-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft neue (β)-Glucanasen (sowie Cellulasen) aus dem
Pilz Talaromyces, insbesondere Talaromyces emersonii, und ihre Verwendung
beim Abbau von Glucan zu Cellulose.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Die
Zusammensetzung einer Pflanzenzellwand ist komplex und variabel.
Polysaccharide findet man hauptsächlich
in Form langer Cellulose-(die Hauptstrukturkomponente der Pflanzenzellwand),
Hemicellulose-mit verschiedenen β-Xylan-Ketten,
wie Xyloglucane) und Pektin-Ketten.
-
Beta-Glucan
(oder genauer (1→3)(1→4)β-D-Glucan),
MW 10 bis 14 kDa, ist eine Komponente der Pflanzen-Hemicellulose (MW
von ungefähr
700 kDa) und besteht aus einem Gerüst von β-1,4 und 1,3-verknüpften Glucopyranose-Resten.
Eine andere Komponente ist Xylan, das aus β-1,4-verknüpften Xylose-Resten besteht,
die gegebenenfalls mit Seitenketten, wie Arabinose- und/oder Glucuronsäure-Resten,
substituiert sind.
-
Grundlegende
Unterschiede bestehen zwischen Monokotyledonen (beispielsweise Getreide
und Gräsern)
und Dikotyledonen (beispielsweise Klee, Raps und Soja) sowie zwischen
den Samen und den vegetativen Teilen der Pflanze. Monokotyledonen
sind durch die Anwesenheit eines Arabinoxylan-Komplexes als Haupt-Hemicellulose-Gerüst gekennzeichnet,
und die Hauptstruktur der Hemicellulose in den Dikotyledonen ist
ein Xyloglucan-Komplex.
In den Dikotyledonen werden höhere
Pektinkonzentrationen als in den Monokotyledonen gefunden. Samen
sind im Allgemeinen reich an Pektin-Substanzen, haben aber relativ wenig
cellulosehaltiges Material.
-
Cellulose-spaltende
Enzyme werden wegen ihrer Fähigkeit,
auf Haupt-Pflanzenzellwandsubstituenten einzuwirken, zum Verarbeiten
von Pflanzenmaterial in Lebensmittel- sowie Futtermittel-Anwendungen
oder als Lebensmittel- oder Futtermittel-Zusatzstoff verwendet.
-
Die
meisten Cellulose-spaltenden Enzyme, die für die Industrie verfügbar sind,
scheinen Glucanasen mit relativ niedrigem Molekulargewicht und einer
mäßigen Stabilität bei höheren Temperaturen
zu sein. MOLONEY A. P. et al., (Biochemical Journal, Bd. 225, Nr.
2, 1985, S 365–374)
offenbart vier Endo-Glucanasen aus T. emersonii, die eine optimale
Aktivität
bei einem pH-Wert
von 5,5 bis 5,8 und einer Temperatur von 75°C bis 80°C aufweisen.
-
Für bestimmte
Anwendungen ist jedoch die Verwendung einer Glucanase mit einer
relativ hohen Thermostabilität
wünschenswert.
Soll eine Glucanase als Tierfutteradditiv verwendet werden, dann
wird eine hohe Thermostabilität
bevorzugt, und zwar wegen der Hochtemperaturbedingungen, die beim
Pelletieren des Tierfutters angewendet werden.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Es
werden nun neue β-Glucanasen
(oder Cellulasen) bereitgestellt, welche β-D-Glucan (oder Cellulose),
wie es in Pflanzenmaterial vorkommt, spalten können.
-
Es
wird ein Polypeptid, bei dem es sich um eine β-Glucanase handelt, die aus einem Pilz
der Gattung Talaromyces, wie dem Pilz Talaromyces emersonii, erhältlich ist,
mit der Aktivität
EC 3.2.1.4 (Endo-Glucanase-Aktivität) bereitgestellt,
umfassend:
- (i) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2
oder
- (ii) eine Variante von (i), die β-D-Glucan spalten kann und mindestens
70% Identität über die
gesamte Länge
der SEQ ID NR: 2 oder mindestens 80% über einen Bereich von mindestens
150 Aminosäuren
mit der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NR: 2 hat; oder
- (iii) ein Fragment von (i) oder (ii), das β-D-Glucan spalten kann.
-
Die
Erfindung betrifft im weitesten Sinne β-Glucanasen (oder Cellulasen) aus Talaromyces,
wie Talaromyces emersonii, (ein Pilz). Diese β-Glucanasen können β-D-Glucan
oder Cellulose spalten, z. B. sind sie β-1,4-Endoglucanasen oder haben
die Aktivität
EC 3.2.1.4.
-
Die
Glucanasen können
Folgendes besitzen:
- a. einen optimalen pH-Wert
unter 7,0 oder 5,4, wie unter 5,0, z. B. von 4,4 bis 5,2 oder von
3,0 bis 6,0 oder 7,0; oder
- b. ein Temperaturoptimum von mindestens 72°C, 75°C oder sogar 81°C, wie von
78°C bis
85°C oder
von 83°C
bis 87°C.
-
Spezifischer,
stellt die vorliegende Erfindung ein (isoliertes) β-Glucanase-Polypeptid
bereit, umfassend:
- (i) die Aminosäuresequenz
der SEQ ID NR: 2 oder
- (ii) eine Variante von (i), die β-D-Glucan spalten kann; oder
- (iii) ein Fragment von (i) oder (ii), das β-D-Glucan spalten kann.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt,
umfassend:
- (a) die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 1
oder eine Sequenz, die ein Polypeptid nach einem vorhergehenden
Anspruch codiert;
- (b) eine Sequenz, die zu einer Sequenz, wie in (a) definiert, über die
gesamte Länge
komplementär
ist oder unter hochstringenten Bedingungen daran hybridisiert;
- (c) ein Fragment von einer der Sequenzen in (a) oder (b);
- (d) eine Sequenz mit mindestens 75%, vorzugsweise 80%, Identität zu einer
Sequenz, wie in (a) definiert; oder
- (e) eine Sequenz, die infolge des genetischen Codes zu einer
der Sequenzen, wie in (a) definiert, degeneriert ist.
-
Die
Erfindung stellt zudem bereit:
- – einen
(beispielsweise Expressions-)Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
umfasst und der ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren
kann;
- – eine
Zelllinie oder einen Stamm, der einen erfindungsgemäßen Vektor
umfasst;
- – ein
Verfahren zum Produzieren eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei das
Verfahren das Halten einer erfindungsgemäßen Zelllinie oder eines erfindungsgemäßen Stamms
unter Bedingungen, die zum Erzielen der Expression des Polypeptids
geeignet sind, und, wenn notwendig, Isolieren des Polypeptids umfasst
- – ein
Verfahren zum Spalten von β-D-Glucan,
wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines Materials, das β-D-Glucan
umfasst, mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid
umfasst,
- – ein
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die β-Glucanase-Aktivität moduliert,
wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines erfindungsgemäßen Polypeptids
mit einer Test-Verbindung in Anwesenheit von β-D-Glucan und Überwachen
oder Erfassen einer Modulation der Aktivität umfasst;
- – ein
Verfahren zur Behandlung eines Individuums mit Hyperlipämie, wobei
das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids
an das Individuum umfasst; und
- – die
Verwendung des Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur
Behandlung oder Vorbeugung von Hyperlipämie.
-
Kurze Beschreibung der Sequenzen
-
- SEQ ID NR: 1 ist eine DNA-Sequenz einer ersten erfindungsgemäßen β-Glucanase
(CEA) aus Talaromyces emersonii;
- SEQ ID NR: 2 ist die Aminosäuresequenz
der ersten β-Glucanase,
CEA;
- SEQ ID NR: 7 und 8 sind PCR-Primer, die an SEQ ID NR: 1 hybridisieren
(und zum Umklonieren von cDNA-Inserts
während
der genetischen Analyse positiver Transformanten eingesetzt wurden).
-
Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
-
A. Polynukleotide.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein (beispielsweise isoliertes und/oder
gereinigtes) Polynukleotid bereit, das die erfindungsgemäßen Polypeptide
codiert. Die vorliegende Erfindung liefert folglich ein Polynukleotid,
das eine β-Glucanase
codiert, deren Aminosäuresequenz
in SEQ ID NR: 2 dargelegt wird. Die vorliegende Erfindung stellt
zudem ein Polynukleotid bereit, das ein Polypeptid codiert, das
eine erhebliche Aminosäuresequenzhomologie
mit der Aminosäuresequenz
hat, die in SEQ ID NR: 2 dargelegt wird. Zudem ist ein Polynukleotid
eingeschlossen, das ausgewählt
ist aus:
- (a) einem Polynukleotid, umfassend
die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR: 1 aufgeführt ist, oder das Komplement
davon;
- (b) einem Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die
(beispielsweise selektiv) an eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID
NR: 1, aufgeführt
ist, oder ein Fragment davon hybridisieren kann;
- (c) einem Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die
(beispielsweise selektiv) an das Komplement der Nukleotidsequenz,
die in SEQ ID NR: 1, aufgeführt
ist, oder ein Fragment davon hybridisieren kann; und/oder
- (d) einem Polynukleotid, umfassend eine Polynukleotidsequenz,
die infolge des genetischen Codes zu einem Polynukleotid, wie in
(a), (b) oder (c) definiert, degeneriert ist.
-
Ein
erfindungsgemäßes Polynukleotid
schließt
auch ein Polynukleotid ein, das:
- (a) ein Polypeptid
codiert, das β-Glucanaseaktivität hat, wobei
das Polynukleotid folgendes ist:
- (1) die codierende Sequenz von SEQ ID NR: 1;
- (2) eine Sequenz, die selektiv an das Komplement der in (1)
definierten Sequenz hybridisiert; oder
- (3) eine Sequenz, die infolge des genetischen Codes in Bezug
auf eine in (1) oder (2) definierte Sequenz degeneriert ist; oder
- (b) eine Sequenz ist, die zu einem in (a) definierten Polynukleotid
komplementär
ist.
-
Hybridisierbare Sequenzen
-
Der
Begriff "zum Hybridisieren
befähigt" bedeutet, dass das
erfindungsgemäße Ziel-Polynukleotid
an die als Sonde verwendete Nukleinsäure (z. B. die in SEQ ID NR:
1 aufgeführte
Nukleotidsequenz oder ein Fragment davon oder das Komplement davon)
auf einem Niveau hybridisieren kann, das erheblich über dem Hintergrund
liegt. Die Erfindung schließt
auch Nukleotidsequenzen ein, die β-Glucanase
oder Varianten davon codieren, sowie Nukleotidsequenzen, die dazu
komplementär
sind. Die Nukleotidsequenz kann RNA oder DNA sein und schließt folglich
genomische DNA, synthetische DNA oder cDNA ein. Die Nukleotidsequenz
ist vorzugsweise eine DNA-Sequenz und am stärksten bevorzugt eine cDNA-Sequenz. Gewöhnlich umfasst
ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
eine aneinander grenzende Sequenz von Nukleotiden, die unter ausgewählten Bedingungen
an die codierende Sequenz oder das Komplement der codierenden Sequenz
von SEQ ID NR: 1, wenn gültig,
hybridisieren kann. Solche Nukleotide können nach bekannten Verfahren
des Standes der Technik synthetisiert werden1.
-
Ein
erfindungsgemäßes Polynukleotid
kann an die codierende Sequenz oder das Komplement der codierenden
Sequenz von SEQ ID NR: 1 (wenn gültig)
auf einem Niveau erheblich über
dem Hintergrund hybridisieren. Eine Hintergrundhybridisierung kann
z. B. wegen anderer cDNAs auftreten, die in einer cDNA-Bank zugegen
sind. Das Signalniveau (das z. B. durch die Wechselwirkung zwischen
einem erfindungsgemäßen Polynukleotid
und der codierenden Sequenz oder dem Komplement der codierenden
Sequenz von SEQ ID NR: 1 erzeugt wird) ist gewöhnlich mindestens 10-mal, vorzugsweise
mindestens 100-mal so intensiv wie Wechselwirkungen zwischen anderen
Polynukleotiden und der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1. Die
Intensität
der Wechselwirkung kann gemessen werden, indem man z. B. die Sonde,
z. B. mit 32P, radioaktiv markiert. Eine
selektive Hybridisierung kann gewöhnlich mit Bedingungen niedriger
Stringenz (0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei ungefähr 40°C), mittlerer
Stringenz (z. B. 0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei
ungefähr
50°C) oder
hoher Stringenz (z. B., 0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat
bei ungefähr
60°C) erzielt
werden. Die Hybridisierung kann unter allen geeigneten Bedingungen
durchgeführt
werden, die im Stand der Technik1 bekannt
sind, und als Richtlinie kann eine niedrige Stringenz 2 × SSC bei
55°C, eine mittlere
Stringenz 0,5 bis 1,0 × SSC
bei 60°C
und eine hohe Stringenz 0,1 oder 0,2 × SSC bei 60°C oder höher (z.
B. 68°C)
sein, und zwar jeweils bei 0,5% SDS.
-
Modifikationen
-
Erfindungsgemäße Polynukleotide
können
DNA oder RNA umfassen. Sie können
einzel- oder doppelsträngig
sein. Sie können
auch Polynukleotide sein, die in sich ein oder mehrere synthetische
oder modifizierte Nukleotide aufweisen. Eine Anzahl verschiedener
Typen von Modifikationen an Polynukleotiden sind im Stand der Technik
bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat- und Phosphorthioat-Gerüste und/oder
die Addition von Acridin oder Polylysin an das 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung versteht es sich, dass die hierin beschriebenen Polynukleotide
durch jedes mögliche
Verfahren modifiziert werden können,
das im Stand der Technik verfügbar
ist.
-
Es
versteht sich, dass der Fachmann unter Verwendung von Routinetechniken
Nukleotidsubstitutionen vornehmen kann, die die Polypeptidsequenz
nicht beeinflussen, die durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide codiert
wird, um die Codon-Nutzung eines bestimmten Wirtsorganismus wiederzuspiegeln,
in welchem die erfindungsgemäßen Polypeptide
z. B. exprimiert werden sollen.
-
Die
codierende Sequenz von SEQ ID NR: 1 kann durch Nukleotidsubstitutionen,
z. B. von oder bis zu 1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen,
modifiziert werden. Das Polynukleotid kann alternativ oder zusätzlich durch
eine oder mehrer Insertionen und/oder Deletionen und/oder durch
eine Extension an einem oder beiden Enden modifiziert werden. Das
modifizierte Polynukleotid codiert im Allgemeinen ein Polypeptid, das β-Glucanase-Aktivität hat. Degenerierte
Substitutionen können
vorgenommen werden, und/oder Substitutionen können vorgenommen werden, die
zu einer konservativen Aminosäuresubstitution
führen,
wenn die modifizierte Sequenz translatiert wird, wie z. B. später in Bezug
auf Polypeptide besprochen wird.
-
Homologa
-
Eine
Nukleotidsequenz, die an die (beispielsweise an das Komplement der)
DNA-codierenden) Sequenz von SEQ ID NR: 1 selektiv hybridisieren
kann, kann mindestens 50% oder 60%, mindestens 70%, mindestens 80%,
mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99%
Sequenzidentität (oder
Homologie) zu der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1 haben. Dies
kann über
einen Bereich von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, zum
Beispiel mindestens 40, mindestens 60, vorzugsweise mindestens 100
aufeinander folgenden Nukleotiden oder optimalerweise über die
gesamte Länge
von SEQ ID NR: 1 erfolgen. Für
SEQ ID NR: 1 ist die Sequenzidentität vorzugsweise mindestens 75%
oder 80%.
-
Jede
beliebige Kombination der oben erwähnten Homologiegrade und minimalen
Größen kann
verwendet werden, um erfindungsgemäße Polynukleotide zu definieren,
wobei stringentere Kombinationen (d. h. höhere Homologie über größere Längen) bevorzugt
sind. So bildet zum Beispiel ein Polynukleotid, das über 25 vorzugsweise über 30 Nukleotide
zu mindestens 80% oder 90% homolog ist, einen Aspekt der Erfindung, sowie
auch ein Polynukleotid, das über
40 Nukleotide mindestens 90% homolog ist.
-
Homologa
von Polynukleotid-(oder Protein-)-Sequenzen haben gewöhnlich mindestens 70% Homologie,
vorzugsweise mindestens 80, 90%, 95%, 97% oder 99% Homologie, z.
B. über
einen Bereich von mindestens 15, 20, 30, 100 weiteren benachbarten
Nukleotiden (oder Aminosäuren).
Die Homologie kann auf der Grundlage der Aminosäureidentität errechnet werden (manchmal
als "harte Homologie" bezeichnet).
-
Z.
B. liefert das UWGCG-Paket das BESTFIT-Programm, das dazu verwendet
werden kann, eine Homologie zu errechnen (z. B. in seinen Standard-Einstellungen5 verwendet). Die PILEUP- und BLAST-Algorithmen
können
dazu verwendet werden, Homologie zu errechnen oder Sequenzen auszurichten
(wie zum Identifizieren äquivalenter
oder entsprechender Sequenzen, z. B. in ihren Standard-Einstellungen6,7).
-
Software
für das
Durchführen
von BLAST-Analysen ist über
das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.) öffentlich
zugänglich.
Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren des High-Score-Sequenz-Paars
(HSPs) durch Identifizieren kurzer Wörter der Länge W in der Abfragesequenz,
die entweder übereinstimmen
oder einer Schwellenbewertung T mit positivem Wert entsprechen, wenn
sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz
ausgerichtet wird. T wird als Nachbarwort-Bewertungsschwelle6,7 bezeichnet. Diese anfänglichen Nachbarworttreffer
dienen als Keime zum Einleiten von Suchen zum Auffinden von HSPs,
die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang
jeder Sequenz soweit ausgedehnt, wie der kumulative Alignment-Score
erhöht
werden kann. Ausdehnungen der Worttreffer in jeder Richtung werden
angehalten, wenn: der kumulative Alignment-Score um die Menge X
von seinem erzielten Höchstwert
abfällt;
der kumulative Score wegen der Akkumulation von einer oder mehreren
negativ-zählenden
Restausrichtungen auf null oder darunter fällt oder das Ende jeder Sequenz erreicht
ist. Die BLAST-Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit
und die Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet
als Standards eine Wortlänge
(W) von 11, BLOSUM62- Scoringmatrix8-Alignments (B) von 50, eine Erwartung (E)
von 10, von M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
-
Der
BLAST-Algorithmus führt
eine statistische Analyse der Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen9 durch. Ein Maß an Ähnlichkeit,
bereitgestellt vom BLAST-Algorithmus
ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die ein Anzeichen
der Wahrscheinlichkeit liefert, durch die eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid-
oder Aminosäuresequenzen
zufällig
auftreten würde.
Z. B. gilt eine Sequenz als ähnlich
zu einer anderen Sequenz, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit
im Vergleich der ersten Sequenz zur zweiten Sequenz kleiner als
etwa 1, vorzugsweise kleiner als ungefähr 0,1, stärker bevorzugt kleiner als
ungefähr
0,01 und am stärksten
bevorzugt kleiner als ungefähr
0,001 ist.
-
Primer und Sonden
-
Die
erfindungsgemäßen Polynukleotide
umfassen und können
verwendet werden als Primer, beispielsweise PCR-Primer, Primer für eine alternative Amplifikationsreaktion,
Sonde oder die Polynukleotide können
in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente
sind mindestens oder bis zu 20, z. B. mindestens 25, 30 oder 40
Nukleotide lang. Sie sind gewöhnlich
bis 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 oder 300 Nukleotide lang, oder
sogar bis zu wenigen Nukleotiden (wie 5 oder 10 Nukleotiden) der
codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1 kurz.
-
Im
allgemeinen werden Primer durch synthetische Mittel produziert und
beinhalten eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz,
und zwar ein Nukleotid nach dem anderen. Techniken zur Bewerkstelligung
mittels automatisierter Techniken sind im Stand der Technik leicht
verfügbar.
Beispiele für
Primer der Erfindung sind in SEQ ID NR: 7 und 8 aufgeführt.
-
Längere Polynukleotide
werden im Allgemeinen mit Rekombinationsmaßnahmen z. B. mit PCR-(Polymerasekettenreaktion)Klonierungstechniken
produziert. Dieses umfasst die Herstellung eines Paars von Primern
(beispielsweise mit ungefähr
15–30
Nukleotiden) von einer Region der β-Glucanase, die man klonieren möchte, das
Zusammenbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, erhalten aus einer
Ziel-(beispielsweise
Hefe-, Bakterien-, Pflanzen-, Prokaryonten- oder Pilz-)Zelle, vorzugsweise
eines Talaromyces-Stamms, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion
unter Bedingungen, die die Amplifikation der gewünschten Region bewirken, Isolieren
des amplifizierten Fragments (beispielsweise durch Reinigen des
Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und das Gewinnen der amplifizierten
DNA. Die Primer können
so ausgelegt sein, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen
enthalten, damit die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor
kloniert werden kann.
-
Solche
Techniken können
verwendet werden, um alles oder einen Teil der hierin beschriebenen β-Glucanase
Sequenz zu erreichen. Genomische Klone, entsprechend der cDNA von
SEQ ID NR: 1, oder das β-Glucanasegen,
das z. B. Introns und die Promotorregionen enthält, sind auch innerhalb der
Erfindung und können
auch auf analoge Weise erreicht werden (beispielsweise Rekombinationsmaßnahmen,
PCR, Klonierungstechniken), ausgehend von genomischer DNA aus einer
Pilz-, Hefe-, Bakterien-, Pflanzen- oder einer. Prokaryonten-Zelle.
-
Die
Polynukleotide oder die Primer können
eine enthüllende
Markierung tragen, beispielsweise eine radioaktive oder nicht-radioaktive
Markierung. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope wie 32P oder 35S, Enzym-Markierungen
oder andere Protein-Markierungen
wie Biotin. Solche Markierungen können zu erfindungsgemäßen Polynukleotiden
oder Primern hinzugefügt
werden und können
durch an sich bekannte Techniken ermittelt werden.
