DE470740C

DE470740C - Verfahren zur Herstellung konzentrierter Diastase und von Enzymen

Info

Publication number: DE470740C
Application number: DEB110277D
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1922-07-03
Filing date: 1923-07-04
Publication date: 1929-02-02

Description

Verfahren zur Herstellung konzentrierter Diastase und von Enzymen Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist 'eine Verbesserung des Verfahrens nach Patent 320571 der Erfinder und hat den Zweck, die Menge und die Güte der durch aerobe Mikroorganismenerzeugten Enzyme zu erhöhen. Die Verbesserung besteht in dem Vorschlag verschiedener zusätzlicher Mittel. die jedes für sich eine besondere lVirkung besitzen, dabei aber, gleichzeitig verwendet, eine Höchstwirkung erzielen.
Das durch das vorgenannte Patent geschützte und auf der Verwendung von dicken Sojamaischen beruhende Verfahren wird nach der Erfindung durch das Arbeiten mit klaren Würzen ersetzt, welche vorher filtriert und poptonisiert werden. Das Filtrieren ergibt sehr wichtige Ergebnisse: Es gestaltet die Nährlösung viel gleichartiger und erleichtert den Mikroorganismen das aerobe Leben. Während in den dicken Sojamaischen die unlöslichen Rückstände einen Teil der Gärungserreger untergetaucht halten und sie zu einem anaeroben Leben zwingen, gestattet die klare Würze allen Fermenten, an die Oberfläche der Flüssigkeit zu steigen und sich in der freien Luft zu entwickeln. Während die an der Oberfläche und an der Luft lebenden. Fermente das Nährmittel alkalisieren, erzeugen die in der Tiefe bleibenden Fermente eine Säuerung der Maische, so daß diese beiden Arten von Fermenten eine Gegenwirkung erzeugen. Dieser Nachteil wird durch das Arbeiten mit filtrierten Würzen gemäß der Erfindung beseitigt.
Als stickstoffhaltige Nährmittel kann man sehr verschiedene Stoffe benutzen, z. B. Eiweißstoffe, Albumosen, Peptosen, Aminosäuren, .selche vorzugsweise durch die Hydrolyse von Tierischen und pflanzlichen Rückständen nach bekannten Verfahren erzeugt werden.
Die Versuche haben gezeigt, daß die Hydrolyse mäßig sein und unter bestimmten Bedingungen erfolgen muß. Mit stark hydrolysiertem Eiweiß ist es unmöglich, in einem alkalischen Nährmittel die 'Mineralsalze des Eisens und des Mangans und die Salze der Erdalkalien in gelöstem Zustande zu erhalten, die für eine reichliche Absonderung - von flüssigen Diastasen unentbehrlich sind. Jedoch haben die Erfinder festgestellt, daß man auch stark abgebaute Proteine benutzen und sogar Arnmoniaksalze verwenden kann, wenn man den Nährmitteln oxysaure Salze zufügt, die ebenso wirken wie diejenigen, welche bei der Hydrolyse der Proteine,fxei werden, und die u. a. die Eigenschaft besitzen, in alkalischer Lösung clie Mineralsalze (Eisen- und Mangansälze) in Lösung zu erhalten. .Es ist zu bemerken, daß clie günstige 1Virkung einer Düngung* mit Mangansalzen auf den Pflanzenwuchs bekannt ist, und daß auch die Intensität der alkoholischen Gärung erhöht wird, jedoch hatte man bisher von der ausgezeichneten \\Tirkung der Mangansalze auf die Güte und .die Kraft der erzeugten Diastase keilte Kenntnis.

