ES2582320T3 - Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo - Google Patents

Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo

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ES2582320T3 ES12151850.0T ES12151850T ES2582320T3 ES 2582320 T3 ES2582320 T3 ES 2582320T3 ES 12151850 T ES12151850 T ES 12151850T ES 2582320 T3 ES2582320 T3 ES 2582320T3
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Abstract

Un polipéptido que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 24; y b) un fragmento de a) que tiene actividad celulolítica.

Description

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de unidades de p-hidroxifenilpropano diversamente sustituido que proporciona resistencia a la pared celular para soportar la tensión mecánica, y también protege la celulosa de la hidrólisis enzimática.
La lignocelulosa es una combinación de celulosa y hemicelulosa y polímeros de unidades de fenol propanol y lignina. Es físicamente dura, densa y e inaccesible y el material bioquímico más abundante en la biosfera. Los materiales que contienen lignocelulosa son, por ejemplo: virutas de madera dura y de madera blanda, pasta de madera, serrín y residuos industriales de forestales y de madera; biomasa agrícola tal como paja de cereales, pasta de remolacha azucarera, rastrojo y mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, tallos, hojas, cáscaras, cascarillas, y similares; productos de desecho tales como residuos sólidos urbanos, papel de periódico y de oficina de desecho, residuos de la molienda de, p. ej. cereales; cultivos destinados a la producción de energía (p. ej., sauce, chopo, pasto varilla o alpiste arundináceo, y similares). Los ejemplos preferidos son el rastrojo de maíz, el pasto varilla, la paja de cereales, el bagazo de caña de azúcar y los materiales derivados de la madera.
"Material celulósico" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier material que comprende celulosa, hemicelulosa y/o lignocelulosa como componente significativo. "Material lignocelulósico" significa cualquier material que comprende lignocelulosa. Tales materiales son, p. ej. materiales vegetales tales como madera incluyendo madera blanda y dura, cultivos herbáceos, residuos agrícolas, residuos de pasta de celulosa y de papel, papel usado, residuos de la industria alimenticia y de forraje, etc. Las fibras textiles, como el algodón, las fibras derivadas de algodón, lino, cáñamo, yute y fibras celulósicas elaboradas por el hombre como modal, viscosa, liocel son ejemplos específicos de materiales celulósicos.
El material celulósico es degradado en la naturaleza por diversos organismos diferentes, incluyendo bacterias y hongos. La celulosa es degradada típicamente por diferentes celulasas que actúan sucesivamente o simultáneamente. La conversión biológica de celulosa en glucosa requiere generalmente tres tipos de enzimas hidrolíticas: (1) Endoglucanasas que cortan los enlaces glicosídicos beta-1,4 internos; (2) Exocelobiohidrolasas que cortan el disacárido celobiosa del extremo de la cadena polimérica de celulosa; (3) Beta-1,4-glucosidasas que hidrolizan la celobiosa y otros celo-oligosacáridos cortos a glucosa. En otras palabras, los tres principales grupos de celulasas son celobiohidrolasas (CBH), endoglucanasas (EG) y beta-glucosidasas (BG).
La degradación de los sustratos que contienen celulosa más complejos requiere una amplia gama de enzimas diferentes. Por ejemplo la lignocelulosa es degradada por las hemicelulasas, como xilanasas y mananasas. La hemicelulasa es un enzima que hidroliza la hemicelulosa.
Las "enzimas celulolíticas" son enzimas que tienen "actividad celulolítica", lo que significa que son capaces de hidrolizar sustratos celulósicos o derivados de los mismos a sacáridos más pequeños. Por lo tanto, las enzimas celulolíticas incluyen tanto celulasas como hemicelulasas. Celulasas según se utiliza en la presente memoria incluyen celobiohidrolasas, endoglucanasas y beta-glucosidasas.
T. reesei tiene un sistema de celulasa bien conocido y eficaz, que contiene dos CBH, dos EG y BG principales y varias minoritarias. La CBHI de T. reesei (Cel7A) corta el azúcar desde el extremo reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa C-terminal (CBD) y puede constituir hasta 60% de la proteína secretada total. La CBHII de T. reesei (Cel6A) corta el azúcar desde el extremo no reductor de la cadena de celulosa, tiene un dominio de unión a celulosa N-terminal y pueden constituir hasta 20% de la proteína secretada total. Las endoglucanasas EGI (Cel7B), y EGV (Cel45A) tienen un CBD en su extremo C-terminal, EGII (Cel5A) tiene un CBD N-terminal y EGIII (Cel12A) no tiene ningún dominio de unión a celulosa. La CBHI, CBHII, EGI y EGII también se denominan "celulasas principales de Trichoderma" que comprenden juntas 80-90% de las proteínas secretadas totales. Los expertos en la técnica saben que una enzima puede ser activa sobre diversos sustratos y las actividades enzimáticas se pueden medir utilizando diferentes sustratos, métodos y condiciones. La identificación de las diferentes actividades celulolíticas son comentadas, p. ej., por Van Tilbeurgh et al. 1988.
Además de un dominio/núcleo catalítico que expresa la actividad celulolítica, las enzimas celulolíticas pueden comprender uno o más dominios de unión a celulosa (CBD), también denominados dominios/módulos de unión a carbohidratos (CBD/CBM), que pueden estar localizados en el extremo N o C del dominio catalítico. Los CBD tienen actividad de unión a carbohidratos y median la unión de la celulasa a la celulosa cristalina, pero tienen poco o ningún efecto sobre la actividad hidrolítica de celulasa de la enzima sobre sustratos solubles. Estos dos dominios están conectados típicamente a través de una región conectora flexible y altamente glicosilada.
"Celobiohidrolasa" o "CBH" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a enzimas que escinden la celulosa desde el extremo de la cadena de glucosa y producen principalmente celobiosa. También se denominan 1,4-beta-Dglucanocelobiohidrolasas o celulosa 1,4-beta-celobiosidasas. Hidrolizan los enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos desde los extremos reductores o no reductores de un polímero que contiene dichos enlaces, tales como celulosa, por medio de lo cual se libera celobiosa. Se han aislado dos CBH diferentes de Trichoderma reesei, CBHI y CBHII. Estas tienen una estructura modular que consiste en un dominio catalítico conectado a un dominio de unión a celulosa (CBD). También existen celobiohidrolasas en la naturaleza que carecen de CBD.
"Endoglucanasa" o "EG" se refiere a enzimas que cortan los enlaces glicosídicos internos de la cadena de celulosa. Se clasifican como EC 3.2.1.4. Son 1,4-beta-D-glucano-4-glucanohidrolasas y catalizan la endohidrólisis de los
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enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en polímeros de glucosa tales como la celulosa y sus derivados. Algunas endoglucanasas de origen natural tienen un dominio de unión a celulosa, mientras otras no. Algunas endoglucanasas también tienen actividad xilanasa (Bailey et al., 1993).
"Beta-glucosidasa" o "BG" o "βG" se refiere a enzimas que degradan oligosacáridos solubles pequeños incluyendo celobiosa a glucosa. Se clasifican como EC 3.2.1.21. Son beta-D-glucósido glucohidrolasas, que típicamente catalizan la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa no reductores terminales. Estas enzimas reconocen oligosacáridos de glucosa. Los sustratos típicos son celobiosa y celotriosa. La celobiosa es un inhibidor de las celobiohidrolasas, por tanto la degradación de la celobiosa es importante para superar la inhibición por producto final de celobiohidrolasas.
Las xilanasas son enzimas que son capaces de reconocer e hidrolizar la hemicelulosa. Incluyen enzimas tanto exohidrolíticas como endohidrolíticas. Típicamente tienen actividad endo-1,4-beta-xilanasa (EC 3.2.1.8) o beta-Dxilosidasa (EC 3.2.1.37) que rompe la hemicelulosa a xilosa. "Xilanasa" o "Xyn" en relación con la presente invención se refiere especialmente a una enzima clasificada como EC 3.2.1.8 que hidroliza polímeros de xilosa de sustratos lignocelulósicos o xilano purificado.
Además de esto, las celulasas se pueden clasificar en varias familias de glicosil hidrolasas de acuerdo con su secuencia primaria, apoyada por el análisis de la estructura tridimensional de algunos miembros de la familia (Henrissat 1991, Henrissat y Bairoch 1993, 1996). Algunas glicosilhidrolasas son enzimas multifuncionales que contienen dominios catalíticos que pertenecen a diferentes familias de glicosilhidrolasas. La familia 3 consiste en beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) tales como BG_81 de Ta, BG_101 de At y BG_76 de Ct descritas en la presente memoria. La familia 5 (antes conocida como celA) consiste principalmente en endoglucanasas (EC 3.2.1.4) como EG_28 de Ta descrita en la presente memoria. La familia 7 (antes familia de celulasa CELC) contiene endoglucanasas (EC 3.2.1.4) y celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) tales como EG_54 de Ct, CBH de Ta, CBH_A de At, CBH_C de At y CBH de Ct descritas en la presente memoria. La familia 10 (antes CELF) consiste principalmente en xilanasas (EC 3.2.1.8) tales como XYN_30 de Ta y XYN_60 de At descritas en la presente memoria. La familia 45 (antes CELK) contiene endoglucanasas (EC 3.2.1.4), tales como la EG_40 de At y de tipo EG_40 de At descritas en la presente memoria.
