NO330277B1 - Talaromyces emersonii beta-glukanaser samt polynukleotid, vektor, vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av polypeptidet, sammensetning og fôr omfattende polypeptidet - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye (($-) glukanaser (og således også cellulaser) fra fungusen Talaromyces, spesielt Talaromyces emersonii, og deres anvendelse i nedbrytningen av glukan i cellulose. Den foreliggende oppfinnelse vedrø-rer mer spesielt et polypeptid, et polynukleotid, en vektor, en vertscelle, en fremgangsmåte ved fremstilling av nevnte polypeptid, en sammensetning inneholdende nevnte polypeptid og et for (for dyr) omfattende nevnte polypeptid som angitt i de selvstendige patentkrav.

Bakgrunnen for oppfinnelsen

Sammensetningen av en plantecellevegg er kompleks og vari-abel. Polysakkarider forekommer hovedsakelig i form av lange kjeder av cellulose (den hovedsakelige strukturelle komponent i plantecelleveggen), hemicellulose (omfattende forskjellige |$-xylankjeder, så som xyloglukaner) og pektin.

Beta-glukan (eller rettere sagt (l->3) (l->4) |$-D-glukan) , molekylvekt 10 til 14 kDa, er en komponent av plantehemi-cellulose (molekylvekt på omkring 700 kDa) og består av en ryggrad av p~l,4- og 1,3-bundne glukopyranoserester. En annen komponent er xylan som består av p—1,4-bundne xylose-rester, eventuelt substituert med sidekjeder så som arabi-nose og/eller glukuronsyrerester.

Grunnleggende forskjeller foreligger mellom monokotyledoner (f.eks. cerealer og gress) og dikotyledoner (f.eks. kløver, rapsfrø og soyabønner) og mellom frøene og de vegetative deler av planten. Monokotyledoner karakteriseres ved nærvær av et arabinoxylankompleks som den hovedsakelige hemicellu-loseryggrad, og den hovedsakelige struktur for hemicellulose i dikotyledoner er et xyloglukankompleks. Høyere pek-tinkonsentrasjoner forekommer i dikotyledoner enn i monokotyledoner. Frø har generelt høye konsentrasjoner av pektin- stoffer, men relativt lave konsentrasjoner av cellulosematerial.

Cellulosenedbrytende enzymer anvendes for å bearbeide plantematerial i mat samt i for eller som en tilsetning til matvarer eller for på grunn av av deres evne til å innvirke på vesentlige plantecelleveggsubstituenter.

De fleste cellulosenedbrytende enzymer som er tilgjengelige for industrien, synes å være glukanaser med en relativt lav molekylvekt og en moderat stabilitet ved høyere temperaturer. Imidlertid er det for visse bruksområder ønskelig å anvende en glukanase med en relativt høy termostabilitet. Hvis en glukanase skal anvendes som tilsetningsstoff i dyrefor, da er en høy termostabilitet å foretrekke på grunn av de høye temperaturbetingelser som anvendes under pelle-teringen av dyreforet.

Det vises til Moloney et al; Isolation and characterization of the 1,4-|3-D-glucan glucanohydrolases of Talaromyces emersonii, Biochem. J., 1985, vol 225, nr 2, s 365-374, ISSN: 0264-6021 som omhandler isolering og karakterisering av fire 1,4-(3-glukan glukanohydrolaser fra T. emersonii.

Det vises videre til Kitamoto et al; Molecular cloning, purification and characterization of two endo-l,4-(3-glucanases from Aspergillus oryzae KBN616, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, vol 46, nr 5/6, s 538-544, ISSN: 0175-7598 som omhandler kloning og karakterisering av to endo-1,4-|3-glukanaser fra Aspergillus oryzae, hvor enzymene er renset ogkarakterisert, og sekvensen for de to er kjent.

Det vises også til WO 9806858 A som omhandler på samme måte som nevnte Kitamoto et al kloning og karakterisering av (3-1,4-endoglukanase fra Aspergillus niger.

Til slutt skal det også vises til Database EMBL Accession AF054512, 6. april 1998 som omhandler en polynukleotidsekvens fra Aspergillus aculeatus.

Oppsummering av oppfinnelsen

Nye p—glukanaser (eller cellulaser) tilveiebringes hvilke er i stand til å spalte [J-D-glukan (eller cellulose) som er nærværende i plantematerial.

I videste forstand vedrører oppfinnelsen p—glukanaser (eller cellulaser) fra Talaromyces, så som Talaromyces emersonii (en sopp). Disse p-glukanaser kan spalte p-D-glukan eller cellulose, for eksempel er de p-1,4-endoglukanaser, eller de har aktiviteten EC 3.2.1.4.

Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse et polypeptid, som er en p-glukanase som kan oppnås fra en fungus av genusen Talaromyces, så som fungusen Talaromyces emersonii, som har aktiviteten EC 3.2.1.4 (endoglukanaseaktivitet), som er kjennetegnet ved at det omfatter:

(i) aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 2; eller

(ii) en variant av (i) som er i stand til å spalte p-D-glukan som har minst 85% identitet over hele lengden av SEQ ID nr. 2.

Glukanasene kan ha:

a. en optimal pH under 7,0 eller 5,4, så som under 5,0, for eksempel fra 4,4 til 5,2 eller fra 3,0 til 6,0 eller

7,0; eller

b. et temperaturoptimum på minst 72°C, 75°C eller til og med 81°C, så som fra 78°C til 85°C eller fra 83°C til 87°C.

I henhold til et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et polynukleotid som er kjennetegnet ved at det omfatter :

(a) nukleinsyresekvensen i SEQ ID nr. 1 eller en sekvens som koder et polypeptid ifølge oppfinnelsen; (b) en sekvens som er komplementær med, eller som hybridiserer til under høystringente betingelser, en sekvens som definert i (a) over hele lengden; (c) en modifisert sekvens av SEQ ID nr. 1 med opptil 100 nukleotidsubstitusjoner som koder et polypeptid som har (3-glukanaseaktivitet; (d) en sekvens som har minst 75%, fortrinnsvis 80%, identitet med en sekvens som definert i (a); eller (e) en sekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske kode til enhver av sekvensene som definert i (a) .

Oppfinnelsen tilveiebringer også:

en vektor, f.eks. en ekspresjonsvektor, som omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen, og som kan være i stand til å uttrykke et polypeptid ifølge oppfinnelsen;

en cellelinje eller stamme omfattende en vektor ifølge

oppfinnelsen;

en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid ifølge oppfinnelsen, hvilken fremgangsmåte omfatter å dyrke en cellelinje eller stamme ifølge oppfinnelsen under

betingelser som sørger for ekspresjon av polypeptidet; en sammensetning omfattende polypeptidet ifølge oppfinnelsen; og

et for (for dyr) omfattende polypeptidet ifølge oppfinnelsen .

Kort beskrivelse av sekvenser

SEQ ID nr. 1 er en DNA-sekvens av en første p—glukanase

(CEA) ifølge oppfinnelsen fra Talaromyces emersonii; SEQ ID nr. 2 er aminosyresekvensen i den første |$-glukanase, CEA; og

SEQ ID nr. 7 og 8 er PCR-primere som hybridiserer til SEQ

ID nr. 1 (og ble anvendt til å klone på nytt cDNA-innføyninger under genetisk analyse av positive trans-formantet).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Polynukleotider

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et (f.eks. isolert og/eller renset) polynukleotid som koder polypeptider iføl-ge oppfinnelsen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et polynukleotid som koder en p—glukanase hvis aminosyresekvens er vist i SEQ ID nr. 2. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et polynukleotid som koder et polypeptid som har betydelig aminosyresekvenshomologi med aminosyresekvensen vist i SEQ ID nr. 2. Også innbefattet er et polynukleotid valgt fra: (a) et polynukleotid omfattende nukleotidsekvensen vist i SEQ ID nr. 1 eller komplementet derav; (b) et polynukleotid omfattende en nukleotidsekvens som er i stand til (f.eks. selektivt) å hybridisere til en nukleotidsekvens vist i SEQ ID nr. 1 eller et fragment derav; (c) et polynukleotid omfattende en nukleotidsekvens som er i stand til (f.eks. selektivt) å hybridisere til komplementet av nukleotidsekvensen vist i SEQ ID nr. 1 eller et fragment derav; og/eller (d) et polynukleotid omfattende en polynukleotidsekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske kode til et polynukleotid definert i (a), (b) eller (c).

Hybridisable sekvenser

Uttrykket "som er i stand til å hybridisere" betyr at mål-polynukleotidet ifølge oppfinnelsen kan hybridisere til nukleinsyren anvendt som en probe (for eksempel nukleotid sekvensen vist i SEQ. ID nr. 1 eller et fragment derav eller komplementet derav) ved et nivå som er signifikant høy-ere enn bakgrunnen. Oppfinnelsen omfatter også nukleotidsekvenser som koder for p-glukanase eller varianter derav samt nukleotidsekvenser som er komplementære med dem. Nukleotidsekvensen kan være RNA eller DNA og omfatter således genomisk DNA, syntetisk DNA eller cDNA. Fortrinnsvis er nukleotidsekvensen en DNA-sekvens og mest foretrukket en cDNA-sekvens. Vanligvis omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen en tilstøtende sekvens av nukleotider som er i stand til å hybridisere under selektive betingelser til den kodende sekvens eller komplementet av den kodende sekvens i SEQ ID nr. 1. Slike nukleotider kan syntetiseres i henhold til metoder som er velkjent i faget<1>.

Et polynukleotid ifølge oppfinnelsen kan hybridisere til den kodende sekvens eller komplementet av den kodende sekvens i SEQ ID nr. 1 ved et nivå som er signifikant høyere enn bakgrunnen. Bakgrunnshybridisering kan opptre, for eksempel på grunn av andre cDNA-stoffer som foreligger i en cDNA-samling. Signalnivået (f.eks. generert ved interaksjon mellom et polynukleotid ifølge oppfinnelsen og den kodende sekvens eller et komplement av den kodende sekvens i SEQ ID nr. 1) er vanligvis minst 10 ganger, fortrinnsvis minst 100 ganger, så intenst som interaksjoner mellom andre polynukleotider og den kodende sekvens i SEQ ID nr. 1. Intensit-eten av interaksjonen kan måles, for eksempel ved radio-merking av proben, f.eks. med<32>P. Selektiv hybridisering kan vanligvis oppnås ved å anvende betingelser med lav stringens (0,3M natriumklorid og 0,03M natriumcitrat ved omkring 40°C), middels stringens (for eksempel 0,3M natriumklorid og 0,03M natriumcitrat ved omkring 50°C) eller høy stringens (for eksempel 0,3M natriumklorid og 0,03M natriumcitrat ved omkring 60°C). Hybridiseringen kan utføres under alle passende betingelser som er kjent i faget<1>, og som en rettesnor, kan lav stringens være 2 x SSC ved 55°C, middels stringens kan være 0,5 til 1,0 x SSC ved 60°C og høy stringens kan være 0,1 eller 0,2 x SSC ved 60°C eller høyere (f.eks. ved 68°C), alle ved 0,5% SDS.

Modi fikasj oner

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan omfatte DNA eller RNA. De kan være enkelt eller dobbelt tvunnet. De kan også være polynukleotider som innbefatter et eller flere syntetiske eller modifiserte nukleotider. Et antall forskjellige typer av modifikasjoner av polynukleotider er kjent i faget. Disse omfatter metylfosfonat og fosforotionatryggrader og/eller addisjon av akridin- eller polylysinkjeder ved 3'-og/eller 5'-enden av molekylet. Med hensyn til foreliggende oppfinnelse er det underforstått at polynukleotidene beskrevet heri kan modifiseres ved hjelp av enhver metode som er tilgjengelig i faget.

Det er underforstått at fagkyndige personer kan ved å anvende rutinemessige teknikker, utføre nukleotidsubstitusjoner som ikke påvirker polypeptidsekvensen kodet av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen for å gjenspeile kodo-nanvendelsen i enhver spesiell vertsorganisme, for eksempel 1 hvilken polypeptidene ifølge oppfinnelsen skal uttrykkes.

Den kodende sekvens i SEQ ID nr. 1 kan modifiseres ved nukleotidsubstitusjoner, for eksempel fra eller opp til 1, 2 eller 3 til 10, 25, 50 eller 100 substitusjoner. Polynukleotidet kan alternativt eller i tillegg modifiseres med en eller flere innføyninger og/eller slettinger, og/eller ved en forlengelse av en eller begge ender. Det modifiserte polynukleotid koder generelt et polypeptid som has p-glukanaseaktivitet. Degenererte substitusjoner kan utfø-res, og/eller substitusjoner kan utføres som vil kunne resultere i en konservativ aminosyresubstitusjon når den modifiserte sekvens translateres, for eksempel som omtalt med henvisning til polypeptider senere.

Homologer

En nukleotidsekvens som er i stand til selektivt å hybridisere til (f.eks. komplementet av) den DNA kodende sekvens i SEQ ID nr. 1, kan ha minst 50% eller 60%, minst 70%, minst 80%, minst 90%, minst 95%, minst 98% eller minst 99% sekvensidentitet (eller homologi) med den kodende sekvens i SEQ ID nr. 1. Dette kan være over et område på minst 20, fortrinnsvis minst 30, for eksempel minst 40, minst 60, mer foretrukket minst 100 tilstøtende nukleotider eller optimalt over den fulle lengde av SEQ ID nr. 1. For SEQ ID nr. 1 er sekvensidentiteten fortrinnsvis minst 75% eller 80%.

Enhver kombinasjon av ovennevnte grader av homologi og mi-nimumstørrelse kan anvendes for å definere polynukleotidene ifølge oppfinnelsen, og de mer stringente kombinasjoner (dvs. høyere homologi i forhold til større lengder) er foretrukket. Således danner for eksempel et polynukleotid, som er minst 80% eller 90% homologt over 25, fortrinnsvis over 30 nukleotider, et aspekt av oppfinnelsen, og det samme gjør et polynukleotid som er minst 90% homologt over 40 nukleotider.

Homologer av polynukleotid- (eller protein-)sekvenser har vanligvis minst 70% homologi, fortrinnsvis minst 80, 90%, 95%, 97% eller 99% homologi, for eksempel over et område på minst 15, 20, 30, 100 mer tilstøtende nukleotider (eller aminosyrer). Homologien kan beregnes på basis av amino-syreidentiteten (noen ganger omtalt som "hard homologi").

For eksempel tilveiebringer UWGCG-pakken BESTFIT-programmet som kan anvendes til å beregne homologi (for eksempel anvendt på dens forhåndsgitte innstillinger). PILEUP- og BLAST-algoritmene kan anvendes til å beregne homologi eller oppstillingssekvenser (så som å identifisere ekvivalente eller tilsvarende sekvenser, for eksempel på deres forhåndsgitte innstillinger6'7) .

Programvare for å utføre BLAST-analyser er offentlig tilgjengelige fra the National Center for Biotechnology Infor-mation (http://www.ncbi.nlm.nih.govl). Denne algoritme innebærer å først identifisere høytscorende sekvenspar (HSPs) ved å identifisere korte ord av lengden W i spørresekvensen som enten passer sammen eller tilfredsstiller et eller annet positivt vurdert terskelpoengtall T når de linjestilles med et ord av den samme lengde i en databasesekvens. T omtales som omgivelsenes ordpoengsumsterskel. Disse initielle omgivelsers ordtrefninger virker som frø for for å initiere søk for å finne HSPs som inneholder dem. Ordtrefningene forlenges i begge retninger langs hver sekvens så langt som den kumulative linjestillingspoengsum kan økes. Forlengelser for ordtrefningene i hver retning stanses når: den kumulative linjestillingspoengsum minsker med mengden X fra dens maksimalt oppnådde verdi; den kumulative poengsum går mot null eller under, på grunn av akkumuleringen av et eller flere negativt scorende restlinjestillinger; eller slutten av hver sekvens er oppnådd. BLAST-algoritme-parametrene W, T og X bestemmer sensitiviteten og hastigheten av linjestillingen. BLAST-programmet anvender som stan-darder en ordlengde (W) på 11, BLOSUM62-scoringsmatriks<8>linjestillinger (B) på 50, en forventet verdi (E) på 10, M=5, N=4, og en sammenligning av begge strenger.

BLAST-algoritmen utfører en statistisk analyse av likheten mellom to sekvenser. Et mål på likhet som gis av BLAST-algoritmen er den minste sums sannsynlighet (P(N)), som gir en indikasjon på sannsynligheten hvorved et motstykke mellom to nukleotid- eller aminosyresekvenser ville opptre ved en tilfeldighet. For eksempel anses en sekvens lik en annen sekvens hvis den minste sums sannsynlighet i sammenligning av den første sekvens med den andre sekvens er mindre enn omkring 1, fortrinnsvis mindre enn omkring 0,1, mer foretrukket mindre enn omkring 0,01, og mest foretrukket mindre enn omkring 0,001.

Primere og prober

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter og kan anvendes som en primer, f.eks. en PCR-primer, en primer for en alternativ amplifikasjonsreaksjon, en probe, eller polynukleotidene kan klones i vektorer. Slike primere, prober og andre fragmenter vil være minst eller opp til 20, for eksempel minst 25, 30 eller 40 nukleotider lange. De vil vanligvis være opp til 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 eller 300 nukleotider lange, eller til og med opp til noen få nukleotider (så som 5 eller 10 nukleotider) kortere enn den kodende sekvens i SEQ ID nr. 1.

Generelt vil primere fremstilles syntetisk, hvilket innebærer en trinnvis produksjon av den ønskede nukleinsyre-sekvens et nukleotid ad gangen. Teknikker for å oppnå dette ved å anvende automatiserte teknikker er lett tilgjengelig i faget. Eksempler på primere er vist i SEQ ID nr. 7 og 8.

Lengre polynukleotider vil generelt fremstilles ved å anvende rekombinante midler, for eksempel ved å anvende PCR kloningsteknikker (polymerasekjedereaksjon). Dette vil involvere å lage et par primere (f.eks. på omkring 15-30 nukleotider) til et område på p-glukanasen som det er ønskelig å klone, å bringe primerne i kontakt med mRNA eller eDNA oppnådd fra en målcelle (f.eks. gjær, bakterier, planter, en prokaryotisk eller fungal celle), fortrinnsvis fra en Talaromyces- stamme, utføre en polymerasekjedereaksjon under betingelser som fremkaller amplifikasjon av den ønskede region, isolere det amplifiserte fragment (f.eks. ved å rense reaksjonsblandingen på en agarosegel) og gjenvinne det amplifiserte DNA. Primerne kan utformes til å inneholde passende restriksjonsenzymatiske rekognisjonsseter slik at det amplifiserte DNA kan klones i en passende klonende vektor .

