JP3240002B2

JP3240002B2 - β−１，４−ガラクタナーゼ及びＤＮＡ配列

Info

Publication number: JP3240002B2
Application number: JP50487492A
Authority: JP
Inventors: デルライヒ，クルト; ダルベーゲ，ヘンリク; メーラーミッケルセン，ヤン; ミシェラー，マルツェル; マルククリステンセン，フレミング
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-02-06
Filing date: 1992-02-06
Publication date: 2001-12-17
Anticipated expiration: 2016-12-17
Also published as: DK0571475T3; DE69206258D1; CA2100775A1; EP0498137A1; AU1246792A; WO1992013945A1; GR3018913T3; NZ241560A; EP0571475B1; AU649789B2; ES2080486T3; US5474922A; JPH06505154A; ATE130630T1; EP0571475A1; DE69206258T2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、β−1,4−ガラクタナーゼ、対応するDNA配
列、ベクター、形質転換された宿主、β−1,4−ガラク
タナーゼの生産方法、酵素調製、及びβ−1,4−ガラク
タナーゼの使用を含んで成る。

本発明は、遺伝子工学に関係し、そしてβ−1,4−ガ
ラクタナーゼの部分的なアミノ酸配列及び部分的なDNA
配列を提供する。β−1,4−ガラクタナーゼ（EC番号3.
2.1.89）は、ガラクタンを分解する炭水化物酵素のグル
ープである。正式名称は、1,4−β−Ｄ−ガラクタンガ
ラクトヒドロラーゼであるが、その短縮用語であるβ−
1,4−ガラクタナーゼを、請求項と共に本明細書中で使
用する。R.F.H.Dekker and G.N.Richards,“ヘミセルロ
ース、それらの生成、精製、性質及び作用機構"in R.S.
Tipson and D.Horton,炭水化物化学及び生物化学の進
歩、Academic Press32,277−352（1976）、R.F.H.Dekke
r“酵素のヘミセルロースグルー",in J.M.V.Blanchard
and J.R.Nitchell,食品中のポリサッカライド、Butterw
orths,93−108（1979），及びA.G.J.Voragan,F.Geerst
and W.Pilnik“酵素によるフルーツの加工におけるヘミ
セルロース",in P.Depuy,食品加工における酵素の使
用、technique etDocumentation Lavoisier,497−502
（1982）を引用することができる。ガラクタンは、多く
のガム、寒天、及び果実ペクチンと一緒になって見ら
れ、そしてそれらは、例えば果実及び野菜内の細胞壁の
成分である。

上記の部分的なアミノ酸配列は、そのような酵素を発
現する生物のためのゲノムのライブラリー、またはcDNA
ライブラリーのスクリーニングのために使用することが
できるDNAプローブの構築のために使用することがで
き、これによって、親DNA分子がそこから生じた微生物
種に挿入された場合に、β−1,4−ガラクタナーゼの過
剰生産のために、または非形質転換条件下β−1,4−ガ
ラクタナーゼと密接に関係するいかなる酵素も生産しな
い宿主微生物に挿入された場合に、密接に関係する酵素
を伴わないでβ−1,4−ガラクタナーゼの生産のために
使用することができるDNAを得ることができる。以下か
ら明らかなように、上記のDNA配列は、外の方法によっ
ても確立することができる。

したがって、本発明の目的は、新規β−1,4−ガラク
タナーゼの提供並びに今まで可能なものよりもより良い
収率及びより高い純度でβ−1,4−ガラクタナーゼを生
産する方法及び手段の提供、そして今まで可能なものよ
りももっと効率よく植物の細胞壁組織の分解のための、
単独でのまたは他の酵素と組み合わされてのβ−1,4−
ガラクタナーゼの使用の提供にある。元の製品での割合
と比較して、β−1,4−ガラクタナーゼの割合が増加ま
たは減少している新規製品の提供も、本発明の目的であ
る。

本発明に従って得られる組み換えDNA配列は、β−1,4
−ガラクタナーゼ活性をもつポリペプチドをコードする
DNA配列、またはこのようなβ−1,4−ガラクタナーゼを
コードする配列と実質的に相同な配列をもつDNA配列を
含んで成る。

本発明の組み換えDNA配列をどのように作るかは、以
下で詳細に説明する。

β−1,4−ガラクタナーゼの精製のためにアスペルギ
ルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）から生
産される粗酵素調整物は、以下のように生産することが
できる。簡潔にするために、この粗アスペルギルス・ア
クレアタス（Aspergillus aculeatus）調整物を、以下
ではA.a.e.pと称する。

遺伝子供与体としてのアスペルギルス・アクレアタス
（Aspergillus aculeatus）CBS 101.43株は、以下の方
法により、パイロットプラントの規模で発酵された。

以下の組成：ペプトンDifco 6g アミノリンOrtana 4g グルコース 1g 酵母抽出物Difco 3g 肉抽出物Difco 1.5g KH₂PO₄Merk 20g 麦芽抽出物Evers 20g イオン交換H₂O 1000mlまでをもつ寒天基質が、Fernbackフラスコ中で調整された。

pHを、5.30と5.35の間に調整した。次に40gの寒天Dif
coを添加し、そしてその混合物を120℃で20分間オート
クレーブで処理した（この基質をＥ−寒天と名ずけ
る）。

CBS101.43株をＥ−寒天の斜面（slant）上で培養した
（37℃）。この斜面からの胞子を、滅菌されたスキムミ
ルク内に懸濁し、そしてその懸濁液をバイアル内で凍結
乾燥した。１つの凍結乾燥されたバイアル内の中身をFe
rnbachフラスコに移した。次にそのフラスコを30℃で13
日間インキュベートした。

以下の組成： CaCO₃ 1.2kg グルコース 7.2kg Rofec（コーン浸酒の乾燥物） 3.6kg 大豆油 1.2kg をもつ基質を500リッターの種母発酵槽内で調製した。

水道水を加え、約240リッターの全容量とした。CaCO₃
の添加の前に約5.5のpHに調整した。上記の基質を種母
発酵槽内で121℃で１時間滅菌した。接種前の最終容量
は、約300リッターであった。

上記Fernbachフラスコの胞子懸濁液を、種母発酵槽に
移した。種母発酵の条件は：発酵槽のタイプ：約2.3の高さ／直径の比をもつ一般
的なエアレーション及び攪拌装置のある発酵槽攪拌:300rpm（２つのタービン翼）エアレーション:300nリッター／分温度:30〜31℃ 時間：約28時間であった。

接種後28時間目付近で、150リッターを、種母発酵槽
から主発酵槽に移した。

以下の組成：焼いた大豆粉 90kg KH₂PO₄ 20kg Pluronic消泡剤 150ml をもつ基質を2500リッターの主発酵槽内で調製した。

水道水を、約900リッターの全容量まで添加した。上
記の焼いた大豆粉を水に懸濁した。pHをNaOHで8.0に調
製し、そして温度を50℃まで上昇させた。その後、約92
5Anson単位のAlcalase0.6Lを、この懸濁液に添加し
た。この混合液を、エアレーション無しで及び100rpmの
攪拌で、50℃で４時間及びpH＝8.0（Na₂CO₃添加）に保
った。その後、残りの基質成分を添加し、そしてpHをリ
ン酸で約6.0に調整した。この基質を、主発酵槽内で、1
23℃で1 1/2時間滅菌した。接種前の最終容積は、約108
0リッターであった。

