PL209225B1 - Izolowany polipeptyd stanowiący ß-glukanazę uzyskaną z grzyba rodzaju Talaromyces, izolowany polinukleotyd, wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania izolowanego polipeptydu, sposób identyfikowania związku modulującego aktywność ß-glukanazy, kompozycja odpowiednia do zastosowania jako pasza dla zwierząt, sposób obróbki materiału roślinnego, sposób zmniejszenia lepkości materiału roślinnego, zastosowanie izolowanego polipeptydu oraz pasza dla zwierząt - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy izolowanego polipeptydu stanowiącego β-glukanazę uzyskaną z grzyba rodzaju Talaromyces, izolowanego polinukleotydu, wektora, komórki gospodarza, sposobu wytwarzania izolowanego polipeptydu, sposób identyfikowania związku modulującego aktywność β-glukanazy, kompozycji odpowiedniej do stosowania jako pasza dla zwierząt, sposobu obróbki materiału roślinnego, sposobu zmniejszenia lepkości materiału roślinnego, zastosowania izolowanego polipeptydu oraz paszy dla zwierząt.

Skład ściany komórkowej komórek roślinnych jest złożony i zmienny. Wielocukry znajdowane są głównie w formie długich łańcuchów celulozy (główny strukturalny składnik ściany komórkowej komórek roślinnych), hemicelulozy (zawierającej różne łańcuchy β-ksylanu, takie jak ksyloglukany) i pektyny. β-glukan (lub bardziej poprawnie (1 >3) (1 >4) β-D-glukan), MW 10 do 14 kDa, jest składnikiem hemicelulozy roślin (MW około 700 kDa) i zawiera szkielet β-1,4 i e-1,3-połączonych reszt glukozopiranozy. Innym składnikiem jest ksylan, który zawiera e-1,4-połączone reszty ksylozy, ewentualnie podstawione łańcuchami bocznymi, takimi jak reszty arabinozy i/lub kwasu glukoronowego.

Istnieją podstawowe różnice pomiędzy roślinami jednoliściennymi (na przykład zboża i trawy) i roślinami dwuliściennymi (na przykład koniczyna, rzepak i soja) oraz pomiędzy nasionami i wegetatywnymi częściami roślin. Rośliny jednoliścienne cechują się obecnością kompleksów arabinoksylanu, jako głównego szkieletu hemicelulozy, a główną strukturą hemicelulozy u roślin dwuliściennych jest kompleks ksyloglukanu. U roślin dwuliściennych stwierdza się większe stężenie pektyn niż u roślin jednoliściennych. Nasiona generalnie zawierają więcej substancji pektynowych, stosunkowo niewiele materiału celulozowego.

Ze względu na swoją zdolność działania na składniki głównej ściany komórkowej komórek roślinnych, enzymy rozkładające celulozę są używane do obróbki materiału roślinnego w pożywieniu, a także w zastosowaniach związanych z paszą dla zwierząt lub jako dodatki do żywności i pasz.

Większość enzymów rozkładających celulozę dostępnych dla przemysłu wydaje się być glukanazami o stosunkowo niewielkiej masie cząsteczkowej i umiarkowanej stabilności w wyższych temperaturach. Jednakże, w pewnych zastosowaniach pożądane jest użycie glukanaz o stosunkowo wysokiej termostabilności. Jeżeli glukanaza ma być użyta jako dodatek do pasz dla zwierząt korzystne są glukanazy o wysokiej termostabilności, ze względu na wysokie temperatury stosowanie przy granulowaniu pasz zwierzęcych.

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd stanowiący β-glukanazę uzyskaną z grzyba rodzaju Talaromyces, takiego jak grzyb Talaromyces emersonii, posiadającą aktywność EC 3.2.1.4 (aktywność endoglukanazy); który to polipeptyd zawiera:

(i) sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 2; lub (ii) wariant (i), który jest zdolny do cięcia β-D-glukanu, posiadający co najmniej 80% identyczności względem pełnej długości SEQ ID no: 2 lub co najmniej 80% identyczności względem regionu 150 sąsiadujących aminokwasów sekwencji aminokwasowej SEQ ID No: 2.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji polipeptydu według wynalazku wariant (ii) ma co najmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową SEQ ID No: 2 i/lub fragment (iii) ma długość co najmniej 150 sąsiadujących aminokwasów.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowany polinukleotyd zawierający (a) sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID No: 1 lub sekwencję kodującą izolowany polipeptyd jak zdefiniowano powyżej;

(b) sekwencję, która jest komplementarna do, lub która hybrydyzuje z każdą sekwencją określoną w (a);

(c) sekwencję mającą co najmniej 80% identyczności z każdą z sekwencji określonej w (a); lub (d) sekwencję, która jest ze względu na cechy kodu genetycznego zdegenerowana, w stosunku sekwencji określonej w (a).

W korzystnym wariancie realizacji polinukleotydu według wynalazku sekwencja koduje polipeptyd mający aktywność β-glukanazy. W innym korzystnym wariancie realizacji polinukleotydu według wynalazku jest sekwencją DNA.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający sekwencję polinukleotydową określoną powyżej, a w korzystnym przypadku - wektor ten jest wektorem ekspresyjnym, takim, w którym sekwencja DNA określona powyżej połączona jest funkcjonalnie z sekwencją regulatorową.

PL 209 225 B1

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza, która jako białko heterogenne eksprymuje izolowany polipeptyd określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania izolowanego polipeptydu zdefiniowanego powyżej, w którym to sposobie hoduje się komórkę gospodarza zdefiniowaną powyżej w warunkach, które podtrzymują ekspresję tego polipeptydu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania związku modulującego aktywność β-glukanazy, w którym kontaktuje się izolowany polipeptyd określony powyżej z testowanym związkiem i monitoruje się aktywności β-glukanazy.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja odpowiednia do stosowania jako pasza dla zwierząt, zawierająca izolowany polipeptyd określony powyżej. Korzystnie kompozycja zawiera również polipeptyd mający aktywność celulazy, endoarabinazy, ramnogalakturonazy lub poligalakturonazy.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób obróbki materiału roślinnego, w którym to sposobie kontaktuje się materiał roślinny z izolowanym polipeptydem określonym powyżej % lub z kompozycją określoną powyżej. W jednym z wariantów sposób według wynalazku obejmuje degradowanie lub modyfikowanie celulozy, takiej jak β-glukan, w materiale roślinnym. W korzystniejszym wariancie realizacji sposób według wynalazku obejmuje degradowanie lub modyfikowanie ściany komórkowej roślin. W innym korzystnym wariancie realizacji sposób według wynalazku obejmuje cięcie podjednostek glukozy w β-D-glukanie zawartym w materiale roślinnym. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji sposób według wynalazku materiał obejmuje rośliny, pulpę roślinną, ekstrakty roślinne lub ich jadalne części lub składniki, lub materiały, tekstylia lub ubrania zawierające materiał roślinny.

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest sposób zmniejszenia lepkości materiału roślinnego, obejmujący doprowadzenie do kontaktu materiału roślinnego z izolowanym polipeptydem określonym powyżej lub kompozycją określoną powyżej, w ilości i w warunkach odpowiednich do zdegradowania celulozy zawartej w materiale roślinnym.

Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie izolowanego polipeptydu określonego powyżej lub kompozycji określonej powyżej w sposobie odpowiednim do traktowania materiału roślinnego. W korzystnym przypadku zastosowania według wynalazku traktowanie obejmuje cięcie polimerów β-D-glukanu zawartych w materiale roślinnym.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie izolowanego polipeptydu określonego powyżej lub kompozycji określonej powyżej w sposobie obróbki pulpy roślinnej, soku lub ekstraktu, obejmującym inkubację pulpy roślinnej, soku lub ekstraktu z tym polipeptydem lub tą kompozycją, do przynajmniej częściowego zdegradowania celulozy.

Przedmiotem wynalazku jest wreszcie pasza dla zwierząt, zawierająca izolowany polipeptyd określony powyżej.

Zgodnie z wynalazkiem glukanazy mogą mieć:

a. optymalne pH poniżej 7,0 lub 5,4, takie jak poniżej 5,0, na przykład od 4,4 do 5,2 lub od 3,0 do 6,0 lub 7,0; lub

b. optimum temperaturowe przynajmniej 72°C, 75°C lub nawet 81°C, takie jak od 78°C do 81°C lub od 83°C do 87°C.

Krótki opis sekwencji

SEQ ID No: 1 jest sekwencją DNA pierwszej β-glukanazy (CEA) wytworzonej sposobem według wynalazku z Talaromyces emersonii;

SEQ ID No: 2 jest sekwencją aminokwasową pierwszej β-glukanazy, CEA;

SEQ ID No: 3 jest sekwencją DNA drugiej β-glukanazy (CEA) wytworzonej sposobem według wynalazku z tego samego organizmu;

SEQ ID No: 4 jest sekwencją aminokwasową drugiej β-glukanazy, CEA;

SEQ ID No: 5 jest sekwencją DNA trzeciej β-glukanazy (CEA) wytworzonej sposobem według wynalazku z tego samego organizmu;

SEQ ID No: 6 jest sekwencją aminokwasową trzeciej β-glukanazyl, CEA;

SEQ ID No: 7 i 8 są starterami PCR, które hybrydyzują z SEQ ID; 1 (i były użyte do klonowania wstawek cDNA w czasie analizy genetycznej dodatnich transformantów).

Szczegółowy opis wynalazku A. Polinukleotydy

Sposobem według wynalazku dostarcza się (wyizolowanego i/lub oczyszczonego) polinukleotydu kodującego polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku. Sposobem według wynalazku dostarcza się więc polinukleotydu kodującego β-glukanazę, której sekwencja aminokwasowa przed4

PL 209 225 B1 stawiona jest przez SEQ ID No: 2. Sposobem według wynalazku dostarcza się także polinukleotydu kodującego polipepityd, który posiada sekwencję aminokwasową znacząco homologiczną z sekwencją aminokwasową przedstawioną przez SEQ ID No: 2. Sposobem według wynalazku dostarcza się także polinukleotydu wybranego z grupy zawierającej:

(a) polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną przez SEQ ID No: 1, lub do niej komplementarne;

(b) polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową zdolną (na przykład wybiórczo) do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową przedstawioną przez SEQ ID No: 1 jej fragmentami;

(c) polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową zdolną (na przykład wybiórczo) do ( hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową komplementarną do sekwencji nukleotydowej przedstawionej przez SEQ ID No: 1 lub jej fragmentami;

(d) polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową, która ze względu na cechy kodu genetycznego jest zdegenerowana w stosunku do polinukleotydu zdefiniowanego w (a) i (b) lub (c).

Sekwencje zdolne do hybrydyzacji

Termin sekwencje zdolne do hybrydyzacji oznacza, że docelowy polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku może hybrydyzować z kwasem nukleinowym użytym jako sonda (na przykład sekwencją nukleotydową przedstawioną przez SEQ ID No: 1 lub jej fragmentem) na poziomie znacząco różniącym się od tła. Sposób według wynalazku obejmuje także sekwencje nukleotydowe, które kodują β-glukanazę lub jej warianty, a także sekwencje nukleotydowe, które są do niej komplementarne. Sekwencja nukleotydową może być sekwencją RNA lub DNA i obejmuje genomowy DNA, syntetyczny DNA lub cDNA. Korzystnie sekwencja nukleotydowa jest sekwencją DNA, najbardziej korzystnie sekwencją cDNA. Typowo polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku zawiera ciągłą sekwencję nukleotydów, które są zdolne do hybrydyzacji w wybranych warunkach z sekwencją kodującą lub z sekwencją komplementarną do sekwencji kodującej SEQ ID No: 1, co bardziej właści₁ we. Nukleotydy takie można zsyntetyzować metodami dobrze znanymi w dziedzinie wynalazku¹.

Polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku jest zdolny do hybrydyzacji z sekwencją kodującą lub z sekwencją komplementarną do sekwencji kodującej SEQ ID No: 1 (co bardziej właściwe) na poziomie znacząco różniącym się od tła. Hybrydyzacja z tłem może wystąpić, na przykład, ponieważ w bibliotece cDNA występują też inne cDNA. Poziom sygnału (na przykład powstający w wyniku oddziaływania polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku z sekwencją kodującą lub z sekwencją komplementarną do sekwencji kodującej SEQ ID No: 1) jest typowo przynajmniej 10 razy, korzystnie przynajmniej 100 razy silniejszy niż sygnał powstający w wyniku oddziaływania innych polinukleotydów z sekwencją kodującą SEQ ID No: 1. Intensywność tego oddziaływania można mierzyć, na przykład, znakują sondę znacznikiem radioaktywnym, na przykład ³²P. Selektywną hybrydyzację otrzymuje się typowo stosując warunki o niskiej sile (0,3 M chlorek sodu, 0,03 M cytrynian sodu w temperaturze około 40°C), stosując warunki o średniej sile (0,3 M chlorek sodu, 0,03 M cytrynian sodu w temperaturze około 50°C) lub stosując warunki o dużej sile (0,3 M chlorek sodu, 0,03 M cytrynian sodu w temperaturze około 60°C). Hybrydyzację prowadzi się w każdych odpowiednich warunkach znanych w dziedzinie wynalazku¹. Jako wytyczne można przyjąć, że warunki o niskiej sile to 2 x SSC w temperaturze 55°C, że warunki o średniej sile to 0,5 do 1 x SSC w temperaturze 60°C, że warunki o dużej sile to 0,1 do 0,2 x SSC w temperaturze 60°C lub więcej (na przykład w temperaturze 68°C), wszystkie w 0,5% SDS.

Modyfikacje

Polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku może zawierać RNA lub DNA. Może być jednoniciowy lub dwuniciowy. Polinukleotydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą zawierać w sobie jeden lub większą liczbę syntetycznych lub zmodyfikowanych nukleotydów. W sztuce znanych jest wiele różnych typów modyfikacji nukleotydów. Modyfikacje te obejmują szkielet metylofosfonianowy lub fosforotionianowy i/lub dodanie łańcuchów akrydyny lub polilizyny na 3'- i/lub 5'-końcu cząsteczki. Dla celów sposobu według wynalazku przyjmuje się, że opisane tu polinukleotydy można modyfikować każdą z metod znanych w dziedzinie wynalazku. Przyjmuje się także, że w celu odzwierciedlenia używania kodonów przez dany organizm gospodarza, na przykład w którym będą eksprymowane polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku, biegli w dziedzinie wynalazku mogą przy użyciu rutynowych technik dokonać podstawień nukleotydowych, które nie wpływają na sekwencję polipeptydową kodowaną przez polinukletydy wytworzone sposobem według wynalazku.

Sekwencję kodującą SEQ ID No: 1 można modyfikować przez podstawienia nukleotydowe, na przykład od lub do 1, 2 lub 3 do 10, 25, 50 lub 100 podstawień. Polinukleotyd można alternatywnie lub

PL 209 225 B1 dodatkowo zmodyfikować przez jedną lub większą liczbę insercji i/lub delecji i/lub przez dodanie nukleotydów na jednym lub obu końcach. Zmodyfikowany polinukleotyd ogólnie koduje polipeptyd, który ma aktywność β-glukanazy. Można wprowadzić zdegenerowane podstawienia i/lub podstawienia, których wynikiem, kiedy dana sekwencja ulega translacji, są konserwatywne podstawienia aminokwasów, na przykład tak jak to opisano poniżej w odniesieniu do polipeptydów.

Homologi

Sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do selektywnej hybrydyzacji (na przykład do komplementacji) z kodującą sekwencją DNA SEQ ID No: 1 może mieć przynajmniej 50% lub 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80%, przynajmniej 90%, przynajmniej 95%, przynajmniej 98%, przynajmniej 99% identyczności (lub homologii z kodującą sekwencją DNA SEQ ID No: 1. Może to zachodzić w regionie przynajmniej 20, korzystnie przynajmniej 30, na przykład przynajmniej 40, przynajmniej 60, korzystniej przynajmniej 100 ciągłych nukleotydów lub optymalnie na całej długości sekwencji SEQ ID No: 1. Dla sekwencji SEQ ID No: 1 identyczność sekwencji korzystnie wynosi przynajmniej 75% lub 80%. Do określenia polinukletydu wytworzonego sposobem według wynalazku można użyć każdej kombinacji wspomnianych powyżej stopni homologii i minimalnej wielkości regionu, przy czym korzystne są silniejsze kombinacje (to znaczy wyższy stopień homologii nad długością regionu). Na przykład, polinukleotyd, którego stopień homologii wynoszący przynajmniej 80% lub 90% w regionie o długości 25, korzystnie 30 nukleotydów stanowi jeden przykład wykonania sposobu według wynalazku, tak samo jak polinukleotyd, którego stopień homologii wynosi przynajmniej 90% w regionie o długości 40 nukleotydów.

Homologi sekwencji polinukleotydowej (lub białkowej) typowo mają przynajmniej 70%, homologii, korzystnie przynajmniej 80%, 90%, 95%, 97% lub 99% homologii, na przykład 80% w regionie o długości przynajmniej 15, 20, 30, 100 lub więcej ciągłych nukleotydów (lub aminokwasów). Homologię można obliczać w oparciu o identyczność aminokwasów (czasami nazywaną mocną homologią).

Na przykład pakiet UWGCG Package zawiera program BESTFIT który można użyć do obliczenia homologii (na przykład przy użyciu ustawień fabrycznych⁵). Do obliczania homologii sekwencji linowych (takich jak identyfikacja równoważników lub sekwencji pokrewnych, na przykład przy użyciu ustawień fabrycznych^6,7) można użyć algorytmów PILEUP i BLAST.

Oprogramowanie do prowadzenia analizy BLAST jest dostępne publicznie w National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Algorytm obejmuje pierwszą identyfikację par sekwencji z wysokim wynikiem (HSP) przez identyfikację krótkich słów o długości W sekwencji sprawdzanej, które albo spełniają lub są wystarczające do uzyskania założonego poziomu wyniku pozytywnego, po porównaniu ze słowem tej samej długości w sekwencji bazy danych. T określa się jako poziom wyniku dla słów sąsiednich^6,7. Te wyjściowe słowa sąsiednie stanowią podstawę dla przeszukiwania bazy w celu znalezienia HSP zawierających takie słowa. Wybrane słowa są rozszerzane w obie strony wzdłuż każdej sekwencji, dopóki zbiorczy wynik porównania zwiększa się. Rozszerzanie wybranych słów w obu kierunkach jest zatrzymywane kiedy: zbiorczy wynik porównania obniży się o wartość X od swojej najwyższej osiągniętej wartości; w wyniku policzenia jednej lub większej liczby reszt dających wynik negatywny, zbiorczy wynik porównania osiągnie zero lub mniej; lub osiągnięty został koniec jednej z porównywanych sekwencji. Parametry algorytmu BLAST W, T i X określają czułość i szybkość porównania. Nastawy fabryczne programu BLAST to długość słowa (W) wynosi 111 matryca liczenia porównania⁸ BLOSUM62 (B) wynosi 50, wartość oczekiwana (E) wynosi 101 M=51 N=4 i porównuje się oba łańcuchy.

Za pomocą algorytmu BLAST prowadzi się statystyczną analizę podobieństwa pomiędzy dwoma sekwencjami. Jedną z miar podobieństwa obliczaną przez algorytm BLAST jest najmniejsza suma prawdopodobieństwa (P. (N)), która jest wskaźnikiem prawdopodobieństwa z jakim przypadkowo może zajść dopasowanie pomiędzy dwoma badanymi sekwencjami nukleotydowymi lub aminokwasowymi. Na przykład, sekwencję uważa się za podobną do innej sekwencji jeżeli najmniejsza suma prawdopodobieństwa porównania pierwszej sekwencji z drugą sekwencją jest mniejsza niż około 1, korzystnie jest mniejsza niż około 0,1, korzystniej jest mniejsza niż około 0,01 i najkorzystniej jest mniejsza niż 5 około 0,001.

Startery i sondy

Polinukleotydy wytworzone sposobem według wynalazku obejmują i mogą być użyte jako startery, na przykład startery PCR, startery alternatywnej reakcji amplifikacji, jako sondy lub polinukleotydy mogą być włączone w wektory. Takie startery, sondy i inne fragmenty mają długość przynajmniej 20 nukleotydów lub więcej, na przykład długość 25, 30 lub 40 nukleotydów. Typowo mają długość do 40,

PL 209 225 B1

50, 60, 70, 100, 150, 200 lub 300 nukleotydów lub nawet kilku nukleotydów (na przykład długość 5 lub 10 nukleotydów) sekwencji kodującej SEQ ID No: 1.

Ogólnie, startery wytwarza się metodami syntetycznymi, włączając krokowe wytwarzanie pożądanej sekwencji nukleotydowej po jednym nukleotydzie w jednym cyklu reakcji. Metody umożliwiające takie postępowanie wykorzystują zautomatyzowane techniki łatwo dostępne biegłym w sztuce. Przykłady starterów wytworzonych sposobem według wynalazku pokazane są na SEQ ID No: 7 i 8.

Dłuższe polinukleotydy wytwarza się metodami rekombinacyjnymi na przykład przy użyciu technik klonowania metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Obejmuje to wytworzenie pary starterów (na przykład około 15-30 nukleotydów) dla regionu β-glukanazy, który chce się klonować, doprowadzenie do kontaktu pomiędzy mRNA lub cDNA uzyskanego z komórki organizmu docelowego (na przykład drożdży, bakterii, rośliny, organizmu prokariotycznego lub grzyba), korzystnie szczepu Talaromyces, przeprowadzenie reakcji łańcuchowej polimerazy w warunkach, które umożliwiają amplifikację pożądanego regionu, wyizolowanie namnożonego fragmentu (na przykład przez oczyszczenie mieszaniny reakcyjnej na żelu agarozowym) i odzyskanie namnożonego DNA.

Startery można zaprojektować tak, żeby zawierały przydatne miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, dzięki czemu namnożony DNA można włączyć w odpowiedni wektor do klonowania.

Takie techniki mogą być użyte do uzyskania całego lub części opisanej tu sekwencji β-glukanazy. Klony genomowe odpowiadające cDNA SEQ ID No: 1, lub genu β-glukanazy zawierające, na przykład, introny, regiony promotorowe objęte są również przez zakres sposobu według wynalazku i mogą być uzyskane analogicznymi metodami (na przykład metodami rekombinacyjnymi, technikami PCR, klonowania), wychodząc z genomowego DNA grzybów, drożdży, bakterii, roślin lub komórek prokariotycznych.

Polinukleotydy lub startery mogą zawierać znaczniki, na przykład znaczniki radioaktywne lub nieradioaktywne. Przydatne znaczniki obejmują radioizotopy, takie jak ³²P lub ³⁵S, znaczniki enzymatyczne lub inne znaczniki, takie jak biotyna. Takie znaczniki można dodać do polinukleotydów lub starterów wytworzonych sposobem według wynalazku i mogą być wykryte przy użyciu znanych w dziedzinie wynalazku.

Polinukleotydy, znakowane i nieznakowane mogą być użyte w opartych na kwasach nukleinowych testach do wykrywania lub sekwencjonowania β-glukanazy lub jej wariantów (na przykład grzybowych) w badanej próbce. Takie testy do wykrywania obejmują na przykład doprowadzenie do kontaktu pomiędzy próbką (na przykład grzybową) podejrzaną o zawieranie DNA β-glukanazy z sondą lub starterem wytworzonym sposobem według wynalazku w warunkach umożliwiających hybrydyzację i wykrycie jakiegokolwiek dupleksu tworzącego się pomiędzy sondą i kwasem nukleinowym badanej próbki. Wykrywanie takie prowadzi się przy pomocy technik takich jak PCR lub immobilizacji sondy na stałym podłożu, po usunięciu kwasu nukleinowego próbki, który nie hybrydyzuje z sondą, wykrywa się kwas nukleinowy, który hybrydyzował z sondą. Alternatywnie, na stałym podłożu immobilizuje się badaną próbkę kwasu nukleinowego i wykrywa się ile sondy związało się z takim podłożem.

Sondy wytworzone sposobem według wynalazku dla wygody pakuje się w postaci zestawów testowych w odpowiednie pojemniki. W takich zestawach testowych sonda może być związana ze stałym podłożem, jeżeli sposób testowania dla którego zaprojektowany jest ten zestaw testowy wymaga takiego wiązania. Zestaw może zawierać także odpowiednie odczynniki do traktowania badanej próbki, hybrydyzacji sondy z kwasem nukleinowym próbki, odczynniki kontrolne, instrukcje i tym podobne.

Korzystnie, polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku uzyskuje się z tego samego organizmu jak polipeptyd, takiego jak grzyb, szczególnie grzyb z rodzaju Talaromyces.

Polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku obejmuje także warianty sekwencji SEQ ID No: 1, które mają aktywność β-glukanazy. Warianty można tworzyć przez dodania, podstawienia i/lub delecje i mogą mieć zdolność do przecinania polimeru 0-D-glukanu.

