AT398436B - Verfahren zum abbau von polysacchariden - Google Patents

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Description

AT 398 436 B
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbau von Polysacchariden, vorzugsweise von Zellwandpolysacchariden von Pflanzen mit Hilfe einer Carbohydrase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Carboh-ydrase (SPS-ase), die gebildet worden ist mit Hilfe von Aspergillus aculeatus CBS 101.43 und/oder Aspergillus japonicus IFO 4408, oder eine davon abgeleitete SPS-ase, und die fähig ist zum Abbau von 5 löslichen Soja-Polysacchariden (Soja-SPS) unter geeigneten Bedingungen zu Abbauprodukten, die sich an Protein in einem wässerigen Medium in einem geringeren Ausmaß anlagern, als sich das Soja-SPS vor dem Abbau an das gleiche Protein unter entsprechenden Bedingungen anlagern würde, in einem wässerigen Medium mit dem abzubauenden Substrat zusammengebracht wird.
Insbesondere wird dazu eine Carbohydrase eingesetzt, die fähig ist, Soja-SPS in einem wässerigen το Medium zu Abbauprodukten abzubauen, die sich an pflanzliches Protein in dem wässerigen Medium in geringerem Maß anlagern, als Soja-SPS vor dem Abbau sich an das gleiche pflanzliche Protein in dem wässerigen Medium angelagert hätte, bevorzugt eine solche, die fähig ist, Soja-SPS in einem wässerigen Medium mit einem pH-Wert, der nicht mehr als 1,5 von 4,5 abweicht, zu Abbauprodukten abzubauen, die sich an Sojaprotein in dem wässerigen Medium in einem geringeren Ausmaß aniagern, als das Soja-SPS 75 sich vor dem Abbau an das Sojaprotein in dem wässerigen Medium angelagert hätte, und besonders bevorzugt eine solche, die fähig ist, Soja-SPS zu Abbauprodukten abzubauen, die nach vollständigem Abbau sich an pflanzliches Protein in einem Ausmaß von weniger als 50%, insbesondere weniger als 20 %, aniagern, als das Soja-SPS sich vor dem Abbau an das pflanzliche Protein in dem wässerigen Medium angelagert hätte. 20 insbesondere wird beim erfindungsgemäßen Verfahren der Abbau durchgeführt durch Isolierung oder Extraktion eines anderen biologischen Bestandteils als Sojaprotein und verwandten Pflanzenproteinen aus einem biologischen Rohmaterial, wobei die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei ist von irgendeinem Enzym, das imstande ist, das biologische Material abzubauen.
Vorteilhaft werden dabei ein oder mehrere Reaktionsprodukte der Polysaccharide unabhängig davon, ob 25 sie erwünschte Endprodukte oder Abfallprodukte sind, gleichzeitig mit oder nach der Enzymbehandlung weiter behandelt.
Weiterhin wird bevorzugt, daß als weitere Behandlung eine Alkoholgärung durchgeführt wird, wenn eines der Reaktionsprodukte ein vergärbarer Zucker ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten pflanzlichen Proteinprodukts (pvp) durch enzymatati-30 sehe Entfernung des Rückstands, ohne das Protein zu lösen und wieder auszufällen,ist in der BE-PS 882 769 beschrieben. Die Reinheit des nach dem bekannten Verfahren erhältlichen pvp ist jedoch nicht zufriedenstellend und sollte daher verbessert werden. In den Beispielen ist eine Reinheit des pvp von ungefähr 85 % angegeben. Selbst wenn es möglich ist, ein pvp mit einer Reinheit von ungefähr. 90 % nach dem bekannten Verfahren zu erhalten, ist dies nur möglich unter Verwendung bestimmter vorbehandelter 35 Ausgangssubstanzen,z.B. von Sojaproteinkonzentrat. Es wäre günstig, wenn es möglich wäre, eine Reinheit des pvp von ungefähr oder über 90 % mit einem wesentlich breiteren Spektrum an Ausgangsmaterialien zu erhalten, insbesondere aus enthülstem und entfettetem Sojamehl.
Es wurde überraschend gefunden, daß ein bestimmter Teil des Rückstandzersetzungsproduktes, wie es während der oben angegebenen enzymatischen Behandlung auftritt, d.h. ein wasserlösliches hochmolekula-40 res Kohlenhydrat, sich an einen Teil des pflanzlichen Proteins anlagert (bindet), wie später näher erläutert wird. Das führt natürlich zu einer geringeren Reinheit des Proteins. Es hat sich auch gezeigt, daß dieses hochmolekulare Kohienhydrat die Fähigkeit besitzt, sich an Proteine tierischen Ursprungs anzulagern.
Es bestand daher die Aufgabe, ein Enzym zum Abbau des oben erwähnten hochmolekularen Kohlenhydrats zur Verfügung zu steilen, das die Möglichkeit zur Herstellung eines pvp mit verbesserter Reinheit 45 eröffnet, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Enzyms.
Das Prinzip dazu kann folgendermaßen beschrieben werden, wobei auf Fig. 1 Bezug genommen wird, in der nur Produkte, die als ungelöste Feststoffe vorliegen, angegeben sind, wahrend alle überstehenden Flüssigkeiten (und darin gelösten Stoffe) weggelassen worden sind. Eine Menge Sojamehl wurde in zwei gleiche Teile aufgeteiit, Teil I und Teil ({(Spalte a in Fig. 1). Teil I wurde proteolytisch bei einem pH-Wert so von ungefähr 8 mit Hilfe von ALCALASE (einem proteolytischen Enzym, das gebildet worden ist von B. licheniformis und von NOVO INDUSTRI A/S auf den Markt gebracht worden ist) abgebaut und dann weiter bei ungefähr pH 8 gewaschen, um die Gesamtmenge an Protein zu entfernen, und der Rückstand wurde von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und gewaschen (siehe Teil I, Spalten a und b der Fig. 1). Auf diese Weise wurde ein reiner Rückstand (als Rückstand I bezeichnet) isoliert (Spalte b in Fig. 1). Teil II des 55 Sojamehls wurde nicht behandelt. Der Rückstand in Teil II wird als Rückstand II bezeichnet (Spalte b in Fig. 1). Jetzt wurden sowohl Rückstand I als auch Teil II mit Hilfe einer handelsüblichen Pectinase z.B. PECTINEX (ein proteolytisches Enzym der Schweizerische Ferment AG) abgebaut (siehe Spalten b und c in Fig. 1). Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß der ungelöste Teil des Rückstands I wesentlich 2
AT 398 436 B geringer ist als der ungelöste Teil des Rückstands II auf der Basis der Stickstoff- und Trockensubstanz-Bilanz, siehe Fig. 1, wo die schraffierten Bereiche in Spalte c den unlöslichen nicht-Proteinsubstanzen in der oben angegebenen Stufe entsprechen. Wenn darüberhinaus die überstehende Flüssigkeit des mit Pectinase behandelten Rests I mit einer Sojaprotein-Suspension bei pH 4,5 zusammengebracht wird, wird ein Polysaccharid in der überstehenden Flüssigkeit an das Sojaprotein gebunden. Dieses Polysaccharid in dem Überstand von dem Rest I, das ein Teil des Rest-Abbauproduktes ist und das in Wasser in Abwesenheit von Sojaprotein klar löslich ist, aber beim oder ungefähr beim isoelektrischen Punkt des Sojaproteins, soweit ein solches vorhanden ist, an dieses gebunden wird, wird als SPS (Soluble Polysaccharide) bezeichnet (siehe Fig. 1). Das SPS besitzt eine Molekulargewichtsverteilung zwischen 5 x 10e und 4,9 x 104. Die Bildung von isoliertem SPS geht aus dem in Fig. 2 angegebenen Schema hervor, das auch einen Teil des in Fig. 1 angegebenen Verfahrens umfaßt. Somit bestand das Problem darin, ein Enzym zu finden, das imstande ist; das SPS in einer solchen Weise abzubauen, daß die SPS-Abbauproduk-te sich nicht an Sojaprotein anlagern bzw. in einem wesentlich geringeren Maß als SPS an Sojaprotein gebunden wird. Die Lösung dieses Problems ist Gegenstand der AT-PS 387 789.
Obwohl in der dortigen Beschreibung spezietl Sojaprotein erwähnt wird, umfaßt diese alle Arten von pflanzlichen Proteinen, siehe z.B. die in der BE-PS 882 769, Seite 1, angegebenen Proteine.
Es hatte sich gezeigt, daß es durch Untersuchung ihrer Fähigkeit, Soja-SPS abzubauen, möglich ist, Mikroorganismen auszuwählen, die imstande sind, eine Verbindung zu bilden, die enzymatische Aktivität besitzt und imstande ist, Soja-SPS abzubauen und die im folgenden kurz als SPS-ase bezeichnet wird.
Dabei geht es in erster Linie um eine SPS-ase, eine Carbohydrase (Glycosidase) in geeigneter Form, die imstande ist, Soja-SPS unter entsprechenden Bedingungen zu Produkten abzubauen, die sich in wässrigem Medium in geringerem Maße an Protein anlagern als das Soja-SPS sich vor dem Abbau an das gleiche Protein unter entsprechenden Bedingungen angelagert hätte.
Es hat sich ferner gezeigt, daß diese SPS-ase, die fähig ist, Soja-SPS abzubauen, imstande ist, Polysaccharide, die SPS ähnlich sind und aus Pflanzen (Gemüsen und Früchten) stammen, vollständiger abzubauen als übliche Pectinasen und übliche Cellulasen.
Der oben verwendete Ausdruck "in einer geeigneten Form" ist so zu verstehen, daß er z.B. ein SPS-ase haltiges Mittel ausschließt, das toxische Substanzen enthält oder daß eine so geringe SPS-ase Aktivität besitzt, daß mehr als 10 % SPS-ase haltiges Mittel angewandt werden müssen, bezogen auf das Gewicht des SPS in dem Substrat bei einer Reaktion, die 24 h bei 50'C beim pH-Optimum der betreffenden SPS-ase durchgeführt wird, um einen Abbau von SPS von praktischer Bedeutung zu erreichen.
Durch vollständige oder teilweise Abtrennung des SPS von dem erhaltenen pflanzlichen Protein wird die Reinheit des erhaltenen pflanzlichen Proteins verbessert im Vergleich mit der Reinheit von pflanzlichem Protein, das nach dem aus der BE-PS 882 769 bekannten Verfahren erhalten worden ist, da dieses pflanzliche Proteinprodukt mit SPS verunreinigt war.