次に、150リッターの種母培養液を添加した。

発酵条件は：発酵槽のタイプ：約2.7の高さ／直径の比をもつ一般
的なエアレーション及び攪拌装置のある発酵槽攪拌:250rpm（２つのタービン翼）エアレーション:1200nリッター／分温度:30℃ 時間約15時間であった。

24発酵時間から116発酵時間までに、以下の組成：ペクチンgenu^＊） 22kg 濃リン酸 6kg Pluronic消泡剤 50ml ^＊）Genuペクチン（Copenhagen pectin factory Lt
dからの柑橘類タイプNF）を有するペクチンの溶液を、約８リッター／時間の一定
速度で、主発酵槽に無菌的に添加した。

水道水を添加し、約325リッターの全容量とした。上
記基質を、121℃で１時間その投与タンク内で滅菌し
た。投与開始前の最終容積は、約360リッターであっ
た。この部分の供給が尽きた時、他の同様の部分を調製
した。１回の発酵のためのペクチン溶液の全容量は、約
725リッターであった。

約151発酵時間の後、上記発酵工程を停止した。約185
0リッターの培養液を、約５℃まで冷却し、そして上記
酵素を以下の方法に従って回収した。

上記液を、Hyflo Super−Cell珪藻土（濾過助剤）で
プレコートされた真空ドラムフィルター（Dorr Olive
r）上でドラム濾過した。濾液を蒸発により、培養液の
容量の約15％に濃縮した。濾過助剤として0.25％Hyflo
Super−CellをもつSeitz濾過シート（タイプsupra100）
上で、その濃縮物を濾過した（以下の表では、濾過Ｉと
称する）。その濾液を、pH5.5で561gの（NH₄）₂SO₄/リ
ッターで沈殿させ、そして濾過助剤として４％のHyflo
Super−Cell珪藻土を添加した。その沈殿物及び濾過助
剤を、フレームフィルター上の濾過により分離する。そ
の濾過ケーキを水に溶解し、そして不溶成分をフレーム
フィルター上の濾過により分離する。その濾液を、濾過
助剤として0.25％Hyflo Super−CellをもつSeitz濾過シ
ート（タイプsupra100）上でチェック濾過する（以下の
表では、濾過IIと称する）。この濾液を、限外濾過装置
上で完全濾過する。完全濾過後、この液体を12.7％の乾
燥物含有量まで濃縮する（以下の表では、濃縮物中の乾
燥物含有量と称する）。

プロテアーゼ活性の部分的除去のための任意の塩基処
理を、この段階で実施することができる。この塩基処理
を使用する場合には、pH9.2で１時間実施し、その後pH
値を5.0に調整する。

そして、上記液体を、細菌減少の目的のために、チェ
ック濾過及び濾過を行い、そしてその濾液を、Stokesか
らの凍結乾燥装置上で凍結乾燥する。

純粋なβ−1,4−ガラクタナーゼは、表１に示すよう
に、A.a.e.p.から得ることができる。

ステップ１の補足：ステップ２の準備のための濃縮及び緩衝液の交換、小粒
子及び約50％の色の除去ステップ２の補足： HICは、疎水的相互作用クロマトグラフィーである。こ
の無色のβ−1,4−ガラクタナーゼの分画は、ステップ
0.8−0.2M（NH₄）₂SO₄からプールされる。

ステップ３の補足：ａ−サンプル内の塩濃度を減少するための希釈ｂ−ステップ４の準備のための緩衝液の交換ステップ４の補足： IECは、イオン交換クロマトグラフィーである。このβ
−1,4−ガラクタナーゼの分画は、ステップ0.25−0.5M
NaClからプールされる。

ステップ５の補足：ステップ６の準備のための緩衝液の改造ステップ６の補足：この活性β−1,4−ガラクタナーゼの分画は、ステップ
0.4M（NH₄）₂SO₄の範囲内でプールされた。この分画
は、IEF（等電点電気泳動）で１つのバンドを示す。SDS
−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミド
ゲル電気泳動）／銀上で、３つのバンドが検出され、こ
こで、その主分画は、本テスト中の蛋白質の80％より多
くの量となる。同様の模様が、DDT（ジチオトレイトー
ル）と共に／を伴わず現れた。上記A.a.e.p.に対する抗
体の方法によるイムノブロット法は、SDS−PAGE/銀と同
様の模様を作り出した。

これらの３つのバンドをHPLCで分離しようとする全て
の試みは失敗した。Ｎ−末端のさらなる調査により、こ
のサンプルが純粋な酵素の分画であること、そしてその
バンドを伴うものがそのサンプル調製及び作業条件から
生じた人工産物であることが示された。

表２に示された以下のことは、その濃縮率が、その精
製の進行とともに、どのように増加するかを示してい
る。

単位（unit）の定義表２の中で示されたＵ単位は、β−1,4−ガラクタナ
ーゼの活性単位であり、以下のように定義する：１単位は、以下に記載するように、30℃及び１分間
で、ポテトのガラクタンから１μモルのガラクトースを
放出する酵素の量である。

アミノ酸配列以下の部分的なアミノ酸配列は、自動配列決定法（Ap
plied Biosystems 437A protein sequencer）により、
その精製されたβ−1,4−ガラクタナーゼから決定され
た。

それ故、本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼ
は、この事実によって、それが以下の部分的アミノ酸配
列：または、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、
より好ましくは少なくとも90％の、上記配列に対する相
同性をもつ部分的アミノ酸配列を示すと特徴付けられ
る。上記部分的配列の第１番目のAlaは、Ｎ−末端のア
ミノ酸であると推定される。

上記配列に基礎を置き、上記サンプルの純度は、90％
より高いと推定される。

β−1,4−ガラクタナーゼのアミノ酸配列は、UW−GCG
データバンク、公然と利用できるデータバンク（これに
関して、UWは、ウィスコンシン大学の短縮形である）の
中の他の蛋白質との相同性を示さない。

上記のβ−1,4−ガラクタナーゼは、以下に示すよう
に、さらに特徴ずけられる。

図４及び図５は、β−1,4−ガラクタナーゼのそれぞ
れ、pH活性及びpH安定性を示す。

このβ−1,4−ガラクタナーゼは、pH3.5−4.0に最適p
Hをもつ比較的幅広いpHスペクトルを示す。

上記のβ−1,4−ガラクタナーゼは、比較的酸性で安
定である。この安定性は、室温で１時間処理された時、
pH2から８の間で良好である。

図６及び図７は、β−1,4−ガラクタナーゼのそれぞ
れ、温度活性依存状態及び温度安定性依存状態を示す。

このβ−1,4−ガラクタナーゼの最適温度は、30℃付
近にあり、そして、この温度活性範囲は、比較的幅広で
ある。果実及びワインの分野のためには、低温範囲での
活性は、非常に顕著である：５℃で約60％の活性 10℃で約80％の活性５−55℃の温度範囲では、このβ−1,4−ガラクタナ
ーゼ活性は、pH4.5で１時間の処理後著しくは影響され
ない（その最初の活性の≧80％）。

分子量:40.000ダルトン等電点:pH2.8 Km−値：そのMichaelis−Menten−速度式及びそれに対
応するLineweaver−Burk−速度式は、それぞれ図８及び
図９から現れる。結果としてのKm−値は、基質濃度の％
で表現される（mole/lではない、この理由は、その基質
の分子量分布が均一でないことにあり；それ故、その分
子量の正確な数値を計算するのは不可能であった）。