Wytwarzanie polinukleotydów

Polinukleotydy, które nie mają 100% identyczności z SEQ ID No: 1, ale które zawierają się w zakresie sposobu według wynalazku można otrzymać kilkoma różnymi metodami. Opisane tu warianty sekwencji β-glukanazy otrzymuje się przez sondowanie bibliotek genomowego DNA różnych organizmów, na przykład tych, które opisuje się jako źródło polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku. Ponadto, można otrzymać inne grzybowe, roślinne lub prokariotyczne homologi β-glukanazy, i takie homologi lub ich fragmenty są przeważnie zdolne do hybrydyzacji z SEQ ID No: 1. Takie sekwencje można otrzymać przez sondowanie bibliotek cDNA lub genomowego DNA innych organizmów, i sondowanie takich bibliotek sondami zawierającymi całą lub część SEQ ID No: 1,

PL 209 225 B1 w ś rednich lub ostrych warunkach hybrydyzacji (opisanych wcześ niej). Do sondowania bibliotek cDNA innych organizmów, na przykład tych, które opisuje się jako źródło polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku można użyć sond kwasu nukleinowego zawierających całą lub część SEQ ID No: 1.

Homologi z innych gatunków można otrzymać także przy użyciu zdegenerowanego PCR, w którym używa się starterów zaprojektowanych dla sekwencji docelowych wariantów i homologów kodujących konserwowane sekwencje aminokwasów. Startery mogą zawierać jedną lub więcej zdegenerowanych pozycji i są używane w mniej ostrych warunkach hybrydyzacji niż te używane do klonowania sekwencji ze starterami dla pojedynczej sekwencji znanych sekwencji.

Alternatywnie, takie polinukleotydy można otrzymać metodą mutagenezy skierowanej miejscowo z sekwencji β-glukanazy lub jej wariantów. Takie podejście, może być użyteczne jeżeli pożądane są na przykład ciche zmiany kodonów sekwencji w celu jej optymalizacji pod kątem preferencji kodonowych określonego rodzaju komórek gospodarza, w których sekwencje polinukleotydowe będą eksprymowane. Inne zmiany sekwencji mogą być pożądane, w celu wprowadzenia miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne, lub w celu zmiany właściwości lub działania polipeptydu kodowanego przez te polinukleotydy.

Sposób według wynalazku obejmuje dwuniciowe polinukleotydy zawierające polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku i polinukleotyd komplementarny.

Sposobem według wynalazku dostarcza się także polinukleotydów kodujących opisane poniżej polinukleotydy wytworzone sposobem według wynalazku. Ponieważ polinukleotydy takie są użyteczne jako sekwencje do wytwarzania rekombinowanych polinukleotydów wytworzonych sposobem według wynalazku i nie jest konieczne, żeby były one zdolne do hybrydyzacji z sekwencją SEQ ID No: 1, chociaż ogólnie jest to pożądane. W innym przypadku, jeśli to jest pożądane takie polinukleotydy można znakować, używać i wykonać tak jak to opisano powyżej.

B. Polipeptydy

Jak wspomniano powyżej wynalazek dotyczy (na przykład (znacząco) oczyszczonych i/lub wyizolowanych) β-glukanaz (lub celulaz) i ich wariantów. Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku zawierają całkowicie sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 2, 4 lub 6 lub wariant tych sekwencji. Polipeptydy te mogą być także kodowane przez opisane powyżej polinukleotydy wytworzone sposobem według wynalazku.

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być w formie izolatu lub znacząco oczyszczonej. Zrozumiałe jest, że polipeptyd można zmieszać z nośnikami lub rozcieńczalnikami, które nie wpływają na zamierzone użycie i/lub działanie polipeptydu i takie polinukleotydy ciągle są uważane za znacząco oczyszczone. Zawierają one polipeptyd w preparacie, w którym jest więcej niż 20%, na przykład więcej niż 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% lub 99% wagowych polipeptydu w preparacie, jest on polipeptydem wytworzonym sposobem według wynalazku. Do oczyszczenia i/lub syntezy białek wytworzonych sposobem według wynalazku można użyć rutynowych metod. Dla niektórych formuł (na przykład dla zastosowania niefarmaceutycznego) ilość obecnego polipeptydu może być niewielka, na przykład od 0,01% do 10%, taka jak 0,1% do 5% lub 2% lub nawet 0,2% do 1%.

Korzystnie, polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku otrzymuje się z mikroorganizmu, który posiada gen kodujący enzym o aktywności β-glukanazy (lub celulazy).

Korzystniej, mikroorganizmem jest grzyb, optymalnie grzyb lamentujący. Korzystnym organizmem są grzyby z rodzaju Talaromyces, takie jak Talaromyces emersonii.

Aktywność

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą mieć jedną lub więcej z poniższych cech:

(1) mieć aktywność p-glukanazy (lub celulazy), (2) optymalne pH w zakresie od 3 do 6,5 lub 7, takie, jak 4 do 5,5 lub 6,0, optymalnie od 4,5 do 5,0 (3) optymalną aktywność w temperaturze od 30°C do 100°C, takie, jak 60°C do 95°C, 9 optymalnie od 75°C lub 85°C do 90°C. Korzystnie optymalną temperaturą jest temperatura przynajmniej 75°C, taka jak przynajmniej 850C;

(4) ma masę cząsteczkową (cząsteczka deglikozylowana) od 20 do 60 kDa, korzystnie od 20 do 25, 35 do 45 lub 23 do 50 kDa, optymalnie od 36 do 40 kDa lub (cząsteczka glikozylowana) od 40 do kDa;

(5) ma punkt izoelektryczny od 3,0 do 3,6 lub 5,0, 3,8 do 4,5, 4,5 do 5,0 lub od 6,0 do 7,0; i/lub

PL 209 225 B1 (6) ma aktywność hydrolityczną w stosunku do β-glukanu ze zboża lub ma aktywność hydrolityczną poniżej pH 7.

Polipeptyd ma aktywność enzymu EC 3.2.1.4 (lub aktywność endoglukanazy). Ogólnie, może to być endohydroliza wiązania 1,4-e-D-glikozydowych celulozy. „Aktywność β-glukanazy jest zdolnością do cięcia celulozy lub polimerów β-glukanu (na przykład takich jakie występują w roślinach, na przykład owsie lub jęczmieniu). Taka aktywność pozwala na cięcie pomiędzy sąsiednimi końcowymi i/lub nie-końcowymi resztami. Korzystnie następuje cięcie wiązania [glukoza (1-4), (1-3) lub (1-6) glukoza]. Polipeptyd może korzystnie ciąć pomiędzy dwoma sąsiednimi resztami (na przykład niepodstawionymi glukozami). Może więc mieć aktywność endo (to znaczy może być endoglukanazą). Substrat polimerowy może być, albo nie być podstawiony. Korzystnie polipeptyd nie ma aktywności ksylanazy.

Polipeptyd może mieć aktywność celulazy, to oznacza, ze jest aktywny lub może ciąć celulozę. Ponieważ β-glukan jest składnikiem celulozy, wszystkie glukanazy mieszczą się w szerokim znaczeniu określenia celulazy. Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku są więc celulazami, ponieważ należą do podklasy glukanaz. Oprócz endoglukanaz (wymienione powyżej EC 3.2.1.4) w skład celulaz wchodzą też egzoglukanazy/celobiohydrolazy (EC 3.2.1.91), β-glukozydazy (EC 3.2.1.21), endo-1,6-glukanazy (EC 3.2.1.75), egzo-1,3-glukanazy (EC 3.2.1.58), mannanazy (EC 3.2.1.78) i endo-glikoceramidazy (EC 3.2.1.123). Wnioskując z sekwencji i struktury, oraz porównując je ze znanymi enzymami z rodziny hydrolaz do której należą, niektóre z polipeptydów mają jedną, dwie lub większą liczbę tych dodatkowych rodzajów aktywności. W opisie, jeżeli kontekst jest odpowiedni, aktywność glukanazy oznacza aktywność celulazy. Lista aktywności (celulazy) peptydów opisana jest w przykładzie 11 poniżej.

Korzystnie polipeptyd należy do jednej z rodzin 5, 7 lub 45, według klasyfikacji hydrolaz glukozydowych (CAZy). Polipeptyd może być glu/glu lub asp/asp nukleofilowym donorem protonów.

Warianty i homologi

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową pokazaną w SEQ ID No: 2, lub całkowicie homologiczną sekwencję, lub fragment jednej z tych sekwencji i ma aktywność β-glukanazy. Korzystna jest występująca w naturze sekwencja aminokwasowa pokazana w SEQ ID No: 2.

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku zawiera:

(i) sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 2; lub (ii) wariant (i), który jest zdolny do cięcia β-D-glukanu, posiadający co najmniej 80% identyczności względem pełnej długości SEQ ID no: 2 lub co najmniej 80% identyczności względem regionu 150 sąsiadujących aminokwasów sekwencji aminokwasowej SEQ ID No: 2. Wariant może występować w naturze, w komórkach grzybów, bakterii, drożdży lub roślin, w których działa w sposób podobny do białka SEQ ID No: 2, na przykład ma aktywność β-glukanazy. Podobnie, gatunkowy odpowiednik białka będzie równoważnym białkiem, które występuje w naturze w innych gatunkach i które działa jako enzym β-glukanaza. Warianty obejmują warianty alleliczne z tego samego szczepu jak polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku lub z innego szczepu, ale tego samego rodzaju lub tego samego gatunku.

Warianty i homologi gatunkowe otrzymuje się według następujących procedur opisanych w tym opisie dla wytwarzania polipeptydu o SEQ ID No: 2 i przeprowadza się takie procedury na odpowiednim źródle komórek, komórek bakterii, drożdży, grzybów lub roślin. W celu otrzymania klonów zawierających warianty i homologi gatunkowe, do badania bibliotek uzyskanych z komórek drożdży, bakterii, grzybów lub roślin można także użyć zdefiniowanych powyżej sond. Klony obrabia się tradycyjnymi technikami w celu otrzymania polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku, a te z kolei wytwarza się znanymi technikami rekombinacji lub syntetycznymi.

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku korzystnie ma przynajmniej 70% identyczność sekwencji z białkiem SEQ ID No: 2, bardziej korzystnie ma przynajmniej 80%, przynajmniej 90%, przynajmniej 95%, przynajmniej 97%, przynajmniej 99% identyczność sekwencji z tym białkiem, na przykład w regionie przynajmniej 60, przynajmniej 100, 150, 200 lub 300 kolejnych aminokwasów lub na całej długości SEQ ID No: 2. Dla SEQ ID No: 2, identyczność sekwencji wynosi korzystnie przynajmniej 70%.

Sekwencja polipeptydu SEQ ID No: 2, jej wariantów i homologów gatunkowych może być modyfikowana w celu otrzymania polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku. Można zrobić podstawienia aminokwasowe, na przykład od lub do 1, 2 lub 3 do 10, 20, 30, 50 lub 100 podstawień. Można także zrobić taką samą liczbę delecji i/lub insercji. Zmian tych można dokonać poza rePL 209 225 B1 gionem krytycznym dla działania polipeptydu, tak więc w ich wyniku otrzymuje się wciąż aktywny enzym. Zmodyfikowane enzymy generalnie zachowują aktywność β-glukanazy.

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku obejmują fragmenty opisanych powyżej polipeptydów pełnej długości i ich wariantów, włączając fragmenty sekwencji pokazanej jako SEQ ID No: 2. Takie fragmenty typowo zachowują aktywność β-glukanazy. Fragmenty mają przynajmniej długość 50, 100, 150, 200 lub 250 aminokwasów, lub są krótsze o tę liczbę aminokwasów od pełnej długości sekwencji (pokazanej jako SEQ ID No: 2).

Jeśli to konieczne polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku wytwarza się sposobami syntetycznymi, chociaż przeważnie wytwarza się je opisanymi poniżej metodami rekombinacyjnymi. W celu ułatwienia ich identyfikacji lub oczyszczania można je modyfikować, na przykład przez dodanie reszt histydyny lub znacznika T7, lub przez dodanie sekwencji sygnałowej w celu umożliwienia ich wydzielania na zewnątrz komórki.

Termin „warianty oznacza polipeptydy, które mają całkowicie taki sam charakter lub podstawowe działanie biologiczne jak β-glukanaza (lub celulaza), i obejmuje warianty alleliczne. Całkowicie taki sam charakter jak β-glukanaza oznacza, że jest to enzym mający aktywność EC 3.2.1.4 lub, że może przecinać wiązania 1>3, 1 >4 i/lub 1 >6 β-D-glukanu, takiego jak β-glukan zbóż lub pszenicy. Korzystnie wariant polipeptydu ma taką samą aktywność jak β-glukanaza. Polipeptyd mający całkowicie taki sam charakter jak β-glukanaza można zidentyfikować przy użyciu testu degradacji celulozy lub β-glukanu, takiego jak na przykład test opisany poniżej.

Warianty SEQ ID No: 2 obejmują także sekwencje, które różnią się od SEQ ID No: 2, lub które niekoniecznie pochodzą od występujących w naturze białek β-glukanazy. Te warianty opisuje się jako mające % identyczności z SEQ ID No: 2, lub jako mające pewną liczbę podstawień w sekwencji. Alternatywnie, warianty mogą być kodowane przez polinukleotydy, które hybrydyzują z SEQ ID No: 1.

Warianty takie mogą być określone w podobny sposób jak warianty SEQ ID No: 1. Warianty takie mogą zawierać warianty sekwencji pochodzących z innych szczepów Talaromyces. Takie warianty znajduje się w innych szczepach Talaromyces dzięki badaniu aktywności β-D-glukanazy, klonowaniu i sekwencjonowaniu, tak jak poprzednio. Dopóki badany polipeptyd zachowuje podstawowe działanie biologiczne jak β-glukanaza, warianty obejmują delecje, modyfikacje lub addycje pojedynczych aminokwasów lub grup aminokwasów w obrębie sekwencji białka.

Podstawień konserwatywnych dokonuje się na przykład według następującej tabeli. Aminokwasy w tym samym bloku w drugiej kolumnie i korzystnie w tej samej linii w trzeciej kolumnie mogą się wzajemnie wymieniać. Korzystne podstawienia nie wpływają na składanie lub aktywność polipeptydu.

Alifatyczne	Niepolarne	GAP.
I LV
Polarne bez ładunku	CSTM.
N Q
Polarne z ładunkiem	D E
K R
Aromatyczne		HFWY

Krótsze sekwencje polipeptydowe są także objęte zakresem sposobu według wynalazku. Przyjmuje się, że polipeptyd o długości od lub do 60, 70, 80, 100, 150 lub 200 aminokwasów wchodzi w zakres sposobu według wynalazku, dopóki zachowuje podstawowe działanie biologiczne jak β-glukanaza. Szczególnie, chociaż bez ograniczania, ten przykład wykonania sposobu według wynalazku dotyczy przypadku, w którym białko jest fragmentem kompletnej sekwencji białkowej i zawiera lub jest regionem wiązania β-D-glukanu (lub mannozy) lub regionem cięcia β-D-glukanu (lub celulozy).

Modyfikacje

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być modyfikowane chemicznie, na przykład modyfikowane posttranslacyjnie. Na przykład, mogą być glikozylowane, (jeden lub większą liczbę razy, tym samym lub różnymi cukrami) lub zawierać zmodyfikowane reszty aminokwasowe. Mogą być także modyfikowane przez dodanie reszt histydynowych (w celu ułatwienia oczyszczania białka) lub przez dodanie sekwencji sygnałowych (w celu ułatwienia wnikania w błonę komórkową). Polipeptyd może mieć jeden lub więcej dodatków na (N) amino- lub (C) karboksy- końcu, na przykład

PL 209 225 B1 końcową resztę metioniny, mały peptyd łączący do około 20-25 reszt, lub (małe) dodatki ułatwiające oczyszczanie, takie jak polihistydyna lub znacznik T7, epitop antygenowy lub (na przykład na C-końcu) domenę wiążącą¹⁴ (na przykład maltozę). Te dodatki mogą być dodane z wykorzystaniem lub bez wykorzystania łącznika.

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może być znakowany rozpoznawalnym znacznikiem. Rozpoznawalnym znacznikiem może być każdy odpowiedni znaczniki który pozwala na wykrycie polipeptydu. Odpowiednie znaczniki obejmują radioizotopy, na przykład ¹²⁵I, ³⁵S, enzymy, przeciwciała, polinukleotydy i łączniki, takie jak biotyna.

Polipeptydy można zmodyfikować taki żeby zawierały aminokwasy, które nie występują w przyrodzie lub w celu zwiększenia stabilności polipeptydu. Jeżeli polipeptyd lub białko wytarza się metodami syntetycznymi takie aminokwasy można wprowadzić w czasie wytwarzania. Białka lub polipeptydy można także modyfikować po wytworzeniu metodami syntetycznymi lub rekombinacji.

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku można także wytwarzać przy użyciu, lub mogą one zawierać (jeden lub większą liczbę) D-aminokwasów. W dziedzinie wynalazku znanych jest kilka modyfikacji łańcucha bocznego i można je wprowadzić dla łańcuchów bocznych białek lub polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku. Takie modyfikacje obejmują na przykład, modyfikacje aminokwasów przez alkilacje redukującą w reakcji z aldehydem, a następnie redukcję NaBH4, amidowanie przy użyciu metyloacetamidu lub acylowania przy użyciu bezwodnika octowego.

Sekwencje dostarczone sposobem według wynalazku mogą być użyte jako materiał wyjściowy do konstrukcji enzymów drugiej generacji. Glukanazy drugiej generacji są glukanazami zmienionymi technikami mutagenezy (na przykład mutagenezy ukierunkowanej miejscowo), których własności różnią się od własności glukanaz typu dzikiego lub glukanaz rekombinowanych, takich jak te wytworzone sposobem według wynalazku. Na przykład mogą mieć zmienione optimum pH, specyficzność aktywności, powinowactwo do substratu lub termostabilność, w taki sposób, żeby lepiej się dopasowały do zastosowań w określonym procesie.

Aminokwasy niezbędne dla aktywności glukanaz wytworzonych sposobem według wynalazku, i dlatego najbardziej korzystne dla modyfikacji, można określić procedurami znanymi w dziedzinie wynalazku, takimi jak mutageneza ukierunkowana miejscowo lub mutageneza z wyszukiwaniem alanin¹⁰. W tej drugiej technice mutacje wprowadza się w każdej reszcie aminokwasowej cząsteczki, a powstające zmutowane cząsteczki bada się pod kątem aktywności biologicznej (na przykład aktywności glukanazy) w celu zidentyfikowania reszty aminokwasowej najważniejszej dla aktywności cząsteczki. Miejsca oddziaływania enzym-substrat można także określić przy pomocy krystalograficznej analizy struktury, określonej takimi technikami jak jądrowy rezonans magnetyczny, krystalografia lub znakowania metodą foto-powinowactwa^11,12,13 lub modelowanie cząsteczkowe.

Użycie jako komórek gospodarza komórek drożdży lub grzybów powinno dostarczyć takich modyfikacji posttranslacyjnych (na przykład obróbki proteolitycznej, merystylacji, glikozylacji, defosforylacji i fosforylacji reszt tyrozynowych, serynowych i treoninowych), które mogą być potrzebne do osiągnięcia optymalnej aktywności biologicznej rekombinowanych produktów ekspresji wytworzonych sposobem według wynalazku.

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku można dostarczyć w takiej postaci, że występują poza swoim naturalnym środowiskiem komórkowym. W ten sposób mogą być łatwo wyizolowane i oczyszczone, lub w komórkach w których nie występują w naturze, na przykład w komórkach innych gatunków grzybów, zwierząt; drożdży lub bakterii.

C. Rekombinacja

Sposobem według wynalazku dostarcza się także wektorów zawierających polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku, włączając wektory do klonowania i wektory do ekspresji oraz metod do hodowli, transformowania lub transfekowania takich wektorów do odpowiednich komórek gospodarza, na przykład w warunkach, w których zachodzi ekspresja polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku. Dostarcza się także komórek gospodarza zawierających polinukleotyd lub wektor wytworzony sposobem według wynalazku, znamiennych tym, że polinukleotyd jest heterogenny w stosunku do genomu komórek gospodarza. Termin „heterogenny, zwykle w odniesieniu do komórek gospodarza, oznacza, że w naturze polinukleotyd nie występuje w genomie komórek gospodarza lub polinukleotyd nie jest wytarzany przez te komórki. Korzystnie komórkami gospodarza są komórki drożdży, na przykład komórki drożdży z rodzaju Kluyveromyces lub Saccharomyces lub komórki grzybów, na przykład z rodzaju Aspergillus.

PL 209 225 B1

Polinukleotydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być włączone w rekombinowany wektor replikujący, na przykład wektor do klonowania i wektor do ekspresji. Wektor może być użyty do replikacji kwasu nukleinowego w kompatybilnych komórkach gospodarza. W tym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku dostarcza się metody otrzymywania polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku przez wprowadzenie polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku do wektora do replikacji, wprowadzenie tego wektora do kompatybilnych komórek gospodarza i hodowania takich komórek gospodarza w warunkach, w których zachodzi replikacja wektora. Wektor można odzyskać z komórek gospodarza. Odpowiednie komórki gospodarza opisane są poniżej w połączeniu z wektorami do ekspresji.

Wektory

Polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku można włączyć w kasetę do ekspresji. Wektorem do którego wstawia się kasetę do ekspresji lub polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku może być każdy wektor, który łatwo jest poddać procedurom rekombinacji DNA, a jego wybór zależy często od komórek gospodarza do których ma być wprowadzony. Wektor taki może by wektorem replikującym się autonomicznie, to znaczy wektorem który istnieje jako cząstka pozachromosomowa, a jego replikacja jest niezależna od replikacji chromosomów, na przykład plazmid. Alternatywnie, wektor po wprowadzeniu do komórki gospodarza może się integrować z jej genomem, a jego replikacja będzie następowała razem z replikacją chromosomu w który się włączył. Korzystnie, polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku jest połączony w wektorze czynnościowo z sekwencją regulatorową, która jest zdolna do wywołania ekspresji sekwencji kodującej w komórkach gospodarza, to znaczy wektor jest wektorem do ekspresji. Termin „połączony funkcjonalnie oznacza takie położenie, w którym opisane komponenty znajdują się w zależności umożliwiającej im funkcjonowanie w sposób w jaki powinny funkcjonować. Sekwencja regulatorowa, taka jak promotor, sekwencja wzmacniająca lub inny sygnał regulujący ekspresję „połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą jest umiejscowiony w taki sposób, że ekspresję sekwencji kodującej uzyskuje się w warunkach zgodnych z sekwencją kontrolną.

Wektor może być plazmidem, kosmidem, wirusem lub wektorem fagowym, zwykle dostarczanym z początkiem replikacji, ewentualnie z promotorem dla ekspresji polinukleotydu i ewentualnie z sekwencją wzmacniającą i/lub regulatorem promotora. Obecna może być sekwencja terminatora, tak jak sekwencja poliadenylacji. Wektor może zawierać jeden lub większą liczbę genów markerowych do selekcji, na przykład gen oporności na ampicylinę (w przypadku plazmidów bakteryjnych) lub gen oporności na neomycynę (w przypadku wektorów ssaczych). Wektorów można używać in vitro, na przykład do wytwarzania RNA lub do transfekowania lub transformowania komórek gospodarza. Wektory mogą zawierać dwa lub większą liczbę polinukleotydów wytworzonych sposobem według wynalazku, na przykład w celu uzyskania nadekspresji.

Sekwencja DNA kodująca polinukleotyd jest korzystnie wprowadzona do odpowiedniego gospodarza jako część kasety ekspresyjnej (lub konstruktu) w których sekwencja DNA jest połączona funkcjonalnie z sygnałami ekspresji, i które są zdolne do kierowania ekspresją sekwencji DNA w komórkach gospodarza. W celu transformowania odpowiednich komórek gospodarza konstruktem do ekspresji używa się procedur transformacji, które są dobrze znane biegłym w dziedzinie wynalazku^3,4.

Konstruktu do ekspresji można użyć do transformowania komórek gospodarza jako części wektora niosącego marker selekcyjny, lub konstrukt do ekspresji można transformować jako oddzielną cząsteczkę razem z wektorem niosącym marker selekcyjny. Wektor może zawierać dwa lub więcej genów markerowych. Korzystne markery selekcyjne^15,16 obejmują ale nie są ograniczone do tych genów, które komplementują defekt komórek gospodarza lub dają oporność na leki. Obejmują one, na przykład różne geny markerowe, które mogą być użyte do transformowania większości grzybów filamentujących i drożdży, takie jak geny acetamidazy lub cDNA (geny amdS, niaD, facA lub cDNA z A.nidulans, A.oryzae lub A.niger), lub geny dające oporność na antybiotyki, takie jak G418, higromycyna, bleomycyna, kanamycyna, fleomycyna lub benomycyna (benA). Alternatywnie, specyficzne markery selekcyjne mogą być używane jako markery auksotroficzne, których użycie wymaga odpowiednich zmutowanych szczepów gospodarza: na przykład URA3 (z S.cerevisiae lub analogicznych genów z innych drożdży), pyrG lub pyrA (z A.nidulans lub A.niger), agrB (z A.nidulans lub A.niger) lub trpC. W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku marker selekcyjny jest usunięty z transformowanych komórek gospodarza po wprowadzeniu konstruktu ekspresyjnego, tak więc otrzymuje się transformowane komórki gospodarza zdolne do wytwarzania polinukleotydu, które są wolne od genów markerowych ^21,22.

