DE3529221A1

DE3529221A1 - Verfahren zur gewinnung eines pektolytischen enzympraeparats

Info

Publication number: DE3529221A1
Application number: DE19853529221
Authority: DE
Inventors: Simeon Grigorievitsch Tschaga; Zvetana Semkova Dostinova; Desimira Koleva Karachomakova
Original assignee: I CENTAR BIOTECHNOLOGIJA
Current assignee: I CENTAR BIOTECHNOLOGIJA
Priority date: 1985-08-20
Filing date: 1985-08-14
Publication date: 1987-02-26
Also published as: JPS6255080A; CH666283A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines pektolytischen Enzympräparats mit einer Mutantenlinie von Aspergillus niger, das beim Saftauszug aus Gemüse- und Obstbrühen und bei der Klärung von Obst- und Gemüsesäften Einsatz findet.

Bekannt ist ein Verfahren zur Gewinnung eines pektolytischen Präparats durch Tiefenkultivierung eines Stamms der Art Asp.niger Van Tieghen, das die Gewinnung von Kulturflüssigkeiten mit einer Aktivität von 1500 E/cm³ (1) sichert. Als Nachteile dieses Verfahrens sind vorzubringen das unbefriedigende Niveau der Enzymaktivität der Kulturflüssigkeiten und das unbefriedigend hohe Temperaturoptimum der Wirkung - 45°C -, die sich negativ auf die ökonomischen Ergebnisse bei der Gewinnung und der Anwendung auswirken.

Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines thermostabilen pektolytischen Enzympräparats durch voluminöse Kultivierung bereitzustellen, das zu einem hohen Ertrag an Emzymaktivität führt.

Die Aufgabe wird durch Vornahme von Gärungen mit einer Kultur Asp.niger -8MX-41, registriert in DIKLS (Staatliches Institut für Kontrolle der Arzneimittel) unter Nr. 8 vom 28. 2. 1984, gelöst, erhalten nach natürlicher Auslese und durch Einwirkung auf Konidien von Asp.niger-8M mit UV-Strahlen, gefolgt von mehrmaligem Screening auf der Basis der realisierten Enzymaktivität bei Laborgärungen.

Auf Malzagar formt Aspergillus niger-8MX-41 nach ca. 72 Stunden runde Kolonien mit glattem Rand, eingefallenem Zentrum und dichten radialen Falten mit gelbbräunlich gefärbtem zentralen Teil mit einem Durchmesser von 1,7 cm und weißer Peripherie mit einer Breite von 1,2 cm. Nach 7 Tagen und Nächten erreicht der Durchmesser der Kolonie 9 cm und ist schwarz gefärbt. Das Zentrum ist weiter eingefallen und die radialen Falten sind greller ausgeprägt. Die Kultur scheidet in der Mitte kein Pigment aus. Die kehrseite der Kolonie ist bleich-cremefarben.

Auf Kartoffelagar bildet Aspergillus niger-8MX-41 nach ca. 72 Stunden runde Kolonien mit hellgelblichem zentralen Teil mit einem Durchmesser von 0,5 cm aus, gefolgt von einer zweiten mit einem Durchmesser von 2,2 cm mit schwarzem Pigment und einem 3 mm breiten weißen Peripheriestreifen. Nach rund 7 Tagen und Nächten erreicht der Durchmesser der Kolonie 7 cm. Das helle Zentrum bleibt erhalten und bekommt an der Peripherie eine 2,5 cm breite schwarze Zone und an dem Rand selbst einen 0,5 cm breiten weißen Streifen.

Auf Capek-Dox-Agar formt Apsergillus niger -8MX-41 nach rund 72 Stunden runde Kolonien mit einem Durchmesser von 1,1 cm aus, die ein weißes Zentrum und eine leichtpigmentierte hellcremefarbene Oberfläche besitzen. Gegen den 7. Tag erreicht der Durchmesser der Kolonie 3 bis 4 cm mit weißem Zentrum, gefolgt von einem Ring mit d = 0,7 cm mit gelb-grüner Färbung, nach dem eine Zone von 2 cm mit schwarzem Pigment und eine weiße Peripheriezone von 2-3 mm folgen.

Die Kultur formt Konidienträger mit einer Länge von 250 µ bis 500 µ und einer Dicke von 2 bis 3,5 µ, abschließend mit sphärischen Kallumelen mit d = 100-200 µ, und sphärischen Konidien mit d = 1,5-2,2 µ, aus, die dunkelbraun bis schwarz gefärbt und mit 0,2 bis 0,5 µ langen Dornen bedeckt sind.

Auf den harten Nährböden bildet Asp.niger -8MX-41 Kolonien mit gut geformtem Luftmyzel und schwachem Substratmyzel aus, das aus septierten Hyphen aufgebaut ist.

Die Kultur wird auf geneigtem agarisierten Malzextrakt und mit einer TS von 6% gehalten.