Slike teknikker kan anvendes til å oppnå alle eller deler av p-glukanasesekvensen beskrevet heri. Genomiske kloner korresponderende til cDNA'et i SEQ ID nr. 1 eller p-gluk-anasegenet inneholdende for eksempel introner og promoter-regioner er også innenfor oppfinnelsen og kan også oppnås på analog måte (f.eks. rekombinante midler, PCR, kloningsteknikker), begynnende med genomisk DNA fra en fungal celle, gjærcelle, bakteriecelle, plantecelle eller en prokaryotisk cell.

Polynukleotidene eller primerne kan ha en gjenkjennende merkelapp, f.eks. en radioaktiv eller ikke-radioaktiv merkelapp. Passende merkelapper omfatter radioisotoper så som<32>P eller<35>S, enzymmerkelapper eller andre protein-merkelapper, så som biotin. Slike merkelapper kan adderes til polynukleotider eller primere og kan påvises ved å anvende teknikker kjent pr. se.

Polynukleotider, merket eller umerket kan anvendes i nuk-leinsyrebaserte tester for å påvise eller sekvensere P~glukanase eller en variant derav i en (f.eks. fungal) prø-ve. Slike tester for påvisning omfatter generelt å bringe en (f.eks. fungal) prøve inneholdende (eller mistenkt for å inneholde) DNA i kontakt med en probe eller primer under hybridiseringsbetingelser og påvise enhver dupleks dannet mellom proben og nukleinsyren i prøven. Slik påvisning kan oppnås ved å anvende teknikker så som PCR eller ved å immo-bilisere proben på en fast bærer, å fjerne nukleinsyren i prøven som ikke er hybridisert til proben, og deretter å påvise nukleinsyre som var hybridisert til proben. Alternativt kan prøvens nukleinsyre immobiliseres på en fast bærer, og mengden av probe bundet til en slik bærer kan påvises .

Probene kan med fordel pakkes i form av et testsett i en passende beholder. I slike sett kan proben være bundet til en fast bærer hvor analyseformatet, som settet er utviklet for, krever slik binding. Settet kan også inneholde passende reagenser for å behandle prøven som skal probes, hybri disere proben til nukleinsyre i prøven, kontrollreagenser, instruksjoner og lignende.

Fortrinnsvis kan polynukleotidet ifølge oppfinnelsen oppnås fra den samme organisme som polypeptidet, så som en sopp, spesielt en sopp av genusen Talaromyces.

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter også varianter av sekvensen i SEQ ID nr. 1 som har [J-glukanaseaktivitet. Varianter kan dannes ved addisjoner, substitusjoner og/eller delesjoner og kan ha evnen til å spalte en p-D-glukanpolymer.

Fremstilling av polynukleotider

Polynukleotider som ikke har 100% identitet med SEQ ID nr. 1, men faller innenfor omfanget av oppfinnelsen, kan oppnås på flere måter. Således kan varianter av p-glukanasesekvensen beskrevet heri oppnås for eksempel ved å probe genomiske DNA-samlinger fremstilt fra mange forskjellige organismer, for eksempel de som er omtalt som kilder for polypeptidene ifølge oppfinnelsen. I tillegg kan andre fungale homologer, plantehomologer eller prokaryotiske homologer av p-glukanase oppnås, og slike homologer og fragmenter derav vil generelt være i stand til å hybridisere til SEQ ID nr. 1. Slike sekvenser kan oppnås ved å probe cDNA-samlinger eller genomiske DNA-samlinger fra andre arter, og probe slike samlinger med prober omfattende alle eller deler av SEQ ID. 1 under betingelser for middels til høy stringens (som beskrevet tidligere). Nukleinsyreprober omfattende alle eller deler av SEQ ID nr. 1 kan anvendes til å probe cDNA-samlinger fra andre arter, så som de som er beskrevet som kilder for polypeptidene ifølge oppfinnelsen .

Artshomologer kan også oppnås ved å anvende degenerert PCR som vil anvende primere utformet for å sikte inn sekvenser innenfor variantene og homologer som koder konserverte ami nosyresekvenser. Primerne kan inneholde en eller flere degenererte posisjoner og vil anvendes ved stringens-betingelser lavere enn de som anvendes for å klone sekvenser med enkeltsekvensprimere mot kjente sekvenser.

Alternativt kan slike polynukleotider oppnås ved seterettet mutagenese av [J-glukanasesekvensene eller varianter derav. Dette kan være nyttig hvor for eksempel stille kodonfor-andringer er nødvendige til sekvenser for å optimalisere kodonpreferanser for en spesiell vertscelle i hvilken poly-nukleotidsekvensene uttrykkes. Andre sekvensforandringer kan være ønskelige for å innføre restriksjonsenzymatiske rekognisjonsseter, eller for å endre egenskapene eller funksjonen av polypeptidene kodet av polynukleotidene.

Oppfinnelsen omfatter dobbeltstrengede polynukleotider omfattende et polynukleotid ifølge oppfinnelsen og dets komplement .

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også polynukleotider som koder polypeptidene ifølge oppfinnelsen beskrevet nedenfor. Siden slike polynukleotider vil være nyttige som sekvenser for rekombinant fremstilling av polypeptider ifølge oppfinnelsen, er det ikke nødvendig at de er i stand til å hybridisere til sekvensen i SEQ ID nr. 1, skjønt dette vil generelt være ønskelig. For øvrig kan slike polynukleotider merkes, anvendes og fremstilles som beskrevet ovenfor, hvis ønskelig.

B. Polypeptider

Foreliggende oppfinnelse vedrører (f.eks. (hovedsakelig) rensede og/eller isolerte) |$-glukanaser (eller cellulaser) og varianter derav. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan bestå hovedsakelig av aminosyresekvensen i SEQ ID nr. 2 eller av en variant av den sekvensen. Polypeptider kan også være kodet av et polynukleotid ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor.

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan være i isolert eller hovedsakelig renset form. Det vil være underforstått at polypeptidet kan være blandet med bærere eller fortynningsstoffer som ikke vil interferere med det tiltenkte formål og/eller funksjonen av polypeptidet og likevel vil det be-traktes som hovedsakelig isolert. Det vil generelt omfatte polypeptidet i et preparat hvori mer enn 20%, f.eks. mer enn 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% eller 99%, ifølge vekt av polypeptidet i preparatet er et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Rutinemessige metoder kan anvendes for å rense og/eller syntetisere proteinene i henhold til oppfinnelsen. For noen formuleringer (f.eks. for ikke-farmasøytiske anvendelser) kan mengden av polypeptid som er nærværende, være liten, for eksempel fra 0,01 til 10%, så som fra 0,1 til 5%, eller 2% eller til og med fra 0,2 til 1%.

Fortrinnsvis kan polypeptidet ifølge oppfinnelsen oppnås fra en mikroorganisme som har et gen som koder et enzym med p-glukanase-(eller cellulase-)aktivitet. Mer foretrukket er mikroorganismen fungal, og optimalt en trådformet fungus. Foretrukne organismer er således av genusen Talaromyces, så som av artene Talaromyces emersonii.

Aktivi tet

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan ha et eller flere av følgende trekk, nemlig det: (1) har p-glukanase-(eller cellulase-)aktivitet; (2) har et optimalt pH-område på fra 3 til 6,5 eller 7,0, så som fra 4 til 5,5 eller 6,0, optimalt fra 4,5 til 5,0; (3) har optimal aktivitet ved en temperatur på fra 30°C til 100°C, så som 60 til 95°C, optimalt fra 75°C eller 80°C til 90°C. Fortrinnsvis er den optimale temperatur minst 75 °C, så som minst 85°C; (4) har en molekylvekt (deglykosylert) på fra 20 til 60 kDa, fortrinnsvis fra 20 til 25, 35 til 45 eller 23 til 50 kDa, optimalt fra 36 til 40 kDa eller (glykosylert) fra 40 til 45kDa; (5) har et isoelektrisk punkt på fra 3,0 til 3,6 eller 5,0, 3,8 til 4,5, 4,5 til 5,0 eller fra 6,0 til 7,0;

og/eller

(6) har hydrolytisk aktivitet på cerealisk p-glukan eller utøver hydrolytisk aktivitet under pH 7.

Polypeptidet kan ha aktiviteten som EC.3.2.1.4 har (eller endoglukanaseaktivitet). Generelt kan dette være endo-hydrolyse av 1,4-p-D-glukosidiske bindinger i cellulose. "P-glukanaseaktivitet" er evnen til spalte cellulose eller en p-glukanpolymer (for eksempel som forekommer i planter f.eks. havre eller bygg). Aktiviteten muliggjør således spaltning mellom tilstøtende glukopyranoseterminale og/eller ikke-terminale enheter. Fortrinnsvis opptrer spaltningen ved en [glukose(1-4), (1-3) eller (1-6)-glukose] -binding. Polypeptidet kan fortrinnsvis spaltes mellom to tilstøtende (f.eks. ikke-substituerte glukose)-enheter. Det kan således ha endo-aktivitet (dvs. være en endo-glukanase). Substratpolymeren kan eventuelt være substituert. Fortrinnsvis vil polypeptidet ikke ha xylanaseaktivitet.

Polypeptidet kan også ha cellulaseaktivitet, det vil si det er aktivt på, eller kan spalte, cellulose. Siden p-glukan er en komponent av cellulose, faller alle glukanaser innenfor den bredere definisjon av cellulaser. Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor cellulaser fordi de tilhører underklassen av glukanaser. Andre typer av klasser av aktivitet innenfor cellulaser, bortsett fra endoglukanase (EC 3.2.1.4, som nevnt ovenfor) er ekso-glukanase/cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91),p-glukosidase (EC 3.2.1.21), endo-1,6-glukanase (EC 3.2.1.75), ekso-1,3-glukanase (EC 3.2.1.58), mannanase (EC 3.2.1.78) og endo-glycoceramidase (EC 3.2.1.123). Noen av polypeptidene for menes å ha en, to eller flere av disse ytterligere aktiviteter basert på deres struktur og sekvens, ved sammenligning med kjente enzymer og familien av hydrolaser som de faller inn under. Således kan i beskrivelsen, hvor sammen-hengen er passende, glukanaseaktivitet bety cellulaseaktivitet. En liste over (cellulase)aktiviteter for polypeptidene er angitt i Eksempel 11 senere.

Fortrinnsvis faller polypeptidet inn under en av familiene 5, 7 eller 45, i henhold til glykosidhydrolaseklassifise-ringen (CAZy). Polypeptidet kan være en glu/glu- eller asp/asp-nukleofil/protondonor.

Varianter og homologer

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan omfatte aminosyresekvensen vist i SEQ ID nr. 2 eller en hovedsakelig homolog sekvens, eller en variant derav, og kan ha p-glukanaseaktivitet. Generelt er den naturlig forekommende aminosyresekvens vist i SEQ ID nr. 2 foretrukket.

Spesielt kan polypeptidet ifølge oppfinnelsen omfatte:

a. polypeptidsekvensen i SEQ ID nr. 2;

b. en naturlig forekommende variant eller artshomolog

derav; eller

c. et protein med minst 70, minst 80, minst 90, minst 95, minst 98 eller minst 99% sekvensidentitet med (a) eller (b) .

En variant kan være en som opptrer naturlig, for eksempel i fungus-, bakterie-, gjær- eller planteceller og som kan fungere på hovedsakelig samme måte som proteinet med SEQ ID nr. 2, for eksempel har den ^-glukanaseaktivitet. På lignende måte vil en artshomolog av proteinet være det ekvivalente protein som opptrer naturlig i en annen art og som kan fungere som et p-glukanaseenzym. Varianter omfatter alleliske varianter enten fra den samme stamme som polypepti det ifølge oppfinnelsen eller fra en forskjellig stamme, men av den samme genus eller av den samme art.

Varianter og artshomologer kan oppnås ved å følge prose-dyrene beskrevet heri for fremstillingen av polypeptidet med SEQ ID nr. 2 og utføre slike prosedyrer på en passende cellekilde, for eksempel en bakterie-, gjær-, fungus- eller plantecell. Det vil også være mulig å anvende en probe som definert ovenfor for å probe samlinger fremstilt fra gjær-, bakterie-, fungus- eller planteceller for å å oppnå kloner innbefattende variantene eller artshomologene. Klonene kan manipuleres ved hjelp av konvensjonelle teknikker for å generere et polypeptid ifølge oppfinnelsen som deretter kan fremstilles ved rekombinante eller syntetiske teknikker kjent pr. se.

Polypeptidet ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis minst 70% sekvensidentitet med proteinet med SEQ ID nr. 2, mer foretrukket minst 80%, minst 90%, minst 95%, minst 97% eller minst 99% sekvensidentitet med det, for eksempel over et område på minst 60, minst 100, 150, 200 eller 300 til-støtende aminosyrer eller over den fulle lengde av SEQ ID nr. 2. For SEQ ID nr. 2 er sekvensidentiteten fortrinnsvis minst 70%.

Sekvensen av polypeptidet med SEQ ID nr. 2 og av varianter og artshomologer kan således modifiseres for å tilveiebringe polypeptider ifølge oppfinnelsen. Aminosyre-substitusjoner kan utføres, for eksempel fra eller opp til 1, 2 eller 3 til 10, 20, 30, 50 eller 100 substitusjoner. Det samme antall av delesjoner og innføyninger kan også ut-føres. Disse endringer kan utføres utenfor regioner som er kritiske funksjonen av polypeptidet og således kan fremdeles resultere i et aktivt enzym. Det modifiserte polypeptid bibeholder generelt aktivitet som en p-glukanase.

Polypeptider ifølge oppfinnelsen omfatter fragmenter av de ovenfor nevnte full-lengdede polypeptider og av varianter derav, inklusive fragmenter av sekvensen vist i SEQ ID nr. 2. Slike fragmenter bibeholder vanligvis aktivitet som en p-glukanase. Fragmenter kan være minst 50, 100, 150, 200 eller 250 aminosyrer lange eller kan være dette antall aminosyrer kortere enn den uforkortede sekvens (som vist i SEQ ID nr. 2).

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan hvis nødvendig fremstilles syntetisk, skjønt vanligvis vil de være fremstilt rekombinant som beskrevet nedenfor. De kan modifiseres for eksempel ved addisjon av histidinrester eller en T7-tag for å underlette deres identifisering eller rensing eller ved addisjon av en signalsekvens for å fremme deres sekresjon fra en celle.

Uttrykket "varianter" refererer til polypeptider som har den samme essensielle karakter eller grunnleggende biologiske funksjonalitet som p-glukanasen (eller cellulasen) og omfatter alleliske varianter. Den essensielle karakter hos p-glukanase er at den er et enzym som utøver EC 3.2.1.4-aktivitet eller at den kan spalte l-»3, l->4 og/eller l->6-bindinger i p-D-glukan, så som cereal- eller "oat spelt"

(P)-glukan. Fortrinnsvis har et avvikende polypeptid den samme aktivitet som p-glukanase. Et polypeptid som har den samme essensielle karakter som p-glukanase kan identifiseres ved å anvende en cellulose- eller p-glukannedbryt-ningsanalyse, for eksempel som beskrevet senere.

Varianter av SEQ ID nr. 2 omfatter også sekvenser som vari-erer fra SEQ ID nr. 2, men som ikke nødvendigvis er avledet fra det naturlig forekommende p-glukanaseprotein. Disse varianter kan beskrives som at de har en % homologi med SEQ ID nr. 2 eller har et antall substitusjoner innenfor denne sekvens. Alternativt kan en variant være kodet av et polynukleotid som hybridiserer til SEQ ID nr. 1.

Variantene kan defineres på lignende måte som variantene av SEQ ID nr. 1. Således kan variantene omfatte variant- sekvenser avledet fra andre stammer av Talaromyces. Andre varianter kan identifiseres fra andre Talaromyces-stammer ved å lete etter p-D-glukanaseaktivitet og klone og sekvensere som tidligere. Varianter kan omfatte delesjon, modifi-kasjon eller addisjon av enkelte aminosyrer eller grupper av aminosyrer innenfor proteinsekvensen, så lenge peptidet beholder den grunnleggende biologiske funksjonalitet som p-glukanase har.

Konservative substitusjoner kan utføres for eksempel i henhold til følgende tabell. Aminosyrer i den samme blokk i den andre kolonne og fortrinnsvis i den samme linje i den tredje kolonne kan erstattes innbyrdes. Fortrinnsvis påvirker substitusjoner ikke foldingen eller aktiviteten av polypeptidet.

Kortere polypeptidsekvenser er innenfor omfanget av oppfinnelsen. For eksempel anses et peptid på minst 50 aminosyrer eller opp til 60, 70, 80, 100, 150 eller 200 aminosyrer lange å falle innenfor omfanget av oppfinnelsen så lenge det utviser den grunnleggende biologiske funksjonalitet som p-glukanasen har. Spesielt, men ikke utelukkende, omfatter dette aspekt av oppfinnelsen den situasjon da proteinet er et fragment av den fullstendige protein-sekvens og kan omfatte eller representere en p-D-glukan-(eller mannose-)bindende region eller en p-D-glukan-(eller cellulose-)spaltende region.

Modi fikasj oner

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan være kjemisk modifisert, f.eks. post-translasjonalt modifisert. For eksempel kan de være glykosylert (en eller flere ganger, av det samme eller forskjellige sukker) eller omfatter modifiserte aminosyrerester. De kan også modifiseres ved addisjon av histidinrester (for å underlette deres rensing) eller ved addisjon av en signalsekvens (for å fremme innsetningen i cellemembranen). Polypeptidet kan ha et eller flere (N)amino- eller (c)karboksyl-terminale forlengelser, så som en amino-terminal metioninrest, et lite linker-peptid på opp til omkring 20-25 rester, eller en (liten) forlengelse som underletter rensingen, så som et poly-histidin eller T7-tag, en antigen epitop eller et (f.eks. maltose)bindende domene<14>(f.eks. ved C-terminusen). Disse forlengelser kan eventuelt være addert via en linker.

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan være merket med en gjenkjennende merkelapp. Den gjenkjennende merkelapp kan være enhver passende merkelapp som gjør det mulig å påvise polypeptidet. Passende merkelapper omfatter radioisotoper,<f.>eks.125I,<35>S, enzymer, antistoffer, polynukleotider og linkere så som biotin.