Las enzimas celulolíticas útiles para hidrolizar material celulósico son obtenibles de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum. "Obtenible de" significa que se pueden obtener de dichas especies, pero no excluye la posibilidad de obtenerlas de otras fuentes. En otras palabras, se pueden originar a partir de cualquier organismo, incluidas plantas. Preferiblemente se originan a partir de microorganismos, por ejemplo bacterias u hongos. Las bacterias pueden ser, p. ej., de un género seleccionado entre Bacillus, Azospirillum y Streptomyces. Más preferiblemente, la enzima se origina a partir de hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), por ejemplo de un género seleccionado del grupo que consiste en Thermoascus, Acremonium, Chaetomium, Achaetomium, Thielavia, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Myriococcum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes y Trichoderma.
La presente solicitud describe enzimas que se pueden obtener de Thermoascus aurantiacus cepa ALKO4242 depositada como CBS 116239, cepa ALKO4245 depositada como CBS 116240 actualmente clasificada como Acremonium thermophilium, o Chaetomium thermophilum cepa ALKO4265 depositada como CBS 730.95.
La celobiohidrolasa preferiblemente comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.
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Estas CBH tienen una inhibición de celulosa constante ventajosa en comparación con la de la CBH de Trichoderma reesei, y muestran mejores resultados de hidrólisis cuando se someten a ensayo diversos sustratos celulósicos. Los SEQ ID NO: 2 y 4 no lo comprenden un CBD. Se pueden obtener resultados de hidrólisis particularmente mejorados
cuando un dominio de unión a celulosa (CBD) se ancla una CBH que no tiene un CBD propio. El CBD se puede obtener p. ej. a partir de una especie de Trichoderma o Chaetomium, y se ancla a la CBH preferiblemente a través de un conector. La proteína de fusión resultante que contiene una región núcleo de CBH anclada a un CBD a través de un conector puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 28 o 30. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o 29 codifican tales proteínas de fusión.
La endoglucanasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo. Estas endoglucanasas tienen buena termoestabilidad.
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La beta-glucosidasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 22, 24 o 26, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo. Estas beta-glucosidasas tienen buena resistencia a la inhibición por glucosa, que es ventajosa para evitar la inhibición por el producto final durante la hidrólisis enzimática del material celulósico. Las beta-glucosidasas también se pueden utilizar en la preparación de
15 soforosa, un inductor de celulasa utilizado en el cultivo de T. reesei.
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La xilanasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 18 o 20, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.
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20 Mediante el término "identidad" se quiere significar aquí la identidad global entre dos secuencias de aminoácidos comparadas entre sí desde el primer aminoácido codificado por el gen correspondiente hasta el último aminoácido. La identidad de las secuencias completas se mide utilizando el programa de alineamiento global de Needleman-Wunsch en el paquete de programas EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000), versión 3.0.0, con los siguientes parámetros: EMBLOSUM62, Penalización por hueco 10,0, Penalización por
25 extensión 0,5. El algoritmo es descrito por Needleman y Wunsch (1970). El experto en la técnica es consciente del hecho de que los resultados en los que se utiliza el algoritmo de Needleman-Wunsch son comparables solamente cuando se alinean los dominios correspondientes de la secuencia. Por consiguiente, la comparación p. ej. de secuencias de celulasa que incluyen CBD o secuencias señal con secuencias que carecen de esos elementos no se puede realizar.
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Según una realización de la invención se utiliza un polipéptido celulolítico que tiene una identidad al menos 80, 85, 90, 95 o 99% con la SEQ ID NO: 24 o al menos con su fragmento enzimáticamente activo.
Mediante el término "fragmento enzimáticamente activo" se quiere significar cualquier fragmento de una secuencia definida que tiene actividad celulolítica. En otras palabras un fragmento enzimáticamente activo puede ser la parte de la proteína madura de la secuencia definida, o puede ser solamente un fragmento de la parte de la proteína madura, siempre que tenga todavía actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, beta-glucosidasa o xilanasa.
Las enzimas celulolíticas son preferiblemente enzimas recombinantes, que pueden ser producidas de una manera generalmente conocida. Se aísla un fragmento de polinucleótido que comprende el gen de la enzima, el gen se inserta bajo un promotor fuerte en un vector de expresión, el vector se transfiere en células anfitrionas adecuadas y las células anfitrionas se cultivan en condiciones que provocan la producción de la enzima. Los métodos para la producción de proteínas mediante tecnología recombinante en diferentes sistemas anfitriones son bien conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989; Coen, 2001; Gellissen, 2005). Preferiblemente, las enzimas se producen como enzimas extracelulares que son secretadas al medio de cultivo, a partir del cual se puede recuperar y aislarse fácilmente. Se puede utilizar el medio de cultivo gastado del anfitrión de producción tal cual, o se pueden retirar de allí las células anfitrionas, y/o se puede concentrar, filtrar o fraccionar. También se puede secar.
El polipéptido aislado en el presente contexto puede significar simplemente que las células y los residuos celulares se han retirado del medio de cultivo que contiene el polipéptido. Convenientemente, los polipéptidos se aíslan, p. ej., añadiendo polímeros aniónicos y/o catiónicos al medio de cultivo gastado para mejorar la precipitación de las células, los restos celulares y algunas enzimas que tienen actividades secundarias no deseadas. A continuación el medio se filtra, utilizando un agente de filtración inorgánico y un filtro para retirar los precipitantes formados. Después de esto el producto filtrado se procesa adicionalmente utilizando una membrana semi-permeable para retirar el exceso de sales, azúcares y productos metabólicos.
Según una realización de la invención el polinucleótido heterólogo comprende un gen similar al incluido en un microorganismo que tiene el número de acceso DSM 17325.
El anfitrión de producción puede ser cualquier organismo capaz de expresar la enzima celulolítica. Preferiblemente, el anfitrión es una célula microbiana, más preferiblemente un hongo. Lo más preferiblemente, el anfitrión es un hongo filamentoso. Preferiblemente, el anfitrión recombinante se modifica para expresar y secretar enzimas celulolíticas como su actividad principal o una de sus actividades principales. Esto se puede realizar mediante la supresión de los principales genes homólogos secretados, p. ej., las cuatro principales celulasas de Trichoderma y dirigiendo genes heterólogos a un locus que se ha modificado para asegurar altos niveles de expresión y producción. Los anfitriones preferidos para la producción de las enzimas celulolíticas son en particular cepas del género Trichoderma o Aspergillus.
Las enzimas necesarias para la hidrólisis del material celulósico según la invención se pueden añadir en una cantidad enzimáticamente eficaz o bien simultáneamente, p. ej., en forma de una mezcla de enzimas, o bien sucesivamente, o bien como una parte de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). Se puede utilizar cualquier combinación de las celobiohidrolasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o con un fragmento enzimáticamente activo del mismo junto con cualquier combinación de endoglucanasas y beta-glucosidasas. Si el material celulósico comprende hemicelulosa, se utilizan adicionalmente para la degradación hemicelulasas, preferiblemente xilanasas. Las endoglucanasas, beta-glucosidasas y xilanasas se pueden seleccionar entre las descritas en la presente memoria, pero no se limitan a las mismas. Estas pueden ser también por ejemplo preparaciones de enzimas asequibles comercialmente. Además de celulasas y hemicelulasas opcionales se pueden utilizar una o más enzimas, por ejemplo, proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas. Se puede llevar a cabo otro tratamiento enzimático antes, durante o después del tratamiento con celulasa.
El término "preparación de enzima" se refiere a una composición que comprende al menos una de las enzimas deseadas. La preparación puede contener las enzimas en forma al menos parcialmente purificada y aislada. Ésta puede consistir incluso esencialmente en la enzima o enzimas deseadas. Alternativamente, la preparación puede ser un medio de cultivo gastado o producto filtrado que contiene una o más enzimas celulolíticas. Además de la actividad celulolítica, la preparación puede contener aditivos, tales como mediadores, estabilizantes, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes del medios de cultivo. Los aditivos preferidos son tales que se utilizan comúnmente en preparaciones de enzimas destinadas a una aplicación concreta. La preparación de enzima puede estar en forma de líquido, polvo o granulado. Preferiblemente, la preparación de enzima es medio de cultivo gastado. El "medio de cultivo gastado" se refiere al medio de cultivo del anfitrión que comprende las enzimas producidas. Preferiblemente, las células anfitrionas se separan de dicho medio después de la producción.
Según una realización de la invención la preparación de enzima comprende una mezcla de CBH, EG y BG, opcionalmente junto con xilanasa y/u otras enzimas. La CBH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o con un fragmento enzimáticamente activo del mismo, y se puede obtener a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum, mientras que EG, BG y xilanasa pueden ser de cualquier origen, incluyendo a partir de dichos
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organismos. Otras enzimas que podrían estar presentes en la preparación son, p. ej. proteasas, amilasas, lacasas, lipasas, pectinasas, esterasas y/o peroxidasas.