Es ist zur Zeit nicht bekannt, ob die im folgenden beschriebene spezielle SPS-ase ihre enzymatische Aktivität aus einem einzigen Enzym bezieht oder aus einem Enzymkomplex, umfassend mindestens zwei Enzyme. Einige Untersuchungen scheinen darauf hinzudeuten, daß zumindest zwei Enzyme für die Abbauwirkung der SPS-ase verantwortlich sind, wobei eines dieser Enzyme nur einen geringen Abbau des SPS hervorrufen kann, woraufhin ein oder mehrere Enzyme imstande sind, einen weitergehenden Abbau des SPS zu erreichen. Die Erfindung soll jedoch durch diese Hypothese nicht eingeschränkt werden.
Es geht vorzugsweise um eine SPS-ase, die imstande ist, Soja-SPS in einem wässrigen Medium zu Produkten abzubauen, die sich in dem wässrigen Medium weniger stark an pflanzliches Protein anlagern als das Soja-SPS vor dem Abbau. Vorzugsweise ist diese SPS-ase imstande, Soja-SPS in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert abzubauen, der nicht mehr als 1,5 von 4,5 abweicht. Die SPS-ase führt zu Abbauprodukten, die sich nach beendetem Abbau vorzugsweise zu weniger als 50 %, insbesondere weniger als 20 %, bezogen auf das Soja-SPS vor dem Abbau, an pflanzliches Protein in wässrigem Medium anlagern. Die SPS-ase führt vorzugsweise zu einem positiven SPS-ase-Test, wenn sie nach dem später näher erläuterten Verfahren qualitativ und quantitativ bestimmt wird. Die SPS-ase wird vorzugsweise gebildet mit Hilfe eines Mikroorganismus, der zur Gattung Aspergillus, vorzugsweise zur Art Aspergillus niger, gehört. Günstigerweise ist die SPS-ase abgeleitet von Enzymen, die gebildet werden können mit Hilfe von Asp. aculeatus CBS 101.43. Die gleiche SPS-ase kann gebildet werden mit Hilfe von Asp. japonicus IFO 4408. Es hat sich gezeigt, daß Asp. aculeatus CBS 101.43 auch sehr wirksame Remanasen, Cellulasen, Pectinasen und Hemicellulasen bildet. Ferner hat es sich gezeigt, daß nicht jeder zu der Art Aspergillus aculeatus oder Aspergillus japonicus gehörende Stamm eine SPS-ase bildet, die brauchbar ist. So konnte, wie später in der Beschreibung angegeben ist (Abschnitt 5), gezeigt werden, daß der Stamm Asp. japonicus ATCC 20 236 nicht solche Mengen an SPS-ase bildet, die mit Hilfe der enzymatischen Bestimmung von SPS-ase, wie sie später beschrieben wird, nachgewiesen werden können. Die SPS-ase ist 3
AT 398 436 B vorzugsweise immunoelektrophoretisch identisch mit der SPS-ase, die gebildet werden kann von Asp. aculeatus CBS 101.43 und identifizierbar durch Immunoeiektrophorese-Überlagerungsverfahren (siehe Abschnitte 6 und 7).
Wenn eine SPS-ase mikrobiologisch gebildet wird, wird sie gebildet im Gemisch mit verschiedenen begleitenden Substanzen, insbesondere anderen Enzymen. Wenn dies erwünscht ist, kann die betreffende SPS-ase gereinigt werden, z.B. durch chromatographische Trennungsverfahren, wie später näher erläutert ist (Abschnitt 8).
In Agr. Biol. Chem 40 (1), 87 - 92, 1976 ist beschrieben, daß ein Stamm von Asp. japonicus, ATCC 20236, einen Enzymkomplex bildet, der imstande ist, einen speziellen Abbau eines sauren Polysaccharids in Sojasoße, das als APS bezeichnet wird, hervorzurufen, von dem ein Teil als APS-I bezeichnet wird. Dieses saure Polysaccharid ist nicht identisch mit SPS, wie später in Abschnitt 3 näher erläutert wird. So sind die HPLC-Gelfiltrations-Chromatogramme von SPS und APS deutlich verschieden und darüberhinaus sind die Gelfiltrations-Chromatogramme von APS, das mit Hilfe von handelsüblicher Pectinase, Pectolyase, abgebaut worden ist und von SPS, das mit der handelsüblichen Pectinase, Pectolyase, behandelt worden ist, deutlich verschieden. Darüberhinaus geht aus dem Artikel nicht hervor, daß das saure Polysaccharid an das Sojaprotein gebunden ist und daß das abgebaute saure Polysaccharid nicht an das Sojaprotein oder zu einem wesentlich geringeren Grad an das Sojaprotein gebunden ist als das nicht abgebaute saure Polysaccharid. Außerdem konnte gezeigt werden, daß dieser Stamm keine SPS-ase in solchen Mengen bildet, die mit Hilfe der enzymatischen Bestimmung von SPS-ase, wie sie später näher beschrieben ist, nachgewiesen werden können. Das führte zu einem Vorurteil gegen die Anwendung irgendeines Stammes von Asp. japonicus als SPS-ase-Bildner. Aber überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß einige Stämme von Asp. japonicus SPS-ase-Bildner sind. Die AT-PS 387 789 betrifft auch das isolierte SPS, das auf der Basis von rohem pflanzlichen Protein als Ausgangsmaterial gebildet worden ist.
Bei einem bevorzugten isolierten SPS ist das pflanzliche rohe Protein entfettetes Sojamehl. Die Herstellung des isolierten SPS ist oben mit Bezug auf Fig. 2 beschrieben worden.
Die AT-PS 387 789 betrifft darüberhinaus ein Verfahren zur Auswahl eines SPS-ase produzierenden Mikroorganismus zur Bildung der erwähnten SPS-ase, wobei der zu untersuchende Mikroorganismus auf einem Wachstumsmedium gezüchtet wird, dessen hauptsächliche Kohlenstoffquelle SPS ist, woraufhin eine Probe des Fermentationsmediums auf SPS-ase analysiert wird und der fragliche Mikroorganismus als SPS-ase produzierender Mikroorganismus ausgewählt wird, wenn die Analyse auf SPS-ase positiv ist.
Die AT-PS 387 789 betrifft ferner ein Verfahren zur Bildung von SPS-ase, bei dem ein nach dem oben angewandten Auswahlverfahren für einen SPS-ase bildenden Mikroorganismus auswählbarer Stamm in einem Nährmedium gezüchtet wird. Die Züchtung kann als Submerskultur oder als Oberflächenkultur durchgeführt werden.
Bei diesem Verfahren wird vorzugsweise der Stamm Asp. aculeatus CBS 101.43 oder Asp. japonicus IFO 4408 in einem Nährmedium gezüchtet. Es ist ferner bevorzugt, daß die Züchtung als Submerskultur bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 7, vorzugsweise von 4 bis 6 bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40, vorzugsweise von 25 bis 35'C durchgeführt wird, wobei das Nährmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Sal2e enthält. Günstigerweise enthält das Nährmedium zusätzlich geröstetes Sojamehl. Das Sojamehl wird vorzugsweise vor der Verwendung als Komponente des Substrats mit einem proteolytischen Enzym behandelt, vorzugsweise einem solchen, das mikrobiologisch gebildet worden ist, mit Hilfe von Bacillus licheniformis. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß eine Lösung von Pectin aseptisch während der Züchtung zu der Fermentationsbrühe zugesetzt wird.
Es hat sich gezeigt, daß Asp. aculeatus CBS 101.43 auch sehr wirksame den Rückstand löslich machende Enzyme, Cellulasen, Pectinasen und Hemicellulasen neben der SPS-ase bildet und daß der mit Hilfe von Asp. aculeatus CBS 101.43 gebildete Enzymkomplex außerordentlich gut geeignet ist als Mittel zur Zellwandzerstörung von pflanzlichen Materialien. So kann der von Asp. aculeatus CBS 101.43 gebildete Komplex angewandt werden in der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie zur Behandlung von Frucht- und Gemüsemaische und zur Klärung und Viskositätsverringerung bei der Verarbeitung von Fruchtsaft und Wein mit ausgezeichneten Ergebnissen. Er kann außerdem angewandt werden als Entwässerungsmittel (d.h. Mittel zum Abbau von Polysacchariden und damit zur Freisetzung des in der polymeren Struktur der Polysaccharide gebundenen Wassers (bei der Verarbeitung von Gemüsen). Die vorliegende Erfindung betrifft nunmehr die Verwendung einer SPS-ase oder ein Verfahren zum Abbau von Polysacchariden, vorzugsweise Pflanzen-Zellwand-Polysacchariden, mit Hilfe einer Carbohydrase, wobei ein SPS-ase haltiges Mittel nach der Erfindung in einem wässrigen Medium mit einem Substrat für das SPS-ase-Zubereitung zusammengebracht wird.
So hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen wertvolle Enzymzubereitungen zur teilweisen oder vollständigen Verflüssigung oder Abbau von verschiedenen Materialien, vorzugsweise 4
AT 398 436 B pflanzlichen Materialien, z. B. Früchten-und Pflanzen-Abfällen, die Protein, Cellulose, Hemicellulose (z. B. Glucane, Xylan, Galactane und Araban), Gummen, Pectin, Lipide, Inulin, Polyphenole, Stärke und Alginate enthalten, sind und für damit verwandte Zwecke (siehe die später angegebene Tabelle). Als Beispiele für solche verwandte Zwecke können alle Zwecke erwähnt werden, bei denen heute kommerzielle Pectinasen und Cellulasen angewandt werden. Einige Beispiele sind später angegeben.
Im Zusammenhang mit dem Extraktions-(lsolier)-Verfahren, das z. B. in Beispiel 2 beschrieben ist, wurde festgestellt, daß die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen Proteinase-frei ist, auf Grund der Tatsache, daß das gewünschte Endprodukt, d. h. das Protein, sonst abgebaut würde. Ähnlich sollte, wenn andere biologische Materialien als Protein aus einem biologischen Rohmaterial extrahiert (isoliert) werden, die angewandte SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei sein von Enzymen, die diese anderen biologischen Materialien abbauen. Solche modifizierte SPS-ase-Zubereitungen können gebildet werden durch selektive Inaktivierung des unerwünschten Enzyms, durch Fraktionierung oder andere an sich bekannte Verfahren.