PL 209 225 B1

Inne markery obejmują syntazę ATP, podjednostkę 9 (oliC), dekarboksylazę orotydyno-5'-fosforanu (pvrA), bakteryjny gen oporności na G418 (ten można użyć w drożdżach, ale nie w grzybach), gen oporności na ampicyliną (E. coli), gen oporności na neomycynę (Bacillus) i gen uidA E.coli kodujący glukoronidazę (GUS). Wektory mogą być używane in vitro, na przykład do wytwarzania RNA lub do transfekowania lub transformowania komórek gospodarza.

Dla większości grzybów filamentujących i drożdży, wektor lub konstrukt ekspresyjny jest korzystnie włączony w genom komórek gospodarza w celu uzyskania stałych transformantów. Jednakże, dla pewnych drożdży dostępne są także odpowiednie wektory episomowe, w które można włączyć konstrukt ekspresyjny w celu uzyskania stałej ekspresji na wysokim poziomie. Przykłady takich wektorów obejmują wektory pochodzące od plazmidów 2μ i pKDl z odpowiednio, Saccharomyces i Kluyveromyces lub wektory zawierające sekwencję AMA (na przykład AMA1 z Aspergillus^3,20). W przypadku, w którym wektory ekspresyjne są włączone w genom komórek gospodarza, konstrukty są albo włączone w losowe loci w genomie, lub w loci docelowe we wcześniej określone przy użyciu rekombinacji homologicznej. W tym ostatnim przypadku loci docelowe są korzystnie genami o wysokiej ekspresji. Gen o wysokiej ekspresji jest genem, którego mRNA stanowi przynajmniej 0,01% (wagowo/wagowy) całkowitego komórkowego mRNA, na przykład w warunkach indukcji, lub ewentualnie genem, którego produkt stanowi przynajmniej 0,2% (wagowo/wagowy) całkowitego komórkowego białka, lub w przypadku wydzielanego produktu genu, może być wydzielany w ilości przynajmniej 0,05 g/l. Przykłady odpowiednich genów o wysokiej ekspresji przedstawione są poniżej.

Wektor lub konstrukt ekspresyjny dla danych komórek gospodarza może zawierać następujące elementy połączone czynnościowo kolejno jeden z drugim od 5'-końca do 3'-końca w stosunku do nici kodującej sekwencji kodującej polipeptyd według pierwszego wynalazku:

(1) sekwencję promotorową, która w danych komórkach gospodarza jest zdolna do wywołania ekspresji sekwencji DNA kodującej polipeptyd, (2) ewentualnie, sekwencję sygnałową, która jest zdolna do skierowania sekrecji polipeptydu z danych komórek gospodarza do podłoża hodowlanego, (3) sekwencję DNA kodującą dojrzałą i korzystnie aktywną formę polipeptydu i korzystnie także, (4) region terminacji transkrypcji (terminator) zdolny do zakończenia transkrypcji poniżej sekwencji DNA kodującej polipeptyd.

Poniżej sekwencji DNA kodującej polipeptyd może znajdować się nie ulegający translacji region 3' zawierający jeden lub więcej miejsc terminacji transkrypcji (na przykład terminatorów). Pochodzenie terminatorów jest mniej ważne. Terminatory mogą być, na przykład natywne w stosunku do sekwencji DNA kodującej polipeptyd. Jednakże, korzystnie terminator drożdżowy używany jest w drożdżowych komórkach gospodarza, a terminator grzybów filamentujących używany jest w komórkach gospodarza grzybów filamentujących. Bardziej korzystnie terminator jest endogenny dla komórek gospodarza (w których sekwencja DNA kodująca polipeptyd ma być eksprymowana).

Zwiększoną ekspresję polinukleotydu kodującego polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku uzyskuje się także przez selekcję heterogennych regionów regulatorowych, na przykład promotora, sekwencji sygnałowej sekrecji i/lub regionu terminatora, które służą do zwiększenia ekspresji i, jeśli to konieczne, poziomu wydzielania interesującego białka z komórek gospodarza i/lub do zapewnienia indukowanej kontroli ekspresji polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku.

Do uzyskania bezpośredniej ekspresji polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku, oprócz promotorów natywnych dla genów kodujących polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku można użyć innych promotorów. Promotor można wybrać pod kątem jego wydajności w kierowaniu ekspresją polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku w pożądanych komórkach gospodarza.

Promotory/sekwencje wzmacniające i inne sygnały regulacji ekspresji można wybrać tak, żeby były kompatybilne z komórkami gospodarza dla których zaprojektowany został wektor do ekspresji. Na przykład, można użyć prokariotycznych promotorów, szczególnie tych odpowiednich do użycia w szczepach E.coli. Jeżeli ekspresję prowadzi się w komórkach ssaków, używa się promotorów ssaków. Można także użyć promotorów specyficznych dla tkanek, na przykład promotorów specyficznych dla komórek hepatocytów. Można także użyć promotorów wirusowych, na przykład terminalnych długich sekwencji powtarzających wirusa mysiej białaczki Moloney'a (MMLV LTR), promotora LTR wirusa mięsaka Rousa (RSV), promotorów SV40 (na przykład dużego antygenu T), promotora IE ludzkiego cytomegalowirusa (CMV), promotorów wirusa opryszczki lub promotorów adenowirusów, promotorów HSV, takich jak promotora IE HSV, lub promotorów HPV, szczególnie regionów regulatorowych powyPL 209 225 B1 żej sekwencji kodującej HPV (DRR). Promotory drożdżowe obejmują promotory GAL4 i ADH S.cerevisiae, promotory nmtl i adh S.pombe. Promotory ssaków obejmują promotor metalotioneiny, który może być indukowany w odpowiedzi na metale ciężkie, takie jak kadm lub promotor β-aktyny. Szczególnie korzystne są promotory specyficzne dla tkanek, szczególnie promotory specyficzne dla komórek nabłonkowych i nerwowych (na przykład promotory DDAHI i DDAHII).

Do kierowania transkrypcją w komórkach gospodarza wytworzonych sposobem według wynalazku można użyć wiele promotorów ^15,16. Korzystne sekwencje promotorowe pochodzą od genów ulegających wysokiej ekspresji, tak jak to opisano poprzednio. Przykłady korzystnych, ulegających wysokiej ekspresji genów z których korzystnie wyprowadza się promotory i/lub które są zawarte w korzystnych wcześniej określonych loci docelowych dla włączenia konstruktów ekspresyjnych, obejmują ale bez ograniczania, geny kodujące enzymy glikolityczne, takie jak izomerazy fosforanów trioz (TPI) dehydrogenazy fosforany gliceryloaldehydu (GADPH), kinazy fosfoglicerynianowe (POK), kinazy pirognonianowe (POK), dehydrogenazyalkoholowe (ADH), a także geny kodujące amylazy, glukoamylazy, proteazy, ksylanazy, celobiohydrolazy, β-galaktozydazy, oksydazy alkoholowe (metanolu) czynniki wydłużania i białka rybosomowe. Specyficzne przykłady odpowiednich ulegających wysokiej ekspresji genów obejmują, na przykład gen LAC4 z Kluyveromyces SP., geny oksydazy metanolu (AOX i MOX) odpowiednio z Hansenula i Pichia, geny glukoamylazy (glaA) z A.niger i A.awamori, gen TAKA-amylazy A. ozyrae, gen gpdA z A.nidulans i geny celobiohydrolazy T.reesei.

Przykładami silnych konstytutywnych i/lub indukowanych promotorów, które są korzystne do użycia w grzybowych komórkach do ekspresji^15,16, są promotory otrzymane z genów grzybów, takich jak ksylanaza (xlnA), fitazy, syntazy ATP, podjednostki 9 (oliC), izomerazy fosforanów trioz (tpi), dehydrogenaza alkoholowa (AdhA), α-amylaza (amy), amyloglukonidaza (promotor AG z genu glaA), acetamidaza (amdS) i dehydrogenaza gliceryloaldehydo-3-fosforanu (gpd).

Przykładami silnych promotorów drożdżowych są promotory otrzymane z genów takich jak dehydrogenaza alkoholowa, laktaza, kinaza 3-fosfoglicerynianu i izomeraza fosfotrioz.

Przykładami silnych promotorów bakteryjnych są promotory otrzymane z genów takich jak α-amylaza i SPo2 a także promotory genów proteaz zewnątrzkomórkowych.

Promotory odpowiednie dla komórek roślinnych obejmują promotory syntazy nopaliny (nos), syntazy oktopiny (ocs), syntazy mannopiny (mas), małej podjednostki rybulozy (rubisco ssu), histonów, aktyny ryżu, faseolint, wirusa mozaiki kalafiorowej (CMV) 358 i 19S i cirkowirusa. Wszystkie te promotory są dobrze znane w dziedzinie wynalazku.

Wektor może zawierać także sekwencje flankujące polinukleotyd, które powodują, że powstający RNA zawiera sekwencje homologiczne do eukariotycznych sekwencji genomowych, korzystnie sekwencji genomowych ssaków lub wirusowych sekwencji genomowych. Pozwala to na wprowadzenie polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku do genomu komórek eukariotycznych lub wirusów przez rekombinację homologiczną. Do wytworzenia wektora przydatnego do wprowadzenia polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku do genomu komórek ssaków można użyć wektora plazmidowego zawierającego kasetę ekspresyjną otoczoną sekwencjami wirusowymi. Inne przykłady korzystnych wektorów obejmują wektory oparte na wirusie opryszczki^18,19 i retrowirusy, włączając lentiwirusy, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami i wirusy HPV (takie jak HPV-16 lub HPV-18). Techniki przenoszenia genów przy użyciu tych wirusów znane są biegłym w sztuce. Wektory retrowirusowe mogą być na przykład użyte do stabilnego włączenia polinukleotydu, który powoduje wytwarzania antysensownego RNA w genomie gospodarza. Defektywne w mechanizmach replikacji wektory adenowirusowe mogą pozostawać w formie episomalnej i dlatego pozwalają na uzyskanie przejściowej ekspresji.

Wektor może zawierać polinukleotyd wytworzony sposobem według wynalazku położony w kierunku antysensownym w celu wytworzenia antysensowenego RNA.

Komórki gospodarza i ekspresja

Następnym aspektem sposobu według wynalazku jest dostarczenie procesu przygotowania polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku który obejmuje hodowlę komórek gospodarza (na przykład transformowanych lub transfekowanych opisanym powyżej wektorem do ekspresji) w warunkach umożliwiających uzyskanie ekspresji (przez ten wektor) sekwencji kodującej ten polipeptyd i ewentualnie odzyskanie eksprymowanego polipeptydu. Polinukleotydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być włączone w rekombinowany wektor replikacyjny, na przykład wektor do ekspresji. Wektor może być użyty do replikacji kwasu nukleinowego w kompatybilnych komórkach gospodarza. W następnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku wynalazek dostarcza

PL 209 225 B1 sposobu wytwarzania polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku przez wprowadzenie polinukleotydu wytworzonego sposobem według wynalazku do wektora replikacyjnego, wprowadzenie wektora do kompatybilnych komórek gospodarza i hodowanie komórek gospodarza w warunkach umożliwiających uzyskanie replikacji tego wektora. Wektor można odzyskać z komórek gospodarza. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują bakterie, takie jak E. coli, drożdże, linie komórek ssaków i inne eukariotyczne linie komórkowe, na przykład komórki owadów, takie jak komórki Sf9 i komórki grzybów (na przykład filamentujących).

Korzystnie polipeptyd wytwarza się jako białko wydzielane. W tym przypadku sekwencja DNA kodująca dojrzałą formę polipeptydu w konstrukcie ekspresyjnym połączona jest funkcjonalnie z sekwencją DNA kodującą sekwencję sygnałową. Korzystnie sekwencja sygnałowa jest natywna (homologiczna) w stosunku do sekwencji kodującej polipeptyd. Ewentualnie sekwencja sygnałowa jest obca (heterogenna) w stosunku do sekwencji kodującej polipeptyd. W tym przypadku korzystnie sekwencja sygnałowa jest endogenna dla komórek gospodarza w których sekwencja DNA jest eksprymowana.

Przykładami odpowiednich sekwencji sygnałowych dla drożdżowych komórek gospodarza są sekwencje sygnałowe pochodzące z drożdżowych genów czynników a. Podobnie, sekwencjami sygnałowymi odpowiednimi dla komórek grzybów filamentujących są, na przykład sekwencje sygnałowe pochodzące z genu amyloglukonidazy (AG) grzybów filamentujących, na przykład gen glaA A.niger. Sekwencje takie mogą być użyte w połączeniu z promotorem amyloglukonidazy (nazywanego także (gluko)amylazą), a także w połączeniu z innymi promotorami. W kontekście sposobu według wynalazku używane mogą być także hybrydowe sekwencje sygnałowe.

Korzystne heterogenne sekwencje wiodące sekrecji są sekwencjami pochodzącymi z grzybowego genu amyloglukonidazy (AG) (gen glaA zarówno wersja 18 jak I 24 aminokwasową, na przykład z Aspegillus), gen czynnika u (drożdży na przykład Saccharomyces i Kluyveromyces) lub gen α-amylazy (Bacillus).

W celu uzyskania ekspresji polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku wektory można transformować lub transfekować do odpowiednich komórek gospodarza tak jak opisano powyżej. Proces ten może obejmować hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym opisanym powyżej w warunkach umożliwiających uzyskanie ekspresji wektora zawierającego sekwencję kodującą polipeptyd.

W jednym z aspektów wynalazku dostarcza się komórki gospodarza transformowane lub transfekowane lub zawierające polinukleotyd lub wektor wytworzony sposobem według wynalazku. Korzystnie polinukleotyd zawarty jest w wektorze do replikacji i ekspresji tego polinukleotydu. Komórki wybiera się tak, żeby były kompatybilne z tym wektorem i mogą to być na przykład komórki prokariotyczne (na przykład bakteryjne), grzybów, drożdży lub komórki roślinne.

Można także użyć heterogennych gospodarzy, w których polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku wytwarzany jest w postaci całkowicie wolnej od innych enzymów degradujących celulozę. Można to osiągnąć wybierając gospodarza, którego komórki normalnie nie wytwarzają jakich enzymów, takiego jak Kluyveromyces lactis.

Jak wskazano powyżej sposób według wynalazku obejmuje proces wytwarzania polipeptydu otrzymanego sposobem według wynalazku przy wykorzystaniu ekspresji rekombinowanych sekwencji DNA kodujących polipeptyd. W tym celu sekwencji DNA wytworzonej sposobem według wynalazku używa się do amplifikacji genu i/lub wymiany sygnałów ekspresji, takich jak promotory, sekwencje sygnałowe wydzielania. Pozwala to na uzyskanie ekonomicznych sposobów produkcji polipeptydu w odpowiednich homogennych lub heterogennych komórkach gospodarza. Homogenna komórka gospodarza jest tu zdefiniowana jako komórka gospodarza, która należy do tego samego gatunku lub która jest wariantem w obrębie tego samego gatunku z którego pochodzi sekwencja DNA.

Odpowiednie komórki gospodarza korzystnie są komórkami mikroorganizmów prokariotycznych, takich jak bakterie, lub bardziej korzystnie organizmów eukariotycznych, na przykład grzybów, takich jak drożdże lub grzyby filamentujące, lub komórkami roślinnymi. Ogólnie, komórki drożdży są bardziej korzystne niż komórki grzybów, ponieważ są łatwiejsze do manipulacji. Jednakże, niektóre białka są słabo wydzielane przez komórki drożdży lub w niektórych przypadkach nie są odpowiednio obrabiane (na przykład ulegają w komórkach drożdży nadmiernej glikozylacji). W takich przypadkach powinno się wybrać grzybowe komórki gospodarza

Komórki gospodarza mogą wytwarzać nadmierne ilości polipeptydu, a techniki uzyskiwania nadmiernej ekspresji są dobrze znane³. Komórki gospodarza mogą zawierać jedną lub dwie kopie kodujące polinukleotyd (wektor też może zawierać jedną lub dwie kopie).

PL 209 225 B1

Bakterie z rodzaju Bacillus są bardzo korzystne jako heterogenny gospodarz ponieważ mają zdolność do wydzielania białek do podłoża do hodowli. Inne bakterie korzystne jako gospodarz to bakterie z rodzajów Streptomyces i Pseudomonas. Komórki drożdży korzystne do ekspresji sekwencji DNA kodującej polipeptyd należą do rodzajów Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, i Schizosaccharomyces. Korzystniej komórki gospodarza drożdżowego wybiera się z grupy zawierającej gatunki Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (znany także jako Kluyveromyces marxianus var. Lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica i Schizosaccharomyces pombe.

Jako komórki gospodarza najbardziej korzystne są jednak komórki grzybów (na przykład filamentujących). Korzystne komórki grzybów filamentujących wybiera się z grupy zawierającej gatunki. Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia i Talaromyces. Korzystniej komórki grzybów filamentujących wybiera się z grupy zawierającej gatunki Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, lub gatunki z Grupy Aspergillus niger. (tak jak to zdefiniował Raper i Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Williams Company, Baltimore, strony 293-344, 1965). Gatunki te obejmują, ale bez ograniczania Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae i Aspergillus ficuum, i dalej obejmują gatunki Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, penicilliwn chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum I Thielavia terrestris.

Przykładami korzystnych komórek do ekspresji objętych zakresem sposobu według wynalazku są grzyby, takie jak gatunki z rodzaju Aspergillus (opisane w EP-A-184,43 8 i EP-A-284,603) i gatunki z rodzaju Trichoderma; bakterie takie jak gatunki z rodzaju Bacillus (opisane w EP-A-134,048 i EP-A-253,455), na przykład Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, gatunki z rodzaju Pseudomonas; i drożdże, takie jak gatunki z rodzaju Kluyveromyces (opisane w EP-A-096,430, na przykład Kluyveromyces lactis w EP-A-301,670) i gatunki z rodzaju Saccharomyces, na przykład Saccharomyces cerevisiae.

Komórki gospodarza objęte zakresem wynalazku zawierają komórki roślinne, i sposób według wynalazku rozciąga się na organizmy transgeniczne, takie jak rośliny i ich części, które zawierają jedną lub więcej komórek wytworzonych sposobem według wynalazku. Komórki mogą heterogennie eksprymować polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku lub mogą heterogennie zawierać jeden lub więcej polinukleotydów wytworzonych sposobem według wynalazku. Transgeniczne (lub modyfikowane genetycznie) rośliny mogą mieć wstawiony (na przykład stabilnie) w genom sekwencję kodującą jeden lub więcej polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku. Transformację komórek roślinnych osiąga się znanymi w dziedzinie wynalazku sposobami, na przykład przy użyciu plazmidów Ti lub Ri z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid (lub wektor) może więc zawierać sekwencje konieczne to infekowania roślin, i można w tym celu używać pochodnych plazmidów Ti i/lub Ri.

Opcjonalnie, prowadzi się bezpośrednią infekcję części rośliny, takiej jak liść, korzeń lub pień. Technika ta polega na zranieniu rośliny która ma być zainfekowana, na przykład przez nacięcie rośliny ostrzem lub nakłucie rośliny igłą lub starcie rośliny ściernicą. Następnie ranę szczepi się Agrobacterium. Roślinę lub jej część hoduje się w odpowiednim podłożu hodowlanym i pozwala na rozwinięcie się dojrzałej rośliny. Regenerację transformowanych 5 komórek w genetycznie zmodyfikowane rośliny można osiągnąć znanymi technikami, na przykład przez wyselekcjonowanie transformowanych siewek przy użyciu antybiotyków i przez hodowanie siewek w podłożu zawierającym odpowiednie składniki odżywcze, hormony roślinne i tym podobne.¹⁷

Hodowla komórek gospodarza i wytwarzanie rekombinantów

Sposób według wynalazku dostarcza także komórek, które były zmodyfikowane w celu uzyskania ekspresji β-glukanazy lub jej wariantów. Takie komórki obejmują przejściowe, lub korzystniej stabilne linie komórkowe wyższych eukariontów, takie jak komórki ssaków lub komórki owadów, komórki niższych eukariontów, takich jak drożdże i komórki grzybów (na przykład filamentujących) lub komórki prokariotyczne, takie jak komórki bakterii.

Możliwe jest także, że białko wytworzone sposobem według wynalazku jest przejściowo wytwarzane w linii komórkowej lub na błonie, takiej jak na przykład system ekspresyjny bakulowirusa. Takie systemy, które są zaadaptowane do wytwarzania białka sposobem według wynalazku także są włączone w zakres sposobu według wynalazku.

PL 209 225 B1

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku można otrzymać hodując w tradycyjnej pożywce hodowlanej do fermentacji, zdolne do ekspresji mikrobiologiczne komórki gospodarza, które były transformowane jednym lub większą liczbą polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku.

Rekombinowane komórki gospodarza wytworzone sposobem według wynalazku można hodować wykorzystując procedury znane w dziedzinie wynalazku. Dla każdej kombinacji promotora komórki gospodarza, znane są warunki hodowli, które umożliwiają ekspresję sekwencji DNA kodującej polipeptyd. Po osiągnięciu pożądanej gęstości lub miana polipeptydu, hodowlę hamuje się i polipeptyd odzyskuje się przy użyciu znanych procedur.

Podłoże fermentacyjne może być podłożem znanym z sztuce zawierającym źródło węgla (na przykład glukozę, maltozę, melasę, celulozę, β-glukan i tym podobne), źródło azotu (na przykład siarczan amonowy, azotan amonowy, chlorek amonowy i tym podobne) i organiczne źródło azotu (na przykład ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodu, pepton i tym podobne) i źródło związków nieorganicznych (na przykład fosforany, magnez, potas, cynk, żelazo i tym podobne). Ewentualnie można dodać związku indukującego (na przykład celulozy, β-glukanu, maltozy lub maltodekstryny).

Wybór odpowiedniego podłoża oparty jest na doborze zdolnych do ekspresji komórek gospodarza i/lub elementów regulatorowych konstruktu do ekspresji. Podłoża takie są znane biegłym w sztuce. Jeśli jest to pożądane podłoże może zawierać dodatkowe składniki dające przewagę wzrostową transformowanych, zdolnych do ekspresji komórek gospodarza komórek ponad innymi potencjalnie zanieczyszczającymi mikroorganizmami.

Fermentacje prowadzi się w czasie 0,5 - 30 dni. Można ją prowadzić w formie wsadu, w formie ciągłej lub z dokarmianiem. Odpowiedni zakres temperatury wynosi od 0°C do 45°C, a odpowiednie pH od 2 do 10. Korzystne warunki fermentacji to zakres temperatury od 20°C do 37°C i/lub odpowiednie pH 3 do 9. Odpowiednie warunki fermentacji dobiera się zwykle w oparciu o wybrane zdolne do ekspresji komórki gospodarza i białko, które ma być eksprymowane.

Jeśli to konieczne po fermentacji komórki gospodarza można usunąć z bulionu fermentacyjnego przez wirowanie lub filtrację. Po zatrzymaniu fermentacji lub po usunięciu komórek gospodarza, polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku odzyskuje się i jeśli jest to pożądane, oczyszcza i izoluje tradycyjnymi metodami.

D. Użycie polipeptydu i sposobów obróbki roślin lub materiału zawierającego celulozę

Polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku, który posiada aktywność β-glukanazy (lub celulazy) używa się do traktowania grzybowego lub roślinnego materiału, włączając pulpę roślinną lub ekstrakty roślinne. Na przykład, może być użyty do traktowania zboża, warzyw, owoców lub ich ekstraktów. Może być użyty w kompozycjach do przemywania (ciekłych lub stałych, na przykład proszków) i/lub kompozycjach z detergentami. W celu otrzymania preparatu kompozycja/enzym, korzystnie polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku łączy się z odpowiednim (ciekłym lub stałym) nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, włączając bufory. Polipeptyd może być przyłączony lub zmieszany z nośnikiem, na przykład immobilizowany na stałym nośniku. Sposobem według wynalazku dostarcza w swoim następnym aspekcie kompozycji zawierającej polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku. Kompozycja ta może występować w formie odpowiedniej do pakowania, transportu i/lub przechowywania, korzystnie jeżeli zachowana jest aktywność glukanazy. Kompozycja obejmuje pasty, płyny, emulsje, proszki, płatki, granulaty, tabletki i inne formy tłoczone.