Se pueden utilizar mezclas y combinaciones de enzimas para adaptarse a diferentes condiciones del proceso. Por ejemplo, si el proceso de degradación se lleva a cabo a una temperatura alta, se eligen enzimas termoestables. Una combinación de una CBH de la familia 7 con una endoglucanasa de la familia 45, opcionalmente combinadas con una BG de la familia 3 y/o una xilanasa de la familia 10 tuvo un excelente rendimiento de hidrólisis tanto a 45°C, como a temperaturas elevadas.
Las enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei se utilizan convencionalmente a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 40-50°C en la hidrólisis, y a 30-40°C en SSF. La CBH, EG, BG y Xyn obtenibles de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, o Chaetomium thermophilum también son eficientes a estas temperaturas, pero además la mayoría de ellas también funciona extremadamente bien a temperaturas entre 50°C y 75°C, o incluso hasta 80°C y 85°C, tal como entre 55°C y 70°C, p. ej., entre 60°C y 65°C. Para tiempos de incubación cortos las mezclas de enzimas son funcionales incluso hasta 85°C, para la hidrólisis completa se utilizan normalmente temperaturas más bajas.
El método para el tratamiento de material celulósico con CBH, EG y BG y Xyn es especialmente adecuado para la producción de azúcares fermentables a partir de material lignocelulósico. Los azúcares fermentables se pueden fermentar a continuación por medio de levadura en etanol, y utilizar como combustible. También se pueden utilizar como intermedios o materias primas para la producción de diversos productos químicos o elementos esenciales para los procesos de la industria química, p. ej. en la denominada biorrefinería. El material lignocelulósico se puede pretratar antes de la hidrólisis enzimática para desorganizar la estructura de fibra de los sustratos celulósicos y hacer la fracción de celulosa más accesible a las enzimas celulolíticas. Los pretratamientos actuales incluyen procesos mecánicos, químicos o térmicos y sus combinaciones. El material puede ser pretratado por ejemplo mediante explosión de vapor o hidrólisis ácida.
Se encontraron diversos nuevos polipéptidos celulolíticos en Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, y Chaetomium thermophilum. Los nuevos polipéptidos pueden comprender un fragmento que tiene actividad celulolítica y se pueden seleccionar del grupo que consiste en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 66%, preferiblemente 70% o 75%, con la SEQ ID NO: 4, una identidad de 79% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de 78% con la SEQ ID NO: 12, una identidad de 68%, preferiblemente 70% o 75%, identidad con la SEQ ID NO: 14, una identidad de 72%, preferiblemente 75%, con la SEQ ID NO: 16, una identidad de 68%, preferiblemente 70% o 75%, con la SEQ ID NO: 20, una identidad de 74% con la SEQ ID NO: 22 o 24, o una identidad de 78% con la SEQ ID NO: 26.
Los nuevos polipéptidos también pueden ser variantes de dichos polipéptidos. Una "variante" puede ser un polipéptido que se produce naturalmente, p. ej., en forma de una variante alélica dentro de la misma cepa, especie o género, o puede haber sido generado mediante mutagénesis. Puede comprender sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, pero todavía funciona de una manera sustancialmente similar a las enzimas definidas anteriormente, es decir, comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica.
Los polipéptidos celulolíticos se producen normalmente en las células en forma de polipéptidos inmaduros que comprenden una secuencia señal que es escindida durante la secreción de la proteína. También pueden ser procesados adicionalmente durante la secreción, en el extremo N-terminal y/o extremo C-terminal para dar una proteína enzimáticamente activa, madura. Un polipéptido "que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica" significa por lo tanto que el polipéptido puede estar en forma inmadura o madura, preferiblemente está en forma madura, es decir, ha tenido lugar el procesamiento.
Los nuevos polipéptidos pueden ser, adicionalmente, un "fragmento de los polipéptidos o variantes" mencionados anteriormente. El fragmento puede ser la forma madura de las proteínas mencionadas anteriormente, o puede ser solamente una parte enzimáticamente activa de la proteína madura. De acuerdo con una realización de la invención, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80, 85, 90, 95, o 99% con la SEQ ID NO: 24, o con un fragmento celulolíticamente activo del mismo. También puede ser un fragmento del mismo que tiene actividad celobiohidrolasa, endoglucanasa, xilanasa, o beta-glucosidasa. De acuerdo con otra realización de la invención, el polipéptido consiste esencialmente en un fragmento celulolíticamente activo de una secuencia de la SEQ ID NO: 24.
Los nuevos polinucleótidos pueden comprender una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 23 o una secuencia que codifica un nuevo polipéptido como se ha definido anteriormente, incluyendo hebras complementarias del mismos. Polinucleótido según se utiliza en la presente memoria se refiere tanto a ARN y ADN, y puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. El polinucleótido también puede ser un fragmento de dichos polinucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos, p. ej. al menos 25, 30 o 40 nucleótidos. El polinucleótido puede tener al menos 100, 200 o 300 nucleótidos de longitud. Adicionalmente, el polinucleótido puede ser degenerado como resultado del código genético con respecto a una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente. Esto significa que diferentes codones pueden codificar para el mismo aminoácido.
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se hicieron eluir con el gradiente lineal desde el tampón anterior a fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0. Las fracciones se recogieron y la actividad de endoglucanasa se determinó como se ha descrito anteriormente. La actividad endoglucanasa eluyó en una amplia zona de conductividad de 120 a 15 mS/cm.
Las fracciones combinadas se aplicaron a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 8 mM, pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,25 M en el tampón de equilibrado. La actividad endoglucanasa que contenía proteína se hizo eluir en la zona de conductividad de 3-7 mS/cm. Se repitió la cromatografía de intercambio catiónico y el eluato de la proteína se concentró mediante liofilización.
La muestra disuelta se cargó en una columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La fracción principal de la proteína se hizo eluir de la columna con el volumen de retención de 13,3 ml. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 40 kDa. Se determinó que la actividad específica de la proteína purificada, designada como EG_40 de At, a 50°C era 450 de nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato CMC).
La estabilidad térmica de la endoglucanasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de 0,1 mg/ml de BSA a pH 5,0 durante 60 min utilizando carboximetilcelulosa como sustrato. A. thermophilum EG_40/Cel45A fue estable hasta 80°C. Las enzimas de referencia de T. reesei EGI (Cel7B) y EGII (Cel5A) conservaron 100% de la actividad hasta 60°C y 65°C, respectivamente.
Ejemplo 4. Purificación de una endoglucanasa de Chaetomium thermophilum ALKO4261
Se cultivó Chaetomium thermophilum ALKO4261 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio catiónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato (procedimiento de la IUPAC 1987).
Se añadió sulfato amónico al sobrenadante de cultivo para alcanzar la misma conductividad que fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. La muestra se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. La elución se llevó a cabo con un gradiente lineal de fosfato de potasio de 20 a 0 mM, pH 6,0, seguido de fosfato de potasio 5 mM, pH 6,0 y agua. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de urea de 0 a 6 M. Las fracciones se recogieron y la actividad endoglucanasa se analizó como se ha descrito anteriormente. La proteína que contiene actividad endoglucanasa se hizo eluir al principio del gradiente de urea.
Las fracciones se combinaron, se equilibraron a Tris-HCl 16 mM, pH 7,5 (I = 1,4 mS/cm) mediante una columna 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en el tampón de equilibrado. Las fracciones se recogieron y analizaron para determinar la actividad endoglucanasa como se ha descrito anteriormente. La proteína se hizo eluir en el intervalo de 10-20 mS/cm.
La muestra se equilibró a acetato de sodio 15 mM, pH 4,5 mediante una columna 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 20 mM de pH 4,5. Las proteínas se hicieron eluir con un gradiente lineal de acetato de sodio de 0 a 0,4 M, pH 4,5. La actividad endoglucanasa eluyó en el intervalo de 1-10 mS/cm. La muestra recogida se liofilizó.
La muestra se disolvió en agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 6,0, que contenía NaCl 0,15 M. Las fracciones se recogieron y las que contenían actividad endoglucanasa se combinaron. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que la masa molecular sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE preteñidos, Broad Range, Bio-Rad) era de 54 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada EG_54 de Ct con PhastSystem (Pharmacia) era aprox. 5,5.
Ejemplo 5. Purificación de una endoglucanasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALKO4242 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La endoglucanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio aniónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato (Procedimiento de la IUPAC 1987). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con (NH4)2SO4 0,2 M (I = 39 mS/cm). Las fracciones que contenían actividad endoglucanasa se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
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La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,4 M en el tampón de equilibrado. La proteína que contiene actividad endoglucanasa se hizo eluir en la zona de conductividad de 15-21 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron como antes.
La muestra se aplicó a una columna de filtración en gel Sephacryl S-100 HR 26/60 equilibrada con tampón acetato de sodio 50 mM de pH 5,0, que contenía NaCl 0,05 M. La fracción de proteína que contenía actividad endoglucanasa se hizo eluir de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 16 kDa. Las fracciones recogidas se combinaron, se concentraron y se repitió la filtración en gel. Se estimó que el eluato de proteína era puro mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se consideró que el peso molecular era de 28 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada EG_28 de Ta, en un gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) era de aproximadamente 3,5. Se determinó que la actividad específica de EG_28 de Ta a 50°C era de 4290 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato CMC).
