVO DO FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA TRANSFORMADO COM O GENE β-GLUCOSIDASE

[072] O fungo filamentoso do gênero Trichoderma transformado com o gene β-glucosidase produzido no Exemplo 9 foi cultivado pelo mesmo método que no Exemplo de Referência 7. A solução de cultura, após 4 dias a partir do início da cultura, foi centrifugada; um sobrenadante foi filtrado por uma membrana de ultrafiltração para remover corpos fúngicos; e assim, foi preparada uma composição enzimática contendo a β-glucosidase da presente invenção expressa no fungo filamentoso do gênero Trichoderma e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma. A concentração de proteína da composição enzimática foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 1, e o SDS-PAGE foi conduzido de acordo com o Exemplo de Referência 6, para que a proteína expressa fosse confirmada. Para um controle comparativo, apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, obtida pela cultura dos fungos filamentosos do gênero Trichoderma não transformados, foi utilizada e a cultura, coleta de um sobrenadante, filtração do sobrenadante cultivado e o SDS-PAGE foram realizados da mesma maneira. Como resultado do SDS-PAGE, em relação à composição enzimática contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, a banda da β-glucosidase da presente invenção foi observada como uma banda maior do que um décimo do total da banda da composição enzimática confirmada por SDS-PAGE; e em relação ao fungo filamentoso do gênero Trichoderma transformado com o gene β-glucosidase, foi confirmado que uma grande quantidade de β-glucosidase da presente invenção foi expressa. Uma fotografia do gel SDS-PAGE é mostrada na Figura 2.

[073] Além disso, de acordo com o Exemplo de Referência 2, a composição enzimática contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi medida em termos da atividade de β- glucosidase. Como resultado, a composição enzimática contendo a β- glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma tinha uma atividade de β-glucosidase 2.0 vezes maior do que a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma sozinha. Além disso, toda a atividade da β-glucosidase obtida a partir de 1L da solução de cultura do fungo filamentoso gênero Trichoderma transformado com gene β-glucosidase foi de cerca de 1,80 x 103 U, o que proporcionou, em termos da expressão da β- glucosidase em fungos filamentosos do gênero Trichoderma, cerca de 850 vezes a β-glucosidase obtida com a expressão de β-glucosidase em E. coli do Exemplo

3 com o mesmo volume de solução de cultura. Verificou-se assim que a produtividade da β-glucosidase da presente invenção era alta.

EXEMPLO 11

SACARIFICAÇÃO DE CELULOSE MICROCRISTALINA PELA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA QUE CONTÉM A β-GLUCOSIDASE E A CELULASE DERIVADA DO FUNGO FILAMENTOSO

DO GÊNERO TRICHODERMA

[074] A composição enzimática contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma preparada no Exemplo 10 foi usada para a reação de sacarificação. Como biomassa para sacarificação, foi utilizada celulose microcristalina (fabricada pela Merck). Com exceção da biomassa usada, a reação de sacarificação e a análise de açúcar do sobrenadante sacarificado foram conduzidas da mesma maneira que no Exemplo 6. Uma quantidade de enzima adicionada foi de 8 mg/g - biomassa.

Para controle comparativo, apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi utilizada, e a reação de sacarificação e análise de açúcar de um sobrenadante sacarificado foram realizadas da mesma maneira. Como resultado, a sacarificação usando a composição enzimática contendo a β- glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma aumentou em uma quantidade acumulada de glicose cerca de 1,6 vezes e diminuiu uma quantidade acumulada de celobiose, em comparação com a sacarificação usando apenas a celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma. Os resultados de glicose/celobiose obtidos por análise de açúcar são mostrados na Tabela 6.