-
Markierte
oder unmarkierte Polynukleotide können in Tests auf Nukleinsäure-Basis
zum Nachweisen oder Sequenzieren von β-Glucanase oder einer Variante
davon in einer (beispielsweise Pilz-)Probe verwendet werden. Solche
Nachweistests umfassen im Allgemeinen das Zusammenbringen einer
(beispielsweise Pilz-)Probe, die (mutmaßlich) DNA enthält, mit
einer erfindungsgemäßen Sonde
oder Primer unter Hybridisierungsbedingungen und Erfassen jeglichen
Doppelstrangs zwischen der Sonde und der Nukleinsäure in der Probe.
Ein solcher Nachweis kann mit Techniken erzielt werden, wie PCR
oder durch Immobilisierung der Sonde auf einem festen Träger, Entfernen
der Nukleinsäure
in der Probe, die nicht an die Sonde hybridisierte, und dann Nachweisen
der Nukleinsäure,
die an die Sonde hybridisierte. Alternativ kann die Proben-Nukleinsäure auf
einem festen Träger
immobilisiert werden, und die Menge der Sonde, die an einen solchen
Träger
gebunden wurde, kann erfasst werden.
-
Die
Sonden der Erfindung können
in Form eines Test-Kits in einem geeigneten Behälter bequem verpackt werden.
In solchen Kits kann die Sonde an eine feste Stütze gebunden sein, in der das
Testformat, für das
der Kit bestimmt ist, eine solche Bindung erfordert. Der Kit kann
auch die geeigneten Reagenzien zur Behandlung der zu untersuchenden
Probe, Hybridisierung der Sonde an die Nukleinsäure in der Probe, die Steuerungreagenzien,
die Anweisungen und dergleichen enthalten.
-
Vorzugsweise
ist das erfindungsgemäße Polynukleotid
vom gleichen Organismus wie das Polypeptid, wie einem Pilz, insbesondere
einem Pilz der Gattung Talaromyces erhältlich.
-
Die
erfindungsgemäßen Polynukleotide
umfassen auch Varianten der Sequenz von SEQ ID NR: 1, die β-Glucanase-Aktivität haben.
Varianten können
durch Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen gebildet werden
und können
ein β-D-Glucan-Polymer
spalten.
-
Produktion von Polynukleotiden
-
Polynukleotide,
die keine 100% Identität
mit SEQ ID NR: 1 haben, aber innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung
fallen, können
in einer Anzahl von Wegen erreicht werden. So können Varianten der hierin beschriebenen β-Glucanase-Sequenz
erhalten werden, zum Beispiel indem man die genomischen DNA-Banken prüft, die
von einer Reihe von Organismen gebildet werden, z. B. diejeninge,
die als Quellen der erfindungsgemäßen Polypeptide der Erfindung
erörtert
wurden. Zusätzlich
können
andere Pilz-, Pflanzen- oder Prokaryonten-Homologa von β-Glucanase erhalten werden,
und solche Homologe und Fragmente davon können im allgemeinen an SEQ
ID NR: 1, hybridisieren. Solche Sequenzen können erhalten werden, indem
man cDNA-Banken oder genomische DNA-Banken von anderen Arten prüft und solche
Banken mit Sonden prüft,
die SEQ ID NR: 1 ganz oder teilweise umfassen, und zwar unter Bedingungen
mittlerer bis hoher Stringenz (wie früher beschrieben). Nukleinsäuresonden,
die die SEQ ID NR: 1, vollständig
oder teilweise umfassen, können verwendet
werden, um cDNA-Banken anderer Arten, wie sie als Quellen für die erfindungsgemäßen Polypeptide
beschrieben wurden, zu prüfen.
-
Spezieshomologa
können
auch mittels degenerierter PCR erhalten werden, welche Primer verwendet, die
dazu ausgelegt sind, auf Sequenzen innerhalb der Varianten und der
Homologe zu zielen, die konservierte Aminosäuresequenzen codieren. Die
Primer können
eine oder mehrer degenerierte Positionen enthalten und werden bei
schwächeren
Stringenzbedingungen verwendet als diejenigen, die zum Klonieren
von Sequenzen mit einzelnen Sequenz-Primern gegen bekannte Sequenzen
verwendet werden.
-
Alternativ
können
solche Polynukleotide durch stellengerichtete Mutagenese von β-Glucanase-Sequenzen
oder Varianten davon erhalten werden. Dieses kann geeignet sein,
wo zum Beispiel stille Codon-Änderungen
an Sequenzen erforderlich sind, um Codon-Präferenzen für eine bestimmte Wirtszelle
zu optimieren, in der die Polynukleotid-Sequenzen exprimiert werden.
Andere Sequenzänderungen
können
gewünscht
sein, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzuführen, oder
die Eigenschaft oder die Funktion der Polypeptide zu ändern, die
durch die Polynukleotide codiert werden.
-
Die
Erfindung umfasst doppelsträngige
Polynukleotide, die ein Polynukleotid der Erfindung und sein Komplement
umfassen.
-
Die
vorliegende Erfindung liefert auch die Polynukleotide, welche die
unten beschriebenen Polypeptide der Erfindung codieren. Da solche
Polynukleotide als Sequenzen für
rekombinante Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide geeignet sind,
brauchen sie nicht an die Sequenz der SEQ ID NR: 1 zu hybridisieren,
obgleich dieses im Allgemeinen wünschenswert
ist. Andernfalls können
solche Polynukleotide bei Bedarf wie oben beschrieben markiert werden,
verwendet werden, und gebildet werden.
-
B. Polypeptide.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft (beispielsweise (im Wesentlichen)
gereinigte und/oder isolierte) β-Glucanasen (oder
Cellulasen) und Varianten davon. Die erfindungsgemäßen Polypeptide
können
im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NR: 2 oder einer Variante dieser Sequenz bestehen. Polypeptide
können
auch durch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
codiert werden, wie oben beschrieben worden.
-
Ein
Polypeptid der Erfindung kann in einer isolierten oder im Wesentlichen
gereinigten Form sein. Es versteht sich, dass das Polypeptid mit
Trägern
oder Verdünnungsmitteln
gemischt werden kann, die den beabsichtigten Zweck und/oder die
Funktion des Polypeptids nicht behindern und dennoch als im Wesentlichen isoliert
angesehen werden. Es umfasst im Allgemeinen das Polypeptid in einem
Präparat,
in dem mehr als 20%, beispielsweise mehr als 30%, 40%, 50%, 80%,
90%, 95% oder 99%, bezogen auf das Gewicht des Polypeptids, im Präparat ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
ist. Routineverfahren können
eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Proteine zu reinigen; und/oder
zu synthetisieren1. Für einige Formulierungen (beispielsweise
für nicht-pharmazeutische
Verwendungen) kann die Menge des vorhandenen Polypeptids klein sein,
z. B. von 0,01 bis 10%, wie von 0,1 bis 5% oder 2% oder sogar von
0,2 bis 1%.
-
Vorzugsweise
ist das Polypeptid der Erfindung aus einem Mikroorganismus erhältlich,
der ein Gen besitzt, das ein Enzym mit β-Glucanase-(oder Cellulase-)Aktivität codiert.
Vorzugsweise ist der Mikroorganismus ein Pilz, und optimal filamentöse Pilze.
Bevorzugte Organismen sind folglich von der Gattung Talaromyces,
wie der Spezies Talaromyces emersonii.
-
Aktivität
-
Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
kann eine oder mehre der folgenden Eigenschaften haben, nämlich es:
- (1) besitzt β-Glucanase-(oder
Cellulase)-Aktivität;
- (2) hat einen optimalen pH-Wert-Bereich von 3 bis 6,5 oder 7,0,
wie von 4 bis 5,5 oder 6,0, optimal von 4,5 bis 5,0;
- (3) hat optimale Aktivität
bei einer Temperatur von 30°C
bis 100°C,
wie 60 bis 95°C,
optimal von 75°C
oder 80°C
bis 90°C.
Vorzugsweise ist die optimale Temperatur mindestens 75°C, wie mindestens
85°C;
- (4) hat ein Molekulargewicht (deglykosyliert) von 20 bis 60
kDa, vorzugsweise von 20 bis 25, 35 bis 45 oder 23 bis 50 kDa, optimal
von 36 bis 40 kDa oder (glykosyliert) oder von 40 bis 45 kDa;
- (5) hat einen isoelektrischen Punkt von 3,0 bis 3,6 oder 5,0,
3,8 bis 4,5, 4,5 bis 5,0 oder von 6,0 bis 7,0; und/oder
- (6) besitzt hydrolytische Aktivität auf Getreide β-Glucan oder
weist hydrolytische Aktivität
unter pH-Wert 7 auf.
-
Das
Polypeptid kann die Aktivität
von EC 3.2.1.4 (oder Endoglucanase-Aktivität) haben. Im allgemeinen kann
dieses die Endohydrolyse von 1,4-β-D-glucosidscher
Bindungen in Cellulose sein. "β-Glucanase-Aktivität" ist die Fähigkeit,
Cellulose oder ein β-Glucan-Polymer
zu spalten (wie beispielsweise in den Pflanzen Hafer oder Gerste
gefunden). Die Aktivität
ermöglicht
folglich die Spaltung zwischen endständigen oder nicht-endständigen angrenzendem
Glucopyranose-Einheiten. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung an einer [Glucose(1→4), (1→3) oder
(1→6)Glucose]-Bindung.
Das Polypeptid kann vorzugsweise zwischen zwei benachbarten (beispielsweise
nicht-substituierten Glucose-)Einheiten spalten. Es kann folglich
Endoaktivität
haben (d. h. eine Endoglucanase sein). Das Substrat-Polymer kann
substituiert sein oder nicht. Vorzugsweise hat das Polypeptid keine
Xylanase-Aktivität.
-
Das
Polypeptid kann auch Cellulase-Aktivität haben, das heißt es ist
an Cellulose aktiv oder kann dieses spalten. Da β-Glucan eine Komponente der
Cellulose ist, fallen alle Glucanasen innerhalb des breiteren Begriffs
der Cellulasen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind folglich
Cellulasen, weil sie zur Unterklasse der Glucanasen gehören. Andere
Typen von Aktivitätsklassen
innerhalb der Cellulasen, abgesehen von Endoglucanase (EC 3.2.1.4,
wie oben erwähnt)
sind Exo-Glucanase/Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-Glukosidase
(EC 3.2.1.21), Endo-1,6-Glucanase
(EC 3.2.1.75), Exo-1,3-Glucanase (EC 3.2.1.58), Mannanase (EC 3.2.1.78)
und Endo-Glykoceramidase
(EC 3.2.1.123). Einige der Polypeptide haben wahrscheinlich eine,
zwei oder mehr dieser zusätzlichen
Aktivitäten,
die auf ihrer Struktur und Sequenz beruhen, durch Vergleich mit
bekannten Enzymen und der Familie der Hydrolasen, in die sie fallen.
In der Beschreibung, in der der Kontext angebracht ist, kann somit
Glucanase-Aktivität
Cellulase-Aktivität
bedeuten. Eine Liste von (Cellulase)-Aktivitäten für die Polypeptide wird in Beispiel
11 später
bereitgestellt.
-
Vorzugsweise
fällt das
Polypeptid in eine der Familien 5, 7 oder 45, entsprechend der Glykosidhydrolase(CAZy)-Klassifikation.
Das Polypeptid kann ein glu/glu oder asp/asp-Nukleophil/Proton-Donator sein.
-
Varianten und Homologa
-
Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
kann die in SEQ ID NR: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfassen oder eine
im Wesentlichen homologe Sequenz oder ein Fragment der Sequenz und
kann β-Glucanase Aktivität haben.
Im Allgemeinen ist die natürlich
vorkommende Aminosäuresequenz,
gezeigt in SEQ ID NR: 2 bevorzugt.
- Insbesondere
kann das Polypeptid der Erfindung umfassen:
- a. die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2;
- b. eine natürlich
vorkommende Variante- oder ein Spezieshomologon davon; oder
- c. ein Protein mit mindestens 70, mindestens 80, mindestens
90, mindestens 95, mindestens 98 oder mindestens 99% Sequenzidentität zu (a)
oder zu (b).
-
Eine
Variante kann eine sein, die natürlich
vorkommt, z. B. in Pilz-, Bakterium-, Hefe- oder Pflanzenzellen,
und die in einer im Wesentlichen ähnlichen Weise zum Protein
von SEQ ID NR: 2 arbeiten kann, z. B. hat es β-Glucanase-Aktivität. Ähnlich ist
ein Spezieshomologon des Proteins ein äquivalentes Protein, das natürlich in
einer anderen Art vorkommt und das als β-Glucanase-Enzym arbeiten kann.
Varianten umfassen allelische Varianten vom gleichen Stamm wie das
Polypeptid der Erfindung oder von einem anderen Stamm, aber der
gleichen Gattung oder der gleichen Spezies.
-
Varianten
und Spezieshomologa können
erhalten werden, indem man den hierin beschriebenen Verfahren für die Produktion
des Polypeptids von SEQ ID NR: 2 und Durchführen solcher Verfahren auf
einer geeigneten Zellquelle folgt, z. B. eine Bakterien-, Hefe-,
Pilze- oder Pflanzen-Zelle.
Man kann auch eine Sonde, wie oben definiert, verwenden, um Banken
zu prüfen,
die aus Hefe-, Bakterien-, Pilz- oder Pflanzenzellen hergestellt
wurden, so dass man Klone erhält,
die die Varianten oder die Spezieshomologa enthalten. Die Klone können durch
herkömmliche
Techniken manipuliert werden, um ein Polypeptid der Erfindung zu
erzeugen, die dann durch Rekombinations- oder Synthesetechniken
produziert werden können,
die an sich bekannt sind.
-
Das
erfindungsgemäße Polypeptid
hat vorzugsweise mindestens 70% Sequenzidentität zum Protein von SEQ ID NR:
Nr. 2, vorzugsweise mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%,
mindestens 97% oder mindestens 99% Sequenzidentität dazu,
z. B. über
einen Bereich von mindestens 60, mindestens 100, 150, 200 oder 300
angrenzenden Aminosäuren
oder über
die gesamte Länge
von SEQ ID NR: 2. Für
SEQ ID NR: 2 ist die Sequenzidentität vorzugsweise mindestens 70%.
-
Die
Sequenz des Polypeptids von SEQ ID NR: Nr. 2 und von Varianten und
von Spezieshomologa können
folglich modifiziert werden, so dass die Polypeptide der Erfindung
bereitgestellt werden. Aminosäuresubstitutionen
können
z. B. von oder bis zu 1, 2 oder 3 bis 10, 20, 30, 50 oder 100 Substitutionen
gebildet werden. Es kann auch die gleiche Zahl Deletionen und Additionen
vorgenommen werden. Diese Wechsel können außerhalb der Bereiche gebildet
werden, die zur Funktion des Polypeptids entscheidend sind und können so
dennoch zu einem aktiven Enzym führen.
Das modifizierte Polypeptid behält
im Allgemeinen Aktivität
als β-Glucanase.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
umfassen Fragmente der oben erwähnten
Polypeptide voller Länge
und der Varianten davon, einschließlich der Fragmente der Sequenz,
die in SEQ ID NR: 2 Nr. dargelegt ist. Solche Fragmente behalten
gewöhnlich
Aktivität
als β-Glucanase. Fragmente
können
mindestens 50, 100, 150, 200 oder 250 Aminosäuren lang sein oder können diese Zahl
der Aminosäuren
der Sequenz voller Länge kurz
sein (wie in SEQ ID NR: 2 gezeigt).
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
wenn notwendig mit synthetischen Mitteln produziert werden, obgleich
sie normalerweise rekombinant gebildet werden, wie unten beschrieben.
Sie können
zum Beispiel durch Addition von Histidin-Resten oder einer T7-Markierung
modifiziert werden, so dass ihre Identifikation oder Reinigung unterstützt wird
oder durch Addition einer Signalsequenz, damit ihre Sekretion aus
einer Zelle gefördert
wird.
-
Die
Bezeichnung "Varianten" bezieht sich auf
Polypeptide, die den gleichen wesentlichen Charakter oder grundlegende
biologische Funktionalität
wie die β-Glucanase (oder Cellulase)
haben, und umfasst allelische Varianten. Der wesentliche Charakter
von β-Glucanase ist, dass
es ein Enzym ist, das EC 3.2.1.4-Aktivität aufweist
oder 1→3-,
1→4- und/oder
1→6-Bindungen in β-D-Glucan,
wie β-D-Glucan
aus Getreide- oder
Haferspelzen. Vorzugsweise hat eine Polypeptid-Variante die gleiche Aktivität wie die β-Glucanase.
Ein Polypeptid, das den gleichen wesentlichen Charakter wie β-Glucanase
hat, kann identifiziert werden, indem man einen Cellulose- oder β-Glucan-Abbau-Test
verwendet, z. B. wie später
beschrieben.
-
Varianten
von SEQ ID NR: 2 umfassen auch Sequenzen, die von SEQ ID NR: 2 abweichen,
die aber nicht notwendigerweise vom natürlich vorkommenden β-Glucanase-Protein
hergeleitet werden. Diese Varianten können Beschreibungen zufolge
eine prozentuale Homologie zu SEQ ID NR: 2 haben oder eine Anzahl Substitutionen
innerhalb dieser Sequenz aufweisen. Alternativ kann eine Variante
durch ein Polynukleotid codiert werden, das an SEQ ID NR: 1 hybridisiert.
-
Die
Varianten können
in einer ähnlichen
Weise zu den Varianten von SEQ ID NR: 1 definiert werden. So können die
Varianten variante Sequenzen umfassen, die von anderen Talaromyces-Stämmen hergeleitet werden.
Andere Varianten können
aus anderen Talaromyces-Stämmen identifiziert
werden durch das Suchen nach β-D-Glucanase-Aktivität und Klonieren
und Sequenzieren wie zuvor. Varianten können die Deletion, Modifikation
oder Addition einzelner Aminosäuren
oder Gruppen von Aminosäuren
innerhalb der Proteinsequenz einschließen, solange das Peptid die
grundlegende biologische Funktionalität der β-Glucanase beibehält.
-
Konservative
Substitutionen können
z. B. entsprechend der folgenden Tabelle gebildet werden. Aminosäuren im
gleichen Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in der gleichen
Zeile in der dritten Säule können gegeneinander
substitutiert werden. Vorzugsweise beeinflussen Substitutionen nicht
die Faltung oder die Aktivität
des Polypeptids.
ALIPHATISCH | nicht polar | G
A P |
I
L V |
polar ungeladen | C
S T M |
N
Q |
polar geladen | D
E |
K
R |
AROMATISCH | | H
F W Y |
-
Kürzere Polypeptidsequenzen
liegen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung. Z. B. liegt ein
Peptid mit mindestens 50 Aminosäuren
oder bis 60, 70, 80, 100, 150 oder 200 Aminosäuren Länge innerhalb des Schutzbereichs
der Erfindung, solange es die grundlegende biologische Funktionalität der β-Glucanase
zeigt. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, umfasst dieser Aspekt
der Erfindung die Situation, wenn das Protein ein Fragment der vollständigen Proteinsequenz
ist und kann eine β-D-Glucan(oder Mannose)-bindende
Region oder eine β-D-Glucan(oder Cellulose)-spaltende
Region umfassen oder darstellen.
-
Modifikationen
-
Erfindungsgemäße Polypeptide
können
chemisch modifiziert sein, beispielsweise posttranslational modifiziert.
Sie können
beispielsweise (ein oder mehrmals, durch den gleichen oder einen
anderen Zucker) glykosyliert sein oder modifizierte Aminosäurereste
umfassen. Sie können
auch durch die Addition von Histidinresten (um ihre Reinigung unterstützen) oder
durch die Addition einer Signalsequenz (um die Einfügung in die
Zellmembran zu fördern)
modifiziert sein. Das Polypeptid kann eine oder mehrere (N)-Amino- oder (C)-carboxylterminale
Extensionen haben, wie einen aminoterminalen Methioninrest, ein
kleines Linkerpeptid von bis zu ungefähr 20–25 Resten oder eine (kleine)
Extension, die die Reinigung erleichtert, wie ein Polyhistidin oder eine
T7-Markierung, ein Antigenepitop oder eine (beispielsweise Maltose)
bindende Domäne14 (beispielsweise am C-Terminus). Diese
Extensionen können über einen
Linker hinzugefügt
werden oder nicht.
-
Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
kann mit einer enthüllenden
Markierung markiert werden. Die enthüllende Markierung kann jede
geeignete Markierung sein, die den Nachweis des Polypeptids ermöglicht.
Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, beispielsweise 125I, 35S, Enzyme,
Antikörper,
Polynukleotide und Linker, wie Biotin.
-
Die
Polypeptide können
so modifiziert sein, dass nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten sind,
oder die Stabilität
des Polypeptids erhöht
wird. Wenn die Proteine oder die Peptide mit synthetischen Mitteln
produziert werden, können
solche Aminosäuren
während
der Produktion eingeführt
werden. Die Proteine oder die Peptide können auch gemäß synthetischer
oder rekombinanter Produktion modifiziert werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
auch mit Hilfe von (einer oder mehren) D-Aminosäuren hergestellt werden oder
diese umfassen.
-
Eine
Anzahl von Seitenketten-Modifikationen sind im Stand der Technik
bekannt und können
an den Seitenketten der erfindungsgemäßen Proteine oder Peptide der
vorgenommen werden. Solche Modifikationen umfassen z. B. Modifikationen
der Aminosäuren
durch reduktive Alkylierung durch Reaktion mit einem Aldehyd, gefolgt
von Reduktion mit NaBH4, Amidierung mit
Methylacetimidat oder Acylierung mit Essigsäureanhydrid.
