DE60132762T2

DE60132762T2 - Talaromyces emersonii beta-glucanase

Info

Publication number: DE60132762T2
Application number: DE60132762T
Authority: DE
Inventors: Johannes Petrus Theodorus Van Den Hombergh; Jan-Metske Van Der Laan; Jean-Marc Georges Daran; Margareta Adriana Herweijer; Daniel Paul Teufel
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2021-03-21
Also published as: PT1621628E; ATE386124T1; DK1272643T4; WO2001070998A1; RU2321635C2; RU2002128017A; CA2403486A1; ATE512214T1; AU2001262116A1; PT1272643E; NO20024516D0; DE60132762D1; EP1272643B2; DK1272643T3; CN1426470A; CA2689798C; CA2689798A1; CA2403486C; ES2299486T5; PL358324A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue (β)-Glucanasen (sowie Cellulasen) aus dem Pilz Talaromyces, insbesondere Talaromyces emersonii, und ihre Verwendung beim Abbau von Glucan zu Cellulose.
Hintergrund der Erfindung
Die Zusammensetzung einer Pflanzenzellwand ist komplex und variabel. Polysaccharide findet man hauptsächlich in Form langer Cellulose-(die Hauptstrukturkomponente der Pflanzenzellwand), Hemicellulose-mit verschiedenen β-Xylan-Ketten, wie Xyloglucane) und Pektin-Ketten.
Beta-Glucan (oder genauer (1→3)(1→4)β-D-Glucan), MW 10 bis 14 kDa, ist eine Komponente der Pflanzen-Hemicellulose (MW von ungefähr 700 kDa) und besteht aus einem Gerüst von β-1,4 und 1,3-verknüpften Glucopyranose-Resten. Eine andere Komponente ist Xylan, das aus β-1,4-verknüpften Xylose-Resten besteht, die gegebenenfalls mit Seitenketten, wie Arabinose- und/oder Glucuronsäure-Resten, substituiert sind.
Grundlegende Unterschiede bestehen zwischen Monokotyledonen (beispielsweise Getreide und Gräsern) und Dikotyledonen (beispielsweise Klee, Raps und Soja) sowie zwischen den Samen und den vegetativen Teilen der Pflanze. Monokotyledonen sind durch die Anwesenheit eines Arabinoxylan-Komplexes als Haupt-Hemicellulose-Gerüst gekennzeichnet, und die Hauptstruktur der Hemicellulose in den Dikotyledonen ist ein Xyloglucan-Komplex. In den Dikotyledonen werden höhere Pektinkonzentrationen als in den Monokotyledonen gefunden. Samen sind im Allgemeinen reich an Pektin-Substanzen, haben aber relativ wenig cellulosehaltiges Material.
Cellulose-spaltende Enzyme werden wegen ihrer Fähigkeit, auf Haupt-Pflanzenzellwandsubstituenten einzuwirken, zum Verarbeiten von Pflanzenmaterial in Lebensmittel- sowie Futtermittel-Anwendungen oder als Lebensmittel- oder Futtermittel-Zusatzstoff verwendet.
Die meisten Cellulose-spaltenden Enzyme, die für die Industrie verfügbar sind, scheinen Glucanasen mit relativ niedrigem Molekulargewicht und einer mäßigen Stabilität bei höheren Temperaturen zu sein. MOLONEY A. P. et al., (Biochemical Journal, Bd. 225, Nr. 2, 1985, S 365–374) offenbart vier Endo-Glucanasen aus T. emersonii, die eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 5,5 bis 5,8 und einer Temperatur von 75°C bis 80°C aufweisen.
Für bestimmte Anwendungen ist jedoch die Verwendung einer Glucanase mit einer relativ hohen Thermostabilität wünschenswert. Soll eine Glucanase als Tierfutteradditiv verwendet werden, dann wird eine hohe Thermostabilität bevorzugt, und zwar wegen der Hochtemperaturbedingungen, die beim Pelletieren des Tierfutters angewendet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden nun neue β-Glucanasen (oder Cellulasen) bereitgestellt, welche β-D-Glucan (oder Cellulose), wie es in Pflanzenmaterial vorkommt, spalten können.
Es wird ein Polypeptid, bei dem es sich um eine β-Glucanase handelt, die aus einem Pilz der Gattung Talaromyces, wie dem Pilz Talaromyces emersonii, erhältlich ist, mit der Aktivität EC 3.2.1.4 (Endo-Glucanase-Aktivität) bereitgestellt, umfassend:

(i) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 oder
(ii) eine Variante von (i), die β-D-Glucan spalten kann und mindestens 70% Identität über die gesamte Länge der SEQ ID NR: 2 oder mindestens 80% über einen Bereich von mindestens 150 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 hat; oder
(iii) ein Fragment von (i) oder (ii), das β-D-Glucan spalten kann.

Die Erfindung betrifft im weitesten Sinne β-Glucanasen (oder Cellulasen) aus Talaromyces, wie Talaromyces emersonii, (ein Pilz). Diese β-Glucanasen können β-D-Glucan oder Cellulose spalten, z. B. sind sie β-1,4-Endoglucanasen oder haben die Aktivität EC 3.2.1.4.
Die Glucanasen können Folgendes besitzen:

a. einen optimalen pH-Wert unter 7,0 oder 5,4, wie unter 5,0, z. B. von 4,4 bis 5,2 oder von 3,0 bis 6,0 oder 7,0; oder
b. ein Temperaturoptimum von mindestens 72°C, 75°C oder sogar 81°C, wie von 78°C bis 85°C oder von 83°C bis 87°C.

Spezifischer, stellt die vorliegende Erfindung ein (isoliertes) β-Glucanase-Polypeptid bereit, umfassend:

(i) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 oder
(ii) eine Variante von (i), die β-D-Glucan spalten kann; oder
(iii) ein Fragment von (i) oder (ii), das β-D-Glucan spalten kann.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, umfassend:

(a) die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 1 oder eine Sequenz, die ein Polypeptid nach einem vorhergehenden Anspruch codiert;
(b) eine Sequenz, die zu einer Sequenz, wie in (a) definiert, über die gesamte Länge komplementär ist oder unter hochstringenten Bedingungen daran hybridisiert;
(c) ein Fragment von einer der Sequenzen in (a) oder (b);
(d) eine Sequenz mit mindestens 75%, vorzugsweise 80%, Identität zu einer Sequenz, wie in (a) definiert; oder
(e) eine Sequenz, die infolge des genetischen Codes zu einer der Sequenzen, wie in (a) definiert, degeneriert ist.

Die Erfindung stellt zudem bereit:

– einen (beispielsweise Expressions-)Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfasst und der ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren kann;
– eine Zelllinie oder einen Stamm, der einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst;
– ein Verfahren zum Produzieren eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei das Verfahren das Halten einer erfindungsgemäßen Zelllinie oder eines erfindungsgemäßen Stamms unter Bedingungen, die zum Erzielen der Expression des Polypeptids geeignet sind, und, wenn notwendig, Isolieren des Polypeptids umfasst
– ein Verfahren zum Spalten von β-D-Glucan, wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines Materials, das β-D-Glucan umfasst, mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid umfasst,
– ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die β-Glucanase-Aktivität moduliert, wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit einer Test-Verbindung in Anwesenheit von β-D-Glucan und Überwachen oder Erfassen einer Modulation der Aktivität umfasst;
– ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums mit Hyperlipämie, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids an das Individuum umfasst; und
– die Verwendung des Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Hyperlipämie.

Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NR: 1 ist eine DNA-Sequenz einer ersten erfindungsgemäßen β-Glucanase (CEA) aus Talaromyces emersonii;
SEQ ID NR: 2 ist die Aminosäuresequenz der ersten β-Glucanase, CEA;
SEQ ID NR: 7 und 8 sind PCR-Primer, die an SEQ ID NR: 1 hybridisieren (und zum Umklonieren von cDNA-Inserts während der genetischen Analyse positiver Transformanten eingesetzt wurden).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
A. Polynukleotide.
Die vorliegende Erfindung stellt ein (beispielsweise isoliertes und/oder gereinigtes) Polynukleotid bereit, das die erfindungsgemäßen Polypeptide codiert. Die vorliegende Erfindung liefert folglich ein Polynukleotid, das eine β-Glucanase codiert, deren Aminosäuresequenz in SEQ ID NR: 2 dargelegt wird. Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Polynukleotid bereit, das ein Polypeptid codiert, das eine erhebliche Aminosäuresequenzhomologie mit der Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NR: 2 dargelegt wird. Zudem ist ein Polynukleotid eingeschlossen, das ausgewählt ist aus:

(a) einem Polynukleotid, umfassend die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR: 1 aufgeführt ist, oder das Komplement davon;
(b) einem Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die (beispielsweise selektiv) an eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR: 1, aufgeführt ist, oder ein Fragment davon hybridisieren kann;
(c) einem Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die (beispielsweise selektiv) an das Komplement der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR: 1, aufgeführt ist, oder ein Fragment davon hybridisieren kann; und/oder
(d) einem Polynukleotid, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die infolge des genetischen Codes zu einem Polynukleotid, wie in (a), (b) oder (c) definiert, degeneriert ist.

Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid schließt auch ein Polynukleotid ein, das:

(a) ein Polypeptid codiert, das β-Glucanaseaktivität hat, wobei das Polynukleotid folgendes ist:
(1) die codierende Sequenz von SEQ ID NR: 1;
(2) eine Sequenz, die selektiv an das Komplement der in (1) definierten Sequenz hybridisiert; oder
(3) eine Sequenz, die infolge des genetischen Codes in Bezug auf eine in (1) oder (2) definierte Sequenz degeneriert ist; oder
(b) eine Sequenz ist, die zu einem in (a) definierten Polynukleotid komplementär ist.

Hybridisierbare Sequenzen
Der Begriff "zum Hybridisieren befähigt" bedeutet, dass das erfindungsgemäße Ziel-Polynukleotid an die als Sonde verwendete Nukleinsäure (z. B. die in SEQ ID NR: 1 aufgeführte Nukleotidsequenz oder ein Fragment davon oder das Komplement davon) auf einem Niveau hybridisieren kann, das erheblich über dem Hintergrund liegt. Die Erfindung schließt auch Nukleotidsequenzen ein, die β-Glucanase oder Varianten davon codieren, sowie Nukleotidsequenzen, die dazu komplementär sind. Die Nukleotidsequenz kann RNA oder DNA sein und schließt folglich genomische DNA, synthetische DNA oder cDNA ein. Die Nukleotidsequenz ist vorzugsweise eine DNA-Sequenz und am stärksten bevorzugt eine cDNA-Sequenz. Gewöhnlich umfasst ein erfindungsgemäßes Polynukleotid eine aneinander grenzende Sequenz von Nukleotiden, die unter ausgewählten Bedingungen an die codierende Sequenz oder das Komplement der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1, wenn gültig, hybridisieren kann. Solche Nukleotide können nach bekannten Verfahren des Standes der Technik synthetisiert werden¹.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann an die codierende Sequenz oder das Komplement der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1 (wenn gültig) auf einem Niveau erheblich über dem Hintergrund hybridisieren. Eine Hintergrundhybridisierung kann z. B. wegen anderer cDNAs auftreten, die in einer cDNA-Bank zugegen sind. Das Signalniveau (das z. B. durch die Wechselwirkung zwischen einem erfindungsgemäßen Polynukleotid und der codierenden Sequenz oder dem Komplement der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1 erzeugt wird) ist gewöhnlich mindestens 10-mal, vorzugsweise mindestens 100-mal so intensiv wie Wechselwirkungen zwischen anderen Polynukleotiden und der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1. Die Intensität der Wechselwirkung kann gemessen werden, indem man z. B. die Sonde, z. B. mit ³²P, radioaktiv markiert. Eine selektive Hybridisierung kann gewöhnlich mit Bedingungen niedriger Stringenz (0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei ungefähr 40°C), mittlerer Stringenz (z. B. 0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei ungefähr 50°C) oder hoher Stringenz (z. B., 0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei ungefähr 60°C) erzielt werden. Die Hybridisierung kann unter allen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, die im Stand der Technik¹ bekannt sind, und als Richtlinie kann eine niedrige Stringenz 2 × SSC bei 55°C, eine mittlere Stringenz 0,5 bis 1,0 × SSC bei 60°C und eine hohe Stringenz 0,1 oder 0,2 × SSC bei 60°C oder höher (z. B. 68°C) sein, und zwar jeweils bei 0,5% SDS.
Modifikationen
Erfindungsgemäße Polynukleotide können DNA oder RNA umfassen. Sie können einzel- oder doppelsträngig sein. Sie können auch Polynukleotide sein, die in sich ein oder mehrere synthetische oder modifizierte Nukleotide aufweisen. Eine Anzahl verschiedener Typen von Modifikationen an Polynukleotiden sind im Stand der Technik bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat- und Phosphorthioat-Gerüste und/oder die Addition von Acridin oder Polylysin an das 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung versteht es sich, dass die hierin beschriebenen Polynukleotide durch jedes mögliche Verfahren modifiziert werden können, das im Stand der Technik verfügbar ist.
Es versteht sich, dass der Fachmann unter Verwendung von Routinetechniken Nukleotidsubstitutionen vornehmen kann, die die Polypeptidsequenz nicht beeinflussen, die durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide codiert wird, um die Codon-Nutzung eines bestimmten Wirtsorganismus wiederzuspiegeln, in welchem die erfindungsgemäßen Polypeptide z. B. exprimiert werden sollen.
Die codierende Sequenz von SEQ ID NR: 1 kann durch Nukleotidsubstitutionen, z. B. von oder bis zu 1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen, modifiziert werden. Das Polynukleotid kann alternativ oder zusätzlich durch eine oder mehrer Insertionen und/oder Deletionen und/oder durch eine Extension an einem oder beiden Enden modifiziert werden. Das modifizierte Polynukleotid codiert im Allgemeinen ein Polypeptid, das β-Glucanase-Aktivität hat. Degenerierte Substitutionen können vorgenommen werden, und/oder Substitutionen können vorgenommen werden, die zu einer konservativen Aminosäuresubstitution führen, wenn die modifizierte Sequenz translatiert wird, wie z. B. später in Bezug auf Polypeptide besprochen wird.
Homologa
Eine Nukleotidsequenz, die an die (beispielsweise an das Komplement der) DNA-codierenden) Sequenz von SEQ ID NR: 1 selektiv hybridisieren kann, kann mindestens 50% oder 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität (oder Homologie) zu der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1 haben. Dies kann über einen Bereich von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, zum Beispiel mindestens 40, mindestens 60, vorzugsweise mindestens 100 aufeinander folgenden Nukleotiden oder optimalerweise über die gesamte Länge von SEQ ID NR: 1 erfolgen. Für SEQ ID NR: 1 ist die Sequenzidentität vorzugsweise mindestens 75% oder 80%.
Jede beliebige Kombination der oben erwähnten Homologiegrade und minimalen Größen kann verwendet werden, um erfindungsgemäße Polynukleotide zu definieren, wobei stringentere Kombinationen (d. h. höhere Homologie über größere Längen) bevorzugt sind. So bildet zum Beispiel ein Polynukleotid, das über 25 vorzugsweise über 30 Nukleotide zu mindestens 80% oder 90% homolog ist, einen Aspekt der Erfindung, sowie auch ein Polynukleotid, das über 40 Nukleotide mindestens 90% homolog ist.
Homologa von Polynukleotid-(oder Protein-)-Sequenzen haben gewöhnlich mindestens 70% Homologie, vorzugsweise mindestens 80, 90%, 95%, 97% oder 99% Homologie, z. B. über einen Bereich von mindestens 15, 20, 30, 100 weiteren benachbarten Nukleotiden (oder Aminosäuren). Die Homologie kann auf der Grundlage der Aminosäureidentität errechnet werden (manchmal als "harte Homologie" bezeichnet).
Z. B. liefert das UWGCG-Paket das BESTFIT-Programm, das dazu verwendet werden kann, eine Homologie zu errechnen (z. B. in seinen Standard-Einstellungen⁵ verwendet). Die PILEUP- und BLAST-Algorithmen können dazu verwendet werden, Homologie zu errechnen oder Sequenzen auszurichten (wie zum Identifizieren äquivalenter oder entsprechender Sequenzen, z. B. in ihren Standard-Einstellungen^6,7).
Software für das Durchführen von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.) öffentlich zugänglich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren des High-Score-Sequenz-Paars (HSPs) durch Identifizieren kurzer Wörter der Länge W in der Abfragesequenz, die entweder übereinstimmen oder einer Schwellenbewertung T mit positivem Wert entsprechen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet wird. T wird als Nachbarwort-Bewertungsschwelle^6,7 bezeichnet. Diese anfänglichen Nachbarworttreffer dienen als Keime zum Einleiten von Suchen zum Auffinden von HSPs, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz soweit ausgedehnt, wie der kumulative Alignment-Score erhöht werden kann. Ausdehnungen der Worttreffer in jeder Richtung werden angehalten, wenn: der kumulative Alignment-Score um die Menge X von seinem erzielten Höchstwert abfällt; der kumulative Score wegen der Akkumulation von einer oder mehreren negativ-zählenden Restausrichtungen auf null oder darunter fällt oder das Ende jeder Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Standards eine Wortlänge (W) von 11, BLOSUM62- Scoringmatrix⁸-Alignments (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, von M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen⁹ durch. Ein Maß an Ähnlichkeit, bereitgestellt vom BLAST-Algorithmus ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die ein Anzeichen der Wahrscheinlichkeit liefert, durch die eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Z. B. gilt eine Sequenz als ähnlich zu einer anderen Sequenz, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit im Vergleich der ersten Sequenz zur zweiten Sequenz kleiner als etwa 1, vorzugsweise kleiner als ungefähr 0,1, stärker bevorzugt kleiner als ungefähr 0,01 und am stärksten bevorzugt kleiner als ungefähr 0,001 ist.
Primer und Sonden
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen und können verwendet werden als Primer, beispielsweise PCR-Primer, Primer für eine alternative Amplifikationsreaktion, Sonde oder die Polynukleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente sind mindestens oder bis zu 20, z. B. mindestens 25, 30 oder 40 Nukleotide lang. Sie sind gewöhnlich bis 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 oder 300 Nukleotide lang, oder sogar bis zu wenigen Nukleotiden (wie 5 oder 10 Nukleotiden) der codierenden Sequenz von SEQ ID NR: 1 kurz.
Im allgemeinen werden Primer durch synthetische Mittel produziert und beinhalten eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz, und zwar ein Nukleotid nach dem anderen. Techniken zur Bewerkstelligung mittels automatisierter Techniken sind im Stand der Technik leicht verfügbar. Beispiele für Primer der Erfindung sind in SEQ ID NR: 7 und 8 aufgeführt.
Längere Polynukleotide werden im Allgemeinen mit Rekombinationsmaßnahmen z. B. mit PCR-(Polymerasekettenreaktion)Klonierungstechniken produziert. Dieses umfasst die Herstellung eines Paars von Primern (beispielsweise mit ungefähr 15–30 Nukleotiden) von einer Region der β-Glucanase, die man klonieren möchte, das Zusammenbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, erhalten aus einer Ziel-(beispielsweise Hefe-, Bakterien-, Pflanzen-, Prokaryonten- oder Pilz-)Zelle, vorzugsweise eines Talaromyces-Stamms, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die die Amplifikation der gewünschten Region bewirken, Isolieren des amplifizierten Fragments (beispielsweise durch Reinigen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und das Gewinnen der amplifizierten DNA. Die Primer können so ausgelegt sein, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, damit die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
Solche Techniken können verwendet werden, um alles oder einen Teil der hierin beschriebenen β-Glucanase Sequenz zu erreichen. Genomische Klone, entsprechend der cDNA von SEQ ID NR: 1, oder das β-Glucanasegen, das z. B. Introns und die Promotorregionen enthält, sind auch innerhalb der Erfindung und können auch auf analoge Weise erreicht werden (beispielsweise Rekombinationsmaßnahmen, PCR, Klonierungstechniken), ausgehend von genomischer DNA aus einer Pilz-, Hefe-, Bakterien-, Pflanzen- oder einer. Prokaryonten-Zelle.
Die Polynukleotide oder die Primer können eine enthüllende Markierung tragen, beispielsweise eine radioaktive oder nicht-radioaktive Markierung. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope wie ³²P oder ³⁵S, Enzym-Markierungen oder andere Protein-Markierungen wie Biotin. Solche Markierungen können zu erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Primern hinzugefügt werden und können durch an sich bekannte Techniken ermittelt werden.
Markierte oder unmarkierte Polynukleotide können in Tests auf Nukleinsäure-Basis zum Nachweisen oder Sequenzieren von β-Glucanase oder einer Variante davon in einer (beispielsweise Pilz-)Probe verwendet werden. Solche Nachweistests umfassen im Allgemeinen das Zusammenbringen einer (beispielsweise Pilz-)Probe, die (mutmaßlich) DNA enthält, mit einer erfindungsgemäßen Sonde oder Primer unter Hybridisierungsbedingungen und Erfassen jeglichen Doppelstrangs zwischen der Sonde und der Nukleinsäure in der Probe. Ein solcher Nachweis kann mit Techniken erzielt werden, wie PCR oder durch Immobilisierung der Sonde auf einem festen Träger, Entfernen der Nukleinsäure in der Probe, die nicht an die Sonde hybridisierte, und dann Nachweisen der Nukleinsäure, die an die Sonde hybridisierte. Alternativ kann die Proben-Nukleinsäure auf einem festen Träger immobilisiert werden, und die Menge der Sonde, die an einen solchen Träger gebunden wurde, kann erfasst werden.
Die Sonden der Erfindung können in Form eines Test-Kits in einem geeigneten Behälter bequem verpackt werden. In solchen Kits kann die Sonde an eine feste Stütze gebunden sein, in der das Testformat, für das der Kit bestimmt ist, eine solche Bindung erfordert. Der Kit kann auch die geeigneten Reagenzien zur Behandlung der zu untersuchenden Probe, Hybridisierung der Sonde an die Nukleinsäure in der Probe, die Steuerungreagenzien, die Anweisungen und dergleichen enthalten.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynukleotid vom gleichen Organismus wie das Polypeptid, wie einem Pilz, insbesondere einem Pilz der Gattung Talaromyces erhältlich.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen auch Varianten der Sequenz von SEQ ID NR: 1, die β-Glucanase-Aktivität haben. Varianten können durch Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen gebildet werden und können ein β-D-Glucan-Polymer spalten.
Produktion von Polynukleotiden
Polynukleotide, die keine 100% Identität mit SEQ ID NR: 1 haben, aber innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung fallen, können in einer Anzahl von Wegen erreicht werden. So können Varianten der hierin beschriebenen β-Glucanase-Sequenz erhalten werden, zum Beispiel indem man die genomischen DNA-Banken prüft, die von einer Reihe von Organismen gebildet werden, z. B. diejeninge, die als Quellen der erfindungsgemäßen Polypeptide der Erfindung erörtert wurden. Zusätzlich können andere Pilz-, Pflanzen- oder Prokaryonten-Homologa von β-Glucanase erhalten werden, und solche Homologe und Fragmente davon können im allgemeinen an SEQ ID NR: 1, hybridisieren. Solche Sequenzen können erhalten werden, indem man cDNA-Banken oder genomische DNA-Banken von anderen Arten prüft und solche Banken mit Sonden prüft, die SEQ ID NR: 1 ganz oder teilweise umfassen, und zwar unter Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz (wie früher beschrieben). Nukleinsäuresonden, die die SEQ ID NR: 1, vollständig oder teilweise umfassen, können verwendet werden, um cDNA-Banken anderer Arten, wie sie als Quellen für die erfindungsgemäßen Polypeptide beschrieben wurden, zu prüfen.
Spezieshomologa können auch mittels degenerierter PCR erhalten werden, welche Primer verwendet, die dazu ausgelegt sind, auf Sequenzen innerhalb der Varianten und der Homologe zu zielen, die konservierte Aminosäuresequenzen codieren. Die Primer können eine oder mehrer degenerierte Positionen enthalten und werden bei schwächeren Stringenzbedingungen verwendet als diejenigen, die zum Klonieren von Sequenzen mit einzelnen Sequenz-Primern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
Alternativ können solche Polynukleotide durch stellengerichtete Mutagenese von β-Glucanase-Sequenzen oder Varianten davon erhalten werden. Dieses kann geeignet sein, wo zum Beispiel stille Codon-Änderungen an Sequenzen erforderlich sind, um Codon-Präferenzen für eine bestimmte Wirtszelle zu optimieren, in der die Polynukleotid-Sequenzen exprimiert werden. Andere Sequenzänderungen können gewünscht sein, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzuführen, oder die Eigenschaft oder die Funktion der Polypeptide zu ändern, die durch die Polynukleotide codiert werden.
Die Erfindung umfasst doppelsträngige Polynukleotide, die ein Polynukleotid der Erfindung und sein Komplement umfassen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch die Polynukleotide, welche die unten beschriebenen Polypeptide der Erfindung codieren. Da solche Polynukleotide als Sequenzen für rekombinante Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide geeignet sind, brauchen sie nicht an die Sequenz der SEQ ID NR: 1 zu hybridisieren, obgleich dieses im Allgemeinen wünschenswert ist. Andernfalls können solche Polynukleotide bei Bedarf wie oben beschrieben markiert werden, verwendet werden, und gebildet werden.
B. Polypeptide.
Die vorliegende Erfindung betrifft (beispielsweise (im Wesentlichen) gereinigte und/oder isolierte) β-Glucanasen (oder Cellulasen) und Varianten davon. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 oder einer Variante dieser Sequenz bestehen. Polypeptide können auch durch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid codiert werden, wie oben beschrieben worden.
Ein Polypeptid der Erfindung kann in einer isolierten oder im Wesentlichen gereinigten Form sein. Es versteht sich, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden kann, die den beabsichtigten Zweck und/oder die Funktion des Polypeptids nicht behindern und dennoch als im Wesentlichen isoliert angesehen werden. Es umfasst im Allgemeinen das Polypeptid in einem Präparat, in dem mehr als 20%, beispielsweise mehr als 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% oder 99%, bezogen auf das Gewicht des Polypeptids, im Präparat ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist. Routineverfahren können eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Proteine zu reinigen; und/oder zu synthetisieren¹. Für einige Formulierungen (beispielsweise für nicht-pharmazeutische Verwendungen) kann die Menge des vorhandenen Polypeptids klein sein, z. B. von 0,01 bis 10%, wie von 0,1 bis 5% oder 2% oder sogar von 0,2 bis 1%.
Vorzugsweise ist das Polypeptid der Erfindung aus einem Mikroorganismus erhältlich, der ein Gen besitzt, das ein Enzym mit β-Glucanase-(oder Cellulase-)Aktivität codiert. Vorzugsweise ist der Mikroorganismus ein Pilz, und optimal filamentöse Pilze. Bevorzugte Organismen sind folglich von der Gattung Talaromyces, wie der Spezies Talaromyces emersonii.
Aktivität
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann eine oder mehre der folgenden Eigenschaften haben, nämlich es:

(1) besitzt β-Glucanase-(oder Cellulase)-Aktivität;
(2) hat einen optimalen pH-Wert-Bereich von 3 bis 6,5 oder 7,0, wie von 4 bis 5,5 oder 6,0, optimal von 4,5 bis 5,0;
(3) hat optimale Aktivität bei einer Temperatur von 30°C bis 100°C, wie 60 bis 95°C, optimal von 75°C oder 80°C bis 90°C. Vorzugsweise ist die optimale Temperatur mindestens 75°C, wie mindestens 85°C;
(4) hat ein Molekulargewicht (deglykosyliert) von 20 bis 60 kDa, vorzugsweise von 20 bis 25, 35 bis 45 oder 23 bis 50 kDa, optimal von 36 bis 40 kDa oder (glykosyliert) oder von 40 bis 45 kDa;
(5) hat einen isoelektrischen Punkt von 3,0 bis 3,6 oder 5,0, 3,8 bis 4,5, 4,5 bis 5,0 oder von 6,0 bis 7,0; und/oder
(6) besitzt hydrolytische Aktivität auf Getreide β-Glucan oder weist hydrolytische Aktivität unter pH-Wert 7 auf.

Das Polypeptid kann die Aktivität von EC 3.2.1.4 (oder Endoglucanase-Aktivität) haben. Im allgemeinen kann dieses die Endohydrolyse von 1,4-β-D-glucosidscher Bindungen in Cellulose sein. "β-Glucanase-Aktivität" ist die Fähigkeit, Cellulose oder ein β-Glucan-Polymer zu spalten (wie beispielsweise in den Pflanzen Hafer oder Gerste gefunden). Die Aktivität ermöglicht folglich die Spaltung zwischen endständigen oder nicht-endständigen angrenzendem Glucopyranose-Einheiten. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung an einer [Glucose(1→4), (1→3) oder (1→6)Glucose]-Bindung. Das Polypeptid kann vorzugsweise zwischen zwei benachbarten (beispielsweise nicht-substituierten Glucose-)Einheiten spalten. Es kann folglich Endoaktivität haben (d. h. eine Endoglucanase sein). Das Substrat-Polymer kann substituiert sein oder nicht. Vorzugsweise hat das Polypeptid keine Xylanase-Aktivität.
Das Polypeptid kann auch Cellulase-Aktivität haben, das heißt es ist an Cellulose aktiv oder kann dieses spalten. Da β-Glucan eine Komponente der Cellulose ist, fallen alle Glucanasen innerhalb des breiteren Begriffs der Cellulasen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind folglich Cellulasen, weil sie zur Unterklasse der Glucanasen gehören. Andere Typen von Aktivitätsklassen innerhalb der Cellulasen, abgesehen von Endoglucanase (EC 3.2.1.4, wie oben erwähnt) sind Exo-Glucanase/Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-Glukosidase (EC 3.2.1.21), Endo-1,6-Glucanase (EC 3.2.1.75), Exo-1,3-Glucanase (EC 3.2.1.58), Mannanase (EC 3.2.1.78) und Endo-Glykoceramidase (EC 3.2.1.123). Einige der Polypeptide haben wahrscheinlich eine, zwei oder mehr dieser zusätzlichen Aktivitäten, die auf ihrer Struktur und Sequenz beruhen, durch Vergleich mit bekannten Enzymen und der Familie der Hydrolasen, in die sie fallen. In der Beschreibung, in der der Kontext angebracht ist, kann somit Glucanase-Aktivität Cellulase-Aktivität bedeuten. Eine Liste von (Cellulase)-Aktivitäten für die Polypeptide wird in Beispiel 11 später bereitgestellt.
Vorzugsweise fällt das Polypeptid in eine der Familien 5, 7 oder 45, entsprechend der Glykosidhydrolase(CAZy)-Klassifikation. Das Polypeptid kann ein glu/glu oder asp/asp-Nukleophil/Proton-Donator sein.
Varianten und Homologa
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann die in SEQ ID NR: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfassen oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder ein Fragment der Sequenz und kann β-Glucanase Aktivität haben. Im Allgemeinen ist die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz, gezeigt in SEQ ID NR: 2 bevorzugt.

Insbesondere kann das Polypeptid der Erfindung umfassen:
a. die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2;
b. eine natürlich vorkommende Variante- oder ein Spezieshomologon davon; oder
c. ein Protein mit mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 95, mindestens 98 oder mindestens 99% Sequenzidentität zu (a) oder zu (b).

Eine Variante kann eine sein, die natürlich vorkommt, z. B. in Pilz-, Bakterium-, Hefe- oder Pflanzenzellen, und die in einer im Wesentlichen ähnlichen Weise zum Protein von SEQ ID NR: 2 arbeiten kann, z. B. hat es β-Glucanase-Aktivität. Ähnlich ist ein Spezieshomologon des Proteins ein äquivalentes Protein, das natürlich in einer anderen Art vorkommt und das als β-Glucanase-Enzym arbeiten kann. Varianten umfassen allelische Varianten vom gleichen Stamm wie das Polypeptid der Erfindung oder von einem anderen Stamm, aber der gleichen Gattung oder der gleichen Spezies.
Varianten und Spezieshomologa können erhalten werden, indem man den hierin beschriebenen Verfahren für die Produktion des Polypeptids von SEQ ID NR: 2 und Durchführen solcher Verfahren auf einer geeigneten Zellquelle folgt, z. B. eine Bakterien-, Hefe-, Pilze- oder Pflanzen-Zelle. Man kann auch eine Sonde, wie oben definiert, verwenden, um Banken zu prüfen, die aus Hefe-, Bakterien-, Pilz- oder Pflanzenzellen hergestellt wurden, so dass man Klone erhält, die die Varianten oder die Spezieshomologa enthalten. Die Klone können durch herkömmliche Techniken manipuliert werden, um ein Polypeptid der Erfindung zu erzeugen, die dann durch Rekombinations- oder Synthesetechniken produziert werden können, die an sich bekannt sind.
Das erfindungsgemäße Polypeptid hat vorzugsweise mindestens 70% Sequenzidentität zum Protein von SEQ ID NR: Nr. 2, vorzugsweise mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97% oder mindestens 99% Sequenzidentität dazu, z. B. über einen Bereich von mindestens 60, mindestens 100, 150, 200 oder 300 angrenzenden Aminosäuren oder über die gesamte Länge von SEQ ID NR: 2. Für SEQ ID NR: 2 ist die Sequenzidentität vorzugsweise mindestens 70%.
Die Sequenz des Polypeptids von SEQ ID NR: Nr. 2 und von Varianten und von Spezieshomologa können folglich modifiziert werden, so dass die Polypeptide der Erfindung bereitgestellt werden. Aminosäuresubstitutionen können z. B. von oder bis zu 1, 2 oder 3 bis 10, 20, 30, 50 oder 100 Substitutionen gebildet werden. Es kann auch die gleiche Zahl Deletionen und Additionen vorgenommen werden. Diese Wechsel können außerhalb der Bereiche gebildet werden, die zur Funktion des Polypeptids entscheidend sind und können so dennoch zu einem aktiven Enzym führen. Das modifizierte Polypeptid behält im Allgemeinen Aktivität als β-Glucanase.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen Fragmente der oben erwähnten Polypeptide voller Länge und der Varianten davon, einschließlich der Fragmente der Sequenz, die in SEQ ID NR: 2 Nr. dargelegt ist. Solche Fragmente behalten gewöhnlich Aktivität als β-Glucanase. Fragmente können mindestens 50, 100, 150, 200 oder 250 Aminosäuren lang sein oder können diese Zahl der Aminosäuren der Sequenz voller Länge kurz sein (wie in SEQ ID NR: 2 gezeigt).
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können wenn notwendig mit synthetischen Mitteln produziert werden, obgleich sie normalerweise rekombinant gebildet werden, wie unten beschrieben. Sie können zum Beispiel durch Addition von Histidin-Resten oder einer T7-Markierung modifiziert werden, so dass ihre Identifikation oder Reinigung unterstützt wird oder durch Addition einer Signalsequenz, damit ihre Sekretion aus einer Zelle gefördert wird.
Die Bezeichnung "Varianten" bezieht sich auf Polypeptide, die den gleichen wesentlichen Charakter oder grundlegende biologische Funktionalität wie die β-Glucanase (oder Cellulase) haben, und umfasst allelische Varianten. Der wesentliche Charakter von β-Glucanase ist, dass es ein Enzym ist, das EC 3.2.1.4-Aktivität aufweist oder 1→3-, 1→4- und/oder 1→6-Bindungen in β-D-Glucan, wie β-D-Glucan aus Getreide- oder Haferspelzen. Vorzugsweise hat eine Polypeptid-Variante die gleiche Aktivität wie die β-Glucanase. Ein Polypeptid, das den gleichen wesentlichen Charakter wie β-Glucanase hat, kann identifiziert werden, indem man einen Cellulose- oder β-Glucan-Abbau-Test verwendet, z. B. wie später beschrieben.
Varianten von SEQ ID NR: 2 umfassen auch Sequenzen, die von SEQ ID NR: 2 abweichen, die aber nicht notwendigerweise vom natürlich vorkommenden β-Glucanase-Protein hergeleitet werden. Diese Varianten können Beschreibungen zufolge eine prozentuale Homologie zu SEQ ID NR: 2 haben oder eine Anzahl Substitutionen innerhalb dieser Sequenz aufweisen. Alternativ kann eine Variante durch ein Polynukleotid codiert werden, das an SEQ ID NR: 1 hybridisiert.
Die Varianten können in einer ähnlichen Weise zu den Varianten von SEQ ID NR: 1 definiert werden. So können die Varianten variante Sequenzen umfassen, die von anderen Talaromyces-Stämmen hergeleitet werden. Andere Varianten können aus anderen Talaromyces-Stämmen identifiziert werden durch das Suchen nach β-D-Glucanase-Aktivität und Klonieren und Sequenzieren wie zuvor. Varianten können die Deletion, Modifikation oder Addition einzelner Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren innerhalb der Proteinsequenz einschließen, solange das Peptid die grundlegende biologische Funktionalität der β-Glucanase beibehält.
Konservative Substitutionen können z. B. entsprechend der folgenden Tabelle gebildet werden. Aminosäuren im gleichen Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in der gleichen Zeile in der dritten Säule können gegeneinander substitutiert werden. Vorzugsweise beeinflussen Substitutionen nicht die Faltung oder die Aktivität des Polypeptids.