Kompozycja może też zawierać dodatkowe składniki, takie jak jeden lub większą liczbę enzymów, na przykład pektynaz, włączając (na przykład endo-) arabinazę i ramnogalakturonidazę, inne celulazy, ksylanazy, galaktanazy, mannazy i/lub ksyloglukanazy. Polipeptyd występuje typowo w formie stabilnej albo w postaci płynu lub suchej. Typowo, produkt robi się jako kompozycję, która ewentualnie zawiera, na przykład bufor stabilizujący i/lub konserwanty. Kompozycja może też zawierać inne enzymy zdolne do trawienia materiału roślinnego lub celulozy, na przykład inne celulazy, na przykład β-D)-glukanazy. W pewnych zastosowaniach, korzystna jest immobilizacja enzymu na stałym podłożu lub włączenia na lub do cząstek stałego nośnika. Kompozycja może też zawierać różne inne enzymy degradujące materiał roślinny, na przykład (inne) celulazy lub inne pektynazy.

Polipeptydy i kompozycje wytworzone sposobem według wynalazku mogą być użyte do obróbki materiału roślinnego w celu jego zdegradowania lub zmodyfikowania związków celulozy (na przykład (β-D-glukanu) w ścianach komórkowych materiału roślinnego lub grzybowego. Kolejnym aspektem sposobu według wynalazku jest dostarczenie metody degradowania lub modyfikowania komórek roślinnych lub celulozy cechującego się tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórki roślinnej lub grzyba lub celulozy z polipeptydem lub kompozycją wytworzonymi sposobem według wynalazku.

PL 209 225 B1

Jak wspomniano powyżej wynalazek zapewnia także sposób obróbki materiału roślinnego obejmujący doprowadzenie do kontaktu materiału roślinnego z polipeptydem lub kompozycją wytworzonymi sposobem według wynalazku w celu zdegradowania lub zmodyfikowania celulozy w materiale roślinnym. Korzystnie materiałem roślinnym jest pulpa roślinna lub ekstrakt roślinny.

Korzystnie degradacja obejmuje cięcie podjednostek β-glukanu celulozowego składnika ściany komórkowej roślin. Korzystnie materiałem roślinnym są zboża, warzywa, owoce, warzywna lub owocowa pulpa lub ekstrakt. Sposobem według wynalazku dostarcza się także traktowanego materiału roślinnego uzyskanego przez doprowadzenie do kontaktu materiału roślinnego z polipeptydem lub kompozycją wytworzonymi sposobem według wynalazku.

Sposobem według wynalazku dostarcza się także metody zmniejszenia lepkości ekstraktu roślinnego znamiennej tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu ekstraktu roślinnego 25 z polipeptydem lub kompozycją wytworzonymi sposobem według wynalazku w ilości odpowiedniej do zdegradowania celulozy (lub β-D-glukanu) zawartych w ekstrakcie roślinnym.

Materiał zawierający rośliny lub celulozę obejmuje pulpę roślinną, części roślin i ekstrakt roślinny. W kontekście sposobu według wynalazku ekstrakt z materiału roślinnego jest każdą substancją, którą można otrzymać z materiału roślinnego przez ekstrakcję (mechaniczną lub chemiczną) lub innymi technikami separacji. Ekstrakt może być sokiem, nektarem, zaprawą lub koncentratem z nich zrobionym. Polipeptydu używa się do (na przykład całkowitego) upłynnienia i/lub (zaawansowanej) maceracji, na przykład w czasie wytwarzania soków (owocowych). Materiał roślinny może zawierać lub może pochodzić z warzyw, na przykład marchewki, selera, cebuli, strączków lub roślin strączkowych (soja, nasiona soi, groszek) lub owoców, na przykład jabłkopodobnych lub owoców pestkowych (jabłek, gruszek, pigwy), winogron, pomidorów, cytrusów (pomarańczy, cytryn, limonek, mandarynek), melonów, śliwek, wiśni, czarnej porzeczki, czerwonej porzeczki, malin, truskawek, żurawin, ananasa i innych owoców tropikalnych, drzew i ich części (na przykład pyłku sosnowego) lub zbóż (owsa, jęczmienia, pszenicy, kukurydzy, ryżu).

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być użyte do traktowania materiału roślinnego włączając pulpę roślinną lub ekstrakty roślinne. Używa się ich także do traktowania płynnego lub stałego pożywienia lub jadalnych składników pożywienia.

Typowo, polipeptydów wytworzonych sposobem według wynalazku używa się jako opisanych powyżej preparatów kompozycja/enzym. Kompozycję dodaje się do pulpy roślinnej otrzymanej przez na przykład obróbkę mechaniczną, takie jak kruszenie lub mielenie materiału roślinnego. Inkubację takiej kompozycji z rośliną typowo prowadzi się przez czas od 10 minut do 5 godzin, taki jak 30 minut do 2 godzin, korzystnie 1 godzinę. Temperatura obróbki korzystnie wynosi 10-55°C, na przykład od 15 do 25°C, optymalnie około 20°C. Używa się od 10 do 300 g, korzystnie 30-70 g, optymalnie około 50 g enzymu na tonę traktowanego materiału. Wszystkie enzymy i ich kompozycje mogą być kolejno dodawane lub dodane jednocześnie do pulpy roślinnej. W zależności od preparatu kompozycji enzymatycznej materiał roślinny może najpierw ulec maceracji (na przykład do puree) lub zostać upłynniony. Przy użyciu polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku można polepszyć parametry procesu, takie jak wydajność ekstrakcji, lepkość ekstraktu i/lub jakość ekstraktu.

Ewentualnie, lub jako uzupełnienie powyższego polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku dodaje się do surowego soku uzyskanego przez wyciskanie lub upłynnienie pulpy roślinnej. Traktowanie surowego soku prowadzi się w podobny sposób jak pulpy roślinnej jeśli chodzi o dawkowanie, temperaturę i czas traktowania. Podobnie można dodać także innych enzymów tak jak to dyskutowano powyżej. Typowe warunki traktowania opisano w poprzednim paragrafie. W celu otrzymania produktu końcowego, po inkubacji z polipeptydem wytworzonym sposobem według wynalazku surowy sok wiruje się lub (ultra)filtruje.

Kompozycja zawierająca polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może być użyta w czasie wytwarzania owocowego lub warzywnego puree.

Polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku można użyć także w browarnictwie, przemyśle winiarskim, destylarskim lub piekarnictwie. Można go używać do wytwarzania napojów alkoholowych, takich jak wino i piwo, na przykład do poprawienia klarowności i przechodzenia przez filtry wina. W piekarnictwie polipeptyd może poprawić strukturę surowego ciasta, zmodyfikować jego kleistość, miękkość, poprawić objętość bochenka i/lub strukturę miękiszu chleba.

Polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku można użyć w browarnictwie. W browarnictwie można napotkać problemy w czasie filtrowania miazgi, które wynikają z obecności nadmiernie zmodyfikowanego słodu, powstającego z β-glukanu uwalnianego w wysokich temperaturach.

PL 209 225 B1

Jednym z najczęściej napotykanych problemów jest zmniejszenie szybkości filtracji brzeczki. Innym problemem jest stabilność koloidu i mętnienie gotowego piwa. Może to być spowodowane przez te same kompleksy węglowodanowe, szczególnie w czasie wytwarzania piwa metodą wysokograwitacyjną. Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może poprawić przechodzenie brzeczki przez filtry, na przykład po otrzymaniu miazgi. W ten sposób mniej płynnej brzeczki pozostanie w nieprzerobionym ziarnie i poprawiona zostanie wydajność otrzymywania ekstraktu. Bardziej wydajna filtracja zwiększa wydajność browaru. Polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku można użyć do poprawienia przechodzenia brzeczki przez filtry lub tempa filtracji (na przykład gotowego) piwa.

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może zahamować lub przynajmniej zmniejszyć mętnienie piwa w czasie wytwarzania, β-glukan znajdujący się w ścianie endospermy zbóż może przechodzić do gotowego piwa. Może to powodować mętnienie i utratę klarowności. Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może zahamować lub przynajmniej zmniejszyć nagromadzenie się cząsteczek wynikających z hydrolizy β-glukanu. Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może być użyty do zwiększenia stabilności koloidu (na przykład gotowego) piwa.

Ze względu na swoją aktywność glukanazową polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. Obejmują one nie tylko produkcję alkoholu, ale także biologiczne wytwarzania metanu, produkcję chleba i piekarnictwo, aspekty higieny jamy ustnej (na przykład kompozycje dentystyczne lub doustne), obróbkę materiału, ubrań lub wytwarzanie skóry, wytwarzanie papieru, farmaceutyków, herbaty, przygotowywanie lub obróbkę tekstyliów, zastosowanie w kompozycjach do mycia lub zawierających detergenty i obróbkę odpadów. Jednym aspektem sposobu według wynalazku jest karma lub pasza zawierające polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku, takie jak napoje alkoholowe, chleb, ciasto lub herbata. Dla każdego z tych zastosowań polipeptyd może mieć odpowiednią formę. Może występować jako kompozycja płynna (na przykład gorąca woda) I korzystnie z dodatkiem jednego lub więcej środków grzybobójczych, do traktowania materiału roślinnego (na przykład cebulek), szczególnie w celu kontroli owadów pasożytniczych, roztoczy i nicieni.

Ponieważ polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może degradować glukan można go dodawać do jedzenia lub paszy (na przykład do spożycia przez ludzi). Wiadomo, że rozpuszczalny β-D-glukan wpływa na obniżenie poziomu cholesterolu i triglicerydów w osoczu, dlatego polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może być użyty do obniżenia poziomu cholesterolu i triglicerydów w osoczu ludzi lub zwierząt, na przykład u osobników z hiperlipemią.

Farmaceutyczne i weterynaryjne kompozycje według wynalazku zawierają zatem polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku i farmaceutycznie lub weterynaryjnie akceptowany nośnik. Polipeptydów używa się więc do wytwarzania leków zapobiegających lub leczących hiperlipemię, wysoki poziom cholesterolu i triglicerydów w osoczu lub schorzenia z tego wynikające.

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mają także działanie przeciwgrzybicze. Mogą one degradować ścianę komórkową grzybów, i mogą być użyte do lizowania ściany komórkowej grzybów w celu otwarcia komórek. Może to powodować uwolnienie białek wewnątrzkomórkowych. W ten sposób polipeptydy mogą być użyte do wytwarzania drożdżowych i/lub grzybowych ekstraktów.

E. Pasza dla zwierząt

Jak wskazano powyżej przedmiotem według wynalazku jest także pasza dla zwierząt, zawierająca co najmniej jeden polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku. Polipeptyd może być obecny w paszy w stężeniach różnych od jego stężeń występujących naturalnie. Korzystne ilości wynoszą od 0,1 do 100, na przykład 0,5 do 50, korzystnie 1 do 10 mg na kilogram paszy.

Paszę dla zwierząt według wynalazku przygotowuje się w ten sposób, że co najmniej jednej jadalnej substancji lub składnika dodaje się polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku. Polipeptydy dodaje się do przygotowywania paszy dla zwierząt oddzielnie od substancji żywieniowych lub składników, pojedynczo lub w połączeniu z innymi dodatkami do pasz. Polipeptyd może być integralną częścią jednej z substancji żywieniowych lub składnika.

Polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku można dodać do paszy bogatej w celulozę w celu zwiększenia stopnia rozkładu ściany komórek roślinnych co prowadzi do lepszego przyswajania roślinnych składników odżywczych przez zwierzę. Polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku można także dodać do paszy lub kiszonki, jeżeli korzystna jest wcześniej rozmoczona lub wilgotna dieta. Korzystnie, polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku kontynuują degradację celulozy w paszy in vivo. Pochodzące z grzybów polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mają ogólnie rzecz biorąc niższe optymalne wartości pH i są zdolne do uwalniania

PL 209 225 B1 ważnych składników odżywczych w kwaśnym środowisku jakim jest żołądek zwierzęcia. Wynalazek dotyczy też pasz dla zwierząt zawierających co najmniej jeden polipeptyd wytworzonych sposobem według wynalazku.

Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być także użyte w czasie produkcji preparatów mlekozastępczych z ziarna sojowego. Preparaty mlekozastępcze mogą być spożywane przez ludzi lub zwierzęta. Typowym problemem w czasie wytwarzania takich preparatów mlekozastępczych jest duża lepkość zawiesiny sojowej, co powoduje konieczność niepożądanego rozcieńczenia zawiesiny do uzyskania stężenia substancji stałych od 10 do 15%. Preparat enzymatyczny zawierający polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku może być dodany do przed lub w czasie obróbki zawiesiny, co umożliwi obróbkę przy wyższym stężeniu substancji stałych (typowo od 40 do 50%). Enzymu można także użyć do obróbki dodatków smakowych, na przykład z ziarna sojowego.

Kompozycja może dodatkowo zawierać (szczególnie kiedy ma formę przewidzianą do użycia z paszami zwierzęcymi) co najmniej jeden jonofor, związek utleniający, związek powierzchniowo czynny, aminokwas chroniący żwacz, wzmacniacz enzymów lub enzym, który jest wytwarzany w sposób naturalny w przewodzie pokarmowym karmionych zwierząt.

Jeżeli kompozycję dodaje się do paszy (włączając kiszonki) dla przeżuwaczy i zwierząt nieprzeżuwających (na przykład drobiu lub świń), pasza może zawierać zboża, takie jak jęczmień, pszenicę, kukurydzę, ryż lub owies lub półprodukty zbożowe, takie jak otręby pszenne lub otręby kukurydziane, lub inny materiał roślinny, taki jak ziarno sojowe i innych roślin strączkowych. Enzym może znacząco poprawić rozbicie ściany komórek roślinnych, co prowadzi do lepszego przyswajania roślinnych składników odżywczych przez zwierzę. W efekcie poprawia się szybkość wzrostu i współczynnik wykorzystania paszy. Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być dodane do paszy (bezpośrednio lub jako dodatek lub składnik) lub zamiast tego można dodać do paszy traktowanej nimi celulozy (na przykład glukanu).

Szczególnie korzystnym sposobem (zewnętrznego) dodania β-glukanazy jest dodanie polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku jako transgenicznego materiału roślinnego i/lub (na przykład transgenicznych) nasion. Polipeptyd można otrzymać drogą ekspresji heterogennych genów, na przykład gen kodujący pożądany enzym można wprowadzić do roślinnego wektora ekspresyjnego pod kontrolą odpowiednich roślinnych sygnałów ekspresji, na przykład specyficznych tkankowo promotorów, takich jak promotory specyficzne dla nasion. Wektor ekspresyjny zawierający gen kodujący polipeptyd można następnie transformować do komórek roślinnych, a transformowane mogą być wyizolowane i wyhodowane do całych roślin. Otrzymane w ten sposób rośliny transgeniczne hoduje się i zbiera, a części roślin zawierające heterogenny (w stosunku do rośliny) polipeptyd, włącza się do kompozycji, w stanie naturalnym lub po obróbce. Ogólne metody uzyskania ekspresji enzymów (heterogennych) w (transgenicznych) roślinach, włączając metody specyficznej dla nasion ekspresji enzymów są znane w dziedzinie wynalazku²³. Heterogenny peptyd może by zawarty w nasionach rośliny transgenicznej lub może występować w innych częściach rośliny, takich jak korzenie, łodygi, liście, drewno, kwiaty, kora i/lub owoce. Roślina może być jednoliścienna lub dwuliścienna. Odpowiednie rośliny obejmują zboża, takie jak owies, jęczmień, pszenice, kukurydzę i ryż. Korzystnie polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku włączony jest w genom rośliny.

Dodatek polipeptydu w postaci transgenicznego materiału roślinnego, na przykład transgenicznych nasion może wymagać obróbki takiego materiału roślinnego, w taki sposób aby uczynić ten enzym dostępnym lub przynajmniej poprawić jego dostępność. Techniki obróbki obejmują różne techniki mechaniczne (na przykład mielenie i/lub rozdrabnianie) lub obróbkę termomechaniczną, taką jak wyciskanie lub rozszerzanie.

Jak wspomniano powyżej, jeden z aspektów niniejszego wynalazku jest także sposób poprawiania wzrostu i/lub i współczynnika wykorzystania paszy zwierząt pojedynczożołądkowych lub nieprzeżuwających obejmujący żywienie zwierzęcia polipeptydem wytworzonym sposobem według wynalazku.

Odpowiednie zwierzęta obejmują fermowe pojedynczożołądkowe lub nieprzeżuwające zwierzęta, takie jak świnie (lub prosięta) drób (taki jak kurczaki i indyki), krowy lub cielęta lub zwierzęta wodne (na przykład morskie, takie jak ryby).

Analiza enzymów degradujących celulozę

Wynalazek dotyczy także zastosowania polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku w badaniach przesiewowych w celu zidentyfikowania związków, które mogą działać jako agony lub antagony i modulować β-glukanazę. Mówiąc ogólnie, takie badania przesiewowe obejmują doprowadzenie do kontaktu polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku z badanym związ20

PL 209 225 B1 kiem, a następnie pomiar aktywności lub inkubację polipeptydu wytworzonego sposobem według wynalazku z badanym związkiem, a następnie wykrycie jakiejkolwiek modulacji aktywności β-glukanazy. Można także wykryć związki, które wiążą się z polipeptydem wytworzonym sposobem według wynalazku przy użyciu testu wiązania.

Aktywność modulującą można określić doprowadzając do kontaktu komórek eksprymujących polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku z badaną substancją i monitorując wpływ jaki wywierają na nią polipeptydy. Komórkami eksprymującymi polipeptyd mogą być komórki hodowane in vitro, i korzystne badanie prowadzi się in vitro przy użyciu komórek eksprymujących rekombinowany polipeptyd.

Opisane tu testy i substraty pozwalają na identyfikację i potwierdzenie aktywności β-glukanazy. Jednakże, testów tych można używać do wykrywania innych degradujących celulozę enzymów, mających lub nie aktywność β-glukanazy. Substrat używany w tych badaniach może zawierać β-glukan.

Innym aspektem sposobu według wynalazku jest test do wykrywania i identyfikowania polipeptydu, który jest zdolny do degradowania celulozy. Tą aktywnością może być aktywność glukanazy (na przykład β-glukanazy) lub celulazy lub ksyloglukanazy. Test obejmuje: (a) dostarczenie substratu opisanego w poprzednim akapicie dla badanego związku (przeważnie polipeptydu) i (b) doprowadzenie do kontaktu substratu z badanym związkiem i wykrycie czy powstają węglowodany.

Ilość powstających węglowodanów można zmierzyć. Jeśli 10 to konieczne można ją porównać z ilością węglowodanów wytwarzanych w doświadczeniu kontrolnym, bez badanego związku.

Opisane powyżej testy mogą być wykorzystywane do identyfikacji modulatorów aktywności β-glukanazy.

Korzystne cechy i charakterystyki jednego aspektu sposobu według wynalazku mają zastosowanie do innych aspektów mutatis mutandis.

Sposób według wynalazku zostanie teraz opisany w odniesieniu do następujących przykładów, które zamieszczono tylko w celach ilustracyjnych bez ograniczania zakresu sposobu według wynalazku.

PRZYKŁADY

Procedury ogólne

Standardowe techniki klonowania molekularnego/takie jak izolacja DNA, elektroforeza na żelu, enzymatyczne restrykcyjne modyfikacje kwasów nukleinowych, analiza metodą Southern blot, transformacja E. coli, przenoszenie kolonii i hybrydyzacja na filtrach, prowadzi się według standardowych techniki^1,2. Syntetyczne oligodeoksynukleotydy otrzymano z ISOGEN Bioscience (Maarssen, Holandia). Analizę sekwencji DNA prowadzi się przy użyciu aparatu do sekwencjonowania DNA Applied Biosystems 373A, według instrukcji producenta.

Znakowanie DNA i hybrydyzacje prowadzi się tak jak opisano w systemach bezpośredniego wykrywania i znakowania ID kwasów nukleinowych ECL™ (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Wielka Brytania) lub według standardowych technik znakowania radioizotopowego¹.

P r z y k ł a d 1: Izolacja RNA z T.emersoni i synteza cDNA

Szczep CBS 393.64 T. emersonii hoduje się w warunkach indukujących celulazę. W kilku punktach czasowych pobiera się próbki mycelium i supernatantu z hodowli metodą filtracji przy użyciu tkaniny filtracyjnej Miracloth. Mycelium przemywa się intensywnie wodą demineralizowaną i ściska pomiędzy ręcznikami papierowymi w celu usunięcia nadmiaru wody. Mycelium pobrane w wybranych punktach czasowych (w oparciu o aktywność celulazy zmierzoną w supernatancie z hodowli) błyskawicznie zamraża się w ciekłym azocie, rozdrabnia na drobny proszek przy użyciu moździerza i tłuczka. Otrzymany proszek przenosi się do sterylnej probówki o objętości 50 ml i waży: na każde 1-1,2 g sproszkowanego mycelium dodaje się 10 ml odczynnika TRIzol (Gibco/BRL) (maksymalnie 25 ml na probówkę). Sproszkowane mycelium natychmiast rozpuszcza się przez intensywne wstrząsanie (na wytrząsarce 1 minuta), a następnie trzyma w temperaturze pokojowej przez 5 minut okazyjnie wstrząsając. Do mieszaniny dodaje się Ot2 objętości chloroformu (oryginalnej objętości TRIzolu) (to znaczy 2 ml chloroformu na 10 ml TRIzolu oryginalnie użytego), miesza na wytrząsarce i zostawia w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie mieszaninę odwirowuje się w temperaturze 4°C, 6000 x g przez 30 minut. Wierzchnią fazę wodną przenosi się do świeżej probówki i całkowity RNA strąca się przez dodanie 0,5 objętości alkoholu izopropylowego (oryginalnej objętości TRIzolu) (to znaczy 5 ml chloroformu na 10 ml TRIzolu oryginalnie użytego). Po 10 minutach strącania w temperaturze pokojowej, odzyskuje się RNA przez wirowanie przy 6000 x g przez 30 minut. Po usunięciu supernatantu osad RNA przemywa się jedną objętością 70% etanolu. Po usunięciu etanolu, osad RNA suszy się. Wysuszony osad RNA rozpuszcza się w 3 ml buforu GTS (100 mM Tris-CI, pH 7,5, 4M tiocyjanian guanidyPL 209 225 B1 ny, 0,5% laurylosarkozynian sodowy). 10 μl roztworu RNA używa się do określenia jakości i stężenia kwasu nukleinowego.

Prowadzi się analizę metodą Northern blotting³ i wyizolowane RNA dodatkowo się oczyszcza^1,3. Do izolacji mRNA używa się zmodyfikowanego protokołu (stosując przepływ grawitacyjny zamiast wirowania) z zestawu do oczyszczania PHARMACIA (Numer Katalogowy 27-9258-02).³ Do syntezy cDNA używa się STRATAGENE cDNA Synthesis KIT stosując zalecenia wytwórcy, z wyjątkiem liczby optymalizacji dla używanych wektorów pGBFIN z dużymi zmianami tak jak opisano wcześniej.³

Zsyntetyzowaną ilość cDNA określa się metodą strącania TCA i elektroforezy na zasadowych żelach aga różowych.³

P r z y k ł a d 2: Otrzymywanie biblioteki cDNA z mRNAT. emersonii cDNA otrzymany w przykładzie I poddaje się reakcji wytwarzania tępych końców, łączy z adap₃ terami i trawi enzymami restrykcyjnymi.³

Klonowanie cDNA do wektora ekspresyjnego pGBFIN-11 (konstrukcję tego wektora opisano w WO-99/32617) wymaga obecności miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne EcoRI na 5'-końcu i miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne XhoI na 3'-końcu cDNA. Dlatego oligonukleotyd startera pierwszego łańcucha cDNA i sekwencję użytego adaptera (Pharmacia) dobiera się tak, żeby spełnić te wstępne wymagania wektora ekspresyjnego. Otrzymany cDNA rozdziela się metodą frakcjonowania wielkości przez żywicę SEPHAROSE CL-2B, a wielkość każdej pojedynczej otrzymanej puli cDNA analizuje się metodą elektroforezy na niedenaturującym żelu.³ Do konstruowania biblioteki cDNA w wektorze pGBFIN-11 wybiera się dwie pule cDNA, otrzymane przy odcięciu odpowiednio 0,5 kilopar zasad i 1,0 kilopar zasad.

Do celów klonowania do pGBFIN-11, przygotowuje się pulę całkowicie podwójnie strawionego (EcoRI-XhoI) wektora pGBFTN-11 (łączenie tła < 1%). Wybraną pulę cDNA klonuje się w wektorze pGBFIN-11 i transformuje do komórek szczepu E. coli XL10-Gold i otrzymuje dwie pierwotne biblioteki cDNA. Częstość transformacji dla obu pul cONA wynosiła >1,0 x 10⁶. Z części obu bibliotek cDNA w E. coli, losowo wybiera się kolonie i izoluje plazmidowe DNA. Analiza tego plazmidowego DNA wykazała, że w obu bibliotekach cDNA od 90 do 95 procent kolonii zawiera inserty.