-
Die
erfindungsgemäß bereitgestellten
Sequenzen können
auch als Ausgangsmaterialien für
die Konstruktion der Enzyme "der
zweiten Generation" verwendet
werden. Glucanasen der "zweiten
Generation" sind Glucanasen,
geändert
durch Mutagenesetechniken (beispielsweise stellengerichtete Mutagenese),
deren Eigenschaften sich von denen der Wildtyp-Glucanasen oder rekombinanten
Glucanasen unterscheiden wie diejenigen, die durch die vorliegende
Erfindung produziert werden. Z. B. können die Temperatur oder das pH-Wert-Optimum,
die spezifische Aktivität,
die Substrataffinität
oder die Thermostabilität
so geändert
werden, dass dies für
Anwendung in einem definierten Verfahren besser geeignet ist.
-
Die
Aminosäuren,
die für
die Aktivität
der erfindungsgemäßen Glucanasen
essentiell sind und folglich vorzugsweise der Substitution unterliegen,
können
entsprechend den Verfahren des Standes der Technik identifiziert
werden, wie stellengerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese10. In der letzteren Technik werden die Mutationen
an jedem Rest im Molekül
eingeführt,
und die resultierenden Mutantenmoleküle werden auf biologische Aktivität geprüft (beispielsweise
Glucanaseaktivität),
um die Aminosäurereste
zu identifizieren, die für
die Aktivität
des Moleküls
entscheidend sind. Stellen der Enzym-Substrat-Wechselwirkung können auch
durch die Analyse der Kristallstruktur festgestellt werden, wie
durch solche Techniken wie Kernmagnetresonanz, Kristallographie
oder Fotoaffinitätsmarkierung11,12,13 oder Molekülmodelling.
-
Die
Verwendung von Hefe und Pilz-Wirtszellen stellt Erwartungen zufolge
solche postranslationalen Modifikationen bereit (beispielsweise
proteolytisches Verarbeiten, Myristilierung, Glykosylierung, Verkürzung, und
Tyrosin-, Serin- oder Threoninphosphorylierung) wie es erforderlich
sein kann, damit den rekombinanten Expression-Produken der Erfindung
die optimale biologische Aktivität
verliehen wird.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
in einer Form bereitgestellt werden, so dass sie außerhalb
ihrer natürlichen
Zellumgebung sind. So können
sie im wesentlichen isoliert oder gereinigt werden, wie vorstehend
erörtert
oder in einer Zelle, in der sie in der Natur, nicht vorkommen, beispielsweise
einer Zelle anderer Pilzarten, Tiere, Hefe oder Bakterien.
-
C. Rekombinationsaspekte.
-
Die
Erfindung liefert auch Vektoren, umfassend ein erfindungsgemäßes Polynukleotid,
einschließlich Klonierungs-
und Expressionvektoren und Verfahren zum Züchten, Transformieruen oder
Transfizieren solcher Vektoren in einer geeigneten Wirtszelle, z.
B. unter Bedingungen, in denen die Expression eines Polypeptids der
Erfindung auftritt. Es werden auch Wirtszellen bereitgestellt, die
ein Polynukleotid oder einen Vektor der Erfindung umfassen, worin
das Polynukleotid zum Genom der Wirtszelle heterolog ist. Der Begriff "heterolog", normalerweise in
Bezug auf die Wirtszelle, bedeutet, dass das Polynukleotid nicht
natürlich
im Genom der Wirtszelle vorkommt, oder dass das Polypeptid nicht
natürlich
durch diese Zelle produziert wird. Vorzugsweise ist die Wirtszelle
eine Hefezelle, z. B. eine Hefezelle der Gattung Kluyveromyces oder
Saccharomyces oder eine Pilzzelle, z. B. der Klasse Aspergillus.
-
Die
erfindungsgemäßen Polynukleotide
können
in einem rekombinant replizierbaren Vektor, z. B. einem Klonierungs-
oder Expressionvektor eingebracht werden. Der Vektor kann verwendet
werden, um die Nukleinsäure
in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. So stellt die Erfindung
in einer weiteren Ausführungsform
ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Polynukleotide der Erfindung
durch Einführen
eines Polynukleotids der Erfindung in einen replizierbaren Vektor,
Einbringen des Vektor in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der
Wirtszelle unter Bedingungen, die die Reproduktion des Vektors bewirken,
bereit. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete
Wirtszellen sind in Zusammenhang mit Expressionvektoren unten beschrieben.
-
Vektoren
-
Das
erfindungsgemäße Polynukleotid
kann in eine Expressionskassette eingebracht werden. Der Vektor,
in den die erfindungsgemäße Expressionskassette
oder das Polynukleotid eingesetzt wird, kann ein beliebiger Vektor
sein, der geeigneterweise DNA-Rekombinationsverfahren
unterworfen werden kann, und die Auswahl des Vektors hängt oft
von der Wirtszelle ab, in die er eingeführt werden soll. Somit kann
der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor,
der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation
von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, wie ein Plasmid.
Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle
eingeführt
wird, in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit de(m/n)
Chromosom(en) repliziert, in die er integriert wurde.
-
Ein
erfindungsgemäßes Polynukleotid
in einem Vektor ist vorzugsweise operativ mit einer regulatorischen
Sequenz verknüpft,
die in der Lage ist, die Expression der codierenden Sequenz durch
die Wirtszelle bereitzustellen, d. h. der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Der Begriff "operativ
verknüpft" betrifft ein Nebeneinanderliegen,
wobei die beschriebenen Komponenten eine Beziehung zueinander haben,
die es ihnen gestattet, auf ihre beabsichtigte Weise zu wirken.
Eine regulatorische Sequenz, wie ein Promotor, Enhancer oder ein anderes
Expressionsregulationssignal, das mit einer codierenden Sequenz "operativ verknüpft" ist, ist derart platziert, dass
eine Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erzielt
wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
-
Der
Vektor kann gewöhnlich
im Fall von Plasmid-, Cosmid-, Virus- oder Phagenvektoren, mit einem Replikationsursprung,
gegebenenfalls einem Promotor zur Expression des Polynukleotids
und gegebenenfalls einem Enhancer und/oder einem Regulator des Promotors
ausgestattet werden. Eine Terminatorsequenz sowie eine Polyadenylierungssequenz
können
vorhanden sein. Der Vektor kann ein oder mehrere Selektionsmarkergene
enthalten, zum Beispiel ein Ampicillin-Resistenzgen (im Fall eines
bakteriellen Plasmids), oder ein Neomycin-Resistenzgen (für einen Säuger-Vektor). Vektoren können in
vitro, zum Beispiel zur Produktion von RNA, oder zur Transfektion
oder Transformation einer Wirtszelle verwendet werden. Sie können zwei
oder mehr erfindungsgemäße Polynukleotide,
beispielsweise zur Überexpression
umfassen.
-
Die
DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, wird vorzugsweise in einen
geeigneten Wirt als Teil einer Expressionskassete (oder Konstrukts)
eingeführt,
in dem die DNA-Sequenz mit Expressionssignalen operativ verknüpft ist,
die die Expression der DNA-Sequenz in den Wirtszellen steuern können. Zur
Transformation des geeigneten Wirts mit dem Expressionskonstrukt
sind Transformationsverfahren verfügbar, die dem Fachmann bekannt
sind3,4. Das Expressionskonstrukt kann zur
Transformation des Wirts als Teil eines Vektors verwendet werden,
der einen Selektionsmarker trägt,
oder das Expressionskonstrukt wird als ein separates Molekül zusammen
mit dem Vektor transformiert, der einen Selektionsmarker trägt. Der
Vektor kann ein oder mehrere Selektionsmarkergene enthalten.
-
Bevorzugte
Selektionsmarker15,16 beinhalten, sind aber
nicht beschränkt
auf diejenigen, die einen Defekt in der Wirtszelle komplementieren
oder Resistenz gegen einen Arzneistoff verleihen. Sie beinhalten
zum Beispiel vielseitige Markergene, die zur Transformation der
meisten filamentösen
Pilze und Hefen verwendet werden können, wie Acetamidase-Gene
oder -cDNAs (die amdS-, niaD-, facA-Gene oder -cDNAs aus A. nidulans,
A. oryzae oder A. niger), oder Gene, die eine Resistenz gegen Antibiotika
verleihen, wie eine G418-, Hygromycin-, Bleomycin-, Kanamycin-,
Phleomycin- oder Benomyl-Resistenz (benA). Alternativ können spezifische
Selektionsmarker verwendet werden, wie auxotrophe Marker, die entsprechende
mutierte Wirtsstämme
erfordern: z. B. URA3 (aus S. cerevisiae oder analoge Gene aus anderen
Hefen), pyrG oder pyrA (aus A. nidulans oder A. niger), argB (aus
A. nidulans oder A. niger) oder trpC. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird
der Selektionsmarker aus der transformierten Wirtszelle nach Einbringen
des Expressionskonstrukts deletiert, um transformierte Wirtszellen
zu erhalten, die das Polypeptid produzieren können und frei von Selektionsmarkergenen
sind21.22.
-
Andere
Marker sind u. a. ATP-Synthetase Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase (pvrA), das bakterielle
G418-Resistenzgenen
(das in Hefe, aber nicht in filamentösen Pilzen verwendet werden kann),
das Ampicillin-Resistenzgen
(E. coli), das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus) und das E.-coli-uidA-Gen, das
für β-Glucuronidase (GUS)
codiert. Vektoren können
in vitro, zum Beispiel zur Produktion von RNA oder zur Transfektion
oder Transformation einer Wirtszelle, verwendet werden.
-
Für die meisten
filamentösen
Pilze und Hefe wird das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das
Genom der Wirtszelle integriert, um stabile Transformanten zu erhalten.
Für bestimmte
Hefen sind jedoch auch geeignete episomale Vektoren erhältlich,
in die das Expressionskonstrukt für eine stabile Expression in
einem hohen Spiegel eingebracht werden kann. Beispiele dafür beinhalten
Vektoren, die aus den 2-μ-,
und pKD1-Plasmiden
von Saccharomyces bzw. Kluyveromyces stammen, oder Vektoren, die
eine AMA-Sequenz enthalten (z. B. AMA1 aus Aspergillus3,20).
Wenn Expressionskonstrukte in Wirtszellgenome integriert werden, werden
die Konstrukte entweder an zufallsgemäßen Loci in das Genom integriert
oder an zuvor bestimmten Zielloci unter Einsatz homologer Rekombination,
wobei in diesem Fall die Zielloci vorzugsweise ein hoch exprimiertes
Gen umfassen. Ein hoch exprimiertes Gen ist ein Gen, dessen mRNA
mindestens 0,01% (w/w) der gesamten zellulären mRNA, zum Beispiel unter
induzierten Bedingungen, ausmachen kann, oder alternativ ein Gen,
dessen Genprodukt mindestens 0,2% (w/w) des gesamten zellulären Proteins
ausmachen kann, oder im Fall eines sezernierten Genprodukt, bis
zu einem Spiegel von mindestens 0,05 g/l sezerniert werden kann. Nachstehend
wird eine Reihe von Beispielen für
geeignete hoch exprimierte Gene bereitgestellt.
-
Ein
Vektor oder Expressionskonstrukt für eine gegebene Wirtszelle
enthält
gewöhnlich
die folgenden Elemente, operativ miteinander verknüpft in aufeinander
folgender Reihenfolge vom 5'-Ende
zum 3'-Ende relativ
zum codierenden Strang der Sequenz, die das Polypeptid der ersten
Erfindung codiert:
- (1) eine Promotorsequenz,
welche die Transkription der DNA-Sequenz, die das Polypeptid in
der gegebenen Wirtszelle codiert, steuern kann,
- (2) gegebenenfalls eine Signalsequenz, die die Sekretion des
Polypeptids aus der gegebenen Wirtszelle in das Kulturmedium steuern
kann,
- (3) eine DNA-Sequenz, die eine reife und vorzugsweise aktive
Form des Polypeptids codiert, und vorzugsweise auch
- (4) eine Transkriptionsterminationsregion (Terminator), die
die Transkription stromabwärts
der DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, terminieren kann.
-
Stromabwärts der
DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, enthält das Expressionskonstrukt
vorzugsweise eine 3'-untranslatierte
Region, die ein oder mehrere Transkriptionsterminationsstellen,
(beispielsweise einen Terminator) enthält. Der Ursprung des Terminators
ist weniger wichtig. Der Terminator kann zum Beispiel nativ für die DNA-Sequenz
sein, die das Polypeptid codiert. Vorzugsweise wird jedoch in Hefe-Wirtszellen
ein Hefe-Terminator verwendet, und ein Terminator aus filamentösem Pilz
wird in filamentosen Pilz-Wirtszellen verwendet. Stärker bevorzugt
ist der Terminator für
die Wirtszelle, (in der die DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert,
exprimiert wird) endogen.
-
Eine
verstärkte
Expression des Polynukleotids, das das erfindungsgemäße Polypeptid
codiert, kann auch durch Auswahl heterologer regulatorischer Regionen
erzielt werden, z. B. Promotor-, Sekretionsleader- und/oder Terminator-Regionen,
die zur Erhöhung
der Expression und, wenn gewünscht,
der Sekretionsspiegel des Proteins von Interesse aus dem Expressionswirt
und/oder zum Bereitstellen einer induzierbaren Kontrolle der Expression
des erfindungsgemäßen Polypeptids
dienen.
-
Neben
den Promotor, der für
das Gen nativ ist, das für
das erfindungsgemäße Polypeptid
codiert, können
andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids
zu steuern. Der Promotor kann hinsichtlich seiner Effizienz bei
der Steuerung der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids in dem gewünschten
Expressionswirt ausgewählt
werden.
-
Promoter/Enhancer
und andere Expressionsregulationssignale können derart ausgewählt werden, dass
sie mit der Wirtszelle kompatibel sind, für die der Expressionsvektor
gestaltet worden ist. Zum Beispiel können prokaryontische Promotoren
verwendet werden, insbesondere diejenigen, die zur Verwendung in E.-coli-Stämmen geeignet
sind. Wenn die Expression in Säugerzellen
durchgeführt
wird, können
Säuger-Promotoren verwendet
werden. Gewebespezifische Promotoren, zum Beispiel Hepatozyten-zellspezifische
Promotoren, können
ebenfalls verwendet werden. Auch virale Promotoren können verwendet
werden, zum Beispiel der Promotor aus dem Long Terminal Repeat des
Moloney-Mäuseleukämievirus
(MMLV-LTR), der Rous-Sarkomvirus-(RSV-)LTR-Promotor,
der SV40-(beispielsweise großes
T-Antigen)Promotor, der IE-Promotor des humanen Cytomegalievirus
(CMV), Herpes-simplex-Virus-Promotoren oder Adenovirus-Promotoren,
HSV-Promotoren, wie die HSV-IE-Promotoren) oder HPV-Promotoren,
insbesondere die stromaufwärts gelegene
regulatorische Region (URR) von HPV. Hefe-Promotoren sind u. a.
die S.-cerevisiae-GAL4-
und ADH-Promotoren und der S.-pombe-nmt1- und adh-Promotor. Säuger-Promotoren
sind u. a. der Metallothionein-Promotor, der als Reaktion auf Schwermetalle,
wie Cadmium, induziert werden kann, und β-Aktin-Promotoren. Gewebespezifische
Promotoren, wie Endothel- oder nervenzellenspezifische Promotoren
(beispielsweise DDAH1 und DDAHII-Promotoren) sind besonders bevorzugt.
-
Eine
Reihe von Promotoren15,16 kann verwendet
werden, die die Transkription in den erfindungsgemäßen Wirtszellen
steuern können.
Vorzugsweise stammt die Promotorsequenz aus einem hoch exprimierten Gen,
wie vorstehend definiert. Beispiele für bevorzugte hoch exprimierte
Gene, aus denen die Promotoren vorzugsweise stammen und/oder die
in den bevorzugten zuvor festgelegten Zielloci für die Integration von Expressionskonstrukten
umfasst sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Gene, die glykolytische
Enzyme codieren, wie Triosephosphatisomerasen (TPI), Glyceraldehydphosphatdehydrogenasen
(GAPDH), Phosphoglyceratkinasen (PGK), Pyruvatkinasen (PYK), Alkoholdehydrogenasen
(ADH), sowie Gene, die für
Amylasen, Glucoamylasen, Proteasen, Xylanasen, Cellobiohydrolasen, β-Galactosidasen,
Alkohol-(Methanol-)oxidasen, Elongationsfaktoren
und ribosomale Proteine codieren. Spezifische Beispiele für geeignete
hoch exprimierte Gene beinhalten z. B. das LAC4-Gen aus Kluyveromyces
sp., die Methanoloxidase-Gene (AOX und MOX) aus Hansenula bzw. Pichia,
die Glucoamylase-(glaA-)Gene
aus A. niger und A. awamori, das A. oryzae-TAKA-Amylase-Gen, das
A. nidulans-gpdA-Gen und die T.-reesei-Cellobiohydrolase-Gene.
-
Beispiele
für starke
konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die für die Verwendung
in Pilz-Expressionswirten15,16 bevorzugt
sind, sind diejenigen, die aus dem Pilz-Gen für Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase-Untereinheit
9 (oliC) Triosephosphatisomerase (tpi-), Alkoholdehydrogenase (AdhA),
Amylase (amy), Amyloglucosidase (AG aus dem glaA-Gen) erhältlich sind,
die Acetamidase-(amdS-) und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(gpd-)Promotoren.
-
Beispiele
für starke
Hefe-Promotoren sind diejenigen, die aus dem Gen für Alkoholdehydrogenase, Lactase,
3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase erhältlich sind.
-
Beispiele
für starke
bakterielle Promotoren sind u. a. die α-Amylase- und SPo2-Promotoren
sowie Promotoren aus extrazellulären
Proteasegenen.
-
Für Pflanzenzellen
geeignete Promotoren sind u. a. die Nopalinsynthase-(nos-), Octopinsynthase-(ocs-),
Mannopinsynthase-(mas-)Promotoren, die Promotoren der kleinen Untereinheit
der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco-ssu), Histon-, Reis-Aktin-,
Phaseolin-, Blumenkohlmosaikvirus-(CMV-)-35S- und -19-S- und Circovirus-Promotoren.
All diese Promotoren sind im Stand der Technik leicht erhältlich.
-
Der
Vektor kann ferner Sequenzen enthalten, die das Polynukleotid flankieren,
was RNA ergibt, die Sequenzen umfasst, die homolog zu solchen aus
eukaryontischen genomischen Sequenzen, vorzugsweise genomischen
Säuger-Sequenzen
oder viralen genomischen Sequenzen, sind. Dies ermöglicht die
Einführung der
erfindungsgemäßen Polynukleotide
in das Genom von eukaryontischen Zellen oder Viren durch homologe Rekombination.
Insbesondere kann ein Plasmidvektor, der die Expressionskassette,
flankiert von viralen Sequenzen, umfasst, zur Herstellung eines
viralen Vektors verwendet werden, der zur Abgabe der erfindungsgemäßen Polynukleotide
an eine Säugerzelle
geeignet ist. Weitere Beispiele für geeignete virale Vektoren
sind u. a. Herpes-simplex-Virus-Vektoren18,19 und
Retroviren, einschließlich
Lentiviren, Adenoviren, adeno-assoziierter Viren und HPV-Viren (wie
HPV-16 oder HPV-18). Gentransfertechniken unter Verwendung dieser
Viren sind dem Fachmann bekannt. Retrovirus-Vektoren können zum
Beispiel dazu verwendet werden, um das Polynukleotid, das die Antisense-RNA
erzeugt, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren. Replikationsdefiziente Adenovirus-Vektoren
bleiben im Gegensatz dazu episomal und gestatten daher eine transiente
Expression.
-
Der
Vektor kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
enthalten, das in einer Antisense-Richtung orientiert ist, um die Produktion
von Antisense-RNA bereitzustellen. Mit dieser können bei Bedarf die Spiegel
der Expression des Polypeptids verringert werden.
-
Wirtszellen und Expression
-
Unter
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines erfindungsgemäßen Polypeptids
bereit, umfassend das Züchten
einer Wirtszelle (die mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend
beschrieben, transformiert oder transfiziert wurde) unter Bedingungen,
die zur Expression (durch den Vektor) einer codierenden Sequenz,
die das Polypeptid codiert, geeignet ist, und gegebenenfalls Gewinnen des
exprimierten Polypeptids. Erfindungsgemäße Polynukleotide können in
einen rekombinanten replizierbaren Vektor, wie beispielsweise einen
Expressionsvektor, eingebracht werden. Der Vektor kann zum Replizieren der
Nukleinsäure
in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. Somit stellt die
Erfindung bei einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur
Herstellung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids
durch Einbringen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einen
replizierbaren Vektor, Einbringen des Vektors in eine kompatible
Wirtszelle und Züchten
der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Replikation des Vektors
herbeiführen,
bereit. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete
Wirtszellen sind u. a. Bakterien, wie E. coli, Hefe, Säugerzelllinien
und andere eukaryontische Zelllinien, zum Beispiel Insektenzellen, wie
Sf9-Zellen, und (z. B. filamentöse)
Pilzzellen.
-
Vorzugsweise
wird das Polypeptid als sezerniertes Protein produziert, wobei in
diesem Fall die DNA-Sequenz,
die eine reife Form des Polypeptids codiert, in dem Expressionskonstrukt
operativ mit einer DNA-Sequenz
verknüpft
ist, die eine Signalsequenz codiert. Die verwendete Signalsequenz
ist vorzugsweise nativ (homolog) für die DNA-Sequenz, die das
Polypeptid codiert. Alternativ ist die Signalsequenz fremd (heterolog)
für die
DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, wobei in diesem Fall die
Signalsequenz vorzugsweise für
die Wirtszelle endogen ist, in der die DNA-Sequenz exprimiert wird.
