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Verfahren zur Herstellung konzentrierter Diastase und von Enzymen
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist 'eine Verbesserung des Verfahrens
nach Patent 320571 der Erfinder und hat den Zweck, die Menge und die Güte der durch
aerobe Mikroorganismenerzeugten Enzyme zu erhöhen. Die Verbesserung besteht in dem
Vorschlag verschiedener zusätzlicher Mittel. die jedes für sich eine besondere lVirkung
besitzen, dabei aber, gleichzeitig verwendet, eine Höchstwirkung erzielen.
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Das durch das vorgenannte Patent geschützte und auf der Verwendung
von dicken Sojamaischen beruhende Verfahren wird nach der Erfindung durch das Arbeiten
mit klaren Würzen ersetzt, welche vorher filtriert und poptonisiert werden. Das
Filtrieren ergibt sehr wichtige Ergebnisse: Es gestaltet die Nährlösung viel gleichartiger
und erleichtert den Mikroorganismen das aerobe Leben. Während in den dicken Sojamaischen
die unlöslichen Rückstände einen Teil der Gärungserreger untergetaucht halten und
sie zu einem anaeroben Leben zwingen, gestattet die klare Würze allen Fermenten,
an die Oberfläche der Flüssigkeit zu steigen und sich in der freien Luft zu entwickeln.
Während die an der Oberfläche und an der Luft lebenden. Fermente das Nährmittel
alkalisieren, erzeugen die in der Tiefe bleibenden Fermente eine Säuerung der Maische,
so daß diese beiden Arten von Fermenten eine Gegenwirkung erzeugen. Dieser Nachteil
wird durch das Arbeiten mit filtrierten Würzen gemäß der Erfindung beseitigt.
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Als stickstoffhaltige Nährmittel kann man sehr verschiedene Stoffe
benutzen, z. B. Eiweißstoffe, Albumosen, Peptosen, Aminosäuren, .selche vorzugsweise
durch die Hydrolyse von Tierischen und pflanzlichen Rückständen nach bekannten Verfahren
erzeugt werden.
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Die Versuche haben gezeigt, daß die Hydrolyse mäßig sein und unter
bestimmten Bedingungen erfolgen muß. Mit stark hydrolysiertem Eiweiß ist es unmöglich,
in einem alkalischen Nährmittel die 'Mineralsalze des Eisens und des Mangans und
die Salze der Erdalkalien in gelöstem Zustande zu erhalten, die für eine reichliche
Absonderung - von flüssigen Diastasen unentbehrlich sind. Jedoch haben die Erfinder
festgestellt, daß man auch stark abgebaute Proteine benutzen und sogar Arnmoniaksalze
verwenden kann, wenn man den Nährmitteln oxysaure Salze zufügt, die ebenso wirken
wie diejenigen, welche bei der Hydrolyse der Proteine,fxei werden, und die u. a.
die Eigenschaft besitzen, in alkalischer Lösung clie Mineralsalze (Eisen- und Mangansälze)
in Lösung zu erhalten. .Es ist zu bemerken, daß clie günstige 1Virkung einer Düngung*
mit Mangansalzen auf den Pflanzenwuchs bekannt ist, und daß auch die Intensität
der alkoholischen Gärung erhöht wird, jedoch hatte man
bisher von
der ausgezeichneten \\Tirkung der Mangansalze auf die Güte und .die Kraft der erzeugten
Diastase keilte Kenntnis.
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Wein. man mit Ammoniaksalzen zusätzlich zu den oxysauren Salzen arbeiten
will, muß man eine stark min.cralisierte Nährlösung bereiten und den erforderlichen
Kohlenstoff in (festalt von Zucker, Dextrose oder anderen Kohlenstoffhydraten eintragen:
diese Kohlenstoffhydrate ersetzen den Kohlenstoff, der beim Arbeiten mit Proteinen
den durch Spaltung erhaltenen Produkten dieser Eiweißstoffe entnommen wird. Als
Beispiel wird im folgenden ein Rezept zur Herstellung eines mineralischen Nährmittels
gegeben, das Diastasen von hoher Güte liefert, wenn man darin Bakterien oder Schimmelpilze
züchtet:
| Chlorkalium . . . . . . . . . . . . . 1,50 g a. d. Liter |
| Chlornatrium . . . . . . . . . . . . 0,50 - - - - |
| Kaliumsulfat . . . . . . . . . . . . . 0,50 _ - - - |
| Calciumtartrat oder Calcium- |
| nitrat . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10 - _ - - |
| Magnesiumtartrat oder Ma- |
| gnesiumcitrat . . . . . . . . . . 3-1o - - - - |
| Kaliumphosphat oder Na- |
| triumphosphat . . . . . . . . . 3-15 - - - - |
| Ammoniumcarbonat ....... 0,50 - - - - |
| Eisensulfat . . . . . . . . . . . . . . o,1o - - - - |
| Mangansulfat . . . . . . . . . . . . o,1o - _ - - |
| Ammoniumsulfat . . . . . . . . . 5-15 - - - - |
| Fructose oder Stärke ...... a5-35 J - - - |
Ein derartiges Nährmittel oder eine andere gleichwirkende Lösung, wie sie durch
Anderungdes Mischverhältnisses der Zusätze erzielt wird, liefern mit den geeigneten
Fermenten sehr stark wirkende Diastasen; die so .erhaltenen Enzyme werden weder
durch die Hitze noch durch Säuren niedergeschlägen und widerstehen erhöhten Temperaturen
von 85 bis 9o° C. Sie erfüllen demgemäß vollständig die Wünsche der TeiAilindustrie,
und sie eignen sich für die ununterbrochene Entschlichtung der Gewebe. Z\Tenn-man
überdies dafür sorgt, daß die Fructose, welche im alkalischen Mittel Karamel ergeben
würde, in einem abgesonderten Gefäß sterilisiert wird, erhält man farblose Diastasen,
die in der Bleicherei und für das Entfärben und Reinigen von photographischen Filmen
sehr schätzenswert sind. Diese hellen Diastasen gestatten auch die Erz:eugting von
absolut weißem Fruchtzucker.