Polypeptidene kan modifiseres til å omfatte ikke-naturlig

forekommende aminosyrer eller til å øke stabiliteten av polypeptidet. Når proteinene eller peptidene fremstilles syntetisk, kan slike aminosyrer innføres under fremstillingen. Proteinene eller peptidene kan også modifiseres etter enten syntetisk eller rekombinant fremstilling.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles, eller omfatte, under anvendelse av (en eller flere) D-aminosyrer.

Et antall sidekjedemodifikasjoner er kjent i faget og kan utføres på sidekjedene i proteinene eller peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike modifikasjoner omfatter for eksempel modifikasjoner av aminosyrer ved reduktiv alkyle-ring ved omsetning med et aldehyd etterfulgt av reduksjon med NaBH4, amidering med metylacetimidat eller acylering med eddiksyreanhydrid.

Sekvensene fremskaffet ved foreliggende oppfinnelse kan også anvendes som utgangsmaterialer for konstruksjonen av "annen generasjons" enzymer. "Annen generasjons" glukanaser er glukanaser, endret ved mutageneseteknikker (f.eks. seterettet mutagenese), som har egenskaper som adskiller seg fra egenskapene hos ville glukanaser eller rekombinante glukanaser så som glukanaser fremstilt ved foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan temperaturen eller pH-optimum, spesifikk aktivitet, substrataffinitet eller termostabilitet endres for å være bedre egnet for anvendelse i en definert prosess.

Aminosyrer som er essensielle for aktiviteten av glukanasene ifølge oppfinnelsen, og derfor fortrinnsvis gjen-stand for substitusjon, kan identifiseres i henhold til prosedyrer som er kjent i faget, så som seterettet mutagenese eller alanine-avsøkende mutagenese<10>. I sistnevnte teknikk innføres mutasjoner ved hver rest i molekylet, og de resulterende mutante molekyler testes med hensyn til bi-ologisk aktivitet (f.eks. glukanaseaktivitet) for å identifisere aminosyrerester som er kritiske for aktiviteten av molekylet. Steder for enzym-substratinteraksjon kan også bestemmes ved analyse av krystallstrukturen bestemt ved hjelp av slike teknikker som kjernemagnetisk resonans, krystallografi eller fotoaffinitetsmerking<11>'<1>2'13eller mo-lekylmodellering .

Anvendelse av gjær- eller fungus-vertsceller forventes å tilveiebringe slike post-translasjonale modifikasjoner (f.eks. proteolytisk nedbrytning, myristilasjon, glyko-sylering, trunkering, og tyrosin, serin eller treoninfos-forylering) som kan være nødvendig for å gi optimal bio- logisk aktivitet på rekombinante ekspresjonsprodukter iføl-ge oppfinnelsen.

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringes i en form så at de er utenfor deres naturlige cellulære om-givelse. Således kan de hovedsakelig isoleres eller renses, som omtalt ovenfor, eller i en celle som de ikke opptrer i i naturen, f.eks. en celle av andre fungusarter, dyr, gjær eller bakterier.

C. Rekombinante aspekter

Oppfinnelsen tilveiebringer også vektorer omfattende et polynukleotid ifølge oppfinnelsen, inklusive klonende og uttrykkende vektorer, og fremgangsmåter for dyrking av slike vektorer i en passende vertscelle, for eksempel under betingelser hvor ekspresjon av et polypeptid ifølge oppfinnelsen opptrer. Også fremskaffet er vertsceller omfattende et polynukleotid eller en vektor ifølge oppfinnelsen hvori polynukleotidet er heterologt med genomet i vertscellen. Uttrykket "heterolog", vanligvis med hensyn til vertscellen, betyr at polynukleotidet ikke opptrer naturlig i genomet i vertscellen eller at polypeptidet ikke er naturlig fremstilt av cellen. Fortrinnsvis er vertscellen en gjærcelle, for eksempel en gjærcelle av genusen Kluyveromyces eller Saccharomyces eller en funguscelle, for eksempel av genusen Aspergillus.

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan innlemmes i en rekombinant reproduserbar vektor, for eksempel en klonende eller uttrykkende vektor. Vektoren kan anvendes til å reprodusere nukleinsyren i en kompatibel vertscelle. Det tilveiebringes en fremgangsmåte for å fremstille polynukleotidene ifølge oppfinnelsen ved å innsette et polynukleotid ifølge oppfinnelsen i en reproduserbar vektor, innføre vektoren i en kompatibel vertscelle og dyrke vertscellen under betingelser som fremkaller reproduksjon av vektoren. Vekto ren kan gjenvinnes fra vertscellen. Passende vertsceller er beskrevet under i forbindelse med ekspresjonsvektorer.

Vektorer

Polynukleotidet ifølge oppfinnelsen kan innføres i en eks-pres jonskassett . Vektoren i hvilken ekspresjonskassetten eller polynukleotidet ifølge oppfinnelsen innføres kan være enhver vektor som med letthet kan underkastes rekombinante DNA-prosedyrer, og valget av vektoren vil ofte avhenge av vertscellen som den skal innføres i. Således kan vektoren være en autonomt reproduserende vektor, dvs. en vektor som foreligger som en ekstra-kromosomisk enhet, hvor reproduksjonen av den er avhengig av kromosomisk reproduksjon, f.eks. et plasmid. Alternativt kan vektoren være en vektor som, når den innføres i en vertscelle, integreres i verts-cellegenomet og reproduseres sammen med kromosomet(ene) som den er blitt integrert i.

Fortrinnsvis er et polynukleotid ifølge oppfinnelsen i en vektor funksjonsdyktig bundet til en regulerende sekvens som er i stand til å sørge for ekspresjon av den kodende sekvens av vertscellen, dvs. vektoren er en ekspresjonsvektor. Uttrykket "funksjonsdyktig bundet" refererer til en juxtaposisjon hvori de beskrevne komponentene er i et forhold som tillater dem å fungere på tiltenkt måte. En regulerende sekvens, så som en promoter, forsterker eller et annet ekspresjonsregulerende signal som er "funksjonsdyktig bundet" til en kodende sekvens, plasseres på en slik måte at ekspresjon av den kodende sekvens oppnås under betingelser som er kompatible med de kontrollerende sekvenser.

Vektoren kan være en plasmid-, kosmid-, virus- eller fag-vektor, vanligvis fremskaffet med en bakgrunn av reproduksjon, eventuelt en promoter for ekspresjon av polynukleotidet og eventuelt en forsterker og/eller en regulator av promoteren. En terminatorsekvens kan være nærværende, og det samme kan en polyadenyleringssekvens. Vektoren kan in neholde et eller flere valgbare markørgener, for eksempel et ampicillinmotstandsgen (vedrørende et bakterieplasmid) eller et neomycinmotstandsgen (for en pattedyrvektor). Vektorer kan anvendes in vitro, for eksempel for fremstilling av RNA eller anvendes for å transfektere eller transformere en vertscelle. De kan omfatte to eller flere polynukleotider ifølge oppfinnelsen, for eksempel for overekspresjon.

DNA-sekvensen som koder polypeptidet, innføres fortrinnsvis i en passende vert som en del av en ekspresjonskassett (eller konstrukt) i hvilken DNA-sekvensen er funksjonsdyktig bundet til ekspresjonssignaler som er i stand til å dirigere ekspresjon av DNA-sekvensen i vertscellene. For transformasjon av en passende host med ekspresjonskonstruktet er er transformasjonsprosedyrer tilgjengelige, hvilke er velkjent for en fagkyndig person. Ekspresjonskonstruktet kan anvendes for transformasjon av verten som en del av en vektor som bærer en valgbar markør, eller ekspresjonskonstruktet kan kotransformeres som et separat molekyl sammen med vektoren som bærer en valgbar markør. Vektoren kan omfatte et eller flere valgbare markørgener.

Foretrukne valgbare markører<15>,<16>omfatter, men er ikke begrenset til, de som komplementerer en defekt i vertscellen eller gir motstand mot et medikament. De omfatter f.eks. mansidige markørgener som kan anvendes for transformasjon av de fleste filamentfunguser og gjærsorter, så som aceta-midasegener eller cDNA-stoffer ( amdS-, niaD-, facEt- genene eller cDNA-stoffer fra A. nidulans, A. oryzae, eller A. niger) , eller gener som gir motstand mot antibiotika, så som G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin, phleomycin eller benomyl-motstand (benA). Alternativt kan spesifikke selek-sjonsmarkører anvendes, så som auxotrofe markører som krever tilsvarende mutante vertsstammer: f.eks. UP- 43 (fra S cerevisiae eller analoge gener fra andre gjærsorter), pyrG eller pyrA (fra A. nidulans eller A. niger), argB (fra A. nidulans eller A. niger) eller trpC. I en foretrukken utfø-relsesform er seleksjonsmarkøren slettet fra den transfor merte vertscelle etter innføring av ekspresjonskonstruktet for å oppnå transformerte vertsceller som er i stand til å produsere polypeptidet som er fritt for seleksjonsmarkør-21 22

gener<1>'".

Andre markører omfatter ATP-syntetase, underenhet 9 ( oliC), orotidin-5'-fosfatdekarboksylase ( pvrA), det bakterielle G418-motstandsgen (dette kan også anvendes i gjær, men ikke i fungi), ampicillin-motstandsgenet (E. coli), neomycin-motstandsgenet ( Bacillus) og E. coli uidA- genet, som koder for (3-glukuronidase (GUS). Vektorer kan anvendes in vitro, for eksempel for fremstillingen av RNA eller anvendes til å transfektere eller transformere en vertscelle.

For den mest filamentære fungus og gjær integreres vektoren eller ekspresjonskonstruktet fortrinnsvis i genomet i vertscellen for å oppnå stabile transformanter. Imidlertid er for visse gjærsorter også passende episomale vektorer tilgjengelige i hvilke ekspresjonskonstruktet kan innlemmes for stabil og høy ekspresjon, eksempler på dette omfatter vektorer avledet fra 2u- og pKD 1- plasmidene fra Saccharomyces og Kluyveromyces, respektive, eller vektorer inneholdende en AMA-sekvens (f.eks. AMA1 fra Aspergillus o ' on). Hvis ekspresjonskonstruktene integreres i vertscellenes genom, integreres konstruktene enten ved tilfeldige lokuser i genomet eller ved forhåndsbestemte mållokuser ved å anvende homolog rekombinasjon, og i dette tilfelle omfatter mål-lokusene fortrinnsvis et høyt uttrykket gen. Et høyt uttrykket gen er et gen hvis mRNA kan utgjøre minst 0,01%

(w/w) av det totale cellulære mRNA, f.eks. under induserte betingelser, eller alternativt kan et gen hvis genprodukt utgjøre minst 0,2% (w/w) av det totale cellulære protein, eller vedrørende utskilt genprodukt kan det utskilles til et nivå på minst 0,05g/l. Et antall eksempler på passende høyt uttrykte gener er angitt nedenfor.

En vektor eller ekspresjonskonstrukt for en gitt vertscelle kan omfatte følgende elementer; funksjonsdyktig bundet til hverandre i følgeriktig rekkefølge fra 5'-enden til 3'— enden i forhold til den kodende streng av sekvensen som koder polypeptidet av den første oppfinnelse: (1) en promotersekvens som er i stand til å dirigere transkripsjon av DNA-sekvensen som koder polypeptidet i den gitte vertscelle; (2) valgfritt, en signalsekvens som er i stand til å dirigere sekresjon av polypeptidet fra den gitte vertscelle inn i et kulturmedium; (3) en DNA-sekvens som koder en moden og fortrinnsvis aktiv form av polypeptidet; og fortrinnsvis også (4) en transkripsjonsterminasjonsregion (terminator) som er i stand til å terminere transkripsjon nedstrøms for DNA-sekvensen som koder polypeptidet.

Nedstrøms for DNA-sekvensen som koder polypeptidet, kan det være en 3'-utranslatert region inneholdende et eller flere transkripsjonsterminasjonsseter (f.eks. en terminator). Opphavet for terminatoren er mindre kritisk. Terminatoren kan f.eks. være naturlig forekommende for DNA-sekvensen som koder polypeptidet. Imidlertid anvendes fortrinnsvis en gjærterminator i gjærvertsceller og en filamentøs fungus-terminator anvendes i filamentøse fungale vertsceller. Mer foretrukket er terminatoren endogen med vertscellen (i hvilken DNA-sekvensen som koder polypeptidet, skal uttrykkes) .

Forsterket ekspresjon av polynukleotidet som koder polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kan også oppnås ved å utvelge heterologe regulerende regioner, f.eks. promoter-, sekre-sjonsleder- og/eller terminatorregioner, som kan tjene til å øke ekspresjonen og hvis ønskelig, sekresjonsnivåene av proteinet av interesse fra ekspresjonsverten og/eller for å tilveiebringe for den induserbare kontroll av ekspresjonen av polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Bortsett fra promoteren som er naturlig forekommende for genet som koder polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kan andre promotere anvendes for å dirigere ekspresjonen av polypeptidet ifølge oppfinnelsen. Promoteren kan velges på grunn av sin effektivitet i å dirigere ekspresjonen av polypeptidet ifølge oppfinnelsen i den ønskede ekspresjonsvert.

Promotere/forsterkere og andre ekspresjonsregulerende sig-naler kan velges for å være kompatible med vertscellen for hvilken ekspresjonsvektorenen er utformet. For eksempel kan prokaryotiske promotere anvendes, spesielt de som passer for anvendelse i E. coli-stammer. Når ekspresjon utføres i pattedyrceller, kan pattedyrspromotere anvendes. Vevsspesifikke promotere, for eksempel hepatocyttiske cellespesifik-ke promotere, kan også anvendes. Virale promotere kan også anvendes, for eksempel "the Moloney murine leukaemia virus long terminal repeat" (MMLV LTR), promoter-oppvekkende sar-komvirus (RSV)LTR-promoter, SV40 (f.eks. stor T-antigen)-promoter, humancytomegalovirus (CMV) IE-promoter, herpes simplex-viruspromotere eller adenovirus-promotere, HSV-promotere så som HSV IE-promoterne), eller HPV-promotere, spesielt den oppstrøms HPV-regulerende region (URR). Gjær-promotere omfatter S. cerevisiae GAL4 og ADH-promotere, S pombe nmt 1 og adh-promoteren. Pattedyrspromotere omfatter metallothoneinpromoteren som kan induseres som svar på tunge metaller, så som kadmium- and p—aktin-promotere. Vevsspesifikke promotere, spesielt endotel- eller neuronal-cellespesifikke promotere (for eksempel DDAHI- og DDAHII-promoterne), er spesielt foretrukket.

Mange forskjellige promotere<15>,<16>kan anvendes som er i stand til å dirigere transkripsjon i vertscellene ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis er promotersekvensen avledet fra et høyt uttrykket gen som tidligere definert. Eksempler på foretrukne høyt uttrykte gener fra hvilke promotere fortrinnsvis avledes og/eller som er innbefattet i foretrukne forhåndsbestemte mållokuser for integrering av ekspresjons-konstrukter, omfatter, men er ikke begrenset til, gener som koder glykolyttiske enzymer, så som triose-fosfatisomeraser (TPI), glyseraldehydfosfatdehydrogenaser (GAPDH), fosfo-glyseratkinaser (PGK), pyruvatkinaser (PYK), alkoholde-hydrogenaser. (ADH), samt gener som koder amylaser, gluko-amylaser, proteaser, xylanaser, cellobiohydrolaser, B-galaktosidaser, alkohol (metanol) oksidaser, forlengnings-faktorer og ribosomale proteiner. Spesifikke eksempler på passende høyt uttrykte gener omfatter f.eks. LAC4-genet fra Kluyveromyces sp., metanoloksidasegenene ( A OX og MOX) fra Hansenula og Pichia, respektive, glukoamylase genene ( glaA) fra A. niger og A. awamori, A. oryzae TAKA-amylasegenet, A. nidulans gpdA- genet og T.reesei-cellobiohydrolasegenene.

Eksempler på sterke konstitutive og/eller induserbare promotere som er foretrukket for anvendelse i fungale ekspresjonsverter<15>'<16>, er de som kan oppnås fra de fungale gener for xylanase ( xlnA), fytase, ATP-syntetase, underenhet 9 ( oliC), triosefosfatisomerase ( tpi), alkoholdehydrogenase (AAA), a-amylase ( amy), amyloglukosidase (AG - fra glaEt-genet), acetamidase ( amdS) og glyseraldehyde3-fosfatde-hydrogenase ( gpd).

Eksempler på sterke gjær-promotere er de som kan oppnås fra alkohol dehydrogenase, laktase, 3-fosfoglyseratkinase og triosefosfatisomerase.

Eksempler på sterke bakteriepromotere er a-amylase og SPo2-promotere samt promotere fra ekstracellulære protea-segener.

Promotere som er passende for planteceller, omfatter napa-linsyntase (nos), oktopinsyntase (oes), mannopinsyntase (mas), ribulosisk liten underenhet (rubisco ssu), histon, risaktin, faseolin, blomkålmosaikkvirus (CMV) 35S og 19S og cirkovirus-promotere. All disse promotere er lett tilgjengelige i faget.

Vektoren kan videre omfatte sekvenser som flankerer polynukleotidet og gi opphav til RNA som omfatter sekvenser som er homologe med eukaryotiske genomiske sekvenser, fortrinnsvis pattedyrs genomiske sekvenser eller virale genomiske sekvenser. Dette muliggjør innføringen av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen inn i genomet av eukaryotiske celler eller viruser ved homolog rekombinasjon. Spesielt kan en plasmidvektor omfattende ekspresjonskassetten flan-kert av virale sekvenser anvendes til å fremstille en viral vektor som passer for å levere polynukleotidene ifølge oppfinnelsen til en pattedyrcelle. Andre eksempler på passende virale vektorer omfatter herpes simplex virale vektorer18,19og retroviruser, inklusive lentiviruser, adenoviruser, ade-no-forbundne viruser og HPV-viruser (så som HPV-16 eller HPV-18). Genoverføringsteknikker som anvender disse viruser, er kjent for fagkyndige personer. Retrovirus-vektorer kan for eksempel anvendes for å stabilt integrere polynukleotidet og gi opphav til antisense-RNA i i vertsgeno-met. Reproduksjonsdefekte adenovirusvektorer forblir der-imot episomale og muliggjør derfor transient ekspresjon.

Vektoren kan inneholde et polynukleotid ifølge oppfinnelsen orientert i en antisense-retning for å sørge for fremstillingen av antisense-RNA. Dette kan anvendes for å redusere, hvis ønskelig, nivåene av ekspresjon av polypeptidet.

