JPWO2019044887A1 - 新規β−グルコシダーゼ、これを含む酵素組成物およびこれらを用いた糖液の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]下記(A)〜(C)のいずれか1つのポリペプチド。
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
(C)配列番号1に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
[2]下記(a)〜(d)のいずれか1つのポリヌクレオチド。
(a)配列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に記載の塩基配列と少なくとも60%の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(d)[1]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
[3]下記(a)〜(d)のいずれか1つのポリヌクレオチド。
(a)配列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に記載の塩基配列と少なくとも50%の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(d)[1]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
[4][2]または[3]に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[5][2]または[3]に記載のポリヌクレオチドまたは[4]に記載の発現ベクターを有する、形質転換体。
[6][2]または[3]に記載のポリヌクレオチドまたは[4]に記載の発現ベクターを有する、形質転換Trichoderma属糸状菌。
[7][5]に記載の形質転換体または[6]に記載の形質転換Trichoderma属糸状菌を培養する工程を含む、酵素組成物の製造方法。
[8][7]に記載の酵素組成物を製造する工程を含み、当該工程によって得られた酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
[9]グルコース非存在下でのβ−グルコシダーゼの活性を1としたとき、グルコース濃度8g/Lの条件下でのβ−グルコシダーゼ活性が0.5以上であることを特徴とする、Pseudotrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼ。
[10]Pseudotrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼと、糸状菌由来セルラーゼとを含む酵素組成物。
[11]前記糸状菌がTrichoderma属糸状菌であることを特徴とする、[10]に記載の酵素組成物。
[12][10]または[11]に記載の酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
[13]前記糖液から[10]または[11]に記載の酵素組成物を回収する工程を含む、[12]に記載の糖液を製造する方法。
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
(C)配列番号1に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
市販のタンパク質濃度測定試薬(Quick Start Bradfordプロテインアッセイ、Bio−Rad製)を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬250μLに希釈した糸状菌由来セルラーゼ溶液を5μL添加し、室温で5分間静置後の595nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてBSAを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
1mMp-ニトロフェニル-β−グルコピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加して30℃で10分間反応させた。その後2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは1mM p-ニトロフェニル-β−グルコピラノシドを含有する50mM酢酸ナトリウムバッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。この際に405nmの吸光度が1を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はp−ニトロフェノール溶液を濃度0.1mM、0.2mM、1mM、2mMになるように調製し、酵素希釈液の代わりに10μLを入れ、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。
1mMp-ニトロフェニル-β−キシロピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは1mMp-ニトロフェニル-β−キシロピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。この際に405nmの吸光度が1を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はp−ニトロフェノール溶液を濃度0.1mM、0.2mM、1mM、2mMになるように調製し、酵素希釈液の代わりに10μLを入れ、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。
1mMp-ニトロフェニル-β−ラクトピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加し30℃で60分間反応させた。その後、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは1mMp-ニトロフェニル-β−ラクトピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。この際に405nmの吸光度が1を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はp−ニトロフェノール溶液を濃度0.1mM、0.2mM、1mM、2mMになるように調製し、酵素希釈液の代わりに10μLを入れ、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。
グルコース、セロビオースは、ACQUITY UPLC システム(Waters)を用いて、以下の条件で定量分析した。
グルコース、セロビオースの標品で作成した検量線をもとに、定量分析した。セロビオースが1g/Lより低い値の場合は、検出限界以下とした。
カラム:AQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1×100mm Column
分離法:HILIC
移動相:移動相A:80%アセトニトリル、0.2%TEA(トリエチルアミン)水溶液、移動相B:30%アセトニトリル、0.2%TEA(トリエチルアミン)水溶液とし、下記グラジエントに従った。グラジエントは下記の時間に対応する混合比に到達する直線的なグラジエントとした。
開始条件:(A99.90%、B0.10%)、開始2分後:(A96.70%、B3.30%)、開始3.5分後:(A95.00%、B5.00%)、開始3.55分後:(A99.90%、B0.10%)、開始6分後:(A99.90%、B0.10%)。