Die Unterschiede von Aspergillus niger -8MX-41 der genutzten Produktionskultur drücken sich in der mehrmalig höheren biosynthetischen Enzymaktivität aus. Gegen die 144. Stunde von der Entwicklung häuft die Kultur im Milieu mit optimisierter Zusammensetzung in 1 ml Fermentationsflüssigkeit 4000 ± 300 E polygalakturonase Aktivität und 20 ± 4 E pektinoesterase Aktivität und die Produktionskultur entsprechend 1500 ± 20 E/ml PGA und 4 ± 0,5 E/ml PEA an.

Nach Anwendung eines mehrfaktoriellen Experiments 2⁴ und nachfolgender mathematischer Modellierung werden die Fermentationen im Milieu mit folgender Zusammensetzung durchgeführt (%):
trockene Rübenschnitzel 4,5 - 5,5
Weizenkleie 0,75 - 1,5
Ammoniumsulfat 0,35 - 0,75
Natriumphosphat (dibasisch) 0,125 - 0,250
Stärke 0,5 - 1,5
Magnesiumsulfat 0,025 - 0,05
Kaliumchlorid 0,025 - 0,05.
nach Trennung des Myzels wird die Fermentationsflüssigkeit zur Beseitigung der mechanischen Beimengungen filtriert und von den niedermolekularen löslichen Beimengungen durch Ultrafiltration befreit, wobei das Volumen 7- bis 9-mal verkleinert und die Trockensubstanz von 1,2 - 1,5 auf 1,75 - 2,0% gesteigert wird. Es folgt eine achtmalige Vakuumkonzentration bei einer niedrigeren Tempertur als 36°C und eine lyophile oder Vakuum-Trocknung bei einer Temperatur, die 38°C nicht übersteigt.

Die Vorteile dieses Verfahrens im Vergleich mit den bekannten bestehen in der höheren Thermostabilität des Präparats (50° Wirkungsoptimum), in der dreimal höheren biosynthetischen Aktivität bezüglich der Polygalakturonase und der fünfmal höheren Biosynthese bezüglich der Pektinesterase, was sich positiv auf die ökonomische Effektivität der Produktion auswirkt, und der hohen Klärungsaktivität des Präparats, also dessen geringer Aufwand und die verkürzte Zeitdauer der Depektinisation.

Beispiel 1

Zu 45 l sterilisiertem und bis auf 27°C gekühltem Fermentationsgemisch mit der Zusammensetzung (%):4,5 trockene Rübenschnitzel, 0,75 Weizenkleie, 0,35 Ammoniumsulfat, 0,125 Natriumphosphat (dibasisch), 0,5 Stärke, 0,025 Magnesiumsulfat, 0,025 Kaliumchlorid, wird 1,5 l 24-stündiges Inokulat aus Asp.niger -8MX-41 DIKLS zugesetzt, das in einem Milieu mit identischer Zusammensetzung des Fermentationsgemisches in einem runden exzentrischen Schüttel mit 220 V/min bei 27,5 ± 0,5°C zubereitet wurde.
Die Fermentation verläuft im Fermentor bei 27,5 ± 0,5°C Aeration mit steriler Luft bei einem Aufwand von 0,8 bis 1,1 l/Liter Fermentationsgemisch in der Minute bei einer Peripheriegeschwindigkeit des Rührers von 2,4 bis 3,2 m/s im Laufe von 144 ± 8 Stunden. Am Ende des Prozesses häufen sich in 1 cm³ Fermentationsflüssigkeit 4000 ± 300 E Polygalakturonase und 20 ± 4 E Pektinesterase Aktivität an. Nach Beseitigung des Myzels, der unlöslichen Bestandteile des Mediums und einer feinen Filtrierung oder Separierung werden 35-37 l Fermentationsflüssigkeit gewonnen, die einer rund achtmal das Volumen verkleinernden Membranultrafiltration, die achtmal das Vakuum konzentriert bei einer Temperatur von 38°C und einer Vakuum- oder lyophilen Trocknung bei einer Temperatur unter 38°C unterzogen. Erhalten werden 300 bis 350 g Präparat mit einer Aktivität 400 000 E/g PGA und 2000 E/g PEA. Nach Standardisierung in Perlit und Kieselgur werden rund 2 kg Präparat mit 60 000 E/g PGA und 300 E/g PEA gewonnen.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines pektolytischen Enzympräparats, bei dem ein Stamm der Art Aspergillus niger Van Tieghen mit voluminöser Kultivierung zum Einsatz kommt, dadurch gekennzeichnet, daß man den mutanten Stamm Asp. niger -8MX-41 registriert beim DIKLS in Sofia unter Nr. 8 vom 28. 2. 1984, in Fermentationsnährboden kultiviert, danach das Enzym aus der Fermentationsflüssigkeit konzentriert und bei einer Temperatur von 30°C bis 38°C trocknet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Fermentationsnährboden (in %) folgendes enthält:
trockene Rübenschnitzel 4,5 - 5,5
Weizenkleie 0,75 - 1,5
Ammoniumsulfat 0,35 - 0,75
Natriumphosphat (dibasisch) 0,125 - 0,250
Stärke 0,5 - 1,5
Magnesiumsulfat 0,025 - 0,05
Kaliumchlorid 0,025 - 0,05