JP2015527065A - 酵素 - Google Patents

Abstract

本発明は、食品製品、飼料製品、又はモルト飲料製品の製造、例えば醸造工程、に使用するのに適した、改良された性質を有する新規な酵素、及び当該酵素を含む組成物に関する。

Description

本発明は、食品、飲料（ビール等）、飼料、又はバイオ燃料の製造における使用（例えば、醸造工程における使用）に適した改良された性質を有する酵素、及び、当該酵素を含む組成物に関する。

ビール製造における酵素の使用はよく知られている。マッシュのろ過性の改善及びエキス収率の向上のために糖化（マッシング）工程に酵素を適用することは、国際公開公報WO97/42302に記載されている。

国際公開公報WO2005/118769及びWO2005/059084は、ビール製造工程における糖化及びろ過工程に関し、また、当該工程における酵素組成物の使用に関するものである。

国際公開公報WO99/57325は、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）の菌株、当該菌株から得られる新規酵素混合物、及びそれらに対する核酸配列に関するものである。

しかし、食品製品及び飲料製品の製造（例えば、ビール又はウイスキー等のアルコール飲料の製造における糖化工程、蒸煮工程、及びろ過工程）において有用な改良された酵素及び酵素の組み合わせについては、更に必要とされている。

本発明の課題の一つは、食品製品及び飲料製品の製造（例えば、アルコール飲料又はノンアルコール飲料の製造や、ビール又はウイスキーのような穀物使用飲料又はモルト使用飲料の製造）に適した酵素を提供することにある。本発明によって提供される酵素は、醸造における使用に関して改良された性質を有してもよい。この多種多様な改良された性質には、例えば、温度最適性の改良、不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）への活性に対する可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）への活性の比率の改良、醸造工程のロイターリング（ロイター式ろ過）及び／又はろ過の工程中に増加する総圧力（合計圧力）の軽減（減少）、及び酵素処理した原料のろ過性の向上等が含まれる。

本発明者らは、１種以上の酵素及び酵素の特定の組み合わせが、公知の酵素や公知の酵素を組み合わせた場合の性質を改良すること、特に、デンプン含有原料が１種以上の酵素で処理されて醸造用マッシュが製造される醸造工程における酵素の使用に関して酵素の性質を改良することを発見した。

すなわち、第一の側面において、本発明は、
エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む酵素
に関する。

本明細書において、「機能性断片」とは、酵素の切断体であって、非切断の基準酵素と実質的に同じ程度の酵素活性又は非切断の基準酵素の少なくともかなりの程度の酵素活性を有する酵素切断体をさす。

第二の側面において、本発明は、
エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む酵素
に関する。

第三の側面において、本発明は、
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を含む組み換え発現ベクター
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で形質転換された細胞
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
本発明の酵素、本発明のＤＮＡ構築物、本発明のベクター、又は本発明の細胞を含む調製物
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のβ-グルカナーゼと組み合わせて含む組成物
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
本発明のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
食品製品、飼料製品、又はビール若しくはウイスキー等のモルト飲料製品の製造における、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
ドウ製品又はベークド製品の製造における、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
パルプ又は紙の調製における、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
穀物成分の調製のための、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用
に関する。いくつかの実施形態においては、穀物は、ライ麦、小麦、又は大麦である。

更に別の側面において、本発明は、
ビールの製造又は醸造工程からの副産物の改変における、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
ワイン又はジュースの製造における、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃料の製造における、本発明の酵素、本発明の調製物、又は本発明の組成物の使用
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
デンプン含有原料のろ過性を変更する方法であって、本発明の酵素、調製物、又は組成物で前記デンプン含有原料を処理する工程を含む方法
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
醸造用途においてロイターリング（ロイター式ろ過）中に増加する圧力を軽減する（減少させる）方法であって、本発明の酵素、調製物、又は組成物で醸造用マッシュを処理する工程を含む方法
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
食品製品、飼料製品、又は、アルコール飲料若しくはノンアルコール飲料や、ビール若しくはウイスキーのような穀物使用飲料若しくはモルト使用飲料等の飲料製品を製造する方法であって、本発明の酵素、調製物、又は組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
醸造用マッシュを製造する方法であって、本発明の酵素、調製物、又は組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃料を製造する方法であって、本発明の酵素、調製物、又は組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
本発明の方法によって得られた製品
に関する。

更に別の側面において、本発明は、
本発明の方法によって得られた製品を含む組成物であって、前記製品が０．１％〜９９．９％の範囲で含まれるような組成物
に関する。

ラボスケール醸造及びパイロットスケール醸造において使用する糖化プロファイル。１０分間のマッシングイン（マッシュ投入）期間によって糖化を開始し、その期間の後に酵素を添加した。 グルカナーゼ及びキシラナーゼのスクリーニングを確認するパイロット規模醸造の適用結果。アスペルギルス ツビゲンシス（A. tub）キシラナーゼと組み合わせたバチルス スブチリス（B. sub）グルカナーゼを、ブランク及びUltraFlo maxを対照として試験した。収集したデータは、平均流量（L/h）、ロイターリングの工程中に増加した総圧力（mmWC、ここで1mmWC=9.80665Pa）、及びロイターリングの工程中に記録した最大圧力（mmWC）である。 醸造におけるキシラナーゼの機能。 流量−種々のキシラナーゼの候補を適用したロイターリング。 ビールろ過−繰り返し行ったろ過の平均。 ビールろ過−繰り返し行ったろ過の平均。 実施例３の糖化工程図。

発明の詳細な説明

ビールとは、大麦穀物由来の麦芽等のモルト、必要に応じてデンプン含有植物原料（例えば、穀物）等の付加原料、及び必要に応じて香料（例えば、ホップ等）に由来するアルコール飲料のことを、伝統的にビールと呼んでいる。

本発明に関しては、用語「ビール」は、デンプン含有植物原料の発酵／醸造によって製造される全てのウォルト（麦汁）発酵物を含むことを意味する。従って、又、特に、ビールは、もっぱら付加原料から製造されてもよいし、モルトと付加原料の組み合わせから製造されてもよい。

本発明に関しては、用語「発酵」は、培養物中で微生物を生育させることによるエタノール等の物質の生産を意味する。一般に、酵母等の微生物が発酵に使用される。

本明細書において、用語「モルト」は、モルトにした大麦等、任意のモルトにした穀物を意味する。「付加原料」は、モルト又は大麦麦芽以外の全てのデンプン含有植物原料を意味する。

用語「デンプン含有植物原料」は、例えば、大麦、小麦、トウモロコシ、ライ麦、ソルガム、キビ、又は米、及びこれらの任意の組み合わせ等の１種以上の穀物であり得る。デンプン含有植物原料は、例えば、粉砕する、モルトにする、部分的にモルトにする、又はモルトにしない等の処理を行ってもよい。モルトにしていない穀物も、又、「原料穀物」と呼ぶ。非穀物性のデンプン含有植物原料は、例えば、ジャガイモ及びキャッサバ等の塊茎植物を含む。

本明細書において、用語「飲料」及び「飲料製品」は、オールモルトビール、ビール純粋例の下で醸造したビール、エール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、モルトリカー、ノーアルコールビール、ノーアルコールモルトリカー等の発泡性発酵飲料を含む。また、用語「飲料」又は「飲料製品」は、非発泡性ビール、及び代替モルト飲料（例えば、フルーツの香り（レモン、オレンジ、ライム等の柑橘類の香り、又はベリーの香り）のモルト飲料）、リカーの香りのモルト飲料（例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラの香りのモルトリカー）、又はコーヒーの香りのモルト飲料（例えば、カフェインの香りのモルトリカー）、等）を含む。

ビールは、基本的に同様の工程によって、種々のデンプン含有植物原料から製造することができる。デンプンは、主として、グルコース残基が、α-1,4-結合又はα-1,6-結合のいずれかによって(前者の結合が多い）結合したグルコースのホモポリマーからなる。

ビール等の発酵飲料を製造する工程は、一般に醸造と呼ばれる。これらの飲料の製造において使用される伝統的な原料は、水、ホップ、及びモルト（麦芽）である。モルトに加えて、又はモルトに替えて、普通のコーングリッツ、精製したコーングリッツ、粉砕した醸造酵母、米、ソルガム、精製したコーンスターチ、大麦、大麦スターチ、脱穀大麦、小麦、小麦スターチ、乾燥した穀物、穀物フレーク、ライ麦、オート麦、ジャガイモ、タピオカ、及びシロップ（コーンシロップ、サトウキビシロップ、転化糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ）等の付加原料を、デンプン供給源として用いてもよい。デンプンは、酵素によって、最終的に発酵性糖に変換される。

主としてモルトから製造されるビール（例えば、付加原料は１５〜２０％までである）に関しては、種々の理由により、モルト（モルトは、主として、選ばれた品種の大麦から製造される）は、ビールの全体の性質及び品質に大きな影響を及ぼす。第1に、モルトは、ビールの最初の香味料である。第２に、モルトは、発酵性糖の大部分を供給する。第３に、モルトはタンパク質を供給し、このタンパク質はビールのボディー及び泡の性質に関与する。第４に、モルトは、糖化の時に必要な酵素活性を供給する。

ホップも又、香味付を含めて、ビールの品質に重要な影響を及ぼす。特に、ホップ（又は、ホップ成分）により、ビールに望ましい苦味物質が添加される。更に、ホップは、タンパク沈殿剤として働き、保存剤並びに泡形成及び安定化の補助剤となる。全てのビールが、ホップを用いて製造されるわけではない。プロテアーゼ（例えば、パパイン）等の他の安定化剤も又、使用してもよい。

本発明を限定的に解釈するものではないが、伝統的なビール醸造工程は、次のように説明できる：

ビール製造工程は、当技術分野で周知である。簡単にいえば、ビール製造工程は、５つの工程を含む：（ａ）糖化（マッシング）及び／又は付加原料の蒸煮（クッキング）、（ｂ）ウォルトの分離及び抽出、（ｃ）ウォルトの煮沸及びホップ添加（ホッピング）、（ｄ）冷却、発酵、及び貯蔵(storage)、（ｅ）熟成(maturation)、加工、及び包装。一般的には、第１工程では、粉砕又は圧砕したモルトを水と混合し、制御された温度の下で一定の時間保持して、モルト中の酵素にモルト中のデンプンを発酵性糖へ変換させる。

第２工程では、マッシュをロイタータン（ロイター式ろ過槽）又はマッシュフィルター（マッシュろ過布）へ移し、そこで液体を穀物残渣から分離する。この甘い液体は、ウォルト(麦汁）と呼ばれ、残りの穀物残渣はスペントグレイン（モルト粕）と呼ばれる。一般的にはマッシュを抽出するが、この抽出においてスペントグレイン（モルト粕）に残っている可溶性エキスを回収するために、マッシュに水を加える。

第３工程では、ウォルトを激しく煮沸する。これにより、ウォルトが殺菌され、色、香味、及び香りが増す。煮沸中のある時点で、ホップを添加する。

第４工程では、ウォルトを冷却して発酵槽へ移す。この発酵槽は、予め酵母が添加されているか、又はウォルト添加後に酵母を添加する。酵母は、発酵によって糖をアルコールと二酸化炭素ガスに変換する。発酵の最後に発酵槽を冷却する。又は、発酵を止めるために発酵槽を冷却してもよい。酵母は、凝集し、回収される。

最終工程では、ビールを冷却し、ある期間貯蔵する。この貯蔵期間中に、ビールは清澄になり、香味が増し、ビールの外観、香味、賞味期間に悪影響を及ぼす可能性のある物質が沈殿する。包装の前に、ビールにカーボネーションを行い、必要に応じて、ビールをろ過及び低温殺菌する。

発酵後には、通常、約２重量％〜約１０重量％のアルコールを含む飲料が得られる。非発酵性の炭水化物は、発酵中には変換されず、最終ビール中で溶解固形物の大部分を形成する。

この残渣が残るのは、モルトのアミラーゼがデンプンのα-1,6-結合を加水分解することができないからである。非発酵性の炭水化物は、ビール１２オンス当たり、約５０カロリーの寄与をする。

近年、ライトビール、減カロリービール、又は低カロリービールと呼ばれる醸造飲料が、特に米国市場で広く普及している。米国において定義されているように、これらのビールは、製造業者の通常のビールより約３０％低いカロリーのビールである。

伝統的な醸造工程に関する他の情報、及び本発明に適用する醸造技術の技術分野において使用する用語の定義については、「"Technology Brewing and Malting"、Wolfgang Kunze著 (the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB)), 2nd revised Edition 1999, ISBN 3-921690-39-0, 3rd edition (2004): ISBN 3-921690-49-8, 4^th updated edition, 2010 (ISBN 978-3-921690-64-2)」を参照してもよい。

キシラナーゼは、EC 3.2.1.8、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.136、及びEC 3.2.1.156に分類される。キシラナーゼの活性は、例えば、本実施例に記載したように測定してもよい。本発明のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素と組み合わせて用いるための好ましいキシラナーゼは、EC 3.2.1.8、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.136、及びEC 3.2.1.156に分類されるキシラナーゼ（例えば、国際公開公報WO2010072226、WO2010072225、WO2010072224、WO2005059084、WO2007056321、WO2008023060A、WO9421785、WO2006114095、WO2006066582、US2008233175、及びWO10059424に開示されているいずれかの酵素）を含む。

エンド-1,4-β-キシラナーゼは、EC 3.2.1.8に分類される。この酵素は、キシランの1,4-β-D-キシロシド結合をエンド加水分解する。

本明細書において、用語「ファミリー１１キシラナーゼ」、「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１１」、又は単に「ＧＨ１１キシラナーゼ」は、EC 3.2.1.8に分類されるエンド-1,4-β-キシラナーゼをさし、これは、キシランの1,4-β-D-キシロシド結合をエンド加水分解し、「B. Henrissat著、"A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities"、Biochem. J. 280 (1991), pp. 309−316」に従ってファミリー１１キシラナーゼに分類される。

用語「ファミリー１０キシラナーゼ」、「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１０」、又は単に「ＧＨ１０キシラナーゼ」は、キシラナーゼ（EC:3.2.1.8）、エンド-1,3-β-キシラナーゼ（EC:3.2.1.32）、セロビオヒドロラーゼ（EC:3.2.1.91）等のいくつかの公知の活性を有する酵素を含む。

いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す本発明の酵素は、ファミリー１１キシラナーゼである。いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す本発明の酵素は、ファミリー１０キシラナーゼである。

一つの側面において、本発明の酵素組成物は、実施例に記載したアッセイによって測定されるエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を有する。