上記β−1,4−ガラクタナーゼは、≧0.3％の基質濃度
により阻害される。その理論的及び計算されたKm−値
は、 Km＝0.41％NNFAG−ポテト−ガラクタンである。

アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株に
より生産されたペクチナーゼ調製物（Pectinex）か
ら、他のβ−1,4−ガラクタナーゼが、単離され、そし
て、部分的アミノ酸配列が決定された：この部分的なアミノ酸配列が、請求項１に示すアミノ酸
配列の70％より大きい部分で相同性を示すことから、上
記のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株
に起源をもつβ−1,4−ガラクタナーゼは、本発明の範
囲内にある。また、このβ−1,4−ガラクタナーゼが植
物の細胞壁の分解剤として利用できることが見いだされ
ている事実、並びに請求項１で特徴ずけたβ−1,4−ガ
ラクタナーゼとそれらの相同性が70％よりも大きいとい
う事実も、その相同性が70％より大きいという事実に関
して、請求項１の範囲を正当化する。

本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼの好ましい
態様は、このβ−1,4−ガラクタナーゼが、3.0−5.0の
の最適pHを、2.0−3.5の等電点を、30,000と50,000の間
の分子量を、そして、10と50℃の間の最適温度を示す事
実により特徴ずけられる。

本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼの好ましい
態様は、このβ−1,4−ガラクタナーゼが、3.5−4.0の
の最適pHを、2.5−3.1の等電点を、37,000と45,000の間
の分子量を、そして、25と40℃の間の最適温度を示す事
実により特徴ずけられる。

本発明は、本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼ
のためのコーディングにより特徴ずけされる組み換えDN
A配列も含んで成る。

本発明に記載の上記の組み換えDNA配列の好まれる態
様は、それが以下の部分的なDNA配列の少なくとも１つ
を含んで成ることにより特徴ずけられる：本発明に記載の上記の組み換えDNA配列の好まれる態様
は、それが以下の：ａ）上記アスペルギルスアクレアタス（Aspergillus ac
uleatus）のβ−1,4−ガラクタナーゼのDNA挿入物pHD43
8 ｂ）ａ）を含んで成る成熟β−1,4−ガラクタナーゼDNA
のためのコード領域にハイブリダイズし、そして、β−
1,4−ガラクタナーゼ活性をもつポリペプチドのための
構造遺伝子、成びに場合によってはプロモーター、シグ
ナルまたはリーダーペプチドのためのコード領域、及び
／または転写ターミネーターを含んで成るDNA挿入物を
さらに含んで成るDNA配列ｃ）T.Maniatis他,Molecular cloning,A laboratory Ma
nual,Cold Spring Harbor,1982,から引用する比較的ス
トリンジェントな条件下（1.0×SSC,0.1％SDS,65℃）
で、請求項３に示す配列の中の１つとハイブリダイズす
るに十分な相同性をもつDNA配列，または、ｄ）成熟β−1,4−ガラクタナーゼまたはそれらのシグ
ナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードするDN
A配列並びにａ）、ｂ）、もしくはｃ）のDNA配列に関し
てその遺伝子コードの意味の範囲内で縮重しているDNA
配列から選ばれたDNA配列を含んで成るという事実により特
徴ずけられる。

また、本発明は、ベクターが本発明に記載の組み換え
DNA配列を含んで成るという事実により特徴ずけされる
ところのベクターも含んで成る。

本発明に記載のベクターの好ましい態様は、そのプロ
モーターがアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus or
yzae）タカアミラーゼのプロモーターであるという事実
により特徴ずけされる。このベクターは、1992年２月３
日、DSMに寄託されている（寄託番号DSM6901）。

本発明に記載のベクターの好ましい態様は、そのベク
ターがpHD438であるという事実により特徴ずけされる。

また、本発明は、形質転換された宿主が本発明に記載
のベクターを含むという事実により特徴ずけされるとこ
ろの形質転換された宿主も含んで成る。

本発明に記載の形質転換された宿主の好ましい態様
は、その形質転換された宿主がアスペルギルス（Asperg
illus）株であるという事実により特徴ずけされる。こ
こことによって、そのβ−1,4−ガラクタナーゼの良好
な生産能力を得る。

本発明に記載の形質転換された宿主の好ましい態様
は、その形質転換された宿主がアスペルギルス・アクレ
アタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・
ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリ
ザエ（Aspergillus oryzae）またはアスペルギルス・ア
ワモリ（Aspergillus awamori）の種であるという事実
により特徴ずけされる。

このことによって、そのβ−1,4−ガラクタナーゼの
良好な生産能力を得る。

本発明に記載の形質転換された宿主の好ましい態様
は、その形質転換された宿主が微生物（形質転換されな
い条件下では、β−1,4−ガラクタナーゼを生産しない
か、または有意でない量のβ−1,4−ガラクタナーゼし
か生産しない）であるという事実により特徴ずけされ
る。これにより、高いβ−1,4−ガラクタナーゼ活性を
もつ“あつらえの”酵素調製物及び広い範囲にわたる他
の望まれる特異的酵素活性を得ることができる。

本発明に記載の形質転換された宿主の好ましい態様
は、その形質転換された宿主が、バチルス・エスピー
（Bacillus sp.）、大腸菌（E.coli）またはパン酵母
（S.cerevisiae）であるという事実により特徴ずけされ
る。

また、本発明は、本発明に記載の形質転換された宿主
の使用によるβ−1,4−ガラクタナーゼの生産方法も含
んで成る。この方法によって、そのβ−1,4−ガラクタ
ナーゼを、高い収率で得ることができる。

また、本発明は、本発明に記載の方法により生産され
たとき、そのβ−1,4−ガラクタナーゼも含んで成る。
そのβ−1,4−ガラクタナーゼを高い収率で得ることが
できる。

また、本発明は、酵素調製物が本発明に記載のβ−1,
4−ガラクタナーゼにより強化された、植物細胞壁の分
解または修飾のために使用できるペクチナーゼ調製物を
含むという事実によって、特徴ずけされるところの酵素
調製物も含んで成る。この方法により、そのペクチナー
ゼ調製物の植物細胞壁の分解能力の上昇を得ることがで
きる。

また、本発明は、酵素調製物が本発明に記載のβ−1,
4−ガラクタナーゼにより、少なくとも1.1の濃縮率によ
り濃縮された、植物細胞壁の分解または修飾のために使
用できるペクチナーゼ調製物を含むという事実によっ
て、特徴ずけされるところの酵素調製物も含んで成る。

本発明に記載の酵素調製物の好ましい態様は、上記ペ
クチナーゼ調製物が、アスペルギルス（Aspergillus）
属に属する微生物により、生産できるという事実によっ
て特徴ずけされる。このような調製物は、非常に良好な
全液化力並びにリンゴをすりつぶしたもの及び同様の生
体物質の著しい粘度減少を提供することができる。この
ことは、そのペクチナーゼがA.a.e.p.である場合には、
本明細書の以降の章の中で記載されるであろう。

本発明に記載の酵素調製物の好ましい態様は、上記ペ
クチナーゼ調製物が、アスペルギルス・ニガー（Asperg
illus niger）、アスペルギルス・アクレアタス（Asper
gillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspe
rgillus awamori）またはアスペルギルス・オリザエ（A
spergillus oryzae）により、生産できるという事実に
よって特徴ずけされる。

