DE69736975T2

DE69736975T2 - Enzym mit galaktanaseaktivität

Info

Publication number: DE69736975T2
Application number: DE69736975T
Authority: DE
Inventors: Venke Lene KOFOD; Sakari Markus KAUPPINEN; Nonboe Lene ANDERSEN; Groth Ib CLAUSEN; Anette MÜLLERTZ
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2017-03-01
Also published as: JP2000505303A; AU727785B2; CA2246732A1; EP0885296B1; JP4267696B2; US6485954B1; ATE346144T1; CN1274820C; CN1212011A; US6242237B1; EP0885296A1; AU2090997A; WO1997032014A1; DK0885296T3; DE69736975D1; AU727785C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym mit Galactanase-Aktivität, ein DNA-Konstrukt kodierend für das Enzym mit Galactanase-Aktivität, ein Verfahren, das Enzym herzustellen, eine Enzymzusammensetzung umfassend das Enzym mit Galactanase-Aktivität und die Verwendung des Enzyms und der Enzymzusammensetzung für eine Anzahl von gewerblichen Anwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Galactane und Arabinogalactane sind in den meisten Pflanzen als Bestandteile der pektinischen „hairy regions" vorhanden. Sie sind üblicherweise an O-4 der Rhamnosereste im Rhamnogalacturonanrückgrat der „hairy region" befestigt. Die Verteilung und Zusammensetzung der Seitenketten variieren beträchtlich zwischen unterschiedlichen Zelltypen und physiologischen Zuständen, aber im Allgemeinen haben ungefähr die Hälfte der Rhamnosyleinheiten in den Rhamnogalacturonanregionen angefügte Seitenketten. Die Galactanseitenketten sind in den meisten Pflanzen Typ 1 Galactane, welche aus β-1,4 verknüpfter Galactopyranose mit einigen Verzweigungspunkten und einer Länge von bis zu 60 Saccharideinheiten (DP60) zusammengesetzt sind. Arabinofuranosereste oder kurze Arabinanoligomere können an die Galactankette am O-3 der Galactosyleinheit angefügt sein, daher Arabinogalactan genannt. Galactane (oder Arabinogalactane) haben eine wichtige Funktion in der Primärzellwand, wo sie mit anderen Strukturbestandteilen der Zellwand wie zum Beispiel Xyloglucanen oder Arabinoxylanen interagieren. Daher dienen sie vielleicht dazu, die pektinische Matrix in der Zellwand zu verankern. Außerdem steigern sie die Hydratisierungs- und Wasserbindungsfähigkeit und verringern die Interkettenassoziation zwischen Pektinpolymeren, von der angenommen wird, dass sie für die Modulation der Potosität und passiven Diffusion wichtig ist (Carpita & Gibeaut, 1993, Plant J., 3, 1–30; O'Neill et al., 1990, Methods in Plant Biochemistry, 415–441; Selvendran, 1983, The Chemistry of Plant Cell Walls. Dietary Fibers; Hwang et al., Food Hydrocolloids, 7, 39–53; Fry, 1988, The growing Plant Cell Wall: Chemical and Metabolic Analysis).
β-1,4-Galactanasen (E.C.3.2.1.89) bauen Galactane (und Arabinogalactane) ab und sind aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen gereinigt worden (Nakano et al., 1985, Agric. Biol. Chem., 49, 3445–3454; Emi & Yamamoto, 1972, Agric. Biol. Chem., 36, 1945–1954; Araujo & Ward, 1990, J. Ind. Microbiol., 6, 171–178; Van De Vis et al., 1991, Carbohydr. Polym., 16, 167–187).
Das pH-Optimum der zurzeit bekannten Pilz-Galactanasen liegt im niedrigen pH-Bereich. Daher beschreiben Araujo et al. (J. Industrial Microbiology (1990) 6: 171–178) eine Pilz-Galactanase (Thielavia terrestris) mit einem pH-Optimum von 5,8; und Hirofumi et al. (Kagaku to Kogyo (science) (science and Industry), (1990) Bd. 64, Nr. 9, S. 440–445) beschreiben eine Pilz-Galactanase aus Aspergillus niger mit einem pH-Optimum um 4,0.
Obwohl sogar eine Anzahl von β-1,4-Galactanasen gereinigt worden ist, ist nur eine kloniert und ihre DNA sequenziert worden. Daher beschreibt WO 92/13945 das Klonieren und DNA-Sequenzieren einer Pilz-β-1,4-Galactanase (Aspergillus aculeatus).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Galactanasen mit einem pH-Optimum im neutralen oder basischen Bereich bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Klonieren und der Charakterisierung von zwei DNA-Sequenzen, die aus Pilzstämmen innerhalb der Ordnung der Sordariales erhalten wurden, welche beide für Pilzenzyme kodieren, die Galactanase-Aktivität zeigen und ein pH-Optimum von wenigstens 5,9 aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Galactanasen sind die ersten bekannten und gereinigten Pilzgalactanasen mit einem pH-Optimum über 5,8.
Es wird zurzeit angenommen, dass dies für eine Anzahl von gewerblichen Anwendungen vorteilhaft ist, zum Beispiel in der Tierfutterindustrie (siehe z.B. ein hierin offenbartes Arbeitsbeispiel (siehe unten)).
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt eine Pilz-Galactanase, die ein pH-Optimum über 5,9 aufweist.
Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zwei Aminosäuremotive in den Aminosäurensequenzen der zwei Galactanasen, die aus Sordariales erhalten wurden, identifiziert. Es wird zurzeit angenommen, dass diese Motive für Galactanasen aus Sordariales charakteristisch sind. Basierend auf die vorstehend erwähnten zwei Motive sind zwei degenerierte PCR-DNA-Primer hergestellt worden und es wird zurzeit angenommen, dass es möglich ist, andere Galactanasen aus Sordariales zu klonieren, die ähnliche Eigenschaften wie die zwei vorstehend beschriebenen aufweisen. Insbesondere das hohe pH-Optimum-Profil, welches für eine Anzahl von gewerblichen Anwendungen vorteilhaft ist (siehe vorstehend).
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein DNA-Konstrukt, erhalten der vorliegenden Erfindung aus einem Pilzstamm der Ordnung Sordariales, kodierend für ein Enzym, welches Galactanase-Aktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz unter Bedingungen geringer Stringenz mit einer Sonde hybridisiert, die ein Produkt einer PCR-Reaktion mit DNA, die aus Humicola insolens (DSM 1800) isoliert ist und/oder mit DNA, die aus Myceliophthora thermophila (CBS 117.65) isoliert ist, und den folgenden Paaren von PCR-Primern ist:

"5'-CTA TTC GGA TCC AG(C/T) GA(C/T) AC(A/C) TGG GC(G/C) GA(C/T) CC(G/T) GC(G/T) C-3'" [SEQ ID NR 5] als dem Strang-Primer und
"5'-CTA ATG TCT AGA (A/G)AT CCA (A/G/C/T)GC (A/G/C/T)GG (C/T)TC CCA (A/G)TA AAA-3'" [SEQ ID NR 6] als dem Gegenstrang-Primer.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Galactanaseenzym umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, welcher die rekombinante Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms ermöglicht. Dadurch ist es möglich, eine einkomponentige-Galactanasezusammensetzung herzustellen, was für eine Anzahl von gewerblichen Anwendungen sehr vorteilhaft ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Enzym, welches Galactanaseaktivität zeigt, welches die Aminosäure-Teilsequenz umfasst

a) Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-His(H) und/oder Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I).

Schließlich betrifft die Erfindung eine isolierte, im Wesentlichen reine, biologische Kultur des Saccharomyces cerevisiae Stammes DSM Nr. 9983, die eine Galactanase kodierende DNA-Sequenz enthält (gezeigt in SEQ ID NR. 1) (der für die Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2.0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 vorhanden ist) abgeleitet von einem Stamm des filamentösen Pilzes Myceliophthora thermophila oder jeglicher Mutante von dem Saccharomyces cerevisiae – Stamm, der die Galactanase kodierende Fähigkeit beibehalten hat; und
die Erfindung betrifft eine isolierte, im Wesentlichen reine biologische Kultur des Saccharomyces cerevisiae Stammes DSM Nr. 9976, die eine Galactanase kodierende DNA-Sequenz enthält (gezeigt in SEQ ID NR 3) (der für die Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2.0 kodiert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9976 vorhanden ist), abgeleitet von einem Stamm des filamentösen Pilzes Humicola insolens oder jeglicher Mutante von dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der die Galactanase kodierende Fähigkeit beibehalten hat.
DEFINITIONEN
Bevor diese Erfindung in weiteren Einzelheiten diskutiert wird, werden zunächst die folgenden Begriffe definiert werden.
"Ein DNA-Konstrukt": Der Begriff "ein DNA-Konstrukt" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die in Einklang mit Standard-Klonierungs-Arbeitsverfahren, die in der Gentechnik verwendet werden, kloniert wurde, um ein DNA-Segment aus seiner natürlichen Lage an eine andere Stelle zu verlagern, wo es reproduziert werden wird. Der Klonierungsprozess bezieht das Ausschneiden und die Isolierung des gewünschten DNA-Segmentes ein, die Insertion des Teilstücks der DNA in ein Vektormolekül und die Inkorporation des rekombinanten Vektors in eine Zelle, wo vielfache Kopien oder Klone des DNA-Segmentes repliziert werden.
Das erfindungsgemäße "DNA-Konstrukt" kann alternativ "klonierte DNA-Sequenz" oder "isolierte DNA-Sequenz" genannt werden werden.
"Erhalten aus": Für den Zweck der vorliegenden Erfindung meint der Begriff "erhalten aus" wie er hierin in Verbindung mit einer spezifischen mikrobiellen Quelle verwendet wird, dass das Enzym durch die spezifische Quelle oder durch eine Zelle, in welche ein Gen aus der Quelle insertiert worden ist, produziert wird.
"Ein isoliertes Polypeptid": Wie hierin definiert, ist der Begriff "ein isoliertes Polypeptid" oder "isolierte Galactanase", wie er über die erfindungsgemäße Galactanase verwendet wird, eine Galactanase oder Galactanase-Teil-Zubereitung, welche wenigstens, wie durch SDS-PAGE bestimmt, ungefähr 20% rein, bevorzugt wenigstens ungefähr 40% rein, mehr bevorzugt ungefähr 60% rein, noch mehr bevorzugt ungefähr 80% rein, am meisten bevorzugt ungefähr 90% rein und noch mehr bevorzugt ungefähr 95% rein ist.
Der Begriff "isoliertes Polypeptid" kann alternativ "gereinigtes Polypeptid" genannt werden.
"Homologe Verunreinigungen": Wie hierin verwendet meint der Begriff "homologe Verunreinigungen" jede Verunreinigung (z.B. ein anderes Polypeptid als das erfindungsgemäße Enzym), welche aus der homologen Zelle stammt, aus der das erfindungsgemäße Enzym ursprünglich erhalten wurde. Bei der vorliegenden Erfindung kann die homologe Zelle z.B. ein Stamm von H. insolens und/oder ein Stamm von M. thermophilum sein.
"Galactanase kodierender Teil": Wie hierin verwendet meint der Begriff "Galactanase kodierender Teil", wenn er in Verbindung mit einer DNA-Sequenz verwendet wird, die Region der DNA-Sequenz, welche der Region, die in einer Polypeptidsequenz translatiert wird, entspricht. In der in SEQ ID NR 1 gezeigten DNA-Sequenz ist es die Region zwischen dem ersten "ATG" Start-Codon ("AUG" Codon auf der mRNA) und das folgende Stopp-Codon ("TAA", "TAG" oder "TGA"). Mit anderen Worten ist es das translatierte Polypeptid.
Das translatierte Polypeptid umfasst, zusätzlich zu der reifen Sequenz, welche Galactanaseaktivität zeigt, eine N-terminale Signalsequenz. Die Signalsequenz lenkt üblicherweise die Sekretion des Polypeptids. Für weitere Informationen siehe (Stryer, L., "Biochemistry" W.H., Freeman and Company/New York, ISBN 0-7167-1920-7).
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "Galactanase kodierender Teil" das translatierte Polypeptid und den reifen Teil davon umfassen.
"Galactanase" Im vorliegenden Zusammenhang ist eine Galactanase nach der Enzymklassifikation (EC) definiert als die EC-Nummer: 3.2.1.89 aufweisend.