キシラナーゼ活性を測定するアッセイは、ｐＨ３．５又はｐＨ５、及び５０℃で、基質としてキシランを用いて、実施してもよい。あるいは、酵素の更に別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ及び温度の値でアッセイを実施することができる。酵素活性は、５４０ｎｍでのキシロースによる吸光度の単位時間当たりの増加から計算される。

いくつかの実施形態において、本発明の酵素組成物は、実施例に記載したアッセイによって測定した場合、少なくとも約５０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約６０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約７０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約８０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約８５００Ｕ／ｇのキシラナーゼ活性を含む。

本発明の酵素組成物は、セルロース分解活性を有してもよい。セルロースの系統名は4-(1,3;1,4)-β-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼであり、セルロース分解酵素又はセルラーゼはEC 3.2.1.4に分類される。セルラーゼは、例えばセルロース、リケニン、及び穀物のβ-D-グルカンの(1→4)-β-D-グルコシド結合をエンド加水分解し、又β-D-グルカン（1,3-結合も含んでいる）の1,4-結合も加水分解する。セルラーゼには、又、エンド-1,4-β-D-グルカナーゼ、β-1,4-グルカナーゼ、β-1,4-エンドグルカンヒドロラーゼ、セルラーゼ A、セルロシン AP、エンドグルカナーゼ D、アルカリ セルロース、セルラーゼ A 3、セルデキストリナーゼ、9.5 セルラーゼ、アビセラーゼ、パンセラーゼ SS、及び1,4-(1,3;1,4)-β-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ等の別の名称もある。

本発明の一つの側面において、本発明の酵素組成物のセルラーゼ活性は、「アッセイ」という表題で下記に記載した「セルラーゼ活性の方法」により測定する。

更に別の側面において、本発明は、実施例に記載したアッセイにより決定するエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を有する酵素に関する。

本明細書において、「β−グルカナーゼ」又は「ベータ-グルカナーゼ」とは、EC 3.2.1.6のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼをさす。Ｃ−３の位置でグルコース残基（グルコース残基の還元性基は、加水分解する結合に関与している）に置換されている場合に、β-D-グルカンの(1→3)-結合又は(1→4)-結合のエンド加水分解を触媒する。本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素と組み合わせて用いる好ましいβ-グルカナーゼは、国際公開公報WO2004087889、WO2005059084、WO9414953、WO2007056321、WO9531533、WO08023060、WO2005100582、WO9828410、WO9742301、WO2006066582、WO05118769、WO2005003319、及びWO10059424に記載されたいずれか１種のβ-グルカナーゼを含む。

標準的なアッセイはｐＨ５．０で実施するが、更に、酵素の別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ値でアッセイを実施することもできる。

エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（又は指定されたｐＨ）及び５０℃）の下で、１分間に１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。

いくつかの実施形態において、本発明の酵素組成物は、実施例に記載したアッセイによって測定した場合、少なくとも約１００００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１２０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１４０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１５０００Ｕ／ｇ、例えば少なくとも約１８０００Ｕ／ｇのβ-グルカナーゼ活性を含む。

更に別の側面において、本発明の酵素組成物は、ラミナリナーゼ活性を有するか、又はラミナリナーゼ活性を有する任意の１種以上の更なる酵素を含む。ラミナリナーゼ活性は、アッセイのセクションに記載したラミナラーゼ（ｌａｍｉｎａｒａｓｅ）アッセイの記載のように決定する。

ラミナリナーゼは、E.C. 3.2.1.6に分類されるエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ、又はE.C. 3.2.1.39に分類されるグルカンエンド-1,3-β-D-グルコシダーゼであってよい。ラミナリナーゼ、エンド-1,3-β-グルカナーゼ、エンド-1,4-β-グルカナーゼという代替名を持つエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼは、E.C. 3.2.1.6に分類される。基質は、ラミナリン、リケニンおよび穀物Ｄ−グルカンを含み、酵素は、Ｃ−３の位置でグルコース残基（グルコース残基の還元性基は、加水分解する結合に関与している）に置換されている場合に、β-D-グルカンの(1→3)-結合又は(1→4)-結合のエンド加水分解を触媒する。(1→3)-β-グルカンエンドヒドロラーゼ、エンド-1,3-β-グルカナーゼ、及びラミナリーゼという代替名を持つグルカンエンド-1,3-β-D-グルコシダーゼは、E.C. 3.2.1.39に分類され、例えばラミナリン、パラミロン及びパキマンのような基質の(1→3)-β-D-グルカンの(1→3)-β-D-グルコシド結合を加水分解する。

いくつかの側面において、本発明の酵素組成物はアラビナナーゼ活性を有するか、又はアラビナナーゼ活性を有する更なる酵素を含む。アラビナナーゼは、EC 3.2.1.99に分類される。系統名は、5-α-L-アラビナン5-α-L-アラビナノヒドロラーゼであるが、アラビナンエンド-1,5-α-L-アラビノシダーゼ、及びエンド-1,5-α-L-アラビナナーゼ、エンド-α-1,5-アラバナーゼ、エンド-アラバナーゼ、1,5-α-L-アラビナン、及び1,5-α-L-アラビナノヒドロラーゼ等のいくつかの別の名称もある。アラビナーゼは、(1→5)-アラビナンの(1→5)-α-アラビノフラノシド結合をエンド加水分解する。アラビナナーゼは、アラビナンにも作用する。

本発明の一つの側面において、本発明の酵素組成物のアラビナーゼ活性は、「アッセイ」という表題で下記に記載したアラビナーゼアッセイにより測定する。アッセイは、ｐＨ３．５及び５０℃で、基質としてサトウダイコンアラビナンを用いて、実施できる。また、酵素の更に別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ及び温度の値でアッセイを実施することができる。酵素活性は、５４０ｎｍでの吸光度の単位時間当たりの増加から計算される。

アラビナーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ３．５及び５０℃）の下で、ΔOD_540nm.min^-1の増加を生じる酵素の量（総アッセイ体積に対して標準化したもの）として定義される。

いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ活性を有するか、又はβ-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ活性を有する更なる酵素を含む。β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼは、E.C 3.2.1.21の酵素をさす。

いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、β-キシロシダーゼ活性を有するか、又はβ-キシロシダーゼ活性を有する更なる酵素を含む。「β-キシロシダーゼ」又は「キシラン1,4-β-キシロシダーゼ」は、E.C 3.2.1.37の酵素をさす。β-キシロシダーゼは、(1→4)-β-D-キシランの加水分解を触媒し、非還元末端から連続するD-キシロース残基を除去する。

本発明のいくつかの側面において、本発明の酵素組成物はセロビオヒドロラーゼ活性を有するか、又はセロビオヒドロラーゼ活性有する更なる酵素を含む。「セロビオヒドロラーゼ」又は「セルロース1,4-β-セロビオシダーゼ」は、EC 3.2.1.91の酵素をさす。セルロース1,4-β-セロビオシダーゼは、セルロース及びセロテトラオースの1,4-β-D-グルコシド結合の加水分解を触媒して、鎖の非還元端部からセロビオースを放出する。

本発明の酵素組成物のセロビオヒドロラーゼ活性は、「アッセイ」という表題で下記に記載したセロビオヒドロラーゼアッセイにより測定する。標準的なアッセイはｐＨ５．０で実施するが、更に、酵素の別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ値でアッセイを実施することもできる。

セロビオヒドロラーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（又は指定されたｐＨ）及び５０℃）の下で、１分間に、p-ニトロフェニルβ-D-セロビオピラノシドから１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを生じる酵素の量として定義される。

いくつかの側面において、本発明の酵素組成物はα-N-アラビノフラノシダーゼ活性を有するか、又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する更なる酵素を含む。「α-N-アラビノフラノシダーゼ」又は「α-N-アラビノフラノシダーゼ」は、EC 3.2.1.55の酵素をさす。α-N-アラビノフラノシダーゼは、α-L-アラビノシドの末端の非還元性のα-L-アラビノフラノシド残基の加水分解を触媒する。

本発明の一つの側面において、本発明の酵素組成物のアラビノフラノシダーゼ活性は、「アッセイ」という表題で下記に記載したアラビノフラノシダーゼアッセイにより測定する。標準的なアッセイはｐＨ５．０および５０℃で実施するが、更に、酵素の別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ値及び温度でアッセイを実施することもできる。

α-N-アラビノフラノシダーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０および５０℃（又は指定された通り））の下で、１分間に、p-ニトロフェニルα-L-アラビノフラノシドから１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを生じる酵素の量として定義される。

いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、グルカン1,4-β-グルコシダーゼ活性を有するか、又はグルカン1,4-β-グルコシダーゼ活性を有する更なる酵素を含む。「グルカン1,4-β-グルコシダーゼ」又は「グルカン1,4-β-グルコしダーゼ」は、E.C3.2.1.74の酵素をさす。グルカン1,4-β-グルコシダーゼは、(1→4)-β-D-グルカンの(1→4)-結合の加水分解を触媒し、連続したグルコース単位を除去する。

いくつかの側面において、本発明の酵素組成物は、キシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ活性を有するか、又はキシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ活性を有する更なる酵素を含む。「キシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ」は、E.C3.2.1.155の酵素をさす。キシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼは、キシログルカンの(1→4)-β-D-グルコシド結合のエキソ加水分解を触媒する。

更なる側面における本発明の酵素及び酵素組成物は、デンプン加水分解物を含む水溶液の粘度を減少させることを含む工程に使用してもよい。

本発明の酵素及び酵素組成物は、デンプン加水分解物を含む水溶液のろ過を含む工程に使用してもよい。いくつかの実施形態においては、デンプン加水分解物を含む水溶液はビール製造のためのマッシュであり、他の実施形態においては、デンプン加水分解物を含む水溶液は食品組成物である。

あるいは、本発明の酵素組成物は、フルーツジュース、ワイン、穀物加工、燃料アルコール、第１世代又は第２世代のバイオ燃料（例えば、バイオエタノール等）、及び飲用アルコールの製造に使用してもよい。

いくつかの実施形態において、第１世代又は第２世代のバイオ燃料（例えば、バイオエタノール等）は、サトウキビ、ジャガイモ、トウモロコシ、小麦ソルガム等の農業による供給原料から、又はトウモロコシ茎葉、スイッチグラス若しくは他の植物材料等のセルロース系原料から製造される。いずれの場合も、発酵性糖は、原料から抽出し、微生物によってアルコールへ発酵させる。アルコールは蒸留し、輸送燃料として使用してもよい。本発明の酵素組成物は、このバイオ燃料の製造において使用してもよい。原料からの多糖類の抽出を増強するために、多糖類の発酵性糖への分解を促進するために、及び／又は、固形分からの液体の分離、流量特性、ポンプ能力等の加工パラメータを高めるために、酵素複合体を添加してもよい。

本発明の工程は、任意のグリスト（粉砕したモルト）の糖化に適用してもよい。本発明によれば、粉砕穀物は、任意の植物および植物の一部（塊茎、根、茎、葉、及び種子を含む）に由来する任意のデンプン及び／又は糖含有植物原料を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、グリストは、大麦、小麦、ライ麦、オート麦、トウモロコシ、米、ミロ、キビ、及びソルガム由来の穀物等の穀物を含む。好ましくは、ウォルトのグリストの、少なくとも１０％、又は、より好ましくは少なくとも１５％、更により好ましくは少なくとも２５％、又は、最も好ましくは少なくとも３５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は１００％（ｗ／ｗ）が、穀物に由来する。

いくつかの実施形態において、グリストは、大麦麦芽等のモルトにした穀物を含む。好ましくは、ウォルトのグリストの、少なくとも１０％、又は、より好ましくは少なくとも１５％、更により好ましくは少なくとも２５％、又は、最も好ましくは少なくとも３５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は１００％（ｗ／ｗ）が、モルトにした穀物に由来する。

用語「マッシュ」は、水性のデンプンスラリー（例えば、破砕した大麦麦芽、破砕した大麦、及び／又は他の付加原料、又はこれらの組み合わせを含む）で、水と混合されており、後に、ウォルトとスペントグレイン（モルト粕）に分離されるものと理解される。

用語「マッシュの分離」は、ロイターリング（ロイター式ろ過）又はマッシュろ過等によって、スペントグレイン（モルト粕）からウォルトを分離することと理解される。

用語「ビールろ過」は、精密ろ過又は膜処理等によって、ビール中にまだ存在している酵母細胞及び他の濁り生成物質を除去する分離工程と理解される。

本発明の酵素調製物（例えば、本発明により調製される食品成分の形態における酵素調製物）は、使用、及び／又は適用方法、及び／又は投与方法に応じて、溶液の形態であっても固体の形態であってもよい。固体形態は、乾燥酵素粉末としての形態、又は粒状酵素としての形態とすることができる。

一つの側面において、本発明は、本発明の酵素または酵素組成物、酵素キャリア、並びに、必要に応じて、安定剤及び／又は防腐剤を含む酵素組成物調製物を提供する。

本発明の更なる側面において、酵素キャリアは、グリセロール又は水からなる群から選択される。

更なる側面において、本発明の調製物は、安定剤を含む。一つの側面において、安定剤は、無機塩、ポリオール、糖、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一つの側面において、安定剤は塩化カリウム等の無機塩である。別の側面において、ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール、又はソルビトールである。更に別の側面において、糖は、小分子炭水化物、特に、グルコース、フルクトース、及びサッカロース等のいくつかの甘味性の糖のいずれかである。

更なる側面において、本発明の調製物は防腐剤を含む。一つの側面において、防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンゾエート、ソルベート、若しくは他の食品認可された防腐剤、又はこれらの混合物である。

本発明の特定の実施形態
いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す本発明の酵素は、必要に応じて任意の１種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、醸造に使用した場合に粘度を顕著に低下させ、マッシュ及びビールの分離の改善を促す。

醸造に使用するための望ましいキシラナーゼ特性は、以下の点のうちの１つ以上を含んでもよい：
ａ）酵素基質特異性
ＷＥ−ＡＸ／ＷＵ−ＡＸ比は粘度に影響を与える。いくつかの実施形態において、この比は、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満である。
ｂ）酵素基質選択性
酵素による切断が枝分かれ部位にどれくらい近いかで、その機能性に影響を与えると考えられる。
ｃ）酵素の熱安定性
糖化中に連続して起こるＡＸの可溶化−熱安定性が重要な性質。従って、いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素は、６５〜７８℃の温度範囲内で熱安定性である。
ｄ）酵素の至適ｐＨ。従って、いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す本発明の酵素は、ｐＨ５．４〜５．６の範囲の至適ｐＨを有する。
ｅ）酵素阻害（例えば、キシラナーゼの既知の重要な因子）。