Ejemplo 6. Purificación y caracterización de una β-glucosidasa de Acremonium thermophilum ALKO4245
Se cultivó Acremonium thermophilum ALKO4245 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio aniónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990). El contenido de proteína se midió mediante BioRad Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de Phenyl Sepharose FF de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 1 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado a fosfato de potasio 5 mM en la zona de conductividad de 137-16 mS/cm. Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración.
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con fosfato de potasio 10 mM de pH 7,0. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 0,25 M en la zona de conductividad de 1,5-12 mS/cm. La cromatografía de intercambio aniónico se repitió como antes, excepto que se utilizó tampón de fosfato de potasio 4 mM de pH 7,2 mM. Las proteínas se hicieron eluir a la zona conductividad de 6-9 mS/cm. Las fracciones que contenían actividad de β-glucosidasa se recogieron, se combinaron y se concentraron.
El material activo de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna HR 26/60 Sephacryl S-300 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 6,5, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína con actividad βglucosidasa se hizo eluir con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 243 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se evaluó que el peso molecular era de 101 kDa. Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada A βG_101, en un gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) estaba en la zona de 5,6-4,9. Se determinó que la actividad específica de βG_101 de At a 50°C era de 1100 nkat/mg (utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato, Bailey y Linko, 1990).
La estabilidad térmica de la β-glucosidasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó en presencia de 0,1 mg/ml de BSA a pH 5,0 durante 60 min utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato. La βG_101 de A. thermophilum fue estable hasta 70°C. La enzima de referencia de Aspergillus (Novozym 188) conservó 100% de la actividad hasta 60°C.
Ejemplo 7. Purificación de una β-glucosidasa de Chaetomium thermophilum ALKO4261
Se cultivó Chaetomium thermophilum ALKO4261 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La β-glucosidasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguida de filtración en gel. La actividad β-glucosidasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó utilizando 4-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato (Bailey y Linko, 1990).
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,8 M. La elución se llevó a cabo con un gradiente lineal desde tampón de equilibrado a fosfato de potasio 3 mM, pH 6,0, seguido de elución con agua y urea 6 M. Las primeras fracciones con actividad β-glucosidasa se hicieron eluir en la zona de conductividad de 80-30 mS/cm. La segunda actividad β-glucosidasa se hizo eluir con urea 6 M. Las fracciones activas eluidas mediante urea se reunieron y se desalaron en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con Tris-HCl 10 pH 7,0.
Después de la eliminación de las sales, la muestra se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM de pH 7,0. La proteína no se unió a la columna, sino que eluyó durante la introducción de la muestra. Esta fracción de flujo directo se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) equilibradas con acetato de Na 7 mM, pH 4,5.
La muestra de la cromatografía de intercambio aniónico se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP FF equilibrada con acetato de sodio 10 mM de pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal
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directo durante la introducción de la muestra. Este eluato se concentró mediante ultrafiltración. La cromatografía hidrófoba se repitió como se ha descrito anteriormente. Las proteínas no unidas se recogieron y se liofilizaron.
La muestra disuelta se cargó en la columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada con tampón de fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. Se estimó que la proteína eluida de la columna con el volumen de retención de 11,2 ml era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se consideró que la masa molecular de la proteína purificada sobre la base de los patrones de masa molecular (patrones SDS-PAGE teñidos previamente, Intervalo Amplio, Bio-Rad) era de 60 kDa. Se determino que la actividad específica de la proteína, denominada XYN_60 de At, a 50°C era de 1800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato xilano de abedul). La actividad relativa aumentó aproximadamente 1,2 veces a 60°C y 1,65 veces a 70°C (10 min, pH 5,0) en comparación con 50°C. Las actividades específicas contra MUG2 (4-metilumbeliferil-β-Dcelobiósido), MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactósido) y MUG3 (4-metilumbeliferil-β-D-celotriósido) fueron de 54, 33 y 78 nkat/mg (50°C, pH 5,0, 10 min), respectivamente. Esto está de acuerdo con el hecho de que las xilanasas de la familia 10 también muestran actividad contra los arilglucopiranósidos (Biely et al. 1997).
Ejemplo 10. Purificación de una xilanasa de Thermoascus aurantiacus ALKO4242
Se cultivó Thermoascus aurantiacus ALKO4242 como se ha descrito en el Ejemplo 1. La xilanasa pura se obtuvo mediante purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrófoba, de intercambio aniónico y catiónico seguida de filtración en gel. La actividad xilanasa se determinó utilizando como sustrato xilano de abedul (Procedimiento de la IUPAC 1987). La proteína se analizó mediante BioRad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.
El sobrenadante de cultivo se aplicó a una columna de interacción hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,7 M. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un protocolo de elución de dos etapas. La elución se llevó a cabo dejando caer primero la concentración de sal a (NH4)2SO4 0,2 M y después de eso se aplicó un gradiente lineal de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,0, que contenía (NH4)2SO4 0,2 M a fosfato de potasio 5 mM de pH 6,0. La proteína se hizo eluir con (NH4)2SO4 0,2 M (I = 39 mS/cm).
La muestra se desaló en columnas 10DG (Bio-Rad) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico HiTrap DEAE FF equilibrada con Tris-HCl 15 mM, pH 7,0. La proteína no se unió a la columna de intercambio aniónico sino que eluyó en el flujo directo. La conductividad de la muestra se ajustó para que correspondiera a la de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 mediante adición de agua y el pH se ajustó a 4,5 durante la concentración mediante ultrafiltración.
La muestra se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL equilibrada con acetato de sodio 20 mM, pH 4,5. Las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente lineal desde el tampón de equilibrado al mismo tampón que contenía NaCl 1 M. La enzima se hizo eluir en la zona de conductividad de 1-7 mS/cm. La muestra se liofilizó y después de eso se disolvió en agua.
La muestra liofilizada se disolvió en agua y se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con fosfato de sodio 20 mM de pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M. La proteína se hizo eluir de la columna con un volumen de retención correspondiente a un peso molecular de 26 kDa. Se estimó que la proteína era pura mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. La masa molecular de la proteína pura fue de 30 kDa según se evaluó sobre la base de patrones de masa molecular (patrones de SDS-PAGE teñidos previamente, Intervalo Amplio, Bio-Rad). Se determinó que el pl de la proteína purificada, denominada XYN_30 de Ta con PhastSystem (Pharmacia) era de aprox. 6,8. Se determinó que la actividad específica de XYN_30 de Ta a 50°C era de 4800 nkat/mg (Procedimiento de la IUPAC 1987, utilizando como sustrato xilano de abedul).
Ejemplo 11. Secuenciación de aminoácidos internos
Los péptidos internos se secuenciaron mediante ionización por electropulverización combinada con espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS) utilizando un aparato Q-TOF1 (Micromass). La proteína se alquiló primero y se digirió en péptidos trípticos. Los péptidos generados se desalaron y se separaron parcialmente mediante nanocromatografía líquida (de fase inversa) antes de aplicarlos al aparato Q-TOF1. Las secuencias de los péptidos internos para las celobiohidrolasas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se muestran en la Tabla 2. Los péptidos de CBH de Chaetomium se obtuvieron después de haber clonado el correspondiente gen CBH. Los péptidos determinados de CBH de Acremonium no se utilizaron en la clonación del gen correspondiente.
Tabla 2. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de CBH (1_C -4_C) de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y de CBH (1_A -4_A) de Acremonium thermophilum ALKO4245.