Wein. man mit Ammoniaksalzen zusätzlich zu den oxysauren Salzen arbeiten will, muß man eine stark min.cralisierte Nährlösung bereiten und den erforderlichen Kohlenstoff in (festalt von Zucker, Dextrose oder anderen Kohlenstoffhydraten eintragen: diese Kohlenstoffhydrate ersetzen den Kohlenstoff, der beim Arbeiten mit Proteinen den durch Spaltung erhaltenen Produkten dieser Eiweißstoffe entnommen wird. Als Beispiel wird im folgenden ein Rezept zur Herstellung eines mineralischen Nährmittels gegeben, das Diastasen von hoher Güte liefert, wenn man darin Bakterien oder Schimmelpilze züchtet:

Chlorkalium . . . . . . . . . . . . . 1,50 g a. d. Liter

Chlornatrium . . . . . . . . . . . . 0,50 - - - -

Kaliumsulfat . . . . . . . . . . . . . 0,50 _ - - -

Calciumtartrat oder Calcium-

nitrat . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10 - _ - -

Magnesiumtartrat oder Ma-

gnesiumcitrat . . . . . . . . . . 3-1o - - - -

Kaliumphosphat oder Na-

triumphosphat . . . . . . . . . 3-15 - - - -

Ammoniumcarbonat ....... 0,50 - - - -

Eisensulfat . . . . . . . . . . . . . . o,1o - - - -

Mangansulfat . . . . . . . . . . . . o,1o - _ - -

Ammoniumsulfat . . . . . . . . . 5-15 - - - -

Fructose oder Stärke ...... a5-35 J - - -

Ein derartiges Nährmittel oder eine andere gleichwirkende Lösung, wie sie durch Anderungdes Mischverhältnisses der Zusätze erzielt wird, liefern mit den geeigneten Fermenten sehr stark wirkende Diastasen; die so .erhaltenen Enzyme werden weder durch die Hitze noch durch Säuren niedergeschlägen und widerstehen erhöhten Temperaturen von 85 bis 9o° C. Sie erfüllen demgemäß vollständig die Wünsche der TeiAilindustrie, und sie eignen sich für die ununterbrochene Entschlichtung der Gewebe. Z\Tenn-man überdies dafür sorgt, daß die Fructose, welche im alkalischen Mittel Karamel ergeben würde, in einem abgesonderten Gefäß sterilisiert wird, erhält man farblose Diastasen, die in der Bleicherei und für das Entfärben und Reinigen von photographischen Filmen sehr schätzenswert sind. Diese hellen Diastasen gestatten auch die Erz:eugting von absolut weißem Fruchtzucker.