Offizieller Name: ARABINOGALACTAN-ENDO-1,4-BETA-GALACTOSIDASE.
Alternative(r) Name(n): ENDO-1,4-BETA-GALACTANASE. GALACTANASE. ARABINOGALACTANASE.
Katalysierte Reaktion: ENDOHYDROLYSE VON 1,4-BETA-D-GALACTOSIDISCHEN BINDUNGEN IN ARABINOGALACTANEN.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Pilz-Galactanase mit einem pH-Optimum über 5,9:
Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal eine Pilz-Galactanase bereit, welche ein pH-Optimum über 5,8 aufweist.
Der Ausdruck "pH-Optimum bei 5,9" meint, dass ein erfindungsgemäßes Enzym seine maximale Aktivität bei pH 5,9 zeigt, verglichen mit der Aktivität bei anderen pH-Werten in dem pH-Intervall von 2,5–10,0. Die Aktivität wird als die Freisetzung von blauem Farbstoff aus AZCL-Galactan nach 15 Minuten Inkubation bei 30°C in Citrat/Phosphatpuffern gemessen, siehe Beispiel 3 für eine weitere ausführliche Beschreibung. Daher meint im vorliegenden Zusammenhang der Begriff "pH-Optimum über 5,9", dass ein erfindungsgemäßes Enzym seine maximale Aktivität bei einem pH-Wert über 5,9 zeigt.
Das pH-Optimum ist bevorzugt über 5,9, mehr bevorzugt über 6,0, mehr bevorzugt über 6,25, mehr bevorzugt über 6,5, mehr bevorzugt über 7,0, mehr bevorzugt über 7,5. Anders ausgedrückt, das pH-Optimum der erfindungsgemäßen Galactanase liegt bevorzugt in dem Bereich von 5,8–10, mehr bevorzugt von 6,0–10, mehr bevorzugt von 6,5–10, mehr bevorzugt von 7,0–10, mehr bevorzugt von 7,5–10.
Ohne durch jegliche Theorie limitiert zu sein, wird zurzeit angenommen, dass eine Pilz-Galactanase mit einem pH-Optimum über 5,9 aus anderen Pilzen stammen kann. Daher kann das Enzym von beiden stammen, einem filamentösen Pilz und einer Hefe. Bevorzugt stammt das Enzym von einem Pilz der Ordnung Sordariales, insbesondere von einem Pilz der Gattung Humicola, Myceliophthora, Scytalidium, Chaetomium, Melanospora, Cercophora, Gelasinospora, Neurospora, Podospora, oder Thielavia. Mehr bevorzugt wird die erfindungsgemäße Galactanase aus einem Stamm von Myceliophthora thermophila oder Humicola insolens kloniert.
DNA-Konstrukte
DNA-Konstrukt kodierend für eine Pilz-Galactanase mit einem pH-Optimum über 5,9
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein DNA-Konstrukt bereit, umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für ein Erfindungsgemäßes Enzym, welches Galactanase-Aktivität zeigt und ein pH-Optimum über 5,9 aufweist.
Die DNA-Sequenz kann aus einem Organismus isoliert werden, der das Enzym produziert, z.B. durch Reinigen des Enzyms, Aminosäure-Sequenzieren, und Herstellen einer geeigneten Sonde oder eines PCR-Primers basierend auf dieser Aminosäuresequenz.
Andere geeignete Verfahren zur Isolierung der DNA-Sequenz sind nachstehend beschrieben.
In einer spezifischen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, das für eine Pilz-Galactanase mit einem pH-Optimum über 5,9 kodiert, die DNA-Konstrukte, die durch die Charakteristika a)–f) definiert sind, welche in weiteren Einzelheiten nachstehend beschrieben sind, oder das DNA-Konstrukt nach dem dritten Aspekt der Erfindung.
DNA-Konstrukt kodierend für eine Galactanase definiert durch Verwenden von Aminosäuresequenz-Motiven
Bevorzugt kodiert das DNA-Konstrukt nach dem dritten Aspekt der Erfindung, d.h. die DNA-Sequenz basierend auf Hybridisierung mit der PCR-Sonde, die wie vorstehend beschrieben durch Verwenden der PCR-Primer, die in SEQ ID NR 5 und 6 gezeigt sind generiert wurde, ein Enzym mit Galactanase-Aktivität, wobei das Enzym die folgende Aminosäure-Teilsequenz umfasst

a) Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-His(H) und/oder
b) Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I).

Mehr bevorzugt kodiert das DNA-Konstrukt für ein Enzym mit Galactanase-Aktivität, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR 2 oder SEQ ID NR 4 umfasst.
Es wird zurzeit angenommen, dass das DNA-Konstrukt gemäß diesem Aspekt aus jeder der nachstehend in weiteren Einzelheiten in dem Abschnitt Mikrobielle Quellen beschriebenen Quellen stammen kann. Bevorzugt stammt die klonierte DNA-Sequenz von einem Stamm der Ordnung Sordariales.
DNA-Konstrukt definiert unter Bezug auf SEQ ID NR 1 und 3
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für ein Enzym, das Galactanase-Aktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz umfasst

(a) den Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2,0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 vorhanden ist;
(b) die DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1050 in der SEQ ID NR 1 oder mehr bevorzugt 55-1050 gezeigt ist oder ihr komplementärer Strang;
(c) ein Analog der in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenz, das wenigstens zu 70% homolog mit der besagten DNA-Sequenz ist;
(d) eine DNA-Sequenz, die mit der DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1050 in der SEQ ID NR 1 gezeigt ist, bei geringer Stringenz hybridisiert;
(e) eine DNA-Sequenz, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht mit den Sequenzen von (b) oder (d) hybridisiert, aber die für ein Polypeptid kodiert, das die gleiche Aminosäuresequenz wie das Polypeptid aufweist, das von einer beliebigen dieser DNA-Sequenzen kodiert ist; oder
(f) eine DNA-Sequenz, die eine allele Form oder ein Fragment der DNA-Sequenzen ist, die in (a), (b), (c), (d), oder (e) spezifiziert sind.

Auch betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für ein Enzym, welches Galactanase-Aktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz umfasst

(a) den Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2,0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9976 vorhanden ist;
(b) die DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1047 in der SEQ ID NR 3 oder mehr bevorzugt 58-1047 gezeigt ist oder ihren komplementären Strang;
(c) ein Analog der in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenz, das wenigstens zu 70% homolog ist mit der besagten DNA-Sequenz;
(d) eine DNA-Sequenz, die mit der DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1047 in SEQ ID NR 3 gezeigt ist, bei geringer Stringenz hybridisiert;
(e) eine DNA-Sequenz, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht mit den Sequenzen von (b) oder (d) hybridisiert, aber die für ein Polypeptid kodiert, das die gleiche Aminosäuresequenz wie das Polypeptid aufweist, das von einer beliebigen dieser DNA-Sequenzen kodiert ist; oder

Es wird zurzeit angenommen, dass der Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2,0 kloniert ist, das in DSM 9983 vorhanden ist, identisch ist zu dem Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NR 1 gezeigt ist.
Dementsprechend können die Begriffe "der Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in Plasmid pYES 2,0 kloniert ist, das in DSM 9983 vorhanden ist" und "der Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NR 1 gezeigt ist" synonym verwendet werden.
Es wird zurzeit angenommen, dass der Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in Plasmid pYES 2,0 kloniert ist, das in DSM 9976 vorhanden ist, identisch ist zu dem Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NR 3 gezeigt ist.
Dementsprechend können die Begriffe "der Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in Plasmid pYES 2,0 kloniert ist, das in DSM 9976 vorhanden ist" und "der Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NR 3 gezeigt ist" synonym verwendet werden.
Die DNA-Sequenz kann genomischen, cDNA, oder synthetischen Ursprungs sein oder jegliche Kombination davon.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine klonierte DNA-Sequenz, welche ein Enzym kodiert, das Galactanase-Aktivität zeigt und die Aminosäuresequenz aufweist, die als der reife Teil von SEQ ID NR 2 (d.h. Pos. 19-350) dargelegt ist, diese DNA-Sequenz unterscheidet sich von SEQ ID NR 1 auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine klonierte DNA-Sequenz, welche ein Enzym kodiert, das Galactanase-Aktivität zeigt und die Aminosäuresequenz aufweist, die als der reife Teil von SEQ ID NR 4 (d.h. Pos. 19-349) dargelegt ist, diese DNA-Sequenz unterscheidet sich von SEQ ID NR 3 auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes.
Die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NR 1, 3 gezeigt ist und/oder eine erfindungsgemäße, analoge DNA-Sequenz kann aus einem Mikroorganismus wie zum Beispiel einem Bakterium, einer Hefe oder einem filamentösen Pilz stammen. Bevorzugt wird sie aus einem filamentösen Pilz stammen und Beispiele von geeigneten Pilzen werden in dem Abschnitt "Mikrobielle Quellen" (siehe unten) gegeben.
Alternativ kann die analoge Sequenz auf der Basis der DNA-Sequenz konstruiert werden, die als der Galactanase kodierende Teil von SEQ ID NR 1 oder 3 gezeigt wird, z.B. eine Sub-Sequenz davon sein und/oder durch Einfügen von Nukleotid-Substitutionen, welche nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz der durch die DNA-Sequenz kodierten Galactanase führt, aber welche der Codon Verwendung des Wirtsorganismus entspricht, der für die Produktion des Enzyms vorgesehen ist oder durch Einfügen von Nukleotid-Substitutionen, welche zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz führen.
Wenn Nukleotidsubstitutionen vorgenommen werden, sind die Aminosäureaustausche bevorzugt von geringer Natur, das heißt konservative Aminosäuresubstitutionen, welche die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinflussen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxylterminale Ausdehnungen, wie zum Beispiel ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu ungefähr 20–25 Resten, oder eine kleine Ausdehnung, welche die Reinigung erleichtert, wie zum Beispiel ein Poly-Histidin-Trakt, ein antigenes Epitop oder eine Bindedomäne.
Beispiele für konservative Substitutionen sind innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (zum Beispiel Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (zum Beispiel Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (zum Beispiel Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (zum Beispiel Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (zum Beispiel Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (zum Beispiel Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin). Für eine allgemeine Beschreibung von Nukleotidsubstitutionen siehe z.B. Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95–107.
Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind, durchgeführt werden können und dennoch zu einem aktiven Polypeptid führen können. Die Aminosäuren, die essentiell sind für die Aktivität des durch das Erfindungsgemäße DNA-Konstrukt kodierten Polypeptids, und daher bevorzugt nicht Gegenstand von Substitution sind, können nach im Stand der Technik bekannten Arbeitsverfahren identifiziert werden, wie zum Beispiel ortsgerichteter Mutagenese oder Alanin-Scanning Mutagenese (vgl. z.B. Cunningham and Wells, (1989), Science 244, 1081–1085). Bei der letzteren Technik werden Mutationen an jedem Rest des Moleküls eingefügt und die resultierenden Mutantenmoleküle werden auf biologische (z.B. Galactanase-) Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Die Stellen der Substrat-Enzym-Interaktion können auch durch die Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, wie durch Techniken wie magnetische Kern-Resonanzanalyse, Kristallographie oder Photoaffinitätslabelling bestimmt (vgl. z.B. de Vos et al., (1992), Science 255, 306–312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899–904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett. 309, 59–64).
Die in (c) vorstehend genannte DNA-Sequenzhomologie wird bestimmt als der Grad der Identität zwischen zwei Sequenzen und gibt eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten an. Die Homologie kann geeigneterweise durch Computerprogramme bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel GAP, bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453). GAP wird mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich verwendet: GAP creation penalty von 5,0 und GAP extension penalty von 0,3, die vorstehend genannte kodierende Region der analogen DNA-Sequenzen zeigten einen Identitätsgrad bevorzugt von wenigstens 70%, mehr bevorzugt von wenigstens 80%, mehr bevorzugt von wenigstens 90%, mehr bevorzugt von wenigstens 95%, mehr bevorzugt von wenigstens 97% mit dem Galactanase kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz.
Die Hybridisierungsbedingungen, die vorstehend genannt sind, um eine analoge DNA-Sequenz wie vorstehend in (d) definiert zu definieren, die an den Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, hybridisiert, d.h. an Nukleotide 1-1050, und/oder an den Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenzen, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt sind, hybridisieren, d.h. an Nukleotide 1-1047, unter mindestens Bedingungen geringer Stringenz, aber bevorzugt unter mittleren oder hohen Stringenzbedingungen, werden im Detail nachstehend beschrieben.
Ähnlich hybridisiert in dem dritten Aspekt der Erfindung die Sonde, welche ein Produkt einer PCR-Reaktion ist, unter mindestens Bedingungen geringer Stringenz, aber bevorzugt bei mittlerer oder hoher Stringenz, an eine DNA-Sequenz kodierend für eine Galactanase, die aus Sordariales erhalten wurde, unter den Bedingungen, welche nachstehend ausführlich beschrieben werden.
Geeignete experimentelle Bedingungen, um die Hybridisierung bei geringer, mittlerer oder hoher Stringenz zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz zu bestimmen, schließen voreinweichen der Filter enthaltend die DNA-Fragmente oder RNA ein, um in 5 × SSC (Sodium chloride/Sodium citrate, Natriumchlorid/Natriumcitrat, Sambrook et al., 1989) für 10 Min. zu hybridisieren, und die Prähybridisierung der Filter in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA (Sambrook et al., 1989), gefolgt durch Hybridisierung der gleichen Lösung enthaltend eine Konzentration von 10 ng/ml einer random-geprimten (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6–13), ³²P-dCTP-markierten (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Sonde für 12 Stunden bei ca. 45°C. Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5% SDS bei wenigstens 55°C (geringe Stringenz) gewaschen, mehr bevorzugt bei wenigstens 60°C (mittlere Stringenz), noch mehr bevorzugt bei wenigstens 65°C (mittlere/hohe Stringenz), noch mehr bevorzugt bei wenigstens 70°C (hohe Stringenz) und noch mehr bevorzugt bei wenigstens 75°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
Moleküle, an die die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden detektiert, indem ein Röntgenfilm verwendet wird.
Die DNA-Sequenz kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase kann aus dem Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9983 und/oder Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9976 isoliert werden, indem Standardverfahren verwendet werden, z.B. wie beschrieben bei Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY.
Die DNA-Sequenz kodierend für ein Enzym, welches erfindungsgemäße Galactanase-Aktivität zeigt, kann auch isoliert werden durch jegliches generelle Verfahren, welches einschließt

– Klonieren, in geeigneten Vektoren, einer cDNA-Bibliothek aus jeglichem Organismus, von dem erwartet wird, dass er die interessierende Galactanase produziert,
– Transformieren geeigneter Hefewirtszellen mit diesen Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um jegliches interessierende Enzym, kodiert durch einen Klon in der cDNA-Bibliothek zu exprimieren,
– Screening auf positive Klone durch Bestimmen jeglicher Galactanase-Aktivität des Enzyms, das durch diese Klone produziert wird, und
– Isolieren der für das Enzym kodierenden DNA aus solchen Klonen.