So ist eine bevorzugte Anwendung nach der Erfindung gekennzeichnet durch die Tatsache, daß der Abbau begleitet wird von der Isolierung oder Extraktion eines anderen biologischen Materials als Sojaprotein und verwandte pflanzliche Proteine aus einem biologischen Rohmaterial, wodurch die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei ist von Enzymen, die im Stande sind, das biologische Material abzubauen.
So hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß die modifizierten SPS-ase-Zubereitungen (modifiziert in dem Sinne, daß sie im wesentlichen frei sind von Enzymen, die im Stande sind, das zu extrahierende oder zu isolierende biologische Material abzubauen) wertvolle Enzymzubereitungen darstellen zur Extraktion (Isolierung) von speziellen biologischen Materialien z. B. Stärke, Lipiden, Geschmacksstoffen, Farbstoffen und Säften aus biologischen Rohmaterialien. Verschiedene Beispiele hierfür sind später angegeben.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eines oder mehrere der Reaktionsprodukte (unbeachtlich, ob es erwünschte Endprodukte oder Nebenprodukte sind) gleichzeitig mit oder nach der Enzymbehandlung weiterbehandelt werden. Hierdurch wird eine flexiblere und besser anpaßbare Arbeitsweise ermöglicht. Diese weitere Behandlung ist vorzugsweise eine alkoholische Fermentation, wenn eines der Reaktionsprodukte ein fermentierbarer Zucker ist. Hierdurch erhält man ein billiges Verfahren zur Herstellung von Alkohol.
Um das Wesen der Erfindung näher zu erläutern, wird auf die folgenden Abschnitte 1 bis 10 Bezug genommen, die jeweils Details im Zusammenhang mit der Erfindung beschreiben: 1. Herstellung von SPS. 2. Charakterisierung von SPS, insbesondere Molekulargewichtsverteilung. 3. Nachweis, daß SPS und APS unterschiedliche Verbindungen sind. 4. Auswahl von SPS-ase bildenden Mikroorganismen. 5. Charakterisierung einiger SPS-ase bildender Mikroorganismen. 6. Allgemeine Beschreibung der Überlagerungstechnik bei der Immunoelektrophorese. 7. Immunoelektrophoretische Charakterisierung von SPS-ase mit polyspezifischem Antikörper und Überlagerung, 8. Reinigung einer SPS-ase-Zubereitung. 9. Abhängigkeit der SPS-ase-Aktivität von pH-Wert und Temperatur sowie Stabilität der SPS-ase. 10. Enzymatische Aktivitätsbestimmungen.
Abschnitt 1
Herstellung von SPS
Wie oben erwähnt, kann das Ausgangsmaterial für die Herstellung von SPS Sojarückstand (Bestandteile außer Protein) sein. Daher wird in erster Linie die Herstellung von Sojarückstand beschrieben.
Sojarückstand ist die Protein-freie Kohlenhydrat-Fraktion (die in der Praxis kleine Mengen an Lignin und Mineralien enthalten kann) in entfettetem und enthülstem Sojamehl. Diese Kohlenhydratfraktion ist unlöslich in einem wäßrigen Medium bei pH 4,5 und kann auf folgende Weise hergestellt werden, wobei auf das Fließschema Fig. 17 verwiesen wird.
Entfettetes Sojamehl(Sojamehl 13 der Aarhus Oliefabrik A/S) wird in entionisiertem Wasser von 50 °C in einem Gewichtsverhältnis Sojamehl zu Wasser = 1 : 5 in einem Tank mit einem pH-Stat unter Temperaturregelung suspendiert. Der pH-Wert wird mit 4n NaOH (I) auf 8,0 eingestellt. Jetzt wird mit Hilfe von Alkalase 0,6 L (einem proteolytischen Enzym auf der Basis von B. licheniformis mit einer Aktivität von 0,6 Anson-Einheiten/g, bestimmt nach dem Anson-Verfahren, beschrieben in Novo Enzyme Information IB Nr. 058 e-GB), eine Hydrolyse unter konstantem pH-Wert durchgeführt, wobei das Verhältnis Enzym : Substrat 4 % der Menge an Protein in dem Sojamehl (II) beträgt. Nach einer Hydrolysezeit von 1 h wird die Aufschläm- 5
AT 398 436 B mung abzentrifugiert (III) und gewaschen (IV), wobei diese Maßnahmen zweimal wiederholt werden. (V, VI, VII). Die so erhaltene Aufschlämmung wird ein weiteres Mal 1 h mit Alkalse 0,6 L hydrolysiert (VIII, IX), ähnlich wie oben angegeben. Dann wird die Aufschlämmung abzentrifugiert (X) und zweimal gewaschen (XI, XII, XII, XIV), und die nach der letzten Waschstufe erhaltene Aufschlämmung (6) sprühgetrocknet (XV). Das so erhaltene sprühgetrocknete Pulver ist der Sojarückstand, der als Ausgangsmaterial zur Herstellung von SPS dient. SPS ist die wasserlösliche Polysaccharid-Fraktion, die erhalten wird durch übliche Behandlung des oben angegebenen Sojarückstands mit Pectinase. Das SPS wird auf folgende Weise mit Hilfe der im Folgenden ange - gebenen 14 Reaktionsstufen erhalten: Hierbei wird auf das Fließschema Fig. 18 Bezug genommen. 1. Der Gehalt an trockenen Bestandteilen in dem oben erwähnten Sojarückstand wird bestimmt und der Sojarückstand mit Wasser auf einen Gehalt von 2 % Feststoffe verdünnt und in einem Tank mit Temperaturregelung auf 50 *C gehalten. 2. Der pH-Wert wird mit 6n NaOH auf 4,50 eingestellt. 3. Pectinex Super conc. L wird in einer Menge von 200 g/kg Feststoffe zugegeben (eine handelsübliche Pectinase der Schweizerische Ferment AG, Basel, mit einer Pectinase-Aktivität von 750 000 MOU, bestimmt nach dem Prospekt "Determination of the Pectinase units on Apple Juice (MOU)" vom 12.6.1981, erhältlich von Schweizerische Ferment AG, Basel). Es wird ferner Celluclast 200 L in einer Menge von 2C g/kg Trockensubstanz zugegeben (eine handelsübliche Cellulase, beschrieben in dem Prospekt NOVO Enzyme, Informationsblatt B 153 e-GB 1000, Juli 1981, erhältlich von NOVO INDUSTRl A/S, Dänemark). 4. Der Tankinhalt wird 24 Stunden unter Rühren auf 50 °C gehalten. 5. Die Enzyme werden durch Erhöhung des pH-Werts auf 9,0 mit 4n NaOH inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wird 30 min stehengelassen und der pH-Wert dann wieder mit 6n HCl auf 4,5 eingestellt. 6. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert und sowohl das Zentrifugat (überstehende Flüssigkeit) als auch der Rückstand (Schlamm) gesammelt. 7. Das Zentrifugat aus Stufe 6 wird zur Untersuchung über eine Filterpresse filtriert (das Filter wurde vor der Filtration mit Wasser gewaschen). 8. Das Filtrat wird ultrafiltriert, diafiltriert und nochmals ultrafiltriert über eine Membran mit einem Trennwert von 30 Q00(DDS GR 60-P der Danske Sukkerfabrikker), wobei die folgenden Parameter angewandt werden: 1. Ultrafiltration auf eine Volumenkonzentration von 6. 2. Diafiltration, bis der Prozentsatz an Trockensubstanz in dem Permeat 0 beträgt (0* Brix). 3. Ultrafiltration auf ungefähr 15 % Feststoffgehalt in dem Konzentrat.
Die Temperatur beträgt 50' C, der pH-Wert 4,5 und der mittlere Druck 3 bar. 9. Das ultrafiltrierte Konzentrat wird auf 5'C gekühlt und ein gleiches Volumen 96 %-iges Äthanol zugegeben, 10. Der Niederschlag wird mit Hilfe einer Zentrifuge gesammelt. 11. Der Niederschlag wird zweimal mit 50 % (Vol/Vol) Äthanol in H2O gewaschen, entsprechend dem Volumen des Zentrifugats aus Stufe 10, d. h. es werden zwei Zentrifugierstufen durchgeführt. 12. Der gewaschene Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst, mit einem Volumen entsprechend dem Volumen des ultrafiltrierten Konzentrats der Stufe 9. 13. Die Flüssigkeit der Stufe 12 wird zur Untersuchung über ein Glasfilter filtriert. 14. Das klare Filtrat, enthaltend reines SPS, wird lyophilisiert.
Abschnitt 2
Charakterisierung von SPS und besonders Molekuiargewichtsverteiiung.
Durch Gel-Chromatographie mit Hilfe einer HPLC Vorrichtung (Waters Pumpe Model 6000, Waters Daten Modul 730 und Waters Refraktometer R 401) wurde die Molekulargewichtsverteilung des SPS, dessen Herstellung wie in der Beschreibung angegeben, durchgeführt wurde, bestimmt (Fig. 4). Mit Hilfe der gleichen Methode wurde auch die Molekulargewichtsverteilung der mit Hilfe von SPS-ase erhaltenen Abbauprodukte von SPS bestimmt (Fig. 5). Außerdem wurde mit Hilfe der gleichen Methode der Anlagerungseffekt zwischen Sojaprotein und SPS (Fig. 6) und das Nichtvorhandensein des Anlagerungseffekts zwischen Sojaprotein und SPS, das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mittels abgebaut worden war, (Fig. 7) gezeigt.
Die Eich-Kurve (der Logarithmus des Molekulargewichts gegen Rf, wobei der Rf-Wert für Glucose willkürlich als 1 definiert ist und der Rf-Wert für ein spezielles Dextran als die Retentionszeit für dieses 6
AT 398 436 B
Dextran, dividiert durch die Retentionszeit für Glucose definiert ist) wurde konstruiert mit Hilfe verschiedener Standard-Dextrane mit bekanntem Molekulargewicht (T 4, T 10, T 40, T 70, T 110, T 500) der Pharmacia Fine Chemicals AB, Box 175, S-75104, Uppsala, Schweden). Der RrWert für das Maximum jedes Dextran-Peaks wurde festgestellt und das entsprechende Molekulargewicht berechnet als
wobei Mw das Gewichtsmittel des Molekulargewichts und M„, das Zahlenmittel für das Molekulargewicht ist. Als Eluens für dieses Chromatographieverfahren wurde 0,1 m NaN03-Lösung angewandt. Die für die Chromatographie angewandten Säulen waren 60 cm PW 5000 und anschließend 60 cm PW 3000 der Toyo Soda Manufacturing Co., Japan. Auf diese Weise wurde die Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und dem RrWert für die oben angegebenen Dextrane aufgestellt, siehe Fig. 3.