醸造に使用した場合の前記の粘度の顕著な低下は、同一の条件及び量で使用した既知の酵素又は既知の酵素活性の組み合わせを有する対照（Ｕｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍａｘ等）と比較したときの、醸造使用時の粘度の低下として測定してもよい。

いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、醸造に使用した場合にマッシュ及びビールの分離を改善する。

いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、異臭形成（アラビノキシランの分解に関連する異臭形成等）の可能性を低くする。

いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、ろ床崩壊（ロイターリングの場合等）の危険性を低下させる。

いくつかの実施形態において、本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素は、必要に応じて任意の１種以上の本発明のβ-グルカナーゼと組み合わせられ、異臭形成を低減し、及び／又は異臭の可能性を低減する。

本発明の一つの側面は、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素に関し、本酵素は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む。

別の側面は、エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素に関し、本酵素は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素は、不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質への活性に対する可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）への活性の比率が、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満である。

いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、４０〜７０℃の範囲、例えば４５〜６５℃の範囲、例えば５０〜６５℃の範囲、例えば５５〜６５℃の範囲の至適温度を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する、又はその任意の機能性断片である。

いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、アミノ酸総数が、３５０未満、例えば３４０未満、例えば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、例えば３００未満のアミノ酸、例えば２００〜３５０の範囲、例えば２２０〜３４５の範囲のアミノ酸である。

いくつかの実施形態において、本発明の前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である。

いくつかの実施形態において、本発明の前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である。

いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、配列番号1〜25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む。

いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、配列番号1〜25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片からなる。

本発明の更に重要な側面は、本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のβ-グルカナーゼと組み合わせて含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、この１種以上のβ-グルカナーゼは本発明のβ-グルカナーゼである。

本発明の更に重要な側面は、本発明のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物である。いくつかの実施形態において、この１種以上のキシラナーゼは本発明のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素である。いくつかの実施形態において、この１種以上のキシラナーゼは、配列番号17及び／又は配列番号18の酵素である。いくつかの実施形態において、この１種以上のキシラナーゼは、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び／又は配列番号25の酵素、又はその任意の機能性断片である。

いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素とエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素との組み合わせは、次の表の通りである。

いくつかの実施形態において、エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素とエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素との組み合わせは、次の表の通りである。

エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素である第１の酵素の上記の組み合わせのいずれか１つは、エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素のいずれか１つと組み合わせてもよいと理解されるべきであり、この場合の２つの酵素間の比率は、１：１０、２：１０、３：１０、４：１０、５：１０、６：１０、７：１０、８：１０、９：１０、１０：１０、１０：９、１０：８、１０：７、１０：６、１０：５、１０：４、１０：３、１０：２、又は１０：１、例えば１：１０〜１０：１、例えば２：１０〜１０：２、例えば３：１０〜１０：３、例えば４：１０〜１０：４、例えば５：１０〜１０：５、例えば６：１０〜１０：６、例えば７：１０〜１０：７、例えば８：１０〜１０：８、又は例えば９：１０〜１０：９の範囲内である。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも２種の酵素の組み合わせを含む。ここで、前記２種の酵素は、次の配列からなるリストから選択されるそれぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２種の酵素、又はその任意の機能性断片である。
配列番号1及び配列番号7、配列番号2及び配列番号7、配列番号3及び配列番号7、配列番号4及び配列番号7、配列番号5及び配列番号7、配列番号6及び配列番号7、配列番号17及び配列番号7、配列番号18及び配列番号7、配列番号19及び配列番号7、配列番号20及び配列番号7、配列番号21及び配列番号7、配列番号22及び配列番号7、配列番号23及び配列番号7、配列番号24及び配列番号7、配列番号25及び配列番号7、配列番号1及び配列番号8、配列番号2及び配列番号8、配列番号3及び配列番号8、配列番号4及び配列番号8、配列番号5及び配列番号8、配列番号6及び配列番号8、配列番号17及び配列番号8、配列番号18及び配列番号8、配列番号19及び配列番号8、配列番号20及び配列番号8、配列番号21及び配列番号8、配列番号22及び配列番号8、配列番号23及び配列番号8、配列番号24及び配列番号8、配列番号25及び配列番号8、配列番号1及び配列番号9、配列番号2及び配列番号9、配列番号3及び配列番号9、配列番号4及び配列番号9、配列番号5及び配列番号9、配列番号6及び配列番号9、配列番号17及び配列番号9、配列番号18及び配列番号9、配列番号19及び配列番号9、配列番号20及び配列番号9、配列番号21及び配列番号9、配列番号22及び配列番号9、配列番号23及び配列番号9、配列番号24及び配列番号9、配列番号25及び配列番号9、配列番号1及び配列番号10、配列番号2及び配列番号10、配列番号3及び配列番号10、配列番号4及び配列番号10、配列番号5及び配列番号10、配列番号6及び配列番号10、配列番号17及び配列番号10、配列番号18及び配列番号10、配列番号19及び配列番号10、配列番号20及び配列番号10、配列番号21及び配列番号10、配列番号22及び配列番号10、配列番号23及び配列番号10、配列番号24及び配列番号10、配列番号25及び配列番号10、配列番号1及び配列番号11、配列番号2及び配列番号11、配列番号3及び配列番号11、配列番号4及び配列番号11、配列番号5及び配列番号11、配列番号6及び配列番号11、配列番号17及び配列番号11、配列番号18及び配列番号11、配列番号19及び配列番号11、配列番号20及び配列番号11、配列番号21及び配列番号11、配列番号22及び配列番号11、配列番号23及び配列番号11、配列番号24及び配列番号11、配列番号25及び配列番号11、配列番号1及び配列番号12、配列番号2及び配列番号12、配列番号3及び配列番号12、配列番号4及び配列番号12、配列番号5及び配列番号12、配列番号6及び配列番号12、配列番号17及び配列番号12、配列番号18及び配列番号12、配列番号19及び配列番号12、配列番号20及び配列番号12、配列番号21及び配列番号12、配列番号22及び配列番号12、配列番号23及び配列番号12、配列番号24及び配列番号12、配列番号25及び配列番号12、配列番号1及び配列番号13、配列番号2及び配列番号13、配列番号3及び配列番号13、配列番号4及び配列番号13、配列番号5及び配列番号13、配列番号6及び配列番号13、配列番号17及び配列番号13、配列番号18及び配列番号13、配列番号19及び配列番号13、配列番号20及び配列番号13、配列番号21及び配列番号13、配列番号22及び配列番号13、配列番号23及び配列番号13、配列番号24及び配列番号13、配列番号25及び配列番号13、配列番号1及び配列番号14、配列番号2及び配列番号14、配列番号3及び配列番号14、配列番号4及び配列番号14、配列番号5及び配列番号14、配列番号6及び配列番号14、配列番号17及び配列番号14、配列番号18及び配列番号14、配列番号19及び配列番号14、配列番号20及び配列番号14、配列番号21及び配列番号14、配列番号22及び配列番号14、配列番号23及び配列番号14、配列番号24及び配列番号14、配列番号25及び配列番号14、配列番号1及び配列番号15、配列番号2及び配列番号15、配列番号3及び配列番号15、配列番号4及び配列番号15、配列番号5及び配列番号15、配列番号6及び配列番号15、配列番号17及び配列番号15、配列番号18及び配列番号15、配列番号19及び配列番号15、配列番号20及び配列番号15、配列番号21及び配列番号15、配列番号22及び配列番号15、配列番号23及び配列番号15、配列番号24及び配列番号15、配列番号25及び配列番号15、配列番号1及び配列番号16、配列番号2及び配列番号16、配列番号3及び配列番号16、配列番号4及び配列番号16、配列番号5及び配列番号16、配列番号6及び配列番号16、配列番号17及び配列番号16、配列番号18及び配列番号16、配列番号19及び配列番号16、配列番号20及び配列番号16、配列番号21及び配列番号16、配列番号22及び配列番号16、配列番号23及び配列番号16、配列番号24及び配列番号16、並びに、配列番号25及び配列番号16

いくつかの実施形態において、エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性及びエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性は、少なくとも２種の異なる酵素、例えば２つの異なる種（species）からの少なくとも２種の異なる酵素に由来する。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物を醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増加する総圧力（合計圧力）は、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例えば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満の値に軽減（減少）する。

いくつかの実施形態において、醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増加する総圧力（合計圧力）は、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３又は９５％軽減（減少）する。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物を醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定するウォルトのろ過性は、酵素を含まない対照に対して、１．５倍を超えて、例えば１．６倍を超えて、例えば１．７倍を超えて、例えば１．８倍を超えて、例えば１．９倍を超えて、例えば２．０倍を超えて、例えば２．１倍を超えて、例えば２．２倍を超えて、例えば２．３倍を超えて、例えば２．４倍を超えて、例えば２．５倍を超えて、増加する。

いくつかの実施形態において、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定するウォルトのろ過性は、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００％増加する。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、任意の１種以上の更なる酵素を含む。いくつかの実施形態において、１種以上の更なる酵素は、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.136、又はEC 3.2.1.156に分類されるキシラナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド-1,5-α-L-アラビナナーゼ、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ、β-キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン1,4-β-グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ及びα-N-アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される。

本明細書に記載した配列によって同定され、本発明に従って単独で、又は他の酵素若しくは化合物と組み合わせて使用する配列及び酵素は、シグナルペプチドを有していても有していなくてもよい。

アッセイ
ＤＮＳ セルラーゼ活性法（ＤＮＳ ＣＭＣ法）
系統名：1,4-(1,3;1,4)-β-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ
ＩＵＢ番号：EC 3.2.1.4

原理
セルラーゼのアッセイは、β-1,4-グルカンであるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の1,4-β-D-グルコシド結合の酵素的なエンド加水分解に基づく。反応生成物（β-1,4グルカンオリゴサッカリド）は、3,5-ジニトロサリチル酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基の増加を比色測定によって、測定した。酵素活性は、グルコース当量としての還元性基の濃度と５４０ｎｍでの吸光度との関係から計算した。

アッセイはｐＨ５．０で実施したが、酵素の更に別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ値でアッセイを実施することができる。

単位の定義
セルラーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（又は指定されたｐＨ）及び５０℃）下で、１分間に１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。

材料
カルボキシメチルセルロース。供給業者：Megazyme Ltd. 製品番号：CM-Cellulose 4M
D-グルコース‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10117 M.W.: 180.16
無水酢酸ナトリウム‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10236 M.W.: 82.03
酢酸（氷酢酸）‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10001 M.W.: 60.05
3,5-ジニトロサリチル酸GPR（3,5-ジニトロ-2-ヒドロキシ安息香酸）。 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：28235
水酸化ナトリウムペレット‘AnalaR'。 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10252 M.W.: 40.00
(+)-酒石酸カリウムナトリウム‘AnalaR'。 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10219 M.W.: 282.22
1.5 %(w/v溶液)カルボキシメチルセルロース(CMC)溶液(0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0中)（基質溶液）。
3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)溶液。 32g/Lの水酸化ナトリウムペレット及び600 g/Lの(+)-酒石酸カリウムナトリウムを含む緩衝液中に20g/LのDNS
グルコース標準溶液(0.50 mg/ml)

手順
酵素組成物をサンプル中に希釈した。また、0、0.125、0.25、0.375、及び0.5 mg/mlのグルコース濃度を用いて、図２に示すグルコース標準曲線を作成した。

0.25 mlの酵素溶液を50℃で1.75 mlの基質溶液（1.5% w/v）と混合した。10分後にDNS溶液を添加することにより反応を停止させた。この後、95℃で5分間加熱した。

異なるサンプルの540 nm (OD_540nm)の光学濃度を測定した。

計算
酵素活性は、図２に示した標準曲線から決定する。

活性は次のように計算する：

式中：
T = ΔOD_540nm TEST
= OD_540nm TEST - OD_540nm BLANK
m = 標準曲線の勾配（約1.0）
c = 標準曲線のy軸切片（常にマイナスであり、約-0.02)
180.16 ≡ グルコースの分子量
10³ ≡ μmolへ変換する
A ≡ アッセイ体積（ml）
V ≡ 酵素体積（ml）
t ≡ アッセイ時間（分）
D = 実際の酵素希釈係数（例えば、1.000gを1リットルに希釈する場合はD = 1000）

ラミナリナーゼ（ＤＮＳ ラミナリン法）
原理
ラミナリナーゼによって触媒される反応は、1,3-β-D-グルカンの1,3-グルコシド結合のエンド加水分解に関する。基質には、ラミナリン、パラミロン及びパキマンが含まれる。反応生成物（β-1,3-グルカンオリゴサッカリド）は、3,5-ジニトロサリチル酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基の増加を比色測定によって、測定する。酵素活性は、グルコース当量としての還元性基の濃度と５４０ｎｍでの吸光度との関係から計算する。

アッセイはｐＨ５．０及び５０℃で実施したが、酵素の更に別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ及び温度の値で実施することができる。

単位の定義
ラミナリナーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ５．０及び５０℃（又は指定された通り））下で、１分間に１μｍｏｌのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。

材料
セルラーゼ活性アッセイに関する上記の材料を参照

ラミナリン（ラミナリア・ディギタータ（Laminaria digitata）由来）。供給業者：Sigma-Aldrich Co. Ltd. 製品番号：L 9634
1.00 %(w/v溶液)ラミナリン溶液（基質溶液 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.0)

1.75 mlのラミナリン溶液を、50℃で10分間、0.25 mlの希釈酵素溶液と混合する。そして、2 mlのDNS溶液を添加することにより反応を停止する。

0、0.125、0.25、0.5、及び0.75 mg/mlのグルコース溶液を用いて、標準曲線を作成した。

光学濃度は、540 nm (OD_540nm)で測定した。

計算
活性は次のように計算する：

式中：
T = ΔOD_540nm TEST
= OD_540nm TEST - OD_540nm BLANK
m = 標準曲線の勾配（約1.0）
c = 標準曲線のy軸切片（常にマイナスであり、約-0.03)
180.16 ≡ グルコースの分子量
10³ ≡ μmolへ変換する
A ≡ アッセイ体積（ml）
V ≡ 酵素体積（ml）
t ≡ アッセイ時間（分）
D = 酵素希釈係数（例えば、1gを1リットルに希釈する場合はD = 1000）

アラビナーゼ アッセイ
原理
アラビナーゼ活性のアッセイは、3,5-ジニトロサリチル酸試薬を用いて、結果として生じる還元性基の増加を比色測定により測定することに基づく。酵素活性は、アラビノース当量としての還元性基の濃度と５４０ｎｍでの吸光度との関係から計算した。