Ein generelles Isolierungsverfahren ist in WO 93/11249 oder WO 94/14953 offenbart worden, die Inhalte von diesen werden hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Eine ausführlichere Beschreibung des Screeningverfahrens wird in einem Arbeitsbeispiel hierin gegeben (siehe unten).
Alternativ kann die für eine Erfindungsgemäße Galactanase kodierende DNA in Übereinstimmung mit gut bekannten Arbeitsverfahren in geeigneter Weise aus einer geeigneten Quelle isoliert werden, wie zum Beispiel jegliche der unten genannten Organismen, durch Verwenden von synthetischen Oligonukleotid-Sonden, die auf der Basis einer hierin offenbarten DNA-Sequenz hergestellt wurden. Beispielsweise kann eine geeignete Oligonukleotid-Sonde auf der Basis des Galactanase kodierenden Teils der Nukleotidsequenz, gezeigt als SEQ ID NR. 1 und/oder SEQ ID NR. 3, oder jeglicher geeigneter Sub-Sequenz davon oder auf der Basis der Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 2 und/oder SEQ ID NR. 4 hergestellt werden.
Alternativ kann die DNA-Sequenz kloniert werden, indem PCR-Primer verwendet werden, die auf der Basis der hierin offenbarten DNA-Sequenz hergestellt wurden, insbesondere auf der Basis der degenerierten PCR-Primer, offenbart im dritten Aspekt der Erfindung.
Mikrobielle Quellen
Es wird zurzeit angenommen, dass eine erfindungsgemäße klonierte DNA-Sequenz auch aus anderen Mikroorganismen erhalten werden kann. Beispielsweise kann die DNA-Sequenz abgeleitet werden, indem in ähnlicher Weise eine cDNA-Bibliothek von einem anderen Mikroorganismus gescreent wird, insbesondere von einem Pilz, wie zum Beispiel einem Stamm von Aspergillus sp., insbesondere einem Stamm von A. aculeatus oder A. niger, einem Stamm von Trichoderma sp., insbesondere einem Stamm von T. reesei, T. viride, T. longibrachiatum, T. harzianum oder T. koningii oder einem Stamm von einer Fusarium sp., insbesondere einem Stamm von F. oxysporum, oder einem Stamm von Humicola sp., oder einem Stamm von einer Neocallimastix sp., einer Piromyces sp., einer Penicillium sp., einer Aureobasidium sp., einer Thermoascus sp., einer Paecilomyces sp., einer Talaromyces sp., einer Magnaporthe sp., einer Schizophyllum sp., einer Filibasidium sp., oder einer Cryptococcus sp.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die klonierte DNA-Sequenz kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase aus einem Stamm erhalten, der zu der Ordnung Sordariales gehört, wie zum Beispiel den Genera Humicola, Myceliophthora oder Thielavia, insbesondere ein Stamm von H. insolens oder M. thermophilum.
Das Expressionsplasmid pYES 2.0 umfassend die volle Länge der DNA-Sequenz (gezeigt in SEQ ID NR. 1), kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase, ist in einen Stamm von Saccharomyces cerevisiae transformiert worden, welcher durch die Erfinder nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH., Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, (DSM), hinterlegt wurde.

Hinterlegungsdatum: 11.05.95

Ref. Hinterleger: NN049019

DSM-Bezeichnung: Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9983
Das Expressionsplasmid pYES 2.0 umfassend die volle Länge der cDNA-Sequenz (gezeigt in SEQ ID NR. 3) kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase, ist in einen Stamm von Saccharomyces cerevisiae transformiert worden, welcher durch die Erfinder nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, (DSM), hinterlegt wurde.

Hinterlegungsdatum: 11.05.95

Ref. Hinterleger: NN049018

DSM-Bezeichnung: Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9976
Expressionsvektoren
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann jeglicher Expressionsvektor sein, welcher in geeigneter Weise rekombinanten DNA-Arbeitsverfahren unterzogen wird, und die Wahl des Vektors wird oft abhängig sein von der Wirtszelle, in die er eingeführt werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, d.h. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in die er integriert worden ist, repliziert.
In dem Expressionsvektor sollte die DNA-Sequenz kodierend für die Galactanase funktionell mit einer geeigneten Promotor- und Terminatorsequenz verknüpft sein. Der Promotor kann jegliche DNA-Sequenz sein, welche transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt und kann von Genen, kodierend für Proteine entweder homolog oder heterolog für die Wirtszelle, stammen. Die Arbeitsverfahren, die verwendet wurden, um die DNA-Sequenzen kodierend für die Galactanase, den Promotor bzw. den Terminator zu ligieren und sie in geeignete Vektoren zu insertieren, sind den Fachleuten gut bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor, NY).
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in Wirtszellen filamentöser Pilze sind zum Beispiel der ADH3 Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093–2099) oder der tpiA Promotor. Beispiele für andere verwendbare Promotoren sind diejenigen, die von den Genen kodierend für die Aspergillus oryzae TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei Aspartyl-Proteinase, Aspergillus niger neutrale α-Amylase, Aspergillus niger säurestabile α-Amylase, Aspergillus niger oder Aspergillus awamori Glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei Lipase, Aspergillus oryzae alkalische Protease, Aspergillus oryzae Triosephosphat-Isomerase oder Aspergillus nidulans Acetamidase stammen.
Wirtszellen
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit umfassend das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt und/oder den erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor.
Die Wahl der Wirtszelle wird zu einem großen Teil von dem Gen, das das Polypeptid kodiert, und seiner Quelle abhängen. Die Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus sein, z.B. ein Prokaryot, oder ein nicht-einzelliger Mikroorganismus, z.B. ein Eukaryot.
Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Wirtszelle eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Pilz-Zelle wie zum Beispiel eine Hefe oder filamentöse Pilz-Zelle. Insbesondere kann die Zelle zu einer Spezies von Trichoderma, bevorzugt Trichoderma harzianum oder Trichoderma reesei, oder einer Spezies von Aspergillus, am meisten bevorzugt Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, oder einer Spezies von Fusarium, am meisten bevorzugt einer Fusarium sp., welche die identifizierende Eigenschaft von Fusarium ATCC 20334 besitzen, wie weiter beschrieben in PCT/US/95/07743, gehören.
Pilzzellen können durch einen Prozess transformiert werden, der Protoplasten-Bildung und Transformation der Protoplasten, gefolgt durch Regeneration der Zellwand in einer Art, die per se bekannt ist, einschließt. Die Verwendung von Aspergillus als Wirts-Mikroorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, die Inhalte dieser sind hiermit durch bezugnahme eingeschlossen. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle sein, z.B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces sp., wie zum Beispiel Schizosaccharomyces pombe, ein Stamm von Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp., wie zum Beispiel Yarrowia lipolytica oder Kluyveromyces sp. wie zum Beispiel Kluyveromyces lactis.
Verfahren zur Herstellung von Galactanase
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines isolierten erfindungsgemäßen Enzyms bereit, wobei eine geeignete Wirtszelle, welche mit einer DNA-Sequenz kodierend für das Enzym transformiert worden ist, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
Wenn der Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für das Enzym, in eine heterologe Wirtszelle transfomiert wird, ist es möglich, die heterologe rekombinante Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms zu ermöglichen.
Dabei ist es möglich, eine hochreine Galactanase-Zusammensetzung zu fertigen, die dadurch charakterisiert ist, dass sie frei von homologen Verunreinigungen ist.
Bei der vorliegenden Erfindung kann die homologe Wirtszelle z.B. ein Stamm von H. insolens oder M. thermophilum sein.
Das Medium, welches verwendet wird, um die transformierten Wirtszellen zu kultivieren, kann jegliches konventionelle Medium sein, welches geeignet ist, um die fraglichen Wirtszellen wachsen zu lassen. Die exprimierte Galactanase kann in geeigneter Weise in das Kulturmedium sekretiert werden und kann daraus durch gut bekannte Arbeitsverfahren gewonnen werden, die das Trennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, präzipitieren der Proteinösen Bestandteile des Mediums durch Salz wie Ammoniumsulfat gefolgt durch Chromatographie-Arbeitsverfahren wie zum Beispiel Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie oder ähnlichem einschließen.
Erfindungsgemäßes Enzym
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Enzym, das Galactanase-Aktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass (i) es frei von homologen Verunreinigungen ist und (ii) das Enzym wie vorstehend beschrieben hergestellt wird, indem eine heterologe Wirtszelle verwendet wird.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Enzym, das Galactanase-Aktivität aufweist, das die Aminosäure-Teilsequenz umfasst

Bevorzugt besitzt das Enzym nach dieser Ausführungsform die Eigenschaften a)–d) der Enzyme, die unmittelbar nachstehend beschrieben werden.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Enzym, das Galactanase-Aktivität zeigt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Polypeptid, das von einem Galactanase-Enzym kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2.0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 vorhanden ist, kodiert ist;
(b) einem Polypeptid, das eine wie in den Positionen 19-350 von SEQ ID NR. 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst;
(c) einem Analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptids, das wenigstens zu 70% homolog mit dem besagten Polypeptid ist; und
(d) einer allelen Form oder eines Fragments von (a), (b) oder (c).

In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Enzym, das Galactanase-Aktivität zeigt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Polypeptid, das von einem Galactanase-Enzym kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2.0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 vorhanden ist, kodiert ist;
(b) einem Polypeptid, das eine wie in den Positionen 19-349 von SEQ ID Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; und
(c) einem analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptids, das wenigstens 70% homolog mit dem besagten Polypeptid ist; und einer allelen Form oder Fragment von (a), (b) oder (c).