本発明に記載の酵素調製物の好まれる態様は、そのβ
−1,4−ガラクタナーゼが、本発明に記載の方法により
生産されたβ−1,4−ガラクタナーゼであるという事実
により特徴ずけされる。この調製物の生産コストは比較
的低い。

また、本発明は、ガラクタンの分解または修飾のため
の剤として、本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼ
を使用することも含んで成る。

本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼの使用に関
する好ましい態様は、植物細胞壁の分解または修飾のた
めの剤としての使用である。今のところ、植物細胞壁を
分解することは、植物細胞壁の高い分解活性のために、
本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼの最も好まれ
た使用となっている。

また、本発明は、ガラクタンの分解または修飾のため
の剤として、本発明に記載の酵素調製物を使用すること
も含んで成る。

本発明に記載の酵素調製物の使用に関する好まれる態
様は、植物細胞壁の分解または修飾のための剤としての
使用である。今のところ、植物細胞壁を分解すること
は、植物細胞壁の高い分解活性のために、本発明に記載
の酵素調製物の最も好まれた使用となっている。

図10は、プラスミドpYHD107のマップであり、ここ
で、“TPIプロモーター”は、パン酵母（S.cerevisia
e）のトリオースリン酸イソメラーゼのプロモーターを
示し、“アーミネーター”は、転写ターミネーターを示
し、“Amp"は、アンピシリン耐性を仲介している遺伝子
を示し、“２μori"は、酵母のプラスミド２μの複製起
点を示し、そして“URA3"は、宿主株内のウラシル欠失
を補足する選択マーカーをコードしている遺伝子を示し
ている。

発現プラスミドの構築商業的に利用可能なプラスミドpYES II（Invitroge
n）を、Spe Iで切断し、KlenowのDNAポリメラーゼ＋dNT
Pでフィルインし、そしてCla Iで切断した。そのDNA
を、アガロースゲル上でサイズ分画し、そして約2000塩
基対のフラグメントを電気溶出により精製した。上記と
同様のプラスミドを、Cla I/Pvu IIで切断し、そして約
3400塩基対のフラグメントを電気溶出により精製した。
この２つのフラグメントを、酵母のTPIプロモーターを
含む平滑末端のShi I/EcoR Iフラグメントに連結した。
このフラグメントを、プラスミド〔ここでは、そのパン
酵母（S.cerevisiae）からのTPIプロモーター（T.Alber
s and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1,1982,pp.419−4
34）が、僅かに修飾されていた〕から単離し：内部のSp
h I部位を、この部位のコアを構成している４塩基対を
欠失することにより除去した。さらに、そのプロモータ
ーの上流の余分な配列を、Ballエンドヌクレアーゼ処理
とこれに続くSph Iリンカーの付加により、取り除い
た。最後に、大腸菌（E.coR I）リンカーを10位に付加
した。これらの修飾の後、このプロモーターを、Sph I
−EcoR Iフラグメントの中に含める。元のプロモーター
と比較してこのプロモーターの効率は、上記の修飾によ
っては影響されないようである。得られるプラスミドpY
HD17を図10に示す。

供与体生物十分なエアレーションを確保するための攪拌を伴って
大豆が豊富な発酵培地中で増殖されたアスペルギルス・
アクレアタス（Aspergillus aculeatus）CBS101.43か
ら、mRNAを単離した。

mRNAの単離全てのRNAを約7gの菌糸体から単離した。その菌糸体
を、液体窒素で凍結し、そして、1gの石英砂と共にすり
鉢内で粉状に押しつぶした。そのRNAをチオシアン酸グ
アニジウムで抽出し、そして、Sambrook他、1989,op.ci
t.に本質的に、記載されたように、CsClを通して遠心分
離した。ポリA RNAを、オリゴdTセルロース上のクロマ
トグラフィーにより、全RNAから単離した。

cDNAの合成製造者の取扱説明書に従ってInvitrogenからのcDNA合
成キットにより、cDNAの合成を実施した。このDNAを、B
stx Iリンカー（Invitrogen）の付加によりその発現ベ
クターに適応し、そしてアガロースゲル上でサイズ分画
した。５−600塩基対よりも大きいDNAのみを、そのライ
ブラリーの構築で使用した。この適応されたcDNAを、Bs
tx Iで切断された適切なベクターに連結した。テスト連
結（そのライブラリーのサイズを決定するための）の
後、そのライブラリーを50の寒天プレートの上に置い
た。約500から5000の別個のクローン（そのライブラリ
ーのサイズに依存する）を含んでいるプレートのそれぞ
れに、3mlの培地を加えた。そのバクテリアをこすり取
り、1mlのグリセロールを添加し、そして50のプールと
して−80℃で保存した。その残りの2mlをDNA単離のため
に使用した。もし、そのDNAの量が所望の酵母形質転換
細胞の数を与えるのに不十分である（以下を参照のこ
と）ときは、一夜繁殖させた−80℃の保存バクテリアの
50μｌで接種した500mlの培地（TB）から、大規模なDNA
を調製した。

酵母ライブラリーの構築１またはそれより多くのプールからのDNAを、以下に
記載するように酵母に形質転換した。全てのバクテリア
のクローンを酵母内でテストすることを確保するため
に、元のプール内のバクテリアのクローンの数よりも、
５倍多い酵母の形質転換細胞の数を限界として設定し
た。

酵母の形質転換使用した酵母株は、yNG231.（MAT alpha,leu2,ura3−
52,his4−539,pep−delta 1,cir＋）であった。１つの
コロニーを、30℃で一夜10mlのYPD中で増殖させた（こ
の培養細胞は、５℃で数日間保存できる）。

この培養液の10、30、及び60μｌを、100mlのYPDを含
む３つの振とうフラスコに添加し、そして30℃で一夜振
とうしながらインキュベートした。0.3−0.4に最も近い
吸光度₆₀₀をもつ培養液が選択された。Beckman遠心分離
（スピード６、10分間）において50mlのチューブにその
細胞を収穫し、この細胞を２×5mlのH₂Oに再懸濁し、上
記のように遠心分離し、0.1M LiAc、10mM Tris−Cl、1m
M EDTA、pH7.5を含む5mlの緩衝液に再懸濁し、そして再
び遠心分離した。この細胞を500μｌの上記緩衝液に再
懸濁し、そして30℃で60分間インキュベートした。250
μｇの担体DNA（無菌のサケの精子DNA10mg/ml）を添加
し、そして100μｌの部分を用意した。形質転換される
べきDNA（約５μｇ）を上記100μｌの部分に添加し、緩
やかに混合し、そして30℃で30分間インキュベートし
た。700μｇの40％PEG 4000、0.1M LiAc、10mM Tris−C
l、1mM EDTA、pH7.5を添加し、そしてインキュベーショ
ンを42℃で５分間続け、マイクロ遠心分離機内で短時間
回転させ、100−200μg H₂Oに再懸濁し、そしてウラシ
ルを伴わなずにSCプレート上に置き、次に30℃で３日間
インキュベーションを行った。