TABELA 6 Celulase derivada do fungo Composição enzimática contendo a β- filamentoso do gênero Enzima Usada glucosidase e a celulase derivada do fungo Trichoderma (Controle filamentoso do gênero Trichoderma Comparativo) Glicose (g/L) 20,96 12,80 Celobiose (g/L) Limite de detecção ou menos 3,19

EXEMPLO 12

SACARIFICAÇÃO DE CELULOSE EM PÓ DE MATERIAL DE MADEIRA PELA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA QUE CONTÉM A β-GLUCOSIDASE E A CELULASE DERIVADA DO FUNGO

FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA

[075] A composição enzimática contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma preparada no Exemplo 10 foi usada para a reação de sacarificação. Como biomassa para sacarificação, foi utilizada a celulose em pó de material de madeira, Arbocel (marca registrada) (J. Rettenmaier & Sohne). Com exceção da biomassa usada, a reação de sacarificação e a análise de açúcar do sobrenadante sacarificado foram conduzidas da mesma maneira que no Exemplo 11. Para controle comparativo, apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi utilizada, e a sacarificação e análise de açúcar de um sobrenadante sacarificado foram realizadas da mesma maneira. Como resultado, a sacarificação usando a composição enzimática contendo a β- glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma aumentou em uma quantidade acumulada de glicose cerca de 1,8 vezes e resultou em um acúmulo não detectável de celobiose, em comparação com a sacarificação usando apenas a celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma. Os resultados de glicose/celobiose obtidos por análise de açúcar são mostrados na Tabela 7.

TABELA 7 Composição enzimática contendo a Celulase derivada do β-glucosidase e a celulase derivada fungo filamentoso do Enzima Usada do fungo filamentoso do gênero gênero Trichoderma Trichoderma (Controle Comparativo) Glicose (g/L) 25,60 14,12 Celobiose (g/L) Limite de detecção ou menos 3,27

EXEMPLO 13

SACARIFICAÇÃO DE BAGAÇO TRATADO COM ÁLCALIS PELA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA QUE CONTÉM A β-GLUCOSIDASE E A CELULASE DERIVADA DO FUNGO

FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA

[076] A composição enzimática contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma preparada no Exemplo 10 foi usada para a reação de sacarificação. Como biomassa para sacarificação, foi utilizado o bagaço tratado com álcalis (pré-tratado). Com exceção da biomassa usada, a reação de sacarificação e a análise de açúcar do sobrenadante sacarificado foram conduzidas da mesma maneira que no Exemplo 11. Para controle comparativo, apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi utilizada, e a sacarificação e análise de açúcar de um sobrenadante sacarificado foram realizadas da mesma maneira.

Como resultado, a sacarificação usando a composição enzimática contendo a β- glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma aumentou em uma quantidade acumulada de glicose cerca de 1,8 vezes e resultou em um acúmulo não detectável de celobiose, em comparação com a sacarificação usando apenas a celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma. Os resultados de glicose/celobiose obtidos por análise de açúcar são mostrados na Tabela 8.

TABELA 8 Composição enzimática contendo a Celulase derivada do β-glucosidase e a celulase derivada fungo filamentoso do Enzima Usada do fungo filamentoso do gênero gênero Trichoderma Trichoderma (Controle Comparativo) Glicose (g/L) 24,75 13,98 Celobiose (g/L) Limite de detecção ou menos 5,19

EXEMPLO 14

CONFIRMAÇÃO DOS COMPONENTES REMANESCENTES DA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO A β-GLUCOSIDASE E A CELULASE DERIVADA DO FUNGO FILAMENTOSO