Beispiele für
geeignete Signalsequenzen für
Hefe-Wirtszellen sind die Signalsequenzen, die von den Hefe-α-Faktor-Genen
stammen. Ebenso ist eine geeignete Signalsequenz für filamentöse Pilz-Wirtszellen
z. B. eine Signalsequenz, die aus einem Amyloglucosidase-(AG-)Gen
eines filamentösen
Pilzes, z. B. dem A.-niger-glaA-Gen, stammt. Diese Signalsequenz
kann in Kombination mit dem Amyloglucosidase-(auch als (Gluco)amylase
bezeichnet) Promotor selbst sowie in Kombination mit anderen Promotoren
verwendet werden. Hybrid-Signalsequenzen können im Kontext der vorliegenden
Erfindung ebenfalls verwendet werden.
-
Bevorzugte
heterologe Sekretions-Leadersequenzen sind diejenigen, die aus dem
Pilz-Amyloglucosidase-(AG-)Gen
(glaA – sowohl
der 18- als auch der 24-Aminosäuren-Version,
z. B. aus Aspergillus), dem α-Faktor-Gen (Hefen
z. B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylase-Gen (Bacillus) stammen.
-
Die
Vektoren können
in eine geeignete Wirtszelle, wie vorstehend beschrieben, transformiert
oder transfiziert werden, um die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids
bereitzustellen. Dieses Verfahren kann das Züchten einer Wirtszelle, die
mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, transformiert
wurde, unter Bedingungen umfassen, so dass der Vektor einer codierenden
Sequenz, die das Polypeptid codiert, exprimiert wird.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt somit Wirtszellen bereit, die
mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid
oder Vektor transformiert oder transfiziert worden sind oder die
dies umfassen. Vorzugsweise befindet sich das Polynukleotid in einem
Vektor zur Replikation und Expression des Polynukleotids. Die Zellen werden
derart ausgewählt,
dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können zum Beispiel prokaryontische (zum
Beispiel bakterielle) oder eukaryontische Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen
sein.
-
Ein
heterologer Wirt kann ebenfalls gewählt werden, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid
in einer Form produziert wird, die im Wesentlichen frei von anderen
celluloseabbauenden Enzymen ist. Die kann erzielt werden mit einem
Wirt, der normalerweise nicht solche Enzyme produziert, wie Kluyveromyces
lactis.
-
Die
Erfindung umfasst Verfahren zur Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids
mit Hilfe der rekombinanten Expression einer DNA-Sequenz, die das
Polypeptid codiert. Zu diesem Zweck kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz
zur Genamplifikation und/oder zum Austausch von Expressionssignalen,
wie Promotoren, Sekretionssignalsequenzen, verwendet werden, so
dass eine ökonomische
Produktion des Polypeptids in einer geeigneten homologen oder heterologen
Wirtszelle möglich
ist. Eine homologe Wirtszelle ist hier als eine Wirtszelle definiert,
die von derselben Spezies oder eine Variante innerhalb derselben
Spezies ist wie die Spezies, aus der die DNA-Sequenz stammt.
-
Geeignete
Wirtszellen sind vorzugsweise prokaryontische Mikroorganismen, wie
Bakterien, oder stärker
bevorzugt eukaryontische Organismen, zum Beispiel Pilze, wie Hefe
oder filamentöse
Pilze, oder Pflanzenzellen. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber filamentösen Pilzzellen
bevorzugt, weil sie leichter zu manipulieren sind. Einige Proteine
werden jedoch entweder aus Hefen schlecht sezerniert oder in einigen
Fällen
nicht richtig prozessiert (z. B. Hyperglykosylierung in Hefe). In
diesen Fällen
sollte ein filamentöser Pilz-Wirtsorganismus
gewählt
werden.
-
Die
Wirtszelle kann das Polypeptid überexprimieren,
und Techniken zum Engineering der Überexpression sind bekannt3. Der Wirt kann somit zwei oder mehr Kopien
des codierenden Polynukleotids haben (und der Vektor kann somit
zwei oder mehr Kopien haben).
-
Bakterien
aus der Gattung Bacillus sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine in des Kulturmedium
zu sezernieren, als heterologe Wirte sehr geeignet. Weitere als
Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen aus den Gattungen Streptomyces
und Pseudomonas. Eine bevorzugte Hefe-Wirtszelle zur Expression
der DNA-Sequenz,
die das Polypeptid codiert, stammt aus der Gattung Saccharomyces,
Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia und Schizosaccharomyces.
Stärker
bevorzugt wird eine Hefe-Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt, die
aus den Spezies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (auch
als Kluyveromyces marxianus var. lactis bekannt), Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica und Schizosaccharomyces pombe
stammen.
-
Am
stärksten
bevorzugt sind jedoch (beispielsweise filamentöse) Pilz-Wirtszellen. Bevorzugte
filamentöse
Pilz-Wirtszellen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Aspergillus, Trichoderma,
Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus,
Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, und Talaromyces besteht.
Stärker
bevorzugt ist eine filamentöse
Pilz- Wirtszelle
aus der Spezies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus
nidulans oder ist aus einer Spezies der Aspergillus-niger-Gruppe
(wie definiert von Raper und Fennell, The Genus Aspergillus, The
Williams & Wilkins
Company, Baltimore, S. 293–344, 1965).
Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Aspergillus niger,
Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus,
Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus,
Aspergillus oryzae und Aspergillus ficuum, und auch diejenigen der
Spezies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum,
Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum,
Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum und Thielavia
terrestris.
-
Beispiele
für bevorzugte
Expressionswirte im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind
Pilze, wie Aspergillus-Spezies (insbesondere die in
EPA-184,438 und
EP-A-284,603 beschriebenen)
und Trichoderma-Spezies; Bakterien, wie Bacillus-Spezies (insbesondere
die in
EP-A-134,048 und
EP-A-253,455 beschriebenen),
insbesondere Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus
amyloliquefaciens, Pseudomonas-Spezies; und Hefen, wie Kluyveromyces-Spezies (insbesondere
die in
EP-A-096,430 beschriebenen,
wie Kluyveromyces lactis, und die in
EP-A-301,670 beschriebenen)
und Saccharomyces-Spezies, wie Saccharomyces cerevisiae.
-
Erfindungsgemäße Wirtszellen
beinhalten Pflanzenzellen, und die Erfindung erstreckt sich deshalb
auf transgene Organismen, wie Pflanzen und deren Teile, die eine
oder mehrere erfindungsgemäße Zellen
enthalten. Die Zellen können
das erfindungsgemäße Polypeptid
heterolog exprimieren oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide
heterolog enthalten. Im Genom der transgenen (oder genetisch modifizierten)
Pflanze kann daher eine Sequenz (gewöhnlich stabil) inseriert sein,
die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert.
Die Transformation von Pflanzenzellen kann unter Verwendung bekannter
Techniken durchgeführt werden,
zum Beispiel unter Verwendung eines Ti- oder Ri-Plasmids aus Agrobacterium
tumefaciens. Das Plasmid (oder der Vektor) kann somit Sequenzen
enthalten, die zur Infektion einer Pflanze notwendig sind, und Derivate
der Ti- und/oder Ri-Plasmide
können
eingesetzt werden.
-
Alternativ
kann die direkte Infektion eines Pflanzenteils, wie eines Blatts,
einer Wurzel oder eines Stängels,
durchgeführt
werden. In dieser Technik kann die zu infizierende Pflanze verwundet
werden, beispielsweise durch Schneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge
oder Stechen der Pflanze mit einer Nadel oder Aufrauen der Pflanze
mit einem Schmirgelmittel. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium
angeimpft. Die Pflanze oder der Pflanzenteil kann dann auf einem
geeigneten Kulturmedium gezüchtet
werden und kann sich zu einer reifen Pflanze entwickeln. Die Regeneration
der transformierten Zellen in genetisch modifizierte Pflanzen kann durch
Verwendung bekannter Techniken erzielt werden. Die Regeneration
von transformierten Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann
mittels bekannter Techniken erzielt werden, beispielsweise durch
Auswahl transformierter Stängel
mit einem Antibiotikum und Unter-Züchten der Stängel auf
einem Medium, das die geeigneten Nährstoffe, Pflanzenhormone und
dergleichen enthält17.
-
Kultur
von Wirtszellen und rekombinante Produktion Die Erfindung umfasst
auch Zellen, die derart modifiziert sind, dass sie β-Glucanase
oder eine Variante davon exprimieren. Solche Zellen umfassen transiente oder
vorzugsweise stabil modifizierte höhere eukaryontische Zelllinien,
wie Säugerzellen
oder Insektenzellen, niedere eukaryontische Zellen, wie Hefe und
(beispielsweise filamentöse)
Pilzzellen, oder prokaryontische Zellen wie bakterielle Zellen.
-
Es
ist auch möglich,
dass die erfindungsgemäßen Proteine
in einer Zelllinie oder auf einer Membran, wie zum Beispiel in einem
Baculovirus-Expressionssystem, transient exprimiert werden. Solche
Systeme, die dazu ausgelegt sind, die erfindungsgemäßen Proteine
zu exprimieren, sind auch im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung
enthalten.
-
Erfindungsgemäß kann die
Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids
durch Züchten
mikrobieller Expressionswirte, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Polynukleotiden
transformiert wurden, in einem herkömmlichen Nährstoff-Fermentationsmedium durchgeführt werden.
-
Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Wirtszellen können
unter Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik gezüchtet werden.
Für jede
Kombination von einem Promotor und einer Wirtszelle sind Kulturbedingungen
verfügbar,
die zur Expression der DNA-Sequenz führen, die das Polypeptid codiert. Nach
Erreichen der gewünschten
Zelldichte oder des gewünschten
Titers des Polypeptids wird die Züchtung beendet, und das Polypeptid
wird unter Verwendung bekannter Verfahren gewonnen.
-
Das
Fermentationsmedium kann ein bekanntes Kulturmedium umfassen, das
eine Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Maltose, Melassen, Cellulose, β-Glucan usw.),
eine Stickstoffquelle (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid
usw.), eine organische Stickstoffquelle (z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton
usw.) und anorganische Nährstoffquellen
(z. B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen usw.) enthält. Gegebenenfalls
kann ein Induktor (beispielsweise Cellulose, β-Glucan, Maltose oder Maltodextrin)
enthalten sein.
-
Die
Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirtes
und/oder auf den regulatorischen Anforderungen des Expressionskonstrukts
basieren. Geeignete Medien sind dem Fachmann bekannt. Wenn gewünscht, kann
das Medium zusätzliche
Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber potenziell
verunreinigenden Mikroorganismen begünstigen.
-
Die
Fermentation kann über
einen Zeitraum von 0,5–30
Tagen durchgeführt
werden. Die Fermentation kann ein Chargen-, ein kontinuierliches
oder ein Fed-Batch-Verfahren,
geeigneterweise bei einer Temperatur im Bereich zwischen 0°C und 45°C und zum
Beispiel bei einem pH von 2 bis 10 sein. Bevorzugte Fermentationsbedingungen
beinhalten eine Temperatur im Bereich zwischen 20°C und 37°C und/oder
einem pH-Wert zwischen 3 und 9. Die geeigneten Bedingungen werden
gewöhnlich
auf Basis der Auswahl des Expressionswirtes und des Proteins, das
exprimiert werden soll, gewählt.
-
Wenn
nötig,
können
die Zellen nach der Fermentation aus der Fermentationsbrühe mithilfe
von Zentrifugation oder Filtration entfernt werden. Nachdem die
Fermentation beendet wurde, oder nach der Entfernung der Zellen
kann das erfindungsgemäße Polypeptid
dann gewonnen und, wenn gewünscht,
gereinigt und durch herkömmliche
Mittel isoliert werden.
-
D. Verwendungen der Polypeptide und Verfahren
der Aufbereitung von Pflanzen oder Cellulose-haltiger Materialien
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide,
die β-Glucanase-(oder Cellulase-)Aktivität besitzen,
können
verwendet werden, um Pilze- oder Pflanzenmaterial einschließlich Pflanzen-Zellstoff
und Pflanzenextrakte, zu behandeln. Z. B. können sie verwendet werden,
um Getreide, Gemüse,
Früchte
oder Extrakte davon zu behandeln. Sie können in den Wasch-Zusammensetzungen
(Flüssigkeit
oder Feststoff, beispielsweise Pulver) und/oder in Detergens-Zusammensetzungen
verwendet werden. Das erfindungsgemäße Polypeptid wird mit geeigneten
(festen oder flüssigen)
Trägern
oder Verdünnungsmitteln
einschließlich
Puffern kombiniert, so dass man eine Zusammensetzung/ein Enzym-Präparat produziert.
Das Polypeptid kann an einen Träger
gebunden oder damit gemischt werden, beispielsweise auf einem festen
Träger
immobilisiert. So stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren
Aspekt eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein Polypeptid der
Erfindung. Dieses kann in einer Form sein, die für das Verpacken, den Transport
und/oder die Aufbewahrung, geeignet ist, vorzugsweise wo die Glucanase-Aktivität beibehalten
wird. Zusammensetzungen schließen
Pasten, Flüssigkeits-,
Emulsions-, Pulver-, Flocken-, Granulat, Pellet- oder eine andere
Extrudat-Form ein.
-
Die
Zusammensetzung kann zudem zusätzliche
Bestandteile wie eine oder mehrere Enzyme, z. B. Pektinasen, einschließlich(beispielsweise
Endo)-arabinanase
und Rhamnogalacturonase, andere Cellulasen, Xylanasen, Galactanasen,
Mannanasen und/oder Xyloglucanasen umfassen. Das Polypeptid wird
gewöhnlich entweder
in flüssiger
oder in trockener Form stabil formuliert. Gewöhnlich wird das Produkt als
Zusammensetzung gebildet, die gegebenenfalls z. B., einen Stabilisierungs-Puffer
und/oder ein Konservierungsmittel umfasst. Die Zusammensetzungen
können
auch andere Enzyme umfassen, die Pflanzenmaterial oder Cellulose spalten
können,
Z. B. andere Cellulasen, beispielsweise (β-D)-Glucanasen. Für bestimmte
Anwendungen können
Immobilisierung des Enzyms auf einer festen Matrix oder Einbringen
auf oder in feste Träger-Teilchen
bevorzugt werden. Die Zusammensetzung kann auch eine Vielzahl anderer
Pflanzenmaterial-abbauender Enzyme umfassen, z. B. (andere) Cellulasen
und andere Pektinasen.
-
Die
Polypeptide und die Zusammensetzungen der Erfindung können folglich
in einem Verfahren zur Verarbeitung von Pflanzenmaterial verwendet
werden, um die Cellulose-Komponenten (beispielsweise β-D-Glucan)
der Zellwände
des Pflanzen- oder Pilzmaterials abzubauen oder zu modifizieren.
So stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein
Verfahren zum Abbau oder Modifizieren einer Pflanzenzelle oder -cellulose
bereit, wobei das Verfahren das Zusammenbringen der Pflanzen-, Pilzzelle oder
Cellulose mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung der Erfindung
umfasst.
-
Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Verarbeiten eines Pflanzenmaterial
bereit, wobei das Verfahren das Zusammenbringen des Pflanzenmaterials
mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung der Erfindung umfasst,
um die Cellulose im Pflanzenmaterial zu abzubauen oder zu modifizieren.
Vorzugsweise ist das Pflanzenmaterial ein Pflanzen-Zellstoff oder
Pflanzenextrakt.
-
Insbesondere
umfasst der Abbau vorzugsweise das Spalten von β-Glucan-Untereinheiten einer
Cellulose-Komponente
der Pflanzen-Zellwand. Das Pflanzenmaterial ist vorzugsweise ein
Getreide, Gemüse, Frucht
oder Gemüse-
oder Frucht-Zellstoff oder -extrakt. Die vorliegende Erfindung stellt
weiter ein verarbeitetes Pflanzenmaterial bereit, erhältlich durch
Zusammenbringen eines Pflanzenmaterials mit einem Polypeptid oder
einer Zusammensetzung der Erfindung.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Reduzieren der
Viskosität
eines Pflanzenextrakts bereit, wobei das Verfahren das Zusammenbringen
des Pflanzenextrakts mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung
der Erfindung in einer Menge umfasst, die die im Pflanzenextrakt
enthaltene Cellulose (oder β-D-Glucan)
effektiv abbauen kann.
-
Pflanzen
und Cellulose-haltige Materialien umfassen Pflanzen-Zellstoff, Teile
von Pflanzen und Pflanzenextrakte. Im Kontext dieser Erfindung ist
ein Extrakt von einem Pflanzenmaterial eine beliebige Substanz, die
vom Pflanzenmaterial durch die Extraktion (mechanisch und/oder chemisch),
Verarbeiten oder durch andere Trenntechniken hergeleitet werden
kann. Der Extrakt kann Saft, Nektar, Basis oder daraus hergestellte Konzentrate
sein. Das Polypeptid kann bei (beispielsweise der gesamten) Verflüssigung
und/oder (vorgeschrittenen) Mazerierung, beispielsweise bei der
Herstellung von (Frucht-)Säften
verwendet werden. Das Pflanzenmaterial kann Gemüse, Karotten, Sellerie, Zwiebeln,
Hülsenfrüchte oder
hülsenartige
Pflanzen (Sojabohnenöl, Sojabohne,
Erbsen) oder Frucht, beispielsweise, Kernfrucht- oder Samenfrucht
(Äpfel,
Birnen, Quitte etc.), Trauben, Tomaten, Zitrusfrucht (Orange, Zitrone,
Limette, Mandarine), Melonen, Pflaumen, Kirschen, schwarze Johannisbeeren,
Johannisbeeren, Himbeeren, Erdbeeren, Moosbeeren, Ananas und andere
tropische Früchte,
Bäume und
Teile davon (beispielsweise Blütenstaub,
von Kiefern) oder Getreide (Hafer, Gerste, Weizen, Mais, Reis) umfassen
oder davon hergeleitet werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
folglich verwendet werden, um Pflanzenmaterial einschließlich Pflanzen-Zellstoff
und -pflanzenextrakte zu behandeln. Sie können auch verwendet werden,
um flüssige
oder feste Nahrungsmittel oder essbare Nahrungsmittelbestandteile
zu behandeln.
-
Gewöhnlich werden
die erfindungsgemäßen Polypeptide
als Zusammensetzung/Enzym-Präparat
verwendet, wie oben beschrieben. Die Zusammensetzung wird im Allgemeinen
dem Pflanzen-Zellstoff hinzugefügt,
erhältlich
z. B. durch mechanisches Verarbeiten, wie Zerstoßen oder Mahlen von Pflanzenmaterial.
Die Inkubation der Zusammensetzung mit der Pflanze wird gewöhnlich für eine Zeit
von 10 Minuten bis 5 Stunden, wie 30 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise
für etwa
1 Stunde durchgeführt.
Die Verarbeitungstemperatur ist vorzugsweise 10–55°C, beispielsweise von 15 bis
25°C, optimalerweise
etwa 20°C,
und man kann 10–300
g, vorzugsweise 30–70
g, optimal etwa 50 g Enzym pro Tonne zu behandelndes Material verwenden.
Sämtliches) Enzym(e)
oder ihre verwendeten Zusammensetzungen können dem Pflanzen-Zellstoff
nacheinander oder gleichzeitig hinzugefügt werden. Je nach der Zusammensetzung
des Enzym-Präparates
kann das Pflanzenmaterial zuerst mazeriert (beispielsweise zu einem
Püree)
oder verflüssigt
werden. Mit den Polypeptiden der Erfindung können die Verarbeitungsparameter,
wie die Ausbeute der Extraktion, Viskosität des Extraktes und/oder Qualität des Extraktes
verbessert werden.
-
Alternativ
oder zusätzlich
zum Obengenannten, kann ein Polypeptid der Erfindung dem rohen Saft
hinzugefügt
werden, der durch Pressen oder Verflüssigen des Pflanzen-Zellstoffs
erhalten wird. Die Behandlung des Rohsafts wird ähnlich wie der Pflanzen-Zellstoff
in Bezug auf Dosierung, Temperatur und Haltezeit durchgeführt. Wieder
können
andere Enzyme wie die, die vorher besprochen werden, enthalten sein.
Typische Inkubationsbedingungen sind wie im vorhergehenden Absatz
beschrieben. Sobald der Rohsaft mit den Polypeptiden der Erfindung
inkubiert worden ist, wird der Saft dann zentrifugiert oder (ultra-)filtriert,
um das Endprodukt zu produzieren.
-
Eine
Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält, kann
auch während
der Herstellung der Frucht- oder Gemüse-Pürees verwendet werden.
-
Das
erfindungsgemäße Polypeptid
kann auch beim Brauen, bei der Weinproduktion, Destillation oder Backen
verwendet werden. Es kann folglich bei der Herstellung alkoholischer
Getränke
wie Wein und Bier verwendet werden, um z. B. die Filtrierbarkeit
oder die Klarheit des Weins zu verbessern. Beim Backen kann das Polypeptid
die Teigstruktur verbessern, seine Klebrigkeit oder Geschmeidigkeit ändern, das
Laibvolumen und/oder Krumenstruktur verbessern.