検出方法:ELSD(蒸発光散乱検出器)
流速:0.3mL/min
温度:55℃
SDS−PAGEは15%ポリアクリルアミドゲルe−PAGEL(アトー)を使用した。該β−グルコシダーゼ形質転換Trichoderma株酵素5μgを、等体積のサンプルバッファーEz−apply(アトー)と混合し、95℃10分加熱して、泳動サンプルとした。分子量マーカーは、Precision Plus Protein Dual Color Standards(バイオラッド)を使用した。泳動バッファーは25mMトリス、192mMグリシン、0.1%SDS水溶液とし、20mA定電流で90分間電気泳動を行った。電気泳動後のゲルはBio−Safe Comassie G−250 Stain(バイオラッド)により染色し、純水で脱染した。
Trichoderma属糸状菌の胞子を1.0×107/mLになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液2.5mLを1Lバッフル付フラスコに入れた表1に記した組成で構成される培養液250mLへ接種し、28℃、160rpmの培養条件にて3日間培養(前培養)を行った。本培養は前培養液250mLをそれぞれ5L容ミニジャーに入れた表2に示した本培養液2.5Lへ接種させ、28℃、700rpm、1vvm、pH5の培養条件にて4日間培養を行った。中和は10%アンモニアと1N硫酸を使用した。培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行うことで、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼを取得した。
1mMp-ニトロフェニル-β−グルコピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)、50mM酢酸バッファーおよびグルコースを0、4、8または20g/L含有する混合液に酵素液を添加して反応液合計が100μLとなるように調製し、30℃で100分間反応させた。その後2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは、上記反応液の酵素液添加前の混合液と同量の、1mM p-ニトロフェニル-β−グルコピラノシド、50mM酢酸ナトリウムバッファーおよびグルコースを0、4、8または20g/Lを含有する混合液に2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合した後、酵素液を、ブランクの総液量が110μLになるよう添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。
イエシロアリ腸管抽出物中に含まれる難培養性のシロアリ共生原生生物群の中からPseudotrichonympha grassii細胞を選定し、マイクロキャピラリーで分画して、1細胞からのRNA抽出、逆転写、cDNA増幅、ライブラリーへの変換、およびシークエンシングを笹川らのQuartz−seq法によって行った(Sasagawa,Y.et al.:Genome Biol.,14: R31,2013)。シークエンシングの結果から、β−グルコシダーゼ候補をコードする塩基配列の選定を行った。タンパク質のシグナル配列を予測するツールSignalP(http:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を用いて前記塩基配列がコードするアミノ酸配列の、シグナル配列部分を予測した。結果、シグナル配列を除いたβ−グルコシダーゼ候補配列として配列番号1に記載のアミノ酸配列、該アミノ酸配列をコードする塩基配列として配列番号2の塩基配列を取得した。配列番号1に記載のアミノ酸配列のファミリーをPROSITEで調べたところ、配列番号1の259番目から276番目にGlycosyl hydrolases family 3 active siteにあたる配列番号5のアミノ酸配列を有していることが分かった。
実施例1で取得した、配列番号2(Pseudotrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼ候補遺伝子をコードする塩基配列)に記載のポリヌクレオチドをpET14bのNdeIおよびXhoI制限酵素サイトに連結したプラスミドを人工遺伝子合成サービス(Genscript社)により合成した。ここで、上記プラスミド配列の構成は形質転換体においてN末端にHis−tagが付加された、配列番号1に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼが発現するように設計した。前記プラスミドを大腸菌(Rossetta2(DE3))株に形質転換した。
実施例2で作製したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌をアンピシリン含有LB培地10mLに植菌し、37℃で一晩振とう培養(前培養)を行った。本培養として、アンピシリン含有LB培地に、前培養で得られた菌体を植菌し、波長600nmでの濁度OD600が0.8となるまで37℃で振とう培養を行った。その後、最終濃度が0.1mMになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)を加え、さらに16℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.6)に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。前記β−グルコシダーゼ候補遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液のβ−グルコシダーゼ活性を測定したところ、無細胞抽出液に含まれるタンパク質1mgあたり0.14Uであった。また、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の培養液1Lから得られる全β−グルコシダーゼ活性は21.6Uであった。比較対照として、β−グルコシダーゼ候補遺伝子を含まないプラスミドの形質転換体の無細胞抽出液を同様に調製し、β−グルコシダーゼ活性を測定したところ、β−グルコシダーゼ活性は検出されなかった。すなわち、配列番号1に記載のアミノ酸配列にHis−tagが付加したポリペプチドを発現した無細胞抽出液からのみ、β−グルコシダーゼ活性が検出されたことから、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Pseudotrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼ配列であることが分かった。
実施例2と同様に、配列番号2と配列同一性53%の配列番号7および配列番号2と配列同一性53%の配列番号9に記載のポリヌクレオチドをそれぞれpET14bのNdeIおよびXhoI制限酵素サイトに連結したプラスミドを人工遺伝子合成サービス(Genscript社)により合成した。ここで、上記プラスミド配列の構成は形質転換体においてN末端にHis−tagが付加された、配列番号6および配列番号8に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼがそれぞれ発現するように設計した。前記プラスミドを大腸菌(Rossetta2(DE3))株に形質転換した。