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Secuencia
Péptido 1_C
T P S T N D A N A G F G R
Péptido 2_C
V A F S N T D D F N R
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Proteína
Péptido Secuencia(a
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Péptido 2 V V V G D D A G N P C
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Péptido 3 A F V S Q L T L L E K
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Péptido 4 G T D V L/I Y T P N N K
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Péptido 5 Q P N P A G P N A C V L/I R
βG_76 de Ct
Péptido 1 E G L F I D Y R
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Péptido 2 P G Q S G T A T F R
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Péptido 3 E T M S S N V D D R
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Péptido 4 I A L V G S A A V V
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Péptido 5 M W L C E N D R
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Péptido 6 Y P Q L C L Q D G P L G I R
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Péptido 7 E L N G Q N S G Y P S I
βG_81 de Ta
Péptido 1 T P F T W G K
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Péptido 2 L C L Q D S L P G V R
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Péptido 3 G V D V Q L G P V A G V A P R
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Péptido 4 V N L T L E
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Péptido 5 F T G V F G E D V V G
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Péptido 6 N D L P L T G Y E K
(a I/L = la leucina y la isoleucina tienen la misma masa molecular y no se pueden distinguir en el análisis ESI-MS/MS
Tabla 5. Secuencias de péptidos internos determinados a partir de las xilanasas XYN_60 de Acremonium thermophilum ALK04245 y XYN_30 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Proteína
Péptido Secuencia
XYN_60 de At
Péptido 1 Y N D Y N L E Y N Q K
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Péptido 2 F G Q V T P E N
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Péptido 3 V D G D A T Y M S Y V N N K
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Péptido 4 K P A W T S V S S V L A A K
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Péptido 5 S Q G D I V P R A K
XYN_30 de Ta
Péptido 1 V Y F G V A T D Q N R
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Péptido 2 N A A I I Q A D F G Q V T P E N S M K
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Péptido 3 G H T L V W H S Q L P S W V S S I T D K
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Péptido 4 N H I T T L M T R
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Péptido 5 A W D V V N E A F N E D G S L R
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Péptido 6 L Y I N D Y N L D S A S Y P K
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Péptido 7 A S T T P L L F D G N F N P K P A Y N A I V Q D L Q Q
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Péptido 8 Q T V F L N V I G E D Y I P I A F Q T A R
5 Ejemplo 12. Construcción de bibliotecas genómicas para Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum
Se prepararon las bibliotecas genómicas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum
ALKO4245 para el vector Lambda DASH®II (Stratagene, USA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los
ADN cromosómicos, aislados por el método de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau 3A. Los 10 ADN digeridos también se fraccionaron por tamaños y los fragmentos del tamaño seleccionado (≈ 5-23 kb) se
desfosforilaron y se ligaron a los brazos del vector lambda digerido con BamHI. Las mezclas de ligación se
empaquetaron utilizando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del
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-SDS al 0,1% con las sondas homólogas utilizadas. Se obtuvieron varias placas positivas a partir de cada una de las hibridaciones. En el escrutinio de las bibliotecas genómicas de Acremonium ALKO4245, algunas de las placas positivas hibridaron fuertemente con la sonda en cuestión, pero, además, hubo una cantidad de placas que hibridaron más débilmente con las sondas. Esto sugirió que otro u otros genes de celobiohidrolasa podrían estar 5 presentes en el genoma, causando una reacción cruzada. Se purificaron de cuatro a cinco placas que hibridaron fuertemente a partir de los escrutinios de las bibliotecas genómicas de Thermoascus ALKO4242 y Chaetomium ALKO4265. En el caso de Acremonium thermophilum ALKO4245, cuatro de las seis placas purificadas hibridaron débilmente con la sonda utilizada. Los ADN de fagos se aislaron y se caracterizaron mediante hibridaciones de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción seleccionados que hibridaron con la sonda se subclonaron con
10 el vector pBluescript II KS+ y se secuenciaron las regiones relevantes de los clones.
En total, se clonaron cuatro genes cbh/cel7; uno de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, uno de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y dos de Acremonium thermophilum ALKO4245 (en la fase temprana del trabajo, estos tenían los códigos At_cbh_C At_cbh_A y, a continuación, se denominaron At cel7 A y cel7B de At, respectivamente). La Tabla 7 resume la información sobre las sondas utilizadas para los escrutinios de los genes, los clones de fagos a
15 partir de los cuales se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contenían los genes completos con sus regiones promotoras y terminadoras, los nombres de los plásmidos, y los números de depósito DSM para las cepas de E. coli que portaban estos plásmidos.
Tabla 7. Sondas utilizadas para la clonación de los genes cbhlcel7, el clon de fago y los subclones seleccionados, el número de plásmido y el número de depósito de la correspondiente cepa de E. coli.
Gen
Sonda utilizada en el escrutinio Clon de fago Fragmento subclonado en pBluescript II Número de plásmido Núm. de depósito de E. coli
Cel7A de Ta
pALK1633 F12 XbaI de 3,2 kb pALK1635 DSM 16723
Cel7A de Ct
pALK1632 F36 PvuI -HindIII de 2,3 kb pALK1642 DSM 16727
cel7B de At
pALK1634 F6 EcoRI de 3,1 kb pALK1646 DSM 16728
Cel7A de At
pALK1634 F2 XhoI de 3,4 kb pALK1861 DSM 16729
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La información relevante sobre los genes y las secuencias de proteínas deducidas (SEQ ID NO: 1-8) se resumen en la Tabla 8 y la Tabla 9, respectivamente.
Las secuencias de péptidos de las proteínas CBH purificadas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 (Tabla 2) se encontraron partir de las secuencias de aminoácidos deducidas
25 de los clones que contenían los genes Cel7A de Ct y Cel7A de At. Por lo tanto, se pudo concluir que los genes que codificaban las proteínas CBH/Cel7 purificadas de Chaetomium thermophilum y Acremonium thermophilum se habían clonado.
Tabla 8. Resumen de los genes cbh/cel7 aislados de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245.
Gen Cbh
Longitud con intrones (pb)(a Región codificante (pb)(b Núm. de intrones Longitudes de los intrones (pb) SEQ ID NO:
Cel7A de Ta
1439 1371 1 65 1
Cel7A de Ct
1663 1596 1 64 7
cel7B de At
1722 1377 3 134, 122, 87 3
Cel7A de At
1853 1569 4 88, 53, 54, 86 5
(a Está incluido el codón de PARADA. (b No está incluido el codón de PARADA.
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Tabla 9. Resumen de las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de los genes cbhlcel7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK4265 y Acremonium thermophilum ALK04245. ss, secuencia señal.
Proteína CBH
Núm. de aa Longitud de ss NN/HMM(a CBD Cterminal (b PM pronosticado (Da, no incluida ss)(c pl pronosticado (no incluida ss) Supuestos sitios de N-glicosilación (d SEQ ID NO:
Cel7A de Ta
457 17/17 NO 46873 4,44 2 2
Cel7A de Ct
532 18/18 SI, T497 a L532 54564 5,05 3 8
Cel7B de At
459 21/21 NO 47073 4,83 2 4
Cel7A de At
523 17/17 SI, Q488 a L523 53696 4,67 4 6
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen. et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y el valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov.
(b Se indican el dominio de unión a celulosa (CBD), los aminoácidos de la región CBD C-terminal (M1 (se incluye en la numeración la Met Núm. 1))
(c No se incluyó la secuencia señal pronosticada. La predicción fue hecha utilizando la herramienta Compute pl/MW del servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003).
(d Número de secuencias NXS/T.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de Cel7A de Thermoascus aurantiacus y Cel7A de Acremonium thermophilum (núcleo, sin el CBD) eran muy homólogas entre sí (analizadas mediante el alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS 3.0.0 Needle, con Matrix EBLOSUM62, Penalización por Hueco 10,0 y Penalización por extensión 0,5; Needleman y Wunsch, 1970). Además, la Cel7A de Acremonium thermophilum deducida tenía una identidad menor con la Cel7A de Chaetomium thermophilum deducida. La Cel7B de Acremonium thermophilum fue muy distinta de las secuencias de CBH/Cel7 de la invención.
La secuencia de Cel7A de Chaetomium deducida poseía las identidades más altas (analizadas mediante alineamiento global de Needleman-Wunsch, EMBOSS Needle, véase más arriba) con los polipéptidos de CBHI de Chaetomium thermophilum, Scytalidium thermophilum y Thielavia australiensis describos en el documento WO 03/000941. Del mismo modo, la secuencia de Cel7A de Thermoascus aurantiacus deducida era altamente idéntica a la de CBHI publicada de Thermoascus aurantiacus (documento WO 03/000941, Hong et al., 2003b). Cel7B de Acremonium thermophilum tenía identidades significativamente inferiores a las secuencias previamente publicadas, estando más estrechamente relacionada con el polipéptido de CBHI de Oryza sativa. Los mayores homologías de la secuencia de Cel7A de Acremonium thermophilum deducida fueron con los polinucleótidos de CBHI de Exidia gladulosa y Acremonium thermophilum (documento WO 03/000941). El alineamiento indica que las secuencias clonadas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 codifican las proteínas CBH que tienen alta homología con los polipéptidos de la familia 7 de glicósido hidrolasas, por lo tanto, éstas se denominaron Cel7A o Cel7B (Henrissat et al. 1998).
La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes CBH/cel 7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Acremonium thermophilum ALKO4245 y Thielavia entre sí, y adicionalmente con las secuencias encontradas en las bases de datos, se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Secuencias con una homología más alta con las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes CBH/cel 7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK04265 y Acremonium thermophilum ALK04245. El alineamiento se realizó utilizando el alineamiento global Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, Penalización por huevo 10,0, Penalización por extensión 0,5). * indica una secuencia de aminoácidos derivada de uno de los genes celobiohidrolasa clonados en este trabajo. 'Central' indica el alineamiento sin el CBD.