アッセイはｐＨ３．５で実施したが、酵素の更に別の特性及び仕様について、これと異なるｐＨ値でアッセイを実施することができる。

単位の定義
アラビナーゼ（アラビナナーゼ（エンド-1,5-α-L-アラビナナーゼ））活性の１単位は、アッセイの条件（ｐＨ３．５（又は指定されたｐＨ）及び５０℃）下で、１分間に１μｍｏｌのアラビノース当量を生じる酵素の量として定義される。

材料
Megazymeサトウダイコンアラビナン
アラビノースSigma A3131 M.W.: 150.1
無水酢酸ナトリウム‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10236 M.W.: 82.03
酢酸（氷酢酸）‘AnalaR'。供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10001 M.W.: 60.05
3,5-ジニトロサリチル酸GPR（3,5-ジニトロ-2-ヒドロキシ安息香酸）。 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：28235
水酸化ナトリウムペレット‘AnalaR'。 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10252 M.W.: 40.00
(+)-酒石酸カリウムナトリウム‘AnalaR'。 供給業者：Merck Ltd (BDH). 製品番号：10219 M.W.: 282.22
1.5 %(w/v溶液)アラビナン溶液(0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH3.5中)（基質溶液）。
3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)溶液。 32g/Lの水酸化ナトリウムペレット及び600 g/Lの(+)-酒石酸カリウムナトリウムを含む緩衝液中に20g/LのDNS
アラビナーゼ標準溶液(0.50 mg/ml)

手順
酵素組成物をサンプル中に希釈した。また、0、0.125、0.25、0.375、及び0.5 mg/mlのアラビナーゼ濃度を用いて、グルコース標準曲線を作成した。

0.25 mlの酵素溶液を50℃で1.75 mlの基質溶液（1.5% w/v）と混合した。10分後にDNS溶液を添加することにより反応を停止させた。この後、95℃で5分間加熱した。

異なるサンプルの540 nm (OD_540nm)の光学濃度を測定した。

計算
酵素活性は、標準曲線から決定する。

活性は次のように計算する：

式中：
T = ΔOD_540nm TEST
= OD_540nm TEST - OD_540nm BLANK
m = 標準曲線の勾配（約1.0）
c = 標準曲線のy軸切片（常にマイナスであり、約-0.02)
150.13 ≡ アラビナーゼの分子量
10³ ≡ μmolへ変換する
A ≡ アッセイ体積（ml）
V ≡ 酵素体積（ml）
t ≡ アッセイ時間（分）
D = 実際の酵素希釈係数（例えば、1.000gを1リットルに希釈する場合はD = 1000）

アラビノフラノシダーゼ アッセイ
α-N-アラビノフラノシダーゼによって触媒される反応は、α-L-アラビノシドの非還元性α-L-アラビノフラノシド残基における末端結合の加水分解に関する。この酵素は、α-L-アラビノフラノシド、(1,3)-結合及び／又は(1,5)-結合を含むα-L-アラビナン、アラビノキシラン、並びにアラビノガラクタンに作用する。

α-N-アラビノフラノシダーゼのアッセイは、p-ニトロフェニルα-L-アラビノフラノシドの酵素的加水分解に基づく。このアッセイは、連続モニタリング法ではなく、２点法である。酵素活性の計算は、インキュベーション期間の最初と最後に実施する測定に基づく。反応生成物（p-ニトロフェノール）は、ｐＨ調製後、比色測定によって測定する。酵素活性は、p-ニトロフェノールの濃度と４００ｎｍでの吸光度との関係から計算する。

希釈酵素溶液の調製：
全ての酵素溶液は、粉末または液体の酵素調製物から、ガラス器具による蒸留水を用いて調製する。アッセイ希釈誤差は、小さい体積又は重量を大きく希釈する工程を避けることによって、最小限にする。酵素希釈を行う場合、液体サンプルであっても最初の酵素サンプルの重量を測定すればより正確である。この場合、液体サンプルの場合には２０℃でその液体の比重を測定することが必要である。

アッセイは、連続モニタリング法ではなく、２点法であるので、異なる酵素系及び条件の場合でもインキュベーション期間内の直線性を保証することが重要である。基質濃度、ｐＨ、温度、及びアッセイ時間が標準アッセイ条件の下では、アッセイは、ΔOD_540nm TEST (T) = 0.20〜1.50の範囲内で直線的であることが証明されている。しかし、好ましくは、ΔOD_540nm TEST (T) = 0.400〜0.800の限定した範囲内でアッセイを実施する。

手順
各酵素サンプルアッセイは、３つの分析（２重試験（ＴＥＳＴ）の分析及びブランク（ＢＬＡＮＫ）の分析）を含む。ここに記載する手順は、単一の酵素サンプルの分析である。

0.25 mlの希釈酵素溶液を50℃でこの溶液に添加した。10分後に4 mlの0.4Mグリシン溶液、pH 10.8（停止試薬）を添加することにより反応を停止させた。

吸光度は、水のブランクに対して、25℃、400 nmで測定した。
・測定したTESTの２重試験に対して、OD_400nm TESTを決定した。
・OD_400nm BLANKを決定した。

計算

式中：
T = OD400nm TEST - OD400nm BLANK
18300 = p-ニトロフェノールのモル吸光係数（1 cm経路長）
V = 7.25 （試験における全液体体積（ml））
t = 10（分）
1 u = 1 μmol.min-1
E = 0.25（希釈酵素サンプルの体積（ml））
D =酵素希釈係数（例えば、1 mlを1リットルに希釈する場合はD = 1000）

セロビオヒドロラーゼ アッセイ
原理
セロビオヒドロラーゼによって触媒される反応は、セルロース及びセロテトラオースの1,4-β-D-グルコシド結合の加水分解に関し、鎖の非還元末端からセロビオースを放出する。

セロビオヒドロラーゼのアッセイは、p-ニトロフェニルβ-D-セロビオピラノシドの酵素的加水分解に基づく。反応生成物（p-ニトロフェノール）は、ｐＨ調製後、比色測定によって測定する。酵素活性は、p-ニトロフェノールの濃度と４００ｎｍでの吸光度との関係から計算する。

アッセイは、ΔOD_540nm TEST (T) = 0.400〜0.800の直線的な限定した範囲内で実施する。

手順
各酵素サンプルアッセイは、３つの分析（２重試験（ＴＥＳＴ）の分析及びブランク（ＢＬＡＮＫ）の分析）を含む。ここに記載する手順は、単一の酵素サンプルの分析である。

0.25 mlの希釈酵素溶液を50℃でこの試験溶液に添加した。30分後に4 mlの0.4Mグリシン溶液、pH 10.8（停止試薬）をそれぞれの試験管に添加した。

吸光度は、1cmのガラスキュベット中で、水のブランクに対して、25℃、400 nmで測定した。
・測定したTESTの２重試験に対して、OD_400nm TESTを決定した。
・OD_400nm BLANKを決定した。

計算

式中：
T = OD_400nm TEST - OD_400nm BLANK
18300 = p-ニトロフェノールのモル吸光係数（1 cm経路長）
V = 7.25 （試験における全液体体積（ml））
1000 = リットルへ変換する
10⁶ = μmolesへ変換する
t = 30（分）
1 u = 1 μmol.min^-1
E = 0.25（希釈酵素サンプルの体積（ml））
D =酵素希釈係数（例えば、1 mlを1リットルに希釈する場合はD = 1000）

番号付けした本発明の実施形態：
１． エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む酵素。

２． 不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質への活性に対する可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）への活性の比率が、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満である、実施形態１に記載の酵素。

３． エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む酵素。

４． ４０〜７０℃の範囲、例えば４５〜６５℃の範囲、例えば５０〜６５℃の範囲、例えば５５〜６５℃の範囲の至適温度を有する、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の酵素。

５． 配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する、又はその任意の機能性断片である、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の酵素。

６． アミノ酸総数が、３５０未満、例えば３４０未満、例えば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、例えば３００未満のアミノ酸、例えば２００〜３５０の範囲、例えば２２０〜３４５の範囲のアミノ酸である、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の酵素。

７． 前記酵素のアミノ酸配列が、配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である、実施形態１〜６のいずれか一つに記載の酵素。

８． 前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である、実施形態１〜７のいずれか一つに記載の酵素。

９． 配列番号1〜25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む、実施形態１〜８のいずれか一つに記載の酵素。

１０． 配列番号1〜25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片からなる、実施形態１又は３のいずれか一つに記載の酵素。

１１． 実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。

１２． 実施形態１１に記載のＤＮＡ構築物を含む組み換え発現ベクター。

１３． 実施形態１１に記載のＤＮＡ構築物又は実施形態１２に記載のベクターで形質転換された細胞。

１４． 実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１１に記載のＤＮＡ構築物、実施形態１２に記載のベクター、又は実施形態１３に記載の細胞を含む調製物。

１５． 実施形態１、２、及び４〜１０のいずれか一つに記載のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のβ-グルカナーゼと組み合わせて含む組成物。

１６． 前記１種以上のβ-グルカナーゼが実施形態３〜１０のいずれか一つに記載のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素である、実施形態１５に記載の組成物。

１７． 実施形態３〜１０のいずれか一つに記載のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物。

１８． 前記１種以上のキシラナーゼが実施形態１、２、及び４〜１０のいずれか一つに記載のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素である、実施形態１７に記載の組成物。

１９． 前記エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性及び前記エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性が、少なくとも２種の異なる酵素、例えば２つの異なる種（species）からの少なくとも２種の異なる酵素に由来する、実施形態１５〜１８のいずれか一つに記載の組成物。

２０． 少なくとも２種の酵素の組み合わせを含む実施形態１５〜１９のいずれか一つに記載の組成物であって、前記２種の酵素が、次の配列からなるリストから選択されるそれぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２種の酵素、又はその任意の機能性断片である、組成物。
配列番号1及び配列番号7、
配列番号2及び配列番号7、
配列番号3及び配列番号7、
配列番号4及び配列番号7、
配列番号5及び配列番号7、
配列番号6及び配列番号7、
配列番号17及び配列番号7、
配列番号18及び配列番号7、
配列番号19及び配列番号7、
配列番号20及び配列番号7、
配列番号21及び配列番号7、
配列番号22及び配列番号7、
配列番号23及び配列番号7、
配列番号24及び配列番号7、
配列番号25及び配列番号7、
配列番号1及び配列番号8、
配列番号2及び配列番号8、
配列番号3及び配列番号8、
配列番号4及び配列番号8、
配列番号5及び配列番号8、
配列番号6及び配列番号8、
配列番号17及び配列番号8、
配列番号18及び配列番号8、
配列番号19及び配列番号8、
配列番号20及び配列番号8、
配列番号21及び配列番号8、
配列番号22及び配列番号8、
配列番号23及び配列番号8、
配列番号24及び配列番号8、
配列番号25及び配列番号8、
配列番号1及び配列番号9、
配列番号2及び配列番号9、
配列番号3及び配列番号9、
配列番号4及び配列番号9、
配列番号5及び配列番号9、
配列番号6及び配列番号9、
配列番号17及び配列番号9、
配列番号18及び配列番号9、
配列番号19及び配列番号9、
配列番号20及び配列番号9、
配列番号21及び配列番号9、
配列番号22及び配列番号9、
配列番号23及び配列番号9、
配列番号24及び配列番号9、
配列番号25及び配列番号9、
配列番号1及び配列番号10、
配列番号2及び配列番号10、
配列番号3及び配列番号10、
配列番号4及び配列番号10、
配列番号5及び配列番号10、
配列番号6及び配列番号10、
配列番号17及び配列番号10、
配列番号18及び配列番号10、
配列番号19及び配列番号10、
配列番号20及び配列番号10、
配列番号21及び配列番号10、
配列番号22及び配列番号10、
配列番号23及び配列番号10、
配列番号24及び配列番号10、
配列番号25及び配列番号10、
配列番号1及び配列番号11、
配列番号2及び配列番号11、
配列番号3及び配列番号11、
配列番号4及び配列番号11、
配列番号5及び配列番号11、
配列番号6及び配列番号11、
配列番号17及び配列番号11、
配列番号18及び配列番号11、
配列番号19及び配列番号11、
配列番号20及び配列番号11、
配列番号21及び配列番号11、
配列番号22及び配列番号11、
配列番号23及び配列番号11、
配列番号24及び配列番号11、
配列番号25及び配列番号11、
配列番号1及び配列番号12、
配列番号2及び配列番号12、
配列番号3及び配列番号12、
配列番号4及び配列番号12、
配列番号5及び配列番号12、
配列番号6及び配列番号12、
配列番号17及び配列番号12、
配列番号18及び配列番号12、
配列番号19及び配列番号12、
配列番号20及び配列番号12、
配列番号21及び配列番号12、
配列番号22及び配列番号12、
配列番号23及び配列番号12、
配列番号24及び配列番号12、
配列番号25及び配列番号12、
配列番号1及び配列番号13、
配列番号2及び配列番号13、
配列番号3及び配列番号13、
配列番号4及び配列番号13、
配列番号5及び配列番号13、
配列番号6及び配列番号13、
配列番号17及び配列番号13、
配列番号18及び配列番号13、
配列番号19及び配列番号13、
配列番号20及び配列番号13、
配列番号21及び配列番号13、
配列番号22及び配列番号13、
配列番号23及び配列番号13、
配列番号24及び配列番号13、
配列番号25及び配列番号13、
配列番号1及び配列番号14、
配列番号2及び配列番号14、
配列番号3及び配列番号14、
配列番号4及び配列番号14、
配列番号5及び配列番号14、
配列番号6及び配列番号14、
配列番号17及び配列番号14、
配列番号18及び配列番号14、
配列番号19及び配列番号14、
配列番号20及び配列番号14、
配列番号21及び配列番号14、
配列番号22及び配列番号14、
配列番号23及び配列番号14、
配列番号24及び配列番号14、
配列番号25及び配列番号14、
配列番号1及び配列番号15、
配列番号2及び配列番号15、
配列番号3及び配列番号15、
配列番号4及び配列番号15、
配列番号5及び配列番号15、
配列番号6及び配列番号15、
配列番号17及び配列番号15、
配列番号18及び配列番号15、
配列番号19及び配列番号15、
配列番号20及び配列番号15、
配列番号21及び配列番号15、
配列番号22及び配列番号15、
配列番号23及び配列番号15、
配列番号24及び配列番号15、
配列番号25及び配列番号15、
配列番号1及び配列番号16、
配列番号2及び配列番号16、
配列番号3及び配列番号16、
配列番号4及び配列番号16、
配列番号5及び配列番号16、
配列番号6及び配列番号16、
配列番号17及び配列番号16、
配列番号18及び配列番号16、
配列番号19及び配列番号16、
配列番号20及び配列番号16、
配列番号21及び配列番号16、
配列番号22及び配列番号16、
配列番号23及び配列番号16、
配列番号24及び配列番号16、並びに
配列番号25及び配列番号16