Auf der Basis der Fig. 4 kann berechnet werden, daß SPS eine Molekulargewichtsverteilung besitzt, die zu einem Wert von Mw von ungefähr 5,4 x 105 und einem Wert für M„ von ungefähr 4,2 x 10* führt. Aus dieser Figur geht auch hervor, daß das Chromatogramm zwei deutliche Peaks bei Retentionszeiten von 34,5 min (6 %), entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 5x10® und eine Retentionszeit von 47,12 min (67 %), entsprechend einem Molekulargewicht von rund 4,9 x 10* zeigt. Aus dieser Kurve geht hervor, daß zwischen diesen beiden Peaks eine Schulter existiert, bei einer Retentionszeit von 41,25 min (27 %), entsprechend einem Molekulargewicht von 2,8 x 105.
Nach dem Abbau des SPS mit SPS-ase wurde das Hydrolysegemisch durch eine Membran filtriert und das Filtrat chromatographiert. Es zeigte sich, daß ungefähr 55 % des SPS zu Mono-, Di- und Trisacchariden abgebaut waren, und daß die verbleibenden 45 % zu einem Polymer abgebaut worden waren mit drei Peaks mit den folgenden Molekulargewichten: 5 x 10*, 10* und 4,4 x 103, siehe Fig. 5.
Um den Anlagerungs- bzw. Bindungseffekt zwischen Sojaprotein und SPS zu zeigen und die wesentliche Verringerung des Anlagerungseffekts zwischen Sojaprotein und SPS, das mit Hilfe einer SPS-ase abgebaut worden war, wurden die folgenden Versuche durchgeführt. 3 % SPS in 0,10 m Acetatpuffer bei pH 4,5 wurden zu einer Aufschlämmung von Sojaisolat (Purina E 500) gegeben, um eine Suspension mit einem Verhältnis Isolat zu SPS von 10 : 1 zu erhalten. Diese Suspension wurde 18 h auf einem Schüttelbad bei 50 eC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Suspension zentrifugiert und die klare überstehende Flüssigkeit durch HPLC, wie oben beschrieben, analysiert. Aus einem Vergleich der Fig. 6 mit Fig. 4 geht hervor, daß das SPS vollständig an das Sojaisolat adsorbiert ist.
Das gleiche Verfahren, wie in dem vorhergehenden Absatz angegeben, wurde mit einer 3 prozentigen SPS-Lösung durchgeführt, die mit einer SPS-ase hydrolysiert worden war, die gebildet worden war von CBS 101.43 (Fig 7). Ein Vergleich zwischen Fig. 7 und Fig. 5 zeigt, daß keine Verbindung in dem hydrolysierten SPS mit einem Molekulargewicht unter etwa 10* an das Sojaisolat adsorbiert war. Die Hydrolyse verringert die quantitative Anlagerung auf etwa 10 bis 15 %, bezogen auf die Anlagerung von SPS an Sojaprotein,
Die NMR-Analyse des SPS, dessen Herstellung wie in der Beschreibung angegeben, durchgeführt wurde, zeigt die folgende ungefähre Zusammensetzung des SPS. 1) ο-Galacturonsäure in einer Menge von etwa 45 %, wobei ungefähr 40 % der Gesamtmenge der a-
Galacturonsäure als Methylester vorliegen. 2) Rhamnopyranose in einer Menge von ungefähr 20 %. 3) Galactopyranose in einer Menge von ungefähr 15 %, und 4) /S-Xylopyranose in einer Menge von ungefähr 20 %.
Die Bestandteile scheinen in einer Struktur vorzuliegen, umfassend eine Rhamnogalacturon-Hauptkette und Seitenketten aus Xylose und Galactose.
Eine vollständige saure Hydrolyse von SPS (8 h in 1 n H2SO*) und anschließende Analyse durch Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte, daß auch kleinere Mengen der Monosaccharide Fucose und Arabinose in dem hydrolysierten SPS vorhanden waren.
Die HPLC-Analyse des SPS, das durch den SPS-ase-Enzymkomplex, der von CBS 101.43 gebildet war, abgebaut worden war, zeigte eine starke Reduktion des Molekulargewichts. In Übereinstimmung damit zeige das NMR-Spektrum des wie oben angegeben abgebauten SPS, daß der Hauptteil der Estergruppen verschwunden war, und daß auch der Gehalt an Xylose und Galactose in dem höhermolekularen Material abgenommen hatte. Das NMR-Spektrum des Teils des SPS-Abbauproduktes, der durch Zugabe von einem Volumen Äthanol zu einem Volumen SPS-Abbauprodukt ausfällt, ist ähnlich dem NMR-Spektrum des SPS 7
AT 398 436 B mit den oben erwähnten Modifikationen bezüglich der Estergruppen und des Gehalts an Xylose und Galactose.
Abschnitt 3
Dokumentation der Tatsache, daß SPS und APS unterschiedliche Verbindungen sind. APS wurde hergesteilt wie in Agr. Biol. Chem., Bd.36, Nr.4 S. 544 - 550 (1972).
Dieses Polysaccharid und SPS wurden jetzt mit unterschiedlichen Enzymen hydrolysiert, woraufhin das Abbaugemisch durch Geichromatographie mit Hilfe einer HPLC-Ausrüstung untersucht wurde, wie in Abschnitt 2 "Charakterisierung von SPS, insbesondere Molekulargewichtsverteilung" angegeben.
Im einzelnen wurden die Hydrolysen durchgeführt durch Behandlung von 25 ml Lösung von entweder 2 % APS oder 2 % SPS in 0,1 m Acetatpuffer, pH 4,5 mit 10 mg KRF 68 oder 30 mg Pectolyase. KRF 68 ist eine SPS-ase-Zubereitung, deren Herstellung in Beispiel 1 beschrieben wird. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.
Polysaccharid Enzym HPLC Gel Chromatogramm Polysaccharid abgebaut nicht abgebaut APS Pectolyase Fig.8 X APS KRF 68 Fig.9 X SPS Pectolyase Fig. 10 X SPS KRF 68 Fig.5 X
Abschnitt 4
Auswahl von SPS-ase bildenden Mikroorganismen.
Der zu untersuchende Mikroorganismus wird auf einem Agar-Schräge-Substrat mit einem Mittel inkubiert, das das Wachstum des Mikroorganismus ermöglicht. Nach einem anfänglichen Wachstum auf dem Agar-Schrägen-Substrat, wird der Mikroorganismus in ein flüssiges Hauptsubstrat überführt, in dem die Hauptkohlenstoffquelle SPS (hergestellt wie angegeben) ist, in dem die Stickstoffquelle NO3-, ΝΗ4Λ Harnstoff, freie Aminosäuren, Proteine oder andere stickstoffhaltige Verbindungen ist und das darüberhinaus ein Gemisch von essentiellen Salzen und Vitaminen, vorzugsweise in Form von Hefeextrakt enthält. Die Zusammensetzung des Hauptsubstrats hängt ab von der Art des Mikroorganismus, wobei der wichtigste Faktor der ist, daß das Hauptsubstrat im Stande sein sollte, das Wachstum und den Metabolismus des Mikroorganismus zu unterstützen. Wenn das Wachstum eine entsprechende Zeit lang in der Größenordnung von 1 bis 7 Tagen stattgefunden hat, je nach der Wachstumsgeschwindigkeit des betreffenden Mikroorganismus, wird eine Probe der Fermentationsbrühe auf SPS-ase nach der enzymatischen SPS-ase-Bestimmung, wie sie in dieser Beschreibung angegeben ist, analysiert oder nach irgend einer anderen SPS-ase-Bestimmung, die "maßgeschneidert" ist für andere spezifische Verwendungen der SPS-ase als die Verwendung als Bestandteil eines Mittels zum Abbau von Sojarückstand.
Um ein empfindlicheres Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität zu erreichen, sollte die Temperatur auf 40 *C verringert und die Inkubationszeit auf 20 h erhöht werden während der Bestimmung der SPS-ase-Aktivität, wobei Antibiotika zu dem Substrat zugesetzt werden sollten, um eine Infektion zu vermeiden.
Bei Befolgung dieses Testverfahrens können andere SPS-ase-bildende Mikroorganismen gefunden werden, die sowohl zu der Art Aspergillus als auch zu anderen Arten gehören.
Abschnitt 5
Charakterisierung einiger SPS-ase bildender Mikroorganismen
Nach der hier angegebenen Suchmethode nach SPS-ase-bildenden Mikroorganismen hat es sich gezeigt, daß die im oberen Teil der folgenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen SPS-ase-Bildner sind. Die Tabelle enthält auch einen Stamm,der zur Art Asp. japonicus gehört, jedoch kein SPS-ase-Bildner ist. 8
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Eine Kurz-Identifizierung der oben angegebenen Stämme findet sich in den folgenden Katalogen:
List of Cultures 1978 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande
Institute for Fermentation Osaka, List of Cultures, 1972, 5. Auflage, 17 - 85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan
The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14. Auflage 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. 9
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Alle oben angegebenen Stämme entsprechen gut der taxonomischen Beschreibung der Arten Asp. japonicus und Asp. aculeatus, wie sie angegeben sind in The genus Aspergillus of Raper and Fenneil, 1965 (siehe besonders S. 327 - 330).
Abschnitt 6
Allgemeine Beschreibung des Überlagerungsverfahrens bei der immunoelektrophorese.
Es wurde ein als Agar-Überlagerungs-Technik (top-agar overlay technique) bezeichnetes Verfahren zur Identifizierung von einzelnen Bestandteilen eines Enzymkomplexes durch Kreuz-Immunoelektrophorese mit einem poly-spezifischen Antikörper gegen alle Enzymkomponenten in dem Enzymkomplex entwickelt. Das Verfahren beruht auf der Tatsache, daß Enzyme nach der spezifischen Enzym-Antikörper-Bindung noch aktiv sind oder anders gesagt, daß die aktiven Enzymstellen nicht identisch sind mit den Stellen der Enzym-Antikörper-Bindung.