実施例4で作製したβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌をアンピシリン含有LB培地10mLに植菌し、37℃で一晩振とう培養(前培養)を行った。本培養として、アンピシリン含有LB培地に、前培養で得られた菌体を植菌し、波長600nmでの濁度OD600が0.8となるまで37℃で振とう培養を行った。その後、最終濃度が0.1mMになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)を加え、さらに16℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.6)に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した後、限外ろ過膜ユニットで抽出液体積を12分の1にした後、β−グルコシダーゼ活性の有無を調べた。比較対照として、β−グルコシダーゼ候補遺伝子を含まないプラスミドの形質転換体の無細胞抽出液を同様に調製し、β−グルコシダーゼ活性の有無を調べたところ、β−グルコシダーゼ活性は検出されなかった。すなわち、配列番号1と配列同一性88%の配列番号6および配列番号1と配列同一性80%の配列番号8に記載のアミノ酸配列にHis−tagが付加したポリペプチドを発現した無細胞抽出液からのみ、β−グルコシダーゼ活性が検出されたことから、配列番号6および配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を持つことが分かった。β−グルコシダーゼ活性測定の結果を表3に示した。
参考例7に従って、Trichoderma reeseiの培養を行い、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼを製造した。実施例3で作製したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液を、前記Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼと混合した酵素組成物を調製し、糖化反応に使用した。前記酵素組成物は、糖化反応液1mLあたりのTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのタンパク濃度が0.2g/L、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液のタンパク濃度が2.1g/Lとなるように混合した。糖化対象のバイオマスとしては、木材原料粉末セルロースArbocel(登録商標)(J.Rettenmaier&Sohne)を使用した。糖化反応は以下のようにして行った。2mLチューブの中にバイオマスを50mg分入れ、酢酸ナトリウムバッファー(pH5.2)を終濃度50mMになるように添加し、木材原料粉末セルロースの固形分濃度が反応開始時に5重量%となるように純水を加えた。さらに、前記酵素組成物を、前記調製液に添加し、ヒートブロックローテーターを用いて、35℃の反応条件で反応を開始した。24時間糖化反応後のサンプルを10,000×gの条件下で5分間遠心分離を行い、上清を分取し、上清のボリュームの10分の1量の1N 水酸化ナトリウム水溶液を添加し、糖化反応を停止した。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液を参考例5に従い糖分析に供した。比較対照として、β−グルコシダーゼ遺伝子を含まないベクターのみを形質転換した大腸菌の無細胞抽出液を用い、上記と同様に糖化反応液1mLあたりのタンパク濃度が2.1g/LになるようTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼと混合して、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。なお、上記糖化反応に使用したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液とTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のβ−グルコシダーゼ活性はβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液を含まないTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼの活性の2.6倍となった。糖化反応の結果、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液とTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を添加した場合、本発明のβ−グルコシダーゼを含まないTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを添加した場合に比べて、グルコース蓄積量が約2.7倍に増加し、セロビオースの蓄積量は減少した。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表4に示した。
実施例3で酵素活性を確認できたβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液のHis−tag精製を行った。His−tag精製はHis・Bind Purification Kit(メルクミリポア)を用い、説明書のバッチメソッドに従った。参考例6に従って、精製画分のSDS−PAGEを行ったところ、溶出画分において分子量75kDaから100kDaの間に最も濃いバンドが検出され、理論分子量83.9kDaであるHis−tag付きβ−グルコシダーゼが精製されたことが確認できた。SDS−PAGEゲルの写真を図1に示した。ゲルろ過カラムPD−10(GEヘルスケア)を用いて説明書の方法に従い、前記溶出画分のバッファーを20mMTris−HCl(PH7.6)に交換し、これを粗精製β−グルコシダーゼとした。該粗精製β−グルコシダーゼのタンパク質濃度およびβ−グルコシダーゼ活性を測定したところ、粗精製β−グルコシダーゼに含まれるタンパク質1mgあたり3.50Uであった。
参考例7に従って、Trichoderma reeseiの培養を行い、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼを製造した。実施例7で作製した粗精製β−グルコシダーゼを前記Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼと混合した酵素組成物を調製し、糖化反応に使用した。前記酵素組成物は、糖化反応液1mLあたりのTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのタンパク濃度が0.2g/L、粗精製β−グルコシダーゼのタンパク濃度が0.017g/Lとなるように混合した。酵素組成物に粗精製β−グルコシダーゼを用いた以外は、実施例6と同様に糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。比較対照としてTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、上記と同様に糖化反応液1mLあたりのタンパク濃度が2.1g/LになるようTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを添加して、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。なお、上記糖化反応に使用した粗精製β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のβ−グルコシダーゼ活性は、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみの活性の1.6倍となった。糖化反応の結果、Trichodermaセルラーゼに粗精製β−グルコシダーゼを混合した酵素組成物を添加した場合、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを添加した場合に比べて、いずれもグルコース蓄積量が約1.8倍に増加し、セロビオースの蓄積量は減少した。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表5に示した。