DO GÊNERO TRICHODERMA EM UM SOBRENADANTE SACARIFICADO

[077] A composição enzimática contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma preparada no Exemplo 10 foi usada para a reação de sacarificação. Como biomassa para sacarificação, foram utilizadas celulose em pó de material de madeira, Arbocel (marca registrada) (J. Rettenmaier & Sohne), bagaço tratado com álcalis e bagaço não tratado sem pré-tratamento. A reação de sacarificação foi realizada sob uma condição de reação de 35ºC do mesmo modo como no Exemplo 11; uma amostra após 24 horas da reação de sacarificação foi centrifugada sob uma condição de 10.000 x g durante 5 minutos; e um sobrenadante sacarificado foi coletado. Foram retirados 3,5 μL do sobrenadante sacarificado e misturados com um volume igual de tampão de amostra; e a mistura foi aquecida a 95ºC durante 10 minutos e submetidas ao SDS-PAGE de acordo com o Exemplo de Referência 6. Para confirmação de bandas da enzima utilizada para a sacarificação, a composição enzimática, que foi diluída de modo a ter a mesma concentração como o da solução da reação de sacarificação, também foi submetida ao SDS-PAGE da mesma maneira que o sobrenadante sacarificado. Para um controle comparativo, apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, obtida pela cultura dos fungos filamentosos do gênero Trichoderma não transformados, foi utilizada, e a sacarificação, a coleta de um sobrenadante sacarificado e SDS-PAGE foram realizados da mesma maneira. Como resultado, em todos os casos para a sacarificação da celulose em pó a partir de madeira, bagaço tratado com álcali e bagaço não tratado, a banda para a β-glucosidase da presente invenção foi claramente observada no sobrenadante sacarificado com a composição enzimática contendo a β- glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma; e confirmou-se que a β-glucosidase da presente invenção pode ser mais facilmente recuperada como um sobrenadante sacarificado que muitos outros componentes de celulase derivadas de fungos filamentosos do gênero Trichoderma. Além disso, na sacarificação de celulose em pó a partir de material de madeira, foram observadas mais bandas de mais componentes de celulase derivados de fungos filamentosos do gênero Trichoderma no sobrenadante sacarificado com a composição enzimática que contém a β- glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, em comparação com o sobrenadante sacarificado apenas com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma. Foi, portanto, confirmado que quando a β-glucosidase da presente invenção foi usada como uma composição enzimática, em combinação com a celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma, a celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma também pode ser mais facilmente recuperada como um sobrenadante sacarificado. Uma fotografia do gel SDS- PAGE é mostrada na Figura 3.

EXEMPLO 15

MEDIÇÃO DA ATIVIDADE REMANESCENTE DA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO A β-GLUCOSIDASE E A CELULASE DERIVADA DO FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO

TRICHODERMA EM UM SOBRENADANTE SACARIFICADO DE CELULOSE EM PÓ DE MATERIAL DE MADEIRA

[078] Em relação ao sobrenadado sacarificado de celulose em pó a partir de material de madeira com a composição enzimática recuperada no Exemplo 14, a atividade enzimática foi medida de acordo com os Exemplos de Referência 2, 3 e 4. A composição enzimática, que foi diluída de modo a ter a mesma concentração que a da solução da reação de sacarificação no

Exemplo 14, também foi medida quanto a atividade enzimática.

A razão da atividade enzimática de um sobrenadante sacarificado quando a atividade enzimática da composição enzimática é diluída de modo a ter a mesma concentração que em uma solução de reação de sacarificação foi tomada como 100%, sendo considerada uma atividade remanescente no sobrenadante sacarificado, e tais atividades são apresentadas na Tabela 9. A partir dos resultados da atividade remanescente de β-glucosidase, foi confirmado que a β-glucosidase da presente invenção pode ser mais facilmente recuperada como um sobrenadante sacarificado que a β- glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

Além disso, a partir dos resultados da atividade remanescente da β-xilosidase e da atividade remanescente da celobiohidrolase/endoglucanase, confirmou-se que quando a β-glucosidase da presente invenção foi usada como uma composição enzimática juntamente com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, a β-xilosidase, celobiohidrolase e endoglucanase derivadas do fungo filamentoso do gênero Trichoderma podem ser facilmente recuperadas como um sobrenadante sacarificado.

TABELA 9

Celulase derivada do Composição enzimática fungo filamentoso do Enzima Usada contendo a β-glucosidase e a gênero Trichoderma celulase derivada do fungo (Controle Comparativo) filamentoso do gênero Trichoderma

Atividade remanescente da β- 98,5 77,2 glucosidase (%)

Atividade remanescente da β- 29,3 1,6 xilosidase (%)

Atividade remanescente da 70,5 19,9 celobiohidrolase/endoglucanase (%)

EXEMPLO 16

MEDIÇÃO DA ATIVIDADE REMANESCENTE DA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO A β-GLUCOSIDASE E A CELULASE DERIVADA DO FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO

TRICHODERMA EM UM SOBRENADANTE SACARIFICADO DE BAGAÇO NÃO TRATADO

[079] Em relação ao sobrenadado sacarificado de bagaço não tratado com a composição enzimática recuperada no Exemplo 14, a atividade enzimática foi medida de acordo com os Exemplos de Referência 2, 3 e 4. A composição enzimática, que foi diluída de modo a ter a mesma concentração que a da solução da reação de sacarificação no Exemplo 14, também foi medida quanto a atividade enzimática. A razão da atividade enzimática de um sobrenadante sacarificado quando a atividade enzimática da composição enzimática é diluída de modo a ter a mesma concentração que em uma solução de reação de sacarificação foi tomada como 100%, sendo considerada uma atividade remanescente no sobrenadante sacarificado, e tais atividades são apresentadas na Tabela 10. A partir dos resultados da atividade remanescente de β-glucosidase, foi confirmado que a β-glucosidase da presente invenção pode ser mais facilmente recuperada como um sobrenadante sacarificado que a β- glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma. Além disso, a partir dos resultados da atividade remanescente da β-xilosidase e da atividade remanescente da celobiohidrolase/endoglucanase, confirmou-se que quando a β-glucosidase da presente invenção foi usada como uma composição enzimática juntamente com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, a β-xilosidase, celobiohidrolase e endoglucanase derivadas do fungo filamentoso do gênero Trichoderma podem ser facilmente recuperadas como um sobrenadante sacarificado.

TABELA 10 Composição enzimática Celulase derivada do fungo contendo a β-glucosidase e a filamentoso do gênero Enzima Usada celulase derivada do fungo Trichoderma (Controle filamentoso do gênero Comparativo) Trichoderma Atividade remanescente da β- 92,0 44,2 glucosidase (%) Atividade remanescente da β- 21,9 3,4 xilosidase (%) Atividade remanescente da celobiohidrolase/endoglucanase 42,4 37,3 (%) EXEMPLO 17

MEDIÇÃO DA ATIVIDADE REMANESCENTE DA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO A β-GLUCOSIDASE E A CELULASE DERIVADA DO FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO

TRICHODERMA EM UM SOBRENADANTE SACARIFICADO DE BAGAÇO TRATADO COM ÁLCALI

[080] Em relação ao sobrenadado sacarificado de bagaço tratado com álcalis com a composição enzimática recuperada no Exemplo 14, a atividade enzimática foi medida de acordo com os Exemplos de Referência 2, 3 e 4. A composição enzimática, que foi diluída de modo a ter a mesma concentração que a da solução da reação de sacarificação no Exemplo 14, também foi medida quanto a atividade enzimática. A razão da atividade enzimática de um sobrenadante sacarificado quando a atividade enzimática da composição enzimática é diluída de modo a ter a mesma concentração que em uma solução de reação de sacarificação foi tomada como 100%, sendo considerada uma atividade remanescente no sobrenadante sacarificado, e tais atividades são apresentadas na Tabela 11. A partir dos resultados da atividade remanescente de β-glucosidase, foi confirmado que a β-glucosidase da presente invenção pode ser mais facilmente recuperada como um sobrenadante sacarificado que a β-glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma. Além disso, a partir dos resultados da atividade remanescente da β-xilosidase e da atividade remanescente da celobiohidrolase/endoglucanase, confirmou-se que quando a β-glucosidase da presente invenção foi usada como uma composição enzimática juntamente com a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, a β-xilosidase, celobiohidrolase e endoglucanase derivadas do fungo filamentoso do gênero Trichoderma podem ser facilmente recuperadas como um sobrenadante sacarificado.

TABELA 11 Composição enzimática Celulase derivada do fungo contendo a β-glucosidase e a filamentoso do gênero Enzima Usada celulase derivada do fungo Trichoderma (Controle filamentoso do gênero Comparativo) Trichoderma Atividade remanescente da β- 59,2 44,5 glucosidase (%) Atividade remanescente da β- 15,1 0,4 xilosidase (%) Atividade remanescente da celobiohidrolase/endoglucanase 53,0 23,3 (%) EXEMPLO COMPARATIVO 1

PRODUÇÃO DE FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA TRANSFORMADO COM O GENE β-GLUCOSIDASE DERIVADO DO GÊNERO FUNGO FILAMENTOSO