Die Enzym-Antikörper-Kompiexe werden als deutliche Bögen während der Elektrophorese in dem Gei präzipitiert. Die Gelplatte wird mit löslichem SPS in Agar bedeckt. Nach 20 h langem Erwärmen auf 45 ° C in einer Atmosphäre mit einer relativen Feuchtigkeit von 100 % erscheint der Bogen mit SPS-ase-Aktivität als klare Zone in der SPS-Deckschicht nach Ausfäliung mit einem Gemisch aus gleichen Volumina Äthanol und Aceton bei Betrachtung gegen einen schwarzen Hintergrund. Bögen, die keine SPS-ase-Aktivität besitzen, bleiben unsichtbar.
Abschnitt 7
Immunoelektrophoretische Charakterisierung von SPS-ase mit polyspezifischen Antikörpern und Überlagerung.
Kaninchen wurden mit dem SPS-ase haltigen Enzymkomplex immunisiert, der erhalten worden war durch Fermentation von Aspergilluns aculeatus CBS 101.43 wie in Beispiel 1 angegeben (KRF 68) und der polyspezifische Antikörper wurde in an sich bekannter Weise gewonnen. Mit Hilfe dieses polyspezifischen Antikörpers wurde eine Kreuz-Immunoelektrophorese des Enzymkomplexes, der durch Fermentation von Asp. aculeatus CBS 101.43, wie in Beispiel 1 angegeben (KRF 68) erhalten worden war, durchgeführt, wie von N. H. Axelsen et al., in "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis", 6. Auflage 1977 beschrieben. Es wird auf Fig. 11 verwiesen, die die den unterschiedlichen von dem Mikroorganismus gebildeten Proteinen entsprechenden Bögen zeigt. Mit Hilfe des oben beschriebenen Agar-Überlagerungs- bzw. Überschichtungsverfahrens hat es sich gezeigt, daß die schraffierten Bereiche der SPS-ase entsprechen.
Wenn die oben angegebene Hypothese, daß die SPS-ase aus zumindest zwei Enzymen besteht, richtig ist, ist der schraffierte Bereich der Bereich, in dem alle Enzyme, die für die SPS-ase-Aktivität verantwortlich sind, vorliegen. Wenn diese Enzyme bei anderen Arbeitsweisen nach der Erfindung durch Immunoelektrophorese auf solche Weise getrennt werden sollen, daß sie keinen gemeinsamen Bereich bedecken, kann ein Teil der SPS-ase-Aktivität noch identifiziert werden durch Immunoelektrophorese mit einer Überschichtung sowohl mit SPS als auch einer kommerziellen Pectinase.
Abschnitt 8
Reinigung einer SPS-ase-Zubereitung.
Die Reinigung der SPS-ase-Zubereitung KRF 92 (siehe Beispiel 1) wurde durch lonenaustausch durchgeführt. Der Puffer war 50 mM Tris (Tris-hydroxymethylaminomethan), der mit HCl auf pH 7,0 eingestellt war. Die Säule war eine K 5/30 Säule von Pharmacia, Schweden. Das lonenaustauschermaterial war DEAE-Trisacryl der LKB, Bromma, Schweden (300 ml). Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 100 ml/h. 15 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 92 wurden in 450 ml H20 bei 6'C gelöst und alle weiteren angegebenen Verfahrensstufen zwischen 6 und 10 °C durchgeführt. Der pH-Wert wurde mit 1 m Tris auf 7,0 eingestellt. Die Säule wurde mit dem Puffer äquilibriert und dann die SPS-ase-Probe auf die Säule aufgegeben. Die optische Dichte (OD280) und die Leitfähigkeit wurden an dem Eluat gemessen (siehe Fig. 12). Die Fraktion 1 war das Eluat, das nicht an das lonenaustauschermaterial gebunden war. Dann wurde die Säule mit 2000 ml Puffer gewaschen, wobei man die Fraktion 2 erhielt. Dann wurde ein 0-500 mM NaCI Gradient gebildet, wobei die Fraktionen 3 bis 9 erhalten wurden. Alle 9 Fraktionen wurden auf 200 ml eingeengt und gegen Wasser bis zu einer Leitfähigkeit von 2 mSi dialysiert (Hollow Fiber DP 2 von Amicon, Massachusetts, USA). Dann wurden die 9 Fraktionen gefriergetrocknet. Nur die Fraktionen 1 und 2 Zeigten SPS-ase-Aktivität. 10
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Die Fraktion 1 wurde weiter durch Gelfiltration gereinigt. 1,5 g der Fraktion 1 wurden in 10 ml 50 mM Natriumacetat, pH 4,5 (500 mM KCl) gelöst. Die Säule war eine 2,5 x 100 cm Säule von LKB. Das Füllmateriai für die Gelfiltration war Sephacryl S-200 der Pharmacia, Schweden. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 30 ml/h. Die Fraktionen, die Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 70 000 und 100 000 enthielten, geeicht mit Globular Proteinen, enthielten einen Enzymkomplex, der als Faktor G bezeichnet wird und der bei Untersuchung nach dem qualitativen Agar-Test SPS nicht abbauen kann. SPS wird jedoch nach dem qualitativen Agar-Test abgebaut, wenn der Faktor G mit einer Pectinase vermischt wird. Es hat sich gezeigt, daß der Faktor G im Stande ist, Galactose, Fucose und einen Teil der Galacturonsäure von SPS abzuspalten, aber das Hauptabbauprodukt ist entsprechend der HPLC-Analyse noch ein hochmolekulares Produkt, das SPS sehr ähnlich ist.
Abschnitt 9
Abhängigkeit der Aktivität von pH-Wert und Temperatur sowie Stabilität einer SPS-ase.
Fig. 13 zeigt die pH-Wert-Abhängigkeit der Aktivität der SPS-ase-Zubereitung KRF 68. Von pH 2,7 bis pH 3,5 wurde ein Ameisensäure-Puffer angewandt und von pH 3,7 bis 5,5 ein Acetat-Puffer.
Fig. 14 zeigt die Abhängigkeit der Aktivität von der Temperatur der SPS-ase-Zubereitung KRF 68.
Fig. 15 zeigt die Temperatur-Stabilität der SPS-ase-Zubereitung KRF 68.
Abschnitt 10
Bestimmung der Enzym-Aktivität.
Die unten angegebene Tabelle ist eine Zusammenfassung der verschiedenen Enzym-Aktivitäts-Bestimmun- gen.
Definition der Aktivitäteinheit und Beschreibung der Bestimmung der Enzym-Aktivität Enzym Kurzbeschreibung der Aktivität Allgemein zugänglich In der Beschreibung später erläutert Literatur Nr. SPS-ase SPS-ase X Rückstandlösend SRU X 1 SRUM-120 X Protease HUT X Cellulase ’ Cx X 2 Pectinase PU X 3 PGE X 4 UPTE X 5 PEE X 6 Hemicelluiase VHCU X 7
Die in obiger Tabelle angegebene Literatur wird in der folgenden Tabelle näher erläutert. 11
AT 398 436 B erhältlich von NOVO INDUS-TRI A/S, Novo A11S, 2880 Bag-svard, Denmark Schweizerische Ferment AG, Basel, Svrit-zerland Buchhandel Litera .tur Nr Identifizierung der Literaturstelle 1 Analyseforskrift AF 154/4 of 1981-12-01 X 2 Anaiytical -Biochemistry 84, 522 - 532 (1978) X Anaiytical nethod AF 149/6-GB.of 1981-05-25 X 3 Determination of Pecti-nase Activity with Citrus Pectin (PU) of 23.3.1976 X 4 Viskosimetrisehe Poly-galaeturonase-Bestim-nung (PGE) of 10.11.77 X 5 Bestimmung der Pectin-transeliminase (UPTE/ g) of 24.Sept.1975 X 6 Determination of the Pectinesterase activity (undated) with Initials WJA/GK X 7 Anaiytical nethod AF 156/1-GB X ..
Besonders in Bezug auf die Bestimmung der Cellulose-Aktiviät ist zu bemerken, daß die Analyse durchgeführt wurde, wie in AF 149/6-GB angegeben, und daß das Prinzip der Bestimmung erläutert ist in Anaiytical Biochemistry.
Abschnitt 10 a
Bestimmung der Enzymaktivität von SPS-ase.
Die Bestimmung der Enzymaktivität von SPS-ase wurde in zwei Stufen durchgeführt, d.h. einem qualitativen Agarplatten-Test und einer quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität, die auf der Messung der Gesamtmenge an freigesetzten Zuckern beruht. Wenn der qualitative Agarylatten-Test negativ ist, ist die SPS-ase-Aktivität Null, ungeachtet des Werts, der bei der quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität erhalten wird. Wenn der qualitative Agarplatten-Test positiv ist, ist die SPS-ase-Aktivität gleich dem Wert, der bei der quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität erhalten wird. 12
AT 398 436 B I. Qualitativer Agarplatten-Test
Eine SPS-Agarplatte wurde folgendermaßen hergestellt: Es wurde ein Puffer B hergestellt durch Einstellen von 0,3 m Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,5 mit Hilfe von 1 n NaOH. 1 g SPS wird in 20 ml B gelöst. 1 g Agarose (HSB Litex) wird mit SO ml B vermischt und unter Röhren zum Siedepunkt erhitzt. Wenn sich die Agarose gelöst hat, wird die SPS-Lösung langsam zugegeben. Die erhaltene 1 %-ige SPS-Agarose-Lösung wird in ein Wasserbad von 60 *C gestellt. Die Platten werden jetzt durch Ausgießen von 15 ml der 1 %-igen SPS-Agarose-Lösung auf eine waagerecht liegende Glasplatte von 10 x 10 cm hergestellt. Dann werden neun Löcher im Abstand von 2,5 cm in die verfestigte Schicht der SPS-Agarose gestanzt. In Jede Vertiefung werden 10 μΙ einer 1 %-igen Lösung des auf die SPS-ase-Aktivität zu untersuchenden Enzymproteins gegeben. Die Platte wird 18 h bei 50 *C und einer relativen Feuchtigkeit von 100 % inkubiert. Jetzt wird noch nicht abgebautes SPS mit Hilfe einer Lösung von gleichen Volumina Äthanol und Aceton ausgefällt. Der SPS-ase-Agarplatten-Test ist positiv für eine Probe in einer bestimmten Vertiefung, wenn eine klare ringförmige Zone um diese Vertiefung entsteht. II. Test zur quantitativen Bestimmung der SPS-ase-Aktivität.
Der Zweck dieses Versuches liegt in der Bestimmung der Enzymaktivität, die imstande ist, SPS in einem solchen Maß abzubauen, daß die Abbauprodukte eine stark verringerte oder keine Adsorption oder Bindungsaffinität an Sojaprotein zeigen. Versuche haben gezeigt, daß der Teil der SPS-Abbauprodukte, der durch ein Gemisch gleicher Volumina Wasser und Äthanol nicht ausgefäilt wird, keine Adsorptions- oder Bindungsaffinität gegenüber Sojaprotein besitzt.