２１． 醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増加する総圧力が、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例えば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満の値に軽減する、実施形態１５〜２０のいずれか一つに記載の組成物。

２２． 醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増加する総圧力が、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３又は９５％軽減する、実施形態１５〜２１のいずれか一つに記載の組成物。

２３． 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定するウォルトのろ過性は、酵素を含まない対照に対して、１．５倍を超えて、例えば１．６倍を超えて、例えば１．７倍を超えて、例えば１．８倍を超えて、例えば１．９倍を超えて、例えば２．０倍を超えて、例えば２．１倍を超えて、例えば２．２倍を超えて、例えば２．３倍を超えて、例えば２．４倍を超えて、例えば２．５倍を超えて増加する、実施形態１５〜２２のいずれか一つに記載の組成物。

２４． 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定するウォルトのろ過性は、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００％増加する、実施形態１５〜２３のいずれか一つに記載の組成物。

２５． 任意の１種以上の更なる酵素を含む、実施形態１５〜２４のいずれか一つに記載の組成物。

２６． 前記１種以上の更なる酵素が、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.136、又はEC 3.2.1.156に分類されるキシラナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド-1,5-α-L-アラビナナーゼ、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ、β-キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン1,4-β-グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ及びα-N-アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される、実施形態２５に記載の組成物。

２７． 食品製品、飼料製品、又はモルト飲料製品の製造における、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。

２８． ドウ製品又はベークド製品の製造における、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。

２９． パルプ又は紙の調製における、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。

３０． 穀物成分の調製のための、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。

３１． 前記穀物がライ麦、小麦、又は大麦である、実施形態２９に記載の使用。

３２． ビールの製造又は醸造工程からの副産物の改変における、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。

３３． ワイン又はジュースの製造における、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。

３４． バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃料の製造における、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物の使用。

３５． デンプン含有原料のろ過性を変更する方法であって、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物で前記デンプン含有原料を処理する工程を含む方法。

３６． 醸造工程においてロイターリング中に増加する圧力を軽減する方法であって、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物で醸造用マッシュを処理する工程を含む方法。

３７． 食品製品、飼料製品、又は、アルコール飲料若しくはノンアルコール飲料や、ビール若しくはウイスキーのような穀物使用飲料若しくはモルト使用飲料等の飲料製品を製造する方法であって、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。

３８． 醸造用マッシュを製造する方法であって、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。

３９． バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃料を製造する方法であって、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の酵素、実施形態１４に記載の調製物、又は実施形態１５〜２６のいずれか一つに記載の組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。

４０． 実施形態３８又は３９に記載の方法によって得られた製品。

４１． 実施形態４０に記載の製品を含む組成物であって、前記製品が０．１％〜９９．９％の範囲で含まれるような組成物。

実施例１
醸造用途のためのキシラナーゼ／グルカナーゼに関する方法及び結果

以下の方法は、醸造において使用するキシラナーゼ及びグルカナーゼをスクリーニングするために使用されている。

方法：
水抽出可能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ法：
サンプル（このアッセイにおいておよそOD540 = 0.25〜0.30が得られるもの）、及びキシロース標準液（0、0.125、0.250、0.375、及び0.500 mg/ml蒸留水）を蒸留水中で調製する。t=0分の時点で、1.75 mlの可溶性小麦アラビノキシラン（0.5%小麦アラビノキシラン（PWAXYH, Megazyme, Bray, Ireland）、0.1M酢酸ナトリウム/酢酸、pH 5中）を50℃で試験管に入れる。t=5分の時点で、250μlの酵素溶液を50℃で基質に添加し、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。t=15分の時点で、2mlのDNS溶液（1%の3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）、1.6%の水酸化ナトリウム、30%の酒石酸カリウムナトリウム、蒸留水中）を酵素−基質溶液及び2.0 mlの標準溶液に添加する。サンプル、ブランク、及び、標準液を添加したDNSを、沸騰した水浴（95℃）に5分間入れる。その後、サンプル、ブランク及び標準液を、25℃の水浴に20分間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全てのサンプルの光学濃度をOD540で読み取る。サンプルの希釈、試験に使ったサンプルの量、及び標準液に基づいて、サンプルのキシラナーゼ活性を計算することができる。

エンド-1,4-β-キシラナーゼWE-AX活性の１単位は、上記の条件（水抽出可能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ法）の下で、1分間に1 μmolのキシロース当量を生じる酵素の量として定義される。

水抽出不能アラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）キシラナーゼ法：
サンプルを蒸留水中で調製する。t=0分の時点で、1.75 mlの不溶性小麦（0.5%小麦アラビノキシラン（PWAXYI, Megazyme, Bray, Ireland）、0.1M酢酸ナトリウム/酢酸、pH 5中）を50℃で試験管に入れる。t=5分の時点で、250μlの酵素溶液を50℃で基質に添加し、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。t=15分の時点で、サンプル及びブランクを、沸騰した水浴（95℃）に5分間入れる。その後、サンプル及びブランクを遠心分離し、残存する不溶性基質を沈殿させる。溶液に取り込まれたアラビノキシランの量は、「Rouau, X. 及び Surget, A. (1994), Carbohydrate Polymers, 24, 123-132」に記載された方法を用いて決定する。

WU-AXエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性は、１単位（μgペントース/キシラナーゼサンプルg）の定義に当たる、上記の条件の下で可溶化したペントースの量（μgペントース）として定義される。

キシラナーゼ活性アッセイ
サンプル（このアッセイにおいておよそOD540 = 0.25〜0.30が得られるもの）、及びキシロース標準液（0、0.125、0.250、0.375、及び0.500 mg/ml蒸留水）を蒸留水中で調製する。t=0分の時点で、1.75 mlの可溶性小麦アラビノキシラン（0.5%小麦アラビノキシラン（PWAXYH, Megazyme, Bray, Ireland）、0.1M酢酸ナトリウム/酢酸、pH 5中）を50℃で試験管に入れる。t=5分の時点で、250μlの酵素溶液を50℃で基質に添加し、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。t=15分の時点で、2mlのDNS溶液（1%の3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）、1.6%の水酸化ナトリウム、30%の酒石酸カリウムナトリウム、蒸留水中）を酵素−基質溶液及び2.0 mlの標準溶液に添加する。サンプル、ブランク、及び、標準液を添加したDNSを、沸騰した水浴（95℃）に5分間入れる。その後、サンプル、ブランク及び標準液を、25℃の水浴に20分間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全てのサンプルの光学濃度をOD540で読み取る。サンプルの希釈、試験に使ったサンプルの量、及び標準液に基づいて、サンプルのキシラナーゼ活性を計算することができる。

エンド-1,4-β-キシラナーゼWE-AX活性の１単位は、上記の条件の下で、1分間に1 μmolのキシロース当量を生じる酵素の量として定義される。

グルカナーゼ活性アッセイ
サンプル（このアッセイにおいて標準曲線内にOD540が得られるもの）、及びグルコース標準液（0、0.125、0.250、0.500、及び0.750 mg/ml蒸留水）を蒸留水中で調製する。t=0分の時点で、1,75 mlの大麦β-グルカン（1.5%大麦β-グルカン（P-BGBM, Megazyme, Bray, Ireland）、1M酢酸ナトリウム/酢酸、pH 5中）を50℃で試験管に入れる。t=5分の時点で、250μlの酵素溶液を50℃で基質に添加し、混合する。蒸留水をブランクとして使用する。t=15分の時点で、2mlのDNS溶液（1%の3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）、1.6%の水酸化ナトリウム、30%の酒石酸カリウムナトリウム、蒸留水中）を酵素−基質溶液及び2.0 mlの標準溶液に添加する。サンプル、ブランク、及び、標準液を添加したDNSを、沸騰した水浴（95℃）に15分間入れる。その後、サンプル、ブランク及び標準液を、25℃の水浴に20分間入れることにより冷却する。分光光度計を用いて、全てのサンプルの光学濃度をOD₅₄₀で読み取る。サンプルの希釈、試験に使ったサンプルの量、及び標準液に基づいて、サンプルのグルカナーゼ活性を計算することができる。

エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性の１単位は、アッセイの条件（pH 5.0（又は指定されたｐＨ）及び50℃）の下で、１分間に1 molのグルコース当量を生じる酵素の量として定義される。

ラボスケール醸造における使用方法
75:25の比率のピルスナーモルト：大麦を、3:1の水：グリスト比率（150ml:50gグリスト）で使用して、ラボスケール醸造における使用試験を実施した。最初に、マッシングイン（マッシュ投入）及びｐＨ調製（5.4、2 M H2SO4）の前に、水を予熱した。初期温度に復帰した後に（10分間）、糖化プロファイル（マッシングプロファイル）（図１参照）を開始し、酵素を添加する。マッシングオフ（糖化終了）後、通常のプラスチック漏斗及びろ紙（paper filter No 1, 24 cm直径, Whatman, England）を用いて、ウォルトの分離を実施する。ろ過性能及びいくつかの他のウォルトのパラメータ（すなわち、粘度、β-グルカン、ペントサン等）を評価した。

ウォルトの濾過を３０分間測定し、その後、ろ過を終了した。回収したウォルトは、更なる分析を行う前に、冷却した。

ろ過
ろ過データは、ブランク（外来性酵素を添加しない醸造）に対する５、１０、１５、及び２０分後に回収したウォルトの体積として記載した。

パイロットスケール醸造
パイロットスケールの醸造設備（2 HL 容量）で試験を実施した。ウォルトの分離はロイターリングによって実施し、ビールろ過は水平式珪藻土ろ過によって実施した。

「チャレンジングな」醸造条件の下でグルカナーゼ及びキシラナーゼの組み合わせによるろ過の最適化を解明するために、75%のモルト及び25%の大麦を含む混合グリストを用いて、パイロットスケール醸造試験を実施した。最初に、水：グリスト比率を2.8:1（糖化開始）に設定し、ロイターリングの開始時には3.1:1に増加させた。これに比べて、フルスケールの醸造所のロイターリングでは、水：グリスト比率は、約3.2〜3.8が一般的である。従って、3.1:1の水：グリスト比率という本パイロット試験の設定は、このスケールのチャレンジングな限界であると考えられる。

モルト及び大麦は、２本ローラーミルを用いて乾式粉砕した。大麦及びモルトの両方とも、約0.7 mm（〜0.7 mm）のローラー間隔を用いて２回粉砕した。

初期マッシュ温度53℃を目標にして、マッシングイン（マッシュ投入）を行った。マッシングイン（マッシュ投入）後、水：グリスト比率を2.8:1にするためのマッシュ体積の調製、及びpHを約5.56（〜5.56）にするためのｐＨ調製（乳酸）等、少しの調整を行った。マッシュの微調整の後、酵素を添加し、図１の糖化プロファイルを実施した。70℃の糖化休止は15分間にプログラムしたが、ヨウ素試験によりデンプンが存在しないことが示されるまで、休止時間を5分間延長した（Ludwig Narziss and Werner Back, Technische Universitaet Muenchen (Fakultaet fuer Brauwesen, Weihenstephan), Abriss der Bierbrauerei. WILEY-VCH Verlags GmbH Weinheim Germany, 2005）。

78℃での5分間の休止の後、マッシングオフ（糖化終了）を開始した。事前に「フォルスボトム（疑似底）」の真下の高さまで水を入れたロイタータン（ロイター式ろ過槽）にマッシュを移した。ろ過ケークを形成するため、マッシュを5分間休止させた。この後、15分間の再循環（140 L/h）を行い、ろ過ケークの形成とウォルトの清澄化を確実にした。通常、フルスケール醸造では、所定のウォルト濁度が得られた時に、ろ過を開始する。しかし、本試験では、15分間、再循環を一定に保ち、各試験間の比較が可能なようにした。ロイターリング中、時間（分）、回収したウォルトの体積（L）、ろ過ケーク間のろ過圧力差（mmWC、mm水柱）、ポンプ容量（%）、ウォルト濁度（EBC）、及びマッシュ温度（℃）を含むデータを収集した。

ろ過中にろ過ケーク間で増加する圧力は、ウォルトのロイターリング性能の基準の設定に寄与する因子であると考えられる。非常に高い圧力差（例えば、ファーストウォルト（一番麦汁）回収中では250 mmWC、及びロイターリングの残りについては450 mmWC）に達すると、ろ過ケークのレーキング（ディープカットとしても知られている）が必要となる。レーキングは、特別に設計された刃でろ過ケークをゆっくり切断することにより、ろ過ケークが崩れる、又はろ過流路の形成を回復させる工程である。ろ過ケークのレーキングの後、6分間の麦汁再循環（流速：120 l/h）を行って、ろ過を継続するためにろ過ケークを水で満たした。ろ過ケークのレーキングは、それをしないと低下してしまうろ過性能を回復させる（それをしないとウォルトの品質が低下する）。圧力により必要となるレーキングを３回目のスパージング（湯添加）開始までに行わなかった場合、３回目及び４回目のスパージングの開始時に自動的に行うレーキングを行い、ウォルト分離が終了するまでろ過が完全に詰まってしまうことのないようにした。

ロイターリングは、表１に示す設定を用いて行った。

最終のロイターリングの後、スウィートウォルトをマッシュタンに戻し、加熱して沸騰させ、ホップを添加した。ホッピングを80分間継続させ、ホッピングの最後にｐＨを5.10 ± 0.05に調整する。ワールプールを用いてビターウォルトからホップを除去し、その後、ウォルトを約8℃（〜8℃）に冷却した。発酵のために、Fermentisの下面発酵乾燥酵母(サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)）W34/70を選択した。酵母を30分間再水和させ、100 g/HLで投入した。主発酵を10℃で5〜6日間保ち、その後、発酵度が得られ、ダイアセチルが80 ppb未満になるまで、15℃で熟成(maturation)させた。ビールは、1℃、0.7 barで更に2〜3週間貯蔵した後、ろ過した。

1.2 μm PP-キャンドルプレート及び珪藻土を用いて、ビールを水平にろ過した。ろ過装置には8プレートまで入れることができ、約0.5 m2（〜0.5 m2）の総ろ過面積が得られる。本試験では、3プレートを入れて、130 L/hの流速でろ過を実施し、その結果、6.9 HL/(h・m2)のろ過速度が得られた。フルスケールの醸造所では、ろ過速度は、通常、5〜7 HL/(h・m2)に設定される。従って、本試験の設定は、明らかに、上限であり、醸造工程における酵素使用を選択することから得られる潜在的利益を検証するために、計画的にチャレンジングなビールろ過条件を選択したものである。ビールろ過中は、ビールろ過性能を検証するために、流速(L/h)及び圧力値(P-in及びP-out)をモニターした。また、ビール品質を評価するために、オリジナルグラビティ(OG)、外観エキス(AE)、アルコール体積(ABV)、外観発酵度(ADF)、真正発酵度(RDF)、pH、色、及び苦味等、いくつかのビール分析を実施した。