配列番号2に記載の塩基配列(PseudoTrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼ遺伝子をコードする塩基配列)と配列同一性66%の配列番号3に記載のポリヌクレオチドをpET14bのNdeIおよびXhoI制限酵素サイトに連結したプラスミドを、人工遺伝子合成サービス(Genscript社)により合成した。前記プラスミドから、配列番号3の塩基配列部分をPCRにより増幅し、Trichoderma reesei由来エンドグルカナーゼ1プロモーターの下流に、Aspergillus aculeatusのβ−グルコシダーゼの分泌シグナル配列とin−frameになるように連結し、該配列と形質転換体のハイグロマイシン耐性遺伝子をpBI101プラスミドのT−DNAボーダー間にクローニングした。作製したプラスミドのT−DNAボーダー間の配列を配列番号4に示した。ここで、配列番号4は上記配列が宿主細胞のゲノム中に導入され、下記塩基番号978〜3161(配列番号3)がコードする、配列番号1に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼが発現し、分泌されるように設計した。配列番号4の構成を下記に示す。
Pegl1=Trichoderma reesei由来エンドグルカナーゼ1プロモーター:塩基番号27〜920
Sbgl=Aspergillus aculeatus由来β−グルコシダーゼ分泌シグナル:塩基番号921〜977
bgl=Pseudotrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼ:塩基番号978〜3161(配列番号3)
Tegl1=Trichoderma reesei由来エンドグルカナーゼ1ターミネーター:塩基番号3162〜4019
PamdS=Aspergillus nidulans由来アセトアミダーゼプロモーター:塩基番号4020〜5027
hygR=ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス由来ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ:塩基番号5028〜6065
TamdS=Aspergillus nidulans由来アセトアミダーゼターミネーター:塩基番号6066〜6786
RB=右T−DNAボーダー:塩基番号6787〜6810。
実施例9で作製したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Trichoderma属糸状菌を参考例7と同様の方法で培養し、培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行うことで、Trichoderma属糸状菌で発現した本発明のβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を調製した。前記酵素組成物のタンパク質濃度を参考例1に従って測定し、参考例6に従ってSDS−PAGEを行い、発現タンパクの確認を行った。比較対照として非形質転換Trichoderma属糸状菌の培養により得られたTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に培養、上清回収、培養上清ろ過およびSDS−PAGEを行った。SDS−PAGEの結果、前記β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物では、本発明のβ−グルコシダーゼのバンドが、SDS−PAGEで確認できる酵素組成物のバンドの合計の10分の1より多いバンドとして観察され、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Trichoderma属糸状菌では本発明のβ−グルコシダーゼが多量に発現していることが確認できた。SDS−PAGEゲルの写真を図2に示した。
実施例10で調製したβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとしては、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を使用した。使用バイオマス以外は実施例6と同様に糖化反応および糖化上清の糖分析を行った。酵素の添加量は8mg/g−バイオマスとした。比較対照としてTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。結果、前記β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いた糖化では、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用いた糖化に比べて、グルコース蓄積量が約1.6倍に増加し、セロビオースの蓄積量は減少した。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表6に示した。
実施例10で調製したβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとしては、木材原料粉末セルロースArbocel(登録商標)(J.Rettenmaier&Sohne)を使用した。使用バイオマス以外は実施例11と同様にして、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。比較対照としてTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化、および糖化上清の糖分析を行った。結果、前記β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いた糖化では、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用いた糖化に比べて、グルコース蓄積量が約1.8倍に増加し、セロビオースの蓄積は検出されなかった。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表7に示した。
実施例10で調製したβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとして、アルカリ処理(前処理)を行ったバガスを使用した。使用バイオマス以外は実施例11と同様にして、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。比較対照として、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化、および糖化上清の糖分析を行った。結果、前記β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いた糖化では、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用いた糖化に比べて、グルコース蓄積量が約1.8倍に増加し、セロビオースの蓄積は検出されなかった。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表8に示した。