Część kolonii uzyskanych dla każdej biblioteki przeniesiono na filtry, a otrzymane filtry poddano hybrydyzacji z DNA genu gpdA T. emersonii kodującego gen dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Następnie, wyizolowano plazmidowe DNA i przy pomocy analizy restrykcyjnej wykazano, że wszystkie plazmidy zawierały pojedyncze inserty w prawidłowej orientacji. Sekwencjonowanie 5'-końców cDNAs, które zawierały gpdA T. emersonii wykazało, że > 85% ma pełną długość.

P r z y k ł a d 3: Transformowanie biblioteki ekspresyjnej do A.niger

DNA izoluje się z biblioteki cDNA E.coli tak jak opisano wcześniej. Całkowity plazmidowy DNA trawi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C enzymem restrykcyjnym Notl w celu usunięcia sekwencji plazmidowych pochodzących z E.coli. Po oczyszczeniu DNA rozpuszcza się w sterylnej demineralizowanej wodzie.

Wielokrotne transformacje A.niger DS2978 prowadzi się³ przy użyciu 1,5 x 10⁷ B 3,0 x 10⁷ protoplastów i 10 μg plazmidowego DNA na jedną transformację. Transformanty izoluje się pod kątem obecności markera selekcyjnego amdS umożliwiającego transformantom wzrost na acetamidzie jako jedynym źródle azotu. Ponieważ zarówno marker selekcyjny amdS i kaseta ekspresyjna cDNA znajdują się na jednym fragmencie, wzrost na acetamidzie wskazuje na obecność kasety ekspresyjnej cDNA.

Po około 7-10 dniach inkubacji w temperaturze 30°C, oczyszcza się 10 000 transformantów: transformanty Aspergillus niger przenosi się przy pomocy robota (Flexy sJcolony picker automater) z płytek do transformacji do 96-studzienkowych MTP Master Plates (MP) zawierających 150 μl na studzienkę zestalonego podłoża do hodowli (SM) (na 1000 ml: 0,52 g KCI, 1,52 g K2HPO4, 0,52 g MgSO4, 20 g glukozy, 19 acetamidu, 0,1M buforu MES, 15 g agaru, 1 ml roztworu elementów śladowych [roztwór elementów śladowych (zawiera na 1 litr): 2,2 g ZnSO4/7 H2O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO4/7H2O, 0,17 g CaCI2/6H2O, 0,16 g CuSO4/5H2O, 0,15g NaMoO4/2H2O, 5,0 g EDTA, pH 6,5] pH 5,5. Transformanty hoduje się na SM przez 5 dni w temperaturze 34°C. Otrzymanego w ten sposób zestawu MP używa się do 1) zaszczepienia MTP w celu wykrycia wzrostu i następnie aktywności enzymatycznej i 2) płytek zapasowych (BP) dla biblioteki cDNA, które przechowuje się w temperaturze -80°C.

P r z y k ł a d 4: Analiza biblioteki ekspresyjnej T, emersonii

MP które rosły przez 5 dni używa się jako matrycy replikacyjnej i replikanty wysiewa się na płytki zawierające świeże podłoże selekcyjne (SM), zawierające na 1 litr: 0,52 g KCI, 1,52 g K2HPO4, 0,52 g

MgSO4, 20 g glukozy, 1 g acetamidu, 0,1M buforu MES, 15 g agaru, 1 ml roztworu elementów ślado22

PL 209 225 B1 wych [roztwór elementów śladowych (zawiera na 1 litr): 2,2 g ZnSO4/7 H2O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO4/7H2O, 0,17 g CaCI2/6H2O, 0,16 g CuSO4/5H2O, 0,15 g NaMoO4/2 H2O, 5,0 g EDTA, pH 6,5] pH 5,5.

Po zaszczepieniu płytki inkubuje się w temperaturze 34°C przez 48 godzin. Następnie na płytki nalewa się wierzchnią warstwę agaru zawierającą karboksymetylocelozę (CMC) (5 g agarozy, 0,5 g CMC (Sigma ref C4888) przygotowane w 1000 ml 50 mM buforu fosforanowego pH 7). Po zestaleniu się wierzchniej warstwy agaru, płytki zostawia się w temperaturze 65°C przez 4 godziny. Żeby wykazać aktywność enzymatyczną, płytki barwi się przez 15 minut roztworem czerwieni Kongo (10 g czerwieni Kongo w 1000 ml buforu fosforanowego pH 7). Roztwór barwnika wylewa się i płytki przemywa 1M NaCI (58,44 g w 1 litrze wody destylowanej). Ten ostatni etap powtarza się dwa razy. Pozytywne klony pojawiają się jako klony tworzące blade przejaśnienia (halo) na czerwonym tle.

Pozytywne klony wydzielające celulazę znalezione w tym pierwszym badaniu (dające klarowne halo po barwieniu czerwienią Kongo) powtórnie zaszczepia się na świeże podłoże SM i hoduje 5 dni w temperaturze 34°C. Uzyskane w ten sposób płytki matrycowe replikuje się na płytki z podłożem selekcyjnym i na płytki z podłożem selekcyjnym zawierające 0,075% (wagowo/objętościowy) AZCL-celulozy (Katalog Megazyme ref. I-AZCEL). Płytki SM traktuje się i liczy tak jak opisano poprzednio (wzrost w temperaturze 34°C i późniejsze badanie prowadzi się przy pomocy zawierającej celulozę wierzchniej warstwy agarowej i barwienia czerwienią Kongo), a płytki SM-AZCEL-celuloza inkubuje się w temperaturze 34°C przez 48 godzin, a następnie dalej inkubuje w temperaturze 65°C przez 8 godz. Płytki SM-AZCL-celuloza liczy się przed i po inkubacji w wysokiej temperaturze. Pozytywne klony wydzielające celulazę wytwarzają rozmyte niebieskie halo.

Identyfikuje się 20 pozytywnych klonów wytwarzających celulazę. Zidentyfikowane płytkowym testem ksylanazowym transformanty Aspergillus wytwarzające celulazę hoduje się w wytrząsanych butelkach fermentacyjnych.³ Po 5 dniach fermentacji pobiera się próbki podłoża i analizuje pod kątem aktywności celulazowej, tak jak opisano poniżej.

P r z y k ł a d 5: Analiza genetyczna pozytywnych transformantów

Znalezione pozytywne (potwierdzone) transformanty hoduje się na podłożu ciekłym, zbiera się mycelium i izoluje całkowity (chromosomowy) DNA przy użyciu Puregene Isolation System (Biozym B.V.) do izolacji DNA z grzybów filamentujących. Izolację i oczyszczanie DNA prowadzi się według protokołu producenta, jednak trochę zmodyfikowanego: powtarza się etap wytrącania białka 3 i 4.

W celu namnożenia insertów wstawionych w kasetę ekspresyjną włączoną w chromosomalny DNA jako matrycy w reakcji PCR używa się chromosomalnego DNA i stosuje startery 12207 (SEQ ID No. 8) i 11937 (SEQ ID No. 7).

Na transformantach robi się bezpośredni PCR stosując zaadaptowaną wersję znanego protokołu4, w której zamiast NOVOzymem otrzymane mycelium traktuje się następnie Gluca-nexJ (Novo Nordisk) w stężeniu 5 mg/ml.

Reakcje PCR zawierają bufor eLONGase™ B (Life Technologies, Breda, Holandia), dNTP (200 gM każdego), 1 μl eLONGase⁷¹* Enzyme Mix, 1-5 μl matrycy, i 10-30 pmol każdego oligonukleotydu, w objętości końcowej 50 gl. Optymalną ilość oligonukleotydów określa się doświadczalnie dla każdej zakupionej partii. Średnio, używa się od 10 do 30 pmol. Reakcje prowadzi się w następujących warunkach: 1x(2 minuty) w temperaturze 94°C, 35x(1 minuta w temperaturze 94°C, 1 minuta w temperaturze 55°C, 6 minut w temperaturze 72°C), 1x(7 minut w temperaturze 72°C). Próbki nakłada się na żel agarozowy i analizuje produkty PCR.

Otrzymane w ten sposób produkty PCR klonuje się do wektora do klonowania E. coli pcr2.1 (Invitrogen, według zaleceń producenta), i otrzymuje plazmid pGBCEA-1.

Sklonowane produkty PCR sekwencjonuje się. Otrzymaną sekwencję nukleotydową regionu kodującego oznaczono SEQ ID NO 1 a przewidywaną sekwencję aminokwasową białka oznaczono SEQ ID NO 2. Białko takie nazwano CEA.

P r z y k ł a d 6: Badanie lepkości biblioteki ekspresyjnej cDNA przy użyciu robota Hamilton Visco-robot.

Pomiar lepkości

Najczęściej używanymi lepkościomierzami do pomiaru lepkości cieczy, są lepkościomierze kapilarne. Mówiąc ogólnie, badana ciecz przepływa pod znanym ciśnieniem przez kapilarę. Mierzy się tempo przepływu, przeważnie zapisując czas potrzebny do przepłynięcia danej objętości płynu pomiędzy znacznikami. Inne typy lepkościomierzy kapilarnych wymuszają przepływ cieczy przez kapilarę z wcześniej ustaloną szybkością, a w celu pomiaru lepkości cieczy mierzy się spadek ciśnienia na długości kapilary. Kontrolowana enzymatyczna degradacja polimerowych lepkich roztworów może

PL 209 225 B1 więc być użyta jako wyznacznik aktywności enzymatycznej. Przyjmując, że znana jest liczbowa zależność pomiędzy lepkością a stężeniem cieczy, można wyliczyć parametry kinetyczne, takie jak stała Michaelis-Menten.

I. System detekcji (a) Ustawienia robota do pomiaru lepkości Hamilton Robot pipetujący Hamilton (Hamilton Workstation Microlab 2200 (Hamilton Company, Reno, USA) jest pod kontrolą oprogramowania nazwanego Eclipse ( Hamilton Company). Oprogramowanie to umożliwia użytkownikowi kierowanie ramieniem roboczym w pewne pozycje w przestrzeni roboczej robota Hamiltona. Opracowano standardowy program badający lepkość Eclipse. Program ten współpracuje z 96-studzienkowymi MTP, w których każda studzienka może być traktowana indywidualnie. Do odsysania płynu ze studzienek w pozycjach określonych przez program Eclipse i do ich napełniania używa się strzykawek i igieł. Szybkość odsysania i rozdzielania płynu (w sekundach/ml) oraz odsysana lub rozdzielana objętość (w μθ ustawia się dowolnie. Stosując zdefiniowane stojaki, w wydajny i oszczędzający czas sposób, można wykorzystać wielopojemnikowe kontenery. Stosując w programie Eclipse instrukcję przemywania rurek roztworem systemowym unika się przenoszenia płynu z jednego systemu pipetowania do drugiego. Szybkość wysysania o wartości 10 sekund/ml (czasami 15 sekund/ml) jest odpowiednia do rozróżnienia większości lepkości na podstawie porównania wysokości pików. Zwykle wysysa i rozdziela się 200-250 μl próbki płynu.

(b) Ustawienia Hamiltona

Wysysanie próbki płynu wytwarza spadek ciśnienia w wypełnionej wodą rurce. Wielkość spadku ciśnienia zależy od szybkości wysysania (lub ruchu nurnika) i lepkości próbki płynu. Największy spadek ciśnienia wytwarzany jest w końcówce igły, ponieważ tam promień jest najmniejszy (około 0,3 mm). Wysysanie próbki płynu powoduje zmiany ciśnienia, przeniesioną ze złącza T do zamiennika ciśnienia. Zamiennik ciśnienia (Depex B.V., de Bilt, Holandia) zmienia wielkość podciśnienia na prąd elektryczny. Wielkość prądu elektrycznego odczytywana jest przez Próbnik raz na sekundę i zapisywany w pamięci Próbnika w formacie liczbowym. Komputer podłączony do Próbnika pozwala (przy pomocy oprogramowania Delogger) na przeniesienie pamięci Próbnika do pliku. Plik ten można odczytać i analizować w powszechnie używanych arkuszach kalkulacyjnych (takich jak Microsoft Excel). Ponieważ ciśnienie mierzy się w odniesieniu w czasie, ostateczny wynik można przedstawić jako wykres wielkość podciśnienia (w mV) w zależności od czasu (w sekundach). Po przyłączeniu złącza T w pozycji tuż pod igłą, sygnał ciśnienia jest mniej zależny od zasysanej objętości.

(c) Przygotowanie krzywej kalibracyjnej pozwalającej na określenie lepkości każdego płynu

Według Prawa Poisseuille'a pomiar spadku ciśnienia powinien być bezpośrednio proporcjonalny do jego lepkości, ponieważ r, z , λ,- Q8nl l , , , nr⁴

P = (iiiV)F 2 = — w którym k =nr² k 8lQ

Wzór ten pozwala na przetworzenie danych wyjściowych podciśnienia w mili-V na nieznaną wartość lepkości próbki płynu. Osiąga się to poprzez wyssanie znanej, stałej objętości płynu kalibracyjnego o różnym stężeniu (przeważnie glicerolu, ponieważ obejmuje on szeroki zakres lepkości i zachowuje się jak ciecz niutonowska). Wytworzone w ten sposób podciśnienie przelicza się z danych wyjściowych w mV stosując nieznany współczynnik F. Ponieważ lepkość absolutna różnych stężeń glicerolu jest znana, wykres wielkości podciśnienia w mV dla różnych znanych stężeń glicerolu w zależności od znanych absolutnych lepkości tych samych stężeń glicerolu tworzy linię prostą przechodzącą przez punkt przecięcia się osi (ponieważ P = (mV)*F = q/k).

(d) Program Eclipse używany do przeszukiwania na skalę przemysłową

Pojedynczy cykl pomiarowy składa się z zassania 250 μl mieszaniny próbki i supernatantu substratu przez szybkość zasysania 10 sekund/ml. Przed zassaniem próbki płynu, w celu oddzielenia płynu systemowego od pobranej próbki zasysa się 40 μl powierza. Po zakończeniu zasysania płynu, wypycha się 290 μl powietrza i próbki. Taki cykl pomiarowy (powtarza się sześć razy, a w celu wyczyszczenia rurki przemywa się 5 ml.

PL 209 225 B1

II Opracowanie testu (e) Ustalenie optymalnej mieszaniny pektyn i ksylanu jako substratu do badań

Użycie więcej niż jednego lepkiego substratu w tym samym czasie ma kilka zalet. Można badać w tym samych czasie różne typy enzymów. Oszczędza to dużo wysiłku i czasu oraz potrzeba mniej substratu. Postanowiono, że oprócz ksylanu pszenicy orkisz, jako drugi substrat użyta zostanie pektyna. Najbardziej odpowiedni do badania wydaje się roztwór 1:1 1% pektyny i 7% ksylanu pszenicy orkisz. Ponieważ w bibliotece proporcjonalnie kilka pozytywnych klonów I większość pików miała wielkość około 435 mV. W przypadku próbek pozytywnych pod kątem aktywności ksylanazy, większość lub cały ksylan zostaje zdegradowany i w próbce zostaje tylko 0,5% pektyny. Klony pozytywne pod kątem ksylanazy dają pik wysokości 280 mV. Klony degradujące pektynę dają pik wysokości 220 mV.

(f) Określenie minimalnej aktywności ksylanazy niezbędnej do wykrycia przez robota do pomiaru lepkości Hamilton

Ponieważ pojedyncza studzienka MTP mieści najwyżej 360 μί, badanie prowadzi się wykorzystując bardzo małe objętości substratu i supernatantu. Im więcej supernatantu się dodaje tym bardziej rozcieńcza się substrat i zmniejsza lepkość początkową. 250 μl 6% roztworu ksylanu pszenicy orkisz dodaje się do studzienek MTP. Przygotowuje się serię referencyjnych rozcieńczeń ksylanazy (ksylanaza z A.tubigenesis o aktywności 685400 EXU/g, 1 EXU = 4,53 mola cukrów redukujących/min/g) i po 30 μl każdego rozcieńczenia dodaje się do substratu. Lepkość każdej próbki mierzy się po inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 50°C. Najniższe wykrywane stężenie enzymu odpowiada 53,6 ng/ml lub 0,0367 EXU/ml. Tak więc, dodanie 20 μl supernatantu do 300 μl substratu pozwala na wykrycie bardzo niskich aktywności enzymu.

(g) Ustawienia metody do identyfikacji termostabilnych enzymów

W celu wyszukania w bibliotece tylko enzymów termostabilnych i w celu uniknięcie nakładania się enzymatycznej aktywności gospodarza - A.niger, płytki zawierające klony podejrzane o wytwarzanie enzymów termostabilnych poddaje się działaniu ciepła. System waliduje się używając pustych szczepów gospodarza, szczepów gospodarza eksprymujących termoniestabilne enzymy i szczepów gospodarza eksprymujących termostabilne enzymy. Po wyhodowaniu szczepu i wytworzeniu enzymu płytki MTP ogrzewa się w temperaturze 72°C przez 30 minut. Następnie 20 μl supernatantu dodaje się do 300 μl 6% roztworu ksylanu pszenicy orkisz. Razem z kontrolami negatywnymi (dodanie 20 μl wody), płytki zawierające próbki szczelnie zakrywa się taśmą klejącą i inkubuje w piecu w temperaturze 60°C. Wysoka temperatura może zwiększyć aktywność termostabilnego enzymu i zniszczyć nakładającą się na odczyt aktywność enzymatyczną tła enzymów gospodarza - A.niger i aktywność enzymatyczną szczepów otrzymanych w bibliotece eksprymujących termo-niestabilne enzymy. Po 20 godzinach inkubacji nie stwierdza się zauważalnego spadku wysokości piku dla klonów zawierających termoniestabilną ksylanazę, co wskazuje, ze aktywność ksylanazy komórek gospodarza została całkowicie inaktywowana. Ponadto, jako kontrolę włączono klony zawierające termo-niestabilną ksylanazę xynB z Aspergillus niger. W tym przypadku nie wykrywa się żadnej szczątkowej aktywności enzymatycznej, podczas gdy oporna na ciepło ksylanaza, która była włączona jako kontrola, była wciąż aktywna. Inaktywacja ciepłem przez 30 minut w temperaturze 72°C i inkubacja próby przez 24 godziny lub mniej pozwala na specyficzne wykrycie termostabilnych ksylanaz T. emersonii.

III. Przeszukiwanie biblioteki ekspresyjnej cDNA przy użyciu robota Hamilton Visco.

(h) Replikacja biblioteki ekspresyjnej cDNA i ekspresja tej biblioteki.

Jeden cykl replikacyjny obejmuje dwukrotne zaszczepienie podłoża selekcyjnego (SM) (zawierającego na litr: 0,52 g KCI, 1,52 g KaHPO4, 0,52 g MgSO4, 20 9 glukozy, 1 g acetamidu, 0,1 M buforu MES, 15 g agaru, 1 ml roztworu elementów śladowych [roztwór elementów śladowych (zawiera na 1 litr): 2/2 g ZnSO4/7H2O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO4/7H2O, 0,17 g CaCI2/6H2O, 0,16 g CuSO4/5H2O, 0,15 g NaMoO4/2H2O, 5,0 g EDTA, pH 6,5) pH 5,5) i płynnego podłoża do hodowli (GM) (zawierającego na litr, 70 g glukozy, 25 g hydrolizatu kazeiny, 12,5 g ekstraktu drożdżowego, 1 g KH2PO4, 0,5 g K2SO4, 2 g MgSO4, 0,03 g ZnCI2, 0,02 g CaCI2, 0,01 g MnSO4, 0,39 FeSO4, pH 5,6). Bibliotekę przechowuje się w standardowych MTP, i sporulujące rekombinowane kolonie A.niger hoduje się w każdej studzience na SM w obecności 10% glicerolu. W czasie przechowywania, pytki te (płytki wyjściowe/ MP) trzyma się zamrożone (-80°C). Przed replikacją MP płytki rozmraża się przez godzinę w sterylnym wyciągu laboratoryjnym w celu uniknięcia kontaminacji mikrobiologicznej. Replikację MP prowadzi się przy użyciu PBA Flexys-Colony Replicator. Jako matryc replikacyjnych używa się hodowanych przez 5 dni płytek wyjściowych a kolonie potomne hoduje się w 96-studzienkowych MTP napełnionych płynnym podłożem do hodowli (GM). Świeżo zaszczepione płytki SM z agarem umieszcza się w temperaturze

PL 209 225 B1

32°C i następnie po dodaniu 150 μl 10% glicerolu na studzienkę przechowuje w temperaturze -80°C. Otrzymane płytki GM inkubuje się w nasyconym wodą Tomtec Quadrastor Shaker 96000 (w temperaturze 32°C). Wzrost mycelium stwierdza się na płytkach po 2-3 dniach. Płytki GM inkubuje się przez 6 dni.

(i) Próbkowanie supernatantu po zakończeniu wzrostu.

Po 6 dniach wzrostu, pozostające płynne podłoże do hodowli GM (zawierające produkty eksprymowane zewnątrzkomórkowo) ekstrahuje się i przenosi do świeżych MTP. Supernatanty przenosi się do świeżych MTP przy użyciu 4-kanałowego robota pipetującego Tecan. Średnio odzyskuje się pomiędzy 120 i 140 μl supernatantu. Płytki zawierające supernatant zamraża się i kolejno bada pod kątem aktywności ksylanazy.

(j) Przygotowanie do przeszukiwania na skalę przemysłową

Płytki z supernatantem zawierające bibliotekę ekspresyjną rozmraża się i umieszcza w zamkniętej łaźni wodnej w temperaturze 72°C przez 30-40 minut. Przy użyciu 12-kanałowej pipety i dostępnych w handlu gotowych końcówek do pipet w jednorazowych pojemnikach wielkości MTP (dostarczonych przez Ependorf), 20 μl każdego supernatantu przenosi się MPT zawierających mieszaninę substratów, które przed dodaniem supernatantów były podgrzane do temperatury 60°C. Mieszanina substratów zawiera mieszaninę 1:1 1% roztworu pektyny (patrz punkt (k) poniżej) i 7% roztworu ksylanu pszenicy orkisz (patrz punkt (I) poniżej), o końcowym pH 4,12. Płytki MPT do testu napełnia się 310 ml substratu na studzienkę. Supernatanty i mieszaninę substratu miesza się końcówkami do pipet bezpośrednio po dodaniu supernatantów. Następnie płytki umieszcza się w piecu w temperaturze 60°C i inkubuje przez 18-24 godziny. Po inkubacji pozwala się płytkom MTP ostygnąć i przy użyciu robota Hamilton Visco (Hamilton Company, Reno, USA) bada się je pod kątem zmniejszenia się lepkości.

(k) Przygotowanie 1% roztworu pektyny, pH 4,1

Przygotowuje się bufor cytrynianowo-fosforanowy (bufor Mc Ilvaine'a) przez dodanie 0,2 M roztworu Na2HPO4 do 250 ml 0,1 M roztworu kwasu cytrynowego aż do momentu kiedy uzyska się pH 5,5. Mieszaninę dopełnia się do 1 litra wodą destylowaną i, jeśli to konieczne, ponownie ustawia się wartość pH. 0,5% roztwór pektyny robi się wolno dodając 0,5 g wysoko metylowanej pektyny (typu Ruban Brun) do butelki zawierającej 50 ml opisanego powyżej buforu Mcllvaine'a i 25 ml wody destylowanej w temperaturze 60°C. Szybkie mieszanie zapewnia dobre rozpuszczenie się pektyny. Roztwór dopełnia się do 100 ml i sprawdza pH. Użyta tu pektyna obniża wartość pH roztworu, i w tych warunkach roztwór ma pH 5,1. Jeśli roztwór pektyny jest mętny, w celu usunięcia wszystkich nierozpuszczonych cząsteczek korzystnie wiruje się go z szybkością 15 x g przez 15 minut.

(l) Przygotowanie 7% roztworu ksylanu pszenicy orkisz, pH 4,1 ml 2M roztworu NAOH ogrzewa się do temperatury 60°C w 15 ml zlewce. W oddzielnej zlewce do 20 ml wody dodaje się 7 g ksylanu pszenicy orkisz (z Sigma Company) i otrzymuje się jasnobrązową, gęstą masę. Jeśli to konieczne, dodaje się więcej wody, ale nie więcej niż razem 30 ml. Przy użyciu stalowej łyżeczki tę mieszaninę wody i ksylanu pszenicy orkisz powoli dodaje się do gorącego roztworu NaOH. Żeby rozpuścić ksylan w roztworze zasady należy użyć silnego urządzenia mieszającego, utrzymując jednocześnie stałą temperaturę 60°C. Po rozpuszczeniu się całego ksylanu roztwór staje się ciemnobrązowy i przypomina bardzo lepki, gęsty syrop. Następnie dodaje się resztę wody, czyli dodaje się całkowicie 50 ml wody. Pozwala się mieszaninie ostygnąć i dodaje się 4N HCI do osiągnięcia pożądanego pH (przeważnie pH 4,1-4,2). Roztwór dopełnia się do 100 ml i jeśli to konieczne ponownie ustawia się wartość pH. Po wirowaniu 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 10°C otrzymuje się klarowny żółtawy supernatant (którego lepkość zależy od dodanej na początku ilości ksylanu pszenicy orkisz).