Die vorstehend genannte Polypeptid Homologie (Eigenschaft (c)) von dem/den erfindungsgemäßen Polypeptid(en) wird bestimmt als der Grad der Identität zwischen zwei Sequenzen, der eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten angibt. Die Homologie kann geeigneterweise mittels Computerprogrammen bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel GAP bereitgestellt in dem GCG-Programmpaket (Program Mannual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453). Bei Verwenden von GAP mit den folgenden Einstellungen für den Polypeptidsequenzvergleich: GAP creation penalty von 3,0 und GAP extension penalty von 0,1, zeigt der reife Teil eines Polypeptids kodiert durch eine analoge, erfindungsgemäße DNA-Sequenz einen Identitätsgrad bevorzugt von wenigstens 70%, mehr bevorzugt von wenigstens 80%, mehr bevorzugt von wenigstens 90%, mehr bevorzugt von wenigstens 95%, und speziell wenigstens 97% mit dem reifen Teil der Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NR. 2, d.h. mit den Positionen 19-350 in SEQ ID NR. 2 und/oder mit dem reifen Teil der Aminosäuresequenz, gezeigt in SEQ ID NR. 4, d.h. mit den Positionen 19-349 in SEQ ID NR. 4.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Galactanase-Varianten gerichtet, welche eine Aminosequenz aufweisen, die sich in nicht mehr als drei Aminosäuren, bevorzugt in nicht mehr als zwei Aminosäuren und mehr bevorzugt in nicht mehr als einer Aminosäure von dem reifen Teil der Aminosequenz unterscheidet, die in SEQ ID NR. 2 und/oder SEQ ID NR. 4 dargelegt ist.
Das erfindungsgemäße Enzym kann von jeder beliebigen der Quellen stammen, die in dem "Mikrobielle Quellen" betitelten Absatz beschriebenen werden.
Enzymzusammensetzungen
In nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzusammensetzung, die für den Abbau von Pflanzenzellwand-Bestandteilen verwendet werden kann, diese Zusammensetzung ist angereichert durch ein Enzym, das Galactanase-Aktivität wie vorstehend beschrieben aufweist. Auf diese Weise kann ein Fördern der Zellwand-abbauenden Fähigkeit der Enzymzusammensetzung erreicht werden.
Die Enzymzusammensetzung, die mit einem erfindungsgemäßen Enzym angereichert wurde, kann z.B. eine Enzymzusammensetzung umfassend eine Vielzahl von enzymatischen Aktivitäten sein, insbesondere eine Enzymzusammensetzung umfassend eine Vielzahl von Pflanzenzellwand-abbauenden Enzymen wie zum Beispiel Biofeed^®, Biofeed Wheat^®, Energex^®, Viscozym^®, Pectinex^®, Pectinex Ultra SP^®, Phytase Novo^®, Celluclast oder Celluzym (alle erhältlich von Novo Nordisk A/S).
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "angereichert" angeben, dass die Galactanase-Aktivität der Enzymzusammensetzung gesteigert worden ist, d.h. mit einem Anreicherungsfaktor von 1,1 günstigerweise aufgrund des Hinzufügen eines erfindungsgemäßen Enzyms, welches durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurde.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann, zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen Galactanase-Aktivität, ein oder mehrere andere Enzym(e) enthalten, zum Beispiel solche mit xylanolytischen oder pektinolytischen Aktivitäten wie zum Beispiel α-Arabinosidase, β-Glucuronisidase, β-Xylosidase, Xylanacetylesterase, Arabinanase, Rhamnogalacturonase, Pektinacetylesterase, Phytase, Galactanase, Polygalacturonase, Pektinlyase, Pektatlyase, Glucanase, Pektinmethylesterase, Laccase oder Oxidoreductase. Das 1 die zusätzliche(n) Enzym(e) kann/können durch einen Mikroorganismus herstellbar sein, der zu dem Genus Aspergillus gehört, bevorzugt Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus avamori oder Aspergillus oryzae oder Trichoderma oder Humicola insolens.
Alternativ kann die Enzymzusammensetzung, die angereichert ist mit einem Enzym, welches Galactanase-Aktivität zeigt, eine Zusammensetzung sein, welche ein erfindungsgemäßes Enzym als enzymatischen Haupt-Bestandteil umfasst, z.B. eine einkomponentige Enzymzusammensetzung.
Die Enzymzusammensetzung kann im Einklang mit im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, und kann in Form einer flüssigen oder einer trockenen Zusammensetzung vorliegen. Zum Beispiel kann die Enzymzusammensetzung in der Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats vorliegen. Das Enzym, das in die Zusammensetzung eingeschlossen werden soll, kann in Einklang mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, stabilisiert werden.
Nachstehend werden Beispiele von bevorzugten Verwendungen der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung gegeben. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung und andere Bedingungen, unter denen die Zusammensetzung verwendet wird, können auf der Basis von Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann für wenigstens einen der folgenden Zwecke benutzt werden.
Abbau oder Modifikation von Pflanzenmaterial
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung wird, aufgrund der hohen Pflanzenzellwand abbauenden Aktivität der erfindungsgemäßen Galactanase, bevorzugt als ein Mittel zum Abbau oder zur Modifikation von Pflanzenzellwänden oder jeglichem Galactan-enthaltenden Material, welches von Pflanzenzellwänden stammt, verwendet.
Die erfindungsgemäße Galactanase hydrolysiert β-1,4-Bindungen in Galactanen. Galactane sind Polysaccharide, die ein aus β-1,4-verknüpfter Galactose gebildetes Rückgrat aufweisen. Das Rückgrat kann Seitenzweige, wie zum Beispiel Arabinose, aufweisen. Die Zusammensetzung und die Anzahl der Seitenzweige variieren nach der Quelle des Galactans. (Stephen, A.M., 1983, Kp. 3 in The Polysaccharides, Bd. 2, Hrsg. Aspinall, G.O.).
Der Abbau von Galactan durch Galactanasen wird beschleunigt durch das gesamte oder teilweise Entfernen der Seitenzweige. Arabinose Seitengruppen können durch eine milde Säurebehandlung oder durch alpha-Arabinosidasen entfernt werden. Die Oligomere, welche durch die Galactanase oder durch eine Kombination von Galactanasen und Seitenzweige-hydrolysierenden Enzymen wie oben erwähnt freigesetzt werden, können weiter durch beta-Galactosidasen zu freier Galactose angebaut werden.
Die Galactanase der vorliegenden Erfindung kann, ohne andere pektinolytische oder hemicellulolytische Enzyme oder mit einer begrenzten Aktivität von anderen pektinolytischen oder hemicellulolytischen Enzymen verwendet werden, um Galactane für die Herstellung von Oligosacchariden abzubauen. Die Oligosaccharide können als „bulking agents" verwendet werden, wie von Soja-Zellwandmaterial freigesetzte Arabinogalactan Oligosaccharide, oder wie mehr oder weniger gereinigte Arabinogalactane aus Pflanzenmaterial.
Die Galactanase der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit anderen pektinolytischen oder hemicellulolytischen Enzymen verwendet werden, um Galactane zu Galactose und anderen Monosacchariden abzubauen.
Die Galactanase der vorliegenden Erfindung kann allein oder zusammen mit anderen Enzymen wie Glucanasen, Pektinasen oder Hemicellulasen verwendet werden, um die Extraktion von Öl aus ölreichen Pflanzenmaterial zu verbessern, wie Sojabohnenöl aus Sojabohnen, Olivenöl aus Oliven oder Rapsöl aus Rapssaat oder Sonnenblumenöl aus Sonnenblumen.
Die Galactanase der vorliegenden Erfindung kann zur Trennung von Bestandteilen der Pflanzen-Zellmaterialien verwendet werden. Von besonderem Interesse ist die Trennung von zucker- oder stärkereichem Pflanzenmaterial in Bestandteile von beachtlichem kommerziellen Interesse (wie Saccharose aus Zuckerrübe oder Stärke aus Kartoffel) und Bestandteile von geringem Interesse (wie Pulpe oder Hülsenfraktionen (hull fractions)). Auch von besonderem Interesse ist die Trennung von proteinreichen oder ölreichen Nutzpflanzen in wertvolle Protein- und Öl- und nicht wertvolle Hülsenfraktionen. Der Trennungsprozess kann durchgeführt werden, indem im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Galactanase kann auch, um die Ausbeute zu steigern, bei der Herstellung von Frucht- oder Gemüsesaft verwendet werden, und bei der enzymatischen Hydrolyse von zahlreichen Pflanzenzellwand-abgeleiteten Materialien oder Abfallmaterialien, z.B. aus der Wein- oder Saftherstellung oder agrarwirtschaftliche Reste wie zum Beispiel Gemüsehülsen, Bohnenhülsen, Zuckerrübenpulpe, Olivenpulpe, Kartoffelpulpe und ähnlichem.
Das Pflanzenmaterial kann angebaut werden, um unterschiedliche Arten von Bearbeitungen zu verbessern, die Reinigung oder Extraktion von anderen Bestandteilen als den Galactanen, wie die Reinigung von Pektinen aus Zitrusfrüchten, zu ermöglichen, den Futterwert (feed value) zu verbessern, die Wasserbindungsfähigkeit zu erniedrigen, die Abbaubarkeit in Abwässerungsanlagen zu steigern, die Umwandlung von Pflanzenmaterial in Gärfutter zu verbessern etc.
Durch eine erfindungsgemäße Enzymzubereitung ist es möglich, die Konsistenz und das Aussehen von bearbeiteten Früchten oder Gemüsen zu regulieren. Es ist gezeigt worden, dass die Konsistenz und das Aussehen ein Produkt der tatsächlichen Kombination der Enzyme sind, die für die Bearbeitung verwendet werden, z.B. der Spezifität der Enzyme, mit denen die erfindungsgemäße Galactanase kombiniert wird. Beispiele schließen die Produktion von klarem Saft, z.B. aus Äpfeln, Birnen oder Beeren; trübungsstabile Säften, z.B. aus Äpfeln, Birnen, Beeren, Zitrusfrüchten oder Tomaten; und Pürees, z.B. aus Karotten und Tomaten ein.
Die erfindungsgemäße Galactanase kann bei der Modifizierung der Viskosität von von der Pflanzenzellwand stammendem Material verwendet werden. Zum Beispiel kann die Galactanase verwendet werden, um die Viskosität von Futter zu reduzieren, welches Galactan enthält, und das Bearbeiten von viskosem, Galactan-enthaltenden Material zu fördern. Die Viskositätsreduktion kann durch Behandeln des Galactan-enthaltenden Pflanzenmaterials mit einer erfindungsgemäßen Enzymzubereitung, unter geeigneten Bedingungen, zum gesamten oder teilweisen Abbau des Galactan-enthaltenden Materials erreicht werden.
Die Galactanase kann, z.B. in Kombination mit anderen Enzymen, für das Entfernen von pektischen Substanzen aus Pflanzenfasern verwendet werden. Dieses Entfernen ist z.B. bei der Herstellung von Textilfasern oder anderen zellulosehaltigen Materialien essentiell. Für diesen Zweck wird Pflanzenfasermaterial mit einer geeigneten Menge der erfindungsgemäßen Galactanase unter geeigneten Bedingungen behandelt, um einen vollen oder teilweisen Abbau der pektischen Substanzen, welche mit dem Pflanzenfasermaterial assoziiert sind, zu erreichen.
Tierfutterzusatzstoff
Galactanasen der vorliegenden Erfindung können zur Modifikation von Tierfutter verwendet werden und können ihren Effekt entweder in vitro (durch Modifizieren von Bestandteilen des Futters) oder in vivo zeigen. Die Galactanase ist insbesondere geeignet, um sie zu Tierfutter-Zusammensetzungen hinzuzufügen, welche hohe Mengen an Arabinogalactanen oder Galactanen enthalten, z.B. Futter, welches Pflanzenmaterial aus Sojabohne, Rapssamen, Lupine etc. enthält. Wenn sie zu dem Futter hinzugefügt wird, verbessert die Galactanase signifikant den in vivo-Abbau von Pflanzenzellwand-Material, wobei eine bessere Nutzung der Pflanzennährstoffe durch das Tier erreicht wird. Dadurch wird die Wachstumsgeschwindigkeit und/oder das Futter-Umsetzungsverhältnis (d.h. das Gewicht von aufgenommenem Futter relativ zur Gewichtszunahme) des Tieres verbessert.
Zum Beispiel wird das einnehmbare Galactan durch Galactanase, z.B. in Kombination mit β-Galactosidase, zu Galactose oder Galactooligomeren angebaut, welche durch das Tier verdaut werden können und daher zur verfügbaren Energie des Futters beitragen. Auch kann die Galactanase durch den Abbau von Galactan die Verdaubarkeit und die Aufnahme von Nicht-Kohlenhydrat-Futterbestandteilen, wie zum Beispiel Protein, Fett und Mineralien, verbessern.
Für eine ausführlichere Beschreibung wird auf PCT/DK 96/00443 und einem Arbeitsbeispiel hierin (siehe unten) hingewiesen.
Wein- und Saftbearbeitung
Eine erfindungsgemäße Enzymzubereitung kann für die Depektinisierung und Herabsetzung der Viskosität bei Gemüse- oder Fruchtsaft verwendet werden, insbesondere bei Apfel- oder Birnensaft. Dies kann erreicht werden, indem der Frucht- oder Gemüsesaft mit einer erfindungsgemäßen Enzymzubereitung in einer Menge behandelt wird, die effektiv ist, um das Pektin-enthaltende Material, welches in dem Frucht- oder Gemüsesaft enthalten ist, abzubauen.
Die Enzymzubereitung kann bei der Behandlung von Püree aus Früchten und Gemüsen verwendet werden, um die Extrahierbarkeit oder Abbaubarkeit des Pürees zu verbessern. Zum Beispiel kann die Enzymzubereitung bei der Behandlung von Püree aus Äpfeln und Birnen für die Saftproduktion und bei der Püreebehandlung von Trauben für die Weinherstellung verwendet werden.
Vorteil von einkomponentigen Galactanasen
Aus dem Vorangehenden wird es offensichtlich sein, dass die erfindungsgemäße Galactanase als einzelkomponentige Enzymzusammensetzung hergestellt werden kann, die im Wesentlichen frei von anderen Enzymaktivitäten, wie zum Beispiel Pektinmethylesterase und anderen pektinolytischen Enzymen, ist, die normalerweise in kommerziell erhältlichen, Galactanase enthaltenden, pectinolytischen, hemizellulolytischen oder zellulytischen Enzymzubereitungen gefunden werden.
Aus diesem Grund ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Galactanase besonders vorteilhaft für Zwecke, bei denen die Wirkung von solchen anderen Enzymaktivitäten nicht gewünscht wird. Beispiele schließen die Herstellung von trübungsstabilen Säften und die Herstellung von Pürees ein. Bei diesen Herstellungen führt die Anwesenheit von z.B. Pektinmethylesterase, welche normalerweise als eine Nebenaktivität in konventionellen pektinolytischen Enzymzubereitungen gefunden wird, zu einer abnehmenden Stabilität der Trübung in trübungsstabilen Saft, oder verursacht eine Synärese im Püree.
Außerdem kann die erfindungsgemäße Galactanase durch ihre im Wesentlichen Reinheit verwendet werden, um Pektin in einer Weise zu modifizieren, dass nur die Teile des Pektins, welche Galactan enthalten, angebaut werden. Wenn konventionelle pektinolytische Aktivitäten vorhanden wären, wurde ein umfangreicherer Abbau des Pektins erreicht, mit einer resultierenden Reduktion in der Viskosität- verleihenden oder gelierenden Fähigkeit des Pektins.
Schließlich kann die im Wesentlichen reine Galactanase verwendet werden, um selektiv Galactose und Galactooligomere aus Pflanzenmaterial, das als Futter verwendet wird, freizusetzen. Galactose wird leicht durch Tiere abgebaut. Konventionelle pektinolytische oder hemicellulolytische Enzymzubereitungen mit Galactanase-Aktivität enthalten, zusätzlich zu der Galactanase, eine Mischung von Endo- und Exoenzymen, welche z.B. Xylose und Galacturonsäure produzieren, die in Futter unerwünscht sind.
Die Erfindung wird in weiteren Einzelheiten in den folgenden Beispielen beschrieben, welche in keiner Weise den Umfang der Erfindung, wie beansprucht, limitieren sollen.
MATERIALIEN UND METHODEN
Hinterlegte Organismen:
Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 enthaltend das Plasmid, umfassend die volle Länge DNA-Sequenz, kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase (gezeigt in SEQ ID NR 1) in dem Shuttle-Vektor pYES 2.0.
Saccharomyces cerevisiae DSM 9976 enthaltend das Plasmid, umfassend die volle Länge cDNA-Sequenz, kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase (gezeigt in SEQ ID NR 3) in dem Shuttle-Vektor pYES 2.0.
Andere Stämme:

Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65 umfasst die erfindungsgemäße, Galactanase kodierende DNA-Sequenz (gezeigt in SEQ ID NR 1).
Humicola insolens DSM Nr. 1800 umfasst eine erfindungsgemäße, Galactanase kodierende DNA-Sequenz (gezeigt in SEQ ID NR 3).
Hefestamm: Der verwendete Saccharomyces cerevisiae Stamm war W3124 (MATa; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prc1::HIS3; prb1::LEU2; cir+).

E. Coli Stamm: DH5α (Life Technologies A/S)
Plasmide:
Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023 ). Die Konstruktion von pHD414 wird näher in WO 93/11249 beschrieben.
pYES 2.0 (Invitrogen)
Generelle molekularbiologische Verfahren:
Wenn nicht anders erwähnt, wurden die DNA-Manipulationen und -Transformationen durchgeführt, indem Standardverfahren der Molekularbiologie verwendet wurden (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Enzyme für die DNA-Manipulationen wurden nach den Anweisungen der Hersteller verwendet.
Enzyme für DNA-Manipulationen
Wenn nicht anders erwähnt, wurden alle Enzyme für die DNA-Manipulationen, wie zum Beispiel Restriktionsendonukleasen, Ligasen etc., von New England Biolabs, Inc. bezogen.
Fermentationsverfahren für Humicola insolens DSM 100 für die mRNA-Isolierung:
Humicola insolens DSM 1800 wurde von einer Platte mit ausgewachsenem Mycel in eine Schüttelflasche enthaltend 100 ml Mais-Gries („grits") enthaltendes Medium PD flüssige Brühe inokuliert (24 g Kartoffel-Dextrose-Brühe, Difco 0549, deionisiertes Wasser bis zu 1000 ml; Autoklavieren (121°C für 15–20 Min.)).
Die Kultur wurde bei 26°C für 5 Tage fermentiert. Die resultierende Kulturbrühe wurde durch Miracloth gefiltert und das Mycel wurde in flüssigem Stickstoff gefroren.
mRNA wurde aus dem Mycel dieser Kultur, wie in (H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994) 243: 253–260; WO 93/11249; WO 94/14953) beschrieben, isoliert.
Fermentationsverfahren von Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65 zur mRNA-Isolierung:
Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65 wurde von einer Platte mit ausgewachsenem Mycel in eine Schüttelflasche enthaltend 100 ml Cellulose-enthaltendes Medium PD flüssige Brühe inokuliert (24 g Kartoffel-Dextrose-Brühe, Difco 0549, deionisiertes Wasser bis zu 1000 ml; Autoklavieren (121°C für 15–20 Min.)).
Die Kultur wurde bei 26°C für 5 Tage fermentiert. Die resultierende Kulturbrühe wurde durch Miracloth gefiltert und das Mycel wurde in flüssigem Stickstoff gefroren.
mRNA wurde aus dem Mycel dieser Kultur, wie in (H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994) 243: 253–260; WO 93/11249; WO 94/14953) beschrieben, isoliert.
Extraktion von Gesamt-RNA wird mit Guanidiniumthiocyanat durchgeführt, gefolgt durch Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen, und die Isolierung von Poly(A)⁺RNA wird durch Oligo(dT)-Cellulose-Affinitätschromotagrophie durchgeführt, indem die in WO 94/14953 beschriebenen Arbeitsverfahren verwendet werden.
cDNA-Synthese: Doppelsträngige cDNA wird aus 5 mg Poly(A)⁺RNA durch das RNase-H-Verfahren synthetisiert (Gubler and Hoffman (1983) Gene 25: 263–269, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory ml, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY). Die Poly(A)⁺RNA (5 mg in 5 ml DEPC-behandeltem Wasser) wird in einem präsilikonisierten, RNase-freien Eppendorf-Röhrchen für 8 Min. auf 70°C erhitzt, auf Eis kalt abgeschreckt und in einem Endvolumen von 50 ml mit Reverse Transcriptase Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories) kombiniert, enthaltend 1 mM dATP, dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP (Pharmacia), 40 Einheiten menschlichen plazentalen Ribonuklease-Inhibitor (RNasin, Promega), 1,45 mg Oligo(dT)₁₈-Not I Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten SuperScript II RNase H Reverse Transcriptase (Bethesda Research Laboratories). Die ErstStrang cDNA wird durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei 45°C für 1 Stunde synthetisiert. Nach der Synthese wird die mRNA:cDNA-Hybridmischung durch eine MicroSpin S-400 HR (Pharmacia) Spinsäule nach den Anweisungen des Herstellers gelfiltriert.
Nach der Gelfiltration werden diese Hybride in 250 ml Zweit-Strang-Puffer verdünnt (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,16 mM bNAD⁺), enthaltend 200 mM jeweils dNTP, 60 Einheiten E. coli DNA Polymerase I (Pharmacia), 5,25 Einheiten RNase H (Promega) und 15 Einheiten E. coli DNA-Ligase (Boehringer Mannheim). Zweit-Strang cDNA-Synthese wird durchgeführt durch Inkubieren des Reaktionsröhrchens bei 16°C für 2 Stunden und zusätzlichen 15 Min. bei 25°C. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM gestoppt, gefolgt durch Phenol- und Chloroformextraktionen.
Mungbohnen-Nuklease-Behandlung: Die doppelsträngige cDNA wird bei –20°C für 12 Stunden durch Hinzufügen von 2 Vol. 96% EtOH, 0,2 Vol. 10 M NH₄Ac präzipitiert, durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 ml Mungbohnen-Nuklease-Puffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 0,35 mM DTT, 2% Glycerol) resuspendiert, enthaltend 25 Einheiten Mungbohnen-Nuklease (Pharmacia). Die Einzelstrang-Hairpin DNA wird abgetrennt durch Inkubieren der Reaktion bei 30°C für 30 Min., gefolgt durch Hinzufügen von 70 ml 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Präzipitation mit 2 Vol. 96% EtOH und 0,1 Vol. 3 M NaAc, pH 5,2 auf Eis für 30 Min.
Herstellen von Blunt-Enden mit T4 DNA Polymerase: Die doppelsträngigen cDNAs wurden durch Zentrifugation gewonnen und mit Blunt-Enden versehen in 30 ml T4 DNA Polymerasepuffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT) enthaltend 0,5 mM jeweils dNTP und 5 Einheiten T4 DNA Polymerase (New England Biolabs) durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei 16°C für 1 Stunde. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM gestoppt, gefolgt durch Phenol- und Chloroformextraktionen und einer Präzipitation für 12 Stunden bei –20°C durch das Hinzufügen von 2 Vol. 96% EtOH und 0,1 Vol. 3 M NaAc pH 5,2.
Adapter-Ligation, Not I Verdau und Größenselektion:
Nach der Auffüllreaktion werden die cDNAs durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen und getrocknet. Das cDNA-Pellet wird in 25 ml Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl), pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) resuspendiert, enthaltend 2,5 mg nicht-palindromische BstXI-Adaptoren (Invitrogen) und 30 Einheiten T4-Ligase (Promega) und bei 16°C für 12 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 65°C für 20 Min. gestoppt und dann für 5 Min. auf Eis gekühlt. Die adaptierte cDNA wird mit Not I Restriktionsenzym verdaut durch Hinzufügen von 20 ml Wasser, 5 ml 10× Not I Restriktionsenzympuffer (New England Biolabs) und 50 Einheiten Not I (New England Biolabs), gefolgt durch Inkubation für 2,5 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 65°C für 10 Min. gestoppt. Die cDNAs werden größenfraktioniert durch Gelelektrophorese auf einem 0,8% SeaPlaque GTG „low melting temperature" Agarosegel (FMC) in 1× TBE, um unligierte Adaptoren und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNA wird mit einem Ausschluss von 0,7 kb Größen-selektiert und aus dem Gel gewonnen, indem b-Agarase (New England Biolabs) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird, und für 12 Stunden bei –20°C präzipitiert durch Hinzufügen von 2 Vol. 96% EtOH und 0,1 Vol. 3 M NaAc pH 5,2.
Konstruktion von Bibliotheken: Die gerichtete, Größen-selektierte cDNA wird durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 ml 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert. Die cDNAs werden durch Gelfiltration durch eine MicroSpin S-300 HR (Pharmacia) Spinsäule nach den Anweisungen des Herstellers entsalzen. Drei Testligationen werden durchgeführt in 10 ml Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) enthaltend 5 ml doppel-strängige cDNA (Reaktionsröhrchen #1 und #2), 15 Einheiten T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Röhrchen #1), 40 ng (Röhrchen #2) und 40 ng (Röhrchen #3, die Vektorhintergrundkontrolle) von BstXI-NotI geschnittenem pYES 2.0 Vektor. Die Ligationsreaktionen werden durch Inkubation bei 16°C für 12 Stunden, Erhitzen auf 70°C für 20 Min. und Hinzufügen von 10 ml Wasser zu jedem Röhrchen durchgeführt. 1 ml von jeder Ligationsmischung wird in 40 ml elektrokompetente E. coli DH10B Zellen (Bethesda research Laboratories) wie beschrieben elektroporiert (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY). Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wird eine Bibliothek in E. Coli aufgebaut, die aus Vereinigungen (Pools) besteht. Jeder Pool wird hergestellt, indem transformierte E. coli auf LB+Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen wurden, was 15.000–30.000 Kolonien/Platte nach Inkubation bei 37°C für 24 Stunden ergab. 20 ml LB+Ampicillin wird zu der Platte gegeben und die Zellen wurden hierin suspendiert. Die Zellsuspension wird in einem 50 ml Röhrchen für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt. Plasmid DNA wird von den Zellen nach Anweisung des Herstellers isoliert, indem ein QIAGEN Plasmid Kit verwendet wird, und bei –20°C gelagert.
1 ml Aliquots der gereinigten Plasmid DNA (100 ng/ml) aus individuellen Pools werden in S. cerevisiae W3124 durch Elektroporation (Becker and Guarante (1991) Methods Enzymol. 194: 182–187) transformiert und die Transformanten werden auf SC Agar, enthaltend 2% Glucose, ausplattiert und bei 30°C inkubiert.
Identifizierung positiver Klone:
Die Transformanten werden auf SC Agar enthaltend 0,1% AZCL-Galactan (Megazyme, Australien) und 2% Galactose ausplattiert und für 3–5 Tage bei 30°C inkubiert.
Galactanase-positive Kolonien werden als Kolonien identifiziert, die von einem blauen Hof umgeben sind.
Isolierung eines cDNA-Gens zur Expression in Aspergillus:
Eine Galactanase-produzierende Hefekolonie wird in 20 ml YPD-Brühe in ein 50 ml Glasteströhrchen inokuliert. Das Röhrchen wird für 2 Tage bei 30°C geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 10 Min. bei 3000 upm geerntet.
DNA wird nach WO 94/14953 isoliert und in 50 ml Wasser gelöst. Die DNA wird in E. coli durch Standardarbeitsverfahren transformiert. Plasmid DNA wird aus E. coli isoliert, indem Standardarbeitsverfahren verwendet werden, und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Das cDNA-Insert wird ausgeschnitten, indem geeignete Restriktionsenzyme verwendet werden, und in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger
Protoplasten können hergestellt werden, wie in WO 95/02043, S. 16, Zeile 21 – Seite 17, Zeile 12 beschrieben, was hierdurch durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
100 μl Protoplastensuspension wird mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl₂) gemischt. Die Protoplasten werden mit dem interessierenden Aspergillus-Vektor gemischt. Die Mischung wird für 25 Minuten bei Raumtemperatur belassen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 werden hinzugefügt und sorgfältig gemischt (zweimal) und schließlich wird 0,85 ml der gleichen Lösung hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Die Mischung wird für 25 Minuten bei Raumtemperatur belassen, bei 2500 g für 15 Minuten geschleudert und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56) ausgebreitet, welche 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, um das Hintergrundwachstum zu inhibieren, enthalten. Nach Inkubation für 4–7 Tage bei 37°C werden die Sporen aufgesammelt und, um Einzelkolonien zu erhalten, ausgebreitet. Dieses Arbeitsverfahren wird wiederholt und Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Re-Isolation werden als eine definierte Transformante gelagert.
Test auf A. oryzae Transformanten
Jede der Transformanten wird in 10 ml YPM inokuliert (vgl. unten) und vermehrt. Nach 2–5 Tagen Inkubation bei 30°C wird der Überstand entfernt. Die Galactanase-Aktivität wird bestimmt, indem 10 μl Überstand in 4 mm Durchmesser Löcher, die in Agarplatten enthaltend 0,2% AZCL-Galactan (Megazyme, Australien) ausgestochen wurden, aufgetragen wird. Die Galactanase-Aktivität wird dann als blauer Hof bestimmt.
Fed Batch Fermentation:
Fed Batch Fermentation wurde in einem Medium umfassend Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt durchgeführt. Die Fed Batch Fermentation wurde durch Inokulieren einer Schüttelflaschenkultur mit fraglichen A. oryzae Wirtszellen in einem Medium umfassend 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle durchgeführt. Nach 24 Stunden Kultivierung bei pH 7,0 und 34°C wurde mit der kontinuierlichen Bereitstellung von zusätzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen begonnen. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierender Faktor beibehalten und es wurde sichergestellt, dass Sauerstoff in Überschuss vorhanden war. Die Fed Batch Kultivierung wurde für 4 Tage fortgesetzt.
Isolierung der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist:
Der für die Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, kodierend für die Erfindungsgemäße Galactanase, kann aus dem hinterlegten Organismus Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 durch Extraktion der Plasmid DNA durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY).
Isolierung der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist:
Der Galactanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, kodierend für die erfindungsgemäße Galactanase, kann aus dem hinterlegten Organismus Saccharomyces cerevisiae DSM 9976 durch Extraktion der Plasmid DNA durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY).
Medien

YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O bis 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20% Glucose (sterilfiltriert) hinzugefügt.
YPM: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O bis 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20% Maltodextrin (sterilfiltriert) hinzugefügt.
10fach Grundsalz (Basal salt): 75 g Hefe-Stickstoff-Basis, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, H₂O bis 1000 ml, sterilfiltriert.
SC-URA: 100 ml 10 × Grundsalz, 28 ml 20% Casaminonsäure ohne Vitamine, 10 ml 1% Tryptophan, H₂O bis 900 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 100 ml 20% Glucose oder 20% Galactose hinzugefügt.
SC-Agar: SC-URA, 20 g/l Agar hinzugefügt.
SC-Variante Agar: 20 g Agar, 20 ml 10 × Grundsalz, H₂O bis 900 ml, autoklaviert
AZCL-Galactan (Megazyme, Australien)
PEG 4000 (Polyethylenglycol, Molekulargewicht = 4000) (BDH, England)

BEISPIELE
BEISPIEL 1
Klonieren und Expression einer Galactanase aus Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65
mRNA wurde aus Myceliophthora thermophila, CBS Nr. 117.65 isoliert, in Zelluloseenthaltendem unter Bewegung angezogen, um ausreichende Belüftung zu garantieren. Die Mycelien wurden nach 3–5 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C gelagert. Eine Bibliothek von Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65, enthaltend ungefähr 9 × 10⁵ einzelne Klone, wurde in E. coli mit einem Vektorhintergrund von 1%, wie beschrieben, konstruiert. Plasmid DNA aus einigen der Poole wurde in Hefe transformiert und 50–100 Platten enthaltend 250–400 Hefekolonien wurden aus jedem Pool gewonnen.
Auf SC-Agarplatten wurden Galactanase-positive Kolonien mit dem AZCL-Xylan-Assay identifiziert und isoliert. Die cDNA Inserts wurden direkt aus den Hefekolonien amplifizert und wie in dem Abschnitt Materialien und Methoden vorstehend beschrieben, charakterisiert. Die DNA-Sequenz der cDNA, die für die Galactanase kodiert, wird in SEQ ID Nr. 1 gezeigt und die entsprechende Aminosequenz wird in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. In SEQ ID Nr. 1 definieren die DNA-Nukleotide von Nr. 1-1050 die für die Galactanase kodierende Region.
Die cDNA kann aus dem Plasmid in DSM 9983gewonnen werden.
Die gesamte DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert und die Plasmid DNA wurde durch Transformation von E. coli, wie vorstehend beschrieben, geborgen. Um die Galactanase in Aspergillus zu exprimieren wurde die DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, auf einem Gel größenfraktioniert und ein Fragment, welches dem Galactanase-Gen entspricht, wurde gereinigt. Das Gen wurde anschließend in pHD414 ligiert, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, was zu dem Plasmid pA2G53 führte.
Nach Amplifikation der DNA in E. coli wurde das Plasmid in Aspergillus oryzae, wie vorstehend beschrieben, transformiert.
Test auf A. oryzae Transformanten
Jede der Transformanten wurde, wie vorstehend beschrieben, auf Enzymaktivität getestet. Einige der Transformanten zeigten Galactanase-Aktivität, die signifikant größer war als die des Aspergillus oryzae-Hintergrunds. Dies zeigt die effiziente Expression der Galactanase in Aspergillus oryzae.
BEISPIEL 2
Eine Homologiesuche mit einer DNA-Sequenz (gezeigt in SEQ ID Nr. 1), kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase, wurde gegen Nukleotid- und Proteindatenbanken durchgeführt. Die Homologiesuche zeigte, dass die ähnlichste Galactanase eine β-1,4-Galactanase aus Aspergillus aculeatus war.
Nach dem Verfahren, das in "AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG" beschrieben wurde, wurde die DNA-Homologie einer erfindungsgemäßen Galactanase (gegen die meisten Galactanasen aus dem Stand der Technik) bestimmt, indem das Computerprogramm GAP verwendet wurde. Die erfindungsgemäße Galactanase hat nur 59% DNA-Homologie zu der Beta-1,4-Galactanase aus Aspergillus aculeatus (WO 92/13945). Dies zeigt, dass die erfindungsgemäße Galactanase in der Tat unterschiedlich von allen bekannten Galactanasen ist.
Beispiel 3:
Reinigung von rekombinanten Galactanasen aus M. thermophilum.
Der Kulturüberstand aus der Fermentation von Aspergillus oryzae, welcher das rekombinante Enzym exprimiert, wurde zentrifugiert und durch einen 0,2 μm Filter gefiltert, um die Mycelien zu entfernen. 250 ml des gefilterten Überstandes wurde in einer Filtron Ultracette oder einem Amicon Ultrafiltrationsgerät mit einer 10 kDa Membran ultrafiltriert und gleichzeitig wurde der Puffer zu 25 mM Tris-HCl pH 8,0 gewechselt, in zwei aufeinander folgenden Runden Ultrafiltration in demselben Gerät. Die resultierende 40 ml Probe wurde bei 1,5 ml/Min. auf eine Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q Sepharose Anionenaustausch-Säule geladen, welche mit 25 mM Tris-HCl pH 8,0 equilibriert worden war. Nachdem die Probe aufgetragen worden war, wurde die Säule mit zwei Säulenvolumen 25 mM Tris-HCl pH 8,0 gewaschen und gebundene Proteine wurden mit einem linear ansteigenden NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in 25 mM Tris-HCl pH 8,0 eluiert. Die Fraktionen wurden auf AZCL-Galactan auf Galactanase-Aktivität getestet und die Fraktionen, die die Aktivität enthielten, wurden vereinigt.
Die M. thermophilum Galactanase wurde nicht auf der Säule zurückbehalten und die Waschfraktion aus dem Anionenaustauschschritt wurde gesammelt und konzentriert und der Puffer zu 10 mM Natriumcitrat pH 4,0 gewechselt. Dieses Material wurde bei 1,5 ml/Min. auf eine Pharmacia HR16/20 Fast Flow S Sepharose Kationenaustausch-Säule geladen, welche mit 10 mM Natriumcitrat pH 4,0 equilibriert worden war. Nachdem die Probe aufgetragen worden war, wurde die Säule mit zwei Säulenvolumen des gleichen Puffers gewaschen und gebundene Proteine wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,35 M NaCl in 10 mM Natriumcitrat pH 4,0 eluiert. Die Galactanase-Aktivität eluierte bei ungefähr 0,1 M NaCl und die die Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden auf einem Filtron Macrosep 10 kDa Ultrafiltrationsgerät auf 500 μl konzentriert. 450 μl wurde bei 0,5 ml/Min. auf eine Pharmacia HR10/30 Supderdex 75 Gelfiltrationssäule geladen und die Proteine wurden bei 0,5 ml/Min. mit 0,25 M Ammoniumacetat pH 5,5 eluiert. Die M. thermophilum Galactanase wurde in elektrophoretisch reiner Form von der Säule eluiert.
Die Proteinkonzentration wird durch Verwenden des "Bio-Rad Protein Assays" entsprechend den Empfehlungen der Hersteller (Bio-Rad Laboratories GmbH) bestimmt.
BEISPIEL 4
Charakterisierung von rekombinanten Galactanasen aus M. thermophilum.
Das Molekulargewicht und der isoelektrische Punkt der Enzyme wurden, wie in WO 94/21785 beschrieben, bestimmt.
Die Aktivitäten der Enzyme wurden entweder durch Freisetzung von reduzierenden Zuckern aus Lupinen-Galactan (MegaZyme, Australien) oder durch die Freisetzung von blauem Farbstoff aus AZCL-Kartoffel-Galactan (MegaZyme, Australien) gemessen.
0,5 ml 0,4%-iges AZCL-Kartoffel-Galactan wurde mit 0,5 ml 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer von optimalem pH gemischt und 10 μl einer geeignet verdünnten Enzymlösung wurde hinzugefügt. Die Inkubationen wurden in Eppendorf Thermomixern für 15 Minuten bei 30°C durchgeführt (wenn nicht anders angegeben) vor der Hitze-Inaktivierung der Enzyme bei 95°C für 20 Minuten. Die Enzym-Inkubationen wurden dreifach durchgeführt und eine Blindprobe wurde hergestellt, bei welcher das Enzym hinzugefügt, aber unverzüglich inaktiviert wurde. Nach Zentrifugation wurde die Absorptionsfähigkeit des Überstandes in Mikrotiterplatten bei 620 nm gemessen und der Blindprobenwert wurde abgezogen.
0,5%-Lösungen von Lupinen-Galactan wurden in 0,1 M Citrat/Phosphat mit optimalem pH (wenn nicht anders angegeben) hergestellt, 10 μl von geeignet verdünnter Enzymlösung wurde zu 1 ml Substrat hinzugefügt und die Inkubationen wurden bei 30°C über 15 Minuten, vor der Hitzeinaktivierung bei 95°C für 20 Minuten, durchgeführt. Die reduzierenden Zucker wurden durch eine Reaktion, in Mikrotiterplatten mit einem PHBAH-Reagenz umfassend 0,15 g Parahydroxybenzoesäurehydrazid (Sigma H-9882), 0,50 g Kaliumnatriumtartrat (Merck 8087) und 2% NaOH-Lösung bis zu 10,0 ml, bestimmt. Die Ergebnisse der Blindproben wurden abgezogen. Galactose wurde als Standard verwendet.
pH- und Temperatur-Optima wurden auf AZCL-Galactan gemessen. 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer von pH (2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0) wurden zur Bestimmung des pH-Optimums verwendet. Um das Temperatur-Optimum zu bestimmen wurden 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer bei optimalem pH für eine Reaktion für 15 Minuten bei unterschiedlichen Temperaturen verwendet.
Der Km und die spezifische Aktivität wurden gefunden, indem Inkubationen mit Lupinen-Galactan-Konzentrationen (S), die von 0,025 bis 1,5% reichten durchgeführt wurden und durch Messen der produzierten reduzierenden Zucker, dann Kalkulieren der Reaktionsgeschwindigkeit (v), Abbilden S/v als eine Funktion von S, Durchführen einer linearen Regressions-Analyse, Finden der Steigung (= 1/Vmax) und des Abschnitts (Km/Vmax) und Kalkulieren des Km und der spezifischen Aktivität (= Vmax/E), wobei E die Menge des zugefügten Enzyms ist.