ALIPHATISCH nicht polar G A P

I L V

polar ungeladen C S T M

N Q

polar geladen D E

K R

AROMATISCH H F W Y
Kürzere Polypeptidsequenzen liegen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung. Z. B. liegt ein Peptid mit mindestens 50 Aminosäuren oder bis 60, 70, 80, 100, 150 oder 200 Aminosäuren Länge innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung, solange es die grundlegende biologische Funktionalität der β-Glucanase zeigt. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, umfasst dieser Aspekt der Erfindung die Situation, wenn das Protein ein Fragment der vollständigen Proteinsequenz ist und kann eine β-D-Glucan(oder Mannose)-bindende Region oder eine β-D-Glucan(oder Cellulose)-spaltende Region umfassen oder darstellen.
Modifikationen
Erfindungsgemäße Polypeptide können chemisch modifiziert sein, beispielsweise posttranslational modifiziert. Sie können beispielsweise (ein oder mehrmals, durch den gleichen oder einen anderen Zucker) glykosyliert sein oder modifizierte Aminosäurereste umfassen. Sie können auch durch die Addition von Histidinresten (um ihre Reinigung unterstützen) oder durch die Addition einer Signalsequenz (um die Einfügung in die Zellmembran zu fördern) modifiziert sein. Das Polypeptid kann eine oder mehrere (N)-Amino- oder (C)-carboxylterminale Extensionen haben, wie einen aminoterminalen Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu ungefähr 20–25 Resten oder eine (kleine) Extension, die die Reinigung erleichtert, wie ein Polyhistidin oder eine T7-Markierung, ein Antigenepitop oder eine (beispielsweise Maltose) bindende Domäne¹⁴ (beispielsweise am C-Terminus). Diese Extensionen können über einen Linker hinzugefügt werden oder nicht.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann mit einer enthüllenden Markierung markiert werden. Die enthüllende Markierung kann jede geeignete Markierung sein, die den Nachweis des Polypeptids ermöglicht. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, beispielsweise ¹²⁵I, ³⁵S, Enzyme, Antikörper, Polynukleotide und Linker, wie Biotin.
Die Polypeptide können so modifiziert sein, dass nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten sind, oder die Stabilität des Polypeptids erhöht wird. Wenn die Proteine oder die Peptide mit synthetischen Mitteln produziert werden, können solche Aminosäuren während der Produktion eingeführt werden. Die Proteine oder die Peptide können auch gemäß synthetischer oder rekombinanter Produktion modifiziert werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch mit Hilfe von (einer oder mehren) D-Aminosäuren hergestellt werden oder diese umfassen.
Eine Anzahl von Seitenketten-Modifikationen sind im Stand der Technik bekannt und können an den Seitenketten der erfindungsgemäßen Proteine oder Peptide der vorgenommen werden. Solche Modifikationen umfassen z. B. Modifikationen der Aminosäuren durch reduktive Alkylierung durch Reaktion mit einem Aldehyd, gefolgt von Reduktion mit NaBH₄, Amidierung mit Methylacetimidat oder Acylierung mit Essigsäureanhydrid.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzen können auch als Ausgangsmaterialien für die Konstruktion der Enzyme "der zweiten Generation" verwendet werden. Glucanasen der "zweiten Generation" sind Glucanasen, geändert durch Mutagenesetechniken (beispielsweise stellengerichtete Mutagenese), deren Eigenschaften sich von denen der Wildtyp-Glucanasen oder rekombinanten Glucanasen unterscheiden wie diejenigen, die durch die vorliegende Erfindung produziert werden. Z. B. können die Temperatur oder das pH-Wert-Optimum, die spezifische Aktivität, die Substrataffinität oder die Thermostabilität so geändert werden, dass dies für Anwendung in einem definierten Verfahren besser geeignet ist.
Die Aminosäuren, die für die Aktivität der erfindungsgemäßen Glucanasen essentiell sind und folglich vorzugsweise der Substitution unterliegen, können entsprechend den Verfahren des Standes der Technik identifiziert werden, wie stellengerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese¹⁰. In der letzteren Technik werden die Mutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt, und die resultierenden Mutantenmoleküle werden auf biologische Aktivität geprüft (beispielsweise Glucanaseaktivität), um die Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheidend sind. Stellen der Enzym-Substrat-Wechselwirkung können auch durch die Analyse der Kristallstruktur festgestellt werden, wie durch solche Techniken wie Kernmagnetresonanz, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkierung^11,12,13 oder Molekülmodelling.
Die Verwendung von Hefe und Pilz-Wirtszellen stellt Erwartungen zufolge solche postranslationalen Modifikationen bereit (beispielsweise proteolytisches Verarbeiten, Myristilierung, Glykosylierung, Verkürzung, und Tyrosin-, Serin- oder Threoninphosphorylierung) wie es erforderlich sein kann, damit den rekombinanten Expression-Produken der Erfindung die optimale biologische Aktivität verliehen wird.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in einer Form bereitgestellt werden, so dass sie außerhalb ihrer natürlichen Zellumgebung sind. So können sie im wesentlichen isoliert oder gereinigt werden, wie vorstehend erörtert oder in einer Zelle, in der sie in der Natur, nicht vorkommen, beispielsweise einer Zelle anderer Pilzarten, Tiere, Hefe oder Bakterien.
C. Rekombinationsaspekte.
Die Erfindung liefert auch Vektoren, umfassend ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, einschließlich Klonierungs- und Expressionvektoren und Verfahren zum Züchten, Transformieruen oder Transfizieren solcher Vektoren in einer geeigneten Wirtszelle, z. B. unter Bedingungen, in denen die Expression eines Polypeptids der Erfindung auftritt. Es werden auch Wirtszellen bereitgestellt, die ein Polynukleotid oder einen Vektor der Erfindung umfassen, worin das Polynukleotid zum Genom der Wirtszelle heterolog ist. Der Begriff "heterolog", normalerweise in Bezug auf die Wirtszelle, bedeutet, dass das Polynukleotid nicht natürlich im Genom der Wirtszelle vorkommt, oder dass das Polypeptid nicht natürlich durch diese Zelle produziert wird. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Hefezelle, z. B. eine Hefezelle der Gattung Kluyveromyces oder Saccharomyces oder eine Pilzzelle, z. B. der Klasse Aspergillus.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können in einem rekombinant replizierbaren Vektor, z. B. einem Klonierungs- oder Expressionvektor eingebracht werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. So stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Polynukleotide der Erfindung durch Einführen eines Polynukleotids der Erfindung in einen replizierbaren Vektor, Einbringen des Vektor in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Reproduktion des Vektors bewirken, bereit. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen sind in Zusammenhang mit Expressionvektoren unten beschrieben.
Vektoren
Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann in eine Expressionskassette eingebracht werden. Der Vektor, in den die erfindungsgemäße Expressionskassette oder das Polynukleotid eingesetzt wird, kann ein beliebiger Vektor sein, der geeigneterweise DNA-Rekombinationsverfahren unterworfen werden kann, und die Auswahl des Vektors hängt oft von der Wirtszelle ab, in die er eingeführt werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, wie ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit de(m/n) Chromosom(en) repliziert, in die er integriert wurde.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid in einem Vektor ist vorzugsweise operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft, die in der Lage ist, die Expression der codierenden Sequenz durch die Wirtszelle bereitzustellen, d. h. der Vektor ist ein Expressionsvektor. Der Begriff "operativ verknüpft" betrifft ein Nebeneinanderliegen, wobei die beschriebenen Komponenten eine Beziehung zueinander haben, die es ihnen gestattet, auf ihre beabsichtigte Weise zu wirken. Eine regulatorische Sequenz, wie ein Promotor, Enhancer oder ein anderes Expressionsregulationssignal, das mit einer codierenden Sequenz "operativ verknüpft" ist, ist derart platziert, dass eine Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erzielt wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Der Vektor kann gewöhnlich im Fall von Plasmid-, Cosmid-, Virus- oder Phagenvektoren, mit einem Replikationsursprung, gegebenenfalls einem Promotor zur Expression des Polynukleotids und gegebenenfalls einem Enhancer und/oder einem Regulator des Promotors ausgestattet werden. Eine Terminatorsequenz sowie eine Polyadenylierungssequenz können vorhanden sein. Der Vektor kann ein oder mehrere Selektionsmarkergene enthalten, zum Beispiel ein Ampicillin-Resistenzgen (im Fall eines bakteriellen Plasmids), oder ein Neomycin-Resistenzgen (für einen Säuger-Vektor). Vektoren können in vitro, zum Beispiel zur Produktion von RNA, oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle verwendet werden. Sie können zwei oder mehr erfindungsgemäße Polynukleotide, beispielsweise zur Überexpression umfassen.
Die DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, wird vorzugsweise in einen geeigneten Wirt als Teil einer Expressionskassete (oder Konstrukts) eingeführt, in dem die DNA-Sequenz mit Expressionssignalen operativ verknüpft ist, die die Expression der DNA-Sequenz in den Wirtszellen steuern können. Zur Transformation des geeigneten Wirts mit dem Expressionskonstrukt sind Transformationsverfahren verfügbar, die dem Fachmann bekannt sind^3,4. Das Expressionskonstrukt kann zur Transformation des Wirts als Teil eines Vektors verwendet werden, der einen Selektionsmarker trägt, oder das Expressionskonstrukt wird als ein separates Molekül zusammen mit dem Vektor transformiert, der einen Selektionsmarker trägt. Der Vektor kann ein oder mehrere Selektionsmarkergene enthalten.
Bevorzugte Selektionsmarker^15,16 beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die einen Defekt in der Wirtszelle komplementieren oder Resistenz gegen einen Arzneistoff verleihen. Sie beinhalten zum Beispiel vielseitige Markergene, die zur Transformation der meisten filamentösen Pilze und Hefen verwendet werden können, wie Acetamidase-Gene oder -cDNAs (die amdS-, niaD-, facA-Gene oder -cDNAs aus A. nidulans, A. oryzae oder A. niger), oder Gene, die eine Resistenz gegen Antibiotika verleihen, wie eine G418-, Hygromycin-, Bleomycin-, Kanamycin-, Phleomycin- oder Benomyl-Resistenz (benA). Alternativ können spezifische Selektionsmarker verwendet werden, wie auxotrophe Marker, die entsprechende mutierte Wirtsstämme erfordern: z. B. URA3 (aus S. cerevisiae oder analoge Gene aus anderen Hefen), pyrG oder pyrA (aus A. nidulans oder A. niger), argB (aus A. nidulans oder A. niger) oder trpC. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Selektionsmarker aus der transformierten Wirtszelle nach Einbringen des Expressionskonstrukts deletiert, um transformierte Wirtszellen zu erhalten, die das Polypeptid produzieren können und frei von Selektionsmarkergenen sind^21.22.
Andere Marker sind u. a. ATP-Synthetase Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase (pvrA), das bakterielle G418-Resistenzgenen (das in Hefe, aber nicht in filamentösen Pilzen verwendet werden kann), das Ampicillin-Resistenzgen (E. coli), das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus) und das E.-coli-uidA-Gen, das für β-Glucuronidase (GUS) codiert. Vektoren können in vitro, zum Beispiel zur Produktion von RNA oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle, verwendet werden.
Für die meisten filamentösen Pilze und Hefe wird das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das Genom der Wirtszelle integriert, um stabile Transformanten zu erhalten. Für bestimmte Hefen sind jedoch auch geeignete episomale Vektoren erhältlich, in die das Expressionskonstrukt für eine stabile Expression in einem hohen Spiegel eingebracht werden kann. Beispiele dafür beinhalten Vektoren, die aus den 2-μ-, und pKD1-Plasmiden von Saccharomyces bzw. Kluyveromyces stammen, oder Vektoren, die eine AMA-Sequenz enthalten (z. B. AMA1 aus Aspergillus^3,20). Wenn Expressionskonstrukte in Wirtszellgenome integriert werden, werden die Konstrukte entweder an zufallsgemäßen Loci in das Genom integriert oder an zuvor bestimmten Zielloci unter Einsatz homologer Rekombination, wobei in diesem Fall die Zielloci vorzugsweise ein hoch exprimiertes Gen umfassen. Ein hoch exprimiertes Gen ist ein Gen, dessen mRNA mindestens 0,01% (w/w) der gesamten zellulären mRNA, zum Beispiel unter induzierten Bedingungen, ausmachen kann, oder alternativ ein Gen, dessen Genprodukt mindestens 0,2% (w/w) des gesamten zellulären Proteins ausmachen kann, oder im Fall eines sezernierten Genprodukt, bis zu einem Spiegel von mindestens 0,05 g/l sezerniert werden kann. Nachstehend wird eine Reihe von Beispielen für geeignete hoch exprimierte Gene bereitgestellt.
Ein Vektor oder Expressionskonstrukt für eine gegebene Wirtszelle enthält gewöhnlich die folgenden Elemente, operativ miteinander verknüpft in aufeinander folgender Reihenfolge vom 5'-Ende zum 3'-Ende relativ zum codierenden Strang der Sequenz, die das Polypeptid der ersten Erfindung codiert:

(1) eine Promotorsequenz, welche die Transkription der DNA-Sequenz, die das Polypeptid in der gegebenen Wirtszelle codiert, steuern kann,
(2) gegebenenfalls eine Signalsequenz, die die Sekretion des Polypeptids aus der gegebenen Wirtszelle in das Kulturmedium steuern kann,
(3) eine DNA-Sequenz, die eine reife und vorzugsweise aktive Form des Polypeptids codiert, und vorzugsweise auch
(4) eine Transkriptionsterminationsregion (Terminator), die die Transkription stromabwärts der DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, terminieren kann.