Vertsceller og ekspresjon

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, hvilken fremgangsmåte omfatter å dyrke en vertscelle (f.eks. transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor) under betingelser som sørger for ekspresjon (av vektoren) av en kodende sekvens som koder polypeptidet, og eventuelt gjenvinne det uttrykte polypeptid. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan innlemmes i en rekombinant reproduserbar vektor, f.eks. en ekspresjonsvektor. Vektoren kan anvendes til å reprodusere nukleinsyren i en kompatibel vertscelle. Det tilveiebringes en fremgangsmåte for å fremstille et polynukleotid ifølge oppfinnelsen ved å innsette et polynukleotid ifølge oppfinnelsen i en reproduserbar vektor, innføre vektoren i en kompatibel vertscelle, og dyrke vertscellen under betingelser som fremkaller reproduksjon av vektoren. Vektoren kan gjenvinnes fra vertscellen. Passende vertsceller omfatter bakterier så som E. coli, gjær, pattedyrcellelinjer og andre eukaryotiske cellelinjer, for eksempel insektceller, så som Sf9-celler og (f.eks. filamentøse) fungusceller.

Fortrinnsvis fremstilles polypeptidet som en utskilt protein, og i dette tilfelle er DNA-sekvensen som koder en moden form av polypeptidet i ekspresjonskonstruktet, funksjonsdyktig bundet til en DNA-sekvens som koder en signalsekvens. Fortrinnsvis er signalsekvensen naturlig forekommende for (homolog med) DNA-sekvensen som koder polypeptidet. Alternativt er signalsekvensen fremmed for (heterolog med) DNA-sekvensen som koder polypeptidet, og i dette tilfelle er signalsekvensen fortrinnsvis endogen med vertscellen i hvilken DNA-sekvensen uttrykkes. Eksempler på passende signalsekvenser for gjærvertsceller er signalsekvenser avledet fra gjærens a-faktorgener. På lignende måte er en passende signalsekvens for filamentøse fungale vertsceller f.eks. en signalsekvens avledet fra et filamen-tøst fungalt amyloglukosidasegen (AG), f.eks. A. niger glaA-genet. Dette kan anvendes i kombinasjon med amylo-glukosidasepromoteren (også kalt (gluko)amylase) i seg selv, samt i kombinasjon med andre promotere. Hybrid-signalsekvenser kan også anvendes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse.

Foretrukne heterologe sekresjonsledersekvenser er de som har sitt opphav fra det fungale amyloglukosidasegen (AG)

( glaA - både 18- og 24-aminosyreversjonene f.eks. fra Aspergillus), a-faktorgenet (gjærsorter f.eks. Saccharomyces og Kluyveromyces) eller a-amylasegenet ( Bacillus).

Vektorene kan transformeres eller transfekteres i en passende vertscelle som beskrevet ovenfor for å sørge for ekspresjon av et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Denne prosess kan omfatte å dyrke en vertscelle transformert med an ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor under betingelser som sørger for ekspresjon av vektoren av en kodende sekvens som koder polypeptidet.

Videre tilveiebringes vertsceller som er transformert eller transfektert med eller omfatter et polynukleotid eller en vektor ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis bæres polynukleotidet i en vektor for reproduksjonen og ekspresjon av polynukleotidet. Cellene vil velges slik at de er kompatible med nevnte vektor og kan for eksempel være prokaryotisk (for eksempel bakterier), fungus-, gjær- eller planteceller .

En heterolog vert kan også velges hvori polypeptidet ifølge oppfinnelsen fremstilles i en form som er hovedsakelig fri for andre cellulose-nedbrytende enzymer. Dette kan oppnås ved å velge en vert som normalt ikke produserer slike enzymer, så som Kluyveromyces lactis.

Videre tilveiebringes fremgangsmåter for fremstilling av polypeptidet ifølge oppfinnelsen ved hjelp av rekombinant ekspresjon av en DNA-sekvens som koder polypeptidet. For dette formål kan DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen anvendes for genamplifikasjon og/eller utbytte av ekspresjonssignaler, så som promotere, sekresjonsignalsekvenser, for å mu-liggjøre økonomisk fremstilling av polypeptidet i en passende homolog eller heterolog vertscelle. En homolog vertscelle er heri definert som en vertscelle som er av den samme art, eller som er en variant innenfor den samme art, som artene fra hvilke DNA-sekvensen er avledet.

Passende vertsceller er fortrinnsvis prokaryotiske mikroorganismer så som bakterier, eller mer foretrukket eukaryotiske organismer, for eksempel fungi, så som gjærsorter eller filamentøs fungus, eller planteceller. Generelt er gjærceller foretrukket overfor fungale celler fordi de er lettere å manipulere. Imidlertid utskilles noen proteiner enten dårlig fra gjær, eller i noen tilfeller prosesseres de ikke ordentlig (f.eks. hyperglykosylering i gjær). I disse tilfeller bør en fungal vertsorganisme velges.

Vertscellen kan overuttrykke polypeptidet, og teknikker for å konstruere overekspresjon er velkjent. Verten kan således ha to eller flere kopier av det kodende polynukleotid (og vektoren kan således ha to eller flere kopier av den grunn).

Bakterier fra genusen Bacillus er meget passende som heterologe verter på grunn av deres evne til utsondre proteiner i kulturmediet. Andre bakterier som er passende som verter er bakterier fra genusene Streptomyces og Pseudomonas. En foretrukket gjærvertscelle for ekspresjonen av DNA-sekvensen som koder polypeptidet, er av genusene Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, og Schizosaccharomyces. Mer foretrukket velges en gjærvertscelle fra gruppen bestående av artene Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (også kjent som Kluyveromyces marxia-nus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica og Schizosaccharomyces pombe.

Mest foretrukket er imidlertid (f.eks. filamentøse) fungale vertsceller. Foretrukne filamentøse fungale vertsceller velges fra gruppen bestående av genusene Aspergillus, Tri-choderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Termoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia og Talaromyces. Mer foretrukket er en filamentøs fungal vertscelle av artene Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans eller en art fra Aspergillus niger-gruppen (som definert av Raper og Fennell, genusen Aspergillus, The Williams&Wilkins Company, Baltimore, s. 293-344, 1965). Disse omfatter, men er ikke begrenset til, Aspergillus niger, Aspergillus avi amor i, Aspergillus tubi gensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae og Aspergillus ficuum, og videre bestående av artene Tri-choderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chryso-genum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora termophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum og Thielavia terrestris.

Eksempler på foretrukne ekspresjonsverter innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse er fungi så som Aspergillus-arten (beskrevet i EP-A-184,438 og EP-A-284,603) og Tricho-derma- arten; bakterier så som Bacillus- arten (beskrevet i EP-A-134,048 og EP-A-253,455), f.eks. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas-artern og gjærsorter så som Kluyveromyces-arten (beskrevet i EP-A-096,430 f.eks. Kluyveromyces lactis i EP-A-301,670) og Saccharomyces- arten, f.eks. Saccharomyces cerevisiae.

Vertscellene omfatter planteceller og kan derfor vedrøre transgene organismer, så som planter og deler derav, som inneholder et eller flere celler ifølge oppfinnelsen. Cellene kan heterologt uttrykke polypeptidet ifølge oppfinnelsen eller kan heterologt inneholde et eller flere av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen. Den transgene (eller genetisk modifiserte) plant kan derfor ha innsatt (f.eks. stabilt) i sitt genom en sekvens som koder et eller flere av polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Transformasjonen av planteceller kan utføres under anvendelse av kjente teknikker, for eksempel ved å anvende et Ti- eller et Ri-plasmid fra Agrobacterium tumefaciens. Plasmidet (eller vektoren) kan således inneholde sekvenser som er nødvendige for å transfektere en plante, og derivater av Ti- og/eller Ri-plasmidene kan anvendes.

Alternativt kan direkte infeksjon av en del av en plante, så som et blad, roten eller stammen påvirkes. I denne teknikk kan planten som skal infiseres være skadet, for eksem pel ved å kutte planten med et barberblad eller stikke planten med en nål eller gni planten med et slipemiddel. Skaden inokuleres deretter med Agrobacterium. Planten eller plantedelen kan deretter dyrkes på et passende kulturmedium og få utvikles til en moden plante. Regenerasjon av transformerte celler til genetisk modifiserte planter kan oppnås ved å anvende kjente teknikker, for eksempel ved å velge transformerte skudd under anvendelse av et antibiotikum og ved underdyrkning av skuddene på et medium inneholdende de passende næringsstoffer, plantehormoner og lignende<17>.

Dyrkning av vertsceller og rekombinant fremstilling

Oppfinnelsen omfatter også celler som er blitt modifisert til å uttrykke |$-glukanasen eller en variant derav. Slike celler omfatter transiente, eller fortrinnsvis stabile høy-ere eukaryotiske cellelinjer, så som pattedyrceller eller insektceller, lavere eukaryotiske celler, så som gjær- og (f.eks. filamentøse) fungusceller eller prokaryotiske celler så som bakterieceller.

Det er også mulig for proteinene ifølge oppfinnelsen å uttrykkes transient i en cellelinje eller på en membran, så som for eksempel i et baculovirusekspresjonssystem. Slike systemer, som er tilpasset til å uttrykke proteinene i henhold til oppfinnelsen, er også innbefattet innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

I henhold til foreliggende oppfinnelse kan fremstillingen av polypeptidet ifølge oppfinnelsen påvirkes av dyrkingen av mikrobielle ekspresjonsverter, som er blitt transformert med et eller flere polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse, i et konvensjonelt nærende fermenteringsmedium.

De rekombinante vertsceller i henhold til oppfinnelsen kan dyrkes ved å anvende prosedyrer som er kjent i faget. For hver kombinasjon av en promoter og en vertscelle er kultur-betingelser tilgjengelige som bidrar til å uttrykke DNA- sekvensen som koder polypeptidet. Etter å ha oppnådd den ønskede celletetthet eller titer for polypeptidet, stoppes dyrkingen, og polypeptidet gjenvinnes ved å anvende kjente prosedyrer.

Fermenteringsmediet kan omfatte et kjent kulturmedium inneholdende en karbonkilde (f.eks. glukose, maltose, molasser, cellulose, [J-glukan etc.) , en nitrogenkilde (f.eks. ammoni-umsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumklorid, etc.); en orga-nisk nitrogenkilde (f.eks. gjærekstrakt, maltekstrakt, pep-ton etc.) og uorganiske næringskilder (f.eks. fosfat, mag-nesium, kalium, sink, jern etc). Eventuelt kan en induktor

(f.eks. cellulose, 13-glukan, maltose eller maltodekstrin)

være innbefattet.

Utvalget av passende medium kan være basert på valget av ekspresjonsvert og/eller basert på reguleringskravene hos ekspresjonskonstruktet. Slike medier er kjent for fagkyndige personer. Mediet kan, hvis ønskelig, inneholde ytterligere komponenter som begunstiger de transformerte eks-pres jonsverter i forhold til andre potensielt kontamine-rende mikroorganismer.

Fermenteringen kan utføres over en periode på 0,5-30 dager. Prosessen kan være satsvis, kontinuerlig eller innmatende, hensiktsmessig ved en temperatur i området mellom 0 og 45°C og for eksempel ved en pH mellom 2 og 10. Foretrukne fer-menteringsbetingelser er en temperatur i området mellom 20 og 37°C og/eller en pH mellom 3 og 9. De passende betingelser velges vanligvis basert på valget av ekspresjonsvert og proteinet som skal uttrykkes.

Etter fermenteringen kan, hvis nødvendig, cellene fjernes fra fermenteringsløsningen ved hjelp av sentrifugering eller filtrering. Etter at fermenteringen har stoppet eller etter fjerning av cellene kan polypeptidet ifølge oppfinnelsen deretter gjenvinnes og hvis ønskelig, renses og isoleres ved hjelp av konvensjonelle midler.

D. Anvendelser av polypeptidene og fremgangsmåter for å bearbeide plante- eller celluloseholdige materialer

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen som har [J-glukanase- (eller cellulase-)aktivitet kan anvendes til å behandle fungus- eller plantematerial inklusive plantemasse og planteekstrakter. For eksempel de kan anvendes til å behandle cerealer, grønnsaker, frukt eller ekstrakter derav. De kan anvendes i vaskeblandinger (flytende eller faste, f.eks. pulver) og/eller i detergentsammensetninger. Med fordel kombineres polypeptidet ifølge oppfinnelsen med passende (faste eller flytende) bærere eller fortynningsstoffer inklusive buffere for å tilveiebringe en sammensetning/enzympreparat. Polypeptidet kan bindes til eller blandes med en bærer, f.eks. immobiliseres på en fast bærer. Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i et ytterligere aspekt en sammensetning omfattende et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Denne kan være i en form som passer for pakking, transport og/eller lagring, fortrinnsvis hvor glukanaseaktiviteten er bibeholdt. Sammensetningene omfatter pasta, væske, emulsjon, pulver, flak, granulat, pellet eller en annen ekstrudert form.

Sammensetningen kan videre omfatte ytterligere ingredienser så som et eller flere enzymer; for eksempel pektinaser, inklusive en (f.eks. endo)-arabinanase og rhamnogalaktu-ronase, andre cellulaser, xylanaser, galaktanaser, manna-naser og/eller xyloglukanaser. Polypeptidet er vanligvis stabilt formulert enten i flytende eller tørr form. Normalt fremstilles produktet som en sammensetning som eventuelt vil omfatte for eksempel en stabiliserende buffer og/eller et konserveringsmiddel. Sammensetningene kan også omfatte andre enzymer som er i stand til å digerere plantematerial eller cellulose, for eksempel andre cellulaser, f.eks. (|$-D-)glukanaser. For visse anvendelser kan immobilisering av enzymet på en fast matriks eller innlemmelse på eller i faste bærerpartikler være foretrukket. Sammensetningen kan også omfatte mange forskjellige andre plantematerial- nedbrytende enzymer, for eksempel (andre) cellulaser og andre pektinaser.

Polypeptidene og sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes i en fremgangsmåte for å bearbeide plantematerial for å nedbryte eller modifisere cellulosebestand-delene (f.eks. p-D-glukan) av celleveggene i plante- eller fungusmaterialet. I et ytterligere aspekt tilveiebringes en fremgangsmåte for å nedbryte eller modifisere en plantecelle eller cellulose, hvilken fremgangsmåte omfatter å kontakte planten, funguscellen eller cellulosen med et polypeptid eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen.

Det tilveiebringes også en fremgangsmåte for å bearbeide et plantematerial, hvilken fremgangsmåte omfatter å kontakte plantematerialet med et polypeptid eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen for å nedbryte eller modifisere cellulosen i plantematerialet. Fortrinnsvis er plantematerialet en plantemasse eller et planteekstrakt.

Spesielt omfatter nedbrytningen fortrinnsvis spaltning av p-glukanunderenheter av en cellulosekomponent i plantecelleveggen. Plantematerialet er fortrinnsvis en cerealie, grønnsak, frukt eller grønnsaks- eller fruktmasse eller ekstrakt. Det tilveiebringes videre et bearbeidet plantemateriale som kan oppnås ved å kontakte et plantemateriale med et polypeptid eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen .

Det tilveiebringes også en fremgangsmåte for å redusere viskositeten i et planteekstrakt hvilken fremgangsmåte omfatter å kontakte planteekstraktet med et polypeptid eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen i en mengde som er effektiv i nedbrytningen av cellulose (eller p-D-glukan) som foreligger i planteekstraktet.

Plante- og celluloseholdige materialer omfatter plantemasse, deler av planter og plantekstrakter. I sammenheng med denne oppfinnelse er et ekstrakt fra et plantemateriale enhver substans som kan avledes fra plantemateriale ved ekstraksjon (mekanisk og/eller kjemisk), bearbeiding eller ved andre separasjonsteknikker. Ekstraktet kan være frukt-saft, nektar, base eller konsentrater fremstilt derav. Polypeptidet kan anvendes i (f.eks. total) flytendegjørelse og/eller (fremskutt) oppbløting, for eksempel ved fremstilling av (frukt)safter. Plantematerialet kan omfatte eller avledes fra grønnsaker, f.eks. gulrøtter, seleri, løk, belgfrukter eller belgplanter (soya, soyabønne, erter) eller frukt, f.eks. eplefrukter eller kjernefrukter (epler, pærer, kvede etc.), druer, tomater, citrus (appelsin, sit-ron, lime, mandarin), meloner, svisker, kirsebær, solbær, rips, bringebær, jordbær, tranebær, ananas og andre tropis-ke frukter, trær og deler derav (f.eks. pollen fra fu-rutrær) , eller kornprodukter (havre, bygg, hvete, mais, ris) .

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan således anvendes til å behandle plantemateriale inklusive plantemasse og planteekstrakter. De kan også anvendes til å behandle flytende og faste næringsmidler eller spiselige næringsmiddelingre-dienser.

Normalt anvendes polypeptidene ifølge oppfinnelsen som en sammensetning/et enzympreparat som beskrevet ovenfor. Sammensetningen vil generelt tilsettes til plantemasse, hvilket kan oppnås ved for eksempel mekanisk bearbeidning, så som å knuse eller male plantematerialet. Inkubering av sammensetningen med planten vil vanligvis utføres under en tidsperiode på fra 10 minutter til 5 timer, så som 30 minutter til 2 timer, fortrinnsvis i omkring 1 time. Bear-beidningstemperaturen er fortrinnsvis 10-55°C, f.eks. fra 15 til 25°C, optimalt omkring 20°C, og man kan bruke 10-300g, fortrinnsvis 30-70g, optimalt omkring 50g enzym pr. tonn material som skal behandles. Hele enzymet/enzymene eller dets/deres sammensetninger som anvendes, kan tilsettes sekvensielt eller samtidig til plantemassen. Avhengig av sammensetningen av enzympreparatet kan plantematerialet først oppbløtes (f.eks. til en puré) eller flytendegjøres. Ved å anvende polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan bear-beidningsparametere, så som utbyttet av ekstraksjonen, viskositeten i ekstraktet og/eller kvaliteten av ekstraktet forbedres.

Alternativt, eller i tillegg til ovenstående, kan et polypeptid ifølge oppfinnelsen tilsettes til råsaften oppnådd fra pressing eller flytendegjørelse av plantemassen. Behandling av råsaften vil utføres på lignende måte som plantemassen med hensyn til dosering, temperatur og opp-holdstid. Igjen kan andre enzymer, så som de som er omtalt tidligere, være innbefattet. Typiske inkuberingsbetingelser er som beskrevet i det foregående avsnitt. Straks råsaften er blitt inkubert med polypeptidene ifølge oppfinnelsen, sentrifugeres saften eller (ultra)filtreres for å tilveiebringe sluttproduktet.