ASPERGILLUS E PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA POR CULTURA DO TRANSFORMANTE

[081] Da mesma maneira que no Exemplo 9, um plasmídeo foi projetado e produzido de modo a introduzir a sequência nucleotídica representada pela SEQ ID NO: 11 (sequência nucleotídica que codifica o gene β-glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Aspergillus) em um genoma de uma célula hospedeira, e expressar e secretar a β-glucosidase possuindo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10. O plasmídeo foi introduzido em uma cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1; o Trichoderma reesei foi infectado com o Agrobacterium transformado; e foi obtida uma cepa de Trichoderma transformada com β-glucosidase. Da mesma maneira que no Exemplo 10, o fungo filamentoso produzido acima do gênero Trichoderma transformado com o gene β-glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Aspergillus foi cultivada pelo mesmo método que no Exemplo de Referência 7; a solução de cultura após 4 dias desde o início da cultura foi centrifugada; um sobrenadante foi filtrado por uma membrana de ultrafiltração para remover corpos fúngicos; e, desse modo, foi preparada uma composição enzimática contendo a β-glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Aspergillus expressa no fungo filamentoso do gênero Trichoderma e celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma. O SDS-PAGE na composição enzimática foi conduzida de acordo com o Exemplo de Referência 6, de modo que a proteína expressa foi confirmada. Para um controle comparativo, apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, obtida pela cultura dos fungos filamentosos do gênero Trichoderma não transformados, foi utilizada e a cultura, coleta de um sobrenadante, filtração do sobrenadante cultivado e o SDS-PAGE foram realizados da mesma maneira. Como resultado da SDS-PAGE, foi confirmado que a β-glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Aspergillus foi expressa. Uma fotografia do gel SDS-PAGE é mostrada na Figura 4. De acordo com o Exemplo de Referência 8, a ação inibidora da glicose sobre a atividade da β-glucosidase foi medida na composição enzimática que contém a β-glucosidase derivada do fungo filamentoso do gênero Aspergillus e a celulose derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma, e os resultados foram utilizados para comparação com os do Exemplo 18.

EXEMPLO 18 MÉTODO PARA MEDIR A AÇÃO INIBITÓRIA DA GLICOSE SOBRE A ATIVIDADE DA β-

GLUCOSIDASE

[082] De acordo com o Exemplo de Referência 8, a ação inibidora da glicose sobre a atividade da β-glucosidase foi medida nas composições enzimáticas: contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma preparada no Exemplo 10; e contendo o extrato isento de células de E. coli transformada com o gene mutante da β-

glucosidase preparada no Exemplo 5. Para controle comparativo, apenas a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi utilizada, e a ação inibitória da glicose sobre a atividade da β-glucosidase foi medida da mesma maneira.

Quando a atividade da β-glucosidase sob a condição em que uma solução de reação tinha uma concentração de glicose de 0 g/L foi padronizada como unidade, os valores para a atividade relativa na presença de glicose são mostrados na Figura 5. Além disso, para a atividade da β-glucosidase sob a condição em que uma solução de reação com uma concentração de glicose de 0 g/L foi padronizada como unidade, os valores para a atividade relativa sob a condição de 8 g/L de glicose são mostrados na Tabela 12; e os valores para a atividade relativa sob a condição de 20 g/L de glicose são mostrados na Tabela 13. Como resultado, tanto a composição enzimática contendo a β-glucosidase e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero

Trichoderma quanto a composição enzimática contendo o extrato livre de células de E. coli transformada com o gene mutante da β-glucosidase exibiram uma menor diminuição da atividade da β-glucosidase pela glicose em comparação com a composição contendo apenas a celulase derivada de fungo filamentoso gênero Trichoderma e com a composição enzimática do Exemplo Comparativo

1 contendo β-glucosidase derivada de fungo filamentoso do gênero Aspergillus e celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

Ou seja, tanto a composição enzimática contendo a β-glucosidase da presente invenção e a celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma quanto a composição enzimática contendo o extrato livre de células de E. coli transformada com o gene mutante da β-glucosidase foram menos propensas a sofrer inibição na atividade da β-glucosidase pela glicose quando comparadas com composições contendo apenas a celulase derivada de fungo filamentoso gênero Trichoderma e com a composição enzimática do Exemplo Comparativo 1 contendo β-glucosidase derivada de fungo filamentoso do gênero Aspergillus e celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