実施例10で調製したβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとして、木材原料粉末セルロースArbocel(登録商標)(J.Rettenmaier&Sohne)、アルカリ処理バガスおよび前処理を行っていない無処理バガスを使用した。35℃の反応条件で実施例11と同様に糖化反応を行い、24時間糖化反応後のサンプルを10,000×gの条件下で5分間遠心分離を行い、糖化上清を回収した。該糖化上清3.5μLを分取し、等量のサンプルバッファーと混合し、95℃10分加熱して、参考例6に従ってSDS−PAGEを行った。糖化に供した酵素のバンドの確認のため、糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物も、前記糖化上清と同様にSDS−PAGEを行った。比較対照として非形質転換Trichoderma属糸状菌の培養により得られたTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化、および糖化上清の回収、SDS−PAGEを行った。結果、木材原料粉末セルロース糖化、アルカリ処理バガス糖化および無処理バガス糖化のいずれの場合も、前記β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の糖化上清中では、本発明のβ−グルコシダーゼのバンドが明瞭に見られ、本発明のβ−グルコシダーゼはTrichoderma属糸状菌由来の他の多くのセルラーゼ成分よりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、木材原料粉末セルロース糖化では、β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の糖化上清中では、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみの糖化上清中に比べて、Trichoderma属糸状菌由来の多くのセルラーゼ成分のバンドがより多く観察され、本発明のβ−グルコシダーゼがTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Trichoderma属糸状菌由来セルラーゼも糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。SDS−PAGEゲルの写真を図3に示した。
実施例14で回収した、前記酵素組成物の木材原料粉末セルロース糖化上清について、参考例2、3および4に従って、酵素活性測定を行った。実施例14で糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物についても同様に酵素活性測定を行った。糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物の酵素活性を100%としたときの糖化上清の酵素活性の割合を糖化上清中の残存活性として表9に示した。β−グルコシダーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼは、Trichoderma属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼよりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、β−キシロシダーゼ残存活性およびセロビオハイドロラーゼ・エンドグルカナーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼがTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Trichoderma属糸状菌由来β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼが糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。
実施例14で回収した、前記酵素組成物の未処理バガス糖化上清について、参考例2、3および4に従って、酵素活性測定を行った。実施例14で糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物についても同様に酵素活性測定を行った。糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物の酵素活性を100%としたときの糖化上清の酵素活性の割合を糖化上清中の残存活性として表10に示した。β−グルコシダーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼは、Trichoderma属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼよりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、β−キシロシダーゼ残存活性およびセロビオハイドロラーゼ・エンドグルカナーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼがTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Trichoderma属糸状菌由来β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼが糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。
実施例14で回収した、前記酵素組成物のアルカリ処理バガス糖化上清について、参考例2、3および4に従って、酵素活性測定を行った。実施例14で糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物についても同様に酵素活性測定を行った。糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物の酵素活性を100%としたときの糖化上清の酵素活性の割合を糖化上清中の残存活性として表11に示した。β−グルコシダーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼは、Trichoderma属糸状菌由来β−グルコシダーゼよりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、β−キシロシダーゼ残存活性およびセロビオハイドロラーゼ・エンドグルカナーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼがTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Trichoderma属糸状菌由来β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼが糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。