Die erzielte Diastase gestattet es, die Gelatine und das Silber von Filmen abzunehmen, wodurch man das klare Band, aus Celluloid zurückgewinnt, ohne daß .es dabei irgendwie gefärbt wird. Mit brauner Diastase würde das Band dagegen gefärbt und wäre unbrauchbar. Dies kann sehr leicht in weniger als einer halben Stunde dadurch geschehen, daß man die Filme in ein Bad aus farbloser Diastase von 5 % taucht, welche auf 25° C erwärmt ist. Die Gelatine wird verflüssigt, und das Silber wird auf den Boden des Bades niedergeschlagen und bildet einen zusammenhängenden Niederschlag aus reduziertem Silber. Das dann gewaschene Filmband kann somit weiterbenutzt werden.
Um ein Gemisch aus Glucose und Dextrin zu erzeugen, löst man bei 65 bis 70° C die Stärke mit 2 bis ; % heller Diastase und läßt die Verwandlung in -Zucker 6 bis 9 Stunden andauern, oluie die Temperatur unter 55° C sinken zu lassen. Man erzielt auf diese Weise ein Erzeugnis, welches etwa 40 % Fructose und 6o o;ö Dextrose enthält und welches nach Verdampfung weißen Zucker ergibt. Die lfesentericusdiastasen unterscheiden sich von den Malzdiastasen dadurch, daß sie statt Maltose Fructose erzeugen. Die Umwandlung in Zucker hört mit den Mesentericusdiastasen auf, sobald sich 400/6 Dextrose und 6o % Dextrin auf ioo Teile Kohlenstoffhydrate gebildet haben. Mit Malzdiastase hört die Umwandlung in Zucker nur dann auf, sobald sich in der Lösung 8o o!o Maltose und 2o Klo Dextrin gebildet haben.
Anstatt entsprechend dem oben angegebenen Beispiel ein fast ausschließlich mineralisches Nährmittel zu, verwenden, kann man Pflanzensäfte benutzen, wenn man vorzugsweise alkalische Säfte auswählt, wie ,es meistens bei dem Saft der Kartoffel der Fall ist. Diese Säfte enthalten nämlich immer oxysaure Salze in genügender Menge, um alle Mineralsalze löslich zu erhalten, die für eine bedeutende Er: zeugung von kräftigen Diastasen mittels der Mikroorganismen erforderlich sind. Es wurde festgestellt, daß eine Menge Kartoffelsaft nach Entfernung der gerinnbaren Eiweißstoffe und bei starker Alkalisierung imstande ist, die Hälfte ihres Volumens einer Lösung von Mangansulfat zu lösen, das ein Zehntel molekularen Anteil Sulfat auf den Liter enthält; dieser Saft hat also die gleiche lösende Wirkung wie eine ein Zehntel molekulare Lösung von Ammoniumcitrat.
Es hat sich herausgestellt, daß jeder natürliche oder künstliche Saft, der die Eigenschaft besitzt, in alkalischer Lösung das Manganoxydul oder Manganoxyd zu lösen, einen ausgezeichneten Ausgangsstoff für die Bereitung der Diastasen bildet. Es genügt, um ein erstklassiges Mittel zu erzeugen, soweit wie nötig seine Nährwirkung durch Eintragen von alkalischein Phosphat, Ammoniak, Eisen- und Mangansalzen zu verstärken.
Wenn man mit proteinhaltigen Substanzen arbeiten will, muß man zunächst die Eiweißstoffe in Lösung bringen. Zu diesem Zweck kann man in bekannter Weise proteolytische Enzyme oder verdünnte Säuren benutzen. Wein man die Eiweißstoffe mit Säuren auflöst, kann man beispielsweise wie folgt verfahren In 3 ooo kg Wasser gibt man allmählich unter ständigem Rühren ioookg grobgeschrotenen Erdnußkuchen und gießt dann etwa 1 1 konzentrierte Schwefelsäure zu, worauf man während z bis ; Stunden kocht. Nach dieser Zeit wird die flüssige Mischung mittels einer' hölzernen Filterpresse abgepreßt. Die klare Flüssigkeit, welche mindestens ;o o o der gesamten Eiweißstoffe enthält, wird dann neutralisiert und sorgfältig in einem Druckdämpfer sterilisiert, abgekühlt und mit einem Ansatz von Enzyme erzeugenden Mikroorganismen geimpft. Hierzu eignet sich am besten der Bacillus Mesentericus. -Die geimpfte Flüssigkeit wird dann in Reiiizuchtapparate, beispielsweise nach Patent Sao 571, gebracht.
An diesem Apparat werden zweckmäßig einige Änderungen getroffen, die durch den Ersatz der trüben Maische durch klare Würzen oder filtrierte Säfte bedingt sind. In solchen Nährlösungen wirken die Fermente schneller, und die Temperatur der-gär-enden Flüssigkeit steigt viel höher als bei trüben Maischen. Sie erreicht- rasch und plötzlich die Höhe von 45 bis 47°C, die auf,dieLebensfähigkeit der-Mikroorganismen sehr ungünstig einwirkt. Um die Nährflüssigkeit in den erwünschten Temperaturgrenzen zu erhalten, wird die Höhe der Ränder an den Tellern derart erhöht. daß die Dicke der Flüssigkeitsschicht etwa verdoppelt wird (bis 3o mm).