担体DNAの調製 100mgのサケの精子DNAを計量して取り出し、そして10
mlの10mM Tris−Cl、1mM EDTA、pH7.5（TE）に一夜で溶
解した。次にこの溶液を、粘着性がなくなるまで、氷水
中のプラスチックコンテナ内で音波破砕した。次にこの
溶液を、フェノールで抽出し、そしてEtOHで沈殿させ、
そしてそのペレットを5mlのTE内で洗浄しそして再懸濁
した。この懸濁液をEtOHで沈殿させ、そしてそのペレッ
トを5mlのTE内で洗浄しそして再懸濁した。この吸光度
₂₆₀を測定し、そしてその懸濁液を10mg/mlになるまでTE
で希釈した。

アスペルギルス・オリザエ（Aspergillu orizae）また
はアスペルギル・スニガー（Aspergillus niger）の形
質転換（一般的手順） 100mlのYPD（Sherman他、Methods in Yeast Genetic
s,Cold Spring harbor Laboratory,1981）を、アスペル
ギルス・オリザエ（Aspergillus orizae）またはアスペ
ルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の胞子で接種
し、そして37℃で約２日間振とうしながらインキュベー
ションする。この菌糸体をミラクロス（miracloth）を
通して濾過し、そして200mlの0.6M MgSO₄で洗浄する。
この菌糸体を15mlの1.2M MgSO₄、10mM NaH₂PO₄、pH＝5.
8に再懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、そして120
mgのNovozym234,バッチ1687を含む1mlの緩衝液を添加
する。５分後、12mg/ml BSA（Sigma type H25）の1mlを
添加し、そして、顕微鏡下で観察されたサンプル内に多
数のプロトプラストが見えるようになるまで、緩やかな
攪拌を伴うインキュベーションが、37℃で1.5−2.5時間
続けられる。

この懸濁液をミラクロス（miracloth）を通して濾過
し、その濾液を無菌チューブに移し、そして5mlの0.6M
ソルビトール、100mM Tris−HCl、pH＝7.0で重曹する。
遠心分離を100gで15分間実施し、そしてそのプロトプラ
ストを上記MgSO₄緩衝剤の頂上から回収する。STC（1.2M
ソルビトール、10mM Tris−HCl、pH＝7.5、10mM CaC
l₂）の２容量を上記プロトプラスト懸濁液に添加し、そ
してその混合液を1000gで５分間遠心分離する。このプ
トプラストのペレットを3mlのSTCに再懸濁し、そして再
びペレット化する。これを２回繰り返す。最後に、その
プロトプラストを0.2−1mlのSTCに再懸濁する。

100μｇのプロトプラストの懸濁液を、10μｌのSTC中
で、５−25μｇの適切なDNAと混合する。プロトプラス
トをp3SR2（プラスミドを担持するアスペルギルス・ニ
ジュランス（A.nidulans）のamdS遺伝子）と混合する。
この混合物を室温で25分間放置する。0.2mlの60％PEG 4
000（BDH29576）、10mM CaCl₂及び10mM Tris−HCl、pH
＝7.5を添加し、そして注意して混合（２回）し、そし
て最後に0.85mlの上記と同様の溶液を添加し、そして注
意して混合する。この混合物を室温で25分間放置し、25
00gで15分間回転し、そしてそのペレットを2mlの1.2Mソ
ルビトールに再懸濁する。もう１回沈降させた後、その
プロトプラストを、適切なプレート上に塗り広げる。

プロトプラストを1.0MシュクロースpH＝7.0、窒素源
としての10mMアセトアミド、及びバックグラウンドの増
殖を阻害するための20mM CsClを含む最少プレート（Cov
e Biochem.Biophys.Acta 113（1966）51−56）上に塗り
広げる。37℃で４−７日間のインキュベーションの後、
胞子を拾い、そして単一コロニーを作るために塗り広げ
る。この手順を繰り返し、そして２回の再単離の後、単
一コロニーの胞子を、定義された形質転換細胞として保
存する。

アスペルギルス（Aspergillus）の発現ベクターの構築ベクターpHD414（図11）は、プラスミドp775（EP 238
023に記載されている）の派生物である。このプラスミ
ドと対象的に、pHD414は、そのプロモーターとターミネ
ーターの間にユニークな制限部位のストリングをもって
いる。このプラスミドは、上記ターミネーターの３′末
端にある約200塩基対の長いフラグメント（不所望のRE
部位を含む）を除去することにより、そして次に、上記
プロモーターの５′末端にある約250塩基対の長いフラ
グメント（これも不所望の部位を含む）を除去すること
により構築された。この200塩基対の部位は、Nar I（pU
Cベクター内に位置する）及びXbal（上記ターミネータ
ーへのちょうど３′）での解裂し、そして次のKlenow D
NAポリメラーゼ＋dNTPでその生成末端をフィルインし、
ゲル上での上記ベクターを精製し、そして上記ベクター
のフラグメントを再連結することにより取り出された。
このプラスミドは、pHD413と呼ばれた。pHD413を、Stu
I（上記プロモーターの５′末端に位置する）及びPvu I
I（上記pUCベクター内の）で切断し、ゲル上で分画し、
そして再連結し、pHD414を得た。図11は、プラスミドpH
D414のマップであり、ここでは、“AMGターミネータ
ー”は、上記アスペルギルス・ニガー（A.niger）のグ
ルコアミラーゼのターミネーターを示し、そして“TAKA
プロモーター”は、アスペルギルス・オリザエ（A.oriz
ae）のTAKAアミラーゼのプロモーターを示している。

ポテトのガラクタンの生産 β−1,4−ガラクタンは、以下の手順によりポテト繊
維から得ることができる：澱粉工場からの新鮮な廃原料を出発物質として使用す
る（非常に低いスターチの含有量、17％付近の乾燥物質
基質（DMS））。

ガラクタンの抽出に先立って、上記の残存の溶解性澱
粉を、α−アミラーゼ（Termamyl120L）処理により除
去しなければならない。上記のポテト繊維を水（１部分
の繊維:3部分の水）で希釈し、NaOHでpHをpH6.5に調整
し、そしてその混合液を65℃まで加熱する。上記α−ア
ミラーゼ（DMSに基礎を置く0.2％のTermamyl120L）を
添加し、そしてその残存澱粉を２時間未満の処理時間で
破壊する。

その後、僅かな調整を伴う、柑橘類のペクチンからの
ガラクタンのためのLabavitch他（1976）の一般的な手
順に従って、ガラクタンの抽出を実施する（Labavitch,
J.M.Freeman,P.Albershein,植物細胞壁の構造，双子葉
植物の一次細胞壁の構造成分を分解するβ−1,4−ガラ
クタナーゼの精製及び特徴付け,J.Biol.Chem.,251,5904
−5910（1976））。上記の澱粉を含まない物質のpHをpH
11.4に調整し、そして次にその混合液を90℃まで加熱
し、そして20時間攪拌する（PHを調整しながら）。室温
まで冷却した後、その混合液をpH6−７へ中性とし（H₃P
O₄で）、遠心分離し、濾過し、そして限外濾過する。

このようにして作られたアラビノガラクタン（約40,0
00ダルトンの分子量）を、次に、上記のガラクタンから
アラビノースの側鎖を除去するために、100℃で１時間
0.05Mのトリフルオロ酢酸で処理する。この反応を溶液
を冷却することにより停止し、そして上記のトリフルオ
ロ酢酸を蒸発させる。最後に、この溶液を限外濾過して
砂糖を含まない状態にし、そして凍結乾燥する。