Enzym M. thermophilum

MW 42 kDA

pI 7,8

pH-Optimum 6,0

Temperatur-Optimum 70°C

Km (% Galactan) 0,5–0,9

Spezifische Aktivität

(μmol/min/mg) 800–1200
Aminoterminale Sequenz
Die aminoterminale Analyse wurde bestimmt, indem Edman-Abbau mit der Applied Biosystem-Ausrüstung verwendet wurde (ABI 473A Proteinsequenzierer, Applied Biosystem, USA), durchgeführt wie durch den Hersteller beschrieben.
N-terminale Sequenz(en):
Für die erfindungsgemäße Galactanase, welche die Aminosequenz, die in SEQ ID NR 2 gezeigt ist, aufweist, ist die N-terminale Sequenz:

N-terminal Ala-Leu-Thr-Tyr-Arg-Gly-Val-

Die N-terminale Amino Ala ist Position 19 in SEQ ID NR 2. Dies zeigt, dass an Position 19 in SEQ ID Nr. 2 das reife erfindungsgemäße Galactanaseenzym beginnt.
Folglich ist die reife Sequenz von 19-350 in SEQ ID NR. 2.
BEISPIEL 5
Klonieren und Expression einer Galactanase aus Humicola insolens 1800
mRNA wurde aus Humicola insolens DSM 1800 isoliert, welcher in einem Mais-Gries-(maize grits) enthaltenden Fermentationsmedium unter Bewegung angezogen worden war, um ausreichende Belüftung zu garantieren. Die Mycelien wurden nach 3–5 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C gelagert. Eine Bibliothek von Humicola insolens DSM Nr. 1800, bestehend aus ungefähr 9 × 10⁵ einzelnen Klonen, wurde in E. coli mit einem Vektorhintergrund von 1% wie beschrieben konstruiert. Plasmid DNA von einigen der Poole wurde in Hefe transformiert und 50–100 Platten enthaltend 250–400 Hefekolonien wurden aus jedem Pool gewonnen.
Galactanase-positive Kolonien wurden auf SC-Agarplatten mit dem AZCL-Xylan-Assay identifiziert und isoliert. Die cDNA Inserts wurden direkt aus den Hefekolonien amplifiziert und wie in dem Abschnitt Materialien und Methoden vorstehend beschrieben charakterisiert. Die DNA-Sequenz der cDNA, die für die Galactanase kodiert, wird in SEQ ID Nr. 3 gezeigt und die korrespondierende Aminosequenz wird in SEQ ID Nr. 4 gezeigt.
Die cDNA kann aus dem Plasmid in DSM 9976 gewonnen werden.
Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert und die Plasmid DNA wurde durch Transformation von E. coli wie vorstehend beschrieben, geborgen. Um die Galactanase in Aspergillus zu exprimieren wurde die DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, auf einem Gel größenfraktioniert und ein Fragment, welches dem Galactanase-Gen entspricht, wurde gereinigt. Das Gen wurde anschließend in pHD414 ligiert, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, was zu dem Plasmid pA2G51 führte.
Nach Amplifikation der DNA in E. coli wurde das Plasmid in Aspergillus oryzae, wie vorstehend beschrieben, transformiert.
Test auf A. oryzae Transformanten
Jede der Transformanten wurde, wie vorstehend beschrieben, auf Enzymaktivität getestet. Einige der Transformanten zeigten Galactanase-Aktivität, die signifikant größer war als die des Aspergillus oryzae-Hintergrunds. Dies zeigt die effiziente Expression der Galactanase in Aspergillus oryzae.
BEISPIEL 6
Eine Homologiesuche mit einer DNA-Sequenz (gezeigt in SEQ ID Nr. 3), kodierend für eine erfindungsgemäße Galactanase, wurde gegen Nukleotid- und Proteindatenbanken durchgeführt. Die Homologiesuche zeigte, dass die ähnlichste Galactanase ein β-1,4-Galactanase aus Aspergillus aculeatus war.
Nach dem Verfahren, das in "AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG" beschrieben wurde, wurde die DNA-Homologie einer erfindungsgemäßen Galactanase gegenüber den meisten Galactanasen aus dem Stand der Technik bestimmt, indem das Computerprogramm GAP verwendet wurde. Die erfindungsgemäße Galactanase hatte nur 55% DNA-Homologie zu der β-1,4-Galactanase aus Aspergillus aculeatus (WO 92/13945). Dies zeigt, dass die erfindungsgemäße Galactanase in der Tat verschieden von allen bekannten Galactanasen ist.
Beispiel 7
Reinigung von rekombinanten Galactanasen aus H. insolens
Die Kulturüberstände aus der Fermentation von Aspergillus oryzae, welcher die rekombinanten Enzyme exprimiert, wurden zentrifugiert und durch einen 0,2 μm Filter gefiltert, um die Mycelien zu entfernen. 250 ml des gefilterten Überstandes wurden in einer Filtron Ultracette oder einem Amicon Ultrafiltrationsgerät mit einer 10 kDa Membran ultrafiltriert und gleichzeitig wurde der Puffer zu 25 mM Tris-HCl pH 8,0 gewechselt, in zwei aufeinanderfolgenden Runden Ultrafiltration in demselben Gerät. Die resultierende 40 ml Probe wurde bei 1,5 ml/Min. auf eine Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q Sepharose Anionenaustausch-Säule geladen, welche mit 25 mM Tris-HCl pH 8,0 equilibriert worden war. Nachdem die Probe aufgetragen worden war, wurde die Säule mit zwei Säulenvolumen 25 mM Tris-HCl pH 8,0 gewaschen und gebundene Proteine wurden mit einem linear ansteigenden NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in 25 mM Tris-HCl pH 8,0 eluiert. Die Fraktionen wurden auf AZCL-Galactan auf Galactanase-Aktivität getestet und die Fraktionen, die die Aktivität enthielten, wurden vereinigt.
Die H. insolens Galactanase wurde auf der Säule zurückgehalten und wurde mit NaCl in elektrophoretisch reiner Form eluiert.
Die Proteinkonzentration wird durch Verwenden des "Bio-Rad Protein Assay" nach Empfehlung der Hersteller (Bio-Rad Laboratories GmbH) bestimmt.
BEISPIEL 8
Charakterisierung von rekombinanten Galactanasen aus H. insolens
Das Molekulargewicht und der isoelektrische Punkt der Enzyme wurde wie in WO 94/21785 beschrieben, bestimmt.
Die Aktivitäten der Enzyme wurden entweder durch die Freisetzung von reduzierenden Zucker aus Lupinen-Galactan (MegaZyme, Australien) oder durch die Freisetzung von blauem Farbstoff aus AZCL-Kartoffel-Galactan (MegaZyme, Australien) gemessen.
0,5 ml 0,4%-iges AZCL-Kartoffel-Galactan wurde mit 0,5 ml 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer von optimalem pH gemischt und 10 μl einer geeignet verdünnten Enzymlösung wurde hinzugefügt. Die Inkubationen wurden in Eppendorf Thermomixern für 15 Minuten bei 30°C durchgeführt (wenn nicht anders angegeben) vor der Hitze-Inaktivierung des Enzyms bei 95°C für 20 Minuten. Die Enzyminkubationen wurden dreifach durchgeführt und eine Blindprobe wurde hergestellt, bei welcher das Enzym hinzugefügt, aber unverzüglich inaktiviert wurde. Nach Zentrifugation wurde die Absorption des Überstandes in Mikrotiterplatten bei 620 nm gemessen und der Blindproben-Wert wurde abgezogen.
0,5% Lösungen von Lupinen-Galactan wurden in 0,1 M Citrat/Phosphat mit optimalem pH (wenn nicht anders angegeben) hergestellt, 10 μl von geeignet verdünnter Enzymlösung wurde zu 1 ml Substrat hinzugefügt und die Inkubationen wurden bei 30°C für 15 Minuten, vor Hitzeinaktivierung bei 95°C für 20 Minuten, durchgeführt. Die reduzierenden Zucker wurden durch eine Reaktion, in Mikrotiterplatten mit einem PHBAH-Reagenz umfassend 0,15 g Parahydroxybenzoesäurehydrazid (Sigma H-9882), 0,50 g Kalium-Natriumtartrat (Merck 8087) und 2% NaOH-Lösung bis zu 10,0 ml, bestimmt. Die Ergebnisse der Blindproben wurden abgezogen. Galactose wurde als Standard verwendet.
pH- und Temperatur-Optima wurden auf AZCL-Galactan gemessen. 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer von pH (2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0) wurden zur Bestimmung des pH-Optimums verwendet. Um das Temperatur- Optimum zu bestimmen, wurden 0,1 M Citrat/Phosphatpuffer bei optimalem pH für eine Reaktion für 15 Minuten bei unterschiedlichen Temperaturen verwendet.
Der Km und die spezifische Aktivität wurden gefunden, indem Inkubationen mit Lupinen-Galactan-Konzentrationen (S), die von 0,025 bis 1,5% reichten durchgeführt wurden und durch Messen der produzierten reduzierenden Zucker, dann Kalkulieren der Reaktionsgeschwindigkeit (v), Abbilden S/v als eine Funktion von S, Durchführen einer linearen Regressions-Analyse, Finden der Steigung (= 1/Vmax) und des Abschnitts (Km/Vmax) und Kalkulieren des Km und der spezifischen Aktivität (= Vmax/E), wobei E die Menge des hinzugefügten Enzyms ist.

Enzym H. insolens

MW 44 kDa

pI 8,5

pH-Optimum 7,5

Temperatur-Optimum 60°C

Km (% Galactan) 0,7–1,0

Spezifische Aktivität

(μmol/min/mg) 475–575
Aminoterminale Sequenz
Die aminoterminale Analyse wurde bestimmt, indem Edman-Abbau mit der Applied Biosystem Ausstattung verwendet wurde (ABI 473A Proteinsequenzierer, Applied Biosystem, USA), durchgeführt wie durch den Hersteller beschrieben.
N-terminale Sequenz(en):
Für die erfindungsgemäße Galactanase, die die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR 4 gezeigt ist, aufweist, ist die N-terminale Sequenz:

N-terminal Leu-Gln-Tyr-Lys-Gly-Val-Asp-

Die N-terminale Amino Gln ist Position 19 in SEQ ID NR 4. Dies zeigt, dass das reife erfindungsgemäße Galactanaseenzym bei Position 19 in SEQ ID Nr. 4 beginnt.
Folglich ist die reife Sequenz von 19-349 in SEQ ID Nr. 4.
BEISPIEL 9
Der Effekt von Galactanase auf Tierfutter:
Die in diesem Experiment verwendete Galactanase war die aus H. insolens gewonnene erfindungsgemäße Galactanase und wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben, gereinigt.
Die in diesem Experiment verwendete Lactase war eine kommerzielle Lactase, die Sumilact L (Shinnihon Japan) genannt wird.
Männliche Wistar-Ratten (66–68 g) wurden in Gruppen von 5 eingeteilt, wobei das Durchschnittsgewicht der Behandlungen nicht über ± 0,5 g hinausging. Ratten wurden in individuellen Stoffwechselkäfigen mit separater Sammlung von Urin und Fäkalien gehalten. Der experimentelle Zeitraum wird in einen 4-Tage-Akklimatisierungszeitraum, in dem den Ratten erlaubt wird, sich an die Käfige und das Futter zu gewöhnen und einen 4-tägigen Bilanzierungszeitraum unterteilt, in dem Fäkalien und Urin täglich gesammelt werden.
Zehn g DM (Dry matter, Trockenmasse) werden pro Tag pro Tier gefüttert. Die Ernährung umfasste 600 g/kg Lupin und 400 g/kg einer N-freien Mischung (8,9% Rohrzucker, 5,2% Zellulosepulver, 5,2% pflanzliches Öl, 80,7% Maisstärke) Vitamine, Mineralien und 1,2 g DL-Methionin. Methionin wird hinzugefügt, um den Appetit zu stimulieren, da Lupinen sehr gering in Schwefel-enthaltenden Aminosäuern sind. Die Ratten werden einmal täglich zur selben Zeit gefüttert.
Am Ende jedes experimentellen Zeitraums werden die Tiere einzeln gewogen und mit CO₂ getötet.
Der Trockenmasse-Gehalt der Diät und der Fäkalien wurde durch Lyophilisierung bestimmt.
Der Stickstoff-Gehalt der Ernährungs-, Urin- und Fäkalienproben wurde durch die Kjeltec-Verfahren des Verdaus, der Destillation und der Titration bestimmt.
Die Ergebnisse der Studie, bestimmt als die echte Verdaubarkeit und die DM-Verdaubarkeit wird in Tabelle 1 gezeigt. Nachstehend:
Die Dosis ist in g Galactanase oder Lactase-Zubereitung/kg Lupin in der Ernährung angegeben.
BEISPIEL 10
Isolation eines PCR-Fragmentes spezifisch für ein Galactanase-Gen eines Stammes der Ordnung Sordariales:
Es wurden zwei Aminosäuremotive in den Aminosäuresequenzen der zwei Galactanasen (welche die Aminosäuresequenzen gezeigt in SEQ ID Nr. 2 und 4 aufweisen), die aus Sordariales erhalten worden waren, identifiziert;

a) Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-His(H) (Pos. 101-109 in SEQ ID 2, und Pos. 100-108 in SEQ ID 4);
b) Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I) (Pos. 312-319 in SEQ ID 2, und Pos. 311-318 in SEQ ID 4);

Eine Computeranalyse in der SWISS-PROT Aminosäuredatenbank wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob die zwei vorstehend genannten Motive bereits im Stand der Technik existierten.
Keines der zwei Motive wurde identifiziert, was natürlich auch zeigt, dass diese Motive nicht im Stand der Technik von Pilzgalactanase-Aminosäuresequenzen aus Aspergillus acuelatus (WO 92/13945) existieren.
Degenerierte PCR-DNA-Primer wurden hergestellt, basierend auf den vorstehend genannten zwei Motiven,

a) "5'-CTA TTC GGA TCC AG(C/T) GA(C/T) AC(A/C) TGG GC(G/C) GA(C/T) CC(G/T) GC(G/T) C-3'" [SEQ ID NO 5] der Strang Primer;
b) "5'-CTA ATG TCT AGA (A/G)AT CCA (A/G/C/T)GC (A/G/C/T)GG (C/T)TC CCA (A/G)TA AAA-3'" [SEQ ID NO 6] der Gegenstrang Primer. (Die fettgedruckten Sequenzen sind Linker Seq., um die Klonierung des PCR-Fragments zu ermöglichen).