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
*Thermoascus aurantiacus Cel7A
100,0
Thermoascus aurantiacus, AY840982
99,6
Thermoascus aurantiacus, AX657575
99,1
Organismo, enzima y número de acceso
Identidad, (%)
Thermoascus aurantiacus, AF421954
97,8
Talaromyces emersonii, AY081766
79,5
Chaetomidium pingtungium, AX657623
76,4
Trichophaea saccata, AX657607
73,4
*Acremonium thermophilum Cel7A (núcleo)
70,6
Emericella nidulans, AF420020 (núcleo)
70,4
*Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
66,4
*Chaetomium thermophilum Cel7A
100,0
Chaetomium thermophilum, AY861347
91,9
Chaetomium thermophilum, AX657571
91,7
Scytalidium thermophilum, AX657627
74,7
Thielavia australiensis, AX657577
74,6
Acremonium thermophilum, AX657569
72,3
Exidia glandulosa, AX657613
68,0
*Acremonium thermophilum Cel7A
66,9
*Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
66,4
Exidia glandulosa, AX657615
60,8
Chaetomium pingtungium, AX657623
60,7
*Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
60,2
*Acremonium thermophilum Cel7B
100,0
Oryza sativa, AK108948
66,1
Exidia glandulosa, AX657615
65,0
Acremonium thermophilum, AX657569 (núcleo)
64,8
Thermoascus aurantiacus, AX657575
64,8
*Acremonium thermophilum Cel7A
64,6
*Thermoascus aurantiacus Cel7A
64,4
Trichophaea saccata, AX657607
63,6
*Chaetomium thermophilum Cel7A (núcleo)
60,2
*Acremonium thermophilum Cel7A
100,0
Exidia glandulosa, AX657613
77,9
Exidia glandulosa, AX657615
77,9
Acremonium thermophilum, AX657569
77,5
Thielavia australiensis, AX657577
71,0
*Thermoascus aurantiacus Cel7A (núcleo)
70,6
Scytalidium thermophilum, AX657627
67,5
Chaetomium thermophilum, AX657571
67,5
Chaetomium pingtungium, AX657623
67,3
*Chaetomium thermophilum Cel7A
66,9
*Acremonium thermophilum Cel7B (núcleo)
64,6
Ejemplo 14. Producción de proteínas CBH/Cel7 recombinantes en Trichoderma reesei 24
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producción de la proteína de fusión (SEQ ID NO: 28 que corresponde al ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27) en T. reesei como se describe en FI20055205/US 11/119526; presentado el 29 de Abril 2005. Además, Cel7A de Thermoascus aurantiacus se fusionó con el conector y el CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum (SEQ ID NO: 7) (CBD de Ct). Para ello, se sintetizaron la secuencia codificante del conector y el CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:
5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTC-GACCGTCCCTGGCCTTGAC-3' (secuencia directa)
y
5'-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGG-AACTG-3' (secuencia inversa).
La mezcla de reacción de PCR contenía 1 x tampón de reacción de DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), Mg2+ 15 mM, dNTP 0,2 mM, 2 µM de cada cebador, 0,6 unidades de ADN polimerasa DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), y aproximadamente 75 ng/30 µl de ADN molde, que contenía el gen cel7A completo de Chaetomium thermophilum. Las condiciones para la reacción de PCR fueron las siguientes: 2 min. de desnaturalización inicial a 98°C, seguido de 30 ciclos de 30 seg. a 98°C, 30 seg. de recocido a 68°C (gradiente de ± 4°C), 30 segundos de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 10 min. El fragmento de ADN específico en la reacción de PCR se obtuvo a un intervalo de temperatura de recocido entre 64°C a 68,5°C. El fragmento CBD sintetizado de Chaetomium thermophilum se ligó después del gen cel7A de Thermoascus aurantiacus dando como resultado un punto de unión de GPIGST entre los dominios. El fragmento amplificado por PCR del plásmido se confirmó mediante secuenciación (SEQ ID NO: 29). El gen fusión cel7A construido se fusionó exactamente al promotor de cbh1 (cel7A) de T. reesei. La terminación de la transcripción se aseguró por medio del terminador de cel7A de T. reesei y se utilizó el gen marcador amdS de A. nidulans para la selección de los transformantes como se describe en Paloheimo et al. (2003).
El casete de expresión lineal se aisló de la cadena principal del vector después de la digestión con NotI y se transformó en protoplastos A96 de T. reesei. Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993), con la selección de acetamida como única fuente de nitrógeno. Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de conidios individuales antes de la su esporulación sobre PD.
Se analizó la producción Cel7A + CBD (SEQ ID NO. : 28 y 30) de Thermoascus aurantiacus de los transformantes a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 días en un medio inductor de celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con 5% de KH2PO4 a pH 5,5. La actividad de celobiohidrolasa se analizó utilizando sustrato de 4-metilumbeliferil-β-D-lactósido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurgh et al., 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron utilizando transferencias Southern en las que se habían incluido diversos productos digeridos genómicos y el casete de expresión se utilizó como sonda. Los análisis de SDS-PAGE mostraron que las enzimas Cel7A + CBD de Thermoascus aurantiacus recombinante se habían producido en forma de proteínas de fusión estables en T. reesei.
El transformante seleccionado que producía la proteína de fusión Cel7A de Ta + CBD de Tr (SEQ ID NO: 28) también se cultivó en un biorreactor 2 litros a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con control de pH a 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y se filtraron a través de filtros Seitz K-150 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).
Ejemplo 16. Comparación de las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de celobiosa de celobiohidrolasas recombinantes purificadas
Las constantes de Michaelis-Menten y de inhibición de la celobiosa se determinaron a partir de las celobiohidrolasas producidas de manera heteróloga en T. reesei (Ejemplos 14 y 15). Las enzimas se purificaron como se describe en el Ejemplo 2. Las concentraciones de proteína de las enzimas purificadas se midieron mediante su absorción a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molar teórico, que se evaluó a partir de las secuencias de aminoácidos (Gill y von Hippel, 1989).
Las constantes cinéticas (valores Km y kcat) y la constante de inhibición de celobiosa (Ki) para CBHI/Cel7A de Tr, CBH/Cel7A de Ta, CBH/Cel7A de At y CBH/Cel7A de Ct, se midieron utilizando CNPLac (2-Cloro-4-nitrofenil-β-Dlactósido) como sustrato a la temperatura ambiente (22°C) en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 5,7. Para la determinación de la constante de inhibición (Ki), se utilizaron ocho concentraciones de sustrato diferentes (31 a 4000 µM) en presencia de un intervalo de cinco concentraciones de inhibidor (0-100 µM o 0-400 µM), que agrupen el valor de Ki. Todos los experimentos se realizaron en placas de microtitulación y el volumen de reacción total fue de 200 µl. Las tasas iniciales se midieron en cada caso mediante control continuo de la liberación del anión de cloronitrofenolato (CNP, 2-cloro-4-nitrofenolato) a través de mediciones a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación Varioscan (ThermoLabsystems). Los resultados se calcularon a partir de la curva patrón de CNP (de 0 a 100 µM). Las concentraciones de enzima utilizadas fueron: CBHI/Cel7A de Tr 2,46 µM, CBH/Cel7A de Ta 1,58 µM, CBH/Cel7A de Ct 0,79 µM y CBH/Cel7A de At 3 µM. Las constantes Km y kcat se calcularon a partir del ajuste
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de la ecuación de Michaelis-Menten utilizando el programa de Origen. Se utilizaron diagramas de Lineweaver-Burk, regráficos "replots" (pendiente de LWB frente a [glc2; celobiosa]) y diagramas de Hanes para distinguir entre la inhibición de tipo competitivo y mixta y para determinar las constantes de inhibición (Ki).
Los resultados de las mediciones cinéticas se muestran en la Tabla 12 y la Tabla 13. Como se puede observar, CBH/Cel7A de Ct tiene claramente el número de recambio más alto (kcat) sobre CNPLac y también la constante de especificidad (kcat/Km) es mayor en comparación con CBHI/Cel7A de T. reesei. La celobiosa (glc2) es un inhibidor competitivo para todas las celulasas medidas, y la CBHI/Cel7A de Tr (utilizada como control) tiene la inhibición más fuerte (es decir, el valor de Ki más bajo) por celobiosa. La CBH/Cel7A de At tuvo una constante de inhibición 7 veces mayor en comparación con el de CBHI/Cel7A de Tr. Estos resultados indican que las tres nuevas celobiohidrolasas podrían funcionar mejor en la hidrólisis de celulosa debido a la disminución de la inhibición por celobiosa en comparación con la celobiohidrolasa I de Cel7A de Trichoderma reesei.

Tabla 12. Comparación de las constantes de inhibición de celobiosa de cuatro celobiohidrolasas de la familia 7 de GH, medidas sobre CNPLac en tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 5,7, a 22°C.
Enzima
Ki (µM) Tipo de inhibición
Cel7A de Ct
39 competitiva
Cel7A de Ta
107 competitiva
Cel7A de At
141 competitiva
Cel7A de Tr
19 competitiva
Tabla 13. Comparación de las constantes cinéticas de Michaelis-Menten de celobiohidrolasa Cel7A de Chaetomium thermophilum con CBHI/Cel7A de T. reesei, medidas sobre CNPLac en tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 5,7, a 22°C.