-
Das
erfindungsgemäße Polypeptid
kann beim Brauen verwendet werden. Beim Brauen können Filtrationsprobleme bei
den Zusammensetzungen des Getreideansatzes (mash bill) entstehen,
welche übermodifiziertes
Malz umfassen, aufgrund der Anwesenheit von β-Glucanen, das bei hohen Temperaturen
freigesetzt wird. Die Verringerung der Geschwindigkeit der Stammwürze-Filtration
kann eins der Hauptprobleme sein, auf die man stößt. Zusätzliche Probleme sind kolloidale
Stabilität
und Trübung
im fertigen Bier. Diese können
durch die gleichen Kohlenhydratkomplexe, besonders während des
Brauens unter hoher Schwerkraft verursacht werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide
können
die Filtrierbarkeit der Würze
verbessern, z. B. nach dem Maischen. Auf diese Weise kann weniger
Stammwürze-Flüssigkeit
in den verbrauchten Körnern
behalten werden, und die Ausbeute des Extraktes kann verbessert
werden. Eine leistungsfähigere
Filtration kann eine erhöhte
Leistungsfähigkeit
der Brauerei ergeben. So können
im allgemeinen die erfindungsgemäßen Polypeptide
der Erfindung verwendet werden, um die Filtrierbarkeit- oder Filtrationsrate
von (beispielsweise fertigem) Bier zu verbessern.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
auch die Trübung
während
der Bierherstellung verhindern oder zumindest abschwächen. β-Glucane
die sich in den Endospermwänden
von Getreide befinden, können
in das fertige Bier übertragen
werden. Dieses kann Trübung
und Verlust der Klarheit verursachen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide
können
die Ansammlung der Teilchen aufgrund der Hydrolyse von β-Glucan verhindern
oder mindestens abschwächen.
Folglich können
die erfindungsgemäßen Polypeptide
verwendet werden, um die kolloidale Stabilität von (beispielsweise fertigem)
Bier zu erhöhen.
-
Die
Polypeptide finden in einer Anzahl von Industriegebieten wegen ihrer
Glucanase-Aktivität
Verwendung. Diese können
nicht nur die Alkohol-Produktion,
sondern auch Biomethanierung, Brotherstellung und Backen, Zahnpflege
(z. B. dentale oder orale Zusammensetzungen), Behandlung von Gewebe,
Kleidung oder Lederherstellung, Papierherstellung, pharmazeutische
Produkte, Tee, Herstellung oder Behandlung von Textilien, Detergens-
oder Waschzusammensetzungen und Behandlung von Abfall einschließen. Ein
Aspekt der Erfindung ist folglich ein Lebensmittel oder ein Nahrungsmittel,
das das Polypeptid umfasst, wie ein alkoholisches Getränk, Brot,
Teig oder Tee. Das Polypeptid kann zu geeigneten Zusammensetzungen
für beliebige
Verwendungen formuliert werden. Das Polypeptid kann in einer wässrigen Zusammensetzung
zugegen sein (z. B. heißem
Wasser), vorzugsweise mit einem oder mehreren Fungiziden, damit
das Pflanzenmaterial (z. B. Knollen) behandelt wird, insbesondere
um parasitische Insekten, Milben und Nematoden zu bekämpfen.
-
Während die
erfindungsgemäßen Polypeptide
Glucan abbauen können,
kann es Lebensmitteln oder Nahrungsmitteln (z. B. durch Verbrauch
durch Menschen) hinzugefügt
werden. Es ist bekannt, dass lösliches β-D-Glucan mit der Abnahme
des Serumcholesterins und der Triglyzeride einhergeht, und folglich
können
die erfindungsgemäßen Polypeptide
verwendet werden, um Serumcholesterin- und -triglyzeridspiegel in
Menschen oder Tieren, z. B. in den hyperlipämischen Individuen zu senken.
Die Erfindung umfasst folglich die pharmazeutischen und veterinärmedizinischen
Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Polypeptid und den pharmazeutisch
oder veterinärmedizinisch
verträglichen
Träger
umfassen. Die Polypeptide können
folglich bei der Herstellung eines Medikaments zum Vorbeugen oder
Behandeln von Hyperlipämie,
oder hohen Serumcholesterin- und Triglyzeridspiegeln oder daraus
resultierenden Störungen
verwendet werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
auch Antipilzaktivität
aufweisen. Sie können
Pilzzellwände
abbauen und können
folglich für
Pilz-Zellwand-Lysis eingesetzt werden, um die Zellen zu öffnen. Dieses kann
intrazelluläre
Proteine freisetzen. Bei solch einem Weg können die Polypeptide verwendet
werden, um Hefe- und/oder
Pilz-Extrakte herzustellen.
-
E. Tierfutter
-
Die
Erfindung betrifft zudem Nahrungsmittel oder eine Tierfutter-Zusammensetzung,
die eine oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide umfassen. Das
Polypeptid kann im Futter in einer Konzentration zugegen sein, die
von seiner natürlichen
Konzentration verschieden ist. Bevorzugte Mengen sind von 0,1 bis
100, wie 0,5 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 mg pro Kilogramm Futter.
-
Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Zubereitung einer Tierfutter-Zusammensetzung,
umfassend das Hinzufügen
eines erfindungsgemäßen Polypeptids
zu einer oder mehreren essbaren Futtersubstanz(en) oder Bestandteil(en).
Die Polypeptide können
der Tierfutter-Zusammensetzung
separat von Futtersubstanzen oder -bestandteilen, einzeln oder in
Verbindung mit anderen Futtermitteladditiven hinzugefügt werden.
Das Polypeptid kann ein integraler Teil von einer der Futtersubstanzen
oder Bestandteile sein.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
auch zu cellulosereichen Tierfuttern zugefügt werden, um den Abbau der
Pflanzenzellwand zu verbessern, die zu einer verbesserten Nutzung
der Pflanzenährstoffe durch
das Tier führt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide
können
dem Futter oder der Silage hinzugefügt werden, wenn Quell- oder
Nassfutter bevorzugt werden. Vorteilhafterweise können die
erfindungsgemäßen Polypeptide
weiterhin Cellulose im Futter in vivo abbauen. Von Pilzen abgeleitete
Polypeptide der Erfindung haben insbesondere im Allgemeinen niedrigere
pH-Wert-Optima und können
wichtige Nährstoffe
in einer solchen sauren Umgebung wie dem Magen eines Tiers freisetzen.
Die Erfindung erwägt
folglich auch (beispielsweise Tier-)Futter oder Nahrungsmittel,
die ein oder mehrere Polypeptide der Erfindung umfassen.
-
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
auch während
der Produktion von Milchersatzstoffen (oder Milchaustauscher) aus
Sojabohne verwendet werden. Diese Milchersatzstoffe können von
Menschen und Tieren verzehrt werden. Ein typisches Problem während der
Herstellung dieser Milchersatzstoffe ist die hohe Viskosität des Sojabohnenschlamms,
was dazu führt,
dass eine nicht wünschenswerte
Verdünnung
der Aufschlämmung
auf eine Konzentration der trockenen Feststoffe von 10 bis 15% nötig wird.
Ein Enzym-Präparat,
das ein erfindungsgemäßes Polypeptid
enthält,
kann vor oder während
der Verarbeitung der Aufschlämmung
hinzugefügt
werden, so dass die Verarbeitung bei einer höheren Konzentration (gewöhnlich 40
bis 50%) trockener Feststoffe möglich
wird. Das Enzym kann auch bei der Herstellung schmackhafter Produkt(e),
verwendet werden, beispielsweise aus der Sojabohne.
-
Die
Zusammensetzung kann zusätzlich
(besonders bei der Formulierung zur Verwendung in Tierfutter) einen
oder mehrere Ionophore; Oxidationsmittel, Tenside, pansengeschützte Aminosäuren, Enzymverstärker oder
Enzyme umfassen, die im Magen-Darm-Trakt von zu fütternden
Tieren natürlich
produziert werden können.
-
Bei
Zugabe zu Futter (einschließlich
Silage) für
Wiederkäuer
oder monogastrische Tiere (z. B. Geflügel oder Schweine) können die
Futter Getreide, wie Gerste, Weizen, Mais, Roggen oder Hafer oder
Getreide-Nebenprodukte
wie Weizenkleie oder Maiskleie oder andere Pflanzenmaterialien wie
Sojabohnen und andere Hülsenfrüchte umfassen.
Das oder die Enzym(e) können
den Abbau der Pflanzenzellwände
erheblich verbessern, was zur besseren Nutzung der Pflanzenährstoffe
durch das Tier führt.
Demzufolge können
Wachstumsrate und/oder Futterverwertung verbessert werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide
können
dem Futter (direkt oder als Additiv oder Bestandteil) beigefügt werden
oder behandelte Cellulose (beispielsweise Glucan) kann stattdessen
zugegeben werden.
-
Ein
besonders bevorzugtes Verfahren für die (exogene) Addition von β-Glucanase
ist die Zugabe des erfindungsgemäßen Polypeptids
als transgenes Pflanzenmaterial und/oder (beispielsweise transgenen)
Samen. Das Polypeptid kann folglich durch heterologe Genexpression
synthetisiert worden sein, z. B. kann das Gen, welches das gewünschte Enzym
codiert, in einen Pflanzen-Expressionvektor, unter Steuerung der
passenden Pflanzen-Expressionssignale, beispielsweise einem gewebespezifischen
Promotor, wie einem samenspezifischen Promotor kloniert werden.
Der Expressionsvektor, der das Gen enthält, das das Polypeptid codiert,
kann anschließend
in Pflanzenzellen umgewandelt werden, und umgewandelte Zellen können zur Regeneration
in vollständige
Pflanzen selektiert werden. Die so erhaltenen transgenen Pflanzen
können
gezüchtet und
geerntet werden, und jene Teile der Pflanzen, die das heterologe
(zur Pflanze) Polypeptid enthalten, können in eine der Zusammensetzungen
eingeschlossen werden, und zwar entweder als solche oder nach weiterer
Verarbeitung. Allgemeine Verfahren für die (heterologe) Expression
der Enzyme (in transgenen) Pflanzen, einschließlich Verfahren für samenspezifische
Expression der Enzyme, sind bekannt23. Das
heterologe Polypeptid kann im Samen der transgenen Pflanzen enthalten
sein, oder es kann in anderen Pflanzenteilen wie Wurzeln, Stämmen, Blättern, Holz,
Blüten,
Borke und/oder Frucht enthalten sein. Die Pflanze kann eine Monokotyledone
oder ein Dikotyledone sein. Geeignete Pflanzen umfassen Getreide,
wie Hafer, Gerste, Weizen, Mais und Reis. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynukleotid
stabil im Pflanzengenom integriert.
-
Die
Zugabe des Polypeptids in Form von transgenem Pflanzenmaterial,
beispielsweise im transgenen Samen, kann die Verarbeitung des Pflanzenmaterials
erfordern, damit das Enzym verfügbar
wird, oder zumindest seine Verfügbarkeit
verbessern. Solche Verarbeitungstechniken können verschiedene mechanische
(beispielsweise Mahlen und/oder Schleifen) Techniken oder thermomechanische
Behandlungen wie Extrusion oder Expansion umfassen.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft folglich auch ein Verfahren zur Förderung
des Wachstums und/oder der Futterverwertung in einem monogastrischen
Tier oder Nichtwiederkäuer,
wobei das Verfahren das Verfüttern
des erfindungsgemäßen Polypeptids
an das Tier umfasst. Geeignete Tiere schließen Nutztiere, monogastrische
Tiere und/oder Nichtwiederkäuer
wie Schweine (oder Ferkel), Geflügel
(wie Hühner,
Truthähne),
Kälber oder
Kalbfleisch oder im Wasser (beispielsweise im Meer) lebende Tiere
(z. B. Fisch) ein.
-
Tests auf Cellulose-abbauende Enzyme
-
Auch
innerhalb der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids bei
Screening-Verfahren zur Identifiaktion von Verbindungen, die als
Agonisten oder Antagonisten dienen können, die die β-Glucanase
modulieren können.
Allgemein ausgedrückt
können
solche Screening-Verfahren das Zusammenbringen eines erfindungsgemäßen Polypeptids
mit einer Test-Verbindung und dann Messen der Aktivität oder Inkubieren
eines erfindungsgemäßen Polypeptids
mit einer Testsubstanz und dann Nachweisen jeglicher Modulation
der β-Glucanase-Aktivität umfassen.
Mittel, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden,
können
auch durch Bindungsassays identifiziert werden.
-
Die
Modulatoraktivität
kann nachgewiesen werden, durch Zusammenbringen von Zellen, die
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
exprimieren, mit einer zu untersuchenden Substanz und Überwachen
der Wirkung, die durch die Polypeptide vermittelt wird. Die Zellen,
die das Polypeptid exprimieren, können in vitro sein und vorzugsweise
wird der Test in vitro mit den Zellen durchgeführt, die das rekombinante Polypeptid
exprimieren.
-
Die
hierin beschriebenen Tests und Substrate ermöglichten die Identifikation
und Bestätigung
der β-Glucanase-Aktivität. Jedoch
können
diese Tests verwendet werden, um andere Cellulose-abbauende Enzyme
nachzuweisen, unabhängig
davon, ob sie β-Glucanase-Aktivität haben
oder nicht. Das Substrat, das für diesen
Test verwendet werden kann, kann β-Glucan
umfassen.
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Test zur Identifikation
oder zum Nachweis eines Polypeptids, das Cellulose abbauen kann.
Die Aktivität
kann eine Glucanase (beispielsweise β-Glucanase) oder Cellulase oder
Xyloglucanase sein. Der Test kann umfassen:
- (a)
Bereitstellen des im vorhergehenden Absatz beschriebenen Substrats
als Substrat für
eine Kandidatenverbindung (gewöhnlich
ein Polypeptid); und
- (b) Zusammenbringen des Substrats mit der Kandidatenverbindung
und Nachweisen, ob irgendwelche Kohlenhydrate produziert wurden.
-
Die
Menge dieser Kohlenhydrate kann gemessen werden. Bei Bedarf können sie
dann mit der Menge der Kohlenhydrate verglichen werden, die in einem
Kontrollexperiment bei Fehlen der Kandidatenverbindung produziert
werden.
-
Die
oben genannten Tests können
eingesetzt werden, um Modulatoren der β-Glucanase-Aktivität zu identifizieren.
-
Bevorzugte
Merkmale und Eigenschaften von einem Aspekt der Erfindung sind auf
einen anderen Aspekt entsprechend anwendbar.
-
Die
Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Beispiele beschrieben,
die lediglich veranschaulichend und nicht einschränkend sein
sollen.
-
BEISPIELE
-
Allgemeine Verfahren
-
Molekulare
Standard-Klonierungstechniken wie DNA-Isolation, Gelelektrophorese, enzymatische
Restriktionsmodifikationen der Nukleinsäuren, Southern-Analysen, E. Coli-Transformationen,
Kolonie-Lifts und Filter-Hybridisierungen etc., wurden mit Standardtechniken
durchgeführt1,2. Synthetische Oligodesoxynukleotide wurden
von ISOGEN Bioscience (Maarssen, die Niederlande) erhalten. DNA-Sequenzanalysen wurden mit
einer Applied Biosystems 373A DNA Sequenziervorrichtung, entsprechend
den Herstellerangaben durchgeführt.
-
DNA-Markierung
und Hybridisierungen wurden entsprechend den ECLTM Direkt-Nukleinsäuremarkierungs- und -nachweissystemen
(Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, England) oder entsprechend
den radioaktiven Markierungs-Standardtechniken durchgeführte.
-
Beispiel 1: RNS-Isolation aus T. emersonii
und Synthese von cDNA
-
Der
T. emersonii-Stamm CBS 393.64 wurde unter Cellulase-induzierenden
Bedingungen fermentiert. An einigen Zeitpunkten wurden Myzel und
Kulturüberstände durch
Filtration mittels Miracloth Filtrationsumwicklung geerntet. Myzel
wurde ausgiebig mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und zwischen
Papiertüchern
zusammengedrückt,
um überschüssiges Wasser
zu entfernen. Myzel von ausgewählten
Zeitpunkten (bezogen auf Cellulasemessungen in den Kulturüberständen) wurde
sofort in flüssigem
Stickstoff gefroren und mit Mörser
und Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen. Das resultierende Pulver
wurde in ein steriles 50-ml- Rohr überführt und gewogen: für jede 1–1,2 g gemahlenes
Myzes wurden 10 ml TRIzol-Reagens (Gibco/BRL) zugegeben (Maximum
25 ml pro Röhrchen).
Das Myzel-Pulver wurde sofort durch heftiges Mischen (Vortexing, 1
Minute) solubilisiert, gefolgt von 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
unter gelegentlichem Mischen. 0,2 (Original TRIzol) Volumen Chloroform
(somit 2 ml für
alle ursprünglich
verwendeten 10 ml TRIzol) wurden zugegeben, im Vortexer gemischt
und bei Raumtemperatur für
10 min belassen. Anschließend
wurde das Gemisch bei 4°C,
6000 g für
30 Minuten zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches
Röhrchen überführt und
die Gesamt-RNA wurde durch Zugabe von 0,5 (Original TRIzol) Volumen
Isopropylalkohol (somit 5 ml Isopropylalkohol für alle ursprünglich verwendeten
10 ml TRIzol) ausgefällt.
Nach 10 Minuten Fällung
bei Raumtemperatur, wurde die RNA durch Zentrifugierung für 30 Minuten
bei 6000 g gewonnen. Bei Entfernen des Überstands wurde das RNA-Pellet mit einem
Volumen von 70% Ethanol gespült.
Nach Entfernen des Ethanols wurde das RNS-Pellet an der Luft getrocknet.
Das getrocknete RNS-Pellet wurde in 3 ml GTS(100 mM Tris-Cl, pH
7,5, 4 M Guanidiumthiocyanat, 0,5% Natriumlaurylsarcosinat)-Puffer
gelöst.
10 μl RNA-Lösung wurde verwendet, um Qualität und Konzentration
der Nukleinsäuren
zu bestimmen.
-
Northern-Analyse
wurde durchgeführt3 und die isolierte RNA weiter gereinigt1,3. Zur Isolation von mRNA wurde ein modifiziertes
Protokoll (mittels Gravitationsfluss anstelle von Zentrifugierung)
des PHARMACIA Reinigungs-Kit (Kat. Nr.. 27-9258-02) verwendet3. Für
cDNA-Synthese wurde das STRATAGENE cDNA-Synthese KIT entsprechend den Herstelleranweisungen
verwendet, außer
einer Anzahl von Optimierungen zur Verwendung der pGBFIN-Vektoren,
wobei die Hauptänderungen,
wie vorher beschrieben sind3.
-
Die
Menge der synthetisierten cDNA wurde durch TCA-Fällung geschätzt und anschließend über Elektrophorese
in alkalischen Agarose-Gelen analysiert3.
-
Beispiel 2: Herstellung einer cDNA-Bank
aus T. emersonii mRNA
-
Der
in Beispiel 1 erhaltene cDNA-Pool wurde stumpfendig gemacht, mit
Adaptern ligiert und mit Restriktionsenzym gespalten3.
-
Die
Klonierung der cDNA in den Expressionvektor pGBFIN-11 (siehe
WO-99/32617 für den Aufbau dieses
Vektors), erfordert die Anwesenheit einer EcoRI-Spaltstelle am 5'- und einer XhoI-Spaltstelle am 3'-Ende der cDNA. Folglich wurden das Erststrang-Priming-Oligonukleotid
und die verwendeten Adaptersequenzen (Pharmacia) gewählt, damit
die Vorbedingungen erfüllt
waren, die für
den Expressionvektor eingestellt wurden.
-
Die
erhaltenen cDNAs wurden über
Größenfraktionierung
durch eine SEPHAROSE CL-2B-Matrix getrennt, auf deren Größe die einzelnen
erhaltenen Pools über
nicht-denaturierende Gelelektrophorese analysiert wurden3. Zwei Pools von cDNAs, erhalten über Ausschlussgrenzen
bei 0,5 kb beziehungsweise 1,0 kb wurden für den Aufbau der cDNA-Bank
in pGBFIN-11 gewählt.
Für pGBFIN-11,
wurde ein Pool des vollständig doppelt-gespaltenen
(EcoRI-XhoI) pGBFIN-11-Vektors (Hintergrundligierung < 1%) hergestellt.
Die gewählten cDNA-Pools
wurden in pGBFIN-11-Vektor ligiert und in E. coli XL10-Gold-Bakterienzellen
transformiert, so dass zwei primäre
cDNA-Banken erzeugt wurden. Die Transformationsfrequenzen der beiden
Pools waren jeweils > 1,0 × 106. Von einer Fraktion beider E. coli cDNA-Banken
wurden Kolonien statistisch selektiert und Plasmid-DNA wurde isoliert.
Die Analyse dieser Plasmid-DNA
zeigte, dass beide cDNA-Banken Insert-Prozentsätze zwischen 90 und 95% hatten.
-
Darüber hinaus
wurden Kolonie-Lifts von einer Fraktion der Bank durchgeführt, und
die erzeugten Filter wurden nachher mit T. emersonii gpdA-Gen hybridisiert,
das das Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Gen
codiert. Anschließend
wurde Plasmid-DNA isoliert und über
Restriktionsanalyse wurde gezeigt, dass alle Plasmide einzelne Inserts
in der korrekten Orientierung enthielten. Die Sequenzierung der
5'-Enden der cDNAs
innerhalb dieser T. emersonii-gpdA-enthaltenden
Plasmide zeigte, dass > 85%
volle Länge
aufwies.
-
Beispiel 3: Transformation der Expressionsbank
zu A. niger
-
DNA
wurde aus der E. coli cDNA-Bank, wie früher beschrieben isoliert. Gesamtplasmid-DNA
wurde 4 Stunden lang bei 37°C
mit NotI gespalten, um von E. coli stammende Plasmidsequenzen zu
entfernen. Nach Reinigung wurde die DNA in sterilem entmineralisiertem
Wasser gelöst.
-
Mehrfache
A. Niger DS2978-Transformationen wurden durchgeführt3 mit
1,5 × 107 B 3,0 × 107 Protoplasten und 10 μg Plasmid-DNA pro Transformation.
Transformanten wurden auf die Anwesenheit des amadS-Selektionsmarkers
durch Anzucht auf Acetamid als einzige N-Quelle selektiert. Da sowohl
der amdS-Selektionsmarker als auch die cDNA-Expressionkassette auf
dem integrierenden Fragment zugegen sind, ist Wachstum auf Acetamid
hinweisend für
die Anwesenheit einer cDNA-Expressionkassette.