Die SPS-ase-Bestimmung beruht auf der Hydrolyse von SPS unter Standardbedingungen und anschließende Ausfällung des Teils des SPS, der nicht hydrolysiert worden ist, mit Äthanol. Nach der Ausfällung wird der Gehalt an nicht ausgefällten Kohlenhydraten bestimmt durch quantitative Analyse auf den Gesamtzuckergehalt (nach AF 169/1, der NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvaerd).
Die Standardbedingungen sind:
Temperatur: 50’C pH: 4,5 Reaktionszeit: Vergleich 210 min nur mit Substrat, anschließend 2 min mit zugesetztem Enzym Hauptwert 212 min.
Die Vorrichtung umfaßt:
Thermostatisch geregeltes Rüttel-Wasserbad von 50 * C
Magnetrührer
Zentrifuge
Eis-Wasser-Bad
Die Reagenzien umfassen:
Puffer: 0,6 m Essigsäure in entmineralisiertem Wasser (a) 1,0 m NaOH (b) Substrat: Abbruch-Reagens: Der pH-Wert von 50 ml a wird mit b auf 4,5 eingestellt, dann werden 4,0 g SPS zugegeben und nach Losung des SPS wird der pH-Wert wieder auf 4,5 eingestellt und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 100 ml gebracht. Absolutes Äthanol.
Eine SPS-ase-Einheit (SAE oder SPSU) ist definiert als die SPS-ase-Aktivität, die unter den oben angegebenen Standardbedingungen eine Menge an in 50 %-igem Äthanol löslichen Kohlenhydrat, entsprechend 1 uMol Galactose pro Minute freisetzt.
Selbst wenn der Anfangsteil der Enzym-Standardkurve gerade ist, ist festzustellen, daß er den (0.0) Punkt nicht schneidet. 13
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Abschnitt 10 b
Enzymatische Bestimmung der den Rückstand lösenden Aktivität ausgedrückt als SRUM 120. 5 Prinzip:
Bei dem Verfahren zur Bestimmung der Hydrolyseaktivität wird der unlösliche Anteil an entfettetem deproteinisiertem und enthülstem Sojamehl unter Standardbedingungen hydrolysiert. Die Enzymreaktion wird mit dem Abbruchreagenz abgebrochen und der unlösliche Anteil abfiltriert. Die Menge an gelösten 70 Polysacchariden wird spektrophotometrisch bestimmt nach Säure-Hydrolyse entsprechend AF 169/1, der Novo Industri A/S, 2880 Bagsvaerd.
Entsprechend dem Verfahren werden Carbohydrasen mit Endo- sowie Exoaktivität bestimmt.
Das Substrat für diese Enzymbestimmung ist identisch mit dem für das SRU-Verfahren beschriebenen Rückstandsubstrat. Das Substrat wird als 3 %-ige Lösung in dem unten erwähnten Citratpuffer gelöst: 75 0,1 n Citrat-Phosphat-Puffer pH 4,5 5,24 g Citronensäure 1-hydrat (Merck Art 244) 8,12 g Dinatriumhydrogenphosphat 2-Hydrat (Merck Art 6580) ad 1 I entmineralisiertes Wasser pH 4,5 t 0,05 20 14 Tage stabil.
Das Abbruchreagens besitzt die folgende Zusammensetzung:
100 ml 0,5 n NaOH 200 ml 96 % Äthanol
Bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren. 25
Standardbedingungen
Temperatur 50” C 4,5 pH Reaktionszeit, Probe Blindprobe 120 min 5 min 35
Definition der Einheit
Eine Sojarückstand-Iösende-Einheit (SRUM) 120 (M für manuell) ist die Menge Enzym, die unter den 40 angegebenen Reaktionsbedingungen pro Minute gelöste (solubilisierte) Polysaccharide entsprechend 1 U-Mol Galactose freisetzt.
Abschnitt 10 c 45 Enzymatische Bestimmung der proteolytischen Aktivität. HUT-Messung
Verfahren zur Bestimmung von Proteinase in saurem Medium, so Das Verfahren beruht auf dem Abbau (Digestion) von denaturiertem Hämoglobin durch das Enzym bei 404 C, pH 3,2 innerhalb von 30 min. Das nicht abgebaute Hämoglobin wird mit 14 %-iger Trichloressigsäure (Gew./Vol.) ausgefällt.
Alle Enzymproben werden hergestellt durch Lösen in 0,1 m Acetat-Puffer, pH 3,2.
Das Hämoglobinsubstrat wird hergestellt unter Verwendung von 5,0 g lyophilisiertem Rinder-Hämoglo-55 bin-Pulver konserviert mit 1 % Thiomersalat und 100 ml entmineralisiertem Wasser und 10 min gerührt, wobei der pH-Wert anschließend mit 0,33 n HCl auf 1,7 eingestellt wird.
Nach weiterem 10 min langem Rühren wird der pH-Wert mit 1 n NaOH auf 3,2 eingestellt. Das Volumen dieser Lösung wird mit 0,2 m Acetatpuffer auf 200 ml erhöht. Dieses Hämoglobin-Substrat muß im 14
AT 398 436 B Kühlschrank aufbewahrt werden, wo es sich 5 Tage hält.
Das Hämoglobin-Substrat wird auf Raumtemperatur gebracht. Zum Zeitpunkt Null werden 5 ml Substrat in ein Reagenzröhrchen gegeben, das 1 ml Enzym enthält. Nach 1 s langem Schütteln wird das Röhrchen 30 min in ein Wasserbad von 40* C gegeben. Nach genau 30 min werden 5 ml 14 %-ige Trichloressigsäure in das Reaktionsröhrchen gegeben, das dann geschüttelt und 40 min auf Raumtemperatur gebracht wird. Für die Blindprobe wird das Hämoglobin-Substrat auf Raumtemperatur gebracht. Zum Zeitpunkt Null werden 5 ml des Substrats in ein Reagenzröhrchen, enthaltend 1 ml Enzym, gegeben. Nach 1 s langem Schütteln wird das Röhrchen 5 min in ein Wasserbad von 40 * C gestellt. Nach genau 5 min werden 5 ml 14 % Trichloressigsäure in das Reagenzglas gegeben, das dann geschüttelt und 40 min auf Raumtemperatur gebracht wird.
Nach 40 min werden die Blindproben und die Proben geschüttelt, ein- oder zweimal durch Berzelius-Filter Nr. 0 filtriert und in ein Spektrophotometer gegeben. Die Probe wird gegenüber der Blindprobe bei 275 nm abgelesen, während das Spektrophotometer gegen Wasser eingestellt ist.
Da die Absorption von Tyrosin bei 275 nm ein bekannter Faktor ist, ist es nicht notwendig, eine Tyrosin-Standardkurve zu bilden, soweit es nicht erforderlich ist, das Beckman-Spektrophotometer zu überprüfen.
Berechnungen 1 HUT ist die Enzymmenge, die in 1 min ein Hydrolysat bildet, das in der Absorption bei 275 nm einer Lösung von 1,10 ug/ml Tyrosin in 0,006 n HCl entspricht. Dieser Absorptionswert beträgt 0,0084. Die Reaktion sollte bei 40 * C und pH 3,2 30 min lang ablaufen.
HUT
Probe-Blindprobe 0,0084
Vol. in ml_ Reaktionszeit in min
HUT
Probe-Blindprobe 11 0,0084 30 (P-B) x 43,65 HUT/g Enzym (P-B) x 43,65 g Enzym in 1 ml
Die Untersuchung der Abhängigkeit der Proteasestabilität in KRF 68 vom pH-Wert durch die HUT-Analyse mit pH-Werten von 2,0 bis 8,0 zeigte, daß die Stabilität der Protease oberhalb pH 8,0 sehr gering war, siehe Fig. 16.
Zur näheren Erläuterung der Erfindung wird auf die folgenden Beispiele 1 bis 8 verwiesen, wobei Beispiel 1 die Herstellung von SPS-ase erläutert und die Beispiele 2 bis 8 die Anwendung der SPS-ase auf ein Soja-Ausgangsmaterial erläutern, um ein gereinigtes pflanzliches Protein zu erhalten. Andere Anwendungen der SPS-ase sind in dem Abschnitt zwischen Beispiel 8 und der Zusammenfassung der Figuren angegeben.
Es wurden einige Fermentationen mit den hier angegebenen Stämmen von Asp. aculeatus und Asp. japonicus im Labormaßstab durchgeführt. Hierbei erhielt man Mittel, enthaltend SPS-ase, entsprechend dem hier angegebenen SPS-ase-Test. Da jedoch verhältnismäßig große Mengen an SPS-ase erforderlich sind, um Anwendungsversuche durchzuführen, wurden ähnliche Versuche im Pilotmaßstab durchgeführt, siehe das folgende Beispiel 1.
Herstellungsbeispiel 1
Herstellung von SPS-ase in einer Pilotanlage.
Eine SPS-ase wurde durch Submers-Fermentation von Aspergillus aculeatus CBS 101.43 hergestellt.
In einem Fernbach-Kolben wurde ein Agar-Substrat der folgenden Zusammenstellung hergestellt: 15
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Pepton Difco 6g Aminolin Ortanax 4g Glucose 1 g Hefeextrakt Difco 3g Fleischextrakt Difco 1,5 g KHaPO* Merck 20 g Malzextrakt Evers 20 g entmineralisiertes H2O ad 1000 ml x Kasim Hydrolysat
Der pH-Wert wurde zwischen 5,3 und 5,35 eingestellt. Dann wurden 40 g Agar (Difco) zugegeben und das Gemisch 20 min im Autoklaven bei 120*C behandelt. Das Substrat wird als E-Agar bezeichnet.
Der Stamm CBS 101.43 wurde auf einer E-Agar-Schräge (37*0) gezüchtet. Die Sporen von der Schräge wurden in sterilisierter Magermilch suspendiert und die Suspension in Gläsern lyophilisiert. Der Inhalt einer Ampulle mit lyophilisiertem Inhalt wurde in den Fernbach-Koiben gegeben. Der Kolben wurde dann 13 Tage bei 30 eC inkubiert.