Stromabwärts der DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, enthält das Expressionskonstrukt vorzugsweise eine 3'-untranslatierte Region, die ein oder mehrere Transkriptionsterminationsstellen, (beispielsweise einen Terminator) enthält. Der Ursprung des Terminators ist weniger wichtig. Der Terminator kann zum Beispiel nativ für die DNA-Sequenz sein, die das Polypeptid codiert. Vorzugsweise wird jedoch in Hefe-Wirtszellen ein Hefe-Terminator verwendet, und ein Terminator aus filamentösem Pilz wird in filamentosen Pilz-Wirtszellen verwendet. Stärker bevorzugt ist der Terminator für die Wirtszelle, (in der die DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, exprimiert wird) endogen.
Eine verstärkte Expression des Polynukleotids, das das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, kann auch durch Auswahl heterologer regulatorischer Regionen erzielt werden, z. B. Promotor-, Sekretionsleader- und/oder Terminator-Regionen, die zur Erhöhung der Expression und, wenn gewünscht, der Sekretionsspiegel des Proteins von Interesse aus dem Expressionswirt und/oder zum Bereitstellen einer induzierbaren Kontrolle der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids dienen.
Neben den Promotor, der für das Gen nativ ist, das für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids zu steuern. Der Promotor kann hinsichtlich seiner Effizienz bei der Steuerung der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids in dem gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
Promoter/Enhancer und andere Expressionsregulationssignale können derart ausgewählt werden, dass sie mit der Wirtszelle kompatibel sind, für die der Expressionsvektor gestaltet worden ist. Zum Beispiel können prokaryontische Promotoren verwendet werden, insbesondere diejenigen, die zur Verwendung in E.-coli-Stämmen geeignet sind. Wenn die Expression in Säugerzellen durchgeführt wird, können Säuger-Promotoren verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, zum Beispiel Hepatozyten-zellspezifische Promotoren, können ebenfalls verwendet werden. Auch virale Promotoren können verwendet werden, zum Beispiel der Promotor aus dem Long Terminal Repeat des Moloney-Mäuseleukämievirus (MMLV-LTR), der Rous-Sarkomvirus-(RSV-)LTR-Promotor, der SV40-(beispielsweise großes T-Antigen)Promotor, der IE-Promotor des humanen Cytomegalievirus (CMV), Herpes-simplex-Virus-Promotoren oder Adenovirus-Promotoren, HSV-Promotoren, wie die HSV-IE-Promotoren) oder HPV-Promotoren, insbesondere die stromaufwärts gelegene regulatorische Region (URR) von HPV. Hefe-Promotoren sind u. a. die S.-cerevisiae-GAL4- und ADH-Promotoren und der S.-pombe-nmt1- und adh-Promotor. Säuger-Promotoren sind u. a. der Metallothionein-Promotor, der als Reaktion auf Schwermetalle, wie Cadmium, induziert werden kann, und β-Aktin-Promotoren. Gewebespezifische Promotoren, wie Endothel- oder nervenzellenspezifische Promotoren (beispielsweise DDAH1 und DDAHII-Promotoren) sind besonders bevorzugt.
Eine Reihe von Promotoren^15,16 kann verwendet werden, die die Transkription in den erfindungsgemäßen Wirtszellen steuern können. Vorzugsweise stammt die Promotorsequenz aus einem hoch exprimierten Gen, wie vorstehend definiert. Beispiele für bevorzugte hoch exprimierte Gene, aus denen die Promotoren vorzugsweise stammen und/oder die in den bevorzugten zuvor festgelegten Zielloci für die Integration von Expressionskonstrukten umfasst sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Gene, die glykolytische Enzyme codieren, wie Triosephosphatisomerasen (TPI), Glyceraldehydphosphatdehydrogenasen (GAPDH), Phosphoglyceratkinasen (PGK), Pyruvatkinasen (PYK), Alkoholdehydrogenasen (ADH), sowie Gene, die für Amylasen, Glucoamylasen, Proteasen, Xylanasen, Cellobiohydrolasen, β-Galactosidasen, Alkohol-(Methanol-)oxidasen, Elongationsfaktoren und ribosomale Proteine codieren. Spezifische Beispiele für geeignete hoch exprimierte Gene beinhalten z. B. das LAC4-Gen aus Kluyveromyces sp., die Methanoloxidase-Gene (AOX und MOX) aus Hansenula bzw. Pichia, die Glucoamylase-(glaA-)Gene aus A. niger und A. awamori, das A. oryzae-TAKA-Amylase-Gen, das A. nidulans-gpdA-Gen und die T.-reesei-Cellobiohydrolase-Gene.
Beispiele für starke konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die für die Verwendung in Pilz-Expressionswirten^15,16 bevorzugt sind, sind diejenigen, die aus dem Pilz-Gen für Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase-Untereinheit 9 (oliC) Triosephosphatisomerase (tpi-), Alkoholdehydrogenase (AdhA), Amylase (amy), Amyloglucosidase (AG aus dem glaA-Gen) erhältlich sind, die Acetamidase-(amdS-) und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(gpd-)Promotoren.
Beispiele für starke Hefe-Promotoren sind diejenigen, die aus dem Gen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase erhältlich sind.
Beispiele für starke bakterielle Promotoren sind u. a. die α-Amylase- und SPo2-Promotoren sowie Promotoren aus extrazellulären Proteasegenen.
Für Pflanzenzellen geeignete Promotoren sind u. a. die Nopalinsynthase-(nos-), Octopinsynthase-(ocs-), Mannopinsynthase-(mas-)Promotoren, die Promotoren der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco-ssu), Histon-, Reis-Aktin-, Phaseolin-, Blumenkohlmosaikvirus-(CMV-)-35S- und -19-S- und Circovirus-Promotoren. All diese Promotoren sind im Stand der Technik leicht erhältlich.
Der Vektor kann ferner Sequenzen enthalten, die das Polynukleotid flankieren, was RNA ergibt, die Sequenzen umfasst, die homolog zu solchen aus eukaryontischen genomischen Sequenzen, vorzugsweise genomischen Säuger-Sequenzen oder viralen genomischen Sequenzen, sind. Dies ermöglicht die Einführung der erfindungsgemäßen Polynukleotide in das Genom von eukaryontischen Zellen oder Viren durch homologe Rekombination. Insbesondere kann ein Plasmidvektor, der die Expressionskassette, flankiert von viralen Sequenzen, umfasst, zur Herstellung eines viralen Vektors verwendet werden, der zur Abgabe der erfindungsgemäßen Polynukleotide an eine Säugerzelle geeignet ist. Weitere Beispiele für geeignete virale Vektoren sind u. a. Herpes-simplex-Virus-Vektoren^18,19 und Retroviren, einschließlich Lentiviren, Adenoviren, adeno-assoziierter Viren und HPV-Viren (wie HPV-16 oder HPV-18). Gentransfertechniken unter Verwendung dieser Viren sind dem Fachmann bekannt. Retrovirus-Vektoren können zum Beispiel dazu verwendet werden, um das Polynukleotid, das die Antisense-RNA erzeugt, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren. Replikationsdefiziente Adenovirus-Vektoren bleiben im Gegensatz dazu episomal und gestatten daher eine transiente Expression.
Der Vektor kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthalten, das in einer Antisense-Richtung orientiert ist, um die Produktion von Antisense-RNA bereitzustellen. Mit dieser können bei Bedarf die Spiegel der Expression des Polypeptids verringert werden.
Wirtszellen und Expression
Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereit, umfassend das Züchten einer Wirtszelle (die mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, transformiert oder transfiziert wurde) unter Bedingungen, die zur Expression (durch den Vektor) einer codierenden Sequenz, die das Polypeptid codiert, geeignet ist, und gegebenenfalls Gewinnen des exprimierten Polypeptids. Erfindungsgemäße Polynukleotide können in einen rekombinanten replizierbaren Vektor, wie beispielsweise einen Expressionsvektor, eingebracht werden. Der Vektor kann zum Replizieren der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. Somit stellt die Erfindung bei einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids durch Einbringen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einen replizierbaren Vektor, Einbringen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Replikation des Vektors herbeiführen, bereit. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen sind u. a. Bakterien, wie E. coli, Hefe, Säugerzelllinien und andere eukaryontische Zelllinien, zum Beispiel Insektenzellen, wie Sf9-Zellen, und (z. B. filamentöse) Pilzzellen.
Vorzugsweise wird das Polypeptid als sezerniertes Protein produziert, wobei in diesem Fall die DNA-Sequenz, die eine reife Form des Polypeptids codiert, in dem Expressionskonstrukt operativ mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die eine Signalsequenz codiert. Die verwendete Signalsequenz ist vorzugsweise nativ (homolog) für die DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert. Alternativ ist die Signalsequenz fremd (heterolog) für die DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, wobei in diesem Fall die Signalsequenz vorzugsweise für die Wirtszelle endogen ist, in der die DNA-Sequenz exprimiert wird. Beispiele für geeignete Signalsequenzen für Hefe-Wirtszellen sind die Signalsequenzen, die von den Hefe-α-Faktor-Genen stammen. Ebenso ist eine geeignete Signalsequenz für filamentöse Pilz-Wirtszellen z. B. eine Signalsequenz, die aus einem Amyloglucosidase-(AG-)Gen eines filamentösen Pilzes, z. B. dem A.-niger-glaA-Gen, stammt. Diese Signalsequenz kann in Kombination mit dem Amyloglucosidase-(auch als (Gluco)amylase bezeichnet) Promotor selbst sowie in Kombination mit anderen Promotoren verwendet werden. Hybrid-Signalsequenzen können im Kontext der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Bevorzugte heterologe Sekretions-Leadersequenzen sind diejenigen, die aus dem Pilz-Amyloglucosidase-(AG-)Gen (glaA – sowohl der 18- als auch der 24-Aminosäuren-Version, z. B. aus Aspergillus), dem α-Faktor-Gen (Hefen z. B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylase-Gen (Bacillus) stammen.
Die Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle, wie vorstehend beschrieben, transformiert oder transfiziert werden, um die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereitzustellen. Dieses Verfahren kann das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, transformiert wurde, unter Bedingungen umfassen, so dass der Vektor einer codierenden Sequenz, die das Polypeptid codiert, exprimiert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt somit Wirtszellen bereit, die mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder Vektor transformiert oder transfiziert worden sind oder die dies umfassen. Vorzugsweise befindet sich das Polynukleotid in einem Vektor zur Replikation und Expression des Polynukleotids. Die Zellen werden derart ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können zum Beispiel prokaryontische (zum Beispiel bakterielle) oder eukaryontische Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
Ein heterologer Wirt kann ebenfalls gewählt werden, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid in einer Form produziert wird, die im Wesentlichen frei von anderen celluloseabbauenden Enzymen ist. Die kann erzielt werden mit einem Wirt, der normalerweise nicht solche Enzyme produziert, wie Kluyveromyces lactis.
Die Erfindung umfasst Verfahren zur Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids mit Hilfe der rekombinanten Expression einer DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert. Zu diesem Zweck kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz zur Genamplifikation und/oder zum Austausch von Expressionssignalen, wie Promotoren, Sekretionssignalsequenzen, verwendet werden, so dass eine ökonomische Produktion des Polypeptids in einer geeigneten homologen oder heterologen Wirtszelle möglich ist. Eine homologe Wirtszelle ist hier als eine Wirtszelle definiert, die von derselben Spezies oder eine Variante innerhalb derselben Spezies ist wie die Spezies, aus der die DNA-Sequenz stammt.
Geeignete Wirtszellen sind vorzugsweise prokaryontische Mikroorganismen, wie Bakterien, oder stärker bevorzugt eukaryontische Organismen, zum Beispiel Pilze, wie Hefe oder filamentöse Pilze, oder Pflanzenzellen. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber filamentösen Pilzzellen bevorzugt, weil sie leichter zu manipulieren sind. Einige Proteine werden jedoch entweder aus Hefen schlecht sezerniert oder in einigen Fällen nicht richtig prozessiert (z. B. Hyperglykosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein filamentöser Pilz-Wirtsorganismus gewählt werden.
Die Wirtszelle kann das Polypeptid überexprimieren, und Techniken zum Engineering der Überexpression sind bekannt³. Der Wirt kann somit zwei oder mehr Kopien des codierenden Polynukleotids haben (und der Vektor kann somit zwei oder mehr Kopien haben).
Bakterien aus der Gattung Bacillus sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine in des Kulturmedium zu sezernieren, als heterologe Wirte sehr geeignet. Weitere als Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen aus den Gattungen Streptomyces und Pseudomonas. Eine bevorzugte Hefe-Wirtszelle zur Expression der DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, stammt aus der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia und Schizosaccharomyces. Stärker bevorzugt wird eine Hefe-Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Spezies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (auch als Kluyveromyces marxianus var. lactis bekannt), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica und Schizosaccharomyces pombe stammen.
Am stärksten bevorzugt sind jedoch (beispielsweise filamentöse) Pilz-Wirtszellen. Bevorzugte filamentöse Pilz-Wirtszellen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, und Talaromyces besteht. Stärker bevorzugt ist eine filamentöse Pilz- Wirtszelle aus der Spezies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans oder ist aus einer Spezies der Aspergillus-niger-Gruppe (wie definiert von Raper und Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, S. 293–344, 1965). Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae und Aspergillus ficuum, und auch diejenigen der Spezies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum und Thielavia terrestris.
Beispiele für bevorzugte Expressionswirte im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie Aspergillus-Spezies (insbesondere die in EPA-184,438 und EP-A-284,603 beschriebenen) und Trichoderma-Spezies; Bakterien, wie Bacillus-Spezies (insbesondere die in EP-A-134,048 und EP-A-253,455 beschriebenen), insbesondere Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas-Spezies; und Hefen, wie Kluyveromyces-Spezies (insbesondere die in EP-A-096,430 beschriebenen, wie Kluyveromyces lactis, und die in EP-A-301,670 beschriebenen) und Saccharomyces-Spezies, wie Saccharomyces cerevisiae.
Erfindungsgemäße Wirtszellen beinhalten Pflanzenzellen, und die Erfindung erstreckt sich deshalb auf transgene Organismen, wie Pflanzen und deren Teile, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Zellen enthalten. Die Zellen können das erfindungsgemäße Polypeptid heterolog exprimieren oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide heterolog enthalten. Im Genom der transgenen (oder genetisch modifizierten) Pflanze kann daher eine Sequenz (gewöhnlich stabil) inseriert sein, die das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Die Transformation von Pflanzenzellen kann unter Verwendung bekannter Techniken durchgeführt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines Ti- oder Ri-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens. Das Plasmid (oder der Vektor) kann somit Sequenzen enthalten, die zur Infektion einer Pflanze notwendig sind, und Derivate der Ti- und/oder Ri-Plasmide können eingesetzt werden.
Alternativ kann die direkte Infektion eines Pflanzenteils, wie eines Blatts, einer Wurzel oder eines Stängels, durchgeführt werden. In dieser Technik kann die zu infizierende Pflanze verwundet werden, beispielsweise durch Schneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge oder Stechen der Pflanze mit einer Nadel oder Aufrauen der Pflanze mit einem Schmirgelmittel. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium angeimpft. Die Pflanze oder der Pflanzenteil kann dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden und kann sich zu einer reifen Pflanze entwickeln. Die Regeneration der transformierten Zellen in genetisch modifizierte Pflanzen kann durch Verwendung bekannter Techniken erzielt werden. Die Regeneration von transformierten Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann mittels bekannter Techniken erzielt werden, beispielsweise durch Auswahl transformierter Stängel mit einem Antibiotikum und Unter-Züchten der Stängel auf einem Medium, das die geeigneten Nährstoffe, Pflanzenhormone und dergleichen enthält¹⁷.
Kultur von Wirtszellen und rekombinante Produktion Die Erfindung umfasst auch Zellen, die derart modifiziert sind, dass sie β-Glucanase oder eine Variante davon exprimieren. Solche Zellen umfassen transiente oder vorzugsweise stabil modifizierte höhere eukaryontische Zelllinien, wie Säugerzellen oder Insektenzellen, niedere eukaryontische Zellen, wie Hefe und (beispielsweise filamentöse) Pilzzellen, oder prokaryontische Zellen wie bakterielle Zellen.
Es ist auch möglich, dass die erfindungsgemäßen Proteine in einer Zelllinie oder auf einer Membran, wie zum Beispiel in einem Baculovirus-Expressionssystem, transient exprimiert werden. Solche Systeme, die dazu ausgelegt sind, die erfindungsgemäßen Proteine zu exprimieren, sind auch im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung enthalten.
Erfindungsgemäß kann die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids durch Züchten mikrobieller Expressionswirte, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Polynukleotiden transformiert wurden, in einem herkömmlichen Nährstoff-Fermentationsmedium durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Wirtszellen können unter Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik gezüchtet werden. Für jede Kombination von einem Promotor und einer Wirtszelle sind Kulturbedingungen verfügbar, die zur Expression der DNA-Sequenz führen, die das Polypeptid codiert. Nach Erreichen der gewünschten Zelldichte oder des gewünschten Titers des Polypeptids wird die Züchtung beendet, und das Polypeptid wird unter Verwendung bekannter Verfahren gewonnen.
Das Fermentationsmedium kann ein bekanntes Kulturmedium umfassen, das eine Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Maltose, Melassen, Cellulose, β-Glucan usw.), eine Stickstoffquelle (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid usw.), eine organische Stickstoffquelle (z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton usw.) und anorganische Nährstoffquellen (z. B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen usw.) enthält. Gegebenenfalls kann ein Induktor (beispielsweise Cellulose, β-Glucan, Maltose oder Maltodextrin) enthalten sein.
Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirtes und/oder auf den regulatorischen Anforderungen des Expressionskonstrukts basieren. Geeignete Medien sind dem Fachmann bekannt. Wenn gewünscht, kann das Medium zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber potenziell verunreinigenden Mikroorganismen begünstigen.
Die Fermentation kann über einen Zeitraum von 0,5–30 Tagen durchgeführt werden. Die Fermentation kann ein Chargen-, ein kontinuierliches oder ein Fed-Batch-Verfahren, geeigneterweise bei einer Temperatur im Bereich zwischen 0°C und 45°C und zum Beispiel bei einem pH von 2 bis 10 sein. Bevorzugte Fermentationsbedingungen beinhalten eine Temperatur im Bereich zwischen 20°C und 37°C und/oder einem pH-Wert zwischen 3 und 9. Die geeigneten Bedingungen werden gewöhnlich auf Basis der Auswahl des Expressionswirtes und des Proteins, das exprimiert werden soll, gewählt.
Wenn nötig, können die Zellen nach der Fermentation aus der Fermentationsbrühe mithilfe von Zentrifugation oder Filtration entfernt werden. Nachdem die Fermentation beendet wurde, oder nach der Entfernung der Zellen kann das erfindungsgemäße Polypeptid dann gewonnen und, wenn gewünscht, gereinigt und durch herkömmliche Mittel isoliert werden.
D. Verwendungen der Polypeptide und Verfahren der Aufbereitung von Pflanzen oder Cellulose-haltiger Materialien
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die β-Glucanase-(oder Cellulase-)Aktivität besitzen, können verwendet werden, um Pilze- oder Pflanzenmaterial einschließlich Pflanzen-Zellstoff und Pflanzenextrakte, zu behandeln. Z. B. können sie verwendet werden, um Getreide, Gemüse, Früchte oder Extrakte davon zu behandeln. Sie können in den Wasch-Zusammensetzungen (Flüssigkeit oder Feststoff, beispielsweise Pulver) und/oder in Detergens-Zusammensetzungen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Polypeptid wird mit geeigneten (festen oder flüssigen) Trägern oder Verdünnungsmitteln einschließlich Puffern kombiniert, so dass man eine Zusammensetzung/ein Enzym-Präparat produziert. Das Polypeptid kann an einen Träger gebunden oder damit gemischt werden, beispielsweise auf einem festen Träger immobilisiert. So stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein Polypeptid der Erfindung. Dieses kann in einer Form sein, die für das Verpacken, den Transport und/oder die Aufbewahrung, geeignet ist, vorzugsweise wo die Glucanase-Aktivität beibehalten wird. Zusammensetzungen schließen Pasten, Flüssigkeits-, Emulsions-, Pulver-, Flocken-, Granulat, Pellet- oder eine andere Extrudat-Form ein.
Die Zusammensetzung kann zudem zusätzliche Bestandteile wie eine oder mehrere Enzyme, z. B. Pektinasen, einschließlich(beispielsweise Endo)-arabinanase und Rhamnogalacturonase, andere Cellulasen, Xylanasen, Galactanasen, Mannanasen und/oder Xyloglucanasen umfassen. Das Polypeptid wird gewöhnlich entweder in flüssiger oder in trockener Form stabil formuliert. Gewöhnlich wird das Produkt als Zusammensetzung gebildet, die gegebenenfalls z. B., einen Stabilisierungs-Puffer und/oder ein Konservierungsmittel umfasst. Die Zusammensetzungen können auch andere Enzyme umfassen, die Pflanzenmaterial oder Cellulose spalten können, Z. B. andere Cellulasen, beispielsweise (β-D)-Glucanasen. Für bestimmte Anwendungen können Immobilisierung des Enzyms auf einer festen Matrix oder Einbringen auf oder in feste Träger-Teilchen bevorzugt werden. Die Zusammensetzung kann auch eine Vielzahl anderer Pflanzenmaterial-abbauender Enzyme umfassen, z. B. (andere) Cellulasen und andere Pektinasen.
Die Polypeptide und die Zusammensetzungen der Erfindung können folglich in einem Verfahren zur Verarbeitung von Pflanzenmaterial verwendet werden, um die Cellulose-Komponenten (beispielsweise β-D-Glucan) der Zellwände des Pflanzen- oder Pilzmaterials abzubauen oder zu modifizieren. So stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Abbau oder Modifizieren einer Pflanzenzelle oder -cellulose bereit, wobei das Verfahren das Zusammenbringen der Pflanzen-, Pilzzelle oder Cellulose mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung der Erfindung umfasst.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Verarbeiten eines Pflanzenmaterial bereit, wobei das Verfahren das Zusammenbringen des Pflanzenmaterials mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung der Erfindung umfasst, um die Cellulose im Pflanzenmaterial zu abzubauen oder zu modifizieren. Vorzugsweise ist das Pflanzenmaterial ein Pflanzen-Zellstoff oder Pflanzenextrakt.
Insbesondere umfasst der Abbau vorzugsweise das Spalten von β-Glucan-Untereinheiten einer Cellulose-Komponente der Pflanzen-Zellwand. Das Pflanzenmaterial ist vorzugsweise ein Getreide, Gemüse, Frucht oder Gemüse- oder Frucht-Zellstoff oder -extrakt. Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein verarbeitetes Pflanzenmaterial bereit, erhältlich durch Zusammenbringen eines Pflanzenmaterials mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Reduzieren der Viskosität eines Pflanzenextrakts bereit, wobei das Verfahren das Zusammenbringen des Pflanzenextrakts mit einem Polypeptid oder einer Zusammensetzung der Erfindung in einer Menge umfasst, die die im Pflanzenextrakt enthaltene Cellulose (oder β-D-Glucan) effektiv abbauen kann.
Pflanzen und Cellulose-haltige Materialien umfassen Pflanzen-Zellstoff, Teile von Pflanzen und Pflanzenextrakte. Im Kontext dieser Erfindung ist ein Extrakt von einem Pflanzenmaterial eine beliebige Substanz, die vom Pflanzenmaterial durch die Extraktion (mechanisch und/oder chemisch), Verarbeiten oder durch andere Trenntechniken hergeleitet werden kann. Der Extrakt kann Saft, Nektar, Basis oder daraus hergestellte Konzentrate sein. Das Polypeptid kann bei (beispielsweise der gesamten) Verflüssigung und/oder (vorgeschrittenen) Mazerierung, beispielsweise bei der Herstellung von (Frucht-)Säften verwendet werden. Das Pflanzenmaterial kann Gemüse, Karotten, Sellerie, Zwiebeln, Hülsenfrüchte oder hülsenartige Pflanzen (Sojabohnenöl, Sojabohne, Erbsen) oder Frucht, beispielsweise, Kernfrucht- oder Samenfrucht (Äpfel, Birnen, Quitte etc.), Trauben, Tomaten, Zitrusfrucht (Orange, Zitrone, Limette, Mandarine), Melonen, Pflaumen, Kirschen, schwarze Johannisbeeren, Johannisbeeren, Himbeeren, Erdbeeren, Moosbeeren, Ananas und andere tropische Früchte, Bäume und Teile davon (beispielsweise Blütenstaub, von Kiefern) oder Getreide (Hafer, Gerste, Weizen, Mais, Reis) umfassen oder davon hergeleitet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können folglich verwendet werden, um Pflanzenmaterial einschließlich Pflanzen-Zellstoff und -pflanzenextrakte zu behandeln. Sie können auch verwendet werden, um flüssige oder feste Nahrungsmittel oder essbare Nahrungsmittelbestandteile zu behandeln.
Gewöhnlich werden die erfindungsgemäßen Polypeptide als Zusammensetzung/Enzym-Präparat verwendet, wie oben beschrieben. Die Zusammensetzung wird im Allgemeinen dem Pflanzen-Zellstoff hinzugefügt, erhältlich z. B. durch mechanisches Verarbeiten, wie Zerstoßen oder Mahlen von Pflanzenmaterial. Die Inkubation der Zusammensetzung mit der Pflanze wird gewöhnlich für eine Zeit von 10 Minuten bis 5 Stunden, wie 30 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise für etwa 1 Stunde durchgeführt. Die Verarbeitungstemperatur ist vorzugsweise 10–55°C, beispielsweise von 15 bis 25°C, optimalerweise etwa 20°C, und man kann 10–300 g, vorzugsweise 30–70 g, optimal etwa 50 g Enzym pro Tonne zu behandelndes Material verwenden. Sämtliches) Enzym(e) oder ihre verwendeten Zusammensetzungen können dem Pflanzen-Zellstoff nacheinander oder gleichzeitig hinzugefügt werden. Je nach der Zusammensetzung des Enzym-Präparates kann das Pflanzenmaterial zuerst mazeriert (beispielsweise zu einem Püree) oder verflüssigt werden. Mit den Polypeptiden der Erfindung können die Verarbeitungsparameter, wie die Ausbeute der Extraktion, Viskosität des Extraktes und/oder Qualität des Extraktes verbessert werden.
Alternativ oder zusätzlich zum Obengenannten, kann ein Polypeptid der Erfindung dem rohen Saft hinzugefügt werden, der durch Pressen oder Verflüssigen des Pflanzen-Zellstoffs erhalten wird. Die Behandlung des Rohsafts wird ähnlich wie der Pflanzen-Zellstoff in Bezug auf Dosierung, Temperatur und Haltezeit durchgeführt. Wieder können andere Enzyme wie die, die vorher besprochen werden, enthalten sein. Typische Inkubationsbedingungen sind wie im vorhergehenden Absatz beschrieben. Sobald der Rohsaft mit den Polypeptiden der Erfindung inkubiert worden ist, wird der Saft dann zentrifugiert oder (ultra-)filtriert, um das Endprodukt zu produzieren.
Eine Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält, kann auch während der Herstellung der Frucht- oder Gemüse-Pürees verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch beim Brauen, bei der Weinproduktion, Destillation oder Backen verwendet werden. Es kann folglich bei der Herstellung alkoholischer Getränke wie Wein und Bier verwendet werden, um z. B. die Filtrierbarkeit oder die Klarheit des Weins zu verbessern. Beim Backen kann das Polypeptid die Teigstruktur verbessern, seine Klebrigkeit oder Geschmeidigkeit ändern, das Laibvolumen und/oder Krumenstruktur verbessern.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann beim Brauen verwendet werden. Beim Brauen können Filtrationsprobleme bei den Zusammensetzungen des Getreideansatzes (mash bill) entstehen, welche übermodifiziertes Malz umfassen, aufgrund der Anwesenheit von β-Glucanen, das bei hohen Temperaturen freigesetzt wird. Die Verringerung der Geschwindigkeit der Stammwürze-Filtration kann eins der Hauptprobleme sein, auf die man stößt. Zusätzliche Probleme sind kolloidale Stabilität und Trübung im fertigen Bier. Diese können durch die gleichen Kohlenhydratkomplexe, besonders während des Brauens unter hoher Schwerkraft verursacht werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können die Filtrierbarkeit der Würze verbessern, z. B. nach dem Maischen. Auf diese Weise kann weniger Stammwürze-Flüssigkeit in den verbrauchten Körnern behalten werden, und die Ausbeute des Extraktes kann verbessert werden. Eine leistungsfähigere Filtration kann eine erhöhte Leistungsfähigkeit der Brauerei ergeben. So können im allgemeinen die erfindungsgemäßen Polypeptide der Erfindung verwendet werden, um die Filtrierbarkeit- oder Filtrationsrate von (beispielsweise fertigem) Bier zu verbessern.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch die Trübung während der Bierherstellung verhindern oder zumindest abschwächen. β-Glucane die sich in den Endospermwänden von Getreide befinden, können in das fertige Bier übertragen werden. Dieses kann Trübung und Verlust der Klarheit verursachen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können die Ansammlung der Teilchen aufgrund der Hydrolyse von β-Glucan verhindern oder mindestens abschwächen. Folglich können die erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet werden, um die kolloidale Stabilität von (beispielsweise fertigem) Bier zu erhöhen.
Die Polypeptide finden in einer Anzahl von Industriegebieten wegen ihrer Glucanase-Aktivität Verwendung. Diese können nicht nur die Alkohol-Produktion, sondern auch Biomethanierung, Brotherstellung und Backen, Zahnpflege (z. B. dentale oder orale Zusammensetzungen), Behandlung von Gewebe, Kleidung oder Lederherstellung, Papierherstellung, pharmazeutische Produkte, Tee, Herstellung oder Behandlung von Textilien, Detergens- oder Waschzusammensetzungen und Behandlung von Abfall einschließen. Ein Aspekt der Erfindung ist folglich ein Lebensmittel oder ein Nahrungsmittel, das das Polypeptid umfasst, wie ein alkoholisches Getränk, Brot, Teig oder Tee. Das Polypeptid kann zu geeigneten Zusammensetzungen für beliebige Verwendungen formuliert werden. Das Polypeptid kann in einer wässrigen Zusammensetzung zugegen sein (z. B. heißem Wasser), vorzugsweise mit einem oder mehreren Fungiziden, damit das Pflanzenmaterial (z. B. Knollen) behandelt wird, insbesondere um parasitische Insekten, Milben und Nematoden zu bekämpfen.
Während die erfindungsgemäßen Polypeptide Glucan abbauen können, kann es Lebensmitteln oder Nahrungsmitteln (z. B. durch Verbrauch durch Menschen) hinzugefügt werden. Es ist bekannt, dass lösliches β-D-Glucan mit der Abnahme des Serumcholesterins und der Triglyzeride einhergeht, und folglich können die erfindungsgemäßen Polypeptide verwendet werden, um Serumcholesterin- und -triglyzeridspiegel in Menschen oder Tieren, z. B. in den hyperlipämischen Individuen zu senken. Die Erfindung umfasst folglich die pharmazeutischen und veterinärmedizinischen Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Polypeptid und den pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verträglichen Träger umfassen. Die Polypeptide können folglich bei der Herstellung eines Medikaments zum Vorbeugen oder Behandeln von Hyperlipämie, oder hohen Serumcholesterin- und Triglyzeridspiegeln oder daraus resultierenden Störungen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch Antipilzaktivität aufweisen. Sie können Pilzzellwände abbauen und können folglich für Pilz-Zellwand-Lysis eingesetzt werden, um die Zellen zu öffnen. Dieses kann intrazelluläre Proteine freisetzen. Bei solch einem Weg können die Polypeptide verwendet werden, um Hefe- und/oder Pilz-Extrakte herzustellen.
E. Tierfutter
Die Erfindung betrifft zudem Nahrungsmittel oder eine Tierfutter-Zusammensetzung, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide umfassen. Das Polypeptid kann im Futter in einer Konzentration zugegen sein, die von seiner natürlichen Konzentration verschieden ist. Bevorzugte Mengen sind von 0,1 bis 100, wie 0,5 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 mg pro Kilogramm Futter.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Zubereitung einer Tierfutter-Zusammensetzung, umfassend das Hinzufügen eines erfindungsgemäßen Polypeptids zu einer oder mehreren essbaren Futtersubstanz(en) oder Bestandteil(en). Die Polypeptide können der Tierfutter-Zusammensetzung separat von Futtersubstanzen oder -bestandteilen, einzeln oder in Verbindung mit anderen Futtermitteladditiven hinzugefügt werden. Das Polypeptid kann ein integraler Teil von einer der Futtersubstanzen oder Bestandteile sein.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch zu cellulosereichen Tierfuttern zugefügt werden, um den Abbau der Pflanzenzellwand zu verbessern, die zu einer verbesserten Nutzung der Pflanzenährstoffe durch das Tier führt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können dem Futter oder der Silage hinzugefügt werden, wenn Quell- oder Nassfutter bevorzugt werden. Vorteilhafterweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide weiterhin Cellulose im Futter in vivo abbauen. Von Pilzen abgeleitete Polypeptide der Erfindung haben insbesondere im Allgemeinen niedrigere pH-Wert-Optima und können wichtige Nährstoffe in einer solchen sauren Umgebung wie dem Magen eines Tiers freisetzen. Die Erfindung erwägt folglich auch (beispielsweise Tier-)Futter oder Nahrungsmittel, die ein oder mehrere Polypeptide der Erfindung umfassen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch während der Produktion von Milchersatzstoffen (oder Milchaustauscher) aus Sojabohne verwendet werden. Diese Milchersatzstoffe können von Menschen und Tieren verzehrt werden. Ein typisches Problem während der Herstellung dieser Milchersatzstoffe ist die hohe Viskosität des Sojabohnenschlamms, was dazu führt, dass eine nicht wünschenswerte Verdünnung der Aufschlämmung auf eine Konzentration der trockenen Feststoffe von 10 bis 15% nötig wird. Ein Enzym-Präparat, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält, kann vor oder während der Verarbeitung der Aufschlämmung hinzugefügt werden, so dass die Verarbeitung bei einer höheren Konzentration (gewöhnlich 40 bis 50%) trockener Feststoffe möglich wird. Das Enzym kann auch bei der Herstellung schmackhafter Produkt(e), verwendet werden, beispielsweise aus der Sojabohne.
Die Zusammensetzung kann zusätzlich (besonders bei der Formulierung zur Verwendung in Tierfutter) einen oder mehrere Ionophore; Oxidationsmittel, Tenside, pansengeschützte Aminosäuren, Enzymverstärker oder Enzyme umfassen, die im Magen-Darm-Trakt von zu fütternden Tieren natürlich produziert werden können.
Bei Zugabe zu Futter (einschließlich Silage) für Wiederkäuer oder monogastrische Tiere (z. B. Geflügel oder Schweine) können die Futter Getreide, wie Gerste, Weizen, Mais, Roggen oder Hafer oder Getreide-Nebenprodukte wie Weizenkleie oder Maiskleie oder andere Pflanzenmaterialien wie Sojabohnen und andere Hülsenfrüchte umfassen. Das oder die Enzym(e) können den Abbau der Pflanzenzellwände erheblich verbessern, was zur besseren Nutzung der Pflanzenährstoffe durch das Tier führt. Demzufolge können Wachstumsrate und/oder Futterverwertung verbessert werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können dem Futter (direkt oder als Additiv oder Bestandteil) beigefügt werden oder behandelte Cellulose (beispielsweise Glucan) kann stattdessen zugegeben werden.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren für die (exogene) Addition von β-Glucanase ist die Zugabe des erfindungsgemäßen Polypeptids als transgenes Pflanzenmaterial und/oder (beispielsweise transgenen) Samen. Das Polypeptid kann folglich durch heterologe Genexpression synthetisiert worden sein, z. B. kann das Gen, welches das gewünschte Enzym codiert, in einen Pflanzen-Expressionvektor, unter Steuerung der passenden Pflanzen-Expressionssignale, beispielsweise einem gewebespezifischen Promotor, wie einem samenspezifischen Promotor kloniert werden. Der Expressionsvektor, der das Gen enthält, das das Polypeptid codiert, kann anschließend in Pflanzenzellen umgewandelt werden, und umgewandelte Zellen können zur Regeneration in vollständige Pflanzen selektiert werden. Die so erhaltenen transgenen Pflanzen können gezüchtet und geerntet werden, und jene Teile der Pflanzen, die das heterologe (zur Pflanze) Polypeptid enthalten, können in eine der Zusammensetzungen eingeschlossen werden, und zwar entweder als solche oder nach weiterer Verarbeitung. Allgemeine Verfahren für die (heterologe) Expression der Enzyme (in transgenen) Pflanzen, einschließlich Verfahren für samenspezifische Expression der Enzyme, sind bekannt²³. Das heterologe Polypeptid kann im Samen der transgenen Pflanzen enthalten sein, oder es kann in anderen Pflanzenteilen wie Wurzeln, Stämmen, Blättern, Holz, Blüten, Borke und/oder Frucht enthalten sein. Die Pflanze kann eine Monokotyledone oder ein Dikotyledone sein. Geeignete Pflanzen umfassen Getreide, wie Hafer, Gerste, Weizen, Mais und Reis. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynukleotid stabil im Pflanzengenom integriert.
Die Zugabe des Polypeptids in Form von transgenem Pflanzenmaterial, beispielsweise im transgenen Samen, kann die Verarbeitung des Pflanzenmaterials erfordern, damit das Enzym verfügbar wird, oder zumindest seine Verfügbarkeit verbessern. Solche Verarbeitungstechniken können verschiedene mechanische (beispielsweise Mahlen und/oder Schleifen) Techniken oder thermomechanische Behandlungen wie Extrusion oder Expansion umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft folglich auch ein Verfahren zur Förderung des Wachstums und/oder der Futterverwertung in einem monogastrischen Tier oder Nichtwiederkäuer, wobei das Verfahren das Verfüttern des erfindungsgemäßen Polypeptids an das Tier umfasst. Geeignete Tiere schließen Nutztiere, monogastrische Tiere und/oder Nichtwiederkäuer wie Schweine (oder Ferkel), Geflügel (wie Hühner, Truthähne), Kälber oder Kalbfleisch oder im Wasser (beispielsweise im Meer) lebende Tiere (z. B. Fisch) ein.
Tests auf Cellulose-abbauende Enzyme
Auch innerhalb der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids bei Screening-Verfahren zur Identifiaktion von Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten dienen können, die die β-Glucanase modulieren können. Allgemein ausgedrückt können solche Screening-Verfahren das Zusammenbringen eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit einer Test-Verbindung und dann Messen der Aktivität oder Inkubieren eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit einer Testsubstanz und dann Nachweisen jeglicher Modulation der β-Glucanase-Aktivität umfassen. Mittel, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden, können auch durch Bindungsassays identifiziert werden.
Die Modulatoraktivität kann nachgewiesen werden, durch Zusammenbringen von Zellen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren, mit einer zu untersuchenden Substanz und Überwachen der Wirkung, die durch die Polypeptide vermittelt wird. Die Zellen, die das Polypeptid exprimieren, können in vitro sein und vorzugsweise wird der Test in vitro mit den Zellen durchgeführt, die das rekombinante Polypeptid exprimieren.
Die hierin beschriebenen Tests und Substrate ermöglichten die Identifikation und Bestätigung der β-Glucanase-Aktivität. Jedoch können diese Tests verwendet werden, um andere Cellulose-abbauende Enzyme nachzuweisen, unabhängig davon, ob sie β-Glucanase-Aktivität haben oder nicht. Das Substrat, das für diesen Test verwendet werden kann, kann β-Glucan umfassen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Test zur Identifikation oder zum Nachweis eines Polypeptids, das Cellulose abbauen kann. Die Aktivität kann eine Glucanase (beispielsweise β-Glucanase) oder Cellulase oder Xyloglucanase sein. Der Test kann umfassen:

(a) Bereitstellen des im vorhergehenden Absatz beschriebenen Substrats als Substrat für eine Kandidatenverbindung (gewöhnlich ein Polypeptid); und
(b) Zusammenbringen des Substrats mit der Kandidatenverbindung und Nachweisen, ob irgendwelche Kohlenhydrate produziert wurden.

Die Menge dieser Kohlenhydrate kann gemessen werden. Bei Bedarf können sie dann mit der Menge der Kohlenhydrate verglichen werden, die in einem Kontrollexperiment bei Fehlen der Kandidatenverbindung produziert werden.
Die oben genannten Tests können eingesetzt werden, um Modulatoren der β-Glucanase-Aktivität zu identifizieren.
Bevorzugte Merkmale und Eigenschaften von einem Aspekt der Erfindung sind auf einen anderen Aspekt entsprechend anwendbar.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich veranschaulichend und nicht einschränkend sein sollen.
BEISPIELE
Allgemeine Verfahren
Molekulare Standard-Klonierungstechniken wie DNA-Isolation, Gelelektrophorese, enzymatische Restriktionsmodifikationen der Nukleinsäuren, Southern-Analysen, E. Coli-Transformationen, Kolonie-Lifts und Filter-Hybridisierungen etc., wurden mit Standardtechniken durchgeführt^1,2. Synthetische Oligodesoxynukleotide wurden von ISOGEN Bioscience (Maarssen, die Niederlande) erhalten. DNA-Sequenzanalysen wurden mit einer Applied Biosystems 373A DNA Sequenziervorrichtung, entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt.
DNA-Markierung und Hybridisierungen wurden entsprechend den ECL^TM Direkt-Nukleinsäuremarkierungs- und -nachweissystemen (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, England) oder entsprechend den radioaktiven Markierungs-Standardtechniken durchgeführte.
Beispiel 1: RNS-Isolation aus T. emersonii und Synthese von cDNA
Der T. emersonii-Stamm CBS 393.64 wurde unter Cellulase-induzierenden Bedingungen fermentiert. An einigen Zeitpunkten wurden Myzel und Kulturüberstände durch Filtration mittels Miracloth Filtrationsumwicklung geerntet. Myzel wurde ausgiebig mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und zwischen Papiertüchern zusammengedrückt, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Myzel von ausgewählten Zeitpunkten (bezogen auf Cellulasemessungen in den Kulturüberständen) wurde sofort in flüssigem Stickstoff gefroren und mit Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen. Das resultierende Pulver wurde in ein steriles 50-ml- Rohr überführt und gewogen: für jede 1–1,2 g gemahlenes Myzes wurden 10 ml TRIzol-Reagens (Gibco/BRL) zugegeben (Maximum 25 ml pro Röhrchen). Das Myzel-Pulver wurde sofort durch heftiges Mischen (Vortexing, 1 Minute) solubilisiert, gefolgt von 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen. 0,2 (Original TRIzol) Volumen Chloroform (somit 2 ml für alle ursprünglich verwendeten 10 ml TRIzol) wurden zugegeben, im Vortexer gemischt und bei Raumtemperatur für 10 min belassen. Anschließend wurde das Gemisch bei 4°C, 6000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen überführt und die Gesamt-RNA wurde durch Zugabe von 0,5 (Original TRIzol) Volumen Isopropylalkohol (somit 5 ml Isopropylalkohol für alle ursprünglich verwendeten 10 ml TRIzol) ausgefällt. Nach 10 Minuten Fällung bei Raumtemperatur, wurde die RNA durch Zentrifugierung für 30 Minuten bei 6000 g gewonnen. Bei Entfernen des Überstands wurde das RNA-Pellet mit einem Volumen von 70% Ethanol gespült. Nach Entfernen des Ethanols wurde das RNS-Pellet an der Luft getrocknet. Das getrocknete RNS-Pellet wurde in 3 ml GTS(100 mM Tris-Cl, pH 7,5, 4 M Guanidiumthiocyanat, 0,5% Natriumlaurylsarcosinat)-Puffer gelöst. 10 μl RNA-Lösung wurde verwendet, um Qualität und Konzentration der Nukleinsäuren zu bestimmen.
Northern-Analyse wurde durchgeführt³ und die isolierte RNA weiter gereinigt^1,3. Zur Isolation von mRNA wurde ein modifiziertes Protokoll (mittels Gravitationsfluss anstelle von Zentrifugierung) des PHARMACIA Reinigungs-Kit (Kat. Nr.. 27-9258-02) verwendet³. Für cDNA-Synthese wurde das STRATAGENE cDNA-Synthese KIT entsprechend den Herstelleranweisungen verwendet, außer einer Anzahl von Optimierungen zur Verwendung der pGBFIN-Vektoren, wobei die Hauptänderungen, wie vorher beschrieben sind³.
Die Menge der synthetisierten cDNA wurde durch TCA-Fällung geschätzt und anschließend über Elektrophorese in alkalischen Agarose-Gelen analysiert³.
Beispiel 2: Herstellung einer cDNA-Bank aus T. emersonii mRNA
Der in Beispiel 1 erhaltene cDNA-Pool wurde stumpfendig gemacht, mit Adaptern ligiert und mit Restriktionsenzym gespalten³.
Die Klonierung der cDNA in den Expressionvektor pGBFIN-11 (siehe WO-99/32617 für den Aufbau dieses Vektors), erfordert die Anwesenheit einer EcoRI-Spaltstelle am 5'- und einer XhoI-Spaltstelle am 3'-Ende der cDNA. Folglich wurden das Erststrang-Priming-Oligonukleotid und die verwendeten Adaptersequenzen (Pharmacia) gewählt, damit die Vorbedingungen erfüllt waren, die für den Expressionvektor eingestellt wurden.
Die erhaltenen cDNAs wurden über Größenfraktionierung durch eine SEPHAROSE CL-2B-Matrix getrennt, auf deren Größe die einzelnen erhaltenen Pools über nicht-denaturierende Gelelektrophorese analysiert wurden³. Zwei Pools von cDNAs, erhalten über Ausschlussgrenzen bei 0,5 kb beziehungsweise 1,0 kb wurden für den Aufbau der cDNA-Bank in pGBFIN-11 gewählt. Für pGBFIN-11, wurde ein Pool des vollständig doppelt-gespaltenen (EcoRI-XhoI) pGBFIN-11-Vektors (Hintergrundligierung < 1%) hergestellt. Die gewählten cDNA-Pools wurden in pGBFIN-11-Vektor ligiert und in E. coli XL10-Gold-Bakterienzellen transformiert, so dass zwei primäre cDNA-Banken erzeugt wurden. Die Transformationsfrequenzen der beiden Pools waren jeweils > 1,0 × 10⁶. Von einer Fraktion beider E. coli cDNA-Banken wurden Kolonien statistisch selektiert und Plasmid-DNA wurde isoliert. Die Analyse dieser Plasmid-DNA zeigte, dass beide cDNA-Banken Insert-Prozentsätze zwischen 90 und 95% hatten.
Darüber hinaus wurden Kolonie-Lifts von einer Fraktion der Bank durchgeführt, und die erzeugten Filter wurden nachher mit T. emersonii gpdA-Gen hybridisiert, das das Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Gen codiert. Anschließend wurde Plasmid-DNA isoliert und über Restriktionsanalyse wurde gezeigt, dass alle Plasmide einzelne Inserts in der korrekten Orientierung enthielten. Die Sequenzierung der 5'-Enden der cDNAs innerhalb dieser T. emersonii-gpdA-enthaltenden Plasmide zeigte, dass > 85% volle Länge aufwies.
Beispiel 3: Transformation der Expressionsbank zu A. niger
DNA wurde aus der E. coli cDNA-Bank, wie früher beschrieben isoliert. Gesamtplasmid-DNA wurde 4 Stunden lang bei 37°C mit NotI gespalten, um von E. coli stammende Plasmidsequenzen zu entfernen. Nach Reinigung wurde die DNA in sterilem entmineralisiertem Wasser gelöst.
Mehrfache A. Niger DS2978-Transformationen wurden durchgeführt³ mit 1,5 × 10⁷ B 3,0 × 10⁷ Protoplasten und 10 μg Plasmid-DNA pro Transformation. Transformanten wurden auf die Anwesenheit des amadS-Selektionsmarkers durch Anzucht auf Acetamid als einzige N-Quelle selektiert. Da sowohl der amdS-Selektionsmarker als auch die cDNA-Expressionkassette auf dem integrierenden Fragment zugegen sind, ist Wachstum auf Acetamid hinweisend für die Anwesenheit einer cDNA-Expressionkassette.
Nach ungefähr 7–10 Tagen Inkubation bei 30°C, wurden 10000 Transformanten gereinigt: die Aspergillus niger-Transformanten wurden mittels Roboter (FlexysJcolony Picker Automater) von den Transformationsplatten in Mikrotiterplatten (MPs) mit 96 Vertiefungen mit 150 μl pro Vertiefung mit erstarrtem Selektionsmedium (SM) (pro 1000 ml: 0,52 g KCl, 1,52 g K₂HPO₄, 0,52 g MgSO₄, 20 g Glucose, 1 g Acetamid, 0,1 M MES-Puffer, 15 g Agar, 1 ml Spurenenelementlösung [Spurelementlösung (enthaltend pro 1 Liter): 2,2 g ZnSO₄/7H₂O, 1,1 g H₃BO₃, 0,5 g FeSO₄/7H₂O, 0,17 g CoCl₂/6H₂O, 0,16 g CuSO₄/5H₂O, 0,15 g NaMoO₄/2H₂O, 5,0 g EDTA, pH 6,5] pH 5,5, überführt. Die Transformanten wurden 5 Tage bei 34°C auf SM gezüchtet. Der so erzeugte Satz von MPs wurde verwendet, um 1) MTPs anzuimpfen für das Wachstum und den darauf folgenden Enzymnachweis und 2) Sicherungs-Platten (BPs) der cDNA-Bank zu erstellen, die bei –80°C aufbewahrt wurden.
Beispiel 4: Analyse der T. Emersonii-Expressionsbank
5 Tage alte gewachsene MPs wurden als Replikationschablone verwendet und auf Platten mit frischem Selektionsmedium (SM), enthaltend pro Liter: 0,52 g KCl, 1,52 g K₂HPO₄, 0,52 g MgSO₄, 20 g Glucose, 1 g Acetamid, 0,1 M MES-Puffer, 15 g Agar, 1 ml Spurenelementlösung [Spurenelementlösung (enthaltend pro 1 Liter): 2,2 g ZnSO₄/7H₂O, 1,1 g H₃BO₃, 0,5 g FeSO₄/7H₂O, 0,17 g COCl₂/6H₂O, 0,16 g CuSO₄/5H₂O, 0,15 g NaMoO₄/2H₂O, 5,0 g EDTA, pH 6,5] pH 5,5, replikaplattiert.
Direkt nach dem Animpfen wurden die Platten bei 34°C für 48 Std. inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit einer Topagar enthaltenden Carboxymethylcellulose (CMC) (5 g Agarose, 0,5 g CMC (Sigma ref. C4888), hergestellt in 1000 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 7) überschichtet. Sobald sich der Topagar verfestigte, wurden die Platten bei 65°C 4 Stunden lang belassen. Für die Sichtbarmachung der Aktivität wurden die Platten mit einer der Kongo-Rot-Lösung (10 g Kongo-Rot in 1000 ml Phosphatpuffer pH-Wert 7) für 15 Minuten gefärbt. Die Färbe-Lösung wurde verworfen, und die Platten wurden mit 1 M NaCl (58,44 g in 1 Liter destilliertem Wasser) gewaschen. Dieser letzte Schritt wurde zweimal wiederholt. Positive Klone erschienen durch Formen eines blassen Clearance-Halos auf einem roten Hintergrund.
Die positiven Cellulaseklone aus diesem ersten Screening (das ein klares Halo nach dem Kongo-Rot-Screening zeigt) wurden auf frischem SM-Medium erneut überimpft und für 5 Tage bei 34°C gezüchtet. Die so erhaltene Matrizenplatte wurde dann auf Selektionsmedium und auf Selektionsmedium, das 0,075 (W/V) AZCL-Cellulose (Megazyme Katalog-Nr. I-AZCEL) enthielt, replikaplattiert. Die SM-Platten wurden behandelt und wie vorher beschrieben (Wachstum bei 34°C und anschließendes Screening über eine Cellulose-enthaltene Überschichtung und Kongo-Rot-Färbung) bewertet, wohingegen die SM-AZCEL-Cellulose-Platten bei 34°C für 48 Std. inkubiert und dann weiter bei 65°C für 8 Std. inkubiert wurden. Die SM-AZCL-Cellulose-Platten wurden vor und nach der Hochtemperaturinkubation ausgewertet. Die positiven Cellulase-Klone ergeben einen diffusen blauen Halo.
Schließlich wurden 20 positive Cellulase-Klone identifiziert. Cellulase-produzierende Aspergillus-Transformanten, wie im Xylanase-Plattentest identifiziert, wurden über Schüttelflaschen-Fermentation gezüchtet³. Mediumproben wurden nach 5 Tagen Fermentation entnommen und auf Cellulase-Aktivität, wie später beschrieben, analysiert.
Beispiel 5: Genetische Analyse positiver Transformanten
Die positiven (bestätigten) identifizierten Transformanten wurden auf flüssigem Medium gezüchtet, das Myzel wurde geerntet und die Gesamt-(chromosomale)DNA wurde mit dem Puregene Isolation System (Biozym B. V.) für DNA-Isolation aus filamentösen Pilzen isoliert. DNA-Isolation und Reinigung wurden entsprechend dem Hersteller-Protokoll durchgeführt, jedoch geringfügig modifiziert: Die Protein-Fällungschritte 3 und 4 wurden wiederholt.
Chromosomale DNA wurde als Matrize in einer PCR-Reaktion mit Primer 12207 (SEQ ID NR: 8) und 11937 (SEQ ID NR: 7) verwendet, um das oder die Inserts, die in der in chromosomaler DNA integrierten Expressionkassette vorhanden sind, zu amplifizieren.
Direkte PCRs an Transformanten wurden entsprechend einer angepassten Version eines bekannten Protokolls⁴ durchgeführt, in dem das erhaltene Myzel nachher mit GlucanexJ (Novo Nordisk) bei 5 mg/ml Konzentrationen anstelle mit NOVOzyme behandelt wurde.
PCR-Reaktionen enthielten eLONGase^TM B-Puffer (Life-Technologies, Breda, Niederlande), dNTPs (jeweils 200 μM), 1 μl eLONGase Enzym-Mischung, 1–5 μl Matrize und 10–30 pmol jedes Oligos in einem Endvolumen von 50 μl. Die optimale Menge Oligos wurde experimentell für jeden gekauften Ansatz bestimmt. Im Durchschnitt wurden 10 bis 30 pmol verwendet. Die Reaktionen wurden mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 1 × (2 Minuten); 94°C, 35 × (1 min 94°C, 1 min 55°C, 6 min 72°C), 1 × (7 min 72°C). Die Proben wurden auf Agarose-Gele zur Analyse der PCR-Produkte geladen.
Das so erhaltene PCR-Produkt wurde in E. coli per2.1-Klonierungsvektor (Invitrogen, entsprechend den Herstelleranweisungen) subkloniert, so dass das Plasmid pGBCEA-1 erhalten wurde.
Das subklonierte PCR-Produkt wurde sequenziert. Die resultierende Nukleotidsequenz der codierenden Region ist in SEQ ID NR: 1 dargestellt, und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Proteins in SEQ ID NR: 2. Dieses Protein wurde als CEA bezeichnet.
Beispiel 6: Viskosimetrisches Screening einer cDNA-Expressionsbank mit dem Hamilton Viscorobot.
Viskosimetrische Messungen
Kapillarviskosimeter sind der am häufigsten verwendete Typ Viskosimeter, die für die Messungen viskoser Flüssigkeiten verwendet werden. Im Allgemeinen wird die interessierende Flüssigkeit durch ein Kapillarrohr unter einer bekannten Druckdifferenz geleitet. Dann wird die Strömungsgeschwindigkeit, normalerweise durch Aufzeichnen der Zeit, die ein gegebenes Volumen Flüssigkeit benötigt, um eine Graduierungsmarkierung zu passieren, gemessen. Andere Typen Viskosimeter pressen die Flüssigkeit durch eine Kapillare mit einer festgelegten Strömungsgeschwindigkeit und der dadurch erzeugte Druckabfall, der über der Kapillare produziert wird, wird gemessen, um die Flüssigkeitsviskosität zu bestimmen. Der gesteuerte enzymatische Abbau polymerer viskoser Lösungen kann verwendet werden, um die Enzymaktivität zu bestimmen. Vorausgesetzt, das numerische Verhältnis zwischen der Viskosität und der Konzentration der Flüssigkeit ist bekannt, können kinetische Parameter wie die Michaelis-Menten-Konstante, geschätzt werden.
I. Das Nachweissystem
(a) Die Einstellung des Hamilton-Viscorobots
Der Hamilton-Pipettier-Roboter (Hamilton Workstation Microlab 2200, Hamilton Company, Reno, USA) wurde durch ein Software-Programm mit der Bezeichnung Eclipse (Hamilton Company) gesteuert. Diese Software ermöglicht dem Benutzer, den Sondenarm auf eine bestimmte Position innerhalb des Hamilton-Arbeitsbereichs zu leiten. Es wurde ein Standard-Viscotest-Eclipse-Programm entwickelt. Dieses Programm arbeitet auf MTPs mit 96 Vertiefungen, wo jede Vertiefung einzeln adressiert werden kann. Die Spritzen werden verwendet, um Probenflüssigkeit an einer Eclipse-spezifizierten Position durch die Nadelöffnung anzusaugen oder zuzuführen. Die Ansaug- und Abgabegeschwindigkeit (in s/ml) sowie die Ansaug- und Abgabevolumen (in μl) wurden willkürlich spezifiziert. Durch Realisieren von Rack-Definitionen kann auf mehrfache Reagensbehälter in einer leistungsfähigen und zeitsparenden Weise zugegriffen werden. Der Übertrag von Probenflüssigkeit von einem Pipettierschritt zum nächsten wurde vermieden, indem man Eclipse anwies, die Schläuche mit System-Flüssigkeit zu spülen. Die Ansauggeschwindigkeit von 10 s/ml (manchmal 15 s/ml) war geeignet, um die meisten Viskositäten zu unterscheiden, indem man Peakhöhen verfolgte. Normalerweise wurden 200–250 μl Probenflüssigkeit angesogen und zugeführt.
(b) Hamilton-Einstellung
Das Ansaugen der Probenflüssigkeit erzeugt einen Druckabfall über die wassergefüllten Schläuche. Die Größe des Druckabfalls hängt von der Ansaug-(oder Kolben-Bewegung)-Geschwindigkeit und von der Viskosität der Probenflüssigkeit ab. Der größte Druckabfall wird in der Nadelspitze verursacht, da der Radius am kleinsten ist (ungefähr 0,3 mm). Das Ansaugen der Probenflüssigkeit verursacht Druckwechsel, die vom T-Stück zum Druckwandler weitergegeben werden. Der Wandler (Dépex B. V., de Bilt, Niederlande) wandelt die Größe des Unterdruckes in einen elektrischen Strom um. Der elektrische Strom wird vom Datataker einmal pro Sekunde gelesen und anschließend im Speicher des Datatakers in einem digitalen Format gespeichert. Ein an den Datataker angeschlossener Computer ermöglicht (über die Delogger-Software) den Download des Datataker-Speichers in Dateien. Sie können wiederum durch allgemeine Tabellenkalkulationsprogramme (wie Microsoft Excel) gelesen und analysiert werden. Da der Druck über die Zeit gemessen wurde, kann der endgültige Ausgang durch Aufzeichnen der Größe des Unterdruckes (in mV) gegen die Zeit (in Sekunden) sichtbar gemacht werden. Nach Verstellung des T-Stücks zu einer Position direkt hinter der Nadel, ist das Drucksignal vom Ansaugvolumen weniger abhängig.
(c) Die Herstellung von Eichkurven ermöglichte die Ermittlung der Viskosität jeder möglichen Flüssigkeit.
Entsprechend dem Gesetz von Poisseuille sollte der gemessene Druckabfall direkt proportional zur Viskosität sein; da gilt:
Mit dieser Formel kann man den Millivoltunterdruckausgang auf die unbekannte Viskosität der Probenflüssigkeit beziehen. Dieses erfolgte durch Ansaugen eines definierten konstanten Volumens Kalibrierungsflüssigkeit (normalerweise Glycerin, da es einen breiten Bereich von Viskositäten abdeckt und es sich in einer Newton'schen Weise verhält) bei verschiedenen Konzentrationen. Der so verursachte Unterdruck bezieht sich auf den mV-Ausgang durch einen unbekannten Faktor F. Da die absoluten Viskositäten der verschiedenen Glycerinkonzentrationen bekannt sind, produziert ein Plot des mV-Unterdruckausgangs für verschiedene bekannte Glycerinkonzentrationen gegen die bekannten absoluten Viskositäten der gleichen Glycerinkonzentrationen eine gerade Linie durch den Ursprung (da P = (mV)·Fη/k).
(d) Eclipse-Programm verwendet für Full-Scale-Screening.
Ein einzelner Messzyklus besteht aus dem Ansaugen von 250 μl Probe und Überstand-Substratgemisch) mit einer Ansauggeschwindigkeit von 10 s/ml. Vor dem Ansaugen der Probenflüssigkeit, wurden 40 μl Luft angesogen, um System von der Probenflüssigkeit zu trennen. Sobald das Ansaugen der Probenflüssigkeit beendet war, erfolgte die Abgabe von 290 μl Probe und Luft. Dieser Messzyklus wurde sechsmal wiederholt und gefolgt von einem 5 ml Waschschritt, um die Schläuche zu säubern.
II. Test-Entwicklung
(e) Herstellen des optimalen Substratgemischs aus Pektin und Xylan zum Screening
Das Verwenden von mehr als einem viskosen Substrat hatte mehrere Vorteile. Man kann auf unterschiedliche Typen der Enzyme gleichzeitig screenen. Dieses sparte eine große Menge Bemühung und Zeit, während weniger Substrat erfordert wurde. Zusätzlich zum Haferspelzen-Xylan wurde es entschieden, Pektin als das zweite Substrat zu verwenden. Eine 1:1-Lösung von 1% Pektin und 7% Haferspelzen-Xylan schien für das Screening am besten zu sein. Da es proportional wenig Klone in der Bank gab, hatten die meiste Peaks eine ungefähre Höhe von 435 mV. Bei einer positiven Xylanase-Probe wurde das gesamte oder das meiste Xylan abgebaut, damit nur 0,5% Pektin übrig blieb. Folglich produzierte ein positiver Xylanase-Klon eine Peakhöhe von 280 mV. Im Falle eines Pektin-Abbauklons war die Peakhöhe 220 mV.
(f) Bestimmung der minimalen Xylanase-Aktivität, die zum Erfassen mit dem Hamilton-Viscoroboter nötig war.
Das Screening erfolgte mit sehr kleinen Volumen Substrat und Überstand, da eine einzelne Mikrotiterplatte-Vertiefung höchstens 360 μl enthält; Je mehr Überstand zugefügt wurde, desto mehr wurde weiterhin das Substrat verdünnt, und desto mehr wurde die Ausgangsviskosität verringert. 250 μl 6% Hafer-Spelzen-Xylan wurde in die Vertiefungen eines MTP zugeführt. Die Verdünnung einer Reihe einer Referenzxylanase (A. tubigensis-Xylanase mit einer Aktivität von 685.400 EXU/g, wobei 1 EXU = 4,53 Mol reduzierender Zucker/min/g) wurde hergestellt und 30 μl von jeder Verdünnung wurden dem Substrat hinzugefügt. Nach Inkubation für 24 Stunden bei 50°C wurde die Viskosität jeder Probe gemessen. Die niedrigste nachweisbare Enzymkonzentration entspricht 53,6 ng/ml oder 0,0367 EXU/ml. Folglich ermöglicht die Addition von 20 μl Überstand zu 300 μl Substrat die Abfragung extrem niedriger Enzymaktivitäten.
(g) Einstellen des Screenings zur Identifikation von thermostabilen Enzymen.