(m) Przeszukiwanie biblioteki

Wynikiem przeszukania biblioteki Talaromyces emersoni klonowanej do A.niger było 119 rysunków odpowiadających 119 przebadanym MTP. Każdy rysunek pokazuje lepkość 96 studzienek pokazaną jako 96 pików, odzwierciedlających podciśnienie w studzience wyrażone w mV. Rysunki analizuje się wybierając niskie piki, wskazujące na zmniejszoną lepkość. Piki, które są niższe niż średnia wysokość piku wybiera się do ponownego testowania. Niektóre płytki wykazują bardzo małe zróżnicowanie, więc wybranie potencjalnie pozytywnych klonów do powtórnego testowania jest łatwe. Inne płytki wykazują duże zróżnicowanie więc często do powtórnego testowania wybiera się 5 lub 6 potencjalnie pozytywnych klonów. Jako kontrolę pozytywną po inkubacji do losowo wybranej płytki w ustalonej pozycji dodaje się 10 μl endoksylanazy. Takie pozytywne kontrole wykazały, że jeśli aktywność ksylanazy jest obecna w studzience można spodziewać się piku o wysokości pomiędzy 240 i 280 mV.

PL 209 225 B1

Zbadane płytki z biblioteki Talaromyces zawierały, pięć potwierdzonych klonów zawierających termostabilną ksylanazę, które znaleziono wcześniej, używając testu wykrywania barwnika, opartego na rozpuszczaniu barwników, które były chemicznie związane z nierozpuszczalnymi polimerowymi substratami. Wszystkie pięć klonów niezależnie znaleziono stosując test pomiaru lepkości w pierwszej rundzie poszukiwań. Piki wszystkich znanych klonów miały wysokość dużo mniejszą niż pozostałe piki (250 mV). 118 studzienek wybrano do powtórnego testowania wyłączając te, o których wiadomo, że miały ksylanazę.

(n) Powtórne testowanie 118 potencjalnie pozytywnych klonów

Powtórne testowanie oparte jest na pomiarze lepkości według założeń opisanych dla przeszukiwania na skalę przemysłową. Jednak tym razem używa się większych objętości testowych, ponieważ wymagana jest większa różnica pomiędzy aktywnością enzymu termostabilnego i powstającymi nieregularnymi niskimi pikami. Dwie duże MTP (2 ml/studzienkę) napełnia się 1,2 ml 9% roztworu ksylanu pszenicy orkisz. Do dwóch pierwszych studzienek każdego rzędu dodaje się 50 μl wody (kontrola negatywna). Do ostatniej studzienki każdego rzędu dodaje się 50 μl referencyjnego roztworu ksylanazy jako kontrola negatywna. Studzienki 3 do 11 każdego rzędu używane są do powtórnego testowania potencjalnych klonów zawierających ksylanazę (dodanie 50 μl supernatantu). Po wymieszaniu i inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 60°C, przy użyciu specjalnie napisanego programu Eclipse (objętość zasysana: 800 μί; Szybkość zasysania: 10 sekund/ml) mierzy się lepkość.

Zidentyfikowano kilka pozytywnych klonów, których piki były dokładnie na tym samym poziomie co kontrole pozytywne, co wskazuje na całkowitą degradację ksylanu. W czasie powtórnego badania lepkości zidentyfikowano trzynaście potencjalnie pozytywnych szczepów. Inserty cDNA klonuje się bezpośrednio do wektora pCR2.1 dzięki reakcji amplifikacji chromosomowego DNA metodą PCR. Z 12 szczepów biblioteki uzyskano szesnaście insertów cDNA stosując po-polimerazę i zestaw starterów 2 (11937/12207r SEQ ID No 7 i 8). Orientację insertów cDNA w wektorze pCR2.1 określa się trawiąc enzymem restrykcyjnym XhoIr, który rozpoznaje miejsca w wektorze i 3'końcu cDNA. Analizę sekwencji DNA prowadzi się od 5'-końca insertu cDNA.

W podobny sposób prowadzi się powtórne badanie pod kątem enzymów degradujących pektynę, z jednym wyjątkiem, że zamiast 9% roztworu ksylanu pszenicy orkisz używa się 1% roztworu pektyny. W czasie powtórnego badania znaleziono tylko dziesięć klonów, i były to te klony, które w czasie pierwszego badania miały bardzo niskie piki, ale nie wykazywały żadnej aktywności w czasie powtórnego badania pod kątem aktywności ksylanazy. Jeden klon powtarzalnie wytwarzał enzym degradujący pektyny. Zmierzona wartość ciśnienia wynosiła 200 mV, co odpowiada lepkości czystej wody. Ponieważ użyta pektyna nie była całkowicie metylowana, mogła zostać zdegradowana przez termostabilną poligalakturonazę, pektynazę lub liazę pektynową, (o) Korzyści z badania lepkości

Opracowanie metody badania lepkości do identyfikowania termostabilnych enzymów było ułatwione dzięki trzem kluczowym czynnikom. Po pierwsze, możliwość cieplnej inaktywacji natywnej aktywności ksylanazy gospodarza pozwalała na szybsze dopasowanie odpowiednich warunków reakcji. Po drugie, kiedy testowano klony, zawierające termoniestabilne enzymy, ciepło całkowicie inaktywowało ich aktywność, tak więc wyszukiwano tylko bardziej termostabilne enzymy. Po trzecie wyższe temperatury zwiększają aktywność enzymatyczną, co czyniło test bardziej czułym. Na ksylanie pszenicy orkisz (Sigma) zidentyfikowano jedenaście klonów, które były zdolne do znaczącego zmniejszenia lepkości, a na pektynie zidentyfikowano ostatecznie jeden klon degradujący pektyny. Ponadto, powtórnie i niezależnie zidentyfikowano pięć klonów wytwarzających termostabilną ksylanazę, które zidentyfikowano już poprzednio.

P r z y k ł a d 7: Charakteryzowanie pierwszej termostabilnej β-glukanazy Talaromyces emersonii (CEA) z transformantów A.niger

Testy aktywności i definicje

Definicja jednostki PAHBAH celulazy (CPU)

Jedna jednostka aktywności celulazy określona jest jako ilość enzymu potrzebna do uwolnienia jednego μmola cukrów redukujących, w czasie jednej minuty w pH 5,0 w temperaturze 60°C przy stężeniu substratu 5% karboksymetylocelulozy (CMC), przy użyciu krzywej kalibracyjnej dla glukozy.

Aktywność enzymu według metody CPU mierzy się wykrywając cukry redukujące przy użyciu hydrazydu kwasu 4-hydroksybenzoesowego (PAHBAH). Test oparty jest na publikacji Lever, M., Powell, J.C., Killip, M., Small, C.W. (1973) J. Lab. Clin. Med. 82, 649-655 z pewnymi modyfikacjami. Do odczynnika PAHBAH wprowadzono następujące modyfikacje: 0,05 M cytrynianu trisodowego, 0,1 M

PL 209 225 B1

Na2SO4, 0,02 M CaCI2, 0,5 M NaOH i 0,1 M hydrazydu kwasu p-hydroksybenzoesowego (PAHBAH). Końcowe pH wynosiło 12. Związek zawierający PAHBAH w roztworze zasadowym, przechowywany w temperaturze pokojowej, powinien być zużyty w ciągu jednego dnia. Jako redukującego cukru odniesienia używa się glukozy (krzywa kalibracyjna). Do krzywej kalibracyjnej tego testu stosowano końcowe stężenie glukozy po pomiędzy 0-300 mM. Aktywność CPU mierzy się mieszając 100 μl roztworu enzymu z 400 μl 5% roztworu CMC w 0,1 M buforze z octanem sodu (pH 5,0). Naczynka Ependorfa z substratem (CMC) inkubuje się przez 5 minut w temperaturze 60°C. Reakcję rozpoczyna się dodając roztwór enzymu. Po 15 minutach reakcję zatrzymuje się dodając 1,0 ml odczynnika PAHBAH. Naczynka Ependorfa podgrzewa się przez 5 minut w temperaturze 100°C i oziębia w lodzie. W celu oddzielenia jakiegokolwiek stałego materiału, próbki wiruje się z odpowiednią szybkością (1 minuta na pełnej szybkości w wirówce Beckman Microfuge E). Absorbancję mierzy się przy długości fali 420 nm. Ślepą próbę przygotowuje się dodając 100 μl 0,1 M buforu z octanem sodu zamiast roztworu enzymu.

Definicja jednostki beta-glukanazy (BGU)

Jednostka aktywności beta-glukanazy określona jest jako ilość enzymu potrzebna do uwolnienia 0,258 μmola cukrów redukujących (zmierzonych jako równoważniki glukozy) w czasie jednej minuty w pH 3,5 w temperaturze 40°C przy stężeniu substratu 0,5%.

Oprócz określonej powyżej aktywności celulazy (CPU), w celu wykrycia aktywności β-glukanazy prowadzi się bardziej specyficzny test. Test oparty jest na pomiarze szybkości z jaką spada lepkość roztworu podłoża zawierającego β-glukan jęczmienia (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) po dodaniu pewnej ilości enzymu.

GIukan jęczmienia (Megazyme Australia), rozpuszcza się w 0,425 M buforze cytrynianowym pH 3,5 do stężenia 6,25 mg/ml. Substrat inkubuje się w temperaturze 40°C przez 10 minut. Następnie dodaje się niewielką ilość enzymu (w zakresie 0,005 - 0,062 jednostek/ml) i pozwala się na zachodzenie reakcji. W 60 minucie reakcji określa się lepkość próbki w stosunku do próbki referencyjnej, która była inkubowana ze znaną standardową aktywnością endoglukanazy. Absolutną aktywność standardu określa się metodą cukrów redukujących przy użyciu Fe-III-heksacyjanidu i 4,76 mg/ml β-glukanu jęczmienia jako początkowego stężenia substratu.

Definicja jednostki endo-ksylanazy (EXU)

Jednostka aktywności endo-ksylanazy (EXO) określona jest jako ilość enzymu (endo, endo-1,4-β-ksylanazy z Asp. niger, tak jak opisano w EP-A-0463706 (Gist-brocades B.V.)) potrzebna do uwolnienia 4,53 pmola cukrów redukujących (zmierzonych jako równoważniki ksylozy) w czasie jednej minuty w warunkach testowych. Warunki testowe obejmują: 5mg/ml arabinoksylanu z mąki pszennej (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) w 100 mM buforze cytrynianowym (pH 3,5), temperatura 40°C, czas reakcji 60 minut. Reakcję zatrzymuje się dodając 1M NaOH. Wykrywanie prowadzi się kolorymetrycznie przy długości fali 420 nm po inkubacji próbek z Fe-III-heksacyjanidem przez 15 minut w gotującej się wodzie. Odczynnik heksacyjanożelazowy przygotowuje się przez rozpuszczenie 1,17 g KFe(CN) i 19,5 g bezwodnego węglanu sodowego w 1 litrze wody.

Oprócz opisanego powyżej absolutnego określenia aktywności ksylanazy, używa się także metody relatywnej, w której oznacza się spadek lepkości roztworu arabinoksylanu pszenicy (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Paradę, Warriewood NSW 2101) po dodaniu pewnej ilości enzymu. Arabinoksylan pszenicy (Megazyme Australia), rozpuszcza się w 0,425 M buforze cytrynianowym (pH 3,5) do stężenia 8,3 mg/ml. Substrat inkubuje się w temperaturze 55°C przez 10 minut. Następnie dodaje się niewielką ilość enzymu (w zakresie 0,01 - 0,05 jednostek/ml)i pozwala się na zachodzenie reakcji. Po 60 minutach reakcji określa się lepkość próbki w stosunku do próbki referencyjnej, która była inkubowana ze znaną standardową aktywnością w EXU endoksylanazy Aspergillus niger (EP-A-0463706). Absolutną aktywność standardu w EXU określa się metodą cukrów redukujących przy użyciu Fe-III-heksacyjanidu tak jak opisano powyżej. Lepkość określa się ręcznie przy użyciu wiskometru z opadającą kulką firmy Haake.

Definicja jednostki celulazy (CXU)

Jednostka aktywności beta-glukanazy (BGU) określona jest jako ilość celulazy która hydrolizuje w ciągu jednej godziny ilość wiązań glikozydowych równoważnych wytworzeniu 0,5 mg glukozy w warunkach testowych. Warunki testowe obejmują: 9 mg/ml karboksymetylocelulozy w 5 mM buforze z octanem sodowym (pH 4,6), temperatura 37°C. Uwolnioną glukozę mierzy się metodą cukrów redukujących przy użyciu odczynnika DNS.

PL 209 225 B1

Oprócz opisanego powyżej absolutnego określenia aktywności celulazy, używa się także metody relatywnej, w której oznacza się spadek lepkości roztworu karboksymetylocelulozy po dodaniu pewnej ilości enzymu. Karboksymetylocelulozę rozpuszcza się w 5 mM buforze cytrynianowym (pH 4,6) do stężenia, które zależy od lepkości danej partii. Substrat inkubuje się w temperaturze 37°C przez 10 minut. Następnie dodaje się niewielką ilość enzymu i pozwala się na zachodzenie reakcji. Po 60 minutach reakcji określa się lepkość próbki w stosunku do próbki referencyjnej, która była inkubowana ze znaną standardową aktywnością CXU.

Aktywność wrt pH β-Glukanaza T.emersonii wytwarza się za pomocą odpowiednich transformantów A. niger hodowanych w butelkach do wytrząsania tak jak opisano w przykładzie 3. Po zakończeniu wzrostu mycelium usuwa się przez filtrację. Filtratu używa się do doświadczeń.

Aktywność filtratu mierzy się w różnych wartościach pH w stałej temperaturze 60°C. Aktywność mierzy się metodą CPU. Zamiast stosowania stałego pH wynoszącego 5, substrat CMC rozpuszcza się w buforze cytrynianowym o wartości pH odpowiedniej do uzyskania wartości pH pomiaru. Eksperyment powtórzono dwa razy i wyniki pokazano poniżej w tabeli 1. Stwierdzono, że optymalna wartość pH wynosi pomiędzy pH 4,5 i 5,0, około pH 4,8.

T a b e l a 1

Profil pH w temperaturze 60°C

pH	aktywność (ąM glukozy/15 minut) w temperaturze 60°C (dwa pomiary)
3	27,2	27,7
3,5	66,6	64,2
4	109,3	102,6
4,5	133,8	120,6
5	121,3	135,5
5,5	116,4	107,4
6	68,7	69,3

Aktywność wrt temperatura

Aktywność β-glukanazy mierzy się w różnych temperaturach. Aktywność mierzy się metodą CPU w pH 4. Zamiast inkubować w stałej temperaturze 60°C, próbki inkubuje się w różnych temperaturach. Eksperyment przeprowadzono dwa razy i wyniki pokazano poniżej w tabeli 2. Stwierdzono, że optymalna temperatura wynosi pomiędzy 80°C i 85°C. Wydaje się, że Topt wynosi około 84°C (chociaż w zależności od tego jak narysuje się i interpoluje linie pomiędzy punktami, może wynosić 82°C, 83°C lub 85°C).

T a b e l a 2

Profil temperaturowy w pH 4

Temperatura (°C)	Aktywność (pM glukozy/15 minut) (dwa pomiary)
60	87,8	102,1
70	156,4	154,6
80	208,5	213,1
90	185,4	176,4

Aktywność wrt inne enzymy

Dodatkowo metodą BGU mierzy się aktywność β-glukanazy w temperaturze 30-60°C i porównuje z dostępnym w handlu bezkomórkowym bulionem T.reesei mającym aktywność celulazy i glukanazy, jako próbkami referencyjnymi. Bezkomórkowy bulion T.reesei zawiera mieszaninę różnych enzymów, a wśród nich jedną lub większą liczbę β-glukanaz, ale te aktywności nie zostały dokładnie scharakteryzowane. Dla porównania aktywności β-glukanazy T.emersonii wytworzonej sposobem według wynalazku z aktywnością celulaz/glukanaz T.reesei, enzymy dozuje się tak, żeby miały podobną aktywność w temperaturze 40°C. Aktywność β-glukanazy A T.emersonii w temperaturze 40°C, przyjmuje się za jeden, a inne aktywności odnosi się do niej. Wyniki pokazano w tabeli 3 poniżej.

PL 209 225 B1

T a b e l a 3

Względna aktywność wrt enzymów T.reesei

Temperatura (°C)	Względna aktywność: β-glukanazy (CEA)	Względna aktywność: celulaz/glukanaz z T.reesei
30	0,50	0,44
40	1,00	1,13
50	1,57	1,32
60	2,40	1,59

W temperaturach powyżej 40°C aktywność celulazy/glukanazy T.reesei zmniejsza się w porównaniu z β-glukanazą T.emersonii. Powyżej 40°C aktywności rozdzielają się, CEA zaczyna być bardziej aktywna. Co więcej, chociaż relatywna aktywność jest wyższa w wyższych temperaturach, w umiarkowanych temperaturach aktywność CEA jest podobna do aktywności mieszaniny T.reesei. Ilustruje to szeroki zakres temperatur w jakich aktywna jest β-glukanaza.

Oczyszczanie i aktywność właściwa

Oczyszczanie β-glukanazy T.emersonii rozpoczyna się od filtrowania. Około 25 ml bezkomórkowego bulionu odsala się na kolumnie PD10 i umieszcza na kolumnie anionowymiennej Q 6 ml, która była zrównoważona 10 mM buforem octanowym (pH 5,0). Wymywanie prowadzi się stosując liniowy gradient od 10-300 mM buforu octanowego(pH 5,0). (Gradient liniowy A do B; szybkość przepływu: 6 ml/minutę i czas wymywania: 54 minuty; monitorowanie przy długości fali: 280 nm, 254 nm, 214nm). Aktywne frakcje zbiera się (20 ml), zatęża w koncentratorze Microsep (3,5 ml, 10 K) i przemywa dwukrotnie 0,1 M buforem fosforanowym (pH 5,0). Czystość frakcji określa się metodą HPL-SEC (chromatografia sączenia molekularnego) i SDS-PAGE.

Pomiar aktywności właściwej

Obliczony molowy współczynnik ekstynkcji dla β-glukanazy przy długości fali 280 nm wynosi

-1 -1

81550 M^-1cm^-1. Stężenie białka w oczyszczonym enzymie określa się na podstawie pomiarów ekstynkcji E280^1om stosując wartość absorpcji właściwej E280^1om = 2,33 dla roztworu 1 mg/ml. Aktywność właściwą oczyszczonej próbki określono w BGU (substrat: beta-glukan jęczmienia) i wynosiła ona 1027 BGU/mg. Metodą CPU określono aktywność właściwą na 628 jednostek/mg. Ponieważ aktywność zmierzona lepkościomierzem była wysoka w porównaniu z aktywnością zmierzoną metodą cukrów redukujących, przyjmuje się, że β-glukanaza T.emersonii posiada znaczącą aktywność endoglukanazy. Typowa egzo-glukanaza powinna mieć wysoką aktywność w teście cukrów redukujących, i niską podczas pomiaru lepkościomierzem.

Punkt izoelektryczny

EF-PAGE wykonuje się następująco. Używa się następującego sprzętu: Phast system (Pharmacia Biotech), IEF 3-9 PhastGel (Pharmapia Biotech). Żele rozwija się i barwi (Coomassie) według standardowych metod Phast system. Punkt izoelektryczny określa się na PhastGel IEF 3-9. Wynosi on 3,3.

Określenie ciężaru cząsteczkowego

SDS-PAGE wykonuje się następująco. Znów używa się Phast system (Pharmacia Biotech); 12,5% żeli homogennych (Pharmacia Biotech); pasków SDS-buffer (Pharmacia Bio-tech). Traktowanie próbki: jedna objętość (5 próbek) buforu (500 mM Tris-HCI, pH 6,8, 10% SDS, 0,1% błękitu bromofenolowego) miesza się z 4 objętościami próbki i gotuje przez 3 minuty. Żele rozwija się i barwi (Coomassie) według standardowych metod Phast system. Chromatografię sączenia molekularnego prowadzi się przy użyciu kolumny TSK G3000SW, Numer katalogowy 05103 (TosoHaas). Metoda: eluenty: 0,1 M bufor fosforanowy sodowy pH 7,0, Szybkość przepływu: 1 ml/min, Czas wymywania: 30 min, Długość fali: 280 nm. Deglikozylacja enzymu: zmieszać 5 gl oczyszczonego enzymu (7 mg/ml) z 20 gl 0,5% SDS i 25 gl 1% β-merkaptoetanolu. Mieszaninę gotuje się przez 4 minuty. Po oziębieniu dodaje się 20 gl N-glikozydazy F (500 U/ml) i 20 gl 3% Triton X-100 w 1 M buforze fosforanowym sodowym pH 7,0. Mieszaninę inkubuje się przez noc i stopień deglikozylacji analizuje się metodą SDS-PAGE. Ciężar cząsteczkowy określony na żelu SDS-PAGE i HP-SEC wynosi 43 kDa. Po deglikozylacji na żelu SDS-PAGE otrzymano prostą linię odpowiadającą wielkości 37 kDa.

Termostabilność

T50 termostabilności określono stosując jako próbki referencyjne celulazy/glukanazy T.reesei. T50 jest temperaturą, w której po 20 minutach inkubacji pozostaje 50% aktywności. W tabeli 4 poka30

PL 209 225 B1 zano różnice w T50 termostabilności pomiędzy oczyszczoną β-glukanazą T.emersonii i mieszaniną celulazyjglukanazy T.reesei używanych we wcześniejszych przykładach (aktywność początkową przyjęto za jeden: enzymy inkubuje się przez 20 minut i po oziębieniu mierzy się aktywność metod CPU). Każdy eksperyment powtórzono dwa razy. W tabeli 4 pokazano oba pomiary. T50 termostabilność oczyszczonej β-glukanazy wynosiła około 93,4°C, a T50 termostabilność celulazy/glukanazy T.reesei wynosiła około 64,9°C.

T a b e l a 4

Termostabilność wrt enzymów T.reesei

Temperatura (°C)	Aktywność resztkowa (%) celulazy/glukanazy T.reesei	Aktywność resztkowa (%) β-glukanazy (CEA)
40	97	98
50	96	100	100	99
60	85	83	100	99
70	14	14	98	95
75	0	0	93	96
80	0	0	88	90
85	0	0	89	94
90	0	0	65	64
110			0	0

P r z y k ł a d 8: Pomiary aktywności

Dwa szczepy z biblioteki, które zidentyfikowano w czasie przeszukiwania za pomocą pomiarów lepkości w przykładzie 6, używając jako substratu ksylanu pszenicy orkisz, hoduje się w butelkach do wytrząsania na podłożu GM (oryginalne szczepy oznaczono AD009.21 i AD011.31). Zbadano także szczep oznaczony AD021.B6 (CEA), który jak stwierdzono w przykładzie 4 i 5 wytwarza aktywność β-glukanazy. Przeprowadzono kilka testów, których wyniki pokazano poniżej. Niespodziewanie szczepy AD009.21 i AD011.31 wykazywały niewielką aktywność ksylanazy. Natomiast wydaje się, że szczepy AD009.21 i AD011.31 wykazują aktywność celulazy, pomimo, że klony zidentyfikowano na podstawie badań zmiany lepkości ksylanu pszenicy orkisz. Szczególnie βD009.21 był bardzo aktywny w stosunku do β-glukanu jęczmienia.

T a b e l a 5

Hodowla w butelkach do wytrząsania szczepów celulazowych;

aktywność ksylanazy (EXU/ml), β-glukanazy (BGU/ml) i celulazy (CXU/ml)

Szczep (i oznaczenie glukanazy)	EXU/ml	BGU/ml	CXU/ml
AD021.B6 (CEA)	<10	160	524
AD009.21 (CEB)	<10	884	254
AD011.31 (CEC)	<10	<10	7

Limit wykrywania określono na poniżej 10 dla testów EXU i BGU, oraz 5 dla testu CXU.

Analiza DNA szczepów AD009.21 i AD011.31 (tak jak opisano w przykładzie 6) ujawniła dwie nowe β-glukanazy, nazwane CEB i CEC. Sekwencje nukleotydowe regionów kodujących pokazane są na SEQ ID NO 3 i 5, a odpowiadające im sekwencje aminokwasowe pokazane są odpowiednio na SEQ ID NO 4 i 6.

Szczep CEB wykazuje wysoką aktywność β-glukanazy. W porównaniu ze szczepem CEB, szczep CEA wykazuje stosunkowo wysoką aktywność celulazy. Stosunek aktywności β-glukanazy do aktywności celulazy jest różny dla CEA i CEB. Szczep CEC wykazuje aktywność celulazy, ale jego aktywność β-glukanazy lub ksylanazy była poniżej limitu wykrywania użytych testów. Jednakże, badania homologii mocno sugerują aktywność β-glukanazy, i uważa się, że może ona być znacznie wyższa w innych pH.