結果：
キシラナーゼ：
可溶性基質及び不溶性基質に対する活性、ｐＨ特性、及び温度特性について、キシラナーゼをスクリーニングした。

結果を表２に示す。

WE-AX酵素活性(U)及びWU-AX酵素活性(U)は、「水抽出可能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ法」のセクション及び「水抽出不能アラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）キシラナーゼ法」のセクションで記載したように測定した。

使用試験において更に試験するために、生化学的スクリーニングの結果に基づいて、可溶性アラビノキシラン対不溶性アラビノキシランに関し、適切な活性比を有するキシラナーゼを選択した。結果を表３に示す。

ろ過性能は、前記（「ろ過」）の通り測定した。ろ過性能は、異なる時点での陰性対照（ブランク）に対するろ液の体積として示される。

WE-AX酵素活性(U)及びWU-AX酵素活性(U)は、「水抽出可能アラビノキシラン（ＷＥ−ＡＸ）キシラナーゼ法」のセクション及び「水抽出不能アラビノキシラン（ＷＵ−ＡＸ）キシラナーゼ法」のセクションで記載したように測定した。

グルカナーゼ
活性及び温度特性について、グルカナーゼをスクリーニングした。結果を表４に示す。

グルカナーゼ活性／単位は、前記のグルカナーゼ活性アッセイで記載したように決定した。

使用試験において更に試験するために、生化学的スクリーニングの結果に基づいて、適切な特性を有するグルカナーゼを選択した。結果を表５に示す。

ろ過性能は、前記（「ろ過」）の通り測定した。ろ過性能は、異なる時点での陰性対照（ブランク）に対するろ液の体積として示される。

キシラナーゼ及びグルカナーゼの個々のスクレーニングに基づいて、組み合わせ実験を実施した。結果を表６に示す。

ろ過性能は、前記（「ろ過」）の通り測定した。ろ過性能は、異なる時点での陰性対照（ブランク）に対するろ液の体積として示される。

検証のために、更に、2HLパイロットスケール設備で適切な組み合わせを試験した。結果を表７及び図３に示す。

実施例２
この実施例は、醸造に使用するキシラナーゼが、高分子量可溶性アラビノキシラン(HMWS-AX)及び水抽出可能アラビノキシラン(WE-AX)に対して、非常に高い選択性を有することを示すために行った。これにより、アラビノキシランの限られた量だけが可溶化されると考えられ、その結果、これに関連する異臭の可能性は非常に低減される。

粘度が著しく減少すれば、マッシュ分離及びビール分離が容易になる。醸造に使用するための望ましいキシラナーゼ特性は、表８の次の点のうちの１つ以上を含んでもよい：

図３に示した穀物中の水不溶性アラビノキシラン(WU-AX)は、醸造所において、ろ過ケークの安定性と連動している。
穀物中のフェルラ酸(FA)の濃度は、その組織に大きく依存する。その最高濃度は果皮材料中で認められる。一方、胚乳中の濃度はそれよりもかなり低い。異なる濃度が報告されている。おおよそ、不溶性繊維で2700 μg/g、可溶性繊維で185 μg/gの濃度である(Bunzel et al. 2001, Journal of Sc. of food and agriculture, vol. 81, p. 653-60)。

これは、FAが発見されるのは、不溶性繊維(WU-AX)のアラビノキシランのキシロース分子２００個中に１個、及び可溶性繊維(WE-AX)のキシロース分子２５００個中に１個であるということを意味する。

キシラナーゼが、遊離フェルラ酸及び4-VG等のビールの異臭形成を引き起こすことはよく知られた事実である。

方法
表８及び９に記載した基準に基づいて、DuPont Industrial Biosciencesの１５種を超えるキシラナーゼを候補として選定した。30%未満の大麦を麦芽と組み合わせた実験室のマッシング（糖化）を用いて、キシラナーゼをスクリーニングした。中でも、マッシュの分離速度、ペントサン／アラビノキシランのレベル、及びウォルトの粘度をモニターした。我々の仮説を試験し、キシラナーゼの特性を醸造における機能性と連動させるために、いくつかのパイロット醸造プラント試験で、最も良い候補を試験した。選択したキシラナーゼの候補の最適使用量を、β−グルカナーゼと組み合わせて試験した。

結果及び考察：

パイロットプラント醸造では、酵素使用量が唯一の変数である。WU-AX選択性キシラナーゼ(X1)を使用すると、ろ床の崩壊が生じる。WE-AX選択性キシラナーゼの候補（リファレンス、X2, X3）は、増加する圧力を軽減する（減少させる）。リファレンスは、キシラナーゼ及びβ-グルカナーゼのブレンドである。

β-グルカナーゼ(B)と組み合わせて中使用量(X)及び高使用量(Xh)で使用した場合のWE-AX選択性キシラナーゼの最適なブレンド（20%大麦/80%麦芽の場合）。結果は、良好なマッシュ分離性能及びビール分離性能を示し、異臭形成及びろ床崩壊の危険性は低い。

結論
本試験により、マッシング中にWE-AXの選択性が高いキシラナーゼを醸造に使用することが重要であることが証明された。得られる利点は次の通りである：
・良好なマッシュ分離及びビールろ過性能
・ロイターリング時のろ床崩壊の危険性が最小限
・アラビノキシランの分解に関連する異臭形成の可能性が低下
・キシラナーゼを過剰使用することに寛容性がある

多くの場合、キシラナーゼは、分離を制御するために、β-グルカナーゼと組み合わせて使用することができ、非常に有利な効果が得られる。

実施例３：
2 HLパイロット醸造試験におけるX3/BglS (AtuXyn3/BsuGluSともいう)の組み合わせの評価

材料及び方法：
実験：酵素：
AtuXyn3(X3)/BsuGluS(Bgls)(a)：BglS(バチルス(Bacillus)グルカナーゼ)及びX3(アスペルギルス(Aspergillus)キシラナーゼ)の組み合わせ；BgLS: 0.50 mgタンパク/kgグリスト、及び、X3: 1.50 mgタンパク/kgグリスト。
AtuXyn3(X3)/BsuGluS(Bgls)(b):AtuXyn3(X3)/BsuGluS(Bgls)(a)と同様であるが、堅牢性(robustness)を試験するためにX3使用量を20%増加させる。

リファレンス：使用量0.20 kg/Tグリストの基準酵素製品(Ultraflo(登録商標)Max)。

原料：
付加原料：大麦 22% w/w。
モルト：ピルスナーモルトChiraz 42,6% w/w、ピルスナーモルトQuench DMG 35,4% 重量/重量(ww)。

ｐＨの酸調整のために使用した全ての材料、カルシウム、亜鉛、及び苦味レベルは、食品グレードであり、標準的な醸造の材料であると考えられる。

醸造のレシピは、国際的なラガービールのビールスタイルを目的とした。

ミリング（粉砕）：
Kunzelの2ローラーパイロットミル。粉砕する原料をローラーに２回通して、4ローラーミルをシミュレートした。

モルトグリスト：ミルは、１回目にローラーに通す時は1.5 mm、２回目にローラーに通す時は0.7mmで運転した。

大麦グリスト：ミルは、１回目にローラーに通す時は1.5 mm、２回目にローラーに通す時は0.4mmで運転した。

醸造所 2 HL：
全ての醸造は、16°プラトー（Plato）を目標とした190 LウォルトのＨＧＢ（高濃度醸造（High Gravity Brewing））インフュージョンマッシング及び標準ロイターリングに基づいた。固定流量で実施したロイターリング中、差圧を記録した（ロイターリング性能を評価するためのパラメータとして使用した）。全ての醸造原料を事前に（２４時間前に）粉砕し、水と接触させるまでは密閉容器内に保管した。マッシング開始後、最初の３分以内に、全ての原料をマッシュケトルに投入した。酵素添加の前に、カルシウム及びpHの調整を行った。52℃休止後に、pH(20℃)を再確認した。72℃で10分後に、ヨウ素試験が正常であることを確認した。ロイターリングは、78℃で実施した。

ロイターロング性能は、一番麦汁の回収中に、90 l/ Hの固定流量で評価した。ス
パージング及び薄いウォルトの回収の間は、流量を110 L/時及び130 L/時に増加させた。冷却ウォルトについて、化学分析を実施した。

ウォルトの煮沸：
煮沸は、外部加熱機を用いて、4〜5%の蒸発で行った。ホップ抽出物は、ウォルト沸騰の最初から、最終ビール中で20 BUを目標として添加した。

発酵 50L：
全ての発酵を50Lのシリンドロコニカルタンク（cylindriconical tank）で実施した。発酵は、標準的な操作手順に従って行った。ピッチング（酵母添加）は、15 x 10⁶ 生酵母細胞 / mlで行った。Nucleo counterを用いて、酵母数及び生存率を計算した。

ビール加工：
プレートとフレームのフィルタを一定の圧力で操作した。流量評価は、重量で行った。

１枚のフィルタープレートの場合及び３枚のフィルタプレートの場合からデータを収集した。

醸造終了（Debrewing）：
全てのビールは、国際的なラガービールの基準と考えられる5.0% ABV (アルコール（体積）（Alcohol By Volume）)に達した時点で醸造終了とした。

瓶詰（Bottling）：
CO₂を5.0g / Lに調製した。全てのビールサンプルは、McLennon自動充てん機で、シングルエバキュレーションを用いて、33 clの標準ボトルに瓶詰めした。

ビール分析：
GC-MSを用いて、新鮮ビール(fresh beer)を分析した。

GC-MSを用いて、化学的経時プロファイルを決定した。

結果及び所見：マッシング。
以下の条件でマッシングを実施した：
52℃で10分間（ミルを動かし、15 -20分間のマッシングをシミュレート）。
65℃で40分間。
72℃で30分間。
78℃で10分間。

温度勾配の工程は、全て１℃で実施した。グラフ表示は図７に示す。

16°プラトー（Plato）の醸造を目標とするこのマッシング計画を用いて、全ての試験を行った。この工程に対する特記事項はなかった。

結果及び所見：ロイターリング。
ロイターリングは、2hlの醸造所において、150 kg / m²の負荷で実施した。これは、標
準的な醸造所の操作の代表的なものである。ロイタリング工程の制御は、平均100リットル/時の固定流量で行った。初期流速は、90リットル/時であり、薄いウォルトの回収中は130リットル/時に増加させる。４回の醸造について、差圧及びヘイズ（haze）のインライン測定を記録した。全てのロイターリング及びウォルト回収を約2時間かけて行った。

X3/BglS (b)とX3/BglS (a)の試験がロイターリング性能が最も良かった試験であると示唆され、その次がX3/BglS (a)の試験であり、UF maxの試験は性能が最も悪かった。

表中の「差圧」および「一番ウォルトの増加した圧力」は、cmWC (cm 水柱)で測定した（それぞれ(cm)及び(cm/h)ではない）。

結果及び所見：煮沸後の麦汁の分析
冷却麦汁の分析は、各試験で似たような結果である。β-グルカンの分析は、サンプル間でわずかな違いがある。

結果及び所見：発酵
若ビール（green beer）の分析を、表１６に示す。

若ビール（green beer）の分析は、試験間で高い類似性がある。全ての試験は、比較的低いRDFを有するが、これは、重量／重量(ww)基準で計算して22%の大麦を含む場合に通常見られることである。

結果及び所見：ビールろ過
固定圧力を使用し、プレートとフレームのフィルタを用いて、ビールサンプルをろ過した。約15 kgの２つの樽をろ過した。個々の樽のろ過データを表１７に示す。第１の樽は１枚のフィルタシートを用いてろ過し、第２の樽は３枚のフィルタシートを用いてろ過した。差圧は常に0.5 バール(bar)であった。フィルタプレートは、BegerowのKD7 (20cmx20cm)である。

１枚又は３枚のフィルタプレートによるろ過のろ過曲線の全体像は、同じである。１枚のフィルタプレートによるろ過の記録は、敏感すぎて、実際の比率の違いを示すことができないと考えられる。

結果及び所見：最終ビール(final beer)の分析
試験ビールは、標準的な操作手順（EBC）に従って分析し、表１８に示す。

結果及び所見：ストレッカーアルデヒド及び最終ビール中の「経時マーカー(age markers)」
新鮮(fresh)ビール及び時間経過した(aged)ビールの両者について、分析を実施した。新鮮ビール及び時間経過したビールの両者について、GC-MSにより、ストレッカーアルデヒド、及び「経時及び加熱マーカー(age and heat markers)」(2-Me-Pr (2-メチルプロパナール)、2-Me-Bu (2-メチルブタナール)、3-Me-Bu (3-メチルブタナール)、フルフラール、メチオナール、PheAcal (フェニルアセトアルデヒド)、及びT2N(トランス-2-ノネナール))を分析した。新鮮ビールの分析のデータを表１９に示す。

ストレッカーアルデヒド分析の前に、試験ビールを37℃で2週間インキュベートした。時間経過させたビールサンプルのデータを表２０に示す。

表２０のデータは、ストレッカーアルデヒドレベルの予想された増加を示している。フルフラール及びトランス-2-ノネナールの増加は、予想されたレベルである。

結論：
パイロットスケール実験に基づいて、この実験で試験したBglS及びX3の比率は、パイロットスケール醸造において、リファレンスのUltraFlo Maxと同じように良好な、あるいはUltraFlo Maxよりもさらに良好な性能であると結論付けられる。

300 mg/lのβ-グルカンを含有する麦芽と組み合わせて22%の大麦を含むというチャレンジングな原料を使用した点から見て、この結果は驚くべきものである。この性能はマッシュ分離の結果において見られるだけでなく、ビールろ過においても見られる。BREW2（ペントサンのデータ）の場合に細胞壁材料の可溶化が低いことから、味の悪さ及び安定性に関する品質問題を引き起こす可能性のある細胞壁材料はより低レベルであると言える。

更に、X3/Bgls (b)ではキシラナーゼ成分の使用量が20%増加されているにもかかわらず、評価パラメータのいずれにも影響を与えず、このことから、X3/Bgls (a)は堅牢な(robust)酵素の組み合わせであることが示唆される。