-
Nach
ungefähr
7–10 Tagen
Inkubation bei 30°C,
wurden 10000 Transformanten gereinigt: die Aspergillus niger-Transformanten
wurden mittels Roboter (FlexysJcolony Picker Automater) von den
Transformationsplatten in Mikrotiterplatten (MPs) mit 96 Vertiefungen
mit 150 μl
pro Vertiefung mit erstarrtem Selektionsmedium (SM) (pro 1000 ml:
0,52 g KCl, 1,52 g K2HPO4,
0,52 g MgSO4, 20 g Glucose, 1 g Acetamid,
0,1 M MES-Puffer, 15 g Agar, 1 ml Spurenenelementlösung [Spurelementlösung (enthaltend
pro 1 Liter): 2,2 g ZnSO4/7H2O,
1,1 g H3BO3, 0,5
g FeSO4/7H2O, 0,17
g CoCl2/6H2O, 0,16
g CuSO4/5H2O, 0,15
g NaMoO4/2H2O, 5,0
g EDTA, pH 6,5] pH 5,5, überführt. Die
Transformanten wurden 5 Tage bei 34°C auf SM gezüchtet. Der so erzeugte Satz
von MPs wurde verwendet, um 1) MTPs anzuimpfen für das Wachstum und den darauf
folgenden Enzymnachweis und 2) Sicherungs-Platten (BPs) der cDNA-Bank zu erstellen,
die bei –80°C aufbewahrt wurden.
-
Beispiel 4: Analyse der T. Emersonii-Expressionsbank
-
5
Tage alte gewachsene MPs wurden als Replikationschablone verwendet
und auf Platten mit frischem Selektionsmedium (SM), enthaltend pro
Liter: 0,52 g KCl, 1,52 g K2HPO4,
0,52 g MgSO4, 20 g Glucose, 1 g Acetamid,
0,1 M MES-Puffer, 15 g Agar, 1 ml Spurenelementlösung [Spurenelementlösung (enthaltend
pro 1 Liter): 2,2 g ZnSO4/7H2O,
1,1 g H3BO3, 0,5
g FeSO4/7H2O, 0,17
g COCl2/6H2O, 0,16
g CuSO4/5H2O, 0,15
g NaMoO4/2H2O, 5,0
g EDTA, pH 6,5] pH 5,5, replikaplattiert.
-
Direkt
nach dem Animpfen wurden die Platten bei 34°C für 48 Std. inkubiert. Anschließend wurden
die Platten mit einer Topagar enthaltenden Carboxymethylcellulose
(CMC) (5 g Agarose, 0,5 g CMC (Sigma ref. C4888), hergestellt in
1000 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 7) überschichtet. Sobald sich der
Topagar verfestigte, wurden die Platten bei 65°C 4 Stunden lang belassen. Für die Sichtbarmachung
der Aktivität
wurden die Platten mit einer der Kongo-Rot-Lösung
(10 g Kongo-Rot in 1000 ml Phosphatpuffer pH-Wert 7) für 15 Minuten gefärbt. Die
Färbe-Lösung wurde
verworfen, und die Platten wurden mit 1 M NaCl (58,44 g in 1 Liter
destilliertem Wasser) gewaschen. Dieser letzte Schritt wurde zweimal
wiederholt. Positive Klone erschienen durch Formen eines blassen
Clearance-Halos auf einem roten Hintergrund.
-
Die
positiven Cellulaseklone aus diesem ersten Screening (das ein klares
Halo nach dem Kongo-Rot-Screening
zeigt) wurden auf frischem SM-Medium erneut überimpft und für 5 Tage
bei 34°C
gezüchtet. Die
so erhaltene Matrizenplatte wurde dann auf Selektionsmedium und
auf Selektionsmedium, das 0,075 (W/V) AZCL-Cellulose (Megazyme Katalog-Nr.
I-AZCEL) enthielt, replikaplattiert. Die SM-Platten wurden behandelt
und wie vorher beschrieben (Wachstum bei 34°C und anschließendes Screening über eine
Cellulose-enthaltene Überschichtung
und Kongo-Rot-Färbung)
bewertet, wohingegen die SM-AZCEL-Cellulose-Platten bei 34°C für 48 Std.
inkubiert und dann weiter bei 65°C
für 8 Std.
inkubiert wurden. Die SM-AZCL-Cellulose-Platten wurden vor und nach
der Hochtemperaturinkubation ausgewertet. Die positiven Cellulase-Klone
ergeben einen diffusen blauen Halo.
-
Schließlich wurden
20 positive Cellulase-Klone identifiziert. Cellulase-produzierende
Aspergillus-Transformanten,
wie im Xylanase-Plattentest identifiziert, wurden über Schüttelflaschen-Fermentation gezüchtet3. Mediumproben wurden nach 5 Tagen Fermentation
entnommen und auf Cellulase-Aktivität, wie später beschrieben,
analysiert.
-
Beispiel 5: Genetische Analyse positiver
Transformanten
-
Die
positiven (bestätigten)
identifizierten Transformanten wurden auf flüssigem Medium gezüchtet, das
Myzel wurde geerntet und die Gesamt-(chromosomale)DNA wurde mit
dem Puregene Isolation System (Biozym B. V.) für DNA-Isolation aus filamentösen Pilzen
isoliert. DNA-Isolation und Reinigung wurden entsprechend dem Hersteller-Protokoll
durchgeführt,
jedoch geringfügig
modifiziert: Die Protein-Fällungschritte
3 und 4 wurden wiederholt.
-
Chromosomale
DNA wurde als Matrize in einer PCR-Reaktion mit Primer 12207 (SEQ ID NR:
8) und 11937 (SEQ ID NR: 7) verwendet, um das oder die Inserts,
die in der in chromosomaler DNA integrierten Expressionkassette
vorhanden sind, zu amplifizieren.
-
Direkte
PCRs an Transformanten wurden entsprechend einer angepassten Version
eines bekannten Protokolls4 durchgeführt, in
dem das erhaltene Myzel nachher mit GlucanexJ (Novo Nordisk) bei
5 mg/ml Konzentrationen anstelle mit NOVOzyme behandelt wurde.
-
PCR-Reaktionen
enthielten eLONGaseTM B-Puffer (Life-Technologies,
Breda, Niederlande), dNTPs (jeweils 200 μM), 1 μl eLONGase Enzym-Mischung, 1–5 μl Matrize
und 10–30
pmol jedes Oligos in einem Endvolumen von 50 μl. Die optimale Menge Oligos
wurde experimentell für
jeden gekauften Ansatz bestimmt. Im Durchschnitt wurden 10 bis 30
pmol verwendet. Die Reaktionen wurden mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 1 × (2 Minuten);
94°C, 35 × (1 min
94°C, 1
min 55°C,
6 min 72°C),
1 × (7
min 72°C).
Die Proben wurden auf Agarose-Gele
zur Analyse der PCR-Produkte geladen.
-
Das
so erhaltene PCR-Produkt wurde in E. coli per2.1-Klonierungsvektor
(Invitrogen, entsprechend den Herstelleranweisungen) subkloniert,
so dass das Plasmid pGBCEA-1 erhalten wurde.
-
Das
subklonierte PCR-Produkt wurde sequenziert. Die resultierende Nukleotidsequenz
der codierenden Region ist in SEQ ID NR: 1 dargestellt, und die
abgeleitete Aminosäuresequenz
des Proteins in SEQ ID NR: 2. Dieses Protein wurde als CEA bezeichnet.
-
Beispiel 6: Viskosimetrisches Screening
einer cDNA-Expressionsbank
mit dem Hamilton Viscorobot.
-
Viskosimetrische Messungen
-
Kapillarviskosimeter
sind der am häufigsten
verwendete Typ Viskosimeter, die für die Messungen viskoser Flüssigkeiten
verwendet werden. Im Allgemeinen wird die interessierende Flüssigkeit
durch ein Kapillarrohr unter einer bekannten Druckdifferenz geleitet.
Dann wird die Strömungsgeschwindigkeit,
normalerweise durch Aufzeichnen der Zeit, die ein gegebenes Volumen
Flüssigkeit
benötigt,
um eine Graduierungsmarkierung zu passieren, gemessen. Andere Typen
Viskosimeter pressen die Flüssigkeit
durch eine Kapillare mit einer festgelegten Strömungsgeschwindigkeit und der
dadurch erzeugte Druckabfall, der über der Kapillare produziert
wird, wird gemessen, um die Flüssigkeitsviskosität zu bestimmen.
Der gesteuerte enzymatische Abbau polymerer viskoser Lösungen kann
verwendet werden, um die Enzymaktivität zu bestimmen. Vorausgesetzt, das
numerische Verhältnis
zwischen der Viskosität
und der Konzentration der Flüssigkeit
ist bekannt, können kinetische
Parameter wie die Michaelis-Menten-Konstante, geschätzt werden.
-
I. Das Nachweissystem
-
(a) Die Einstellung des Hamilton-Viscorobots
-
Der
Hamilton-Pipettier-Roboter (Hamilton Workstation Microlab 2200,
Hamilton Company, Reno, USA) wurde durch ein Software-Programm mit
der Bezeichnung Eclipse (Hamilton Company) gesteuert. Diese Software
ermöglicht
dem Benutzer, den Sondenarm auf eine bestimmte Position innerhalb
des Hamilton-Arbeitsbereichs
zu leiten. Es wurde ein Standard-Viscotest-Eclipse-Programm
entwickelt. Dieses Programm arbeitet auf MTPs mit 96 Vertiefungen,
wo jede Vertiefung einzeln adressiert werden kann. Die Spritzen
werden verwendet, um Probenflüssigkeit
an einer Eclipse-spezifizierten Position durch die Nadelöffnung anzusaugen oder
zuzuführen.
Die Ansaug- und Abgabegeschwindigkeit (in s/ml) sowie die Ansaug-
und Abgabevolumen (in μl)
wurden willkürlich
spezifiziert. Durch Realisieren von Rack-Definitionen kann auf
mehrfache Reagensbehälter
in einer leistungsfähigen
und zeitsparenden Weise zugegriffen werden. Der Übertrag von Probenflüssigkeit
von einem Pipettierschritt zum nächsten
wurde vermieden, indem man Eclipse anwies, die Schläuche mit
System-Flüssigkeit
zu spülen.
Die Ansauggeschwindigkeit von 10 s/ml (manchmal 15 s/ml) war geeignet, um
die meisten Viskositäten
zu unterscheiden, indem man Peakhöhen verfolgte. Normalerweise
wurden 200–250 μl Probenflüssigkeit
angesogen und zugeführt.
-
(b) Hamilton-Einstellung
-
Das
Ansaugen der Probenflüssigkeit
erzeugt einen Druckabfall über
die wassergefüllten
Schläuche. Die
Größe des Druckabfalls
hängt von
der Ansaug-(oder Kolben-Bewegung)-Geschwindigkeit und von der Viskosität der Probenflüssigkeit
ab. Der größte Druckabfall
wird in der Nadelspitze verursacht, da der Radius am kleinsten ist
(ungefähr
0,3 mm). Das Ansaugen der Probenflüssigkeit verursacht Druckwechsel,
die vom T-Stück zum Druckwandler
weitergegeben werden. Der Wandler (Dépex B. V., de Bilt, Niederlande)
wandelt die Größe des Unterdruckes
in einen elektrischen Strom um. Der elektrische Strom wird vom Datataker
einmal pro Sekunde gelesen und anschließend im Speicher des Datatakers
in einem digitalen Format gespeichert. Ein an den Datataker angeschlossener
Computer ermöglicht
(über die
Delogger-Software) den Download des Datataker-Speichers in Dateien.
Sie können
wiederum durch allgemeine Tabellenkalkulationsprogramme (wie Microsoft
Excel) gelesen und analysiert werden. Da der Druck über die
Zeit gemessen wurde, kann der endgültige Ausgang durch Aufzeichnen
der Größe des Unterdruckes
(in mV) gegen die Zeit (in Sekunden) sichtbar gemacht werden. Nach
Verstellung des T-Stücks
zu einer Position direkt hinter der Nadel, ist das Drucksignal vom
Ansaugvolumen weniger abhängig.
-
(c) Die Herstellung von Eichkurven ermöglichte
die Ermittlung der Viskosität
jeder möglichen
Flüssigkeit.
-
Entsprechend
dem Gesetz von Poisseuille sollte der gemessene Druckabfall direkt
proportional zur Viskosität
sein; da gilt:
-
Mit
dieser Formel kann man den Millivoltunterdruckausgang auf die unbekannte
Viskosität
der Probenflüssigkeit
beziehen. Dieses erfolgte durch Ansaugen eines definierten konstanten
Volumens Kalibrierungsflüssigkeit
(normalerweise Glycerin, da es einen breiten Bereich von Viskositäten abdeckt
und es sich in einer Newton'schen
Weise verhält)
bei verschiedenen Konzentrationen. Der so verursachte Unterdruck
bezieht sich auf den mV-Ausgang durch einen unbekannten Faktor F.
Da die absoluten Viskositäten
der verschiedenen Glycerinkonzentrationen bekannt sind, produziert
ein Plot des mV-Unterdruckausgangs
für verschiedene
bekannte Glycerinkonzentrationen gegen die bekannten absoluten Viskositäten der
gleichen Glycerinkonzentrationen eine gerade Linie durch den Ursprung
(da P = (mV)·Fη/k).
-
(d) Eclipse-Programm verwendet für Full-Scale-Screening.
-
Ein
einzelner Messzyklus besteht aus dem Ansaugen von 250 μl Probe und Überstand-Substratgemisch)
mit einer Ansauggeschwindigkeit von 10 s/ml. Vor dem Ansaugen der
Probenflüssigkeit,
wurden 40 μl Luft
angesogen, um System von der Probenflüssigkeit zu trennen. Sobald
das Ansaugen der Probenflüssigkeit beendet
war, erfolgte die Abgabe von 290 μl
Probe und Luft. Dieser Messzyklus wurde sechsmal wiederholt und
gefolgt von einem 5 ml Waschschritt, um die Schläuche zu säubern.
-
II. Test-Entwicklung
-
(e) Herstellen des optimalen Substratgemischs
aus Pektin und Xylan zum Screening
-
Das
Verwenden von mehr als einem viskosen Substrat hatte mehrere Vorteile.
Man kann auf unterschiedliche Typen der Enzyme gleichzeitig screenen.
Dieses sparte eine große
Menge Bemühung
und Zeit, während
weniger Substrat erfordert wurde. Zusätzlich zum Haferspelzen-Xylan wurde es entschieden,
Pektin als das zweite Substrat zu verwenden. Eine 1:1-Lösung von
1% Pektin und 7% Haferspelzen-Xylan schien für das Screening am besten zu
sein. Da es proportional wenig Klone in der Bank gab, hatten die
meiste Peaks eine ungefähre
Höhe von
435 mV. Bei einer positiven Xylanase-Probe wurde das gesamte oder
das meiste Xylan abgebaut, damit nur 0,5% Pektin übrig blieb.
Folglich produzierte ein positiver Xylanase-Klon eine Peakhöhe von 280
mV. Im Falle eines Pektin-Abbauklons war die Peakhöhe 220 mV.
-
(f) Bestimmung der minimalen Xylanase-Aktivität, die zum
Erfassen mit dem Hamilton-Viscoroboter nötig war.
-
Das
Screening erfolgte mit sehr kleinen Volumen Substrat und Überstand,
da eine einzelne Mikrotiterplatte-Vertiefung höchstens 360 μl enthält; Je mehr Überstand
zugefügt
wurde, desto mehr wurde weiterhin das Substrat verdünnt, und
desto mehr wurde die Ausgangsviskosität verringert. 250 μl 6% Hafer-Spelzen-Xylan wurde
in die Vertiefungen eines MTP zugeführt. Die Verdünnung einer
Reihe einer Referenzxylanase (A. tubigensis-Xylanase mit einer Aktivität von 685.400
EXU/g, wobei 1 EXU = 4,53 Mol reduzierender Zucker/min/g) wurde
hergestellt und 30 μl
von jeder Verdünnung
wurden dem Substrat hinzugefügt.
Nach Inkubation für
24 Stunden bei 50°C
wurde die Viskosität
jeder Probe gemessen. Die niedrigste nachweisbare Enzymkonzentration
entspricht 53,6 ng/ml oder 0,0367 EXU/ml. Folglich ermöglicht die
Addition von 20 μl Überstand
zu 300 μl
Substrat die Abfragung extrem niedriger Enzymaktivitäten.
-
(g) Einstellen des Screenings zur Identifikation
von thermostabilen Enzymen.
-
Zur
Aufnahme von nur hitzebeständigen
Enzymen aus der Bank und zur Vermeidung von Interferenz der Wirts-A. Niger-Enzymaktivität, wurden
die Platten mit den Klonen, die die thermostabilen Enzymkandidaten
enthielten, einer Wärmebehandlung
unterworfen. Das System wurde mit leeren Wirtsstämmen, Wirtsstämmen, die
thermolabile Enzyme exprimieren und Wirtsstämmen, die thermostabile Enzyme
exprimieren, validiert. Nach dem Wachstum der Stämme und Produktion des Enzyms
wurden die MTP-Platten bei 72°C
für 30 Minuten
erhitzt. Anschließend
wurden 20 μl Überstand
zu 300 μl
6% Haferspelzen-Xylan hinzugefügt.
Zusammen mit negativen Kontrollen (Zugabe von 20 μl Wasser),
wurden die Platten, welche die Proben enthielten, mit Klebeband
verschlossen und bei 60°C
in einem Ofen inkubiert. Die hohe Temperatur kann jede thermostabile
Enzymaktivität
erhöhen
aber zerstört
sowohl die Hintergrund-Wirt-A. Niger-Enzym-störende-Aktivität als auch
die nicht-hitzebeständigen Enzymaktivitäten, die
durch die Bank exprimiert werden. Nach 20 Stunden Inkubation, wurden
keine bemerkenswerten Peaks für
die thermolabilen Xylanase-Klone gefunden, was zeigt, dass die Wirts-Xylanase-Aktivität gänzlich inaktiviert
worden ist. Klone des wärmeunbeständigen Xylanase-Enzyms
von Aspergillus Niger waren zudem als Kontrolle eingeschlossen.
In diesem Fall konnte keine Restaktivität ermittelt werden, während andererseits
die als Kontrolle enthaltene hitzebeständige Xylanase noch aktiv war.
Hitze-Inaktivierung für
30 Minuten bei 72°C
und Probeninkubationszeiten von 24 Stunden oder weniger ermöglichten
uns, hitzebeständige
T. emersonii-Xylanasen
spezifisch zu ermitteln.
-
III. Screening der cDNA-Expressionsbank
mit dem Hamilton Visco-Roboter
-
(h) Replikation der cDNA ExpressionsBank
und Expression der Bank.
-
Ein
Reproduktionszyklus beinhaltet die doppelte Beimpfung von Selektionsmedium
(SM), enthaltend pro Liter: 0,52 g KCl, 1,52 g K2HPO4, 0,52 g MgSO4,
20 g Glucose, 1 g Acetamid, 0,1 M MES-Puffer, 15 g Agar, 1 ml Spurenelementlösung [Spurenelementlösung (enthaltend
pro 1 Liter): 2,2 g ZnSO4/7H2O,
1,1 g H3BO3, 0,5
g FeSO4/7H2O, 0,17
g CoCl2/6H2O, 0,16
g CuSO4/5H2O, 0,15
g NaMoO4/2H2O, 5,0
g EDTA, pH 6,5] pH 5,5 und flüssiges
Wachstumsmedium (GM) (enthaltend pro Liter 70 g Glucose, 25 g Casein-Hydrolysat,
12,5 g Hefeextrakt, 1 g KH2PO4,
0,5 g K2SO4, 2 g
MgSO4, 0,03 g ZnCl2,
0,02 g CaCl2, 0,01 g MnSO4,
0,3 g FeSO4, pH 5,6). Die Bank wurde in
Standard-MTPs aufbewahrt, worin sporulierte rekombinante A. Niger-Kolonien
in jeder Vertiefung auf SM in Anwesenheit von 10% Glycerin gezüchtet wurden.
Während
der Aufbewahrung wurden diese Platten (Masterplatten, MPs) gefroren
gehalten (–80°C). Vor der
Replikation der MPs wurden sie für
eine Std. in einer sterilisierten Abzugshaube gehalten, um mikrobielle
Kontamination zu vermeiden. Die Replikation der MPs erfolgte mit
dem PBA-Flexys-Kolonie-Replicator. 5 Tage alte gewachsene Masterplatten
wurden als Replikationsmatrize verwendet und auf MTPs mit 96 Vertiefungen,
gefüllt
mit flüssigem
Wachstumsmedium (GM) replikaplattiert. Die frisch beimpften SM-Agarplatten wurden
in einem Inkubator bei 32°C
untergebracht und anschließend
bei –80°C nach Zugabe
von 150 μl
10% Glycerin pro Vertiefung aufbewahrt. Die GM-Produktionsplatten
wurden in einem wassergesättigten
Tomtec Quadrastor Shaker 96000 (32°C) inkubiert. Die Platten zeigten
kein wachsendes Myzel nach 2 bis 3 Tagen. Die GM-Platten wurden
für 6 Tage
inkubiert.
-
(i) Probennahme der Überstände nach Beendigung des Wachstums.
-
Nach
6 Tagen Wachstum wurde das verbleibende flüssige GM-Wachstumsmedium (mit
extrazellulären Expressionsprodukten)
extrahiert und in frische MTPs überführt. Die Überstände wurden
in frische MTPs mit einem 4-Kanal-Tecan-Pipettierroboter überführt. Das
durchschnittliche Volumen des erhaltenen Überstandes war zwischen 120
und 140 μl.
Diese Überstandplatten
wurden eingefroren und anschließend
auf Xylanase-Aktivität untersucht.