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Die erzielte Diastase gestattet es, die Gelatine und das Silber von
Filmen abzunehmen, wodurch man das klare Band, aus Celluloid zurückgewinnt, ohne
daß .es dabei irgendwie gefärbt wird. Mit brauner Diastase würde das Band dagegen
gefärbt und wäre unbrauchbar. Dies kann sehr leicht in weniger als einer halben
Stunde dadurch geschehen, daß man die Filme in ein Bad aus farbloser Diastase von
5 % taucht, welche auf 25° C erwärmt ist. Die Gelatine wird verflüssigt, und das
Silber wird auf den Boden des Bades niedergeschlagen und bildet einen zusammenhängenden
Niederschlag aus reduziertem Silber. Das dann gewaschene Filmband kann somit weiterbenutzt
werden.
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Um ein Gemisch aus Glucose und Dextrin zu erzeugen, löst man bei 65
bis 70° C die Stärke mit 2 bis ; % heller Diastase und läßt die Verwandlung in -Zucker
6 bis 9 Stunden andauern, oluie die Temperatur unter 55° C sinken zu lassen. Man
erzielt auf diese Weise ein Erzeugnis, welches etwa 40 % Fructose und 6o o;ö Dextrose
enthält und welches nach Verdampfung weißen Zucker ergibt. Die lfesentericusdiastasen
unterscheiden sich von den Malzdiastasen dadurch, daß sie statt Maltose Fructose
erzeugen. Die Umwandlung in Zucker hört mit den Mesentericusdiastasen auf, sobald
sich 400/6 Dextrose und 6o % Dextrin auf ioo Teile Kohlenstoffhydrate gebildet haben.
Mit Malzdiastase hört die Umwandlung in Zucker nur dann auf, sobald sich in der
Lösung 8o o!o Maltose und 2o Klo Dextrin gebildet haben.
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Anstatt entsprechend dem oben angegebenen Beispiel ein fast ausschließlich
mineralisches Nährmittel zu, verwenden, kann man Pflanzensäfte benutzen, wenn man
vorzugsweise alkalische Säfte auswählt, wie ,es meistens bei dem Saft der Kartoffel
der Fall ist. Diese Säfte enthalten nämlich immer oxysaure Salze in genügender Menge,
um alle Mineralsalze löslich zu erhalten, die für eine bedeutende Er: zeugung von
kräftigen Diastasen mittels der Mikroorganismen erforderlich sind. Es wurde festgestellt,
daß eine Menge Kartoffelsaft nach Entfernung der gerinnbaren Eiweißstoffe und bei
starker Alkalisierung imstande ist, die Hälfte ihres Volumens einer Lösung von Mangansulfat
zu lösen, das ein Zehntel molekularen Anteil Sulfat auf den Liter enthält; dieser
Saft hat also die gleiche lösende Wirkung wie eine ein Zehntel molekulare Lösung
von Ammoniumcitrat.
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Es hat sich herausgestellt, daß jeder natürliche oder künstliche Saft,
der die Eigenschaft besitzt, in alkalischer Lösung das Manganoxydul oder Manganoxyd
zu lösen, einen ausgezeichneten Ausgangsstoff für die Bereitung der Diastasen bildet.
Es genügt, um ein erstklassiges Mittel zu erzeugen, soweit wie nötig seine Nährwirkung
durch Eintragen von alkalischein Phosphat, Ammoniak, Eisen- und Mangansalzen zu
verstärken.
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Wenn man mit proteinhaltigen Substanzen arbeiten will, muß man zunächst
die Eiweißstoffe in Lösung bringen. Zu diesem Zweck kann man in bekannter Weise
proteolytische Enzyme oder verdünnte Säuren benutzen.