結果物としてのβ−1,4−ガラクタンは、13,000付近
の分子量を示す。

大豆ガラクタンの生産アラビノガラクタンは、出発物質として大豆の残存物
を使用して生産する。原理的には、J.Biol.Chem.,251,
p.5904−5910（1976）中にLabavitch他により発表され
た方法と同様の方法を使用する。

培地 YPD:10gの酵母抽出物、20gのペプトン、H₂Oで810mlと
し、オートクレーブにかけ、90mlの20％グルコース（滅
菌濾過した）を添加したもの YPG−寒天:25g/LのBactagar、15g/Lのグルコース、5g/L
のK₂PO₄、0.5g/LのMgSO₄−7H₂O、pHを5.0に調整し、ア
ートクレーブにかけたもの 10×Basal塩:66.8gの酵母ナイトロジェンベース、100g
のコハク酸、60gのNaOHにH₂Oを加え1000mlにし、滅菌濾
過したもの SC−URA:90mlのBasal塩、22.5mlの20％カザミノ酸、9ml
の１％トリプトファンにH₂Oを加え806mlにし、オートク
レーブにかけ、3.6mlの５％トレオニン及び90mlの20％
グルコースを添加したもの SC−Ｈ寒天：アミノ酸を含まない7.5g/lの酵母ナイトロ
ジェンベース、11.3g/lのコハク酸、6.8g/lのNaOH、ビ
タミンを含まない5.6g/lのカザミノ酸、0.1g/lのトリプ
トファン及び20g/lの寒天（Bacto）、121℃で20分間オ
ートクレーブにかけ、オートクレーブ後、450mlの寒天
当たり、55mlの22％グルコース溶液及び1.8mlの５％ト
レオニン溶液を添加したもの YNB−１寒天:3.3g/lのKH₂PO₄、16.7g/lの寒天、PHを７
に調整し、121℃で20分間オートクレーブにかけ、オー
トクレーブ後、450mlの寒天当たり、アミノ酸を含まな
い25mlの13.6％の酵母ナイトロジェンベース、25mlの40
％グルコース溶液、1.5mlの１％Ｌ−ロイシン溶液及び
1.5mlの１％ヒスチジン溶液を添加したもの YNB−１肉汁:YNB−１寒天のような組成であるが上記の
寒天を含まないもの大豆ガラクタン重曹ゲル:1％アガロース、0.1Mクエン酸
−リン酸緩衝液中の0.1％ガラクタン、PH4.5、重層を寒
天プレート上に注ぐ前に、このゲルを沸騰させ、そして
次に55℃まで冷却する。

FG−４−寒天:35g/Lの寒天、30g/Lの大豆粉、15g/Lのマ
ルトデキストリン（Glucidex6）、5g/LのBactoペプト
ン、pH7、121℃で40分間オートクレーブにかけたもの FG−４培地:30g/Lの大豆粉、15g/Lのマルトデキストリ
ン（Glucidex6）、5g/LのBactoペプトン、121℃で40分
間オートクレーブにかけたもの MDU−２培地:45g/Lのマルトース、1g/LのMgSO₄−7H₂O、
1g/LのNaCl、2g/LのK₂SO₄、12g/LのKH₂PO₄、0.1ml/LのP
luronic61L、0.5ml/Lの微量金属溶液、pH5.0、121℃で2
0分間オートクレーブにかけ、15mlの50％滅菌濾過した
尿素をオートクレーブ後に添加したもの微量金属溶液:13.9g/LのFeSO₄−7H₂O、8.45g/LのMnSO₄
−H₂O、6.8g/LのZnCl₂、2.5g/LのCuSO₄−5H₂O、0.24g/L
のNiCl₂−6H₂O、3g/Lのクエン酸例１ 50プールの中の約300,000の別個のクローンを構成し
ているアスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus ac
uleatus）CBS 101.43のライブラリーを、前に記載した
ように、大腸菌（E.coli）内で構築した。

上記ライブラリーからの20個のクローンからDNAを単
離し、そしてcDNA挿入のための分析に供した。その挿入
頻度が＞90％であることが判明し、その平均的な挿入物
のサイズは、約1400塩基対であった。

スペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatu
s）のライブラリーからのDNAを、酵母に形質転換し、そ
して20−30,000コロニーを含むプレートを、それぞれの
プールから得た。そのコロニーをこすり取り、そしてグ
リセロール内で−80℃で保存した。

上記ライブラリーからの酵母細胞を、全体として約25
0,000コロニーになるようにYNB寒天上に塗布した。プレ
ート当たりのコロニー数は、50から500までのバラツキ
であった。増殖から４または５日間後、その寒天プレー
トの、SC−Ｈ寒天プレートの２セット上へのレプリカ平
板法を行った。次にこれらのプレートを30℃で２−４日
間インクベートし、その後、上記寒天プレートの２セッ
トを、ガラクタナーゼ活性の検出のためにβ−1,4−ガ
ラクンの重層ゲルを使用して重層した（β−1,4−ガラ
クンは、前に示したように生産されている）。40℃で一
夜インキュベーションした後、酵素反応を、コンゴーレ
ッドで染色した。最初に、10−15mlの0,5M tris−ホウ
酸緩衝液pH8.4を上記プレートに注ぎ、そして約30分後
除去した。上記の10−15mlの0.1％コンゴーレッド溶液
を、上記重層に注ぎ、そして10−20分後に除去した。次
に上記プレートを、上記プレート上に10−15mlの2M NaC
lに注ぐことにより、１または２回洗浄した。このNaCl
溶液を15−25分後に除去した。ガラクタナーゼ陽性のコ
ロニーは、赤い背景上に、透明または薄い赤い明るい領
域をもつコロニーとして同定された。

酵素陽性コロニーからの細胞を、寒天上で単一コロニ
ーを単離するために塗布し、そして酵素を生産性の単一
コロニーを同定し、そして先に記載したガラクタン重層
法により選択した。

ガラクラナーゼ陽性酵母単離物を同定し、そして陽性
を確認した。

例２ DNAの単離上記単離物を、50mlのガラス試験管内の20mlのYNB−
１肉汁に接種した。この試験管を30℃で２日間振とうし
た。この細胞を、3000rpmで10分間の遠心分離により収
穫した。

この細胞を、1mlの0.9Mソルビトール、0.1M EDTA、pH
7.5に再懸濁した。上記のペレットをEppendorfチューブ
に移し、そしてフルスピードで30秒間回転した。この細
胞を、0.4mlの0.9Mソルビトール、0.1M EDTA、14mMのβ
−１メルカプトエタノールに再懸濁した。100μｌの2mg
/mlチモラーゼ（Zymolase）を添加し、そしてその懸濁
液を、37℃で30分間インキュベートし、そして30秒回転
した。このペレット（スフェロプラスト）を、0.4mlのT
Eに再懸濁した。90μｌの（1.5mlの0.5M EDT pH8.0、0.
6mlの2M Tris−Cl pH8.0、0.6mlの10％SDS）を添加し、
そしてその懸濁液を65℃で30分間インキュベートした。
80μｌの5M KOAcを添加し、そして懸濁液を氷上で少な
くとも60分間インキュベートし、そしてフルスピードで
15分間回転した。上澄を、EtOH（室温）で満たされた新
しいチューブに移し、次に、緩やかであるが十分な混合
及び30秒間の回転を行った。このペレットを、冷70％Et
OHで洗浄し、30秒間回転し、そして室温で乾燥した。そ
のペレットを50μｌのTE（Tris−EDTA）に再懸濁し、そ
して15分間回転した。その上澄を、新しいチューブに移
した。2.5μｌの10mg/ml RNaseを添加し、次に37℃で30
分間インキュベーションし、そして緩やかな混合を伴い
ながら500μｌのイソプロパノールを添加した。この混
合液を30秒間回転し、そして上澄を除去した。このペレ
ットに冷96％EtOHで濯ぎ、そして室温で乾燥した。この
DNAを、約100μl/mlの最終濃度となるように50μｌの水
に溶解した。