Użycie więcej niż jednego substratu do przeszukiwania jest możliwe. Niespodziewanie okazało się, że zamiast dwóch substratów w czasie badania lepkości można użyć jednocześnie trzech różnych

PL 209 225 B1 substratów. Jednym z tych trzech substratów było zanieczyszczenie polimeru glukozy, prawdopodobnie glukanem lub materiałem celulozowym. Wykazano, że użycie ksylanu pszenicy orkisz, pektyny i materiału podobnego do celulozy pozwala na identyfikację trzech typów enzymów, ksylanaz, pektynaz i celulaz w czasie pojedynczej rundy przeszukiwania. Pomiar lepko ś ci ma jedn ą du żą zaletę w stosunku do innych powszechnie używanych testów z barwnikiem. Testy wykrywania barwnika oparte są na chemicznym połączeniu barwnika z substratem. Tego typu substrat jest dostępny w handlu tylko dla kilku związków. Natomiast do testu pomiaru lepkości można użyć każdego typu lepkiego substratu, nawet substratu naturalnego, który nie wymaga żadnego, wcześniejszego traktowania chemicznego. Jest to ważny aspekt, ponieważ z komercyjnego i przemysłowego punktu widzenia możliwość badania aktywności enzymatycznej na substratach, których lepkość spada (na przykład soki owocowe) lub których lepkość rośnie (na przykład produkty mleczarskie) ma znaczenie komercyjne.

P r z y k ł a d 9: Zachowanie się endoglukanazy Talaromyces emersonii (CEC) w czasie pieczenia

Wytwarzanie cienkiego chleba jest standardowym procesem piekarniczym i prowadzi się go mieszając 3500 g mąki pszennej (mieszanina 80% mąki pszennej Kolibri i 20% mąki pszennej Ibis (Meneba, Holland) w temperaturze około 21°C), 77 g prasowanych (Konings) drożdży, 70 g soli, 25 ppm kwasy askorbinowego, 10 ppm grzybowej α-amylazy Fermizyme™P₂₀₀, (DSM N. V., Bakery Ingredients, Delft, Holandia), różnych ilości endoglukanazy CEC (z 4 różnych klonów, określonych przez ich numer AD) i 2030 ml wody (8-15°C) w mikserze spiralnym (Hobart) przez 2 minuty (przy szybkości 1) i przez około 6 minut (przy szybkości 2) wkładając 125 Wh (watogodzin) energii. Temperatura ciasta wynosiła 28°C. Podatność ciasta na przetwarzanie maszynowe mierzona jest ręcznie, przez wykwalifikowanego piekarza.

Bezpośrednio po wymieszaniu ciasto dzieli się na 6 części, każda o wadze 875 g, zaokrągla i pozostawia do wyrośnięcia przez 35 minut w komorze do rośnięcia w temperaturze 34°C i 85% RH (wilgotności względnej). Pod koniec rośnięcia ciasto formuje się, umieszcza w misach i pozostawia do ostatecznego wyrośnięcia przez 75 w komorze do rośnięcia w temperaturze 38°C i 87% RH. W pełni wyrośnięte ciasto piecze się w piecu elektrycznym w temperaturze 210°C przez 30 minut. Po oziębieniu do temperatury pokojowej mierzy się objętość bochenka chleba metodą wypychania ziaren rzepaku. Po 16-24 godzinach przechowywania w zamkniętych polietylenowych torbach w temperaturze pokojowej jakość miękiszu oceniana jest przez wykwalifikowanego piekarza. W takim badaniu piekarniczym zbadano cztery szczepy z biblioteki genowej hodowane w butelkach do wytrząsania, o których wiadomo, że wytwarzają CEC. Wyniki pokazano w tabelach poniżej.

Dawka CEC AD011.31 (CXU/kg mąki)	Objętość bochenka (ml) (%)	Obróbka ciasta	Jakość miękiszu (skala 0-7)
0	4105	100	łatwa, nielepkie	6
56	4357	106	łatwiejsza, nielepkie	6
189	4289	104	łatwiejsza, pewna lepkość	6,5

Dawka CEC AD046b.21 (CXU/kg mąki)	Objętość bochenka (ml) (%)	Obróbka ciasta	Jakość miękiszu (skala 0-7)
0	4105	100	łatwa, nielepkie	6
56	4427	108	łatwiejsza, nielepkie	6
189	4419	108	łatwiejsza, pewna lepkość	6

Dawka CEC AD050.13 (CXU/kg mąki)	Objętość bochenka (ml) (%)	Obróbka ciasta	Jakość miękiszu (skala 0-7)
0	4105	100	łatwa, nielepkie	6
56	4432	108	łatwiejsza, nielepkie	5,5
189	4622 113		łatwiejsza, nielepkie	6

PL 209 225 B1

Dawka CEC AD078.50 (CXU/kg mąki)	Objętość bochenka (ml) (%)	Obróbka ciasta	Jakość miękiszu (skala 0-7)
0	4105	100	łatwa, nielepkie	6
56	4450	108	łatwiejsza, nielepkie	5,5
189	4553	111	łatwiejsza, pewna lepkość	6,5

Jakość ciasta była bardzo dobra. Przy wysokich dawkach endoglukanazy CEC stwierdzono niewielką lepkość w czasie obróbki ciasta. Jednakże, taka niewielka lepkość nie wpływała na podatność ciasta na przetwarzanie maszynowe. Wszystkie ciasta zawierające endoglukanazę CEC były bardzo podatne i łatwe do przetwarzania.

Te wyniki testu pieczenia wskazują, że endoglukanaza CEC jest bardzo wydajna w poprawianiu jakości chleba, zarówno jeśli chodzi o wielkość bochenka, jak i jakość miękiszu. Pomimo większej objętości bochenka struktura miękiszu wciąż była bardzo regularna i drobna.

P r z y k ł a d 10: Porównanie wydajności piekarniczej enzymu Talaromyces emersonii (CEC) i endoksylanazy Asp. niger

Wydajność piekarniczą CEC porównuje się podczas wytwarzania cienkiego chleba holenderskiego z używaną obecnie grzybową endoglukanazą Aspergillus niger. Endoglukanaza A. niger dostarczona jest w czystej, dostępnej w handlu postaci, to znaczy Fermizyme™ HS2000

Enzym	Dawka (CXU/kg mąki)	Objętość bochenka (ml) (%)	Ciasto	Jakość miękiszu (skala 0-7)
endoglukanaza CEC 050.13	0	4105	100	dobre, nielepkie	6
56	4432	108	podatne, nielepkie	5,5
189	4622	113	podatne, nielepkie	6
Fermizyme™ HS2000	0	4123	100	dobre, nielepkie	6
527	4361	106	podatne, nielepkie	6
1056	4535	110	podatne, nielepkie	7

Wyniki te jasno wskazują, że endoglukanaza CEC poprawia objętość bochenka w większym stopniu niż można uzyskać stosując Fermizyme™ HS2000. Ponadto, mniej jednostek/kg mąki endoglukanazy potrzeba było do osiągnięcia pewnego poziomu objętości bochenka, gdy zamiast Ferroizyme™ HS2000 użyto CEC.

P r z y k ł a d 11

W tabeli poniżej przedstawiono porównanie niektórych cząsteczkowych i biochemicznych własności trzech glukanaz.

Glukanaza	MW (po de- glikozylacji)	Wielkość (reszty aminokwasowej)	Aktywność	Numer rodziny*	Optimum pH	PI	Optimum temperaturowe
CEA	43 kDa (37 kDa)	335	3.2.1.4 (endoglukanaza)	5 (struktura 3D: β8β8 TIM beczka)	4,8	3,3 (4,5*)	85°C

2. CBB	44 kDa*	414	3.2.1.4 (endoglukanaza)	7 (struktura 3D: β-obręcz)		4,2	>75°C
CEC	23 kDa*	222	3.2.1.4 (endoglukanaza)	45 (struktura 3D: mieszana β-beczka)		4,0	>75°C

• * Na podstawie klasyfikacji hydrolaz glikozydów (CAZy) • + Przewidywane na podstawie sekwencji aminokwasowej

PL 209 225 B1

Glukanaza/Celulaza	Rodzina	Znane aktywności	Znane aktywności	Wniosek
CEA	5	EC 3.2.1.4 EC 3.2.1.73 EC 3.2.1.53 EC 3.2.1.73 EC 3.2.1.123	celulaza endo 1,6 glukaraza exo 1,3 glucanase mannanase endoglicoceramidaza	Aktywność BGU/CXU mało- prawdopodobna
CEB	7	EC 3.2.1.4 EC 3.2.1.91	celulaza celobiohydrolaza	Aktywność. BGU/CXU mało- prawdopodobna
CEC	45	EC 3.2.1.4	Celulaza	Aktywność HGU/CXU ale w innym pil niż testowane

Glukanaza/Celulaza

Rodzina

3D

Donor Nukleofilowy/Protonów

Mechanizm

CEA	5	TIMS	glu/glu	pozostający
CEN	7	Obręcz	glu/glu	pozostający
CEC	45	mieszana beczka	asp/asp	odwracający
	15	Obręcz	glu/glu	pozostający

CEB, CEC są celulazami, które wykazują aktywność EC 3.2.1.4. Wiele glukolaz może także hydrolizować wiązania 1,4-glukanu jęczmienia, co czyni je szczególnie użytecznymi do pewnych zastosowań, takich jak na przykład eliminowanie czynników antywzrostowych w paszy. Ponieważ aktywność mierzy się testem lepkości możliwe jest, że celulaza wykazywała aktywność endo. Jednakże, nie można wykluczyć, że hydrolizowane były także wiązania 1,3. Na podstawie tych obserwacji nie można więc wykluczyć obecności aktywności EC 3.2.1.73, 3.2.1.39 i 3.2.1.6, chociaż te aktywności znajduje się w enzymach z rodziny 16: charakterystyka rodzin 7 i 16 wydają się być raczej podobne.

Celulazy (EC 3.2.1.4) są przeważnie zdolne do katalizowania endo hydrolizy wiązań 1,4-D-gluzydowych w celulozie. Nazwa systematyczna celulaz to 4-glukanohydrolaza 1,4-(2,3; 1,4)-D-glukanu. Endo-1,4-D-glukanaza id endoglukanaza D są synonimami 4-glukanohydrolazy 14-(1,3;1,4)-D-glukanu. Celulaza może także hydrolizować wiązania 1,4 w D-glukanach zawierających także wiązania 1,3, co czyni je szczególnie użyteczną do pewnych zastosowań, takich jak na przykład eliminowanie czynników antywzrostowych w paszy. Enzymy, które wykazują aktywność endoglukanazy znane są jako glukanazy. Ponadto hydroliza glukanu może być prowadzona przez lichenazy (glukanohydrolaza 1,3-1,4-D-glukanu (EC 3.2.1.73)) i endo-1,3(4)-glukanazę (1,3-(1,3;1,4)-D-glukanu 3(4) glukanohydrolazę (EC 3.2.1.6)).

Podsumowanie aktywności celulaz pokazano w tabeli 10 poniżej.

Numer ECL	Aktywność	Nazwa systematyczna	Zalecana	Synonim
1	2	3	4	5
3.2.1.4	Endo hydroliza wiązań 1,4-(P-D-glukozydowych celulozy. Hydrolizuje także wiązania 1,4 β-D-glukanu także zawierających wiązania 1,3.	4-glukanohydrolaza 1,4-(1,3; 1,4)-β-D-glukanu	Celulaza	glukanaza endo1,4-β-D-endoglukanaza D
3.2.1.73	Hydroliza wiązań 1,4-p-D-glikozydowych β-D-glukanów zawierających wiązania 1,3 i 1,4. Działa na licheninę z β-D-glukany zbóż, ale nie na β-D-glukany zawierające tylko wiązania 1,3 lub tylko wiązania 1,4	Glukanohydrolaza 1,3-1,4-|W-glukanu	Lichenaza

PL 209 225 B1 cd. tabeli

1	2	3	4	5
3.2.1.39	Hydroliza wiązań 1,3 β-D-glukozydowych w 1,3 β-D-glukanach. Ograniczona aktywność do mieszanych (1,3-1,4) β-D-glukanów	Glukanohydrolaza 1,3-β-D-glukanu	Endo-1,3-p- glukozydaza- glukanu	endo 1,3 β-D-glukanaza β 1,3-glukanaza Oligo 1,3 glukozydaza
3.2.1.58	Kolejna hydroliza jednostek β-D-glukozy z nieredukującymi końcami z 1,3-β-D-glukanów, uwalnianie α-glukozy	Glukanohydrolaza 1,3-β-D-glukanu	1,3-β-glukozydaza glukanu	exo β-1,3-glukanaza
3.2.1.75	Losowa hydroliza wiązań 1,6 w 1,6-β-D-glukozydaz. Działa na lutean, pustulan, 1,6-oligo-β-D-glukozydazy	Glukanohydrolaza 1,6-β-D-glukanu	Endo-1,6-glukozydaza glukanu	endo-β-1,6-glukanaza hydrolaza β-1,6-glukanu
3.2.1.6	Endohydroliza wiązań 1,3 lub 1,4 w β-D-glukanach, jeżeli reszta glukozy, której grupa redukująca bierze udział w hydrolizowanym wiązaniu jest podstawiona na C-3. Substraty obejmują D-glukany zbóż, laminarynę, licheninę	3(4) glukanohydrolaza 1,3-(1,3;1,4)-p-D-glukanu	Endo-1,3 (4)-β-glukanaza	β-1,3-glukanaza beta-1,3-1,4-glukanaza endo-β,1,3(4)-glukanaza
3.2.1.91	Hydroliza wiązań 1,4-β^^^kozydowych w celulozie i celotetraozie, uwalnia celobiozę nieredukującego końca	Celobiohydrolaza 1,4-D-glukanu	1,4-β-celobiozylaza celulozy	exoglukanaza celobiohydrolaza exo-celobiohydrolaza

Literatura

1. Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York

2. Innis i wsp. (1990) PCR protocols, a guide to methods and applications Academic Press, San Diego

3. WQ-A-99/32617

4. van Zeij1, C. i wsp. (1998) J Biotechnol. 59: 221-224

5. Devereux i wsp. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395

6. Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300

7. Altschul, S.F i wsp (1990) J Mol Biol 215:403-10

8. Henikoff i Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919)

9. Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl Acad Sci. USA 90: 5873-5787

10. Cunningham i Wells, Science, 244, 1081-1085,1989

11. deVos i wsp. (Science, 255, 306-312(1992)

12. Smith i wsp. (J. Mol. Biol., 224, 899-904, 1992)

13. Wlodaver i wsp. (FEES Lett, 309, 59-64, 1992)

14. Ford i wsp., Protein Expression and Purification, 2, 95-107,1991

15. Goosen i wsp., Transformation and Gene Manipulation in Filamentous Fungi: an overview in: Handbook of Applied Mycology, Vol. 4 (1992)

16. Romanes i wsp., Yeast 8:423-488 (1992)

17. EP-A-0449375

18. WO-A-98/04726

19. WO-A-98/30707

20. Alenkso i Clutterbuck, Fungal Genet. Biol 21: 373-397 (1997)

21. EP-A-0635574

22. WO-A-98/46772

23. WO-A-91/14772

PL 209 225 B1

Lista sekwencj <110> DSM NV <120> NOWE BETA GLUKANAZY <133> N78454A <140>

<141>

<150> GB 00302263.9 <151> 2000-03-20 <160 8 <170> Patentln versja 3.0 <210 1 <211> 1008 <212> DNA <213> Talaromyces emersonii <220>

<22 0 CCS <222> (1)..(1008) <4 0 0 1

a ty Met

day Lys

ttc Phe

agc Ser

agg Arg 5

gtc Val

gtg Val

tgc Cys

ggt Gly

ctg Leu 10

acg Thr

gcc Ala

gca Ala

ggg Gly

ggc Gly 15

gcc Aid

49

ctc

gcc

gct

cca

gtc

aag

gag

aag

ggc

atc

aag

aag

cgg

gcg

tct

ccg

96

Leu

Al a

Ala

Pro

Val

Lys

Glu

I.ys

Gly

Ile

Lys

Lys

Arg

Ala

Ser

Pro

20

25

30

ttt

caa

tgg

tcc

gga

tcc

aac

gag

tct

ggc

gca

gag

ttt

ggg

aac

3dC

144

Phe

Gin

Trp

Pha

Gly

Ser

Asn

Glu

Ser

Gly

Ala

Glu

Phe

Gly

Asn

Asn

35

40

45

aac

atc

cct

ggc

gtg

gag

ggc

acc

gac

tac

acc

ttc

ccc

aac

acg

agc

192

Asn

Ile

Pro

Gly

Val

Glu

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Pro

Asn

Thr

Ser

5C

55

60

gcc

atc

cag

atc

ctc

atc

gac

cag

ggc

atg

aac

ćłtLC

ttc

cgc

gtg

ccg

2 4 C

Ala

Ile

Gin

Ile

Leu

Ile

Aso

Gin

G-y

Met

Asn

Ile

Phe

Arg

Val

Pro

65

70

75

80

ttc

ctg

atg

gag

cgc

atg

gtg

ccc

aac

cag

atg

acg

ggg

ccg

gtg

gat

288

Phe

Leu

Met

Glu

Arg

Met

Val

Pro

Asn

Gin

Met

Thr

Gly

Pro

Val

Asp

85

90

95

tcg

gcg

tat

ttc

cag

ggc

tac

agc

cag

gtt

atc

caC

tac

att

acc

agc

336

Ser

Ala

Tyr

Phe

Gin

Gly

Tyr

Ser

Gin

Vai

Ile

Asn

Tyr

Tle

Thr

Ser

100

105

110

cat

ggc

gcg

tog

gca

gtg

att

gac

ccg

cat

aac

ttc

ggg

ega

tac

tac

384

His

Ala

Ser

Ala

Val

Tle

Asp

Pro

His

Asn

Phe

Gly

Arg

Tyr

Tyr

115

120

125

PL 209 225 B1 aac aat atc atc tcc tcg ccg tct gac ttc cag act ttc tgg cac act 432

Asn Asn Ile Ile Ser Ser Pro Ser Asp Phe Gin Thr Phe Tro His Thr

130 135 140 att gcg tcc aac ttt gcg gat aat gac aat gtc att ttc gac acg aac 480

Tle Ala Ser Asn Phe Ala Asp Asn Asp Asn Val Ile Phe Asp Thr Asn

145 150 155 * 160 aac gaa tac cac gac atg gac gaa agc ctt gtc gtc cag ctc aac cag 528

Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Glu Ser Leu Val Val Gin Leu Asn Gin

165 17C 175 gcc gcc atc gac ggc atc cgc gcc gcg ggc gcc aca tca cag tac atc 576

Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gin Tyr Ile

180 185 190 ttc gtc gag ggc aac tcg tgg acc gęg gcc tgg aca tgg acg cag gtc 524

Phe Val Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Tro Thr Gin Val

195 2C0 205 aac gac gcg atg gcg aac ctg acg gac ccg cag aac aag atc gtg tac 672

Asn Asp Ala Met Ala Asn Leu Thr Asp Pro Gin Asn Lys Ile Vai Tyr

210 215 ' 220 gag atg cac cag tac ctg gac tcg gac ggg tog ggc acg tcg gac cag 720

Glu Met His Gin Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Asp Gin

225 230 ‘ 235 240 tgc gtc aac tcg acc atc ggg cag gac cgc gtc gag tcg gcg acg gcc 768

Cys Val. Asn Ser Thr Ile Gly Gin Asp Arg Val Glu Ser Ala Thr Ala

245 250 255 tgg ctg aag cag aac ggc aag aag gcg atc ctg ggc gag tac gct ggc 816

Trp Leu Lys Gin Asn GLv Lys Lys Ala Ile Leu Gly Glu Tyr Ala Gly

260 265 270 ggc gcc aac agc gtg tgc gag acg gcc gtc acc ggc atg ctc gac tat 864

Gly Ala Asn Ser Val Cys Glu Thr Ala Val Thr Gly Met Leu Asp Tyr

275 280 265 ctc gcc aac aat act gat gtc tgg acc ggt gct atc tgg tgg gcg gct 912

Leu Ala Asn Asn Thr Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala Ala

290 295 3C0

ggg

ccg

tgg

tgg

aga

gac

tat

atc

ttc

tcc

atg

gag

ccg

cct

agt

ggg

960

dy

Pro

Trp

Trp

Gly

Aso

Tyr

Ile

Phe

Ser

Met

Glu

Pro

Pro

Ser

Gly

305

310

315

320

att

gcg

tat

gag

cag

gtt

ctg

ccg

ttg

ctg

aag

ccg

tac

ctc

gaa

tga

1003

Ile

Ala

Tyr

Glu

Gin

Val

Leu

Pro

Leu

Leu

Lys

Pro

Tyr

Leu

Glu

325

330

335

<210>	2
<211>	335
<2I2>	PRT
<213>	Talar	omyces	emersoni
<400>	2
Met Ly	s Phe	Ser Arg	Val Val Cys	Gly Leu	Thr Ma Ala Gly Gly Ala
i J		5		10	15

PL 209 225 B1

Leu

Ala

Ala Pro 20

Val

Lys

Glu

Lys

Gly 25

Ile

Lys

Lys

Arg

Ala Ser 30

Pro

Phe

Gin

Trp Phe 35

Gly

Ser

Asn

Glu 40

Ser

Gly

Ala

Glu

Phe 45

Gly Asn

Asn

Asn

Ile 50

Pro Gly

Val

Glu

Gly 55

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe 60

Pro

Asn Thr

Ser

Ala 65

Ile

Gin Ile

Leu

Ile 70

Asp

Gin

Gly

Met

Asn 75

Ile

Phe

Arg Val

Pro 30

Phe

Leu

Met Glu

Arg 85

Met

Val

Pro

Asn

Gin 90

Met

Thr

Gly

Prc Val 95

Asp

Ser

Ala

Tyr Phe 100

Gin

dy

Tyr

Ser

Gin 105

Vai

Ile

Asn

Tyr

Ile Thr 110

Ser

His

Gly

Ala Ser 115

Ala

Val

Ile

Aso 120

Pro

His

Asn

Phe

Gly 125

Arg Tyr

Tyr

Asn

Asn 130

Ile Ile

Ser

Ser

Pro 135

Ser

Asp

Phe

Gin

Thr 140

Phe

Trp His

Thr

Ile 145

Ala

Ser Asn

Phe

Ala 150

Asp

Asn

Asp

Asn

Val 155

Ile

Phe

Asp Thr

Asn 160

Asn

Glu

Tyr His

Asp 165

Met

Asp

Glu

Ser

Leu 170

Val

Val

Gin

Leu Asn 175

Gin

A .i. a

Ala

Ile Asn 180

Gly

Ile

Arg

Ala

Ala 185

Gly

Ala

Thr

Ser

Gin Tyr 190

Ile

Phe

Val

Glu Gly 195

Asn

Ser

Trp

Thr 200

Gly

Ala

Trp

Thr

Trp 205

Thr Gin

Val

Asn

Asp 210

Ala Met

Al a

Asn

Leu 215

Thr

Asp

Pro

Gin

Asn 220

Lys

Ile Va1

Tyr

Glu 225

Met

His Gin

Tyr

Leu 230

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser 235

Gly

Thr

Ser Asp

Gin 24C

Cys

Val

Asn Ser

Thr 245

Ile

Gly

Gin

Asp

Arg 250

Val

Glu

Ser

Ala Thr 255

A_ a

Trp

Leu

Lys Gin 260

Asn

Gly

Lys

Lys

Ala 265

Ile

Leu

Gly

Glu

Tyr Ala 270

Gly

Gly

Ala

Asn Ser 275

Val

Cys

Glu

Thr 280

Ala

val

Thr

Gly

Met 285

Leu Asp

Tyr

Leu

Ala 290

Asn Asn

Thr

Asp

Val 295

Trp

Thr

Gly

Ala

Ile 300

Trp

Trp Ala

Ala

Gly 305

Pro

Trp Trp

Gly

Asp 310

Tyr

I le

Phe

Ser

Met 315

Glu

Pro

Pro Ser

Gly 320

Ile

Ala

Tyr Glu

Gin

Val

Leu

Pro

Leu

Leu

Lys

Pro

Tyr

Leu Glu

325 33C 335 <210> 3

PL 209 225 B1 <211> 12 4 ο <212> DNA <213> Talaromyces emafsonii <220>

<221> CDS <222> ¢1)..(1245) <400> 3

atg gat

ega

att

ctt

gcg

ctg

atc

ttg

gtc

ccc

ctt

gcc

act

gtc

acg

46

Met Asp

Arg

Ile

Leu

Ala

Leu

Ile

Leu

Val

Pro

Leu

Ala

Thr

Val

Thr

1

5

1C

15

gca cag

cag

att

ggc

act

atc

ccc

gag

gtc

cat

ccc

aag

ctc

ccg

aca

96

Ala Gin

Gin

Ile

Gly

Thr

Ile

Pro

Glu

Val

His

Pro

Lys

Leu

Pro

Thr

20

25

30

tgg aaa

tgc

acg

acc

gag

ggc

ggc

tgt

gtc

cag

cag

aat

acc

tcc

gtc

144

Trp Lys

Cys

Thr

Thr

Glu

Gly

Gly

Cys

Val

Gin

Gin

Asn

Thr

Ser

Val

35

40

45

gtg ttg

gag

tac

ctg

tcg

cat

ccg

atc

cat

gaa

gtt

gga

aac

agc

gac

192

Val Leu

Glu

Tyr

Leu

Ser

His

Pro

Ile

His

Glu

vai

Gly

Asn

Ser

Asp

50

55

60

gtc tcg

tgc

gtg

gtt

tct

ggc

ggg

ctg

aac

cag

agc

ctc

tgt

ccc

aac

240

Lal Ser

Cys

Val

Vai

Ser

Gly

Gly

Leu

Asn

Gin

Ser

Leu

Cys

Pro

Asn

65

70

75

80

gaa gag

tgt

tcc

aaa

aac

tgc

gtc

gtc

gag

ggg

gcc

d£C

tac

acc

238

Glu Glu

Glu

Cys

Ser

Lys

Asn

Cys

Val

Lal

Glu

Gly

Ala

Asn

Tyr

Thr

95

90

95

agc tcg

gca

gtt

cac

aca

gac

ggc

gat

gcc

ctg

act

ctc

aat

cag

tac

33 6

Ser Ser

Gly

Val

His

Thr

Asp

Gly

Asp

Ala

Leu

Thr

Leu

Asn

Gin

Tyr

ICO

105

110

gtc acg

aac

ggc

gac

cag

gtc

gtc

acc

gcc

tcg

ccg

cgg

gtc

tat

ctc

334

Val Thr

Asn

Gly

Asp

Gir.