Wein man die
Eiweißstoffe mit Säuren auflöst, kann man beispielsweise wie folgt verfahren In
3 ooo kg Wasser gibt man allmählich unter ständigem Rühren ioookg grobgeschrotenen
Erdnußkuchen und gießt dann etwa 1 1 konzentrierte Schwefelsäure zu, worauf man
während z bis ; Stunden kocht. Nach dieser Zeit wird die flüssige Mischung mittels
einer' hölzernen Filterpresse abgepreßt. Die klare Flüssigkeit, welche mindestens
;o o o der gesamten Eiweißstoffe enthält, wird dann neutralisiert und sorgfältig
in einem Druckdämpfer sterilisiert, abgekühlt und mit einem Ansatz von Enzyme erzeugenden
Mikroorganismen geimpft. Hierzu eignet sich am besten der Bacillus Mesentericus.
-Die geimpfte Flüssigkeit wird dann in Reiiizuchtapparate, beispielsweise nach Patent
Sao 571, gebracht.
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An diesem Apparat werden zweckmäßig einige Änderungen getroffen, die
durch den Ersatz der trüben Maische durch klare Würzen oder filtrierte Säfte bedingt
sind. In solchen Nährlösungen wirken die Fermente schneller, und die Temperatur
der-gär-enden Flüssigkeit steigt viel höher als bei trüben Maischen. Sie erreicht-
rasch und plötzlich die Höhe von 45 bis 47°C, die auf,dieLebensfähigkeit der-Mikroorganismen
sehr ungünstig einwirkt. Um die Nährflüssigkeit in den erwünschten Temperaturgrenzen
zu erhalten, wird die Höhe der Ränder an den Tellern derart erhöht. daß die Dicke
der Flüssigkeitsschicht etwa verdoppelt wird (bis 3o mm).
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Außerdem wird die Abkühlung der gärenden Flüssigkeit dadurch gesichert,
daß man die mittlere Welle hohl ausbildet. In dieser hohlen Welle fließt ein @Vasserstroin
, von regelbarer Stärke, der .es gestattet, die Temperatur aufrechtzuerhalten, die
mit Rücksicht auf die jeweilige Art der Gäning gewählt wurde.
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Um endlich ruhigere und gleichmäßigere Gärungen zu erzielen, ist @es
vorteilhaft, zur Impfung einen Bakteriensatz zu verwenden. der bei konstanter Temperatur
unter mäßiger Belüftung langsam aufgezogen wird, derart, daß der Ansatz, der ein
Volturen von i bis auf das Tausend des Volumens der Hauptwürze besitzt, im Augenblick
der Impfung in der Sterilisiervorrichtung ungefähr 95 Sporen auf fünf lebende Bazillen
enthält. Hierdurch kann man die Temperaturerhöhung mäßigen.
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Das Filtrieren der dicken Maische nach der Gärung war in den bekannten
Vorrichtungen sehr schwierig und verursachte einen Verlust von mindestens 35 0lo
an Diastase. Dagegen ist das Filtrieren der kaum peptonisierten Flüssigkeiten sehr
leicht. Es erfolgt schnell und verursacht keine Verluste. Die Benutzung von Tellern,
in denen der Flüssigkeitsspiegel in einer Höhe von i 8 bis 3o mm liegt anstatt von
6 bis 8 mm wie früher, ermöglicht die Herstellung von 5oo bis 6oo 1 in einem Apparate
statt von z5o bis 3001 wie früher.
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Die Kraft der Enzyme wird so vermehrt, daß ein Teil der Diastase 4oo
und sogar 6oo Teile Stärke verflüssigt, während er früher nur Zoo bis 3oo Teile
Stärke verflüssigte.
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Diese verschiedenen Verbesserungen erniedrigen den Preis der gewonnenen
Diastase in bedeutender Weise.
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Schließlich ist noch zu bemerken, daß (hie mineralisierten Nährmittel
die Herstellung von farbloser Diastase ermöglichen und mehrere neue Anwendungen,
wie die Bereitung von weißem Zucker, gestatten.
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Es ist aus den Versuchen von Dr. S a i t o iWochenschrift für Brauerei,
16. April 191o) bekannt, daß man zuckernde Diastasen dadurch herstellen kann, daß
man Nährlösungen herstellt, welchen Eisensalze zugegeben werden : jedoch haben die
Erfinder festgestellt, daß die nach den Angaben von Dr. S a i t o hergestellten
Nährlösungen nur. schwache Diastasen :ergeben, selbst bei Benutzung der besten Nährlösungen,
welche er hergestellt hat, und daß insbesondere die mit Ammoniaktartrat hergestellte
Diastase nur das @3ofache ihres Gewichts an Stärke verflüssigt, während die Diastasen,
welche in mineralischen Lösungen gemäß der Erfindung hergestellt werden, ;- bis
i o- und bis 15mal wirksamer sind. Die Erfinder glauben, daß dies der Tatsache zuzuschreiben
ist, daß sie während des ganzen Arbeitsvorgangs Eisen- und Manganspuren in gelöstem
Zustande erhalten, und daß sie dem Ferment eine Nahrung bieten, welche sich für
die zu erzielende Wirkung besser eignet.