実施例9と同様に、配列番号11に記載の塩基配列(Aspergillus属糸状菌由来β−グルコシダーゼ遺伝子をコードする塩基配列)が宿主細胞のゲノム中に導入され、配列番号10に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼが発現し、分泌されるように設計したプラスミドを作製した。該プラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL1株に導入し、Trichoderma reeseiに該形質転換アグロバクテリウムを感染させて、β−グルコシダーゼ形質転換Trichoderma株を取得した。実施例10と同様に、上記で作製したAspergillus属糸状菌由来β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Trichoderma属糸状菌を参考例7と同様の方法で培養し、培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行うことで、Trichoderma属糸状菌で発現したAspergillus属糸状菌由来β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を調製した。参考例6に従って前記酵素組成物のSDS−PAGEを行い、発現タンパクの確認を行った。比較対照として非形質転換Trichoderma属糸状菌の培養により得られたTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に培養、上清回収、培養上清ろ過およびSDS−PAGEを行った。SDS−PAGEの結果、Aspergillus属糸状菌由来β−グルコシダーゼが発現していることが確認できた。SDS−PAGEゲルの写真を図4に示した。参考例8に従い、該Aspergillus属糸状菌由来β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のグルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用測定を行い、結果を実施例18との比較に用いた。
参考例8に従い、実施例10で調製したβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼおよび実施例5で作製したβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液を含む酵素組成物のグルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用測定を行った。比較対照としてTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様にグルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用を測定した。反応液中のグルコース濃度が0g/Lの条件のβ−グルコシダーゼ活性を1として標準化したときの、グルコース存在下での相対活性の値を図5に示した。また、反応液中のグルコース濃度が0g/Lの条件のβ−グルコシダーゼ活性を1として標準化したときの、グルコース8g/Lの条件下での相対活性の値を表12に、グルコース20g/Lの条件下での相対活性の値を表13に示した。結果、前記β−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物およびβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液は、いずれもTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみおよび比較例1のAspergillus属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物と比較して、グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性の低下が小さかった。すなわち、本発明のβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物およびβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液は、いずれもTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼのみおよび比較例1のAspergillus属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼとTrichoderma属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物と比較して、グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害を受けにくかった。
Claims (13)
- 下記(A)〜(C)のいずれか1つのポリペプチド。
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
(C)配列番号1に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド - 下記(a)〜(d)のいずれか1つのポリヌクレオチド。
(a)配列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に記載の塩基配列と少なくとも60%の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(d)請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド - 下記(a)〜(d)のいずれか1つのポリヌクレオチド。
(a)配列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号2に記載の塩基配列と少なくとも50%の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(d)請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド - 請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項2または3に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載の発現ベクターを有する、形質転換体。
- 請求項2または3に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載の発現ベクターを有する、形質転換Trichoderma属糸状菌。
- 請求項5に記載の形質転換体または請求項6に記載の形質転換Trichoderma属糸状菌を培養する工程を含む、酵素組成物の製造方法。
- 請求項7に記載の酵素組成物を製造する工程を含み、当該工程によって得られた酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
- グルコース非存在下でのβ−グルコシダーゼの活性を1としたとき、グルコース濃度8g/Lの条件下でのβ−グルコシダーゼ活性が0.5以上であることを特徴とする、Pseudotrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼ。
- Pseudotrichonympha属原生生物由来β−グルコシダーゼと、糸状菌由来セルラーゼとを含む酵素組成物。
- 前記糸状菌がTrichoderma属糸状菌であることを特徴とする、請求項10に記載の酵素組成物。
- 請求項10または11に記載の酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
- 前記糖液から請求項10または11に記載の酵素組成物を回収する工程を含む、請求項12に記載の糖液を製造する方法。
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