Val

Val

Thr

Ala

Ser

Pro

Arg

Val

Tyr

Leu

115

120

125

ctg gcc

agc

gac

gac

gag

gac

ggg

aat

tac

agc

atg

ctc

cag

ctc

ctc

432

Leu Ala

Ser

Asp

Asp

Glu

Asp

Gly

Asn

Tyr

Ser

Met

Leu

Gin

Leu

Leu

130

135

140

ggc cag

gag

ctg

agc

ttt

gac

gtg

gac

gtc

tcg

aaa

ctg

gtc

tgc

ggg

4 80

Gly Gin

Glu

Leu

Ser

Phe

Asp

Va 1

Asp

Val

Ser

Lys

Leu

Lal

Cys

Gly

145

15C

155

160

atg aac

ggc

gcc

ttg

tat

ctc

tcc

gag

atg

gac

gca

tag

ggc

ggc

ega

528

Met Asn

Gly

Ala

Leu

Tyr

Leu

Ser

Gin

Met

Asp

Ala

Ser

Gly

Gly

Arg

165

170

175

aac agc

ctc

aaa

ccg

ccg

ggg

gca

cag

tat

ggc

tct

gga

tac

tgt

gat

576

Asn Ser

Leu

Asn

Pro

Ala

Gly

Ala

Gin

Tyr

Gly

Ser

Gly

Tyr

Cys

Asp

18C

185

1 9C

gcg caa

tgc

ggc

gtc

cag

ccc

ttc

atc

aac

ggc

acg

gtc

aac

acc

ggc

624

Ala Gin

Cys

Gly

Val

Gin

Pro

Pha

Ile

Asn

Gly

J. Γ1Χ

Val

Asn

Thr

Gly

195 200 205

PL 209 225 B1 tcg ccc ggc gct tgc tgc aac gag atg gac atc tgg gaa gcg aat gcc 672 Ser Leu Gly Ala Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ala

210 215 220 ctt gcc acc gcg ttg act ccg cac ccg tgc agc gtc acc agc atc tat 720

Leu Ala Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Ser Val Thr Ser Ile Tyr

225 230 235 240 gcc tgt tct ggc gct gag tgc cgc tcc aac ggc gtc tgc gac aag ccg 768

Ala Cys Ser Gly Ala Glu Cys Gly Ser Asn Gly Val Cys Asp Lys Pro

245 250 255 gga tgc gga tac aac ccg tac gcg ctg gga gac cac aac tac tac gga 816

Gly Cys Gly Tyr Asn Pro Tyr Ala Leu Gly Asp His Asn Tyr Tyr Gly ' 260 265 * 270 ccc ggg aag acg gtc gac acg tcc agg ccc ttc acc gtg gta acg cag 864

Pro Gly Lys Thr Val Aso Thr Ser Arg Pro Phe Thr Val Val Thr Gin

275 * 280 285 ttt ctc acc aac gac aac acc acg acg ggg act ctg acg gac atc cgt 912

Phe Leu Thr Asn Asp Asn Thr Thr Thr Gly Thr Leu Thr Glu Ile Arg

290 295 300 cgt ctg tac gtc caa gac ggc aac gtg atc ggg cct tcg cct agc gac 960

Arg Leu Tyr Val Gin Asp Gly Asn Val Ile Gly Pro Ser Pro Ser Asp

305 310 315 320 tct gtc tcg tca atc acg gac tcg ttc tgt tcc acg gtg gat tcc tat 1003

Ser Val Ser Ser Ile Thr A.sp Ser Phe Cys Ser Thr Val Aso Ser Tyr

325 330 335 ttc gag ccg ctt ggc ggc ctg aag gag atg ggc gag gcg ctg ggt cgg 1056

Phe Glu Pro Leu Gly Gly Leu Lys Glu Met Gly Glu Ala Leu Gly Arg

340 345 350 ggg atg gtg ctg gtg ttc agc atc tgg aat gat cct ggt cag ttc atg 1104

Glv Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Pro Gly Gin Phe Met ' 355 360 365 aac tgg ctc gac agc ggg aat gct ggg ccc tgc aac agc acc gag ggg 1152 Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Asn Ser Thr Glu Gly

370 ' 375 360

aac Asn 385

cca Pro

gcg Ala

acc Thr

att Ile

gaa Glu 390

gcg Ala

cag Gin

cat His

cct Pro

gac Asp 395

acc Thr

gcg Ala

gtg val

acc Thr

ttc Pha 400

1200

tcg

aac

atc

aga

tgg

ggg

gat

atc

ggg

tcg

acg

ttc

cag

tcg

taa

1245

Ser

Asn

I le

Arg

Trp

Gly

Asp

Ile

Gly

Ser

Thr

Phe

Gin

Ser

405

410

<210 4 <211> 414 <212> ?RT <213> Talaromyces emersonii <400> 4

Met Asp Arg Ile Leu Ala Leu Ile Leu Val Pro Leu Ala Thr Val Thr

PL 209 225 B1 tcg ctc ggc gct tgc tgc aac gag atg gac atc tgg gaa gcg aat gcc 672 Ser Leu Gly Ala Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ala

210 215 220 ctt gcc acc gcg ttg act ccg cac ccg tgc agc gtc acc agc atc tat 720

Leu Ala Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Ser Val Thr Ser Ile Tyr

225 230 235 240 gcc tgt tct ggc gct gag tgc cgc tcc aac ggc gtc tgc gac aag ccg 768

Ala Cys Ser Gly Ala Glu Cys Gly Ser Asn Gly Val Cys Asp Lys Pro

245 250 255 gga tgc gga tac aac ccg tac gcg ctg gga gac cac aac tac tac gga 816

Gly Cys Gly Tyr Asn Pro Tyr Ala Leu Gly Asp His Asn Tyr Tyr Gly ' 260 265 * 270 ccc ggg aag acg gtc gac acg tcc agg ccc ttc acc gtg gta acg cag 864

Pro Gly Lys Thr Val Aso Thr Ser Arg Pro Phe Thr Val Val Thr Gin

275 * 280 285 ttt ctc acc aac gac aac acc acg acg ggg act ctg acg gac atc cgt 912

Phe Leu Thr Asn Asp Asn Thr Thr Thr Gly Thr Leu Thr Glu Ile Arg

290 295 300 cgt ctg tac gtc caa gac ggc aac gtg atc ggg cct tcg cct agc gac 960

Arg Leu Tyr Val Gin Asp Gly Asn Val Ile Gly Pro Ser Pro Ser Asp

305 310 315 320 tct gtc tcg tca atc acg gac tcg ttc tgt tcc acg gtg gat tcc tat 1003

Ser Val Ser Ser Ile Thr A.sp Ser Phe Cys Ser Thr Val Aso Ser Tyr

325 330 335 ttc gag ccg ctt ggc ggc ctg aag gag atg ggc gag gcg ctg ggt cgg 1056

Phe Glu Pro Leu Gly Gly Leu Lys Glu Met Gly Glu Ala Leu Gly Arg

340 345 350 ggg atg gtg ctg gtg ttc agc atc tgg aat gat cct ggt cag ttc atg 1104

Glv Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Pro Gly Gin Phe Met ' 355 360 365 aac tgg ctc gac agc ggg aat gct ggg ccc tgc aac agc acc gag ggg 1152 Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Asn Ser Thr Glu Gly

370 ' 375 360

aac Asn 385

cca Pro

gcg Ala

acc Thr

att Ile

gaa Glu 390

gcg Ala

cag Gin

cat His

cct Pro

gac Asp 395

acc Thr

gcg Ala

gtg val

acc Thr

ttc Pha 400

1200

tcg

aac

atc

aga

tgg

ggg

gat

atc

ggg

tcg

acg

ttc

cag

tcg

taa

1245

Ser

Asn

I le

Arg

Trp

Gly

Asp

Ile

Gly

Ser

Thr

Phe

Gin

Ser

405

410

<210 4 <211> 414 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400> 4

Met Asp Arg Ile Leu Ala Leu Ile Leu Val Pro Leu Ala Thr Val Thr

PL 209 225 B1

1

5

10

15

Ala

Gin

Gin

Ile

Gly

Thr

Ile

Pro

Glu

Val

His

Pro

Ly3

Leu

Pro

Thr

20

25

30

Trp

Lys

Cys

Thr

Thr

Glu

Gly

Gly

cys

Val

Gin

Gin

Asn

Thr

Ser

Val

35

43

45

Val

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ser

His

Pro

ile

His

Glu

Val

Gly

Asn

Ser

Asp

50

5S

60

Val

Sar

Cys

Val

Val

Ser

Gly

Gly

Leu

Asn

Gir.

Ser

Leu

Cys

Pro

Asr.

65

70

75

ec

Glu

Glu

Glu

Cys

Ser

Lys

Asn

Cys

val

Val'

Glu

Gly

Ala

Asn

Tyr

Thr

85

90

95

Ser

Ser

Gly

Val

His

Thr

Asp

Gly

Asp

Ala

Leu

Thr

Asn

Gin

Tyr

100

105

110

Val

Thr

Asn

Gly

Asp

Gin

Val

Val

Thr

Ala

Ser

Pro

Arg

Val

Tyr

Leu

115

120

125

Leu

Ala

Ser

Asp

Asp

Glu

Asp

Gly

Asn

Tyr

Ser

Met

Leu

Gin

Leu

Leu

130

135

140

Gly

Gin

Glu

Lexi

Ser

Phe

Asp

Val

Asp

Val

Sec

Lys

Leu

Val

Cys

Gly

145

150

155

160

Met

Asn

Gly

Ala

Leu

Tyr

Leu

Ser

Glu

Met

Asp

Ala

Ser

Gly

Gly

Arg

165

170

175

Asn

Ser

Leu

Asn

Pro

Ala

dy

Ala

Gin

Tyr

Gly

Ser

Gly

Tyr

Cys

Asp

ISO

185

190

Ala

Gin

Cys

Gly

Val

Gin

Pro

Phe

Ile

Asn

Gly

Thr

Val

Asn

Thr

Gly

195

200

205

Ser

Leu

Gly

Ala

Cys

Cys

Asn

Glu

Met

Asp

Ile

Trp

Glu

Ala

Asn

Ala

210

215

220

Leu

Ala

Thr

Ala

Leu

Thr

Pro

His

Pro

Cys

Ser

Val

Thr

Ser

Ile

Tyr

225

230

235

240

Ala

Cys

Ser

Gly

Ala

Glu

Cys

Gly

Ser

Asn

Gly

Val

Cys

Asp

Lys

Pro

245

250

255

Gly

Cys

Gly

Tyr

Asn

Pro

Tyr

Ala

Leu

Gly

Asp

His

Asn

Tyr

Tyr

Gly

260

265

270

Pro

Gly

Lys

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Arg

Pro

Phe

Thr

Val

Val

Thr

Gin

275

280

285

Phe

Leu

Thr

Asn

Asp

Asn

Thr

Thr

Thr

G1 y

Thr

Leu

Thr

Glu

Ile

Arg

290

295

300

Arg

Leu

Tyr

Val

Gin

Asp

Gly

Asn

Vai

Ile

Gly

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

305

310

315

320

Ser

Val

Ser

Ser

Ile

Thr

Asp

Ser

Phe

Cys

Ser

Thr

val

Asp

Ser

Tyr

325 330 335

PL 209 225 B1

Phe

Glu

Pro

Leu 340

Gly

Gly Leu Lys

Glu 345

Met

Gly

Glu

Ala

Leu 350

Gly

Arg

Gly

Met

Val

Leu

Val

Phe Ser Ile

Trp

Asn

Asp

Pro

Gly

Gin

Phe

Met

355

360

365

Asn

Trp

Leu

Asp

Ser

Gly Asn Ala

Gly

Pro

Cys

Asn

Ser

Thr

Glu

Gly

370

375

380

Asn

Pro

Ala

Thr

Ile

Gru Ala Gin

His

Pro

Asp

Thr

Ala

Val

Thr

Phe

335

390

39*5

400

Ser

Asn

Ile

Arg

Trp

Gly Asp Ile

Gly

Ser

Thr

Phe

Gin

Ser

405

410

<21 0>

5

<21

1>

669

<212>

DNA

<213>

Talaromyces

emersonii

<220>

<221>

CD3

<222>

(1) -

.(569)

<4 00>

5

atg

aat

gtc

aga

gct

gtt

gtc

tct

gtt

tct

gcc

ttc

ttg

ctg

acg

cct

48

Met

Asn

Val

Arg

Ala

Val

Val

Ser

Val

Ser

Ala

Phe

Leu

Leu

Thr

Pro

1

5

10

15

ttg

gct

tca

gcc

ctg

aca

gga

acc

acc

aca

aca

aca

tgg

gac

tgt

tgt

96

Leu

Ala

Ser

Ala

Leu

Thr

Gly

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Trp

Asp

Cys

Cys

20

25

30

aaa

cca

gcg

tgt

agc

tgg

acg

caa

aat

gcc

caa

gca

ggc

gga

gca

agt

144

Lys

Pro

Ala

Cys

Ser

Trp

Thr

Gin

Asn

Ala

Gin

Ala

C-ly

Gly

Ala

Ser

35

40

4 5

ggt

acc

gtc

gcc

acc

tgc

aac

atc

aac

aac

cag

gta

Ct3

agc

aat

ggt

192

Gly

Thr

Val

Ala

Thr

Cys

Asn

Ile

Asn

Asn

Gin

Val

Leu

Ser

Asn

Gly

50

55

60

gcc

tct

gct

ccc

agc

ccc

tgc

cag

gga

ggc

gat

gcc

tac

agc

tgc

tcc

240

Ala

Ser

Ala

Pro

Ser

Ala

Cy3

Gin

Gly

Gly

Asp

Ala

Tyr

Ser

Cys

Ser

65

70

7*5

80

gac

ttc

cag

ccc

atc

atc

atc

agt

gac

acc

ttg

tcg

tac

gga

ttc

gct

283

Asp

Phe

Gin

Pro

Ile

Ile

Ile

Ser

Asp

Thr

Leu

Ser

Tyr

Gly

Phe

Ala

85

90

95

ggc

aac

tgg

gag

aca

agc

aac

tgc

tgc

aag

tgc

ttc

cag

ttc

acc

tgg

336

Gly

Asn

Trp

Glu

Thr

Ser

Asn

Cys

Cys

Lys

Cys

Phe

Gin

Phe

Thr

Trp

100

105

110

PL 209 225 B1

acg

tcg

999 gcg

ggt

gcg

ggc

aag

tcc

atg

atc

gtc

caa

gtt

gtc

aat

384

Thr

Ser

Gly Ala

Gly

Ala

Gly

Lys

Ser

Met

Ile

Val

Gin

Val

Val

Asn

115

120

125

tct

cgc

ggg gtc

agt

aca

ggc

gat

ttc

gac

att

tac

acg

cct

ggt

ggc

432

Ser

Gly

Gly Val

Ser

Thr

Gly

Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr

Thr

Pro

Gly

Giy

130

135

140

ggt

gtt

gga gat

tac

aat

gcc

tgc

act

tcg

cag

tat

ggc

gcg

cca

cca

480

Gly

Val

Gly Asp

Tyr

Asn

Ala

Cys

Thr

Ser

Gin

Tyr

Gly

Ala

Pro

Pro

145

150

155

160

cag

gga

tgg ggt

gct

caa

tac

ggc

ggc

gtc

tcc

agc

gac

gct

gaa

tgc

528

Gin

Gly

Trp Gly

Ada

Gin

Tyr

Gly

Gly

Val

Ser

Ser

Asp

Ala

Glu

Cys

165

170

175

gac

caa

ctc ccc

tcg

atc

ctg

cag

cct

gga

tgc

cac

tgg

cgt

ttc

gag

576

Asp

Gin

Len Pro

Ser

Ile

Leu

Gin

Pro

Gly

Cys

His

Trp

Arg

Phe

Glu

180

185

190

tgg

gca

gga ggt

cgc

atc

35C

gga

tgg

acg

act

gag

tac

CfeŁCJ

gaa

gtc

€24

Trp

Ala

Gly Gly

Gly

Ile

Asn

Gly

Trp

Thr

Thr

Glu

Tyr

Glu

Glu

Val

195

200

205

gat

tgc

cca agc

cag

ctt

act

tcc

atc

tca

ggt

tgc

tat

ccg

tga

669

Asp

Cys

Pro Ser

Gin

Leu

Thr

Ser

Ile

Ser

Gly

Cys

Tyr

Pro

210

215

220

<210>

6

<21

1>

222

<212>

PRT

<213>

Talaromyces

emersonii

<400>

6

Mer

Asn

Va1 Arg

Ala

Vai

Val

Ser

Val

Ser

Ala

Phe

Leu

Leu

Thr

Pro

T

5

10

15

Leu

Ala

Ser Ala

Leu

Thr

Gly

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Trp

Asp

Cys

Cys

20

25

30

Lys

Pro

Ala Cys

Ser

Trp

Thr

Gin

Asn

Ala

Gin

Ala

Gly

Gly

Ala

Se r

35

40

4 5

Gly

Thr

Val Ala

Thr

Cys

Asn

Ile

Asn

Asn

Gin

Val

Leu

Ser

Asn

Gly

50

55

60

Ala

Ser

Ala Pro

Ser

Ala

Cys

Gin

Gly

Gly

Asp

Ala

Tyr

Ser

Cys

Ser

65

70

15

80

Asp

Phe

Gin Pro

Ile

Ile

Ile

Ser

Asp

Thr

Leu

Ser

Tyr

Giy

Phe

Ala

85

90

95

Gly

Asn

Trp Glu

Thr

Ser

Asn

cys

Cys

Lys

Cys

Phe

Gin

Phe

Thr

Trp

100

105

lic

Thr

Ser

Gly Ala

Gly

Ais

Gly

Lys

Ser

Met

Ile

Val

Gin

Val

Vai

Asn

PL 209 225 B1

115 120 125

Ser

Gly 130

Gly

Val

Ser

Thr

Gly 135

Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr 140

Thr

Pro

Gly Gly

Gly 145

Val

Gly

Asp

Tyr

Asn 150

Ala

Cys

ΦΉ y·

Ser

Gir, 155

Tyr

Gly

Al a

Pro Pro 160

Gin

Gly

Trp

Gly

Ala 165

Gin

Tyr

Gly

Gly

Val 170

Ser

Ser

Asp

Ma <

Glu Cys 175

Asp

Gin

Leu

Pro 180

Ser

Ile

Leu

Gin

Pro 185

Gly

Cys

His

Trp

Arg 19C

Phe Glu

Trp

Ala

Gly 195

Gry

Gly

Ile

Asn

Gly 200

Trp

Thr

Thr

Glu

Tyr 205

Glu

Glu

Asp

Cys 210

Pro

Ser

Gin

Leu

Thr 215

Ser

Ile

Ser

Gly

Cys 220

Tyr

Pro

<210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter oligonukleotydowy <400> 7 tatagcgaaa tggattgatt ctacactc <210 8 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter oligonukleotydowy <4C0> 8 atccccagca tcattacacc tcagtg

PL 209 225 B1

Claims (22)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowany polipeptyd stanowiący β-glukanazę uzyskaną z grzyba rodzaju Talaromyces, takiego jak grzyb Talaromyces emersonii, posiadającą aktywność EC 3.2.1.4 (aktywność endoglukanazy), znamienny tym, że zawiera:

   (i) sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 2; lub (ii) wariant (i), który jest zdolny do cięcia β-D-glukanu, posiadający co najmniej 80% identyczności względem pełnej długości SEQ ID no: 2 lub co najmniej 80% identyczności względem regionu 150 sąsiadujących aminokwasów sekwencji aminokwasowej SEQ ID No: 2.
2. 2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wariant (ii) ma co najmniej 85% identyczności z sekwencją aminokwasową SEQ ID No: 2 i/lub fragment (iii) ma długość co najmniej 150 sąsiadujących aminokwasów.
3. 3. Izolowany polinukleotyd zawierający (a) sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID No: 1 lub sekwencję kodującą izolowany polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. 1;

   (b) sekwencję, która jest komplementarna do, lub która hybrydyzuje z każdą sekwencją określoną w (a);

   (c) sekwencję mającą co najmniej 80% identyczności z każdą z sekwencji określonej w (a); lub (d) sekwencję, która jest ze względu na cechy kodu genetycznego zdegenerowana, w stosunku sekwencji określonej w (a).
4. 4. Polinukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że sekwencja koduje polipeptyd mający aktywność β-glukanazy.
5. 5. Polinukleotyd według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że jest sekwencją DNA.
6. 6. Wektor zawierający sekwencję polinukleotydową określoną w zastrz. 3.
7. 7. Wektor według zastrz. 6, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym, takim, w którym sekwencja DNA określona w zastrz. 5 połączona jest funkcjonalnie z sekwencją regulatorową.
8. 8. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jako białko heterogenne eksprymuje izolowany polipeptyd określony w zastrz.1.
9. 9. Sposób wytwarzania izolowanego polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza zdefiniowana w zastrz. 8 w warunkach, które podtrzymują ekspresję tego polipeptydu.
10. 10. Sposób identyfikowania związku modulującego aktywność β-glukanazy, znamienny tym, że kontaktuje się izolowany polipeptyd określony w zastrzeżeniu 1 z testowanym związkiem i monitoruje się aktywności β-glukanazy.
11. 11. Kompozycja odpowiednia do stosowania jako pasza dla zwierząt, znamienna tym, że zawiera izolowany polipeptyd określony w zastrz. 1.
12. 12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera również polipeptyd mający aktywność celulazy, endoarabinazy, ramnogalakturonazy lub poligalakturonazy.
13. 13. Sposób obróbki materiału roślinnego, znamienny tym, że kontaktuje się materiał roślinny z izolowanym polipeptydem określonym w zastrz. 1 lub z kompozycją określoną w zastrz. 11.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że obejmuje degradowanie lub modyfikowanie celulozy, takiej jak β-glukan, w materiale roślinnym.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że obejmuje degradowanie lub modyfikowanie ściany komórkowej roślin.
16. 16. Sposób według zastrzeżenia 13, znamienny tym, że obejmuje cięcie podjednostek glukozy w β-D-glukanie zawartym w materiale roślinnym.
17. 17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że materiał obejmuje rośliny, pulpę roślinną, ekstrakty roślinne lub ich jadalne części lub składniki, lub materiały, tekstylia lub ubrania zawierające materiał roślinny.
18. 18. Sposób zmniejszenia lepkości materiału roślinnego, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu materiału roślinnego z izolowanym polipeptydem określonym w zastrz. 1 lub kompozycją określoną w zastrz. 11, w ilości i w warunkach odpowiednich do zdegradowania celulozy zawartej w materiale roślinnym.

    PL 209 225 B1
19. 19. Zastosowanie izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 1 lub kompozycji jak określono w zastrz. 11 w sposobie odpowiednim do traktowania materiału roślinnego.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że traktowanie obejmuje cięcie polimerów β-D-glukanu zawartych w materiale roślinnym.
21. 21. Zastosowanie izolowanego polipeptydu określonego w zastrz. 1 lub kompozycji określonej w zastrz. 11, w sposobie obróbki pulpy roślinnej, soku lub ekstraktu, obejmującym inkubację pulpy roślinnej, soku lub ekstraktu z tym polipeptydem lub tą kompozycją, do przynajmniej częściowego zdegradowania celulozy.
22. 22. Pasza dla zwierząt, znamienna tym, że zawiera izolowany polipeptyd określony w zastrz. 1.