TABELA 12 Atividade de BGL (valor relativo) na presença de 8 g/L de glicose quando a atividade de BGL na ausência de glicose é tomada como unidade β-glucosidase da presente invenção (SEQ ID NO: 1) (β-glucosidase derivada de um protista do gênero 1,49 Pseudotrichonympha e celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma) β-glucosidase mutante 1 da presente invenção (SEQ ID NO: 6) (extrato sem células de E. coli transformada com o gene do mutante 0,71 da β-glucosidase) β-glucosidase mutante 2 da presente invenção (SEQ ID NO: 8) (extrato sem células de E. coli transformada com o gene do mutante 0,74 da β-glucosidase) Exemplo Comparativo 1: β-glucosidase derivada de fungo filamentoso do gênero Aspergillus (composição enzimática contendo a β-glucosidase derivada de fungo 0,46 filamentoso do gênero Aspergillus e celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma) Controle comparativo: BGL derivado de fungo filamentoso do gênero Trichoderma (somente a celulase derivada de fungo filamentoso do 0,09 gênero Trichoderma) TABELA 13 Atividade de BGL (valor relativo) na presença de 20 g/L de glicose quando a atividade de BGL na ausência de glicose é tomada como unidade β-glucosidase da presente invenção (SEQ ID NO: 1) (β-glucosidase derivada de um protista do gênero 0,94 Pseudotrichonympha e celulase derivada do fungo filamentoso do gênero Trichoderma) β-glucosidase mutante 1 da presente invenção (SEQ ID NO: 6) (extrato sem células de E. coli transformada com o gene do mutante 0,70 da β-glucosidase) β-glucosidase mutante 2 da presente invenção (SEQ ID NO: 8) (extrato sem células de E. coli transformada com o gene do mutante 0,72 da β-glucosidase)

Atividade de BGL (valor relativo) na presença de 20 g/L de glicose quando a atividade de BGL na ausência de glicose é tomada como unidade Exemplo Comparativo 1: β-glucosidase derivada de fungo filamentoso do gênero Aspergillus (composição enzimática contendo a β-glucosidase derivada de fungo 0,20 filamentoso do gênero Aspergillus e celulase derivada de fungo filamentoso do gênero Trichoderma) Controle comparativo: BGL derivado de fungo filamentoso do gênero Trichoderma (somente a celulase derivada de fungo filamentoso do 0,04 gênero Trichoderma)

[083] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados no relatório descritivo são integralmente incorporados ao presente como referência.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. POLIPEPTÍDEO, caracterizado por ser qualquer polipeptídeo dos seguintes de (A) a (C): (A) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1; (B) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos obtida substituindo, deletando, inserindo e/ou adicionando um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e possuindo atividade de β-glucosidase; e (C) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, e possuindo atividade de β-glucosidase.

2. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por ser qualquer um dos seguintes de (a) a (d): (a) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2; (b) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos obtida por substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou vários nucleotídeos na sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2 e codificando um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2, e que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; e (d) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 1.

3. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por ser qualquer um dos seguintes de (a) a (d): (a) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2; (b) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos obtida por substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou vários nucleotídeos na sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2 e codificando um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; (c) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 2, e que codifica um polipeptídeo com atividade de β-glucosidase; e (d) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 1.

4. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 3.

5. TRANSFORMANTE, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 3, ou o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 4.

6. FUNGO FILAMENTOSO TRANSFORMADO, do gênero Trichoderma, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 3, ou o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 4.

7. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA, caracterizado por compreender a etapa de cultura do transformante, conforme definido na reivindicação 5, ou do fungo filamentoso transformado do gênero Trichoderma, conforme definido na reivindicação 6.

8. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR a partir de uma biomassa contendo celulose, caracterizado por compreender a etapa de produção da composição enzimática, conforme definida na reivindicação 7, em que a composição enzimática obtida pela etapa é usada para produzir a solução de açúcar.

9. β-GLUCOSIDASE derivada de um protista do gênero pseudotrichonympha, caracterizada pela atividade da β-glucosidase ser de 0,5 ou maior sob uma condição de uma concentração de glicose de 8 g/L quando uma atividade de β-glucosidase na ausência de glicose é tomada como unidade.

10. COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA, caracterizada por compreender uma β-glucosidase derivada de um protista do gênero Pseudotrichonympha e uma celulase derivada de um fungo filamentoso.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fungo filamentoso ser um fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

12. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR, a partir de uma biomassa contendo celulose, caracterizado por compreender o uso da composição enzimática, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 11.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender a etapa de recuperação da composição enzimática, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 11, a partir da solução de açúcar.