Zur Aufnahme von nur hitzebeständigen Enzymen aus der Bank und zur Vermeidung von Interferenz der Wirts-A. Niger-Enzymaktivität, wurden die Platten mit den Klonen, die die thermostabilen Enzymkandidaten enthielten, einer Wärmebehandlung unterworfen. Das System wurde mit leeren Wirtsstämmen, Wirtsstämmen, die thermolabile Enzyme exprimieren und Wirtsstämmen, die thermostabile Enzyme exprimieren, validiert. Nach dem Wachstum der Stämme und Produktion des Enzyms wurden die MTP-Platten bei 72°C für 30 Minuten erhitzt. Anschließend wurden 20 μl Überstand zu 300 μl 6% Haferspelzen-Xylan hinzugefügt. Zusammen mit negativen Kontrollen (Zugabe von 20 μl Wasser), wurden die Platten, welche die Proben enthielten, mit Klebeband verschlossen und bei 60°C in einem Ofen inkubiert. Die hohe Temperatur kann jede thermostabile Enzymaktivität erhöhen aber zerstört sowohl die Hintergrund-Wirt-A. Niger-Enzym-störende-Aktivität als auch die nicht-hitzebeständigen Enzymaktivitäten, die durch die Bank exprimiert werden. Nach 20 Stunden Inkubation, wurden keine bemerkenswerten Peaks für die thermolabilen Xylanase-Klone gefunden, was zeigt, dass die Wirts-Xylanase-Aktivität gänzlich inaktiviert worden ist. Klone des wärmeunbeständigen Xylanase-Enzyms von Aspergillus Niger waren zudem als Kontrolle eingeschlossen. In diesem Fall konnte keine Restaktivität ermittelt werden, während andererseits die als Kontrolle enthaltene hitzebeständige Xylanase noch aktiv war. Hitze-Inaktivierung für 30 Minuten bei 72°C und Probeninkubationszeiten von 24 Stunden oder weniger ermöglichten uns, hitzebeständige T. emersonii-Xylanasen spezifisch zu ermitteln.
III. Screening der cDNA-Expressionsbank mit dem Hamilton Visco-Roboter
(h) Replikation der cDNA ExpressionsBank und Expression der Bank.
Ein Reproduktionszyklus beinhaltet die doppelte Beimpfung von Selektionsmedium (SM), enthaltend pro Liter: 0,52 g KCl, 1,52 g K₂HPO₄, 0,52 g MgSO₄, 20 g Glucose, 1 g Acetamid, 0,1 M MES-Puffer, 15 g Agar, 1 ml Spurenelementlösung [Spurenelementlösung (enthaltend pro 1 Liter): 2,2 g ZnSO₄/7H₂O, 1,1 g H₃BO₃, 0,5 g FeSO₄/7H₂O, 0,17 g CoCl₂/6H₂O, 0,16 g CuSO₄/5H₂O, 0,15 g NaMoO₄/2H₂O, 5,0 g EDTA, pH 6,5] pH 5,5 und flüssiges Wachstumsmedium (GM) (enthaltend pro Liter 70 g Glucose, 25 g Casein-Hydrolysat, 12,5 g Hefeextrakt, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g K₂SO₄, 2 g MgSO₄, 0,03 g ZnCl₂, 0,02 g CaCl₂, 0,01 g MnSO₄, 0,3 g FeSO₄, pH 5,6). Die Bank wurde in Standard-MTPs aufbewahrt, worin sporulierte rekombinante A. Niger-Kolonien in jeder Vertiefung auf SM in Anwesenheit von 10% Glycerin gezüchtet wurden. Während der Aufbewahrung wurden diese Platten (Masterplatten, MPs) gefroren gehalten (–80°C). Vor der Replikation der MPs wurden sie für eine Std. in einer sterilisierten Abzugshaube gehalten, um mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Die Replikation der MPs erfolgte mit dem PBA-Flexys-Kolonie-Replicator. 5 Tage alte gewachsene Masterplatten wurden als Replikationsmatrize verwendet und auf MTPs mit 96 Vertiefungen, gefüllt mit flüssigem Wachstumsmedium (GM) replikaplattiert. Die frisch beimpften SM-Agarplatten wurden in einem Inkubator bei 32°C untergebracht und anschließend bei –80°C nach Zugabe von 150 μl 10% Glycerin pro Vertiefung aufbewahrt. Die GM-Produktionsplatten wurden in einem wassergesättigten Tomtec Quadrastor Shaker 96000 (32°C) inkubiert. Die Platten zeigten kein wachsendes Myzel nach 2 bis 3 Tagen. Die GM-Platten wurden für 6 Tage inkubiert.
(i) Probennahme der Überstände nach Beendigung des Wachstums.
Nach 6 Tagen Wachstum wurde das verbleibende flüssige GM-Wachstumsmedium (mit extrazellulären Expressionsprodukten) extrahiert und in frische MTPs überführt. Die Überstände wurden in frische MTPs mit einem 4-Kanal-Tecan-Pipettierroboter überführt. Das durchschnittliche Volumen des erhaltenen Überstandes war zwischen 120 und 140 μl. Diese Überstandplatten wurden eingefroren und anschließend auf Xylanase-Aktivität untersucht.
(j) Präparate für das Full-Scale-Screening.
Die Überstandplatten aus der Expressionsbank wurden entfrostet und in einem geschlossenen Wasserbad bei 72°C für 35–40 min untergebracht. Mit einer 12-Kanalpipette und kommerziell vorbereiteten Pipettenspitzen in Wegwerf-Mikrotiterplatte-Format-Racks (geliefert von Eppendorf) wurden 20 μl Überstand in die Substratgemisch enthaltende Mikrotiterplatte überführt, die vor der Zugabe der Überstände auf 60°C erhitzt wurden. Das Substratgemisch bestand aus einem 1:1-Gemisch aus 1% Pektin (siehe (k) unten) und 7% Haferspelzen-Xylan (siehe (1) unten) mit einem End-pH-Wert von 4,12. Die Test-MTPs wurden mit 310 ml Substrat/Vertiefung gefüllt. Mischen der Überstände mit dem Substratgemisch wurde durch Rühren der Pipettenspitzen in den Probenvertiefungen direkt nach der Abgabe der Überstände erreicht. Anschließend wurden die Platten in einen 60°C-Ofen für einen Inkubationszeitraum von 18–24 Stunden überführt. Nach der Inkubation ließ man die MTPs abkühlen und screente sie unter Verwendung eines Hamilton-Visco-Roboters (Hamilton Company, Reno, USA) hinsichtlich der Viskosität.
(k) Herstellung von 1% Pektin, pH-Wert 4,1
Ein Citronensäure-Phosphatpuffer (Mc Ilvaine Puffer) wurde durch Zugabe von 0,2 M Na₂HPO₄-Lösung zu 250 ml 0,1 M Citronensäurelösung, bis ein pH-Wert von 5,5 erhalten wurde, hergestellt. Dies wurde mit destilliertem Wasser auf einen Liter aufgefüllt, und der pH-Wert wurde erneut eingestellt, wenn nötig. Eine 0,5%ige Pektinlösung wurde durch langsame Zugabe von 0,5 g hoch-methyliertem Pektin (Typ Ruban Brun) zu einem Gefäß, das 50 ml des obigen Mc-Ilvaine-Puffers enthielt, und 25 ml destilliertem Wasser bei 60°C hergestellt. Heftiges Rühren stellte sicher, dass das Pektin gut gelöst war. Dies wurde auf 100 ml aufgefüllt, und der pH-Wert wurde wieder überprüft. Das hier verwendete Pektin senkt den pH-Wert der Lösung, so dass unter diesen Bedingungen die Lösung einen pH-Wert von 5,1 hatte. Wenn die Pektinlösung trübe war, war es nützlich, die Lösung bei 15 g 15 Minuten zu zentrifugieren, um jegliche ungelösten Partikel zu entfernen.
(1) Herstellung eines 7%igen alkalibehandelten Haferspelzen-Xylans, pH-Wert 4,1
20 ml 2 M NaOH wurden in einem 150-ml-Becher auf 60°C erhitzt. In einem getrennten Becher wurden 7 g Haferspelzen-Xylan (von der Firma Sigma) zu 20 ml Wasser gegeben, so dass sich eine hellbraune, teigige Masse bildete. Wenn nötig, wurde mehr Wasser zugegeben, aber insgesamt nicht mehr als 30 ml. Unter Verwendung eines Stahllöffels wurde diese Wasser-Haferspelzen-Xylan-Masse langsam zu der heißen NaOH-Lösung gegeben. Eine starke Rührvorrichtung war zum Lösen des Xylans in der Hydroxidlösung erforderlich, wobei die Temperatur bei festen 60°C gehalten wurde. Nachdem das gesamte Xylan sich gelöst hatte, wurde die Lösung dunkelbraun und ähnelte einem sehr viskosen klaren Sirup. Dann wurde der Rest des Wassers zugegeben, so dass eine Gesamtmenge von 50 ml zugegeben wurde. Man ließ die Lösung abkühlen, und 4 N HCl wurden zugegeben, bis der gewünschte pH-Wert erreicht war (gewöhnlich pH-Wert 4,1–4,2). Die Lösung wurde auf 100 ml aufgefüllt und der pH-Wert erneut eingestellt, wenn nötig. Zentrifugation bei 20000 g für 15 Minuten bei 10°C erzeugte einen klaren gelblichen Überstand (dessen Viskosität von der Anfangsmenge an zugegebenem Haferspelzen-Xylans abhing).
(m) Screening der Bank
Das Ergebnis des Screenings der in A. niger klonierten Talaromyces emersonii-Bank war 119 Graphen, die mit den getesteten 119 MTPs übereinstimmten. Jeder Graph zeigte die Viskosität der 96 Vertiefungen, die als 96 Peaks dargestellt werden, welche den Unterdruck pro Vertiefung in mV messen. Die Graphen wurden hinsichtlich niedriger Peaks analysiert, die eine verringerte Viskosität anzeigen. Peaks, die niedriger sind als die durchschnittliche Peakhöhe, wurden für den erneuten Test ausgewählt. Einige Platten erzeugten sehr wenig Schwankung, so dass die Auswahl möglicher positiver Klone für den erneuten Test leicht war. Andere Platten zeigten ein großes Ausmaß an Schwankung, deshalb wurden oft mehr als 5 oder 6 mögliche Klone für den erneuten Test ausgewählt. Um über eine positive Kontrolle zu verfügen, wurden nach der Inkubation 10 μl einer Endoxylanase zu einer zufälligen Platte an einer festen Position zugegeben. Aus den positiven Kontrollen wurde gefunden, dass man eine Peakhöhe zwischen 240 und 280 mV erwarten sollte, wenn eine Xylanase-Aktivität vorliegt.
Die Platten der Talaromyces-Bank, die getestet wurden, enthielten auch fünf bestätigte thermostabile Xylanase-Klone, die zuvor unter Verwendung eines Farbstoffnachweisassays auf Basis der Solubilisierung von Farbstoffen, die chemisch an das unlösliche polymere Substrat gebunden waren, gefunden wurden. Ohne Ausnahme wurden diese fünf Klone unabhängig mit dem viskosimetrischen Assay bereits in der ersten Screening-Runde gefunden. Alle Peaks für die bekannten Klone waren auf einem viel niedrigeren Niveau als die restlichen Peaks (bei 250 mV). Insgesamt wurden 118 Kulturvertiefungen für den erneuten Test ausgewählt, wobei diejenigen mit zuvor gefundenen Xylanase-Klonen ausgenommen sind.
(n) Erneuter Test von 118 mutmaßlichen Klonen
Der erneute Test basierte auf dem viskosimetrischen Assay gemäß dem Prinzip, das bei dem vollen Screen angewendet wurde. Diesmal wurde jedoch ein größeres Assayvolumen verwendet, weil eine deutlichere Unterscheidung zwischen thermostabiler Enzymaktivität und unregelmäßigen niedrigen Peaks vorgenommen werden konnte. Zwei große MTPs (2 ml/Vertiefung) wurden mit 1,2 ml 9% Haferspenzen-Xylan gefüllt. Zu den ersten beiden Vertiefungen jeder Reihe wurden 50 μl Wasser zugegeben (negative Kontrolle). Zu der letzten Vertiefung jeder Reihe wurden 50 μl einer Referenz-Endoxylanase-Lösung gegeben, damit man auch über eine positive Kontrolle verfügte. Die Vertiefungen 3 bis 11 jeder Reihe wurden für den erneuten Test mutmaßlicher Xylanase-Klone verwendet (Zugabe von 50 μl Überstand). Nach Mischen und Inkubation für 24 Stunden bei 60°C wurden die Viskositäten mit einem speziell zugeschnittenen Eclipse-Programm gemessen (Ansaugvolumen: 800 μl, Ansauggeschwindigkeit: 10 s/ml).
Mehrere positive Klone wurden identifiziert, weil ihre Peaks auf dem gleichen Niveau waren wie die positiven Kontrollen, was den vollständigen Abbau von Xylan zeigt. Insgesamt wurden dreizehn mögliche Stämme im erneuten Viskositätstest identifiziert. Die cDNA-Inserts wurden direkt mittels PCR-Amplifikation, die an chromosomaler DNA durchgeführt wurde, in pCR2.1 kloniert. Aus 12 Bank-Stämmen wurden sechzehn cDNA-Inserts unter Verwendung von pwo-Polymerase und Primersatz 2 (11937/12207, SEQ ID NR: 7 und 8) erhalten. Die Orientierung des cDNA-Inserts im pCR2.1-Vektor wurde mittels XhoI-Spaltung bestimmt, die sich im Vektor und am 3'-Ende der cDNA befand. Eine DNA-Sequenzanalyse wurde am 5'-Ende der cDNA-Inserts durchgeführt.
Der erneute Test auf mögliche Pektin-abbauende Enzyme wurde auf ähnliche Weise wie für die Xylanase durchgeführt, ausgenommen dass 1% Pektin anstelle von 9% Haferspenzen-Xylan verwendet wurde. Nur zehn mögliche Klone wurden erneut getestet, bei denen es sich um diejenigen handelte, die sehr niedrige Peaks in der primären Screening-Runde ergeben hatten, aber keinerlei Aktivität während des erneuten Xylanase-Tests zeigten. Reproduzierbar erzeugte nur ein Klon ein Pektin-abbauendes Enzym. Der gemessene Druckwert von 200 mV entspricht der Viskosität von reinem Wasser. Weil das verwendete Pektin nicht vollständig methyliert war, kann es durch eine thermostabile Polygalacturonase, Pektatlyase oder Pektinlyase abgebaut worden sein.
(o) Nutzen von Viscoscreen
Die Entwicklung eines viskosimetrischen Screeningverfahrens zur Identifikation thermostabiler Enzyme wurde durch drei Schlüsselfaktoren erleichtert. Erstens ermöglichte die Möglichkeit einer Thermoinaktivierung von nativer Wirts-Xylanase-Aktivität eine viel schnellere Entwicklung geeigneter Reaktionsbedingungen. Zweitens die Tatsache, dass, wenn Klone mit bekannten thermolabilen Enzymen getestet wurden, die Thermoinaktivierung sämtliche Aktivität zerstörte, so dass nur die thermostabileren Enzyme erfasst wurden. An dritter Stelle erhöhten die erhöhten Temperaturen die Enzymaktivitäten, so dass das Screening noch sensitiver wurde. An Haferspenzen-Xylan (Sigma) wurden elf Klone identifiziert, welche die Viskosität signifikant verringern konnten, und an Pektin wurden ein definitiver Klon identifiziert. Zusätzlich wurden fünf thermostabile Xylanase-Klone, die zuvor identifiziert worden waren, unabhängig erneut gefunden.
Beispiel 7: Charakterisierung einer ersten thermostabilen Talaromyces-emersonii-β-Glucanase (CEA) aus einer A.-niger-Transformante
Aktivitätsassays und Definitionen
Definition der Cellulase-PAHBAH-Einheit (CPU)
Eine Einheit der Cellulase-Aktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die benötigt wird, um ein μmol reduzierende Zucker freizusetzen, die pro Minute bei pH-Wert 5,0 und 60°C bei einer Substratkonzentration von 5% Carboxymethylcellulose (CMC) unter Verwendung einer Glucose-Eichkurve produziert wird.
Die Enzymaktivität gemäß dem CPU-Verfahren wurde gemessen, indem reduzierende Zucker unter Verwendung von 4-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH) ermittelt wurde. Die Probe basiert auf Lever, M., Powell, J. C., Killip, M., Small, C. W. (1973) J. Lab. Clin. Med. 82, 649–655 mit einigen Modifikationen. Die Modifikation erfolgt an dem PAHBAH-Reagens wie folgt: 0,05 M Trinatriumcitrat, 0,1 M Na₂SO₃, 0,02 M CaCl₂, 0,5 M NaOH und 0,1 M p-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH). Der endgültige pH-Wert betrug 12. Das Reagenz, das PAHBAH in alkalischer Lösung enthält und bei Raumtemperatur aufbewahrt wird, sollte innerhalb von einem Tag verwendet werden. Glucose wurde als reduzierender Referenz-Zucker (Kalibrationskurve) verwendet. Für die Kalibrationskurve dieses Assays lagen die Endkonzentrationen an Glucose zwischen 0–300 mM. Die CPU-Aktivität wurde durch Mischen von 100 μl Enzymlösung mit 400 μl 5% CMC in 0,1 M Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,0) untersucht. Eppendorf-Gefäße mit dem Substrat (CMC) wurden für 5 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Enzymlösung gestartet. Nach 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,0 ml PAHBAH-Reagens gestoppt. Die Eppendorf-Gefäße wurden für 5 Minuten bei 100°C erhitzt und dann auf Eis abgekühlt. Die Proben wurden bei der geeigneten Geschwindigkeit zentrifugiert, um jegliche festen Materialien abzuzentrifugieren (1 Minute bei voller Geschwindigkeit in einer Beckman-Microfuge E). Die Extinktion wurde bei 420 nm gemessen. Ein Leerwert wurde durch Zugabe von 100 μl 0,1 M Natriumacetat-Puffer anstelle von Enzymlösung hergestellt.
Definition der beta-Glucanase-Einheit (BGU)
Eine beta-Glucanase-Einheit ist die Aktivität, die benötigt wird, um 0,258 μmol reduzierende Zucker (als Glucose-Äquivalente gemessen) pro Minute bei pH-Wert 3,5 und 40°C bei einer Substratkonzentration von 0,5% β-Glucan aus Gerste freizusetzen.
Somit wurde zusätzlich zu der obigen Definition der Cellulase-(CPU-)Aktivität ein spezifischerer Assay zur Ermittlung von β-Glucanase-Aktivität durchgeführt. Das Prinzip des Assays ist die Geschwindigkeit, mit der die Viskosität einer Lösung von Gersten-β-Glucan mittlerer Viskosität (Megazyme, Australien, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) nach Zugabe einer bestimmten Menge an Enzym abnimmt. Gersten-β-Glucan mittlerer Viskosität (Megazyme, Australien) wurde in 0,425 M Natriumcitrat-Puffer pH-Wert 3,5 in einer Konzentration von 6,25 mg/ml gelöst. Das Substrat wurde 10 Minuten bei 40°C inkubiert. Anschließend wurde eine kleine Menge Enzym (im Bereich von 0,005–0,062 Einheiten/ml) zugegeben, und man ließ die Reaktion ablaufen. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten wurde die Viskosität der Probe in Bezug auf eine Referenzprobe bestimmt, die mit einer Standard-Endo-Glucanase bekannter enzymatischer Aktivität inkubiert wurde. Die absoluten Aktivitäten für den Standard wurden durch ein reduzierender-Zucker-Verfahren unter Verwendung von Fe-III-hexacyanid und 4,76 mg/ml Gersten-β-Glucan als Substratanfangskonzentration bestimmt.
Definition der Endo-Xylanase-Einheit (EXU)
Die Einheit der Xylanase-Aktivität (EXU) ist als die Menge an Enzym (EndoI, Endo-1,4-β-Xylanase aus Asp. niger, wie in EP-A-0,463,706 (Gist-brocades B. V.) beschrieben) definiert, die 4,53 μmol reduzierende Zucker (als Xylose-Äquivalente gemessen) pro Minute unter Assaybedingungen freisetzt. Die Assaybedingungen beinhalten: 5 mg/ml Arabinoxylan aus Weizenmehl (Megazyme, Australien, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) in 100 mM Natriumcitrat-Puffer (pH-Wert 3,5), Temperatur von 40°C bei einer Reaktionszeit von 60 Minuten. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 M NaOH gestoppt. Der Nachweis erfolgte kolorimetrisch bei 420 nm nach Inkubieren der Proben mit Fe-III-hexacyanid für 15 Minuten in kochendem Wasser. Das Hexacyanoferrat-Reagens wurde durch Lösen von 1,17 g KFe (CN) und 19,5 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 1 Liter Wasser hergestellt.
Zusätzlich zu der obigen absoluten Bestimmung der Xylanase-Aktivität wurde ein relatives Verfahren verwendet, das die Abnahme der Viskosität in einer Lösung von Weizen-Arabinoxylan (Megazyme, Australien, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) nach Zugabe einer bestimmten Menge an Enzym verfolgte. Weizenarabinoxylan wurde in 0,425 M Natriumcitrat-Puffer (pH-Wert 3,5) in einer Konzentration von 8,3 mg/ml gelöst. Das Substrat wurde bei 55°C für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurde eine kleine Menge Enzym (im Bereich von 0,01–0,05 Einheiten/ml) zugegeben, und man ließ die Reaktion ablaufen. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten wurde die Viskosität der Probe relativ zu einer Referenz bestimmt, die mit einem Aspergillus-niger-Endo-Xylanase-Standard bekannter EXU-Aktivität ( EP-A-0,463,706 ) inkubiert worden war. Die Absolutaktivitäten in EXU für den Standard wurden durch das reduzierende-Zucker-Verfahren unter Verwendung von Fe-III-hexacyanid, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Viskosität wurde manuell unter Verwendung einer Haake-Fallball-Viskositätsapparatur bestimmt.
Definition der Cellulase-Einheit (CXU)
Die Einheit der beta-Glucanase-Aktivität (BGU) ist definiert als die Menge an Cellulase, die in einer Stunde eine Anzahl glykosidischer Bindungen hydrolysiert, die zu der Produktion von 0,5 mg Glucose unter den Assaybedingungen äquivalent ist. Die Assaybedingungen umfassen: 9 mg/ml Carboxymethylcellulose in 5 mM Natriumacetat-Puffer (pH-Wert = 4,6), Temperatur von 37°C. Freigesetzte Glucose wurde durch das reduzierende-Zucker-Verfahren unter Verwendung des DNS-Reagens bestimmt.
Zusätzlich zu der obigen absoluten Bestimmung der Cellulase-Aktivität wurde ein relatives Verfahren verwendet, das die Abnahme in der Viskosität einer Lösung von Carboxymethylcellulose nach Zugabe einer bestimmten Menge an Enzym verfolgte. Carboxymethylcellulose wurde in 5 mM Natriumcitrat-Puffer (pH-Wert = 4,6) in einer Konzentration gelöst, die von der Viskosität der Charge abhängt. Das Substrat wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde eine kleine Menge Enzym zugegeben, und man ließ die Reaktion ablaufen. Nach 60 Minuten Reaktionszeit wurde die Viskosität der Probe relativ zu einer Referenz bestimmt, die mit einem Standard bekannter CXU-Aktivität inkubiert wurde.
Aktivität wrt pH
Die T.-emersonii-β-Glucanase wurde durch den (die) geeigneten A.-niger-Transformanten in Schüttelkolben produziert, wie im Beispiel 3 beschrieben, nachdem das Wachstumsmyzel durch Filtration entfernt worden war. Das Filtrat wurde für dieses Experiment verwendet. Die Aktivität des Filtrats wurde bei verschiedenen pH-Wert-Werten bei einer festen Temperatur von 60°C gemessen. Die Aktivität wurde gemäß dem CPU-Verfahren gemessen. Anstelle der Verwendung eines festen pH-Werts von 5,0 wurde das CMC-Substrat mit einem Citrat-Puffer bei dem geeigneten pH-Wert verdünnt, um den pH-Wert der Messung zu erhalten. Das Experiment wurde zweimal wiederholt, und die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 dargestellt. Es wurde gefunden, dass der optimale pH-Wert des Enzyms zwischen pH-Wert 4,5 und 5,0 bei etwa pH-Wert 4,8 lag. Tabelle 1: pH-Wert-Profil bei 60°C