3 einzelne PCR-Amplifikationen wurden mit den vorstehenden Primern und mit der cDNA-Bibliothek aus Aspergillus acuelatus CBS 101.43, Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117,65 und Humicola insolens DSM 1800 durchgeführt. Ungefähr 10 ng DNA wurde als Template-DNA in jeder der 3 PCR-Reaktionen verwendet.
Die cDNA-Bibliothek aus Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65 und Humicola insolens DSM Nr. 1800 wurden, wie hierin beschrieben, hergestellt. Die cDNA-Bibliothek aus Aspergillus acuelatus CBS 101.43 wurde, wie in WO 92/13945 beschrieben, hergestellt.
Der Tag-Start Kit von Clontech wurde nach dem Protokoll der Hersteller verwendet. Die Primerkonzentrationen waren für beide vorstehenden Primer 0,5 mM. Zur Amplifikation wurde Touch Down-PCR verwendet (Don, R. H. et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19: 4008). Zuerst wurde die DNA für 3 Min. bei 95°C denaturiert, dann wurden zwei Zyklen jeweils bei den folgenden Annealing-Temperaturen durchgeführt: 60°C, 59°C, 58°C, 57°C, 56°C, 55°C, 54°C, 53°C, 52°C und 51°C mit jeweils einer Annealing-Zeit von einer Min. Vor dem Annealing wurde die Inkubation für eine Min. auf 95°C erhitzt und nach dem Annealing wurde die Verlängerung für 30 Sek. bei 72°C durchgeführt. Zyklen 21 bis 35 wurden wie folgt durchgeführt: Denaturierung eine Min. bei 95°C, Annealing eine Min. bei 50°C und Verlängerung für 30 Sek. Bei 72°C.
Aus jeder der zwei einzelnen PCR-Reaktionen, durchgeführt mit Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65 und Humicola insolens DSM Nr. 1800 DNA als Template-DNA, wurde eine PCR-Bande von ungefähr 700 bp erhalten, wobei in der PCR-Reaktion mit Aspergillus acuelatus CBS 101.43 DNA als Template keine spezifische PCR-Bande erhalten wurde.
Dies zeigt, dass die vorstehend identifizierten zwei Motive und die entsprechend abgeleiteten degenerierten Primer spezifisch für die Galactanasen aus Sordariales sind.
Es wird zurzeit angenommen, dass es möglich ist, andere Galactanasen aus einem Stamm des Genus Sordariales zu klonieren z.B. durch Verwenden jedes der zwei vorstehend generierten PCR-Fragmente als Sonde in einem Standard-Hybridisierungs-Klonierungsverfahren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Galactanase, die aus einem Pilz gewonnen wurde und die ein pH-Optimum von höher als 5,8 aufweist, wobei die Galactanase von einer DNA-Sequenz kodiert ist, die unter Bedingungen mittlerer Stringenz mit einer Sonde hybridisiert, die ein Produkt einer PCR-Reaktion mit DNA, die aus Humicola insolens (DSM 1800) isoliert ist, und/oder mit DNA, die aus Myceliophthora thermophila (CBS 117.65) isoliert ist, und den folgenden Paaren von PCR-Primern ist: "5'-CTA TTC GGA TCC AG(C/T) GA(C/T) AC(A/C) TGG GC(G/C) GA(C/T) CC(G/T) GC(G/T) C-3'" [SEQ ID NR 5] als dem Strang-Primer, und "5'-CTA ATG TCT AGA (A/G)AT CCA (A/G/C/T)GC (A/G/C/T)GG (C/T)TC CCA (A/G)TA AAA-3'" [SEQ ID NR 6] als dem Gegenstrang-Primer.
Galactanase nach Anspruch 1, die ein pH-Optimum von wenigstens 5,9 aufweist.
Galactanase nach Anspruch 1, wobei die Hybridisierungsbedingungen mittlere/hohe, hohe oder sehr hohe Stringenz sind.
Galactanase nach Anspruch 3, die aus einem Stamm eines filamentösen Pilzes oder einem Hefestamm gewonnen wurde, vorzugsweise aus der Klasse der Pyrenomycetes, zum Beispiel aus einem Stamm der Ordnung Sordariales, so wie den Gattungen Humicola, Myceliophthora, Scytalidium, Chaetomium, Melanospora, Cercophora, Gelasinospora, Neurospora, Podospora oder Thielavia, insbesondere einem Stamm von M. thermophilum oder H. insolens.
DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die eine Galactanase nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 kodiert.
DNA-Konstrukt, das ein Enzym kodiert, das Galactanaseaktivität aufweist, wobei die DNA-Sequenz unter Bedingungen mittlerer Stringenz mit einer Sonde hybridisiert, die ein Produkt einer PCR-Reaktion mit DNA, die aus Humicola insolens (DSM 1800) isoliert ist, und/oder mit DNA, die aus Myceliophthora thermophila (CBS 117.65) isoliert ist, und den folgenden Paaren von PCR-Primern ist: "5'-CTA TTC GGA TCC AG(C/T) GA(C/T) AC(A/C) TGG GC(G/C) GA(C/T) CC(G/T) GC(G/T) C-3'" [SEQ ID NR 5] als dem Strang-Primer, und "5'-CTA ATG TCT AGA (A/G)AT CCA (A/G/C/T)GC (A/G/C/T)GG (C/T)TC CCA (A/G)TA AAA-3'" [SEQ ID NR 6] als dem Gegenstrang-Primer.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz ein Enzym mit Galactanaseaktivität kodiert, das die Aminosäure-Teilsequenz a) Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-His(H) und/oder b) Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I) umfasst.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Enzym kodiert, das Galactanaseaktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz (a) den Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenz umfasst, die in das Plasmid pYES 2.0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 vorhanden ist; (b) die DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1050 in der SEQ ID NR 1 oder mehr bevorzugt 55-1050 gezeigt ist, oder ihren komplementären Strang umfasst; (c) ein Analog der in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenz umfasst, das wenigstens zu 70% homolog mit der besagten DNA-Sequenz ist; (d) eine DNA-Sequenz umfasst, die mit der DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1050 in der SEQ ID NR 1 gezeigt ist, bei mittlerer Stringenz hybridisiert; oder (e) eine DNA-Sequenz umfasst, die wegen der Degeneriertheit des Genetischen Codes nicht mit den Sequenzen von (b) oder (d) hybridisiert, aber die für ein Polypeptid kodiert, das die gleiche Aminosäuresequenz wie das Polypeptid aufweist, das von einer beliebigen dieser DNA-Sequenzen kodiert ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Enzym kodiert, das Galactanaseaktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz (a) den Galactanase kodierenden Teil der DNA-Sequenz umfasst, die in das Plasmid pYES 2.0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9976 vorhanden ist; (b) die DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1047 in der SEQ ID NR 3 oder mehr bevorzugt 58-1047 gezeigt ist, oder ihren komplementären Strang umfasst; (c) ein Analog der in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenz umfasst, das wenigstens zu 70% homolog mit der besagten DNA-Sequenz ist; (d) eine DNA-Sequenz umfasst, die mit der DNA-Sequenz, die an den Positionen 1-1047 in der SEQ ID NR 3 gezeigt ist, bei mittlerer Stringenz hybridisiert; oder (e) eine DNA-Sequenz umfasst, die wegen der Degeneriertheit des Genetischen Codes nicht mit den Sequenzen von (b) oder (d) hybridisiert, aber die für ein Polypeptid kodiert, das die gleiche Aminosäuresequenz wie das Polypeptid aufweist, das von einer beliebigen dieser DNA-Sequenzen kodiert ist.
DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 6–9, wobei die Hybridisierung bei mittlerer/hoher, hoher oder sehr hoher Stringenz erfolgt.
DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 8–9, wobei die Homologie des Analogs von (c) zu der jeweiligen DNA-Sequenz (a) oder (b) wenigstens 80%, 90%, 95% oder wenigstens 97% beträgt.
DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 6–11, wobei die DNA-Sequenz aus einem Mikroorganismus, so wie einem filamentösen Pilz, einer Hefe oder einem Bakterium, vorzugsweise aus einem Stamm der Familie Sordariales, so wie den Gattungen Humicola, Myceliophthora oder Thielavia, insbesondere einem Stamm von H. insolens oder M. thermophilum, erhältlich ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 12, wobei die DNA-Sequenz aus oder auf der Basis einer DNA-Bibliothek des Stammes Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65 oder einer DNA-Bibliothek des Stammes Humicola insolens DSM Nr. 1800 isoliert oder hergestellt ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz aus Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9983 isoliert ist oder aus Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9976 isoliert ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 5–14 umfasst.
Wirtszelle, die ein DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 5–14 oder einen rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 15 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 16, die eine eukaryontische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle, so wie eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle, ist.
Zelle nach Anspruch 17, die ein Stamm von Fusarium oder Aspergillus oder Trichoderma, insbesondere ein Stamm von Fusarium graminearum, Fusarium cerealis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma harzianum oder Trichoderma reesei ist.
Zelle nach Anspruch 17, die ein Stamm von Myceliophthora sp. oder Humicola sp., insbesondere Myceliophthora thermophila CBS Nr. 117.65 oder Humicola insolens DSM Nr. 1800 ist.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das Galactanaseaktivität aufweist, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle nach einem beliebigen der Ansprüche 16–19 unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
Isoliertes Enzym, das Galactanaseaktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass (i) es frei von homologen Verunreinigungen ist und (ii) das Enzym mittels des Verfahrens nach Anspruch 20 und mit einer Wirtszelle nach einem beliebigen der Ansprüche 16–19 hergestellt ist.
Isoliertes Enzym, das Galactanaseaktivität aufweist, das die Aminosäure-Teilsequenz a) Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-His(H) und/oder b) Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I) umfasst.
Isoliertes Enzym, das Galactanaseaktivität aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, das von dem Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2.0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9983 vorhanden ist, der das Galactanaseenzym kodiert, kodiert ist; b) einem Polypeptid, das eine wie an den Positionen 19-350 von SEQ ID NR 2 gezeigte Aminosequenz umfasst; und c) einem Analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptids, das weinigstens zu 70% homolog mit dem besagten Polypeptid ist.
Isoliertes Enzym, das Galactanaseaktivität aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, das von dem Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pYES 2.0 kloniert ist, das in Saccharomyces cerevisiae DSM 9976 vorhanden ist, der das Galactanaseenzym kodiert, kodiert ist; b) einem Polypeptid, das eine wie an den Positionen 19-349 von SEQ ID NR 4 gezeigte Aminosequenz umfasst; und c) einem Analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptids, das wenigstens zu 70% homolog mit dem besagten Polypeptid ist.
Enzym nach einem beliebigen der Ansprüche 23–24, wobei des Analog von (c) wenigstens zu 80%, 90%, 95% oder wenigstens zu 97% homolog mit dem jeweiligen Polypeptid (a) oder (b) ist.
Enzymzusammensetzung, die mit einem Enzym angereichert ist, das eine Galactanaseaktivität nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 oder 21–24 zeigt.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, die außerdem eine alpha-Arabinosidase, Xylanase, beta-Galactosidase, alpha-Glucuronisidase, beta-Xylosidase, Xylan-Acetylesterase, Arabinanase, Rhamnogalacturonase, Pectin-Acetylesterase, Polygalacturonase, Pectinlyase, Phytase, Pectatlyase, Glucanase und/oder Pectin-Methylesterase, Galactanase, Laccase und/oder Oxidoreduktase umfasst.
Verwendung eines Enzyms nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4, 23 und 24 oder einer Enzymzusammensetzung nach einem beliebigen der Ansprüche 25 bis 27 bei der Herstellung von Tierfutter oder Lebensmitteln; zur Verringerung der Viskosität oder Wasserbindungsfähigkeit eines von einer Pflanzenwand abgeleiteten Materials; und/oder bei der Herstellung von Wein oder Saft.
Isolierte, im Wesentlichen reine biologische Kultur des hinterlegten Stammes Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9983.
Isolierte, im Wesentlichen reine biologische Kultur des hinterlegten Stammes Saccharomyces cerevisiae DSM Nr. 9976.