Außerdem wird die Abkühlung der gärenden Flüssigkeit dadurch gesichert, daß man die mittlere Welle hohl ausbildet. In dieser hohlen Welle fließt ein @Vasserstroin , von regelbarer Stärke, der .es gestattet, die Temperatur aufrechtzuerhalten, die mit Rücksicht auf die jeweilige Art der Gäning gewählt wurde.
Um endlich ruhigere und gleichmäßigere Gärungen zu erzielen, ist @es vorteilhaft, zur Impfung einen Bakteriensatz zu verwenden. der bei konstanter Temperatur unter mäßiger Belüftung langsam aufgezogen wird, derart, daß der Ansatz, der ein Volturen von i bis auf das Tausend des Volumens der Hauptwürze besitzt, im Augenblick der Impfung in der Sterilisiervorrichtung ungefähr 95 Sporen auf fünf lebende Bazillen enthält. Hierdurch kann man die Temperaturerhöhung mäßigen.
Das Filtrieren der dicken Maische nach der Gärung war in den bekannten Vorrichtungen sehr schwierig und verursachte einen Verlust von mindestens 35 0lo an Diastase. Dagegen ist das Filtrieren der kaum peptonisierten Flüssigkeiten sehr leicht. Es erfolgt schnell und verursacht keine Verluste. Die Benutzung von Tellern, in denen der Flüssigkeitsspiegel in einer Höhe von i 8 bis 3o mm liegt anstatt von 6 bis 8 mm wie früher, ermöglicht die Herstellung von 5oo bis 6oo 1 in einem Apparate statt von z5o bis 3001 wie früher.
Die Kraft der Enzyme wird so vermehrt, daß ein Teil der Diastase 4oo und sogar 6oo Teile Stärke verflüssigt, während er früher nur Zoo bis 3oo Teile Stärke verflüssigte.
Diese verschiedenen Verbesserungen erniedrigen den Preis der gewonnenen Diastase in bedeutender Weise.
Schließlich ist noch zu bemerken, daß (hie mineralisierten Nährmittel die Herstellung von farbloser Diastase ermöglichen und mehrere neue Anwendungen, wie die Bereitung von weißem Zucker, gestatten.
Es ist aus den Versuchen von Dr. S a i t o iWochenschrift für Brauerei, 16. April 191o) bekannt, daß man zuckernde Diastasen dadurch herstellen kann, daß man Nährlösungen herstellt, welchen Eisensalze zugegeben werden : jedoch haben die Erfinder festgestellt, daß die nach den Angaben von Dr. S a i t o hergestellten Nährlösungen nur. schwache Diastasen :ergeben, selbst bei Benutzung der besten Nährlösungen, welche er hergestellt hat, und daß insbesondere die mit Ammoniaktartrat hergestellte Diastase nur das @3ofache ihres Gewichts an Stärke verflüssigt, während die Diastasen, welche in mineralischen Lösungen gemäß der Erfindung hergestellt werden, ;- bis i o- und bis 15mal wirksamer sind. Die Erfinder glauben, daß dies der Tatsache zuzuschreiben ist, daß sie während des ganzen Arbeitsvorgangs Eisen- und Manganspuren in gelöstem Zustande erhalten, und daß sie dem Ferment eine Nahrung bieten, welche sich für die zu erzielende Wirkung besser eignet.

Claims

PATRNTANSI'RÜCÜL: i. Verfahren zur Herstellung konzentrierter Diastase und von Enzymen mit Hilfe von aeroben Mikroorganismen durch Benutzung von klaren und alkalischen Würzen, welche Spuren von Eisen- und Mangansalzen enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß diese Salze während der ganzen Dauer des Arbeitsvorgangs in gelöstem @ Zustande erhalten werden. z. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das Fällen der Eisen-und Mangansalze in der alkalischen Nährlösung durch Zugabe oxysaurer Salze verhindert wird. 3. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß b.ci Ersatz der proteinhaltigen Nährlösungen durch mineralische Würze- Zucker, Dextrin oder lösliche Stärke und oxysaure Salze zugegeben werden. q.. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährwürze aus dem Saft gequetschter Früchte oder Knollen (Kartoffeln) bereitet wird, dem stickstoffreiche Stoffe und oxysäure Salze und Mineralsalze zugegeben werden. 5. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß zur Impfung der Würze bei konstanter Temperatur und unter mäßiger Lüftung hergestellte Ansät7e verwendet werden.