En sammensetning inneholdende et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan også anvendes ved fremstilling av frukt- eller grønnsakspuréer.

Polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i brygging, vinlegging, destillering eller baking. Det kan derfor brukes i fremstillingen av alkoholiske drikkevarer, så som vin og øl, for eksempel for å forbedre filtrerbarheten eller klarheten i vin. I baking kan polypeptidet forbedre deigens struktur, modifisere dens klebrighet eller smidig-het, forbedre brødvolumet og/eller kvaliteten på brødenes indre struktur.

Polypeptid ifølge oppfinnelsen kan anvendes i brygging. I brygging kan filtreringsproblemer oppstå i meskingen, som omfatter over-modifisert malt, på grunn av nærvær av |$-glukaner frigitt ved høye temperaturer. Reduksjonen i hastigheten av vørterfiltreringen kan være en av de viktigste problemer man støter på. Ytterligere problemer er kolloid- stabilitet og uklarhetsdannelse i ferdig øl. Disse kan være forårsaket av de samme karbohydratkomplekser, spesielt under høy gravitetsbrygging. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan være i stand til å forbedre filtrerbarheten av vør-teren, for eksempel after meskingen. På denne måte kan mindre vørtervæske holdes tilbake i de brukte korn, og utbyttet av ekstraktet kan forbedres. En mer effektiv filtrering kan resultere i en øket effektivitet i bryggeriet. Således kan polypeptidene ifølge oppfinnelsen generelt anvendes for å forbedre filtrerbarheten eller filtrerings-hastigheten av (f.eks. ferdig) øl.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan også forhindre eller i det minste mildne uklarhetsdannelse under ølfremstilling. p-glukaner som forekommer i de endosperme vegger av cerealer kan føres over i det ferdige øl. Dette kan forårsake uklarheter og tap av klarhet. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan forhindre eller i det minste minske akkumu-lering av partikler på grunn av hydrolyse av p-glukan. Føl-gelig kan polypeptidene ifølge oppfinnelsen anvendes til å øke den kolloide stabilitet av (f.eks. ferdig) øl.

Polypeptidene finner anvendelse i et antall industrielle områder på grunn av deres glukanaseaktivitet. Dette kan omfatte ikke bare alkoholfremstilling, men også i biometa-nasjon, i brødfremstilling og i baking, i tannhygiene (for eksempel dentale eller orale sammensetninger), i behandling av stoffer, klær eller, produksjon av lær, ved fremstilling av papir, i farmasøytika, i te, i fremstillingen eller behandlingen av tekstiler, i detergent- eller vaskeblandinger og i behandlingen av avfall. Et aspekt av oppfinnelsen er derfor en matvare eller et næringsmiddel omfattende polypeptidet, så som en alkoholisk drikk, brød, deig eller te. Polypeptidet kan formuleres til passende sammensetninger for enhver av disse anvendelser. Polypeptidet kan være nærværende i en vandig sammensetning (f.eks. varmt vann), fortrinnsvis med et eller flere fungicider, for å behandle plantemateriale (f.eks. løker), spesielt til kontrollere parasittiske insekter, midd og nematoder.

Siden polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan nedbryte glukan, kan det tilsettes til matvarene eller næringsmidlene (for eksempel ved konsum av mennesker). Det er kjent at lø-selig p-D-glukan er forbundet med senking av serum-kolesterol og triglyserider, og derfor kan polypeptidene ifølge oppfinnelsen anvendes til å senke serumkolesterol-og triglyseridnivåene i mennesker eller dyr, for eksempel i hyperlipemiske individer. Oppfinnelsen omfatter derfor far-masøytiske og veterinærmedisinske sammensetninger som omfatter polypeptidet ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk akseptabel bærer. Polypeptidene kan således anvendes ved fremstilling av et medikament for forhindring eller behandling av hyperlipemi, eller høye se-rumkolesterol- og triglyseridnivåer eller forstyrrelser som er et resultat derav.

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan også vise anti-fungal aktivitet. De kan være i stand til å nedbryte fungale cellevegger, og de kan således anvendes for oppløsning av fungale cellevegger, for å åpne cellene. Dette kan frigi intracellulærer proteiner. På denne måte kan polypeptidene anvendes til å fremstille gjær- og/eller fungusekstrakter.

E. Dyrefor

Oppfinnelsen vedrører i tillegg en (dyre)forsammensetning omfattende et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Polypeptidet kan være nærværende i foret ved en konsentrasjon som er forskjellig fra dens naturlige konsentrasjon. Foretrukne mengder er fra 0,1 til 100, så som 0,5 til 50, fortrinnsvis 1 til 10 mg pr. kg for.

Det tilveiebringes også en fremgangsmåte ved fremstilling av en (dyre)forsammensetning, hvor fremgangsmåten omfatter å tilsette til et eller flere spiselige forsubstanser eller ingredienser et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Polypeptidene kan tilsettes til (dyre)forsammensetningen separat fra forsubstansene eller ingrediensene, individualt eller i kombinasjon med andre fortilsetningsstoffer. Polypeptidet kan være en integrert del av en av forsubstansene eller ingrediensene.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan også tilsettes til dyrefor som er rik på cellulose, for å forbedre nedbrytningen av plantecelleveggen hvilket fører til forbedret utnyt-telse av plantens næringsstoffer av dyret. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan tilsettes til foret eller ensila-sjen hvis forhåndsbløtlegning eller våtkost er foretrukket. Med fordel kan polypeptidene ifølge oppfinnelsen fortsette å nedbryte cellulose i foret in vivo. Spesielt fungus-avledede polypeptider ifølge oppfinnelsen har generelt lavere pH-optimum og er i stand til å frigi viktige næringsstoffer i slike sure omgivelser som mavesekken i et dyr. Oppfinnelsen omfatter således også (f.eks. dyre-) for omfattende et eller flere polypeptider ifølge oppfinnelsen.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes under fremstillingen av melkesubstitutter (eller erstatningsmid-ler) fra soyabønner. Disse melkesubstitutter kan fortæres av både mennesker og dyr. Et typisk problem ved fremstilling av disse melkesubstitutter er den høye viskositet i soyabønneoppslemmingen, hvilket resulterer i nødvendig-heten av en uønsket fortynning av oppslemmingen til en konsentrasjon av faststoff på 10 til 15%. Et enzympreparat inneholdende et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan tilsettes til, eller under bearbeidningen av, oppslemmingen, hvilket muliggjør bearbeidning ved en høyere konsentrasjon (vanligvis 40 til 50%) faststoff. Enzymet kan også anvendes i fremstillingen av smaksprodukter, f.eks. fra soyabønner.

Sammensetningen kan i tillegg omfatte (spesielt når den formuleres for anvendelse i dyrefor) et eller flere iono-forer, oksidasjonsmidler, surfaktanter, rumen-beskyttede aminosyrer, enzymforsterkere eller enzymer som kan fremstilles naturlig i det gastrointestinale system i dyret for skal fores.

Tilsatt til for (inklusive ensilasje) for drøvtyggere eller monogastriske dyr (f.eks. fjærfe eller svin) kan forene omfatte cerealer så som bygg, hvete, mais, rug eller havre eller cerealiske biprodukter så som hvetekli eller maiskli, eller andre plantematerialer så som soyabønner og andre belgplanter. Enzymet/enzymene kan signifikant forbedre ned-brytelsen av plantecelleveggene hvilket fører til bedre ut-nyttelse av plantens næringsstoffer av dyret. Som en følge kan vekstraten og/eller foromdannelsen forbedres. Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan tilsettes til foret (direkte eller som tilsetningsstoff eller ingrediens) eller behandlet cellulose (f.eks. glukan) kan tilsettes i stedet.

En spesielt foretrukket metode for (eksogen) addisjon av p-glukanasen er å tilsette polypeptidet ifølge oppfinnelsen som transgent plantematerial og/eller (f.eks. transgene) frø. Polypeptidet kan således ha blitt syntetisert via heterolog genekspresjon, for eksempel kan genet som koder det ønskede enzym, klones inn i en planteekspresjons-vektor, under kontroll av de passende planteekspresjons-signaler, f.eks. en vevsspesifikk promoter, så som frøspesifikk promoter. Ekspresjonsvektoren inneholdende genet som koder polypeptidet kan deretter transformeres inn i planteceller, og transformerte celler kan velges for regenerering in i hele planter. De således oppnådde transgene planter kan dyrkes og høstes, og de deler av plantene som inneholder det heterologe (for planten) polypeptid kan innbefattes i en av sammensetningene, enten som sådan eller etter videre bearbeidelse. Generelle metoder for (heterolog) ekspresjon av enzymer i (transgene) planter, inklusive metoder for frøspesifikk ekspresjon av enzymer, er kjent<23>. Det heterologe polypeptid kan være inkludert i frøene fra de transgene planter, eller det kan være inkludert i andre plantedeler så som røtter, stammer, blad, tre, blomster, bark og/eller frukt. Planten kan være en enfrøbladet plante eller en tofrøbladet plante. Passende planter omfatter cerealer, så som havre, bygg, hvete, mais og ris. Fortrinnsvis er polynukleotidet ifølge oppfinnelsen stabilt innlem-met i plantegenomet.

Addisjonen av polypeptidet i form av transgent plantematerial, f.eks. i transgene frø kan kreve bearbeidning av plantematerialet for å gjøre enzymet tilgjengelig, eller i det minste forbedre dets tilgjengelighet. Slike bearbeid-ningsteknikker kan omfatte forskjellige mekaniske (f.eks. maling og/eller sliping) teknikker eller termomekaniske be-handlinger så som ekstrudering eller ekspansjon.

Det tilveiebringes også en fremgangsmåte for å fremme veksten og/eller foromdannelsen i et monogastrisk eller ikke-drøvtyggende dyr, hvor fremgangsmåten omfatter å fore dyret med polypeptid ifølge oppfinnelsen. Passende dyr omfatter husdyr, monogastriske og/eller ikke-drøvtyggende dyr, så som svin (eller grisunger), fjærfe (så som høns, kalkuner), kalver eller okser eller akvatiske (f.eks. marine) dyr (for eksempel fisk).

Analyser med hensyn til cellulosenedbrytende enzymer

Det beskrives også anvendelsen av polypeptider i henhold til oppfinnelsen for å finne metoder for å identifisere forbindelser som kan virke som agonister eller antagonister som kan modulere p-glukanase. Generelt uttrykt kan slike sorteringsmetoder involvere å kontakte et polypeptid ifølge oppfinnelsen med en testforbindelse og deretter måle aktiviteten eller inkubere et polypeptid ifølge oppfinnelsen med en testsubstans og deretter å påvise enhver modulasjon av p-glukanaseaktivitet. Midler som bindes til polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også identifiseres ved bindingsanalyser.

Modulatoraktivitet kan bestemmes ved å kontakte celler som uttrykker et polypeptid ifølge oppfinnelsen med en substans som skal undersøkes og ved å overvåke virkningen mediert av polypeptidene. Cellene som uttrykker polypeptidet, kan være in vitro og fortrinnsvis utføres analysen in vitro ved å

anvende celler som uttrykker rekombinant polypeptid.

Undersøkelsene og substratene beskrevet heri har muliggjort identifisering og bekreftelse av p-glukanaseaktivitet. Imidlertid kan disse undersøkelser anvendes til å påvise andre cellulosenedbrytende enzymer, enten de har p-glukanaseaktivitet eller ikke. Substratet som kan anvendes for denne undersøkelse, kan omfatte P-glukan.

Et annet aspekt av oppfinnelsen vedrører en undersøkelse for å identifisere eller å påvise et polypeptid som er i stand til å nedbryte cellulose. Aktiviteten kan være en glukanase (f.eks. p-glukanase) eller cellulase eller xylo-glukanase. Undersøkelsen kan omfatte: (a) å tilveiebringe, som et substrat for en kandidatfor-bindelse (vanligvis et polypeptid), substratet beskrevet i det foregående avsnitt; og (b) å kontakte substratet med kandidatforbindelseen, og å

påvise om noen karbohydrater er produsert.

Mengden av disse karbohydrater kan måles. Hvis nødvendig, kan de deretter sammenlignes med mengden av karbohydrater produsert i et kontrolleksperiment, i fravær av kandidat-forbindelse.

De ovennevnte undersøkelser kan anvendes for å identifisere modulatorer av p-glukanaseaktivitet. Foretrukne trekk og karakteristika av et aspekt av oppfinnelsen er anvendelig på et annet aspekt mutatis mutandis.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet med henvisning til føl-gende eksempler, som er ment å være bare illustrerende.

EKSEMPLER

Generelle prosedyrer

Standardiserte molekylære kloningsteknikker så som DNA-isolasjon, gelelektroforese, enzymatiske restriksjonsmodi-fikasjoner av nukleinsyrer, Southern-analyser, E. coli-transformasjon, koloniløftninger og filterhybridisasjoner etc. ble utført ved å anvende standardiserte teknikker<1>'<2>. Syntetiske oligo-deoksynukleotider ble oppnådd fra ISOGEN Bioscience (Maarssen, Nederland). DNA-sekvensanalyser ble utført på en Applied Biosystems 373A DNA-sekvenser, i henhold til produsentens instruksjoner.

DNA-merking og hybridisering ble utført i henhold til ECL™ direkte nukleinsyremerking og påvisningssystemer (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, England) eller i henhold til standariserte radioaktive merkingsteknikker<1>.

Eksempel 1: RNA- isolering fra T . emersonii og syntese av cDNA

T. emersonii-stammen CBS 393.64 ble fermentert under cellulase-induserende betingelser. Ved flere tidspunkter ble mycelium og kultursupernatanter høstet ved filtrering ved å anvende Miracloth filtreringsomslag. Myceliet ble vasket i stor utstrekning med avmineralisert vann og presset mellom papirhåndklær for å fjerne overskytende vann. Myceliet fra utvalgte tidspunkter (basert på cellulasemålingene i kul-tursupernatantene) ble frosset umiddelbart i flytende nit-rogen og malt til et fint pulver ved å anvende en morter og støter. Det resulterende pulver ble overført til et sterilt 50 ml rør og veid: for hvert 1-1,2 g malt mycelium ble 10 ml TRIzol-reagens (Gibco/BRL) tilsatt (maks. 25 ml pr. rør). Myceliepulveret ble umiddelbart solubilisert ved kraftig blanding (hvirvelbevegelse, 1 min), etterfulgt av 5 minutter inkubering ved romtemperatur med sporadisk blanding. Et 0,2 (opprinnelig TRIzol) volum av kloroform (såle des 2 ml for hver 10 ml TRIzol anvendt opprinnelig) ble tilsatt, hvirvlet og etterlatt ved romtemperatur i 10 min. Deretter ble blandingen sentrifugert ved 4°C, 6000 g i 30 minutter. Den vandige fase på toppen ble overført til et nytt rør, og totalt RNA ble utfelt ved tilsetning av et 0,5 (opprinnelig TRIzol) volum av isopropylalkohol (således 5 ml isopropylalkohol for hver 10 ml TRIM anvendt opprinnelig) . Etter 10 minutter med utfelling ved romtemperatur ble RNA'et utvunnet ved sentrifugering i 30 minutter ved 6000 g. Ved fjerning av supernatanten ble RNA-pelleten skylt med et volum av 70% etanol. Etter fjerning av etanolen ble RNA-pelleten lufttørket. Den tørkede RNA-pellet ble oppløst i 3 ml GTS (100 mM Tris-Cl, pH 7,5, 4 M guanidiumtiocyanat, 0,5 % natriumlaurylsarkosinat) buffer. lOjil RNA løsning ble brukt for å bestemme kvalitet og konsentrasjon av nukleinsyrer .

Northern-analyse ble utført3 og det isolerte RNA ble videre renset<1>,<3>. For isolering av mRNA ble en modifisert protokoll (ved å anvende graviditetsstrømning istedenfor sentrifugering) av PHARMACIA-rensesettet (Cat no. 27-9258-02) anvendt<3>. For cDNA-syntese ble STRATAGENE cDNA Syntesesettet anvendt i henhold til instruksjonene fra produsenten, med unntagelse av et antall optimaliseringer for å anvende pGBFIN-vektorene med vesentlige endringer som tidligere beskrevet<3>.

Mengden av cDNA som ble syntetisert, ble beregnet ved TCA-utfelling og deretter analysert via elektroforese i alka-liske agarosegeler<3>.

Eksempel 2: Fremstilling av en cDNA- samling fra T . emersonii mRNA

cDNA-poolen oppnådd i Eksempel 1 ble avkortet, ligert med adaptere og restriksjonsenzymdigerert<3>.

Kloning av cDNA'et i ekspresjonsvektoren pGBFIN-11 (se W0-99/32617 med hensyn til konstruksjonen av denne vektor) krever nærvær av et EcoRI-sete på 5'-enden og av et Xhol-sete på 3'-enden av cDNA'et. Derfor ble det første streng-primende oligonukleotid og de anvendte adaptersekvenser (Pharmacia) valgt for å oppfylle forutsetningene som var satt for ekspresjonsvektoren.

CDNA'ene som var oppnådd, ble separert ved størrelsesfrak-sjonering gjennom en SEPHAROSE CL-2B-matriks, hvoretter størrelsen av de enkelte pooler som var oppnådd, ble analysert ved ikke-denaturerende gelelektroforese. To pooler av cDNA'er, oppnådd via avskjæringer ved 0,5 kb og 1,0 kb respektive, ble valgt for konstruktion av en cDNA-samling i pGBFIN-11. For pGBFIN- 11 ble en pool av fullstendig dobbelt-digerert ( EcoRI Xhol) pGBFIN- 11-vektor (bakgrunns-ligasjon < 1%) fremstilt. De valgte cDNA-pooler ble ligert inn i pGBFIN-ll-vektoren og transformert i E. coli XL10-Gold-bakterieceller for å generere to primære cDNA-samlinger. Transformasjonsfrekvensene av de to pooler var begge

>1,0 x IO<6>. Fra en fraksjon av begge E. coli cDNA-samlinger ble kolonier valgt tilfeldig, og plasmid-DNA ble isolert. Analyse av dette plasmid-DNA viste at begge cDNA-samlinger had innføyningsprosentandeler mellom 90 og 95%.

Dessuten ble koloniløftinger utført fra en fraksjon av samlingen, og de genererte filtre ble deretter hybridisert med T. emersonii gpdA gen, som koder glyseraldehyd-3-fos-fatdehydrogenasegenet. Deretter ble plasmid-DNA isolert og ved restriksjonsanalyse ble det vist at all plasmid inneholdt enkeltvise innføyninger i korrekt orientering. Sek-vensering av 5'-endene av cDNA'ene innenfor disse T. emersonii gpdA-inneholdende plasmider viste at > 85% var uav-kortet .