上記のDNAを、標準的な手順により、大腸菌（E.col
i）に形質転換した。２つの大腸菌（E.coli）のコロニ
ーを単離し、そして制限酵素Hind III及びXbal（そのDN
A挿入物を切り取る）で分析した。

上記の陽性クローンのいくつかの部分的なDNA配列を
決定した、請求項４を見よ。このクローンが、上記の精
製β−1,4−ガラクタナーゼのＮ末端と同一な、Ｎ末端
のアミノ酸配列をもつ蛋白質をコードすることが判明し
た。

例３ガラクタナーゼの発現ガラクタナーゼを発現するために、DNAの５′コンテ
クストと一緒になった外来のシグナル配列（原則とし
て、特許公開番号WO 91/17243から知られた配列）を、
その翻訳開始コドンに導入することとし、これによっ
て、高いレベルの翻訳開始という結果となるはずであ
る。PCRアプローチの使用により、上記のシグナルペプ
チドを導入した。

遺伝子の構築以下の２つのプライマーを使用した：プライマー１、シグナルペプチド下線を引いた配列は、遺伝子の５′末端と相同的であ
り、そして！は、上記シグナルペプチドの切断部位を示
す。

プライマー２、３′末端５′GGGCGTGAATGTAAGCGTGAC3′ 製造者の指示に従って、Perkin Elmer Cetus,Norwal
k,CT,USAからのGene Ampキット及び装置を使用して、上
記のPCR反応を実施した。

その条件は： −500ngのプライマー（元のcDNAクローン） −100ピコモルのプライマー１ −100ピコモルのプライマー２ −10μｌの10pcr緩衝液 −10μｌの2mM dNTP −100μｌまでのH₂O −2.5UのTAQポリメラーゼであった。

30サイクルを、94℃で１分間、37℃で２分間、72℃で
２分間実施した。

上記反応物の部分を、１％のアガロースゲル上で分析
した。期待されたバンドを観察した（約1350塩基対）。
そのDNAをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿さ
せ、そして上記の制限酵素Hind III/Xbalで消化した。
このDNAをゲル上でサイズ分画し、そしてそのガラクタ
ナーゼの遺伝子に対応するフラグメントを精製した。次
にこの遺伝子をHind III/Xbalにより消化されたpHD414
に連結し、上記のプラスミドpHD438（図12を見よ）を結
果として得た。

大腸菌（E.coli）内でのこのDNAの増幅後、上記のプ
ラスミドpHD438を、先に記載したように、アスペルギル
ス・オリザエ（Aspergillus orizae）に形質転換した。

アスペルギルス・オリザエ（Aspergillu orizae）形質
転換細胞のテスト FG−４寒天を入れたペトリ皿の中心に、18個の形質転
換細胞のそれぞれを接種した。30℃で５日間インキュベ
ーションした後、コルク穴あけ道具によりそのコロニー
の中心から、直径4mmのプラグを取り出した。このプラ
グを、ガラクタンの重層ゲルに埋め込み、40℃で一夜イ
ンキュベーションを行った、このガラクタナーゼの活性
を、前記のように、コンゴーレッドにより染色した。こ
の形質導入細胞のいくつかは、30mmの明るいゾーンをも
ち、そしてこれにより、14mmの明るいゾーンを作り出し
たアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus orizae）の
背景よりもより高いガラクタナーゼ活性を示している。
このことは、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus
orizae）におけるβ−1,4−ガラクタナーゼの効率的な
発現を証明している。上記のより高いガラクタナーゼ活
性をもつ８個の形質転換細胞を選び、そして接種し、そ
してYPG−寒天上で維持した。

上記の８個の形質転換細胞を、YPG−寒天上から、FG
−４及びMDU−２培地の入った500mlの振とうフラスコ上
に接種した。良好なエアレーションを確保するための十
分な攪拌を伴う発酵の４日後、その培養肉汁を2000gで1
0分間遠心分離し、そしてその上澄みを分析した。

それぞれの上澄みの15μｌの容量を、ガラクタナーゼ
の重層ゲル内であけられた直径4mmの穴に（直径13cmの
ペトリ皿内の25ml）使用した。20時間のインキュベーシ
ョン後、コンゴーレッドにより、このガラクタナーゼ活
性を肉眼観察できるようにした。

SDS−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（Pharmacia
Excel−gel グラジエント８−18）において、上記のア
スペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatu
s）のガラクタナーゼを、アスペルギルス・アクレアタ
ス（Aspergillus aculeatus）から精製されたガラクタ
ナーゼに対して高められた抗血清に対するウェスタンブ
ロット法により同定した。

本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼの使用本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼは、植物の
細胞壁分解酵素として使用されることができ、したがっ
て、GB 2115820Aの35ページ上に示された出願を含んで
いる。

もし本発明に記載のβ−1,4−ガラクタナーゼがペク
チナーゼ調製物と一緒に使用されれば、相乗作用の効果
または上昇効果が、特に、リンゴをすりつぶしたものの
上のTLP（全液化力）に関して証明され得る。上記のペ
クチナーゼが上記のA.a.e.p.である場合は、これは特別
な性質を備えたペクチナーゼ調製物であるが（GB 21158
20Aを見よ）、著しく高い相乗作用効果または上昇効果
が、特に、リンゴをすりつぶしたものの上のTLPに関し
て証明され得る。

TLPは、酵素調製物の全液化活性である。この活性
は、この酵素調製物における全ての単一活性の全体とし
ての効果である。この反応は、レオロジー的に進行され
る。細かく粉砕されたリンゴすりつぶし物におけるその
全体の粘度（＝液＋構造物の粘度の機能）の減少を、回
転式粘度計を使用して連続して２時間以内観察した。

MOU方程式（ここで、 PectinexAP−18のTLP＝０、及び Pectinex Ultra SP−ＬのTLP＝100 の定義による）に基礎を置き（Most Units）、上記の酵
素を比較する。

上記のMOUユニットのより詳細な記述は、Novo Nordis
k Ferment（Schweiz）AG,Neumatt,CH−4243 Dittingen,
Switzerlandから、リクエストに基付き得ることができ
る“リンゴジュースにおけるペクチナーゼユニットの測
定（MOU）”の小冊子内に見つけられるべきである。

上記のガラクタナーゼ単独によりまた上記のA.a.e.p.
との組み合わせにより得られたTLPの数値を表３に示
す。

また、図13にも引用する。表３及び図13の両方は、上
記のβ−1,4−ガラクタナーゼ及び上記のA.a.e.p.との
著しい相乗作用を示している。したがって、ガラクタナ
ーゼ単独は、その粘度に関しては、より高い投与量で、
全く効果を示さない。より低い投与量においては、粘度
における増加だけが観察され得る。しかし、驚くべきこ
とに、上記のA.a.e.p.との組み合わせにおいては、非常
に有意な相乗作用の効果を観察することができる。上記
のA.a.e.p.における上記のガラクタナーゼユニット単独
の約30％（260％）の増加は、60％（100％）のTLPの増
加という結果となる。このことは、上記のβ−1,4−ガ
ラクタナーゼが、植物細胞壁の液化工程のための主要な
活動であることを証明している。