Enzima
kcat (min-1) Km (µM) kcat /Km (min-1 M-1)
Cel7A de Ct
18,8 1960 9,5 103
Cel7A de Tr
2,6 520 5,0 103
Ejemplo 17. Hidrólisis de celulosa cristalina (Avicel) por las celobiohidrolasas recombinantes
Las celobiohidrolasas recombinantes purificadas Cel7A de Ct, Cel7A de Ta, Cel7A de Ta+CBD de Tr, Cel7A de Ta+CBD de Ct, Cel7A de At así como la versión núcleo de Cel7A de Ct (véase más adelante) se sometieron a ensayo en cantidades equimolares en la hidrólisis de celulosa cristalina a dos temperaturas, 45°C y 70°C; la Cel7A de Tr de T. reesei purificada y su versión núcleo (véase más adelante) se utilizaron como comparación. Los análisis de hidrólisis de la celulosa cristalina (Ph 101, Avicel; Fluka, Bucsh, Suiza) se llevaron a cabo en acetato de sodio 50 mM en un tubo con escala de 1,5 ml, pH 5,0. Se aplicó movimiento oscilante a Avicel a 45°C o a 70°C, con la disolución de enzima (1,4 µM), y el volumen final de la mezcla de reacción fue de 325 µl. La hidrólisis siguió hasta 24 horas tomando muestras en seis momentos diferentes y deteniendo la reacción mediante la adición de 163 µl de reactivo de parada que contenía 9 vol de etanol del 94% y 1 vol de glicina 1 M (pH 11). La disolución se filtró a través de una unidad de filtración Millex GV13 de 0,22 µm (Millipore, Billerica, MA, USA). La formación de azúcares reductores solubles en el sobrenadante se determinó mediante el método de la hidrazida de ácido parahidroxibenzoico (PAHBAH) (Lever, 1972) utilizando una curva patrón de celobiosa (celobiosa de 50 a 1600 µM). Se añadió una disolución de PAHBAH 0,1 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) de nueva aportación en NaOH 0,5 M (100 µl) a 150 µl de la muestra filtrada y se hirvió durante 10 minutos después de lo cual la disolución se enfrió sobre hielo. Se midió la absorbancia de las muestras a 405 nm.
Las versiones núcleo de las celobiohidrolasas que albergan un CBD en su forma nativa se obtuvieron como sigue: Cel7A de Ct y Cel7A de Tr fueron expuestas a digestión proteolítica para eliminar el dominio de unión a celulosa. La digestión con papaína (Papaya Latex, 14 U/mg, Sigma) de las celobiohidrolasas nativas se realizó a 37°C durante 24 h en una mezcla de reacción compuesta de L-cisteína 10 mM y EDTA 2 mM en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5,0 ) con la adición de papaína (se sometieron a ensayo dos concentraciones de papaína: una cantidad de una quinta parte o una décima parte de papaína con respecto a la cantidad total de la Cel7A en la mezcla de reacción). La proteína núcleo resultante se purificó con una columna de intercambio aniónico DEAE Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala, Suecia) como se ha descrito anteriormente. El producto se analizó en SDS-PAGE.
Los resultados de hidrólisis a 45°C y 70°C se muestran en la Figura 4 y la Figura 5, respectivamente. Los resultados muestran claramente que todas las celobiohidrolasas muestran una hidrólisis más rápida y más completa a ambas
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La secuencia de la proteína de la endoglucanasa aislada Thermoascus aurantiacus es completamente idéntica a la de la EGI publicada de T. aurantiacus (AF487830, Tabla 18). La homología más próxima se encontró en una secuencia de β-glucanasa de Talaromyces emersonii (AX254752, identidad de 71,1%).

Tabla 18. Comparación de las endoglucanasas EG_40, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium thermophilum, EG_54/Cel7B de Chaetomium thermophilum y EG_28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus con sus contrapartes homólogas. Este alineamiento se realizó utilizando el programa de Needle del paquete de programas EMBOSS. *Indica una endoglucanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
Acremonium thermophilum EG_40
100,0
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
77,3
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
75,3
Neurospora crassa, hipotético XM_324477
68,9
Humicola grisea var thermoidea, EGL3, AB003107
67,5
Humicola insolens EG5, A23635
67,3
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
57,9
*Acremonium thermophilum de tipo EG_40
53,7
Acremonium thermophilum de tipo EG_40
100,0
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305
66,9
Magnaporthe grisea 70-15 hipotético, XM_363402
61,9
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
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*Acremonium thermophilum EG_40
56,8
Melanocarpus albomyces Cel45A, AJ515703
53,7
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52,8
Chaetomium thermophilum EG_54
100,0
Melanocarpus albomyces Cel7A, AJ515704
70,6
Humicola grisea var thermoidea EGI, D63516
68,8
Humicola insolens EGI, AR012244
67,7
Myceliophthora thermophila EGI, AR071934
61,7
Fusarium oxysporum var lycopercisi EGI, AF29210
53,5
Fusarium oxysporum EGI, AR012243
52,6
Thermoascus aurantiacus EG_28
100,0
Thermoascus aurantiacus EG, AX812161
100,0
Thermoascus aurantiacus EGI, AY055121
99,4
Talaromyces emersonii β-glucanasa, AX254752
71,1
Talaromyces emersonii EG, AF440003
70,4
Aspergillus niger EG, A69663
70,1
Aspergillus niger EG, A62441
69,9
Aspergillus niger EG, AF331518
69,6
Aspergillus aculeatus EGV, AF054512
68,5
Ejemplo 19. Producción de endoglucanasas recombinantes en Trichoderma reesei
10 Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes EG_40/Cel45A, de tipo EG_40/Cel45B de Acremonium, y EG_28/Cel5A de Thermoascus como se ha descrito en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 19) se aislaron de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de
imagen49
5
10
15
20
25
30
35
Proteína
Péptido Localización del cebador(a Secuencia del cebador (b
At
EKVNLT(c imagen50 GARAARGTNAAYCTNAC
βG_101
imagen51 imagen52 imagen53
imagen54
Péptido 4 6―11 YTTRCCRTTRTTSGGRGTRTA
Ct
Péptido 6 4―9 TNTGYCTNCARGAYGG
βG_76
imagen55 imagen56 imagen57
imagen58
Péptido 1 3―8 TCRAARTGSCGRTARTCRATRAASAG
Ta
Péptido 3 1―5 AARGGYGTSGAYGTSCAR
βG_81
imagen59 imagen60 imagen61
imagen62
Péptido 1 2―7 YTTRCCCCASGTRAASGG
(a Aminoácidos del péptido utilizado para el diseño de la secuencia del cebador
(b Para reducir la degeneración, algunos codones se seleccionaron de acuerdo con la preferencia fúngica N = A, C, G, o T;. R = A o G, S = C o G; Y = C o T
(c El péptido no deriva de la proteína βG_101 de Acremonium purificada, sino que se origina a partir de la secuencia de β-glucosidasa (BD168028) de A. cellulolyticus homóloga a βG_101.
Las sondas para el escrutinio de las bibliotecas genómicas construidas se amplificaron con las combinaciones de cebadores enumeradas (Tabla 20) utilizando ADN genómico de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus como molde. Las mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,1-0,2 mM, 0,25 µg de cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 0,5 µg de ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de hibridación a 40°C (ADN de Acremonium como molde), a 50°C (ADN de Chaetomium como molde), o a 63°C (ADN de Thermoascus como molde), 2-3 min de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 5-10 min.
Se aislaron productos de PCR específicos del tamaño esperado (estimado a partir de las secuencias de βglucosidasa homólogas BD168028, AY072918, y AY368687) del gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 1,8 kb (Acremonium), 1,5 kb (Chaetomium), y 1,52 kb (Thermoascus) se clonaron en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, USA) dando como resultado los plásmidos pALK1924, pALK1935, y pALK1713, respectivamente. Los productos de ADN se caracterizaron mediante secuenciación y realizando hibridaciones de transferencia Southern del ADN genómico digerido con varias enzimas de restricción. Los patrones de hibridación en condiciones de lavado rigurosas sugieren que se podría aislar un supuesto gen de β-glucosidasa de la biblioteca genómica de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los tres productos de PCR tienen homología con varias secuencias de β-glucosidasa publicadas de la familia 3 de glicosil hidrolasa (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).
El inserto de los plásmidos pALK1713, pALK1924, y pALK1935 se aisló mediante digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Se escrutaron aproximadamente 1-2 x 105 placas de la biblioteca genómica de Acremonium, Chaetomium, o Thermoascus amplificadas como se ha descrito en el Ejemplo 18. Se obtuvieron varias placas positivas, de las cuales de cinco a seis placas que hibridaron fuertemente se purificaron a partir de cada escrutinio. Los ADN de los fagos aislaron y se analizaron mediante hibridación de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción que hibridaban con la sonda se subclonaron en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) y las porciones relevantes se secuenciaron. En todos los casos el fragmento de fago subclonado contiene el gen completo de interés. La Tabla 21 resume la información de las sondas utilizadas para el escrutinio de los genes de β-glucosidasa, los clones de fagos de los que se aislaron los genes, los fragmentos de restricción seleccionados que contienen los genes completos con sus regiones promotora y terminadora, los nombres de los plásmidos que contienen el fragmento de fago subclonado, y los números de depósito en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkulturen GmbH (DSM) de cepas de E. coli que portan estos plásmidos.

Tabla 21. Sondas utilizadas para la clonación del gen de la β-glucosidasa, clon del fago y subclón seleccionados, nombre de plásmido y número de depósito correspondiente de la cepa de E. coli.