Es wurde ein Substrat mit der folgenden Zusammensetzung in einem 500 I Impf-Fermenter hergestellt. C3CO3 1,2 kg Glucose 7,2 kg Rofec (Maiswasser-Feststoffe) 3,6 kg Sojabohnenöl 1,2 kg
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von ungefähr 240 I zugegeben. Der pH-Wert wurde vor der Zugabe von CaC03 auf ungefähr 5,5 eingestellt. Das Substrat wurde in dem Impf-Fermenter 1 h bei 121 *C sterilisiert. Das Endvolumen vor der Beimpfung betrug ungefähr 300 I.
Die Sporensuspension aus dem Fernbach-Kolben wurde in den Impf-Fermenter Überführt. Die Bedingungen der Impf-Fermentation waren:
Fermentertyp: Üblicher belüfteter und gerührter Fermenter mit einem Verhältnis Höhe : Durchmesser von ungefähr 2,3. Rühren: 300 UpM (zwei Turbinen-Propellerrührer) Belüftung: 300 Normal Liter Luft pro Minute Temperatur: 30 bis 31 °C Druck: 1,5 bar (0,5 atü) Zeit etwa 28 h
Ungefähr 28 h nach der Beimpfung wurden 150 I aus dem Impf-Fermenter in den Hauptfermenter überführt.
In einem 2 500 I Hauptfermenter wurde ein Substrat der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Geröstetes Sojamehl 90 kg KH2PO4 20 kg Pluronic x 150 ml x Polyoxyalkylenderivat von Propylenglykol
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 900 I zugegeben. Das geröstete Sojamehl wurde in Wasser suspendiert. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 8,0 eingestellt und die Temperatur auf 50 *C erhöht. Daraufhin wurden etwa 925 Anson-Einheiten Alcalase 0,6 L zu der Suspension gegeben. Das Gemisch wurde 4 h bei 50 *C und pH 8,0 (Na2C03 Zugabe) ohne Belüftung unter Normaldruck (null atü) und Rühren mit 100 UpM gehalten. Anschließend wurden die restlichen Bestandteile des Substrats zugegeben und der pH-Wert mit Phosphorsäure auf ungefähr 6,0 eingestellt. Das Substrat wurde in dem Hauptfermenter 1,5 h bei 123°C sterilisiert. Das Endvolumen vor der Beimpfung betrug 16
AT 398 436 B ungefähr 1080 I.
Dann wurden 150 I Impfkultur zugesetzt. Die Fermentationsbedingungen waren:
Fermentertyp: Üblicher belüfteter und gerührter Fermenter mit einem Verhältnis Höhe : Durchmesser von ungefähr 2,7. Rühren: 250 UpM (zwei Turbinen-Propellerrührer) Belüftung: 1200 Normal Liter Luft pro Minute Temperatur: 30 *C Druck: 1,5 bar Zeit: etwa 151 h
Zwischen ungefähr 24 und ungefähr 116 h der Fermentation wurde eine Pectinlösung aseptisch zu dem 75 Hauptfermenter mit konstanter Geschwindigkeit von ungefähr 8 l/h zugeführt. Die Pectinlösung der folgenden Zusammensetzung wurde in einem 500 I Dosierungstank hergestellt:
Pectin genu x> 22 kg Phosphorsäure, konz. 6 kg Pluronic 50 ml x) Genu pectin (Citrus-Typ NF von The Copenhagen pectin factory Ltd.).
Leitungswasser wurde auf ein Gesamtvolumen von etwa 325 I zugegeben. Das Substrat wurde in dem Dosierungstank 1 h bei 121 ’C sterilisiert. Das Endvolumen vor dem Beginn der Dosierung bzw. Zugabe betrug ungefähr 360 I. Nach Auslauf dieser Menge wurde ein zweiter ähnlicher Ansatz hergestellt. Das Gesamtvolumen an Pectinlösung für eine Fermentation betrug ungefähr 725 I.
Nach ungefähr 151 h langer Fermentation wurde die Fermentation abgebrochen. Die ungefähr 1850 I Kulturbrühe wurden auf ungefähr 5 · C gekühlt und die Enzyme nach dem folgenden Verfahren gewonnen.
Die Kuiturbrühe wurde mit Hilfe eines Vakuum-Trommelfilters (Dorr Oliver), das mit Filterhilfe (Hy-flo-super-cel Diatomeenerde) beschichtet war, filtriert. Das Filtrat wurde durch Eindampfen auf ungefähr 15 % des Volumens der Kulturbrühe eingeengt. Das Konzentrat wurde über eine Seitz-Filterfolie (Type supra 100) mit 0,25 % Hy-flo-super-cel als Filterhilfe filtriert (in der folgenden Tabelle als Filtration I bezeichnet). Das Filtrat wurde mit 561 g (NH+)2SO+/l bei pH 5,5 ausgefällt und 4 % Hy-flo-super-cel Diatomeenerde als Filterhilfe zugegeben. Der Niederschlag und die Filterhilfe wurden durch Filtration über ein Rahmenfilter getrennt. Der Filterkuchen wurde in Wasser gelöst und unlösliche Bestandteile über ein Rahmenfilter abfiltriert. Das Filtrat wurde filtriert, über eine Seitz-Filterfolie (type supra 100) mit 0,25 % Hy-flo-super-cei als Filterhilfe (in der folgenden Tabelle als Filtration II bezeichnet). Das Filtrat wurde über eine Ultrafiltrationsvorrichtung diafiltriert. Nach der Diafiltration wurde die Flüssigkeit auf einen Feststoffgehalt von 12,7 % eingeengt (in der folgenden Tabelle als Feststoffgehalt im Konzentrat bezeichnet).
Eine fakultative Basenbehandlung zur teilweisen Entfernung der Proteaseaktivität kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Im Fall, daß die Basenbehandiung angewandt wird, wird sie 1 h bei einem pH-Wert von 9,2 durchgeführt, woraufhin der pH-Wert auf 5,0 eingestellt wird.
Jetzt wird die Flüssigkeit filtriert und zum Zwecke der Keimverminderung filtriert und das Filtrat Uber eine Gefriertrockenvorrichtung von Stokes gefriergetrocknet.
Es wurden vier Fermentationsansätze in der unten angegebenen Weise durchgeführt, wobei der für die Fermentation angewandte Stamm, die Durchführung der fakultativen Basenbehandlung und andere Parameter verändert wurden, wie in der folgenden Tabelle angegeben. 17 55
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Basen- Behandlung . Code Nr. Konzentration (t) der Füerhilfe bei Fest-, Stoff- gehdt im e fl> e» c Mikro- Organismus Filtration I Aus- Filtration Π Kon zen- X h V ja nein fällung trat E C < CBS 101.43 X KRF 6B 5 _ 28 KTOC 20236 X KRF 74 1 2,0 4 0.4 7.5 IFO 4408 X KRF 83 1,0 5 0,25 12,4 X) CBS 101.43 X KRF 52 0,25 4 0,25 12,7
Nach der Filtration wird das Konzentrat zur Keimverringerung im Verhältnis 1 : 2,3 eingeengt. Ein kleinerer Teil des eingeengten Filtrats wurde sprühgetrocknet und der verbleibende Rest wurde gefriergetrocknet.
Um die Proteaseaktivität weiter zu verringern, wurden einige der oben angegebenen Zubereitungen wie unten angegeben behandelt, wobei nur eine der drei Alternativen A, B und C durchgeführt wurde.
A. 100 g SPS-ase-Zubereitung werden in 1 I entionisiertem Wasser unter Rühren bei 10*C ± 2’C gelöst. Der pH-Wert wird mit 4 n NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt. Der pH-Wert wird dann mit Eisessig auf 4,5 eingestellt und das Gemisch gegen eiskaltes entionisiertes Wasser bis zu einer Leitfähigkeit von 3 mSi dialysiert. Dann wird (das Produkt) gefroren und lyophilisiert.
B. 500 g SPS-ase-Zubereitung werden in 4 I entionisiertem Wasser unter Rühren bei 10’C ± 2’C gelöst. Der pH-Wert wird mit 4 n NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt. Der pH-Wert wird mit Eisessig auf 5,0 eingestellt. Das erhaltene Material wird lyophilisiert. C. 50 g SPS-ase-Zubereitung werden in 400 ml entionisiertem Wasser unter Rühren bei 10*C ± 2’C gelöst. Der pH-Wert wird mit 4 n NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt. Dann wird der pH-Wert mit Eisessig auf 5,7 verringert. Das erhaltene Material wird lyophilisiert.
Als Ausgangssubstanz für die Basen-Behandlung angewandte SPS-ase-Zubereitung Basen-Behandlung Code-Nr. A B C KRF 68 X KRF 68 Bll KRF 68 X KRF 68 BMI KRF 92 X KRF 92 Bl
Die oben angegebenen Zubereitungen werden in der folgenden Tabelle durch ihre Enzymaktivitäten charakterisiert. 18
5 AT 398 436 B f-t a P> b. C Sfi + 4 JO p- in r* 1030 F* o\ π 3092 7600000 6ΘΒ00 62400 790 j 742000 j ID ID o o o © o o © 9 P- PN V VD 9 O o o o © <N nr ID 10 9 F* o o o 9 9 C\ pH in in e o V © © ID V © fe ΗΓ pH Om fcC CD H CD n n 9 o O o o © © \D CD m 9 ΉΓ o 9 9 © © n «-4 ID f» SD © o ID o © o CO PN CD o F* © c ID CN o tu in cn PN « r- PN SC O PN © O o o o o © © H? m PN © o fn F* © ph in 19 n o pH pH n o pH pN o in in b 1 pH © K CD SC H m pH © σ> vd © © © © 9 H CD N n c\ o © o fM © H m f* n cn © F* © pM O a pH © o o \D © 4- 9 F* F· o CD . CD © © CD pH b . C X H Ή f· O in HP o © o © e H o o © o O o o 9 Q m in in pH o o O F* © o pH CD e PN n 9 CD + o F* CD © Φ o H ' a\ b K a o r* m 9 O o © o © o _ in m PN O o © o O o m r* © o © HP © o H* Ol r* O © © CD o ID o pH f* o Ui r-i pH 16 K o sc pH «H ** e w *U c p c- > 1 c 4J 5 u Jj CN CS C C» 3 m l & o PN = E > σ> P Cm >1 — s a 9 N ζ; H s © fr« h η c -¾ ·-> < a. s © X u CH Ed ω < w w W «M V & a D a > 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Anwendungs-Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Bildung eines p.v.p. aus einem enthülsten und entfetteten Sojamehl "Sojamei 13" (im Handel erhältlich von Aarhus Oliefabrik A/S).Der Feststoffgehalt dieses Mehls betrug 94,0 19
AT 398 436 B % und der Gehalt an (N x 6,25) auf Feststoffbasis betrug 58,7 %. Das Sojamehl wurde mit der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 Bll (Herstellungsbeispiel 1)auf die folgende Weise behandelt: 85,2 g des Sojamehls wurden in 664,8 g Wasser suspendiert und unter Rühren bei 50 ° C gehalten und der pH-Wert mit Hilfe von 7,5 ml 6 n HCl auf 4,5 eingestellt. 50 g einer Lösung, enthaltend 4,00 g der erwähnten SPS-ase-Zubereitung wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch dann 240 min bei 50 °C gerührt. Das Gemisch wurde dann in einer Laborzentrifuge (Beckman Model J-6B) 15 min bei 3000 x g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt untersucht. Die feste Phase wurde dann mit einem Volumen Wasser entsprechend der bei der ersten Zentrifugation erhaltenen Menge an überstehender Flüssigkeit gewaschen. Diese Operation wurde zweimal durchgeführt. Die feste Phase wurde dann gefriergetrocknet, gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt untersucht in Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Dänemark. Dieses Labor ist vom Staat autorisiert, Futtermittel und Molkereiprodukte zu analysieren. Die bei dem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus Tabelle 2.1 hervor:
Tabelle 2.1
Ergebnisse Komponente Menge g N x 6,25 (%) Feststoffe (%) Ausbeute an Protein (%) Ausbeute an Feststoffen (%) Sojamehl 85,2 55,2 94,0 100% 100% SPS-ase-Zubereitung 4,00 75,6 - 6,4% - 1. Zentrifugat 666 1,50 5,04 21,2% 42,0% p.v.p. 44,5 87,5 95,7 82,7% 53,2%
So erhielt man ein p.v.p. mit einer Proteinreinheit, d.h. N x 6,25, bezogen auf die Feststoffe, von 91,4 % und mit einer Gesamtausbeute an Protein von 83 %.