ペクチン抽出ペクチンは、ゲル化及び安定化の性質をもっており、
このことがペクチンを食品工業にとって有用なものとし
ている。それらは、食品工業、例えば柑橘類の皮むき、
リンゴの圧搾または砂糖大根のパルプ化の廃原料から商
業的に抽出される。

酸（硫酸または硝酸）による最も普通の抽出が、ペク
チンの製造のために使用される。２付近のpHでそして上
昇された温度で、このペクチンは、植物原料から抽出さ
れ、そして沈殿の後、アルコールにより沈殿される。

この酸による抽出は、いくつかの欠点：水質汚染、腐
食、上記の植物細胞壁の破壊による濾過の問題、所望の
ペクチンポリマーの部分的欠陥（このポリマー化の程度
は、商業的ペクチンの最も重要なパラメーターの中の１
つである）；をもっている。したがって、生来のペクチ
ンのポリマーを壊さない、酵素によるペクチンの抽出
が、大きな利点をもつことは明らかである。

ペクチン製造のための工業的なリンゴ圧搾は、化学物
質またはβ−1,4−ガラクタナーゼのいずれかにより抽
出可能なペクチンの量を比較するために使用された。

ペクチンの化学的抽出（従来の技術）圧搾物の可溶化部分を溶液に運ぶために、圧搾物１に
蒸留水９を加え、そして混合液を沸点まで加熱した。pH
値を、2N H₂SO₄により1.9まで調整した。この混合液
を、このpHで、90℃で2.5時間保ち、そしてその後室温
まで冷却する。この混合液を、濾過し、そしてその圧搾
物の残分を蒸留水10で洗浄する。

その濾液１にメタノール６を添加する。30分間放置の
後、その混合液を濾過し、そして圧縮する。そのアルコ
ール不溶分（AIS）を、メタノール４で洗浄し、そして
濾過し、そして再び圧縮する。

得られたAISを60℃で１時間乾燥する。

このAISから、スターチの量を、Boehringer Mannheim
（注文番号207748）からのテストキットにより測定し
た。

得られたペクチンの量を、上記の圧搾物からの上記乾
燥物質から得られた％におけるAISの量の決定すること
により、そしてそのAIS中の上記スターチの量を差し引
くことにより計算した。

ペクチンの酵素的抽出圧搾物１にpH5.0の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（0.02
％NaN₃を伴う）19を加える。30℃で、この混合液を、本
発明に記載の精製されたβ−1,4−ガラクタナーゼの溶
液により20時間処理する。その後、この混合液を濾過
し、そして圧搾物の残分を蒸留水10で洗浄する。

このAISを、先に記載の方法により得る。

結果化学的抽出により17.5％のペクチンを得たが、一方酵
素的抽出により、使用したβ−1,4−ガラクタナーゼの
量に依存して11.5と14.5％の間のペクチンを得た。

これらの結果は、上記のβ−1,4−ガラクタナーゼ
が、植物原料からのペクチンの酵素的抽出のための主要
な酵素の１つであることを証明している。また、化学的
手段によりそして全てのそれに付随する欠点を伴って、
抽出することができるペクチンの60−80％が、環境的に
妥当な方法で酵素的に抽出され得ることも上記から明ら
かである。

配列表（１）一般情報（ｉ）出願者：ノボノルディスクA/S （ii）発明の名称：ベータ−1,4−ガラクタナーゼ及
びDNA配列（iii）配列数:12 （iv）連絡先：（Ａ）宛て先：ノボノルディスクA/S、特許部（Ｂ）番地：ノボアレ（Novo All）（Ｃ）市：バグスバード（Bagsvaerd）（Ｅ）国：デンマーク（Denmark）（Ｆ）郵便番号:DK−2880 （viii）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：バッハニール（BACH,Niels）（Ｂ）登録番号：（EPO）GA 24307 （ix）遠距離通信情報：（Ａ）電話：＋45 4444 8888 （Ｂ）ファックス：＋45 4449 3256 （Ｃ）テレックス:37304 （２）配列番号１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:31アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル配列：否（iv）アンチセンス：否（vi）起源：（Ａ）生物名：アスペルギルスアクレアタス（Aspe
rgillus acureatus）（Ｂ）株名:CBS 101.43 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:31アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル配列：否（iv）アンチセンス：否（vi）起源：（Ａ）生物名：アスペルギルスアクレアタス（Aspe
rgillus acureatus）（Ｂ）株名:CBS 101.43 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:28アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル配列：否（iv）アンチセンス：否（vi）起源：（Ａ）生物名：アスペルギルスニガー（Aspergillu
s niger）（xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:84塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:rDNA （xi）配列：配列番号４（２）配列番号５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:72塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:rDNA （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:60塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:rDNA （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:39塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:rDNA （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:67塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:rDNA （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:40塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:rDNA （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:78塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:21塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号12:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:66）Ｃ１２Ｒ 1:66）） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:66）Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者ミシェラー，マルツェルスイス国，ツェーハー−4204 ヒンメルリート，バルデック 95 (72)発明者クリステンセン，フレミングマルクスイス国，ツェーハー−4059 バーゼル，ペテルオヒス−シュトラーセ 33 (56)参考文献特開昭58−111685（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−111684（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−55080（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/38 C12N 1/21 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】30,000〜50,000の間の分子量を有し、か
つ、以下の部分アミノ酸配列（ａ）又は（ｂ）：（ａ）配列番号1; （ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列内の１又は数個の
アミノ酸の置換、欠失又は付加により、上記（ａ）の配
列から得られた配列；を含む、ベータ−1,4−ガラクタナーゼ。
【請求項２】前記ベータ−1,4−ガラクタナーゼが、3.0
〜5.0の至適pH、2.0〜3.5の等電点、及び10〜50℃の間
の至適温度を示す、請求項１に記載のベータ−1,4−ガ
ラクタナーゼ。
【請求項３】前記ベータ−1,4−ガラクタナーゼが、3.5
〜4.0の至適pH、2.5〜3.1の等電点、37,000〜45,000の
間の分子量、及び25〜40℃の間の至適温度を示す、請求
項２に記載のベータ−1,4−ガラクタナーゼ。
【請求項４】請求項１に記載のベータ−1,4−ガラクタ
ナーゼをコードするDNA構築物。
【請求項５】配列番号４に示すDNA配列、又はストリン
ジェント条件下、配列番号４にハイブリダイズするDNA
配列を含むDNA構築物であって、30,000〜50,000の間の
分子量を有するベータ−1,4−ガラクタナーゼをコード
する、前記DNA構築物。
【請求項６】請求項４又は５に記載のDNA構築物を含む
ベクター。
【請求項７】請求項６に記載のベクターを含む形質転換
された宿主。
【請求項８】請求項７に記載の形質転換された宿主の使
用によるベータ−1,4−ガラクタナーゼの製造方法。
【請求項９】請求項１〜３のいずれか１項に記載のベー
タ−1,4−ガラクタナーゼ、又は請求項８に記載の製造
方法により得られたベータ−1,4−ガラクタナーゼの、
ガラクタンの分解又は修飾のための剤としての使用方
法。