配列：
AtuXyn3, アスペルギルス・ツビゲンシス (Aspergillus tubigensis) (配列番号1), 302 aa
QASVSIDTKFKAHGKKYLGNIGDQYTLTKNSKTPAIIKADFGALTPENSMKWDATEPSRGQFSFSGSDYLVNFAQSNNKLIRGHTLVWHSQLPSWVQAITDKNTLIEVMKNHITTVMQHYKGKIYAWDVVNEIFNEDGSLRDSVFYQVIGEDYVRIAFETARAADPNAKLYINDYNLDSASYPKLTGMVSHVKKWIEAGIPIDGIGSQTHLSAGGGAGISGALNALAGAGTKEIAVTELDIAGASSTDYVEVVEACLDQPKCIGITVWGVADPDSWRSSSTPLLFDSNYNPKPAYTAIANAL

TerXyn1, ゲオスミチア・エメルソニ (Geosmithia emersonii) (タレロミセス・エメルソニ (Taleromyces emersonii)) (配列番号2)
AGLNTAAKAIGLKYFGTATDNPELSDTAYETQLNNTQDFGQLTPANSMKWDATEPEQNVFTFSAGDQIANLAKANGQMLRCHNLVWYNQLPSWVTSGSWTNETLLAAMKNHITNVVTHYKGQCYAWDVVNEALNDDGTYRSNVFYQYIGEAYIPIAFATAAAADPNAKLYYNDYNIEYPGAKATAAQNLVKLVQSYGARIDGVGLQSHFIVGETPSTSSQQQNMAAFTALGVEVAITELDIRMQLPETEALLTQQATDYQSTVQACANTKGCVGITVWDWTDKYSWVPSTFSGYGDACPWDANYQKKPAYEGILTGLGQTVTSTTYIISPTTSVGTGTTTSSGGSGGTTGVAQHWEQCGGLGWTGPTVCASGYTCTVINEYYSQCL

AtuXyn4, アスペルギルス・ツビゲンシス (Aspergillus tubigensis) (配列番号3)
EPIEPRQASVSIDTKFKAHGKKYLGNIGDQYTLTKNSKTPAIIKADFGALTPENSMKWDATEPSRGQFSFSGSDYLVNFAQSNNKLIRGHTLVWHSQLPSWVQSITDKNTLIEVMKNHITTVMQHYKGKIYAWDVVNEIFNEDGSLRDSVFYKVIGEDYVRIAFETARAADPNAKLYINDYNLDSASYPKLTGMVSHVKKWIAAGIPIDGIGSQTHLSAGGGAGISGALNALAGAGTKEIAVTELDIAGASSTDYVEVVEACLNQPKCIGITVWGVADPDSWRSSSTPLLFDSNYNPKPAYTAIANAL

AacXyn2, アスペルギルス・アキュリエタス (Aspergillus aculeatus) (配列番号4)
MVGLLSITAALAATVLPNIVSAVGLDQAAVAKGLQYFGTATDNPELTDIPYVTQLNNTADFGQITPGNSMKWDATEPSQGTFTFTKGDVIADLAEGNGQYLRCHTLVWYNQLPSWVTSGTWTNATLTAALKNHITNVVSHYKGKCLHWDVVNEALNDDGTYRTNIFYTTIGEAYIPIAFAAAAAADPDAKLFYNDYNLEYGGAKAASARAIVQLVKNAGAKIDGVGLQAHFSVGTVPSTSSLVSVLQSFTALGVEVAYTEADVRILLPTTATTLAQQSSDFQALVQSCVQTTGCVGFTIWDWTDKYSWVPSTFSGYGAALPWDENLVKKPAYNGLLAGMGVTVTTTTTTTTATATGKTTTTTTGATSTGTTAAHWGQCGGLNWSGPTACATGYTCTYVNDYYSQCL

TreXyn3, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号5)
MKANVILCLLAPLVAALPTETIHLDPELAALRANLTERTADLWDRQASQSIDQLIKRKGKLYFGTATDRGLLQREKNAAIIQADLGQVTPENSMKWQSLENNQGQLNWGDADYLVNFAQQNGKSIRGHTLIWHSQLPAWVNNINNADTLRQVIRTHVSTVVGRYKGKIRAWDVVNEIFNEDGTLRSSVFSRLLGEEFVSIAFRAARDADPSARLYINDYNLDRANYGKVNGLKTYVSKWISQGVPIDGIGSQSHLSGGGGSGTLGALQQLATVPVTELAITELDIQGAPTTDYTQVVQACLSVSKCVGITVWGISDKDSWRASTNPLLFDANFNPKPAYNSIVGILQ

TreXyn5, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号6)
QCIQPGTGYNNGYFYSYWNDGHGGVTYCNGPGGQFSVNWSNSGNFVGGKGWQPGTKNRVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPSTGATKLGEVTSDGSVYDIYRTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGSVNTANHFNAWAQQGLTLGTMDYQIVAVEGYFSSGSASITVSD

BsuGluS, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) (配列番号7), 214 aa
QTGGSFFDPFNGYNSGFWQKADGYSNGNMFNCTWRANNVSMTSLGEMRLALTSPAYNKFDCGENRSVQTYGYGLYEVRMKPAKNTGIVSSFFTYTGPTDGTPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNYYTNGAGNHEKIVDLGFDAANAYHTYAFDWQPNSIKWYVDGQLKHTATNQIPTTPGKIMMNLWNGTGVDEWLGSYNGVNPLYAHYDWVRYTKK

TerGlu1, ゲオスミチア・エメルソニ (Geosmithia emersonii) (タレロミセス・エメルソニ (Taleromyces emersonii)) (配列番号8)
APVKEKGIKKRASPFQWFGSNESGAEFGNNNIPGVEGTDYTFPNTSAIQILIDQGMNIFRVPFLMERMVPNQMTGPVDSAYFQGYSQVINYITSHGASAVIDPHNFGRYYNNIISSPSDFQTFWHTIASNFADNDNVIFDTNNEYHDMDESLVVQLNQAAIDGIRAAGATSQYIFVEGNSWTGAWTWTQVNDAMANLTDPQNKIVYEMHQYLDSDGSGTSDQCVNSTIGQDRVESATAWLKQNGKKAILGEYAGGANSVCETAVTGMLDYLANNTDVWTGAIWWAAGPWWGDYIFSMEPPSGIAYEQVLPLLQPYL

BsuGlu103FULL, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) (配列番号9)
DDYSVVEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMKWLRDDWGITVFRAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDWHILSDNDPNIYKEEAKDFFDEMSELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVTWDNQIKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTWSQDVHHAADNQLADPNVMYAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDEAQVWIDFMDERNLSWANWSLTHKDESSAALMPGANPTGGWTEAELSPSGTFVREKIRESASIPPSDPTPPSDPGEPDPGEPDPTPPSDPGEYPAWDSNQIYTNEIVYHNGQLWQAKWWTQNQEPGDPYGPWEPLKSDPDSGEPDPTPPSDPGEYPAWDSNQIYTNEIVYHNGQLWQAKWWTQNQEPGDPYGPWEPLN

TreGlu2, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号10)
QQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNPYYAQCIPGATTITTSTRPPSGPTTTTRATSTSSSTPPTSSGVRFAGVNIAGFDFGCTTDGTCVTSKVYPPLKNFTGSNNYPDGIGQMQHFVNDDGMTIFRLPVGWQYLVNNNLGGNLDSTSISKYDQLVQGCLSLGAYCIVDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFTSLWSQLASKYASQSRVWFGIMNEPHDVNINTWAATVQEVVTAIRNAGATSQFISLPGNDWQSAGAFISDGSAAALSQVTNPDGSTTNLIFDVHKYLDSDNSGTHAECTTNNIDGAFSPLATWLRQNNRQAILTETGGGNVQSCIQDMCQQIQYLNQNSDVYLGYVGWGAGSFDSTYVLTETPTGSGNSWTDTSLVSSCLARK

TreGlu3, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号11)
QTSCDQWATFTGNGYTVSNNLWGASAGSGFGCVTAVSLSGGASWHADWQWSGGQNNVKSYQNSQIAIPQKRTVNSISSMPTTASWSYSGSNIRANVAYDLFTAANPNHVTYSGDYELMIWLGKYGDIGPIGSSQGTVNVGGQSWTLYYGYNGAMQVYSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNKGYNAAGQYVLSYQFGTEPFTGSGTLNVASWTASIN

TreGlu4, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号12)
HGHINDIVINGVWYQAYDPTTFPYESNPPIVVGWTAADLDNGFVSPDAYQNPDIICHKNATNAKGHASVKAGDTILFQWVPVPWPHPGPIVDYLANCNGDCETVDKTTLEFFKIDGVGLLSGGDPGTWASDVLISNNNTWVVKIPDNLAPGNYVLRHEIIALHSAGQANGAQNYPQCFNIAVSGSGSLQPSGVLGTDLYHATDPGVLINIYTSPLNYIIPGPTVVSGLPTSVAQGSSAATATASATVPGGGSGPTSRTTTTARTTQASSRPSSTPPATTSAPAGGPTQTLYGQCGGSGYSGPTRCAPPATCSTNPYYAQCLN

TreGlu6, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号13)
AFSWKNVKLGGGGGFVPGIIFHPKTKGVAYARTDIGGLYRLNADDSWTAVTDGIADNAGWHNWGIDAVALDPQDDQKVYAAVGMYTNSWDPSNGAIIRSSDRGATWSFTNLPFKVGGNMPGRGAGERLAVDPANSNIIYFGARSGNGLWKSTDGGVTFSKVSSFTATGTYIPDPSDSNGYNSDKQGLMWVTFDSTSSTTGGATSRIFVGTADNITASVYVSTNAGSTWSAVPGQPGKYFPHKAKLQPAEKALYLTYSWWPDAQLFRSTDSGTTWSPIWAWASYPTETYYYSISTPKAPWIKNNFIDVTSESPSDGLIKRLGWMIESLEIDPTDSNHWLYGTGMTIFGGHDLTNWDTRHNVSIQSLADGIEEFSVQDLASAPGGSELLAAVGDDNGFTFASRNDLGTSPQTVWATPTWATSTSVDYAGNSVKSVVRVGNTAGTQQVAISSDGGATWSIDYAADTSMNGGTVAYSADGDTILWSTASSGVQRSQFQGSFASVSSLPAGAVIASDKKTNSVFYAGSGSTFYVSKDTGSSFTRGPKLGSAGTIRDIAAHPTTAGTLYVSTDVGIFRSTDSGTTFGQVSTALTNTYQIALGVGSGSNWNLYAFGTGPSGARLYASGDSGASWTDIQGSQGFGSIDSTKVAGSGSTAGQVYVGTNGRGVFYAQGTVGGGTGGTSSSTKQSSSSTSSASSSTTLRSSVVSTTRASTVTSSRTSSAAGPTGSGVAGHYAQCGGIGWTGPTQCVAPYVCQKQNDYYYQCV

TreGlu7, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号14)
HGQVQNFTINGQYNQGFILDYYYQKQNTGHFPNVAGWYAEDLDLGFISPDQYTTPDIVCHKNAAPGAISATAAAGSNIVFQWGPGVWPHPYGPIVTYVVECSGSCTTVNKNNLRWVKIQEAGINYNTQVWAQQDLINQGNKWTVKIPSSLRPGNYVFRHELLAAHGASSANGMQNYPQCVNIAVTGSGTKALPAGTPATQLYKPTDPGILFNPYTTITSYTIPGPALWQG

TreGlu8, トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) (配列番号15)
GKIKYLGVAIPGIDFGCDIDGSCPTDTSSVPLLSYKGGDGAGQMKHFAEDDGLNVFRISATWQFVLNNTVDGKLDELNWGSYNKVVNACLETGAYCMIDMHNFARYNGGIIGQGGVSDDIFVDLWVQIAKYYEDNDKIIFGLMNEPHDLDIEIWAQTCQKVVTAIRKAGATSQMILLPGTNFASVETYVSTGSAEALGKITNPDGSTDLLYFDVHKYLDINNSGSHAECTTDNVDAFNDFADWLRQNKRQAIISETGASMEPSCMTAFCAQNKAISENSDVYIGFVGWGAGSFDTSYILTLTPLGKPGNYTDNKLMNECILDQFTLDEKYRPTPTSISTAAEETATATATSDGDAPSTTKPIFREETASPTPNAVTKPSPDTSDSSDDDKDSAASMSAQGLTGTVLFTVAALGYMLVAF

BsuGluC CBD, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) (配列番号16)
MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASAAGTKTPVAKNGQLSIKGTQLVNRDGKAVQLKGISSHGLQWYGEYVNKDSLKWLRDDWGITVFRAAMYTADGGYIDNPSVKNKVKEAVEAAKELGIYVIIDWHILNDGNPNQNKEKAKEFFKEMSSLYGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDIKPYAEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAADDQLKDANVMYALHFYAGTHGQFLRDKANYALSKGAPIFVTEWGTSDASGNGGVFLDQSREWLKYLDSKTISWVNWNLSDKQESSSALKPGASKTGGWRLSDLSASGTFVRENILGTKDSTKDIPETPSKDKPTQENGISVQYRAGDGSMNSNQIRPQLQIKNNGNTTVDLKDVTARYWYKAKNKGQNFDCDYAQIGCGNVTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKNGTLAPGASTGNIQLRLHNDDWSNYAQSGDYSFFKSNTFKTTKKITLYDQGKLIWGTEPN

BsuXyn3, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) キシラナーゼ変異体 (配列番号17)
ASTDYWQNWTFGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFVVGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYRPTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDDTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQVMATEGYQSSGSSNVTVW

BsuXyn4, バチルス・スブチリス (Bacillus subtilis) キシラナーゼ変異体 (配列番号18)
ASTDYWQNWTDGYGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFVVGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYRPTGTYKGTVYSDGGWYDIYTATRDNAPSIDGDFTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHVNAWRSHGMDLGSNWAYQVMATEGYLSSGSSNVTVW

ApuXyn1, オウレオバシディウム・プルランス (AUREOBASIDIUM PULLULANS) (配列番号19), 343 AA
TPTDYSTSSYSKNQGLAQAWTSKGRQYIGTALTIRDDPVEQGIIQSRTDFNSITPENAMKWESTEPQRNNFTFAGADAVADFADRYNKEMRCHTLVWHSQLPAWVSQGNFDNKTLISIMENHIKKVAGRYKNKCTHWDVVNEALNEDGTYRSSVFYNTIGEAFIPIAFRFAEKYAGSKTKLYYNDYNLEYGSAKALGAQRILKLVQSYGVQIDGVGLQAHLSSEATASTGGGVTPDVQTLTNVLKLYTDLGVEVAYTELDVRFTTPATDAKLKAQADAYARVVQSCINVKRCVGITVWGVSDKYSWIPGVFPTEGAALLWDENFNKKPAYSSVLKTIQSFRKS