-
(j) Präparate
für das
Full-Scale-Screening.
-
Die Überstandplatten
aus der Expressionsbank wurden entfrostet und in einem geschlossenen
Wasserbad bei 72°C
für 35–40 min
untergebracht. Mit einer 12-Kanalpipette
und kommerziell vorbereiteten Pipettenspitzen in Wegwerf-Mikrotiterplatte-Format-Racks (geliefert
von Eppendorf) wurden 20 μl Überstand
in die Substratgemisch enthaltende Mikrotiterplatte überführt, die
vor der Zugabe der Überstände auf
60°C erhitzt wurden.
Das Substratgemisch bestand aus einem 1:1-Gemisch aus 1% Pektin
(siehe (k) unten) und 7% Haferspelzen-Xylan (siehe (1) unten) mit
einem End-pH-Wert
von 4,12. Die Test-MTPs wurden mit 310 ml Substrat/Vertiefung gefüllt. Mischen
der Überstände mit
dem Substratgemisch wurde durch Rühren der Pipettenspitzen in
den Probenvertiefungen direkt nach der Abgabe der Überstände erreicht.
Anschließend
wurden die Platten in einen 60°C-Ofen
für einen
Inkubationszeitraum von 18–24
Stunden überführt. Nach
der Inkubation ließ man
die MTPs abkühlen
und screente sie unter Verwendung eines Hamilton-Visco-Roboters
(Hamilton Company, Reno, USA) hinsichtlich der Viskosität.
-
(k) Herstellung von 1% Pektin, pH-Wert
4,1
-
Ein
Citronensäure-Phosphatpuffer
(Mc Ilvaine Puffer) wurde durch Zugabe von 0,2 M Na2HPO4-Lösung
zu 250 ml 0,1 M Citronensäurelösung, bis
ein pH-Wert von 5,5 erhalten wurde, hergestellt. Dies wurde mit
destilliertem Wasser auf einen Liter aufgefüllt, und der pH-Wert wurde
erneut eingestellt, wenn nötig.
Eine 0,5%ige Pektinlösung
wurde durch langsame Zugabe von 0,5 g hoch-methyliertem Pektin (Typ
Ruban Brun) zu einem Gefäß, das 50
ml des obigen Mc-Ilvaine-Puffers enthielt, und 25 ml destilliertem
Wasser bei 60°C hergestellt.
Heftiges Rühren
stellte sicher, dass das Pektin gut gelöst war. Dies wurde auf 100
ml aufgefüllt, und
der pH-Wert wurde wieder überprüft. Das
hier verwendete Pektin senkt den pH-Wert der Lösung, so dass unter diesen
Bedingungen die Lösung
einen pH-Wert von 5,1 hatte. Wenn die Pektinlösung trübe war, war es nützlich,
die Lösung
bei 15 g 15 Minuten zu zentrifugieren, um jegliche ungelösten Partikel
zu entfernen.
-
(1) Herstellung eines 7%igen alkalibehandelten
Haferspelzen-Xylans, pH-Wert 4,1
-
20
ml 2 M NaOH wurden in einem 150-ml-Becher auf 60°C erhitzt. In einem getrennten
Becher wurden 7 g Haferspelzen-Xylan (von der Firma Sigma) zu 20
ml Wasser gegeben, so dass sich eine hellbraune, teigige Masse bildete.
Wenn nötig,
wurde mehr Wasser zugegeben, aber insgesamt nicht mehr als 30 ml.
Unter Verwendung eines Stahllöffels
wurde diese Wasser-Haferspelzen-Xylan-Masse
langsam zu der heißen
NaOH-Lösung
gegeben. Eine starke Rührvorrichtung
war zum Lösen
des Xylans in der Hydroxidlösung
erforderlich, wobei die Temperatur bei festen 60°C gehalten wurde. Nachdem das
gesamte Xylan sich gelöst
hatte, wurde die Lösung
dunkelbraun und ähnelte
einem sehr viskosen klaren Sirup. Dann wurde der Rest des Wassers
zugegeben, so dass eine Gesamtmenge von 50 ml zugegeben wurde. Man
ließ die
Lösung
abkühlen,
und 4 N HCl wurden zugegeben, bis der gewünschte pH-Wert erreicht war
(gewöhnlich
pH-Wert 4,1–4,2).
Die Lösung
wurde auf 100 ml aufgefüllt
und der pH-Wert erneut eingestellt, wenn nötig. Zentrifugation bei 20000
g für 15
Minuten bei 10°C
erzeugte einen klaren gelblichen Überstand (dessen Viskosität von der
Anfangsmenge an zugegebenem Haferspelzen-Xylans abhing).
-
(m) Screening der Bank
-
Das
Ergebnis des Screenings der in A. niger klonierten Talaromyces emersonii-Bank
war 119 Graphen, die mit den getesteten 119 MTPs übereinstimmten.
Jeder Graph zeigte die Viskosität
der 96 Vertiefungen, die als 96 Peaks dargestellt werden, welche
den Unterdruck pro Vertiefung in mV messen. Die Graphen wurden hinsichtlich
niedriger Peaks analysiert, die eine verringerte Viskosität anzeigen.
Peaks, die niedriger sind als die durchschnittliche Peakhöhe, wurden
für den
erneuten Test ausgewählt.
Einige Platten erzeugten sehr wenig Schwankung, so dass die Auswahl
möglicher
positiver Klone für
den erneuten Test leicht war. Andere Platten zeigten ein großes Ausmaß an Schwankung,
deshalb wurden oft mehr als 5 oder 6 mögliche Klone für den erneuten
Test ausgewählt.
Um über
eine positive Kontrolle zu verfügen,
wurden nach der Inkubation 10 μl
einer Endoxylanase zu einer zufälligen
Platte an einer festen Position zugegeben. Aus den positiven Kontrollen
wurde gefunden, dass man eine Peakhöhe zwischen 240 und 280 mV
erwarten sollte, wenn eine Xylanase-Aktivität vorliegt.
-
Die
Platten der Talaromyces-Bank, die getestet wurden, enthielten auch
fünf bestätigte thermostabile Xylanase-Klone,
die zuvor unter Verwendung eines Farbstoffnachweisassays auf Basis
der Solubilisierung von Farbstoffen, die chemisch an das unlösliche polymere
Substrat gebunden waren, gefunden wurden. Ohne Ausnahme wurden diese
fünf Klone
unabhängig
mit dem viskosimetrischen Assay bereits in der ersten Screening-Runde
gefunden. Alle Peaks für
die bekannten Klone waren auf einem viel niedrigeren Niveau als
die restlichen Peaks (bei 250 mV). Insgesamt wurden 118 Kulturvertiefungen
für den
erneuten Test ausgewählt,
wobei diejenigen mit zuvor gefundenen Xylanase-Klonen ausgenommen
sind.
-
(n) Erneuter Test von 118 mutmaßlichen
Klonen
-
Der
erneute Test basierte auf dem viskosimetrischen Assay gemäß dem Prinzip,
das bei dem vollen Screen angewendet wurde. Diesmal wurde jedoch
ein größeres Assayvolumen
verwendet, weil eine deutlichere Unterscheidung zwischen thermostabiler
Enzymaktivität
und unregelmäßigen niedrigen
Peaks vorgenommen werden konnte. Zwei große MTPs (2 ml/Vertiefung) wurden
mit 1,2 ml 9% Haferspenzen-Xylan gefüllt. Zu den ersten beiden Vertiefungen
jeder Reihe wurden 50 μl
Wasser zugegeben (negative Kontrolle). Zu der letzten Vertiefung
jeder Reihe wurden 50 μl
einer Referenz-Endoxylanase-Lösung
gegeben, damit man auch über eine
positive Kontrolle verfügte.
Die Vertiefungen 3 bis 11 jeder Reihe wurden für den erneuten Test mutmaßlicher
Xylanase-Klone verwendet (Zugabe von 50 μl Überstand). Nach Mischen und
Inkubation für
24 Stunden bei 60°C
wurden die Viskositäten
mit einem speziell zugeschnittenen Eclipse-Programm gemessen (Ansaugvolumen:
800 μl,
Ansauggeschwindigkeit: 10 s/ml).
-
Mehrere
positive Klone wurden identifiziert, weil ihre Peaks auf dem gleichen
Niveau waren wie die positiven Kontrollen, was den vollständigen Abbau
von Xylan zeigt. Insgesamt wurden dreizehn mögliche Stämme im erneuten Viskositätstest identifiziert.
Die cDNA-Inserts
wurden direkt mittels PCR-Amplifikation, die an chromosomaler DNA
durchgeführt
wurde, in pCR2.1 kloniert. Aus 12 Bank-Stämmen wurden sechzehn cDNA-Inserts unter Verwendung
von pwo-Polymerase und Primersatz 2 (11937/12207, SEQ ID NR: 7 und
8) erhalten. Die Orientierung des cDNA-Inserts im pCR2.1-Vektor wurde mittels
XhoI-Spaltung bestimmt, die sich im Vektor und am 3'-Ende der cDNA befand.
Eine DNA-Sequenzanalyse
wurde am 5'-Ende
der cDNA-Inserts durchgeführt.
-
Der
erneute Test auf mögliche
Pektin-abbauende Enzyme wurde auf ähnliche Weise wie für die Xylanase
durchgeführt,
ausgenommen dass 1% Pektin anstelle von 9% Haferspenzen-Xylan verwendet
wurde. Nur zehn mögliche
Klone wurden erneut getestet, bei denen es sich um diejenigen handelte,
die sehr niedrige Peaks in der primären Screening-Runde ergeben
hatten, aber keinerlei Aktivität
während
des erneuten Xylanase-Tests zeigten. Reproduzierbar erzeugte nur
ein Klon ein Pektin-abbauendes Enzym. Der gemessene Druckwert von
200 mV entspricht der Viskosität
von reinem Wasser. Weil das verwendete Pektin nicht vollständig methyliert
war, kann es durch eine thermostabile Polygalacturonase, Pektatlyase
oder Pektinlyase abgebaut worden sein.
-
(o) Nutzen von Viscoscreen
-
Die
Entwicklung eines viskosimetrischen Screeningverfahrens zur Identifikation
thermostabiler Enzyme wurde durch drei Schlüsselfaktoren erleichtert. Erstens
ermöglichte
die Möglichkeit
einer Thermoinaktivierung von nativer Wirts-Xylanase-Aktivität eine viel
schnellere Entwicklung geeigneter Reaktionsbedingungen. Zweitens
die Tatsache, dass, wenn Klone mit bekannten thermolabilen Enzymen
getestet wurden, die Thermoinaktivierung sämtliche Aktivität zerstörte, so
dass nur die thermostabileren Enzyme erfasst wurden. An dritter
Stelle erhöhten
die erhöhten
Temperaturen die Enzymaktivitäten,
so dass das Screening noch sensitiver wurde. An Haferspenzen-Xylan
(Sigma) wurden elf Klone identifiziert, welche die Viskosität signifikant
verringern konnten, und an Pektin wurden ein definitiver Klon identifiziert.
Zusätzlich
wurden fünf
thermostabile Xylanase-Klone, die zuvor identifiziert worden waren,
unabhängig
erneut gefunden.
-
Beispiel 7: Charakterisierung einer ersten
thermostabilen Talaromyces-emersonii-β-Glucanase (CEA) aus einer A.-niger-Transformante
-
Aktivitätsassays und Definitionen
-
Definition der Cellulase-PAHBAH-Einheit
(CPU)
-
Eine
Einheit der Cellulase-Aktivität
ist definiert als die Menge an Enzym, die benötigt wird, um ein μmol reduzierende
Zucker freizusetzen, die pro Minute bei pH-Wert 5,0 und 60°C bei einer
Substratkonzentration von 5% Carboxymethylcellulose (CMC) unter
Verwendung einer Glucose-Eichkurve produziert wird.
-
Die
Enzymaktivität
gemäß dem CPU-Verfahren
wurde gemessen, indem reduzierende Zucker unter Verwendung von 4-Hydroxybenzoesäurehydrazid
(PAHBAH) ermittelt wurde. Die Probe basiert auf Lever, M., Powell,
J. C., Killip, M., Small, C. W. (1973) J. Lab. Clin. Med. 82, 649–655 mit
einigen Modifikationen. Die Modifikation erfolgt an dem PAHBAH-Reagens
wie folgt: 0,05 M Trinatriumcitrat, 0,1 M Na2SO3, 0,02 M CaCl2,
0,5 M NaOH und 0,1 M p-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH). Der endgültige pH-Wert
betrug 12. Das Reagenz, das PAHBAH in alkalischer Lösung enthält und bei
Raumtemperatur aufbewahrt wird, sollte innerhalb von einem Tag verwendet
werden. Glucose wurde als reduzierender Referenz-Zucker (Kalibrationskurve)
verwendet. Für
die Kalibrationskurve dieses Assays lagen die Endkonzentrationen
an Glucose zwischen 0–300 mM.
Die CPU-Aktivität
wurde durch Mischen von 100 μl
Enzymlösung
mit 400 μl
5% CMC in 0,1 M Natriumacetat-Puffer
(pH-Wert 5,0) untersucht. Eppendorf-Gefäße mit dem Substrat (CMC) wurden
für 5 Minuten
bei 60°C
inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Enzymlösung gestartet.
Nach 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,0 ml PAHBAH-Reagens
gestoppt. Die Eppendorf-Gefäße wurden
für 5 Minuten
bei 100°C
erhitzt und dann auf Eis abgekühlt.
Die Proben wurden bei der geeigneten Geschwindigkeit zentrifugiert,
um jegliche festen Materialien abzuzentrifugieren (1 Minute bei
voller Geschwindigkeit in einer Beckman-Microfuge E). Die Extinktion
wurde bei 420 nm gemessen. Ein Leerwert wurde durch Zugabe von 100 μl 0,1 M Natriumacetat-Puffer
anstelle von Enzymlösung
hergestellt.
-
Definition der beta-Glucanase-Einheit
(BGU)
-
Eine
beta-Glucanase-Einheit ist die Aktivität, die benötigt wird, um 0,258 μmol reduzierende
Zucker (als Glucose-Äquivalente
gemessen) pro Minute bei pH-Wert 3,5 und 40°C bei einer Substratkonzentration
von 0,5% β-Glucan
aus Gerste freizusetzen.
-
Somit
wurde zusätzlich
zu der obigen Definition der Cellulase-(CPU-)Aktivität ein spezifischerer
Assay zur Ermittlung von β-Glucanase-Aktivität durchgeführt. Das
Prinzip des Assays ist die Geschwindigkeit, mit der die Viskosität einer
Lösung
von Gersten-β-Glucan
mittlerer Viskosität
(Megazyme, Australien, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101)
nach Zugabe einer bestimmten Menge an Enzym abnimmt. Gersten-β-Glucan mittlerer
Viskosität
(Megazyme, Australien) wurde in 0,425 M Natriumcitrat-Puffer pH-Wert 3,5 in einer Konzentration
von 6,25 mg/ml gelöst.
Das Substrat wurde 10 Minuten bei 40°C inkubiert. Anschließend wurde eine
kleine Menge Enzym (im Bereich von 0,005–0,062 Einheiten/ml) zugegeben,
und man ließ die
Reaktion ablaufen. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten wurde
die Viskosität
der Probe in Bezug auf eine Referenzprobe bestimmt, die mit einer
Standard-Endo-Glucanase
bekannter enzymatischer Aktivität
inkubiert wurde. Die absoluten Aktivitäten für den Standard wurden durch
ein reduzierender-Zucker-Verfahren
unter Verwendung von Fe-III-hexacyanid und 4,76 mg/ml Gersten-β-Glucan als
Substratanfangskonzentration bestimmt.
-
Definition der Endo-Xylanase-Einheit (EXU)
-
Die
Einheit der Xylanase-Aktivität
(EXU) ist als die Menge an Enzym (EndoI, Endo-1,4-β-Xylanase
aus Asp. niger, wie in
EP-A-0,463,706 (Gist-brocades
B. V.) beschrieben) definiert, die 4,53 μmol reduzierende Zucker (als
Xylose-Äquivalente
gemessen) pro Minute unter Assaybedingungen freisetzt. Die Assaybedingungen beinhalten:
5 mg/ml Arabinoxylan aus Weizenmehl (Megazyme, Australien, 2/11
Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) in 100 mM Natriumcitrat-Puffer
(pH-Wert 3,5), Temperatur von 40°C
bei einer Reaktionszeit von 60 Minuten. Die Reaktionen wurden durch
Zugabe von 1 M NaOH gestoppt. Der Nachweis erfolgte kolorimetrisch
bei 420 nm nach Inkubieren der Proben mit Fe-III-hexacyanid für 15 Minuten
in kochendem Wasser. Das Hexacyanoferrat-Reagens wurde durch Lösen von
1,17 g KFe (CN) und 19,5 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 1 Liter
Wasser hergestellt.
-
Zusätzlich zu
der obigen absoluten Bestimmung der Xylanase-Aktivität wurde
ein relatives Verfahren verwendet, das die Abnahme der Viskosität in einer
Lösung
von Weizen-Arabinoxylan (Megazyme, Australien, 2/11 Ponderosa Parade,
Warriewood NSW 2101) nach Zugabe einer bestimmten Menge an Enzym
verfolgte. Weizenarabinoxylan wurde in 0,425 M Natriumcitrat-Puffer (pH-Wert 3,5)
in einer Konzentration von 8,3 mg/ml gelöst. Das Substrat wurde bei
55°C für 10 Minuten
inkubiert. Anschließend
wurde eine kleine Menge Enzym (im Bereich von 0,01–0,05 Einheiten/ml)
zugegeben, und man ließ die
Reaktion ablaufen. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten wurde
die Viskosität
der Probe relativ zu einer Referenz bestimmt, die mit einem Aspergillus-niger-Endo-Xylanase-Standard
bekannter EXU-Aktivität
(
EP-A-0,463,706 )
inkubiert worden war. Die Absolutaktivitäten in EXU für den Standard
wurden durch das reduzierende-Zucker-Verfahren unter Verwendung
von Fe-III-hexacyanid, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Viskosität wurde
manuell unter Verwendung einer Haake-Fallball-Viskositätsapparatur bestimmt.
-
Definition der Cellulase-Einheit (CXU)
-
Die
Einheit der beta-Glucanase-Aktivität (BGU) ist definiert als die
Menge an Cellulase, die in einer Stunde eine Anzahl glykosidischer
Bindungen hydrolysiert, die zu der Produktion von 0,5 mg Glucose
unter den Assaybedingungen äquivalent
ist. Die Assaybedingungen umfassen: 9 mg/ml Carboxymethylcellulose
in 5 mM Natriumacetat-Puffer (pH-Wert = 4,6), Temperatur von 37°C. Freigesetzte
Glucose wurde durch das reduzierende-Zucker-Verfahren unter Verwendung
des DNS-Reagens bestimmt.
-
Zusätzlich zu
der obigen absoluten Bestimmung der Cellulase-Aktivität wurde
ein relatives Verfahren verwendet, das die Abnahme in der Viskosität einer
Lösung
von Carboxymethylcellulose nach Zugabe einer bestimmten Menge an
Enzym verfolgte. Carboxymethylcellulose wurde in 5 mM Natriumcitrat-Puffer (pH-Wert =
4,6) in einer Konzentration gelöst,
die von der Viskosität
der Charge abhängt.
Das Substrat wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde
eine kleine Menge Enzym zugegeben, und man ließ die Reaktion ablaufen. Nach
60 Minuten Reaktionszeit wurde die Viskosität der Probe relativ zu einer
Referenz bestimmt, die mit einem Standard bekannter CXU-Aktivität inkubiert
wurde.
-
Aktivität wrt pH
-
Die
T.-emersonii-β-Glucanase
wurde durch den (die) geeigneten A.-niger-Transformanten in Schüttelkolben
produziert, wie im Beispiel 3 beschrieben, nachdem das Wachstumsmyzel
durch Filtration entfernt worden war. Das Filtrat wurde für dieses
Experiment verwendet. Die Aktivität des Filtrats wurde bei verschiedenen pH-Wert-Werten bei einer
festen Temperatur von 60°C
gemessen. Die Aktivität
wurde gemäß dem CPU-Verfahren
gemessen. Anstelle der Verwendung eines festen pH-Werts von 5,0
wurde das CMC-Substrat mit einem Citrat-Puffer bei dem geeigneten
pH-Wert verdünnt,
um den pH-Wert der Messung zu erhalten. Das Experiment wurde zweimal
wiederholt, und die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 dargestellt.
Es wurde gefunden, dass der optimale pH-Wert des Enzyms zwischen pH-Wert 4,5
und 5,0 bei etwa pH-Wert 4,8 lag. Tabelle 1: pH-Wert-Profil bei 60°C
pH | Aktivität (μM Glucose/15
Minuten) bei 60°C
(doppelte Messungen) |
3 | 27,2 | 27,7 |
3,5 | 66,6 | 64,2 |
4 | 109,3 | 102,6 |
4,5 | 133,8 | 120,6 |
5 | 121,3 | 135,5 |
5,5 | 116,4 | 107,4 |
6 | 68,7 | 69,3 |
-
Aktivität wrt Temperatur
-
Die
Aktivität
dieser β-Glucanase
wurde dann bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Aktivitätsmessungen
wurden gemäß dem CPU-Verfahren
bei pH-Wert 4,0 durchgeführt.