Eksempel 3: Transformasjon av ekspresjonssamlingen til A .

niger

DNA ble isolert fra E. coli eDNA-samlingen som beskrevet tidligere. Totalt plasmid-DNA ble digerert i 4 timer ved 37°C med Noti for å fjerne E. coli-avledede plasmidsekven-ser. Etter rensing ble DNA'et oppløst i sterilt avmineralisert vann.

Multiple A. niger DS2978-transformasjoner ble utført<3>ved å anvende 1,5 x IO<7>B 3,0 x 10<7>protoplaster og 10 ug av plasmid-DNA pr. transformasjon. Transformanter ble valgt med hensyn til nærvær av amdS-seleksjonsmarkøren etter vekst på acetamid som den ensete N-kilde. Siden både amdS-seleksjonsmarkøren og cDNA-ekspresjonskassetten er nærværende på det integrerende fragment er vekst på acetamid indikativisk for nærvær av en cDNA-ekspresjonskassett.

Etter tilnærmelsesvis 7-10 dagers inkubering ved 30°C ble 10000 transformanter renset: Aspergillus niger-transformantene ble overført med robot (FlexysJkoloni-plukkeautomat) fra transformasjonsplatene til 96 brønners MTP Master-platers (MPs) inneholdende 150 \ il pr. brønn av stivnet selektivt medium (SM) (pr. lOOOml: 0,52 g KC1, 1,52 g K2HP04, 0,52 g MgS04, 20g glukose, lg acetamid, 0,1M MES-buffer, 15g agar, lml sporelementløsning [sporelementløsning (inneholdende pr. 1 liter): 2,2g ZnS04/7H20, l,lg H3B03, 0,5gFeS04/7H20, 0,17g CoCl2/6H20, 0,16g CuSO4/5H20, 0,15g Na-Mo04/2H20, 5, Og EDTA, pH 6,5] pH 5,5. Transformantene ble dyrket på SM i 5 dager ved 34°C. Det således genererte sett av MPs ble anvendt til 1) å inokulere MTPs med hensyn til vekst og påfølgende enzympåvisning og 2) sikkerhetsplater (BPs) av cDNA-samlingen som ble lagret ved -80°C.

Eksempel 4: Analyse av T. emersonii - ekspresjonssamlingen

5 dager gamle dyrkede MPs ble anvendt som reproduksjonstemplat og på nytt utsådd i friskt selektivt medium (SM) inneholdende pr. liter: 0,52 g KC1, 1,52 g K2HP04, 0,52 g MgS04, 20g glukose, 1 g acetamid, 0,1M MES-buffer, 15g agar, lml sporelementløsning [sporelementløsning (pr. 1 liter) : 2,2g ZnS04/7H20, l,lg H3B03, 0, 5gFeS04/7H20, 0,17g CoCl2/6H20, 0,16g CuS04/5H20, 0,15g NaMo04/2H20, 5, Og EDTA, pH 6,5] pH 5,5.

Straks de var inokulert ble platene inkubert ved 34°C i 48h. Deretter ble platene fylt opp med en toppagar inneholdende karboksymetylcellulose (CMC) (5g agarose, 0,5g CMC (Sigma ref C4888) fremstilt i lOOOml 50 rtiM fosfatbuffer pH 7). Straks toppagaren var stivnet, fikk platene stå ved 65°C i 4 timer. For synliggjøring av aktiviteten ble platene farvet med en Kongorødt-løsning (10 g Kongorødt i lOOOml fosfatbuffer pH7) i 15 minutter. Den farvende løsning ble helt vekk, og platene ble vasket med IM NaCl (58,44g i 1 liter destillert vann). Dette senere trinn ble gjentatt to ganger. Positive kloner viste seg ved å danne en lys klar lysrand på en rød bakgrunn.

De positive cellulasekloner fra denne første avskjerming (visende en klar lysrand etter Kongorødt-avskjerming) ble inokulert på nytt på friskt SM-medium og dyrket 5 dager ved 34°C. Den således oppnådde templatplate ble deretter gjentatt på selektivt medium og på selektivt medium inneholdende 0,075% (w/v) AZCL-cellulose (Megazyme catalogue ref. I-AZCEL). SM-platene ble behandlet og bedømt som beskrevet tidligere (vekst ved 34°C og påfølgende avskjerming via cellulose-inneholdende overtrekk og Kongorødt-farving) mens SM-AZCEL-celluloseplatene ble inkubert ved 34°C i 48 h og deretter videre inkubert ved 65°C i 8 h. SM-AZCL-celluloseplatene ble bedømt før og etter den høye temperaturinku-bering. De positive cellulasekloner resulterte i en diffus blå lysring.

Til slutt ble 20 positive cellulasekloner identifisert. Cellulaseproduserende Aspergillus- transformanter, identifisert i xylanaseplateundersøkelsen, ble dyrket i ryste- kolbefermentering. Medieprøver ble tatt etter 5 dagers fer-mentering og analysert med hensyn til cellulaseaktivitet som beskrevet senere.

Eksempel 5: Genetisk analyse av positive transformanter

Positive (bekreftet på nytt) identifiserte transformanter ble dyrket på flytende medium, myceliet ble høstet, og totalt (kromosomalt) DNA ble isolert ved å anvende Puregenes isolerende system (Biozym B.V.) for DNA-isolering fra fila-mentøs fungi. DNA-isolering og rensing ble utført i henhold til produsentens protokoll, men noe modifisert: proteinut-fellingstrinnene 3 og 4 ble gjentatt.

Kromosomisk DNA ble anvendt som et templat i en PCR-reak-sjon ved å anvende primerne 12207 (SEQ ID nr. 8) og 11937 (SEQ ID nr. 7) for å amplifisere innføyningen(e) som var nærværende i ekspresjonskassetten integrert i det kromoso-miske DNA.

Direkte PCRs på transformanter ble utført i henhold til en tilpasset versjon av en kjent protokoll<4>hvor myceliet som av oppnådd, deretter ble behandlet med GlukanexJ (Novo Nor-disk) ved 5 mg/ml konsentrasjoner istedenfor NOVOzyme.

PCR-reaksjonene inneholdt eLONGase™ B-buffer (Life Techno-logies, Breda, Nederland), dNTPs (200 uM av hver), 1 yl eLONGase™ Enzym Mix, 1-5 yl templat og 10-30 |iinol av hver oligo, i et sluttvolum på 50 yl. Den optimale mengde av oligos ble bestemt eksperimentelt for hver innkjøpt batch. Gjennomsnittlig ble 10 til 30 pmol anvendt. Reaksjonene ble utført med følgende cyklusbetingelser: lx (2 min )94°C, 35x (1 min 94°C, 1 min 55°C, 6 min 72°C), lx (7 min 72°C). Prø-vene ble overført til agarosegel for analyser av PCR-produkter.

Det således oppnådde PCR-produkt ble underklonet i E. coli pcr2.1 klonende vektor (Invitrogen, i henhold til produsentens instruksjoner), hvilket resulterte i plasmid-pGBCEA-1.

Det underklonede PCR-produkt ble sekvensert. Den resulterende nukleotidsekvens av den kodende region er avbildet i SEQ ID nr. 1 og den deduserte aminosyrerekvens av proteinet i SEQ ID nr. 2. Dette protein er blitt kalt CEA.

Eksempel 6: Viskometrisk avskjerming av en cDNA- ekspre-sjonssamling ved å anvende Hamiltons Viscorobot.

Viskometriske målinger

Kapillære viskometere er den vanligst anvendte type av viskometer anvendt for målinger av viskøse væsker. Generelt fås væsken av interesse til å flyte gjennom et kapillarrør under en kjent trykkforskjell. Deretter måles flythastig-heten, vanligvis ved å notere tiden det tar for et gitt volum av væske til å passere et gradinndelingsmerke. Andre typer av kapillare viskometere tvinger væsken gjennom et kapillar ved en forhåndsbestemt flythastighet, og trykkfallet som derved oppstår gjennom kapillaret måles for å bestemme væskenes viskositet. Regulert enzymatisk nedbrytning av polymere viskøse løsninger kan anvendes til å bestemme enzymaktiviteten. Å tilveiebringe det numeriske forhold mellom viskositeten og konsentrasjonen av væsken er kjent, kinetiske parametere så som Michaelis-Mentens konstant kan fastslås.

I. Påvisningssystemet

( a) Oppbygningen av Hamiltons Viscorobot

Hamiltons pipetterende robot (Hamilton Workstation Mikrolab 2200, Hamilton Company, Reno, USA) ble regulert av et pro-gramvareprogram kalt Eclipse (Hamilton Company). Denne programvare gjør brukeren i stand til å rette probearmen mot en viss posisjon innenfor Hamilton-arbeidsrommet. Et standardisert "visco-assay Eclipse"-program ble utviklet. Dette program arbeider på på 96-brønners MTPs, hvor hver brønn kan adresseres individuelt. Nålene anvendes til å suge av eller avgi i en Eclipse-spesifisert stilling gjennom nålåp-ningen. Hastigheten for både oppsugingen og avgivelsen (i sec/ml) samt volumene for oppsugingen og avgivelsen (i yl) ble specifisert etter behag. Ved å implementere stativdefi-nisjoner, har man tilgang til multiple reagensbeholdere på en effektiv og tidsbesparende måte. Overføring av prøvevæs-ke fra et pipetteringstrinn til det neste ble unngått ved å instruere Eclipse til å rense røropplegget med systemets væske. Innsugningshastigheten på 10 sec/ml (noen ganger 15 sec/ml) var passende til å atskille de fleste viskositeter ved å se på toppenes høyder. Vanligvis ble 200 - 250yl prø-vevæske innsugd og avgitt.

( b) Oppbygning av Hamilton

Innsugning av prøvevæske produserer et trykkfall gjennom hele det vannfylte røropplegg. Størrelsen av trykkfallet avhenger av både innsugninghastigheten (eller stempelbe-vegelsen) og av viskositeten i prøvevæsken. Det største trykkfall oppstaår i nålespissen, siden radiusen er minst (omkring 0,3 mm). Innsugning av prøvevæsken forårsaker trykkforandringer, som overføres fra T- knutepunktet til trykktransduseren. Transduseren (Depex B.V., de Bilt, Nederland) omformer størrelsen av undertrykket til en elektrisk strøm. Den elektriske strøm avleses av Datataker'en en gang pr. sekund, og lagres deretter i Datataker'ens hukommelse i digitalt format. En datamaskin som er forbundet med Datataker'en muliggjør (via Delogger-programvare) å laste ned Datataker'ens hukommelse i datafiler. De kan i sin tur leses og analyseres ved hjelp av vanlige regnearkprogrammer (så som Microsoft Excel). Siden trykket ble målt med tiden, kan det endelige resultat synliggjøres ved å fremstille grafisk størrelsen av undertrykket (i mV) mot tiden (i se-kunder) . Etter forskyvning av T-knutepunktet til en posi sjon rett bak nålen, er trykksignalet mindre avhengig av innsugningsvolumet.

c) Fremstilling av kalibreringskurver gjorde det mulig å bestemme viskositeten i enhver væske

I henhold til Poisseuilles lov bør det målte trykkfall være direkte proporsjonalt med viskositeten, siden

Med denne formel er det mulig å relatere undertrykksutdataene i milli-Volt med den ukjente viskositet av prøve-væsken. Dette ble gjort ved å suge inn et definert konstant volum av kalibreringsvæsken (vanligvis glyserol, siden den dekker et stort område av viskositeter og oppfører seg på Newtonsk manér) ved forskjellige konsentrasjoner. Det således fremkalte undertrykk relaterer til mV-utdataene med en ukjent faktor F. Siden de absolutte viskositeter av forskjellige glyserolkonsentrasjoner er kjent, gir en grafisk fremstilling av mV-undertrykksutdataene for forskjellige kjente glyserolkonsentrasjoner mot de kjente absolute viskositeter av de samme glyserolkonsentrasjoner en rett linje gjennom origo (siden P = (mV)<*>F=n/k).

( d) Ekliptisk program anvendt for avskjerming i full skala

En enkelt målesyklus består av innsugning av 250ul prøve og supernatantsubstratblanding ved en innsugningshastighet av 10 sec/ml. Før innsugningen av prøvevæske ble 40ul luft innsugd for å separere systemet fra prøvevæsken. Straks innsugningen av prøvevæske var fullstendig, ble den etterfulgt av dispensjon av 290ul prøve og luft. Denne målesyklus ble gjentatt seks ganger og etterfulgt av et 5ml vasketrinn for å rense røropplegget.

II. Utvikling av analysen

( e) Fastsettelse av den optimale substratblanding av pektin og xylan for avskjerming

Å anvende mer enn ett viskøst substrat ad gangen hadde flere fordeler. Man kan avskjerme med hensyn til forskjellige typer av enzymer på samme tid. Dette sparte en stor mengde anstrengelse og tid og krevde mindre substrat. I tillegg til "oat spelt" xylan ble det bestemt å anvende pektin som det andre substrat. En l:l-løsning av 1% pektin og 7% "oat spelt" xylan syntes å være mest passende for avskjerming. Siden det proporsjonalt var få positive kloner i samlingen, hadde de fleste topper en tilnærmet høyde på 4 35 mV. Vedrø-rende en positiv xylanaseprøve ble alt eller det meste av xylanet nedbrutt slik at bare 0,5% pektin var igjen. Følge-lig produserte en positiv xylanaseklon en topphøyde på 280mV. Vedrørende en pektinnedbrytende klon ble topphøyden 220mV.

( f) Bestemmelse av den minimale xylanaseaktivitet som er nødvendig å påvises med Hamilton- Viscoroboten

Avskjermingen ble utført med meget små volumer av både substrat og supernatant, siden en enkelt MTP-brønn inneholder maksimalt 360ul. Dessuten jo mer supernatant som ble tilsatt, jo mer ble substratet fortynnet, og jo mer reduse-res den opprinnelige viskositet. 250ul 6% "oat spelt" xylan ble avsatt i brønnene i en MTP. Fortynning av en serie av en referensexylanase ( A. tubigensis- xylana. se med en aktivitet på 685400 EXU/g, hvor 1 EXU =4,53 mol reduserende sukker/min/g) ble fremstilt, og 30ul av hver fortynning ble tilsatt til substratet. Etter inkubering i 24 timer ved 50°C ble viskositeten for hver prøve målt. Den laveste på-viselige enzymkonsentrasjon tilsvarer 53,6ng/ml eller 0,0367 EXU/ml. Følgelig vil tilsetning av 20ul supernatant til 300ul substrate gjøre det mulig å påvise ekstremt lave enzymaktiviteter.

( g) Oppsettingen av avskjermingen for identifisering av termostabile enzymer

For å velge ut bare termostabile enzymer fra samlingen og for å unngå innblanding av vert-A. niger-enzymers aktivitet, ble platene med klonene inneholdende de termostabile kandidatenzymer utsatt for varmebehandling. Systemet ble validert ved å anvende tomme vertsstammer, vertsstammer som uttrykker termolabile enzymer og vertsstammer som uttrykker termostabile enzymer. Etter vekst av stammene og fremstilling av enzym ble MTP-platene oppvarmet ved 72°C i 30 minutter. Deretter ble 20ul supernatant tilsatt til 300ul 6% "oat spelt" xylan. Sammen med negative kontroller (tilsetning av 20ul vann) ble platene inneholdende prøvene for-seglet med klebrig tape og inkubert ved 60°C i ovnen. Den høye temperatur kan øke ethvert termostabilt enzyms aktivitet, men ødelegge både den interfererende aktivitet fra bakgrunnsvertens enzym, A. niger, og de ikke-termostabile enzymaktiviteter uttrykt av samlingen. Etter 20 timer med inkubering ble ingen nevneverdig minskning i toppenes høyde funnet for de termolabile xylanasekloner, hvilket indikerer at vertens xylanaseaktivitet er blitt grundig inaktivert. Dessuten ble kloner av det termolabile xylanaseenzym xynB fra Aspergillus niger medtatt som kontroll. I dette tilfelle kunne ingen restaktivitet påvises, mens på den annen side den varmeresistente xylanase som ble medtatt som kontroll, fremdeles var aktiv. Varmeinaktivering i 30 minutter ved 72°C og prøveinkuberingstider på 24 timer eller mindre gjorde oss i stand til spesifikt å påvise termostabile T emersonii-xylanaser.

III. Avskjerming av cDNA-ekspresjonssamlingen ved å anvende Hamilton Viscoroboten

( h) Reproduksjon av cDNA- ekspresjonssamlingen og ekspresjon av samlingen

En reproduksjonssyklus innebærer dobbelt inokulering av både selektivt medium (SM) (inneholdende pr. liter: 0,52g KC1, l,52g K2HP04, 0, 52g MgS04, 20g glukose, lg acetamid, 0,1M MES-buffer, 15g agar, lml av sporelementløsning [spor-elementløsning (pr. liter): 2,2g ZnS04/7H20, l,lg H3BO3, 0,5gFeSO4/7H20, 0,17g CoCl2/6H20, 0,16g CuS04/5H20, 0,15g NaMo04/2H20, 5, Og EDTA, pH 6,5] pH 5,5) og flytende vekstmedium (GM) (inneholdende pr. liter, 70g glukose, 25g ka-seinhydrolysat, 12,5g gjærekstrakt, lg KH2P04, 0,5g K2S04, 2g MgS04, 0, 03g ZnCl2, 0,02g CaCl2, 0,01g MnS04, 0,3g FeS04, pH 5,6). Samlingen ble lagret i standard MTPs, hvor spor-dannende rekombinante A. niger-kolonier vokste i hver brønn på SM i nærvær av 10% glyserol. Under lagringen ble disse plater (master-plater, MPs) holdt i frossen tilstand (-80°C). Før reproduksjonen av MPs ble de tint i en time i et sterilisert avtrekksskap for å unngå mikrobiell konta-minering. Reproduksjon av MPs ble utført med PBA Flexys-Coloni Replicator. 5 dager gamle dyrkede master-plater ble anvendt som reproduksjonstemplat og eksakte kopier ble ut-ført i 96 bronners MTPs fylt med flytende vekstmedium (GM). De ny-inokulerte SM-agarplater ble plassert i en inkubator ved 32°C og deretter lagret ved -80°C etter addisjon av 150ul 10% glyserol pr. brønn. GM-produksjonsplatene ble inkubert i en vann-mettet Tomtec Quadrastor Shaker 96000 (32°C). Platene viste voksende mycelium etter 2-3 dager. GM-platene ble inkubert i 6 dager.