TlaXyn1, サーモミセス・ラヌギノサス (THERMOMYCES LANUGINOSUS) (配列番号20), 225 AA
AFPAGNATELEKRQTTPNSEGWHDGYYYSWWSDGGAQATYTNLEGGTYEISWGDGGNLVGGKGWNPGLNARAIHFEGVYQPNGNSYLAVYGWTRNPLVEYYIVENFGTYDPSSGATDLGTVECDGSIYRLGKTTRVNAPSIDGTQTFDQYWSVRQDKRTSGTVQTGCHFDAWARAGLNVNGDHYYQIVATEGYFSSGYARITVADVG MVGFTPVALAALAATGAL

TauXyn1, サーモアスカス・オーランティアカス (THERMOASCUS AURANTIACUS); 310 AA (配列番号21),
SPILEERQAAQSVDQLIKARGKVYFGVATDQNRLTTGKNAAIIQADFGQVTPENSMKWDATEPSQGNFNFAGADYLVNWAQQNGKLIRGHTLVWHSQLPSWVSSITDKNTLTNVMKNHITTLMTRYKGKIRAWDVVNEAFNEDGSLRQTVFLNVIGEDYIPIAFQTARAADPNAKLYINDYNLDSASYPKTQAIVNRVKQWRAAGVPIDGIGSQTHLSAGQGAGVLQALPLLASAGTPEVAITELDVAGASPTDYVNVVNACLNVQSCVGITVWGVADPDSWRASTTPLLFDGNFNPKPAYNAIVQDLQQ

SthXyn1, Ｓ．サーモビオラセウス (S. THERMOVIOLACEUS) (配列番号22), 295 AA
DTITSNQTGTHNGYFYSFWTDAPGTVTMNTGAGGNYSTQWSNTGNFVAGKGWATGGRRTVTYSGTFNPSGNAYLALYGWSQNPLVEYYIVDNWGTYRPTGTYKGTVDSDGGTYDIYMTTRYNAPSIEGTKTFNQYWSVRQNKRTGGTITTGNHFDAWAAHGMPLGTFNYMILATEGYQSSGSSNITVGDSGGDNGGGGGGGGGGGNTGGCTATLSAGEQWSDRYNLNVSVSGSDNWTVTMRVPAPEKVMATWNVTASYPDAQTLVARPNGNGNNWGVTIQKNGSTTWPTVSCSVG

TfuXyn1, サーモビフィダ・フスカ (THERMOBIFIDA FUSCA) (配列番号23), 296 AA
AVTSNETGYHDGYFYSFWTDAPGTVSMELGPGGNYSTSWRNTGNFVAGKGWATGGRRTVTYSASFNPSGNAYLTLYGWTRNPLVEYYIVESWGTYRPTGTYMGTVTTDGGTYDIYKTTRYNAPSIEGTRTFDQYWSVRQSKRTSGTITAGNHFDAWARHGMHLGTHDYMIMATEGYQSSGSSNVTLGTSGGGNPGGGNPPGGGNPPGGGGCTATLSAGQQWNDRYNLNVNVSGSNNWTVTVNVPWPARIIATWNIHASYPDSQTLVARPNGNGNNWGMTIMHNGNWTWPTVSCSAN

FoxXyn2*, フザリウム・オキシスポルム (FUSARIUM OXYSPORUM) (配列番号24)
MKLSSFLYTASLVAAIPTAIEPRQASDSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSMKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTVVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNVVGRYKGKIYAWDVVNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAVVNALR

FveXyn4*, フザリウム・バーティシリオイデス (FUSARIUM VERTICILLOIDES) (配列番号25)
QAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQVVGRYKGKIYAWDVVNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAVVNALR

Claims (41)

1. エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む酵素。
2. 不溶性アラビノキシラン基質（ＷＵ−ＡＸ）アラビノキシラン基質への活性に対する可溶性アラビノキシラン基質（ＷＥ−ＡＸ）への活性の比率が、約７．０未満、例えば約６．５未満、例えば約６．０未満、例えば約５．５未満、例えば約５．０未満、例えば約４．５未満である、請求項１に記載の酵素。
3. エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素であって、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、及び配列番号16から選択されるいずれか１つと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む酵素。
4. ４０〜７０℃の範囲、例えば４５〜６５℃の範囲、例えば５０〜６５℃の範囲、例えば５５〜６５℃の範囲の至適温度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素。
5. 配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する、又はその任意の機能性断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
6. アミノ酸総数が、３５０未満、例えば３４０未満、例えば３３０未満、例えば３２０未満、例えば３１０未満、例えば３００未満のアミノ酸、例えば２００〜３５０の範囲、例えば２２０〜３４５の範囲のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素。
7. 前記酵素のアミノ酸配列が、配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素。
8. 前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号1〜25から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を有する、又はその任意の機能性断片である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素。
9. 配列番号1〜25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素。
10. 配列番号1〜25のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列、又はその任意の機能性断片からなる、請求項１又は３のいずれか一項に記載の酵素。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
12. 請求項１１に記載のＤＮＡ構築物を含む組み換え発現ベクター。
13. 請求項１１に記載のＤＮＡ構築物又は請求項１２に記載のベクターで形質転換された細胞。
14. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物、請求項１２に記載のベクター、又は請求項１３に記載の細胞を含む調製物。
15. 請求項１、２、及び４〜１０のいずれか一項に記載のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のβ-グルカナーゼと組み合わせて含む組成物。
16. 前記１種以上のβ-グルカナーゼが請求項３〜１０のいずれか一項に記載のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素である、請求項１５に記載の組成物。
17. 請求項３〜１０のいずれか一項に記載のエンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性を示す酵素を、任意の１種以上のキシラナーゼと組み合わせて含む組成物。
18. 前記１種以上のキシラナーゼが請求項１、２、及び４〜１０のいずれか一項に記載のエンド-1,4-β-キシラナーゼ活性を示す酵素である、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記エンド-1,3(4)-β-グルカナーゼ活性及び前記エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性が、少なくとも２種の異なる酵素、例えば２つの異なる種（species）からの少なくとも２種の異なる酵素に由来する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 少なくとも２種の酵素の組み合わせを含む請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記２種の酵素が、次の配列からなるリストから選択されるそれぞれの配列番号と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２種の酵素、又はその任意の機能性断片である、組成物。
    配列番号1及び配列番号7、
    配列番号2及び配列番号7、
    配列番号3及び配列番号7、
    配列番号4及び配列番号7、
    配列番号5及び配列番号7、
    配列番号6及び配列番号7、
    配列番号17及び配列番号7、
    配列番号18及び配列番号7、
    配列番号19及び配列番号7、
    配列番号20及び配列番号7、
    配列番号21及び配列番号7、
    配列番号22及び配列番号7、
    配列番号23及び配列番号7、
    配列番号24及び配列番号7、
    配列番号25及び配列番号7、
    配列番号1及び配列番号8、
    配列番号2及び配列番号8、
    配列番号3及び配列番号8、
    配列番号4及び配列番号8、
    配列番号5及び配列番号8、
    配列番号6及び配列番号8、
    配列番号17及び配列番号8、
    配列番号18及び配列番号8、
    配列番号19及び配列番号8、
    配列番号20及び配列番号8、
    配列番号21及び配列番号8、
    配列番号22及び配列番号8、
    配列番号23及び配列番号8、
    配列番号24及び配列番号8、
    配列番号25及び配列番号8、
    配列番号1及び配列番号9、
    配列番号2及び配列番号9、
    配列番号3及び配列番号9、
    配列番号4及び配列番号9、
    配列番号5及び配列番号9、
    配列番号6及び配列番号9、
    配列番号17及び配列番号9、
    配列番号18及び配列番号9、
    配列番号19及び配列番号9、
    配列番号20及び配列番号9、
    配列番号21及び配列番号9、
    配列番号22及び配列番号9、
    配列番号23及び配列番号9、
    配列番号24及び配列番号9、
    配列番号25及び配列番号9、
    配列番号1及び配列番号10、
    配列番号2及び配列番号10、
    配列番号3及び配列番号10、
    配列番号4及び配列番号10、
    配列番号5及び配列番号10、
    配列番号6及び配列番号10、
    配列番号17及び配列番号10、
    配列番号18及び配列番号10、
    配列番号19及び配列番号10、
    配列番号20及び配列番号10、
    配列番号21及び配列番号10、
    配列番号22及び配列番号10、
    配列番号23及び配列番号10、
    配列番号24及び配列番号10、
    配列番号25及び配列番号10、
    配列番号1及び配列番号11、
    配列番号2及び配列番号11、
    配列番号3及び配列番号11、
    配列番号4及び配列番号11、
    配列番号5及び配列番号11、
    配列番号6及び配列番号11、
    配列番号17及び配列番号11、
    配列番号18及び配列番号11、
    配列番号19及び配列番号11、
    配列番号20及び配列番号11、
    配列番号21及び配列番号11、
    配列番号22及び配列番号11、
    配列番号23及び配列番号11、
    配列番号24及び配列番号11、
    配列番号25及び配列番号11、
    配列番号1及び配列番号12、
    配列番号2及び配列番号12、
    配列番号3及び配列番号12、
    配列番号4及び配列番号12、
    配列番号5及び配列番号12、
    配列番号6及び配列番号12、
    配列番号17及び配列番号12、
    配列番号18及び配列番号12、
    配列番号19及び配列番号12、
    配列番号20及び配列番号12、
    配列番号21及び配列番号12、
    配列番号22及び配列番号12、
    配列番号23及び配列番号12、
    配列番号24及び配列番号12、
    配列番号25及び配列番号12、
    配列番号1及び配列番号13、
    配列番号2及び配列番号13、
    配列番号3及び配列番号13、
    配列番号4及び配列番号13、
    配列番号5及び配列番号13、
    配列番号6及び配列番号13、
    配列番号17及び配列番号13、
    配列番号18及び配列番号13、
    配列番号19及び配列番号13、
    配列番号20及び配列番号13、
    配列番号21及び配列番号13、
    配列番号22及び配列番号13、
    配列番号23及び配列番号13、
    配列番号24及び配列番号13、
    配列番号25及び配列番号13、
    配列番号1及び配列番号14、
    配列番号2及び配列番号14、
    配列番号3及び配列番号14、
    配列番号4及び配列番号14、
    配列番号5及び配列番号14、
    配列番号6及び配列番号14、
    配列番号17及び配列番号14、
    配列番号18及び配列番号14、
    配列番号19及び配列番号14、
    配列番号20及び配列番号14、
    配列番号21及び配列番号14、
    配列番号22及び配列番号14、
    配列番号23及び配列番号14、
    配列番号24及び配列番号14、
    配列番号25及び配列番号14、
    配列番号1及び配列番号15、
    配列番号2及び配列番号15、
    配列番号3及び配列番号15、
    配列番号4及び配列番号15、
    配列番号5及び配列番号15、
    配列番号6及び配列番号15、
    配列番号17及び配列番号15、
    配列番号18及び配列番号15、
    配列番号19及び配列番号15、
    配列番号20及び配列番号15、
    配列番号21及び配列番号15、
    配列番号22及び配列番号15、
    配列番号23及び配列番号15、
    配列番号24及び配列番号15、
    配列番号25及び配列番号15、
    配列番号1及び配列番号16、
    配列番号2及び配列番号16、
    配列番号3及び配列番号16、
    配列番号4及び配列番号16、
    配列番号5及び配列番号16、
    配列番号6及び配列番号16、
    配列番号17及び配列番号16、
    配列番号18及び配列番号16、
    配列番号19及び配列番号16、
    配列番号20及び配列番号16、
    配列番号21及び配列番号16、
    配列番号22及び配列番号16、
    配列番号23及び配列番号16、
    配列番号24及び配列番号16、並びに
    配列番号25及び配列番号16
21. 醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増加する総圧力が、４７０ｍｍＷＣ未満、例えば４５０ｍｍＷＣ未満、例えば４３０ｍｍＷＣ未満、例えば４１０ｍｍＷＣ未満、例えば３９０ｍｍＷＣ未満、例えば３７０ｍｍＷＣ未満、例えば３５０ｍｍＷＣ未満、例えば３３０ｍｍＷＣ未満、例えば３１０ｍｍＷＣ未満、例えば３００ｍｍＷＣ未満、例えば２９０ｍｍＷＣ未満の値に軽減する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 醸造用途においてロイターリングの前に用いる場合、増加する総圧力が、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３又は９５％軽減する、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定するウォルトのろ過性は、酵素を含まない対照に対して、１．５倍を超えて、例えば１．６倍を超えて、例えば１．７倍を超えて、例えば１．８倍を超えて、例えば１．９倍を超えて、例えば２．０倍を超えて、例えば２．１倍を超えて、例えば２．２倍を超えて、例えば２．３倍を超えて、例えば２．４倍を超えて、例えば２．５倍を超えて増加する、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 醸造用途においてウォルトの分離の前に用いる場合、５分間のろ過の後に回収したウォルトの体積によって測定するウォルトのろ過性は、前記組成物を含まない陰性対照を用いた場合と比較して、少なくとも５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００％増加する、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
25. 任意の１種以上の更なる酵素を含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記１種以上の更なる酵素が、EC 3.2.1.32、EC 3.2.1.136、又はEC 3.2.1.156に分類されるキシラナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド-1,5-α-L-アラビナナーゼ、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ、β-キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン1,4-β-グルコシダーゼ、キシログルカン特異的エキソ-β-1,4-グルカナーゼ及びα-N-アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される、請求項２５に記載の組成物。
27. 食品製品、飼料製品、又はモルト飲料製品の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
28. ドウ製品又はベークド製品の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
29. パルプ又は紙の調製における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
30. 穀物成分の調製のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
31. 前記穀物がライ麦、小麦、又は大麦である、請求項２９に記載の使用。
32. ビールの製造又は醸造工程からの副産物の改変における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
33. ワイン又はジュースの製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
34. バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃料の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
35. デンプン含有原料のろ過性を変更する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物で前記デンプン含有原料を処理する工程を含む方法。
36. 醸造工程においてロイターリング中に増加する圧力を軽減する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物で醸造用マッシュを処理する工程を含む方法。
37. 食品製品、飼料製品、又は、アルコール飲料若しくはノンアルコール飲料や、ビール若しくはウイスキーのような穀物使用飲料若しくはモルト使用飲料等の飲料製品を製造する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。
38. 醸造用マッシュを製造する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。
39. バイオエタノール等の第一世代又は第二世代のバイオ燃料を製造する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素、請求項１４に記載の調製物、又は請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の組成物でデンプン含有原料を処理する工程を含む方法。
40. 請求項３８又は３９に記載の方法によって得られた製品。
41. 請求項４０に記載の製品を含む組成物であって、前記製品が０．１％〜９９．９％の範囲で含まれるような組成物。

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