Anstelle der Inkubation bei einer festen Temperatur von 60°C wurden
die Inkubationen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Es wurde
gefunden, dass das Temperatur-Optimum
zwischen 80°C
und 85°C
lag. Die T
opt scheint bei etwa 84°C zu liegen
(obwohl sie 82°C,
83°C oder
85°C sein
kann, je nachdem, wie die Geraden gezogen und zwischen den Datenpunkten
interpoliert werden). Tabelle 2: Temeraturprofil bei pH-Wert
4
Temperatur
(°C) | Aktivität (μM Glucose/15
Minuten) bei 60°C
(doppelte Messungen) |
60 | 87,8 | 102,1 |
70 | 156,4 | 154,6 |
80 | 208,5 | 213,1 |
90 | 185,4 | 176,4 |
-
Aktivität wrt andere Enzyme
-
Zusätzlich wurde
die Aktivität
bei 30–60°C unter Verwendung
des BGU-Verfahrens für
die β-Glucanase
gemessen und mit einer kommerziell erhältlichen zellfreien T.-reesei-Brühe mit Cellulase-
und Glucanase-Aktivität
als Referenz verglichen. Die zellfreie T.-reesei-Brühe bestand
aus einem Gemisch verschiedener Enzyme, worunter sich eine oder
mehrere β-Glucanasen
befinden, wobei aber diese Aktivitäten nicht charakterisiert worden
sind. Zum Vergleich der Aktivitäten
der erfindungsgemäßen T-emersonii-β-Glucanase und der T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen
wurden die Enzyme zu etwa gleicher Aktivität bei 40°C dosiert. Die Aktivität der T-emersonii-β-Glucanase
A bei 40°C
wurde auf 1 festgelegt, und somit sind die anderen Aktivitäten dazu relativ.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: relative Aktivität wrt T.-reesei-Enzyme
Temperatur
(°C) | Relative
Aktivität: β-Glucanase (CEA) | Relative
Aktivität:
T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen |
30 | 0,50 | 0,44 |
40 | 1,00 | 1,13 |
50 | 1,57 | 1,32 |
60 | 2,40 | 1,59 |
-
Bei
Temperaturen oberhalb von 40°C
begann die T.-reesei-Cellulase-/Glucanase-Aktivität verglichen mit
der T-emersonii-β-Glucanase
abzufallen. Oberhalb von 40°C
trennten sich die Aktivitäten,
wobei CEA aktiver war. Obwohl die relative Aktivität bei höheren Temperaturen
höher war,
wurde zudem bei mäßigen Temperaturen
die Aktivität
relativ zu dem T.-reesei-Gemisch
beibehalten. Dies zeigt den breiten Temperaturbereich, über den
die β-Glucanase
aktiv ist.
-
Reinigung und spezifische
Aktivität
-
Die
Reinigung der T-emersonii-β-Glucanase
ging von dem Filtrat aus. Etwa 25 ml zellfreie Brühe wurden
mit einer PD-10-Säule
entsalzt und auf eine Resource-Q-6-ml-Anionenaustauschsäule aufgebracht, die mit 10
mM Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,0) äquilibriert worden war. Die
Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 10–300 mM
Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,0) durchgeführt. (Linearer Gradient A nach
B; Flussrate: 6 ml/min; Laufzeit: 54 Minuten; Wellenlängenmonitor:
280 nm, 254 nm, 214 nm). Aktive Fraktionen wurden gesammelt (20
ml), mit Microsep-Konzentratoren (3,5 ml, 10 K) aufkonzentriert
und zweimal mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 5,0) gewaschen. Die
Reinheit der Fraktionen wurde mittels HPL-S (Größenausschlusschromatographie)
und SDS-PAGE analysiert.
-
Messungen der spezifischen Aktivität
-
Der
berechnete molare Extinktionskoeffizient der β-Glucanase bei 280 nm ist 81550
M–1·cm–1.
Die Proteinkonzentration des gereinigten Enzyms wurde aus E280-Messungen
unter Verwendung einer spezifischen Absorption von E2801cm =
2,33 für
1 mg/ml hergeleitet. Die spezifische Aktivität dem gereinigten Probe wurde in
BGU bestimmt (Substrat: Gersten-beta-Glucan) und betrug 1027 BGU/mg.
Unter Verwendung des CPU-Verfahrens betrug die spezifische Aktivität 628 Einheiten/mg.
Weil die Aktivität
gemäß dem viskosimetrischen
Verfahren eine hohe Zahl verglichen mit dem reduzierenden-Zucker-Verfahren lieferte,
wurde geschlossen, dass die T-emersonii-β-Glucanase
eine signifikante Endo-Glucanase-Aktivität aufweist.
Eine typische Endo-Glucanase zeigt eine sehr gute Leistung in einem
reduzierenden-Zucker-Assay,
während
sie eine sehr schlechte Leistung in dem viskosimetrischen Verfahren
zeigt.
-
Isoelektrischer Punkt
-
Eine
IEF-PAGE wurde wie folgt durchgeführt. Die Ausrüstung war
das Phast-System (Pharmacia Biotech), IEF 3-9-Phast-Gel (Pharmacia
Biotech). Die Gele wurden gemäß Standard-Phast-System-Verfahren durchgeführt und
gefärbt
(Coomassie). Der isolelektrische Punkt wurde auf einem Phast-Gel-IEF
3-9 bestimmt und stellte sich als 3,3 heraus.
-
Molekulargewichtsbestimmung
-
Eine
SDS-PAGE wurde wie folgt durchgeführt. Die Ausrüstung war
wiederum das Phast-System (Pharmacia Biotech), 12,5%ige homogene
Gele (Pharmacia Biotech); SDS-Puffer-Streifen (Pharmacia Biotech).
Probenbehandlung: Ein Volumen (5 Proben) Puffer (500 mM Tris-HCl,
pH-Wert 6,8, 10% SDS, 0,1% Bromphenolblau) wurde mit 4 Volumina
Probe gemischt und für
3 Minuten gekocht. Die Gele wurden gemäß Standard-Phast-System-Verfahren durchgeführt und
gefärbt
(Coomassie). Eine HPLC-Größenausschlusschromatographie
erfolgte unter Verwendung der Säule:
TSK G3000SW, Kat.-Nr. 05103 (TosoHaas). Verfahren: Die Elutionsmittel
waren: 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,0, Flussrate: 1 ml/min,
Laufzeit: 30 min, Wellenlängenmonitor:
280 nm. Deglykosylierung des Enzyms: Mische 5 μl gereinigtes Enzym (7 mg/ml)
mit 20 μl
0,5% SDS und 25 μl
1% β-Mercaptoethanol.
Dieses Gemisch wurde für
4 Minuten gekocht. Nach Abkühlen wurden
20 μl N-Glykosidase
F (500 U/ml) und 20 μl
3% Triton X-100 in 1 M Natriumphosphat-Puffer pH-Wert 7,0 zugegeben.
Dies wurde über
Nacht inkubiert, und die Deglykosylierung wurde mittels SDS-PAGE
analysiert.
-
Das
mittels SDS-PAGE-Gel und HP-S bestimmte Molekulargewicht erwies
sich als 43 kDa. Nach Deglykosylierung wurde mittels SDS-PAGE eine
gerade Bande bei 37 kDa beobachtet.
-
Thermostabilität
-
Die
T50-Thermostabilität
wurde mit den T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen
als Referenz bestimmt. T50 ist die Temperatur, bei der nach 20-minütiger Inkubation
50% der Aktivität
verbleibt. Tabelle 4 zeigt die Unterschiede in der T50-Thermostabilität zwischen
der gereinigten β-Glucanase
aus T. emersonii und dem T.-reesei-Cellulase-/Glucanase-Gemisch,
das zuvor in diesem Beispiel eingesetzt wurde (die Anfangsaktivität wurde
auf eins gesetzt: Die Enzyme wurden für 20 Minuten inkubiert, und
nach Abkühlen
wurde die Aktivität unter
Verwendung des CPU-Verfahrens gemessen). Jedes Experiment wurde
zweimal wiederholt, und deshalb zeigt Tabelle 4 doppelte Messungen.
Die T50-Thermostabilität
der gereinigten β-Glucanase
liegt bei etwa 93,4°C
und die T50-Thermostabilität
der T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen
bei etwa 64,9°C. Tabelle 4: Thermostabilität wrt T.-reesei-Enzyme
Temperatur
(°C) | Restaktivität (%) T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen | Restaktivität (%) β-Glucanase (CEA) |
40 | 97 | 98 | | |
50 | 96 | 100 | 100 | 99 |
60 | 85 | 83 | 100 | 99 |
70 | 14 | 14 | 98 | 95 |
75 | 0 | 0 | 93 | 96 |
80 | 0 | 0 | 88 | 90 |
85 | 0 | 0 | 89 | 94 |
90 | 0 | 0 | 65 | 64 |
110 | | | 0 | 0 |
-
Beispiel 8: Aktivitätsmessungen
-
Die
beiden Bank-Stämme,
die in dem Viscoscreen von Beispiel 6 unter Verwendung von Haferspenzen-Xylan
als Substrat identifiziert worden waren, wurden in Schüttelkolben
unter Verwendung des GM-Mediums fermentiert (die ursprünglichen
Stämme
wurden als AD009.21 und AD011.31 bezeichnet). Zusätzlich wurde
der als AD021.B6 bezeichnete Stamm (CEA) eingeschlossen, von dem
in den Beispielen 4 und 5 identifiziert worden war, dass er β-Glucanase-Aktivität exprimiert.
Mehrere Assays wurden durchgeführt,
und die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt. Überraschenderweise zeigten
die Stämme
AD009.21 und AD011.31 wenig Xylanase-Aktivität. Es scheint, als ob AD009.21
und AD011.31 stattdessen Cellulase-Aktivität aufweisen, obwohl die Klone
beim Viscoscreening unter Verwendung von Haferspenzen-Xylan identifiziert
wurden. Besonders βD009.21
ist sehr aktiv an Gersten-β-Glucan. Tabelle 5: Schüttelflaschenfermentierung von
Cellulase-Stämmen; Xylanase-(EXU/ml), β-Glucanase-(BGU/ml)
und Cellulase-(CXU/ml)Aktivität.
Stamm
(und Glucanase-Bezeichnung) | EXU/ml | BGU/ml | CXU/ml |
AD021.B6
(CEA) | < 10 | 160 | 524 |
AD009.21
(CEB) | < 10 | 884 | 254 |
AD011.31
(CEC) | < 10 | < 10 | 7 |
-
Die
Nachweisgrenzen wurden auf unter 10 für den EXU- und BGU-Assay und
5 für den
CXU-Assay eingestellt.
-
Die
DNA-Analyse an den Stämmen
AD009.21 und AD011.31 (wie vorstehend im Beispiel 6 beschrieben)
ergab zwei neue Glucanasen, die als CEB und CEC bezeichnet wurden.
Die Nukleotidsequenzen der codierenden Regionen sind die SEQ ID
Nr. 3 und 5 und die entsprechenden Aminosäuresequenzen die SEQ ID Nr.
4 bzw. 6.
-
Der
CEB-Stamm zeigt eine hohe β-Glucanase-Aktivität. Der CEA-Stamm
zeigt eine relativ hohe Cellulase-Aktivität verglichen mit dem CEB-Stamm.
Das Verhältnis
zwischen der β-Glucanase-Aktivität und der Cellulase-Aktivität ist für CEA und
CEB unterschiedlich. Der CEC-Stamm zeigt Cellulase-Aktivität, aber
seine β-Glucanase-
oder Xylanase-Aktivität war unter
der Nachweisgrenze in diesen Assays. Homologieuntersuchungen legen
jedoch eine β-Glucanase-Aktivität stark
nahe, und es wird angenommen, dass diese bei anderen pH-Werten viel
höher sein
kann.
-
Die
Verwendung von mehr als einem Substrat für das Screening ist durchführbar. Es
hat sich überraschenderweise
herausgestellt, dass anstelle von zwei Substraten gleichzeitig drei
verschiedene Substrate im Viscoscreen verwendet werden konnten.
Eines der Substrate war eine Glucosepolymer- Verunreinigung, wahrscheinlich Glucan-
oder Cellulose-Material.
Es wurde gezeigt, dass die Verwendung von Haferspenzen-Xylan-, Pektin-
und Cellulose-ähnlichem
Material zur Identifikation von drei Typen von Enzymen, Xylanasen,
Pektinasen und Cellulasen, bei einer Screening-Runde führte. Der
viskosimetrische Assay birgt einen großen Vorteil in Bezug auf den üblichen
Farbstoffnachweisassay. Der Farbstoffnachweisassay basiert auf chemisch
an ein Substrat gebundenen Farbstoffen. Diese Art des Substrates
ist nur für
wenige Verbindungen kommerziell erhältlich. Der viskosimetrische
Assay kann jedoch mit jeder Art des viskosen Substrats arbeiten,
sogar mit natürlichen,
die keinerlei chemische Vorbehandlung erfordern. Dieser Aspekt ist
wichtig, weil man unter einem kommerziellen und industriellen Gesichtpunkt
Enzymaktivitäten
an Substraten screenen kann, deren Viskositätsabnahme (d. h. Fruchtsäfte) oder
Viskositätszunahme
(d. h. Milchprodukte) von kommerzieller Bedeutung ist.
-
Beispiel 11
-
Ein
Vergleich einiger der molekularen und biochemischen Eigenschaften
der drei Glucanasen wird in der nachstehenden Tabelle bereitgestellt
Glucanase | MW
(nach Deglykosylierung) | Länge (Aminosaurereste) | Aktivität | Familie Nr.* | Optimaler
pH | PI | Optimale Temperatur |
CEA | 43
kDa (37 kDa) | 335 | 3.2.1.4 (Endo-Glucanase) | 5 (3D-Struktur: α8β8-TIM-Fass) | 4,8 | 3,3
(4,5+) | 85°C |
2.
CEB | 44
kDa+ | 414 | 3.2.1.4 (Endo-Glucanase) | 7; (3D-Struktur: β-Jelly-Roll) | | 4,2 | > 75°C |
CEC | 23
kDa+ | 222 | 3.2.1.4 (Endo-Glucanase) | 45 (3D-Struktur: gemischtes β-Fass | | 4,0 | > 75°C |
- *basierend auf der Glykosidhydrolase-(CAZy-)Klassifikation
- + aus der Aminosäuresequenz
vorausgesagt
Glucanase/Cellulase | Familie | Bekannte
Aktivitäten | Bekannte
Aktivitäten | Zusammenfassung |
CEA | 5 | EC
3.2.1.4 | Cellulase | BGU/CXU-Aktivität als unwahrscheinlich angesehen |
EC
3.2.1.75 | Endo-1,6-Glucanase |
EC
3.2.1.58 | Exo-1,3-Glucanase |
EC
3.2.1.78 | Mannanase |
EC
3.2.1.123 | Endoglykoceramidase |
CEB | 7 | EC
3.2.1.4 | Cellulase | BGU/CXU-Aktivität als unwahrscheinlich angesehen |
EC
3.2.1.91 | Cellobiohydrolase |
CEC | 45 | EC
3.2.1.4 | Cellulase | BGU/CXU-Aktivität, aber nicht
bei dem getesteten pH |
Glucanase/Cellulase | Familie | 3D | Nukleophil/Protonendonor | Mechanismus |
CEA | 5 | TIM
8 | Glu/Glu | beibehaltend |
CEN | 7 | Jelly
Roll | Glu/Glu | beibehaltend |
CEC | 45 | gemischtes
Fass | Asp/Asp | invertierend |
16 | Jelly
Roll | Glu/Glu | beibehaltend |
-
CEB,
CEC sind sämtlich
Cellulasen, die eine EC 3.2.1.4.-Aktivität besitzen. Viele Cellulasen
können auch
1,4-Bindungen in Gersten-Glucan hydrolysieren, was sie für bestimmte
Anwendungen, wie z. B. von Anti-Ernährungs-Faktoren
im Futter, besonders geeignet macht. Weil die Aktivität über die
Viskosität
gemessen wurde, ist es wahrscheinlich, dass die Cellulase Endo-Aktivität aufwies.
Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass auch 1,3-Bindungen
hydrolysiert werden.
-
Aufgrund
der Beobachtungen können
somit EC 3.2.1.73-, 3.2.1.39- und 3.2.1.6-Aktivitäten nicht
ausgeschlossen werden, obwohl man diese Aktivitäten in Familie 16 findet: Die
Eigenschaften der Familien 7 und 16 scheinen recht ähnlich zu
sein.
-
Nur
zur Erläuterung
sei gesagt, dass Cellulasen (EC 3.2.1.4) normalerweise in der Lage
sind, die Endo-Hydrolyse
von 1,4-D-glucosidischen Bindungen in Cellulose zu katalysieren.
Der systematische Name der Cellulasen ist 1,4-(2,3;1,4)-D-Glucan-4-glucanohydrolase.
Endo-1,4-D-Glucanase und Endo-Glucanase
D sind Synonyme für
1,4-(1,3;1,4)-D-Glucan-4-glucanohydrolase.
Cellulase kann auch 1,4-Bindungen in D-Glucanan hydrolysieren, die
auch 1,3-Bindungen enthalten, was sie für bestimmte Anwendungen, wie
z. B. die Beseitigung von Antiernährungsfaktoren in Futter, besonders
geeignet macht. Solche Enzyme, die Endo-Glucanase-Aktivität zeigen, werden im Allgemeinen
als Glucanasen bezeichnet. Zusätzlich
kann die Hydrolyse von Glucan durch Lichenase (1,3-1,4-D-Glucan
glucanohydrolase (EC 3.2.1.73) und Endo-1,3(4)-Glucanase (1,3-(1,3;1,4)-D-Glucan-3(4)-glucanohydrolase
(EC 3.2.1.6) erzielt werden.
-
Eine Übersicht über Cellulase-Aktivitäten ist
in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
EC-Nummer | Aktivität | Systematischer
Name | Empfohlen | Synonym |
3.2.1.4 | Endo-Hydrolyse 1,4-β-D-glucosidischer Bindung in
Cellulose. Hydrolysiert auch 1,4-Bindungen in β-D-Glucanen, die auch 1,3-Bindungen enthalten | 1,4-(1,3;1,4)-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase | Cellulase | Endo-1,4-β-D-Glucanase
Endo-glucanase
D |
3.2.1.73 | Hydrolyse 1,4-β-D-glykosidischer Bindungen
in β-D-Glucanen, die 1,3- und 1,4-Bindungen
enthalten. Wirkt auf Lichenin und Getreide-β-D-Glucane, aber nicht auf β-D-Glucane,
die nur 1,3- oder nur 1,4-Bindungen enthalten. | 1,3-1,4-β-D-Glucanglucanohydrolase | Lichenase | |
3.2.1.39 | Hydrolyse 1,3-β-D-glucosidischer Bindungen
in 1,3-β-D-Glucanen. Begrenzte
Aktivität
an gemischten (1,3-1,4)-β-D-Glucanen | 1,3-β-D-Glucanglucanohydrolase | Glucan-Endo-1,3-β-glucosidase | Endo-1,3-β-D-Glucanase
β-1,3-Glucanase
Oligo-1,3-glucosidase |
3.2.1.58 | aufeinander
folgende Hydrolyse von β-D-Glucose-Einheiten von den
nicht-reduzierenden Enden von 1,3-β-D-Glucanen, wobei α-Glucose freigesetzt wird | 1,3-β-D-Glucanglucanohydrolase | Glucan-1,3-β-glucosidase | Exo-β-1,3-Glucanase |
3.2.1.75 | zufallsgemäße Hydrolyse
von 1,6-Bindungen
in 1,6-β-D-Glucosiden. Wirkt
auf Lutean, Pustulan, 1,6-Oligo-β-D-glucoside | 1,6-β-D-Glucanglucanohydrolase | Glucan-Endo-1,6-β-glucosidase | Endo-β-1,6-Glucanase
β-1,6-Glucanhydrolase |
3.2.1.6 | Endo-Hydrolyse
von 1,3- und 1,4-Bindungen
in β-D-Glucanen, wenn der
Glucose-Rest, dessen reduzierende Gruppe an der zu hydrolysierenden
Bindung beteiligt ist, selbst an C-3 substituiert ist. Substrate sind
u. a. Getreide-D-Glucane, Laminarin, Lichenin | 1,3-(1,3;1,4)-β-D-Glucan-3(4)-glucanohydrolase | Endo-1,3(4)-β-glucanase | β-1,3-Glucanase
beta-1,3-1,4-glucanase
Endo-β,1,3(4)-Glucanase |
3.2.1.91 | Hydrolyse
von 1,4-β-D-glucosidischen
Bindungen in Cellulose und Cellotetraose, wodurch Cellobiose vom
nicht-reduzierenden
Ende freigesetzt wird | 1,4-D-Glucancellobiohydrolase | Cellulose-1,4-β-Cellobiosidase | Exoglucanase
Cellobiohydrolase
Exo-Cellobiohydrolase |
-
Literatur
-
- 1. Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A laboratory manual", 2. Auflage, Cold
Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York
- 2. Innis et al. (1990) "PCR
protocols, a guide to methods and applications" Academic Press, San Diego.
- 3. WO-A-99/32617
- 4. van Zeijl, C. et al. (1998) J. of Biotechnol. 59: 221–224
- 5. Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, S. 387–395
- 6. Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36: 290–300
- 7. Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215: 403–10
- 8. Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10915–10919)
- 9. Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
5873–5787
- 10. Cunningham und Wells, Science, 244, 1081–1085, 1989
- 11. de Vos et al. (Science, 255, 306–312, 1992)
- 12. Smith et al. (J. Mol. Biol., 224, 899–904, 1992)
- 13. Wlodaver et al. (FEBS Lett., 309, 59–64, 1992)
- 14. Ford et al, Protein Expression and Purification, 2, 95–107, 1991
- 15. Goosen et al, "Transformation
and Gene Manipulation in Filamentous Fungi: an overview" in: Handbook of Applied
Mycology, Vol. 4 (1992)
- 16. Romanos et al, Yeast 8: 423–488 (1992)
- 17. EP-A-0,449,375
- 18. WO-A-98/04726
- 19. WO-A-98/30707
- 20. Alenkso und Clutterbuck, Fungal Genet. Biol 21: 373–397 (1997)
- 21. EP-A-0,635,574
- 22. WO-A-98/46772
- 23. WO-A-91/14772
-
-
-
-
-
-
-
-
-