( i) Prøvetaking av supernatantene etter at veksten er fullstendig

Etter 6 dagers vekst ble det gjenværende flytende GM-vekstmedium (inneholdende ekstracellulære ekspresjons produkter) ekstrahert og overført til friskt MTPs. Supernatantene ble overført til friskt MTPs ved å anvende en 4-kanalers Tecan pipetteringsrobot. Det gjennomsnittlige volum av utvunnet supernatant var mellom 120 og 140U.1. Disse supernatantplater ble frosset og ble deretter analysert med hensyn til xylanaseaktivitet.

( j) Fremstillinger for avskjerming i full skala

Supernatantplatene fra ekspresjonssamlingen ble tint og an-bragt i et lukket vannbad ved 72°C i 35-40 minutter. Ved å anvende en 12-kanalers pipette og kommersielle forhånds-fremstilte pipettespisser i benyttbare MTP-stativer (levert av Eppendorf) ble 20ul av hver supernatant overført til substratblandingen inneholdende MTP som var blitt oppvarmet til 60°C før tilsetning av supernatantene. Substratblandingen bestod av en l:l-blanding av 1% pektin (se (k) nedenfor) og 7% "oat spelt" xylan (se (1) nedenfor), med en slutt-pH på 4,12. Undersøkelsens MTPs ble fylt med 310ml substrate/brønn. Blanding av supernatanter med substratblandingen ble oppnådd ved å omrøre pipette-spissene i prø-vebrønnene direkte etter avgivelsen av supernatantene. Deretter ble platene plassert i en 60°C ovn i en inkube-ringsperiode på 18-24 timer. Etter inkuberingen, fikk MTP-platene avkjøles og ble avskjermet med hensyn til en viskositetsminskning ved å anvende Hamilton viscoroboten (Hamilton Company, Reno, USA).

( k) Fremstilling av 1 % pektin, pH 4, 1

En sitronsyre-fosfatbuffer (Mc Ilvaine-buffer) ble fremstilt ved å tilsette 0,2M Na2HP04-løsning til 250ml 0,1M sitronsyreløsning inntil en pH på 5,5 var oppnådd. Dette ble fylt opp til en liter med destillert vann, og pH ble justert på nytt, hvis nødvendig. En 0,5% pektinløsning ble fremstilt ved langsomt å tilsette 0,5g høyt metylert pektin (type Ruban Brun) til en kolbe inneholdende 50ml av den ovenfor nevnte Mcllvaine-buffer og 25ml destillert vann ved 60°C. Kraftig omrøring sikret at pektinet ble ordentlig oppløst. Dette ble fylt opp til lOOml, og pH undersøkt igjen. Pektinet som ble anvendt her, senket pH-verdien i løsningen slik at under disse betingelser hadde løsningen en pH-verdi på 5,1. Hvis pektinløsningen var grumset, var det nyttig å sentrifugere løsningen ved 15g i 15 minutter for å fjerne alle uoppløste partikler.

( 1) Fremstilling av 7% alkalisk behandlet " oat spelt" xylan, pH 4, 1

20ml 2M NaOH ble oppvarmet opp til 60°C i et 150ml beger-glass. I et separat begerplass ble 7g av "oat spelt" xylan (fra Sigma company) tilsatt til 20ml vann, slik at en klar brun, deigaktig masse ble dannet. Hvis nødvendig ble mer vann tilsatt, men ikke mer enn 30 ml sammenlagt. Ved å anvende en stålskje ble denne vann-"oatspelt" xylanmasse langsomt tilsatt til den hete NaOH-løsning. En kraftig om-røringsanordning var nødvendig for å oppløse xylanet i hy-droksidløsningen, hvorved temperaturen ble holdt ved kons-tante 60°C. Straks alt xylan var oppløst, ble løsningen mørkebrun og lignet en meget viskøs, klar sirup. Deretter ble resten av vannet tilsatt slik at en total mengde på 50ml var blitt tilsatt. Løsningen fikk avkjøles, og 4N HC1 ble tilsatt inntil den ønskede pH var oppnådd (vanligvis pH 4,1-4,2). Løsningen ble fylt opp til lOOml, og pH-verdien ble justert på nytt, hvis nødvendig. Sentrifugering ved 20000g i 15 minutter ved 10°C gav en klar gulaktig supernatant (hvis viskositet avhang av den initielle mengde av "oat spelt" xylan som var tilsatt).

( m) Avskjermingen av samlingen

Resultatet av avskjermingen av Talaromyces emersonii-samlingen klonet i A. niger var 119 grafiske fremstillinger i overensstemmelse med de 119 MTPs som ble testet. Hver grafisk fremstilling viste viskositeten av de 96 brønner representert som 96 topper som måler undertrykket pr. brønn i mV. De grafiske fremstillinger ble analysert med hensyn til lave topper som indikerte redusert viskositet. Topper som er lavere enn den gjennomsnittlige topphøyde ble valgt for å testes på nytt. Noen plater gav meget liten variasjon, slik at valg av formentlige positive kloner for testing på nytt var lett. Andre plater viste stor variasjon, derfor ble ofte mer enn 5 eller 6 formentlige kloner valgt for testing på nytt. For å ha en positiv kontroll ble etter inkuberingen 10ul av en endoxylanase tilsatt til en tilfeldig plate ved en fast posisjon. Fra disse positive kontroller ble det funnet at hvis der er xylanaseaktivitet, vil vi kunne forvente en topphøyde mellom 240 og 280mV.

Platene fra Talaromyces-samlingen som ble testet, inneholdt også fem bekreftede termostabile xylanasekloner som var funnet før ved å anvende en farvepåvisningsanalyse basert på oppløseligheten av farver som var bundet til det uløse-lige polymere substrat. Uten unntagelse ble disse fem kloner uavhengig funnet med den viskometriske analyse allerede i den primære avskjermingsrunde. Alle topper for de kjente kloner var på et nivå som var meget lavere enn resten av toppene (ved 250mV). Totalt ble 118 kulturbrønner valgt for testing på nytt, utelukkende disse med tidligere påviste xylanasekloner .

( n) Testing på nytt av 118 formentlige kloner

Testingen på nytt var basert på den viskometriske analyse i henhold til prinsippet anvendt med avskjermingen i full skala. Denne gang ble imidlertid et større analysevolum anvendt, siden en klarere distinksjon mellom termostabil enzymaktivitet og uregelmessige lave topper kunne gjøres. To store MTPs (2ml/brønn) ble fylt med l,2ml 9% "oat spelt" xylan. Til de første to brønner i hver rad ble 50ul vann tilsatt (negativ kontroll). Til den siste brønn i hver rad ble 50ul av en referenseendoxylanaseløsning tilsatt for også å ha en positiv kontroll. Brønnene 3 til 11 i hver rad ble anvendt for å teste på nytt putative xylanase kloner

(tilsetning av 50ul supernatant). Etter blanding og inkubering i 24 timer ved 60°C ble viskositetene målt med et spesifikt tilpasset Eclipse-program (innsugningsvolum: 800ul, innsugningshatighet: 10sec/ml).

Flere positive kloner ble identifisert siden deres topper var nøyaktig på den samme nivå som de positive kontroller, hvilket indikerte fullstendig nedbrytning av xylan. Til-sammen ble tretten formentlige stammer identifisert i den gjentatte viscoscreen-test. CDNA-innføyningene ble direkte klonet i pCR2,1-vektoren via PCR-amplifikasjon utført på kromosomisk DNA. Fra 12 stammer fra samlingen ble seksten cDNA-innføyninger oppnådd, ved å anvende pwo-polymerase og primersett 2 (11937/12207, SEQ II) nr. 7 og 8). Oriente-ringen av cDNA'-innføyningen i pCR2,1-vektoren ble bestemt ved hjelp av Xhol-digestion, som var lokalisert i vektoren og ved 3' av eDNA'et. DNA-sekvensanalyse ble utført på 5'-enden av cDNA'-innføyningene.

Testingen på nytt for mulige pektinnedbrytende enzymer ble utført på lignende måte som for xylanasen, unntatt at 1 % pektin ble anvendt istedenfor 9% "oat spelt" xylan. Bare ti mulige kloner ble testet på nytt, og dette var de som gav svært lave topper i den primære avskjermingsrunde, men ikke viste noen aktivitet undet xylanasetestingen på nytt. Re-produserbart gav en klon et pektin-nedbrytende enzym. Den målte trykkverdi på 200mV tilsvarer viskositeten av rent vann. Siden det anvendte pektin ikke var fullt metylert, kan det ha blitt nedbrutt av en termostabil polygalaktu-ronase, pektatlyase eller pektinlyase.

( o) Fordeler av " Viskoscreen"

Utviklingen av en viskometrisk avskjermingsmetode for å identifisere termostabile enzymer ble underlettet av tre nøkkelfaktorer. For det første gjorde muligheten for termo-inaktivering av naturlig hostxylanaseaktivitet det mulig å oppnå en meget hurtigere utvikling av passende reaksjons- betingelser. For det andre, det faktum at når kloner med kjente termolabile enzymer ble testet, ødela termoinaktive-ringen all aktivitet slik at bare de mer termostabile enzymer ble plukket opp. For det tredje øket de forhøyde temperaturer de enzymatiske aktiviteter slik at avskjermingen ble enda mer sensitiv. På "oat spelt" xylan (Sigma) ble el-leve kloner identifisert som var i stand til å redusere viskositeten signifikant, og på pektin ble en utvetydig pektinnedbrytende klon identifisert. I tillegg ble fem termostabile xylanasekloner som var tidligere identifisert, uavhengig oppdaget på nytt.

Eksempel 7: Karakterisering av første termostabile Talaromyces emersonii / p- glucanase ( CEA) fra A . niger- transformant Aktivitetsundersøkelser og definisjoner

Definisjon av cellulase- PAHBAH- enhet ( CPU)

En enhet cellulaseaktivitet er definert som mengden av enzym som er nødvendig for å frigi en umol reduserende sukker produsert pr. minutt ved pH 5,0 og 60°C ved en substrat-konsentrasjon av 5% karboksymetylcellulose (CMC), ved å anvende en kalibreringkurve av glukose.

Enzymaktivitet i henhold til CPU-metoden ble målt ved å påvise reduserende sukker ved å anvende 4-hydroksybenzo-syrehydrazid (PAHBAH). Undersøkelsen er basert på Lever, M., Powell, J.C., Killip, M., Small, C.W. (1973) J. Lab. Clin. Med. 82, 649-655 med noen modifikasjoner. Modifika-sjonen er til PAHBAH-reagenset som følger : 0,05 M tri-natriumcitrat, 0,1 M Na2S03, 0, 02M CaCl2, 0,5M NaOH og 0,1M p-hydroksybenzosyrehydrazide (PAHBAH). Endelig pH var 12. Reagenset inneholdende PAHBAH i alkalisk løsning, lagret ved romtemperatur, bør anvendes i løpet av én dag. Glukose ble anvendt som referense for reduserende sukker (kalibre-ringskurve). For kalibreringskurven i denne undersøkelse var de endelige konsentrasjoner av glukose mellom 0-300 rtiM. CPU-aktiviteten ble undersøkt ved å blande 100 yl enzym-løsning med 400 yl 5% CMC i 0,1 M natriumacetatbuffer (pH 5,0). Eppendorf-kopper med substratet (CMC) ble inkubert på forhånd i 5 minutter ved 60°C. Reaksjonen ble startet ved å tilsette enzymløsningem. Etter 15 minutter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 1,0 ml PAHBAH-reagens. Eppendorf-koppene ble oppvarmet i 5 minutter ved 100°C og deretter avkjølt på is. Prøvene ble sentrifugert ved passende hastighet til å setrifugere ned ethvert fast material (1 minutt ved full hastighet i en Beckman Microfuge E). Ab-sorpsjoenen ble målt ved 420 nm. En blindprøve ble fremstilt ved tilsetning av 100 yl 0,1M natriumacetatbuffer istedenfor enzymløsning.

Definisjon på beta- glukanaseenhet ( BGU)

Beta-glukanaseenhet er aktiviteten som kreves for å frigi 0,258 ymol reduserende sukker (målt som glukoseekvivalen-ter) pr. minutt ved pH 3,5 og 40°C, ved en substratkon-sentrasjon på 0,5% |$-glukan fra bygg.

Så i tillegg til ovennevnte bestemmelse av cellulaseaktivitet (CPU) ble en mer spesifikk undersøkelse utført for å påvise p-glukanaseaktivitet. Prinsippet for undersøkelsen er hastigheten ved hvilken viskositeten avtar i en løsning av bygg-p-glukan, medium viskositet (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) etter tilsetning av en viss mengde enzym. Bygg-^-glukan, medium viskositet (Megazyme Australia), ble oppløst i 0,425M natriumcitratbuffer pH 3,5 til en konsentrasjon av 6,25mg/ml. Substratet ble inkubert ved 40°C i 10 minutter. Deretter ble en liten mengde enzym (i området 0,005-0,062 enheter/ml) tilsatt, og reaksjonen fikk skride frem. Ved 60 minutters reaksjonstid ble viskositeten av prøven bestemt i forhold til en referenseprøve som ble inkubert med en standardisert endo-glukanase med kjent enzymatisk aktivitet. Absolutte aktiviteter for standarden ble bestemt ved en reduserende sukkermetode ved å anvende Fe-III-hekscyanid og 4,76 mg/ml bygg-p-glukan som initiell substratkonsentra-s jon.

De finis j on av endo- xylanaseenhet ( EXU)

Enheten for xylanaseaktivitet (EXU) er definert som mengden av enzym (endol-endo-1,4-[$-xylanase fra Asp. niger, som beskrevet i EP-A-0,463,706 (Gist-brocades B.V.)) som frigir 4,53umol reduserende sukker (målt som xyloseekvivalenter) pr. minutt under analysebetingelser. Undersøkelsesbetingel-sene omfatter: 5mg/ml arabinoxylan fra hvetemel (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) i lOOmM natriumcitratbuffer (pH 3,5), temperatur 40°C, at en reaksjonstid på 60 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av IM NaOH. Påvisningen ble gjort kolorimetrisk ved 420nm etter å ha inkubert med Fe-III-heksacyanid i 15 minutter i kokende vann. Heksacyanoferratreagenset ble la-get ved å oppløse l,17g KFe(CN) og 19,5g vannfritt natrium-karbonat i 1 liter vann.

I tillegg til ovennevnte absolutte bestemmelse av xylanaseaktivitet ble en relativ metode anvendt som fulgte minskningen i viskositet i en løsning av hvete-arabinoxylan (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) etter tilsetning av en viss mengde enzym. Hvete-arabinoxylan ble oppløst i 0,425M natriumcitratbuffer (pH 3,5) til en konsentrasjon av 8,3mg/ml. Substratet ble inkubert ved 55°C i 10 minutter. Deretter ble en liten mengde enzym (i området 0,01-0,05 enheter/ml) tilsatt, og reaksjonen fikk skride fremover. Etter 60 minutter reaksjonstid ble viskositeten i prøven bestemt i forhold til en referanse som ble inkubert med en Aspergillus niger- endo-xylanasestandard med kjent EXU-aktivitet (EP-A-0,463,706). Absolutte aktiviteter i EXU for standarden ble bestemt ved reduserende sukkermetode ved å anvende Fe-III-heksacyanid som beskrevet ovenfor. Viskositet ble bestemt manuelt ved å anvende et Haakes fallende ballviskositetsapparat.

De finis j on av cellulaseenhett ( CXU)

Enheten for beta-glukanaseaktivitet (BGU) er definert som mengden av cellulase som hydrolyser i en time et antall glycosidiske bindinger ekvivalent med fremstillingen av 0,5 mg glukose under analysebetingelsene. Undersøkelsens betingelser omfatter: 9mg/ml karboksymetylcellulose i 5mM natriumacetatbuffer (pH=4,6), temperatur 37°C. Frigitt gluxose ble bestemt ved hjelp av den reduserende sukkermetode ved å anvende DNS-reagenset.

I tillegg til ovennevnte absolutte bestemmelse av cellulaseaktivitet ble en relativ metode anvendt som fulgte minskningen i viskositet i en løsning av karboksymetylcellulose etter tilsetning av en viss mengde enzym. Karboksymetylcellulose ble oppløst i 5mM natriumcitratbuffer (pH=4,6) til en konsentrasjon som avhenger av viskositeten i porsjonen. Substratet ble inkubert ved 37°C i 10 minutter. Deretter ble en liten mengde enzym tilsatt, og reaksjonen fikk skride frem. Etter 60 minutters reaksjonstid ble viskositeten i prøven bestemt i forhold til en referanse som ble inkubert med en standard med kjent CXU-aktivitet.

Aktivitet med hensyn til pH

T. emersonii /?-glukanasen ble fremstilt av den/de passende A. niger-transformant(er) i rystefkasker som beskrevet i Eksempel 3 etter at vekstmyceliet var fjernet ved filtrering. Filtratet ble anvendt for dette eksperiment. Aktiviteten i filtratet ble målt ved forskjellige pH-verdier ved en fast temperatur av 60°C. Aktiviteten ble målt i henhold til CPU-metoden. Istedenfor å anvende den faste pH på pH 5,0 ble CMC-substratet fortynnet med en citratbuffer med den passende pH for å oppnå pH-verdien for målingen. Eksperimentet ble gjentatt to ganger, og resultatene er vist nedenfor i Tabell 1. Den optimale pH for enzymet ble funnet å være mellom pH 4,5 og 5,0, ved omkring pH 4,8.

Aktivitet med hensyn til temperatur

Aktiviteten av denne p-glukanase ble deretter målt ved forskjellige temperaturer. Aktivitetsmålingene ble utført i henhold til CPU-metoden ved pH 4,0. Istedenfor å inkubere ved en fast temperatur på 60°C ble inkuberingene utført ved forskjellige temperaturer. Eksperimentet ble utført to ganger, og resultatene er vist nedenfor i Tabell 2. Temperaturoptimum ble funnet til å være mellom 80°C og 85°C. Toptser ut å være ved omkring 84°C (skjønt den kan være 82°C, 83°C eller 85°C, avhengig av hvordan linjene trekkes og in-terpoleres mellom datapunktene).