Gen
Biblioteca genómica Sonda utilizada en el escrutinio Clon del fago Fragmento subclonado Plásmido Núm. de depósito de E. coli
cel3A de
A. thermophilum pALK1924 P44 6,0 kb pALK1925 DSM
Gen
Biblioteca genómica Sonda utilizada en el escrutinio Clon del fago Fragmento subclonado Plásmido Núm. de depósito de E. coli
At
ALKO4245 imagen63 imagen64 HindIII imagen65 17325
cel3A de Ct
C. thermophilum pALK1935 P51 7,0 kb pALK2001 DSM
ALKO4261
XbaI 17667
cel3A de Ta
T. aurantiacus pALK1713 P21 5,3 kb pALK1723 DSM
ALKO4242
BamHI 16725
La información relevante de los genes y las secuencias de proteína deducidas (SEQ ID NO: 21-26) se resumen en la Tabla 22 y la Tabla 23, respectivamente. Las secuencias de péptidos de las proteínas βG_101 (At Cel3A) Acremonium, βG_76 (Ct Cel3A) de Chaetomium, y βG_81 (Ta Cel3A) de Thermoascus purificadas se encontraron en las correspondientes secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados confirmando que se habían clonado los genes apropiados.

Tabla 22. Resumen de los genes de β-glucosidasa aislados de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus.
Gen de βglucosidasa
Longitud con intrones (pb)(a Región codificante pb)(b Núm. de intrones Longitud de los intrones (pb) SEQ ID NO:
cel3A de At
2821 2583 3 92, 74, 69 23
cel3A de Ct
2257 2202 1 52 25
cel3A de Ta
3084 2529 7 134, 67, 56, 64, 59, 110, 62 21
(a Está incluido el codón de PARADA. 10 (b No está incluido el codón de PARADA. Tabla 23. Resumen de las secuencias de β-glucosidasa deducidas de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum, y Thermoascus aurantiacus. ss, secuencia señal.
Proteína βglucosidasa
Núm. de aa Longitud de la ss NN/HMM(a CBD(b PM pronosticado (Da, no incluida ss)(c pl pronosticado no incluida ss) Supuestos sitios de N-glicosilación(d SEQ ID NO:
βG_101 de At
861 19/18 No 91434 5,46 8 24
βG_76 de Ct
734 20/20 No 76457 6,3 2 26
βG_81 de Ta
843 19/19 No 89924 4,95 8 22
(a La predicción de la secuencia señal se realizó utilizando el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al,. 1997; Bendtsen et al, 2004); el valor NN se obtuvo utilizando redes neuronales y valor HMM utilizando modelos ocultos de Markov.
15 (b Presencia de un dominio de unión a celulosa en la proteína.
(c La secuencia señal pronosticada no está incluida. La predicción se realizó utilizando la herramienta el Compute pl/MW en el servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003).
(d Los supuestos sitios de N-glicosilación NXS/T se pronosticaron utilizando el programa NetNGlyc 1,0 (Gupta et al., 2004).
20 Las secuencias de proteínas deducidas de las β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium, βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_81/Cel3A de Thermoascus comparten homología con las enzimas de la familia 3 de glicosil hidrolasa, identificando de este modo que los genes aislados pertenecen a esta familia de genes. Las contrapartes más cercanas de las β-glucosidasas de Acremonium, Chaetomium, y Thermoascus son las de Magnaporthe grisea (β-glucosidasa, AY849670), Neurospora crassa (hipotética, XM_324308), y Talaromyces emersonii (β-glucosidasa,
25 AY072918), respectivamente (Tabla 24). Se encontró que la identidad de secuencia más alta (73,2%) era la de βG_76/Cel3A de C. thermophilum para la proteína hipotética de N. crassa indicando que se habían clonado genes de nuevas enzimas.

Tabla 24 Comparación de las β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. La alineación se ha realizado mediante el programa Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una β-glucosidasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
*Acremonium thermophilum βG_101
100,0
Magnaporthe grisea β-glucosidasa, AY849670
73,1
Neurospora crassa hipotética, XM_330871
71,1
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
65,2
*Thermoascus aurantiacus βG_81
62,2
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
59,5
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
58,9
Aspergillus oryzae, AX616738
58,2
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
57,2
*Chaetomium thermophilum βG_76
40,9
Chaetomium thermophilum βG_76
100,0
Neurospora crassa, hipotética XM_324308
76,9
Magnaporthe grisea, hipotética XM_364573
70,2
Trichoderma viridae BGI, AY368687
65,8
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
41,2
*Acremonium thermophilum βG_101
40,9
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
40,0
*Thermoascus aurantiacus βG_81
39,9
*Thermoascus aurantiacus βG_81
100,0
Talaromyces emersonii β-glucosidasa, AY072918
73,2
Aspergillus oryzae, AX616738
69,5
Aspergillus aculeatus β-glucosidasa, D64088
68,0
Acremonium cellulolyticus β-glucosidasa, BD168028
65,7
*Acremonium thermophilum βG_101
62,2
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374
57,9
*Chaetomium thermophilum βG_76
39,9
5
Ejemplo 21. Producción de beta-glucosidasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes βG_101/Cel3A de Acremonium, de βG_76/Cel3A de Chaetomium, y βG_81/Cel3A de Thermoascus como se describe en el Ejemplo
14. Se aislaron casetes de expresión lineales (Tabla 25) de la cadena principal del vector mediante digestión con 10 enzimas de restricción, se transformaron en T. reesei A96 o A33 (ambas cepas tienen suprimidos los genes que codifican las cuatro celulasas principales CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A) y los transformantes se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 14.
Tabla 25. Casetes de expresión construidos para la producción de β-glucosidasas βG_101/Cel3A de Acremonium thermophilum, βG_76/Cel3A de Chaetomium thermophilum, y βG_81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus en 15 Trichoderma reesei. La estructura esquemática de los casetes de expresión se describe en la Figura 2.
β-glucosidasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
βG_101 de At
pALK1933 NotI de 10,5 kb 300 pb (HindIII)
imagen66
imagen67

Tabla 28. Comparación de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus deducidas con sus contrapartes homólogas. El alineamiento se realizó utilizando el programa de Needle del paquete de programas EMBOSS. * Indica una xilanasa codificada por un gen clonado en este trabajo.
Organismo, enzima, y número de acceso
Identidad (%)
* Thermoascus aurantiacus XYN_30
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, P23360
100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, AF127529
99,4
Aspergillus niger xilanasa, A62445
69,7
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR137844
69,9
Aspergillus terreus fam 10 xyn, DQ087436
65,0
Aspergillus sojae, XynXl AB040414
63,8
Penicillium chrysogenum xilanasa, AY583585
62,5
*Acremonium thermophilum XYN_60
100,0
Humicola grisea XYL I, AB001030
67,1
Magnaporthe grisea 70-15, hipotética XM_364947
63,8
Aspergillus aculeatus xilanasa, AR149839
53,7
Talaromyces emersonii xilanasa, AX403831
51,8
Gibberella zeae xilanasa, AY575962
51,4
Magnaporthe grisea XYL5, AY144348
48,5
Talaromyces emersonii, AX172287
46,9
5
Ejemplo 23. Producción de xilanasas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes XYN_60/Xyn10A de Acremonium y XYN_30 /Xyn10A de Thermoascus como se ha descrito en el Ejemplo 14. Los casetes de expresión lineales (Tabla 29) se aislaron de la cadena principal del vector mediante digestión con enzimas de restricción, se
10 transformaron en T. reesei A96, y los transformantes se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 14.

Tabla 29. Casetes de expresión construidos para la producción de las xilanasas XYN_60/Xyn10A de Acremonium thermophilum y XYN_30/ Xyn10A de Thermoascus aurantiacus en Trichoderma reesei. Las estructuras esquemáticas de los casetes de expresión se describen en la Figura 2.
Xilanasa
Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b
XYN_60 de At
pALK1912 9,0 kb 150 pb (BamHI)
XYN_30 de Ta
pALK1913 9,3 kb ninguno
(a El casete de expresión para la transformación en T. reesei se aisló de cadena principal del vector mediante 15 digestión con EcoRI.
(b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que está incluido en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se utilizó en la construcción del casete de expresión se indica entre paréntesis.
Se analizó la producción de xilanasa de los transformantes a partir de los sobrenadantes de cultivo de cultivos en
20 matraz oscilante (50 ml). Los transformantes se cultivaron como en el Ejemplo 14 y la actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante de cultivo como la liberación de azúcares reductores de xilano de abedul (1% p/v) a 50°C en tampón citrato 50 mM de pH 5,3 como describen Bailey y Poutanen 1989. También se analizó la producción de la proteína recombinante del sobrenadante de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Además, la expresión de ambas xilanasas se determinó mediante análisis de
25 transferencia Western con anticuerpos anti-XYN_30 o anti-XYN_60 como se ha descrito en el Ejemplo 19. Los genotipos de los transformantes seleccionados se analizaron mediante transferencia Southern utilizando el casete de expresión como sonda.
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