pH Aktivität (μM Glucose/15 Minuten) bei 60°C (doppelte Messungen)

3 27,2 27,7

3,5 66,6 64,2

4 109,3 102,6

4,5 133,8 120,6

5 121,3 135,5

5,5 116,4 107,4

6 68,7 69,3
Aktivität wrt Temperatur
Die Aktivität dieser β-Glucanase wurde dann bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Aktivitätsmessungen wurden gemäß dem CPU-Verfahren bei pH-Wert 4,0 durchgeführt. Anstelle der Inkubation bei einer festen Temperatur von 60°C wurden die Inkubationen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Es wurde gefunden, dass das Temperatur-Optimum zwischen 80°C und 85°C lag. Die T_opt scheint bei etwa 84°C zu liegen (obwohl sie 82°C, 83°C oder 85°C sein kann, je nachdem, wie die Geraden gezogen und zwischen den Datenpunkten interpoliert werden). Tabelle 2: Temeraturprofil bei pH-Wert 4

Temperatur (°C) Aktivität (μM Glucose/15 Minuten) bei 60°C (doppelte Messungen)

60 87,8 102,1

70 156,4 154,6

80 208,5 213,1

90 185,4 176,4
Aktivität wrt andere Enzyme
Zusätzlich wurde die Aktivität bei 30–60°C unter Verwendung des BGU-Verfahrens für die β-Glucanase gemessen und mit einer kommerziell erhältlichen zellfreien T.-reesei-Brühe mit Cellulase- und Glucanase-Aktivität als Referenz verglichen. Die zellfreie T.-reesei-Brühe bestand aus einem Gemisch verschiedener Enzyme, worunter sich eine oder mehrere β-Glucanasen befinden, wobei aber diese Aktivitäten nicht charakterisiert worden sind. Zum Vergleich der Aktivitäten der erfindungsgemäßen T-emersonii-β-Glucanase und der T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen wurden die Enzyme zu etwa gleicher Aktivität bei 40°C dosiert. Die Aktivität der T-emersonii-β-Glucanase A bei 40°C wurde auf 1 festgelegt, und somit sind die anderen Aktivitäten dazu relativ. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: relative Aktivität wrt T.-reesei-Enzyme

Temperatur (°C) Relative Aktivität: β-Glucanase (CEA) Relative Aktivität: T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen

30 0,50 0,44

40 1,00 1,13

50 1,57 1,32

60 2,40 1,59
Bei Temperaturen oberhalb von 40°C begann die T.-reesei-Cellulase-/Glucanase-Aktivität verglichen mit der T-emersonii-β-Glucanase abzufallen. Oberhalb von 40°C trennten sich die Aktivitäten, wobei CEA aktiver war. Obwohl die relative Aktivität bei höheren Temperaturen höher war, wurde zudem bei mäßigen Temperaturen die Aktivität relativ zu dem T.-reesei-Gemisch beibehalten. Dies zeigt den breiten Temperaturbereich, über den die β-Glucanase aktiv ist.
Reinigung und spezifische Aktivität
Die Reinigung der T-emersonii-β-Glucanase ging von dem Filtrat aus. Etwa 25 ml zellfreie Brühe wurden mit einer PD-10-Säule entsalzt und auf eine Resource-Q-6-ml-Anionenaustauschsäule aufgebracht, die mit 10 mM Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,0) äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 10–300 mM Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,0) durchgeführt. (Linearer Gradient A nach B; Flussrate: 6 ml/min; Laufzeit: 54 Minuten; Wellenlängenmonitor: 280 nm, 254 nm, 214 nm). Aktive Fraktionen wurden gesammelt (20 ml), mit Microsep-Konzentratoren (3,5 ml, 10 K) aufkonzentriert und zweimal mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 5,0) gewaschen. Die Reinheit der Fraktionen wurde mittels HPL-S (Größenausschlusschromatographie) und SDS-PAGE analysiert.
Messungen der spezifischen Aktivität
Der berechnete molare Extinktionskoeffizient der β-Glucanase bei 280 nm ist 81550 M^–1·cm^–1. Die Proteinkonzentration des gereinigten Enzyms wurde aus E280-Messungen unter Verwendung einer spezifischen Absorption von E280^1cm = 2,33 für 1 mg/ml hergeleitet. Die spezifische Aktivität dem gereinigten Probe wurde in BGU bestimmt (Substrat: Gersten-beta-Glucan) und betrug 1027 BGU/mg. Unter Verwendung des CPU-Verfahrens betrug die spezifische Aktivität 628 Einheiten/mg. Weil die Aktivität gemäß dem viskosimetrischen Verfahren eine hohe Zahl verglichen mit dem reduzierenden-Zucker-Verfahren lieferte, wurde geschlossen, dass die T-emersonii-β-Glucanase eine signifikante Endo-Glucanase-Aktivität aufweist. Eine typische Endo-Glucanase zeigt eine sehr gute Leistung in einem reduzierenden-Zucker-Assay, während sie eine sehr schlechte Leistung in dem viskosimetrischen Verfahren zeigt.
Isoelektrischer Punkt
Eine IEF-PAGE wurde wie folgt durchgeführt. Die Ausrüstung war das Phast-System (Pharmacia Biotech), IEF 3-9-Phast-Gel (Pharmacia Biotech). Die Gele wurden gemäß Standard-Phast-System-Verfahren durchgeführt und gefärbt (Coomassie). Der isolelektrische Punkt wurde auf einem Phast-Gel-IEF 3-9 bestimmt und stellte sich als 3,3 heraus.
Molekulargewichtsbestimmung
Eine SDS-PAGE wurde wie folgt durchgeführt. Die Ausrüstung war wiederum das Phast-System (Pharmacia Biotech), 12,5%ige homogene Gele (Pharmacia Biotech); SDS-Puffer-Streifen (Pharmacia Biotech). Probenbehandlung: Ein Volumen (5 Proben) Puffer (500 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,8, 10% SDS, 0,1% Bromphenolblau) wurde mit 4 Volumina Probe gemischt und für 3 Minuten gekocht. Die Gele wurden gemäß Standard-Phast-System-Verfahren durchgeführt und gefärbt (Coomassie). Eine HPLC-Größenausschlusschromatographie erfolgte unter Verwendung der Säule: TSK G3000SW, Kat.-Nr. 05103 (TosoHaas). Verfahren: Die Elutionsmittel waren: 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,0, Flussrate: 1 ml/min, Laufzeit: 30 min, Wellenlängenmonitor: 280 nm. Deglykosylierung des Enzyms: Mische 5 μl gereinigtes Enzym (7 mg/ml) mit 20 μl 0,5% SDS und 25 μl 1% β-Mercaptoethanol. Dieses Gemisch wurde für 4 Minuten gekocht. Nach Abkühlen wurden 20 μl N-Glykosidase F (500 U/ml) und 20 μl 3% Triton X-100 in 1 M Natriumphosphat-Puffer pH-Wert 7,0 zugegeben. Dies wurde über Nacht inkubiert, und die Deglykosylierung wurde mittels SDS-PAGE analysiert.
Das mittels SDS-PAGE-Gel und HP-S bestimmte Molekulargewicht erwies sich als 43 kDa. Nach Deglykosylierung wurde mittels SDS-PAGE eine gerade Bande bei 37 kDa beobachtet.
Thermostabilität

Die T50-Thermostabilität wurde mit den T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen als Referenz bestimmt. T50 ist die Temperatur, bei der nach 20-minütiger Inkubation 50% der Aktivität verbleibt. Tabelle 4 zeigt die Unterschiede in der T50-Thermostabilität zwischen der gereinigten β-Glucanase aus T. emersonii und dem T.-reesei-Cellulase-/Glucanase-Gemisch, das zuvor in diesem Beispiel eingesetzt wurde (die Anfangsaktivität wurde auf eins gesetzt: Die Enzyme wurden für 20 Minuten inkubiert, und nach Abkühlen wurde die Aktivität unter Verwendung des CPU-Verfahrens gemessen). Jedes Experiment wurde zweimal wiederholt, und deshalb zeigt Tabelle 4 doppelte Messungen. Die T50-Thermostabilität der gereinigten β-Glucanase liegt bei etwa 93,4°C und die T50-Thermostabilität der T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen bei etwa 64,9°C. Tabelle 4: Thermostabilität wrt T.-reesei-Enzyme

Temperatur (°C)	Restaktivität (%) T.-reesei-Cellulasen/Glucanasen		Restaktivität (%) β-Glucanase (CEA)
40	97	98
50	96	100	100	99
60	85	83	100	99
70	14	14	98	95
75	0	0	93	96
80	0	0	88	90
85	0	0	89	94
90	0	0	65	64
110			0	0

Beispiel 8: Aktivitätsmessungen
Die beiden Bank-Stämme, die in dem Viscoscreen von Beispiel 6 unter Verwendung von Haferspenzen-Xylan als Substrat identifiziert worden waren, wurden in Schüttelkolben unter Verwendung des GM-Mediums fermentiert (die ursprünglichen Stämme wurden als AD009.21 und AD011.31 bezeichnet). Zusätzlich wurde der als AD021.B6 bezeichnete Stamm (CEA) eingeschlossen, von dem in den Beispielen 4 und 5 identifiziert worden war, dass er β-Glucanase-Aktivität exprimiert. Mehrere Assays wurden durchgeführt, und die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt. Überraschenderweise zeigten die Stämme AD009.21 und AD011.31 wenig Xylanase-Aktivität. Es scheint, als ob AD009.21 und AD011.31 stattdessen Cellulase-Aktivität aufweisen, obwohl die Klone beim Viscoscreening unter Verwendung von Haferspenzen-Xylan identifiziert wurden. Besonders βD009.21 ist sehr aktiv an Gersten-β-Glucan. Tabelle 5: Schüttelflaschenfermentierung von Cellulase-Stämmen; Xylanase-(EXU/ml), β-Glucanase-(BGU/ml) und Cellulase-(CXU/ml)Aktivität.

Stamm (und Glucanase-Bezeichnung) EXU/ml BGU/ml CXU/ml

AD021.B6 (CEA) < 10 160 524

AD009.21 (CEB) < 10 884 254

AD011.31 (CEC) < 10 < 10 7
Die Nachweisgrenzen wurden auf unter 10 für den EXU- und BGU-Assay und 5 für den CXU-Assay eingestellt.
Die DNA-Analyse an den Stämmen AD009.21 und AD011.31 (wie vorstehend im Beispiel 6 beschrieben) ergab zwei neue Glucanasen, die als CEB und CEC bezeichnet wurden. Die Nukleotidsequenzen der codierenden Regionen sind die SEQ ID Nr. 3 und 5 und die entsprechenden Aminosäuresequenzen die SEQ ID Nr. 4 bzw. 6.
Der CEB-Stamm zeigt eine hohe β-Glucanase-Aktivität. Der CEA-Stamm zeigt eine relativ hohe Cellulase-Aktivität verglichen mit dem CEB-Stamm. Das Verhältnis zwischen der β-Glucanase-Aktivität und der Cellulase-Aktivität ist für CEA und CEB unterschiedlich. Der CEC-Stamm zeigt Cellulase-Aktivität, aber seine β-Glucanase- oder Xylanase-Aktivität war unter der Nachweisgrenze in diesen Assays. Homologieuntersuchungen legen jedoch eine β-Glucanase-Aktivität stark nahe, und es wird angenommen, dass diese bei anderen pH-Werten viel höher sein kann.
Die Verwendung von mehr als einem Substrat für das Screening ist durchführbar. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass anstelle von zwei Substraten gleichzeitig drei verschiedene Substrate im Viscoscreen verwendet werden konnten. Eines der Substrate war eine Glucosepolymer- Verunreinigung, wahrscheinlich Glucan- oder Cellulose-Material. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung von Haferspenzen-Xylan-, Pektin- und Cellulose-ähnlichem Material zur Identifikation von drei Typen von Enzymen, Xylanasen, Pektinasen und Cellulasen, bei einer Screening-Runde führte. Der viskosimetrische Assay birgt einen großen Vorteil in Bezug auf den üblichen Farbstoffnachweisassay. Der Farbstoffnachweisassay basiert auf chemisch an ein Substrat gebundenen Farbstoffen. Diese Art des Substrates ist nur für wenige Verbindungen kommerziell erhältlich. Der viskosimetrische Assay kann jedoch mit jeder Art des viskosen Substrats arbeiten, sogar mit natürlichen, die keinerlei chemische Vorbehandlung erfordern. Dieser Aspekt ist wichtig, weil man unter einem kommerziellen und industriellen Gesichtpunkt Enzymaktivitäten an Substraten screenen kann, deren Viskositätsabnahme (d. h. Fruchtsäfte) oder Viskositätszunahme (d. h. Milchprodukte) von kommerzieller Bedeutung ist.
Beispiel 11

Ein Vergleich einiger der molekularen und biochemischen Eigenschaften der drei Glucanasen wird in der nachstehenden Tabelle bereitgestellt

Glucanase	MW (nach Deglykosylierung)	Länge (Aminosaurereste)	Aktivität	Familie Nr.*	Optimaler pH	PI	Optimale Temperatur
CEA	43 kDa (37 kDa)	335	3.2.1.4 (Endo-Glucanase)	5 (3D-Struktur: α8β8-TIM-Fass)	4,8	3,3 (4,5+)	85°C
2. CEB	44 kDa+	414	3.2.1.4 (Endo-Glucanase)	7; (3D-Struktur: β-Jelly-Roll)		4,2	> 75°C
CEC	23 kDa+	222	3.2.1.4 (Endo-Glucanase)	45 (3D-Struktur: gemischtes β-Fass		4,0	> 75°C

*basierend auf der Glykosidhydrolase-(CAZy-)Klassifikation
+ aus der Aminosäuresequenz vorausgesagt

Glucanase/Cellulase	Familie	Bekannte Aktivitäten	Bekannte Aktivitäten	Zusammenfassung
CEA	5	EC 3.2.1.4	Cellulase	BGU/CXU-Aktivität als unwahrscheinlich angesehen
		EC 3.2.1.75	Endo-1,6-Glucanase
		EC 3.2.1.58	Exo-1,3-Glucanase
		EC 3.2.1.78	Mannanase
		EC 3.2.1.123	Endoglykoceramidase
CEB	7	EC 3.2.1.4	Cellulase	BGU/CXU-Aktivität als unwahrscheinlich angesehen
CEB	7	EC 3.2.1.91	Cellobiohydrolase	BGU/CXU-Aktivität als unwahrscheinlich angesehen
CEC	45	EC 3.2.1.4	Cellulase	BGU/CXU-Aktivität, aber nicht bei dem getesteten pH

Glucanase/Cellulase	Familie	3D	Nukleophil/Protonendonor	Mechanismus
CEA	5	TIM 8	Glu/Glu	beibehaltend
CEN	7	Jelly Roll	Glu/Glu	beibehaltend
CEC	45	gemischtes Fass	Asp/Asp	invertierend
CEC	16	Jelly Roll	Glu/Glu	beibehaltend

CEB, CEC sind sämtlich Cellulasen, die eine EC 3.2.1.4.-Aktivität besitzen. Viele Cellulasen können auch 1,4-Bindungen in Gersten-Glucan hydrolysieren, was sie für bestimmte Anwendungen, wie z. B. von Anti-Ernährungs-Faktoren im Futter, besonders geeignet macht. Weil die Aktivität über die Viskosität gemessen wurde, ist es wahrscheinlich, dass die Cellulase Endo-Aktivität aufwies. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass auch 1,3-Bindungen hydrolysiert werden.
Aufgrund der Beobachtungen können somit EC 3.2.1.73-, 3.2.1.39- und 3.2.1.6-Aktivitäten nicht ausgeschlossen werden, obwohl man diese Aktivitäten in Familie 16 findet: Die Eigenschaften der Familien 7 und 16 scheinen recht ähnlich zu sein.
Nur zur Erläuterung sei gesagt, dass Cellulasen (EC 3.2.1.4) normalerweise in der Lage sind, die Endo-Hydrolyse von 1,4-D-glucosidischen Bindungen in Cellulose zu katalysieren. Der systematische Name der Cellulasen ist 1,4-(2,3;1,4)-D-Glucan-4-glucanohydrolase. Endo-1,4-D-Glucanase und Endo-Glucanase D sind Synonyme für 1,4-(1,3;1,4)-D-Glucan-4-glucanohydrolase. Cellulase kann auch 1,4-Bindungen in D-Glucanan hydrolysieren, die auch 1,3-Bindungen enthalten, was sie für bestimmte Anwendungen, wie z. B. die Beseitigung von Antiernährungsfaktoren in Futter, besonders geeignet macht. Solche Enzyme, die Endo-Glucanase-Aktivität zeigen, werden im Allgemeinen als Glucanasen bezeichnet. Zusätzlich kann die Hydrolyse von Glucan durch Lichenase (1,3-1,4-D-Glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.73) und Endo-1,3(4)-Glucanase (1,3-(1,3;1,4)-D-Glucan-3(4)-glucanohydrolase (EC 3.2.1.6) erzielt werden.

Eine Übersicht über Cellulase-Aktivitäten ist in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

EC-Nummer	Aktivität	Systematischer Name	Empfohlen	Synonym
3.2.1.4	Endo-Hydrolyse 1,4-β-D-glucosidischer Bindung in Cellulose. Hydrolysiert auch 1,4-Bindungen in β-D-Glucanen, die auch 1,3-Bindungen enthalten	1,4-(1,3;1,4)-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase	Cellulase	Endo-1,4-β-D-Glucanase Endo-glucanase D
3.2.1.73	Hydrolyse 1,4-β-D-glykosidischer Bindungen in β-D-Glucanen, die 1,3- und 1,4-Bindungen enthalten. Wirkt auf Lichenin und Getreide-β-D-Glucane, aber nicht auf β-D-Glucane, die nur 1,3- oder nur 1,4-Bindungen enthalten.	1,3-1,4-β-D-Glucanglucanohydrolase	Lichenase
3.2.1.39	Hydrolyse 1,3-β-D-glucosidischer Bindungen in 1,3-β-D-Glucanen. Begrenzte Aktivität an gemischten (1,3-1,4)-β-D-Glucanen	1,3-β-D-Glucanglucanohydrolase	Glucan-Endo-1,3-β-glucosidase	Endo-1,3-β-D-Glucanase β-1,3-Glucanase Oligo-1,3-glucosidase
3.2.1.58	aufeinander folgende Hydrolyse von β-D-Glucose-Einheiten von den nicht-reduzierenden Enden von 1,3-β-D-Glucanen, wobei α-Glucose freigesetzt wird	1,3-β-D-Glucanglucanohydrolase	Glucan-1,3-β-glucosidase	Exo-β-1,3-Glucanase
3.2.1.75	zufallsgemäße Hydrolyse von 1,6-Bindungen in 1,6-β-D-Glucosiden. Wirkt auf Lutean, Pustulan, 1,6-Oligo-β-D-glucoside	1,6-β-D-Glucanglucanohydrolase	Glucan-Endo-1,6-β-glucosidase	Endo-β-1,6-Glucanase β-1,6-Glucanhydrolase
3.2.1.6	Endo-Hydrolyse von 1,3- und 1,4-Bindungen in β-D-Glucanen, wenn der Glucose-Rest, dessen reduzierende Gruppe an der zu hydrolysierenden Bindung beteiligt ist, selbst an C-3 substituiert ist. Substrate sind u. a. Getreide-D-Glucane, Laminarin, Lichenin	1,3-(1,3;1,4)-β-D-Glucan-3(4)-glucanohydrolase	Endo-1,3(4)-β-glucanase	β-1,3-Glucanase beta-1,3-1,4-glucanase Endo-β,1,3(4)-Glucanase
3.2.1.91	Hydrolyse von 1,4-β-D-glucosidischen Bindungen in Cellulose und Cellotetraose, wodurch Cellobiose vom nicht-reduzierenden Ende freigesetzt wird	1,4-D-Glucancellobiohydrolase	Cellulose-1,4-β-Cellobiosidase	Exoglucanase Cellobiohydrolase Exo-Cellobiohydrolase

Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, bei dem es sich um eine β-Glucanase handelt, erhältlich aus einem Pilz der Gattung Talaromyces, wie dem Pilz Talaromyces emersonii, mit der Aktivität EC 3.2.1.4 (Endoglucanase-Aktivität), umfassend: (i) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 oder (ii) eine Variante von (i), die β-D-Glucan spalten kann und mindestens 70% Identität über die gesamte Länge der SEQ ID NR: 2 oder mindestens 80% über einen Bereich von mindestens 150 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 hat; oder (iii) ein Fragment von (i) oder (ii), das β-D-Glucan spalten kann.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Variante (ii) mindestens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 hat und/oder das Fragment von (iii) mindestens 150 Aminosäuren lang ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das (1→3)-, (1→4)- und/oder (1→6)-Bindungen in β-D-Glucan spaltet.
Polynukleotid, umfassend: (a) die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 1 oder eine Sequenz, die ein Polypeptid nach einem vorhergehenden Anspruch codiert; (b) eine Sequenz, die zu einer Sequenz, wie in (a) definiert, über die gesamte Länge komplementär ist oder unter hochstringenten Bedingungen daran hybridisiert; (c) eine modifizierte Sequenz der SEQ ID NR: 1 mit bis zu 100 Nukleotidsubstitutionen, die ein Polypeptid mit β-Glucanase-Aktivität codiert; (d) eine Sequenz mit mindestens 75%, vorzugsweise 80%, Identität zu einer Sequenz, wie in (a) definiert; oder (e) eine Sequenz, die infolge des genetischen Codes zu einer der Sequenzen, wie in (a) definiert, degeneriert ist.
Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei die Sequenz ein Polypeptid mit β-Glucanase-Aktivität codiert.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 5, das eine DNA-Sequenz ist.
Vektor, der eine Polynukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 4 bis 6 umfasst.
Vektor nach Anspruch 7, bei dem es sich um einen Expressionsvektor handelt, beispielsweise in dem eine DNA-Sequenz nach Anspruch 7 mit einer regulatorischen Sequenz operativ verbunden ist.
Wirtszelle, die als heterologe Sequenz ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 6 umfasst.
Wirtszelle, die als heterologes Protein ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 exprimiert.
Wirtszelle, die mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 5 oder einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, wie in einem der Ansprüche 9 bis 11 definiert, unter Bedingungen, welche die Expression des Polypeptids ergeben.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hyperlipämie und/oder hohen Serum-Cholesterin- und -Triglyceridspiegeln in einem Individuum.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die β-Glucanase-Aktivität moduliert, wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Testverbindung und das Überwachen hinsichtlich β-Glucanase-Aktivität umfasst.
Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, die ferner ein Polypeptid mit Cellulase-, Endoarabinase-, Rhamnogalacturonase- oder Polygalacturonase-Aktivität umfasst.
Verfahren zur Behandlung von Pflanzenmaterial, umfassend das Zusammenbringen des Pflanzenmaterials mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Behandlung den Abbau oder die Modifikation von Cellulose, wie β-Glucan, in dem Pflanzenmaterial umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18 zum Abbau oder zur Modifikation von Pflanzenzellwänden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Behandlung das Spalten von Glucose-Untereinheiten von einer β-D-Glucan-Komponente des Materials umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das Material eine Pflanze, Pflanzenbrei, Pflanzenextrakt oder ein essbares Nahrungsmittel oder einen Inhaltsstoff dafür oder einen Stoff, eine Textilie oder Bekleidung umfasst, der/die Pflanzenmaterial enthält.
Verfahren zur Verringerung der Viskosität eines Pflanzenmaterials, umfassend das Zusammenbringen des Pflanzenmaterials mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 in einer Menge und unter Bedingungen, welche den Abbau der in dem Material enthaltenen Cellulose bewirken.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 in einem Verfahren zur Behandlung von Pflanzenmaterial.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Behandlung das Spalten von β-D-Glucan-Polymeren in dem Pflanzenmaterial umfasst.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 in einem Verfahren zur Verarbeitung von Pflanzenbrei, -saft oder -extrakt, welches das Inkubieren des Breis, Saftes oder Extraktes mit dem Polypeptid oder der Zusammensetzung umfasst, um Cellulose zumindest partiell abzubauen.
(Tier)Futter, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Brauen, Destillieren, zur Biomethanation, Zahnhygiene, Lederbehandlung, Papierherstellung, Textilienbehandlung oder -herstellung, zum Backen oder Brotherstellen, zum Waschen oder zur Detergensbehandlung, zur Behandlung von Blumenzwiebeln oder in einem Tierfutter.
Lebens- oder Nahrungsmittel, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Lebens- oder Nahrungsmittel nach Anspruch 28, bei dem es sich um ein alkoholisches Getränk, ein Brot, einen Teig oder Tee handelt.
Transgener Pflanzenorganismus, umfassend eine Zelle nach Anspruch 10 oder 11.