Aktivitet med hensyn til andre enzymer

Dessuten ble aktiviteten ved 30-60°C målt ved å anvende BGU-metoden for p-glukanasen og sammenlignet med en kommersielt tilgjengelig T. reesei- cellfri buljong som har cellulase- og glukanaseaktivitet som referense. T. reesei- cellefri buljong bestod av en blanding av forskjellige enzymer, blant hvilke er en eller flere p-glukanaser, men hvor disse aktiviteter ikke er blittkarakterisert. For å sam-menligne aktivitetene av T. emersonii-p-glukanase ifølge oppfinnelsen og T reesei-cellulaser/glukanaser ble enzymene dosert til omkring lik aktivitet ved 40°C. Aktiviteten av TT emersonii /?-glukanase A ved 40°C ble satt til en, og således er andre aktiviteter i forhold til dette. Resultatene er vist nedenfor i Tabell 3.

Ved temperaturer over 40°C begynte T.reesei-cellulase/glukanaseaktiviteten å flate ut sammenlignet med T. emersonii/?-glukanasen. Ovenfor 40°C gikk aktivitetene i forskjellige retninger, og CEA var mer aktiv. Dessuten, mens den rela-tive aktivitet var høyere ved forhøyde temperaturer, ble ved moderate temperaturer aktiviteten opprettholdt i forhold til T. reesei-blandingen. Dette illustrerer det vide temperaturområde over hvilket p-glukanasen er aktiv.

Rensing og spesifikk aktivitet

Rensing av T. emersonii /?-glukanasen begynte fra filtratet. Omkring 25 ml cellefri buljong ble avsaltet med en PD 10-kolonne og plassert på en Q 6 ml anionutvekslende hjelpe-kolonne som ble ekvilibrert i 10 mM natriumacetatbuffer (pH 5,0). Eluering ble utført med en lineær gradient fra 10-300 mM natriumacetatbuffer (pH 5,0). (Lineær gradient A til B; gjennornstrømningsmengde: 6 ml/min; kjøretid: 54 min; bølge-lengdemonitor: 280 nm, 254 nm, 214 nm). Aktive fraksjoner ble oppsamlet ( 20 ml), konsentrert med Mikrosep-konsentra-torer (3,5 ml, 10 K) og vasket to ganger med 0,1 M natrium-fosfatbuffer (pH 5,0). Renheten i fraksjonene ble analysert ved hjelp av HPL-SEC (størrelseseksklusjonskromatografi) og

SDS-PAGE.

Målinger av spesifikk aktivitet

Den beregnede molare ekstinksjonskoeffisient for p-glukanase ved 280 nm er 81550 M<-1>.cm<1>. Proteinkonsentrasjonen av det rensede enzym ble avledet fra E280-målinger ved å anvende en spesifikk absorption av E280<lcm>=2,33 for lmg/ml. Den spesifikke aktivitet av den rensede prøve ble bestemt i BGU (substrat: bygg-beta-glukan) og var 1027 BGU/mg. Ved å anvende CPU-metoden ble den spesifikke aktivitet 628 enhet-er/mg. Siden aktiviteten i henhold til den viskosimetriske metode gav et høyt tall sammenlignet med den reduserende sukkermetode, ble det konkludert med at T. emersonii ~p~ glukanase utøver signifikant endo-glukanaseaktivitet. En typisk ekso-glukanase ville yte meget bra i en reduserende sukkeranalyse mens den yter meget dårlig i den viskosimetriske analyse.

Iso- elektrisk punkt

IEF-PAGE ble utført som følger. Utstyret var Phast-systemet (Pharmacia Biotech), IEF 3-9 PhastGel (Pharmacia Biotech). Gelene ble kjørt og farvet (Coomassie) i henhold til stan dardiserte Phast-systemmetoder. Det isoelektriske punkt ble bestemt på PhastGel IEF3-9 og viste seg å være 3,3.

Bestemmelse av molekylvekt

SDS-PAGE ble utført som følger. Utstyret var igjen Phast-systemet (Pharmacia Biotech); 12,5% homogene geler (Pharmacia Biotech); SDS-buffer-strimler (Pharmacia Biotech). Prøvebehandling: et volum (5 prøver) buffer (500mM Tris-HCI, pH 6,8, 10% SDS, 0,1% bromfenolblått) ble blandet med 4 volumer av prøve og kokt i 3 minutter. Gelene ble kjørt og farvet (Coomassie) i henhold til standardiserte Phast-systemmetoder. HPLC-størrelseseksklusjonskromatografi ble utført ved å anvende kolonne: TSK G3000SW, eat. no. 05103 (TosoHaas). Metode: eluentene var: 0,1 M natriumfosfat-buffer pH 7,0, gjennomstrømningsmengde: lml/min, kjøretid: 30 min, bølgelengdemonitor: 280 nm. Deglykosylering av enzymet: bland 5yl renset enzym (7 mg/ml) med 20 yl 0,5% SDS og 25 yl 1% p-merkaptoetanol. Denne blanding ble kokt i 4 minutter. Etter avkjøling ble 20 yl N-glykosidase F (500 U/ml) og 20 \ il 3% Triton X-100 i 1 M natriumf osf atbuf f er pH 7,0 tilsatt. Dette ble inkubert over natten, og deglykosyl-eringen ble analysert med SDS-PAGE.

Molekylvekten bestemt på SDS-PAGE gel og HP-SEC viste seg å være 43 kDa. Etter deglykosylering på SDS-PAGE ble et rett bånd sett ved 37 kDa.

Termostabilitet

T50-termostabilitet ble bestemt med T.reesei-cellulaser/- glukanaser som referanse. T50 er temperaturen ved hvilken, etter 20 minutters inkubering, 50% av aktiviteten er igjen. Tabell 4 viser forskjellene i T50-termostabilitet mellom den rensede p-glukanase fra T. emersonii og T. reesei cellulase/glukanaseblandingen anvendt tidligere i dette Eksempel (initiell aktivitet ble satt til en: enzymene ble inkubert i 20 minutter, og etter avkjøling ble aktiviteten målt ved å anvende CPU-metoden). Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger, og derfor viser Tabell 4 duplikate målinger. T50-termostabiliteten for den rensede p-glukanase ligger rundt 93,4°C og T50-termostabiliteten for T. reesei-cellulase / glukanaser rundt 64,9°C.

Eksempel 8: Aktivitetsmålinger

De to stammer fra samlingen som ble identifisert i viscoscreen i Eksempel 6, ved å anvende "oat spelt" xylan som et substrat, ble fermentert i rystekolber ved å anvende GM-mediet (de opprinnelig stammer var merket AD009,21 og ADO 11,31). I tillegg ble stammemerket AD021.B6 (CEA) medtatt som var identifisert i Eksemplene 4 og 5 for å uttrykke p-glukanaseaktivitet. Flere undersøkelser ble utført, og resultatene er vist nedenfor. Overraskende viste stammene AD009,21 og ADO 11,31 liten xylanaseaktivitet. I stedet synes det som om AD009,21 og ADO 11,31 har cellulaseaktivitet selv om klonene ble identifisert i viskoavskjermingen under anvendelse av "oat spelt" xylan. Spesielt er p-D009,21 meget aktivt på bygg p-glukan.

Påvisningsgrensene ble satt til under 10 for EXU- og BGU-analysene, og 5 for CXU-analysen.

DNA-analysen på stammene AD 009,21 og AD 011,31 (som beskrevet tidligere i Eksempel 6) viste to nye p-glukanaser, kalt CEB og CEC. Nukleotidsekvensene av de kodende regioner er SEQ ID nr. 3 og 5, og tilsvarende aminosyresekvenser er SEQ ID nr. 4 og 6, respektive.

CEB-stammen viser høy p-glukanaseaktivitet. CEA-stammen viser en relativt høy cellulaseaktivitet i sammenligning med CEB-stammen. Forholdet mellom p-glukanaseaktiviteten og cellulaseaktiviteten er forskjellig for CEA og CEB. CEC-stammen viste cellulaseaktivitet, men dens p-glukanase- eller xylanaseaktivitet var under grensene for påvisning i disse analyser. Imidlertid antyder homologistudier sterkt p-glukanaseaktivitet, og det formenes at denne kan være meget høyere ved forskjellige pH-verdier.

Å anvende mer enn ett substrat for avskjermingen er gjen-nomførlig. Overraskende viste det seg at istedenfor to substrater ad gangen kunne tre forskjellige substrater anvendes i viskoscreen. Et av substratene var en glukose-polymerurenhet, antakelig glukan eller cellulosematerial. Det ble vist at anvendelse av "oat spelt" xylan, pektin og celluloselignende material resulterte i identifisering av tre typer av enzymer, xylanaser, pektinaser og cellulaser i

en runde av avskjerming. Den viskosimetriske analyse har en annen stor fordel med hensyn til den vanlige fargepåvis-ningsanalyse. Farvepåvisningsanalysen baserer seg på farver som er kjemisk bundet til et substrat. Denne sort av substrat er kommersielt tilgjengelig for bare noen få forbindelser. Den viskosimetriske analyse kan imidlertid arbeide med enhver type av viskøst substrat, til og med naturlige som

ikke krever noen kjemisk forbehandling. Dette aspekt er av viktighet siden man kan, fra et kommersielt og industrielt synspunkt, avskjerme enzymaktiviteter på substrater hvis viskositetsminskning (dvs. fruktsafter) eller viskositets-økning (dvs. meieriprodukter) er av kommersiell betydning.

Eksempel 9: Bakeevne for Talaromyces emersonii - endoglukanase ( CEC)

Fremstilling av "tin"-brød i en standardisert bakeprosess ble utført ved å blande 3500g hvetemel (en blanding av 80% Kolibri og 20% Ibis hvetemel (Meneba, Holland) ved omkring 21°C), 77g presset (Konings) gjær, 70g salt, 25ppm askor-binsyre, lOppm fungal a-amylase Fennizyme™P2oo(DSM N.V., Bakery Ingredients, Delft, Nederland) og forskjellige mengder av endoglukanase CEC-enzymet (fra 4 forskjellige kloner , identifisert ved deres AD-nummer) og 2030ml vann (8-15°C) i en spiralmikser (Hobart) i 2 minutter (på hastighet 1) og i omkring 6 minutter (ved hastighet 2) for å sette inn

125Wh (Watt-timer) med energi. Deigtemperaturen var 28°C. Deigens bearbeidbarhet ble analysert for hånd av en kvalifisert baker.

Direkte etter blandingen ble deigen delt i 6 deler hver på 875g, avrundet og hevet i 35 minutter i et heveskap ved 34°C og 85% RH (relativ fuktighet). Mot slutten av denne periode ble deigene formet og panert og gitt en avsluttende heving på 75 minutter i et heveskap ved 38°C og 87% RH. Et-terpå ble de fullt hevede deiger stekt i en elektrisk ovn ved 210°C i 30 minutter. Etter avkjøling til romtemperatur ble volumene av brødene bestemt ved rapsfrøfortrengnings- metodem. Etter 16-24 timers lagring i lukkede polyetylen-poser ved romtemperatur ble brødets indre struktur vurdert av en kvalifisert baker. Fem stammer fra samlingen, hvilke var identifisert for å uttrykke CEC, ble fermentert i rystekolber og testet i denne baketest. Resultatene er vist i

tabellene nedenfor.

Kvaliteten på deigene var meget god. Ved den høyere dosering for endoglukanase CEC var der litt klebrighet å føle under håndteringen av deigen. Imidlertid hadde denne lille klebrighet ingen inflytelse på deigens bearbeidelsesevne. Alle deiger inneholdende endoglukanase CEC var meget smi-dige og lette å behandle.

Fra disse bakeresultater ble det konkludert at endoglukanase CEC er meget effektiv når det gjelder å forbedre brødkvaliteten, både vedrørende brødvolum og vedrørende brødets indre struktur. Til tross for brødenes store volumer var deres indre struktur likevel meget regelmessig og fin.

Eksempel 10: Sammenligning av bakeevne for Talaromyces emersonii - enzymet ( CEC) med endoxylanase fra Asp , niger

Bakeevnen for CEC ble sammenlignet i nederlandsk "tin"-brødfremstilling med en for tiden anvendt fungal endoglukanase fra Aspergillus niger. Denne A. niger-endoglukanase ble levert i ren kommersielt tilgjengelig form, dvs. Fer-mizyme HS2000.

Nøyaktig den samme prosedyre som i Eksempel 9 ble gjentatt unntatt at forskjellige mengder av enten endoglukanase CEC eller Fermizyme™ HS2oooble anvendt.

Fra resultatene er det klart at endoglukanase CEC forbedret brødvolumet i større grad enn hva som ble oppnådd ved bruk av Fermizyme™ HS2ooo- Dessuten var færre endoglukanase-enheter/kg mel nødvendig for å oppnå et visst nivå i brød-volumet når CEC ble anvendt istedenfor Fermizyme™HS2ooo•

Eksempel 11

En sammenligning av noen av de molekylære og biokjemiske egenskaper hos de tre glukaser tilveiebringes i tabellene nedenfor. CEB, CEC er alle cellulaser som utøver EC 3.2.1.4-aktivitet. Mange cellulaser kan også hydrolysere 1,4-bindinger i bygg-glukan hvilket gjør dem spesielt nyttige for visse anvendelser, så som f.eks. for å eliminere anti- nærings-faktorer i for. Siden aktiviteten ble målt via viskosi-tetsanalysen, er det sannsynlig at cellulasen utøvde endo-aktivitet. Det kan ikke utelukkes imidlertid at også 1,3-bindinger hydrolyseres. Følgelig, etter observasjonene, kan EC 3.2.1.73-, 3.2.1.39- og 3.2.1.6-aktiviteter ikke utelukkes selv om disse aktiviteter forekommer i familie 16: de karakteristiske egenskaper hos familiene 7 og 16 synes å være temmelig like.

Bare som forklaring er cellulasene (EC 3.2.1.4) vanligvis i stand til å katalysere endo-hydrolysen av 1,4-D-glukosidisk binding i cellulose. Systematisk navn på cellulasene er 1,4-(2,3;1,4)-D-glukan-4-glukanohydrolase. Endo-1,4-D-glukanase og endoglukanase D er synonymer for 1,4-(1,3;1,4)-D-glukan-4-glukanohydrolase. Cellulase kan også hydrolysere 1,4-bindinger i -D-glukaner også inneholdende 1,3 bindinger, hvilket gjør dem spesielt nyttige for visse anvendelser, så som f.eks. å eliminere antinæringsfaktorer i for. Slike enzymer som utøver endo-glukanaseaktivitet, omtales generelt som glukanaser. I tillegg kan hydrolyse av glukan oppnås ved lichenase (1,3-1,4-D-glukan-glukanohydro-lase (EC 3.2.1.73)) og endo-1,3(4)-glukanase (1,3-(1,3;1,4)-D-glukan-3(4)-glukanohydrolase (EC 3.2.1.6)).

En oversikt over cellulaseaktiviteter er vist i tabellen nedenfor.

REFERANSER

1. Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A labora-tory manual", 2<nd>Edition, Cold Spring Harbor Labora-tories, Cold Spring Harbor, New York 2. Innis et al. (1990) "PCR protokolls, a guide to me-thodes and applications" Academic Press, San Diego. 3. WO-A-99/32617 4. van Zeijl, C. et al. (1998) J. of Biotechnol. 59: 221-224 5. Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, s. 387-395

6. Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300

7. Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10

8. Henikoff and Henikoff (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919) 9. Karlin and Altschul (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787 10. Cunningham and Wells, Science, 244, 1081-1085, 1989

11. de Vos et al. (Science, 255, 306-312, 1992)

12. Smith et al. (J. Mol. Biol., 224, 899-904, 1992)

13. Wiodaver et al. (FEBS Lett., 309, 59-64, 1992)

14. Ford et al, Protein Expression and Purification, 2, 95-107, 1991 15. Goosen et al, "Transformation and Gene Manipulation in Filamentous Fungi: an overview" i: Handbook of Applied

Mycology, Vol. 4 (1992)

16. Romanos et al, Gjær 8:423-488(1992)

17. EP-A-0,449,375 18. WO-A-98/04726 19. WO-A-98/30707 20. Alenkso and Clutterbuck, Fungal Genet. Biol 21: 373-397 (1997) 21. EP-A-0,635,574 22. WO-A-98/46772 23. WO-A-91/14772

Claims (11)

1. Polypeptid, som er en p-glukanase som kan oppnås fra en fungus av genusen Talaromyces, så som fungusen Talaromyces emersonii, som har aktiviteten EC 3.2.1.4 (endoglukanaseaktivitet), karakterisert vedat det omfatter: (i) aminosyresekvensen av SEQ ID nr. 2; eller (ii) en variant av (i) som er i stand til å spalte p-D-glukan som har minst 85% identitet over hele lengden av SEQ ID nr. 2.

2. Polynukleotid, karakterisert vedat det omfatter: (a) nukleinsyresekvensen av SEQ ID nr. 1 eller en sekvens som koder et polypeptid ifølge krav 1; (b) en sekvens som er komplementær med, eller som hybridiserer til under høystringente betingelser, en sekvens som definert i (a) over hele lengden; (c) en modifisert sekvens av SEQ ID nr. 1 med opptil 100 nukleotidsubstitusjoner som koder et polypeptid som har p-glukanaseaktivitet; (d) en sekvens som har minst 75%, fortrinnsvis 80%, identitet med en sekvens som definert i (a); eller (e) en sekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske kode til enhver av sekvensene som definert i (a) .

3. Polynukleotid ifølge krav 2, hvori sekvensen koder et polypeptid som har p-glukanaseaktivitet.

4. Polynukleotid ifølge ethvert av kravene 2 til 3, som er en DNA-sekvens.

5. Vektor, karakterisert vedat den omfatter en polynukleotidsekvens ifølge ethvert av kravene 2 til 4.

6. Vektor ifølge krav 5, som er en ekspresjonsvektor, så som hvor en DNA-sekvens ifølge krav 5 er funksjonsdyktig bundet til en regulerende sekvens.

7. Vertscelle, karakterisert vedat den omfatter, som en heterolog sekvens, et polynukleotid ifølge ethvert av kravene 2 til 4 eller som uttrykker, som et heterologt protein, et polypeptid ifølge krav 1 eller som er transformert med DNA-sekvensen ifølge krav 4 eller en vektor ifølge krav 6.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid ifølge krav 1, karakterisert vedat den omfatter å dyrke en vertscelle som definert i krav 7 under betingelser som sørger for ekspresjon av polypeptidet.

9. Sammensetning, karakterisert vedat den omfatter et polypeptid ifølge krav 1.

10. Sammensetning ifølge krav 9, som ytterligere omfatter et polypeptid som har cellulase-, endo-arabinanase-, rham-nogalakturonase- eller polygalakturonaseaktivitet.

11. For (for dyr), karakterisert vedat det omfatter et polypeptid ifølge krav 1.