Anwendungsbeispiel 2
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Proteinausbeuten, die Nährstoffqualität und einige funktioneile Eigenschaften von Sojaproteinprodukten zu vergleichen, die nach den folgenden drei Verfahren hergestellt worden waren. A. Übliche isoelektrische Ausfäliung zur Herstellung von Sojaprotein-Isolat. B. Übliches isoelektrisches Waschverfahren zur Herstellung von Sojaprotein-Konzentrat. C. Isoelektrisches Waschverfahren nach der Erfindung, umfassend ein den Rückstand lösendes Enzym zur Bildung von p.v.p.
Um einen wirklichen Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens (C) mit den üblichen Verfahren für Sojaprotein (A und B) zu erhalten, wurde das gleiche Ausgangsmaterial in allen drei Fällen angewandt. Die Versuche wurden auch so durchgeführt, daß entsprechende Temperaturen und Behandlungszeiten in allen drei Fällen angewandt wurden. Lediglich die pH-Werte waren unterschiedlich aufgrund der fundamentalen Unterschiede zwischen den drei Versuchen. A. Übliche isoelektrische Ausfällung zur Herstellung von Sojaprotein-isolat. 425,8 g Sojamehl (Sojamel 13, hergestellt von Aarhus Oliefabrik A/S) wurden in 3574,2 g Leitungswasser bei 50 *C extrahiert. Der pH-Wert wurde mit 20,1 g 4 n NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach 1 stündigem Rühren wurde die Aufschlämmung bei 3000 x g 15 min unter Verwendung von 4 1 I-Bechern in einer Laborzentrifuge (Beckman Model J-6B) zentrifugiert. Das Zentrifugat I und der Niederschlag I wurden gewogen. Der Niederschlag I wurde wieder mit Wasser auf ein Gesamtgewicht von 4000 g extrahiert. Die Temperatur wurde auf 50* C gehalten, der pH-Wert mit 4 n NaOH auf 8 eingestellt und die Aufschlämmung 1 h gerührt. Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Zentrifugat II und der Niederschlag II wie oben gewogen. Von den Zentrifugaten I und II und dem Niederschlag II wurden Proben entnommen nach Kjeldahl und auf den Feststoffgehalt untersucht. Anschließend wurden die Zentrifugale I und II vermischt und auf 50 · C gehalten. Das Protein wurde dann isoelektrisch bei pH 4,5 mit Hilfe von 45 g 6 n HCl ausgefällt. Nach 1 stündigem Rühren bei 50 °C wurde das Protein durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 x g 20
AT 398 436 B gewonnen. Das Zentrifugat III wurde gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die feste Phase III wurde gewogen und mit Wasser in einer Menge entsprechend dem Gewicht des Zentrifugats I gewaschen. Der Waschvorgang wurde durchgeführt durch 1 ständiges Rühren bei 50 * C. Das gewaschene Protein wurde durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 x g gewonnen. Das Zentrifugat IV und die feste Phase IV wurden gewogen. Das Zentrifugat IV wurde nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die feste Phase wurde in 1550 g Wasser von 50 *C suspendiert und der pH-Wert mit 17 g 4 n NaOH auf 6,5 eingestellt. Das Gemisch wurde 1 h gerührt und der pH-Wert, soweit erforderlich, wieder auf 6,5 eingestellt. Schließlich wurde das Produkt gefriergetrocknet, gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die Berechnungen der Mengenbilanz sind in Tabelle 3.1 angegeben. 21
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Tabelle 3.1
Operationen und Fraktionen Menge der Fraktion g Protein %(N x 6,25) Feststoffe (%) Ausbeute an Protein (%) Ausbeute an Feststoffen (%) Extraktion: Sojamehl 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Wasser 3574,2 0 0 0 0 4 n NaOH 20,1 0 16,0 0 0,8 1. Zentrifugation: Σ 4020.1 5,9 10,0 100,9 100,4 Zentrifugat I 3141,0 4,4 6,9 58,8 54,1 Nierderschiag I 805,0 - - - - Re-Extraktion: Niederschlag I 805,0 - - - - Wasser 3195,0 0 0 0 0 2. Zentrifugation: Zentrifugat II 3104,0 0,5 0,9 6,6 7,0 Niederschlag II 820,0 9,1 17,2 31,7 35,2 Vermischen und Ansäuern Zentrifugate I + II 6245,0 - - - - 6n HCl 45,0 0 21,3 0 2,4 3. Zentrifugation: Σ 6290,0 Zentrifugat III 5650,0 0,3 1,9 7,2 26,8 Niederschlag III 308,0 - - - - Waschen Niederschlag III 308,0 - - - - Wasser 3141,0 0 0 0 0 4. Zentrifugation: Σ 3449,0 Zentrifugat IV 3113,0 0,04 0,15 0,5 1,2 Niederschlag IV 291,0 - - - - Neutralisation: Niederschlag IV 291,0 - - - - Wasser 1550,0 0 0 0 0 4 n NaOH 17,0 0 16,0 0 0,7 Trocknen: Pulver 128,0 93,8 96,3 51,1 30,8
Berechnung der Mengenbilanz bei der üblichen isoelektrischen Ausfäliung zur Herstellung von Sojaprotein-Isolat. B. Isoelektrisches Waschverfahren zur Herstellung von Sojaprotein-Konzentrat. 55 425,6 g Sojamehl (Sojamel 13 hergestellt von Aarhus Oliefabrik A/S) wurden in 3574 g Wasser von 50'C gewaschen. Der pH-Wert wurde mit 44,8 g 6 n HCl auf 4,5 eingestellt. Das Waschen wurde 4 h unter Rühren durchgeführt. Die Aufschlämmung wurde dann 15 min in einer Laborzentrifuge (Beckman Model J-6B) bei 3000 x g zentrifugiert, wobei 4 1 I-Becher verwendet wurden. Das Zentrifugat I wurde gewogen und 22
AT 398 436 B nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die feste Phase I wurde gewogen und erneut mit Wasser bis zu einem Gesamtgewicht von 4000 g gewaschen. Der pH-Wert wurde wieder mit 1,7 g 6 n HCl auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung 30 min bei 50 · C gerührt. Die Masse wurde zentrifugiert und das Zentrifugat II und die Feststoffe II wie oben gewogen. Die feste Phase II wurde erneut in 1575 g H2O bei 50 *C suspendiert und der pH-Wert mit 34,5 g 4 n NaOH auf 6,5 eingestellt. Das Gemisch wurde 1 h bei 50 * C gerührt und der pH-Wert, soweit notwendig, wieder auf 6,5 eingestellt. Schließlich wurde das Proteinprodukt gefriergetrocknet, gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die Mengenbilanz ist in Tabelle 3.2 angegeben. 23
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Tabelle 3.2
Berechnung der Mengenbilanz beim isoelektrischen Waschen zur Herstellung von Sojaprotein-Konzentrat. Operationen und Fraktionen Menge der Fraktion g Protein %(N x 6,25) Feststoffe (%) Ausbeute an Protein (%) Ausbeute an Feststoffen (%) Waschen Sojamehl 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Wasser 3574,0 0 0 0 0 6n HCl 44,8 0 21,3 0 2,4 1. Zentrifugation: Σ 4044,6 - - - - Zentrifugat I 3150,0 0,6 3,2 8,0 25,2 Feststoffe I 846,0 - - - - erneutes Waschen Feststoffe I 846,0 - - - - Waschen 3154,0 0 0 0 0 6n HCl 1,7 0 21,3 0 0,1 2. Zentrifugation: Σ 4001,7 Zentrifugat II 3130,0 0,1 0,4 1,3 3,2 Feststoffe II 863,0 - - - - Neutralisation: Feststoffe II 863,0 - - - - Wasser 1575,0 0 0 0 0 4 n NaOH 34,5 0 16,0 0 1,4 Trocknen: Pulver 281,0 72,5 98,4 86,7 69,1 C. Isoelektrisches Waschverfahren unter Verwendung eines den Rückstand lösenden Enzyms zur Bildung von p.v.p. 425,8 g Sojamehl (Sojamel 13 hergestellt von Aarhus Oliefabrik A/S) wurden in 3524,2 g Wasser bei 50 * C gewaschen. Der pH-Wert wurde mit Hilfe von 43,7 g 6 n HCl auf 4,5 eingestellt. 24 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 Bill (Herstellungsbeispiel 1)wurden in 26 g Wasser gelöst und zu dem Waschgemisch zugegeben. Der Waschvorgang wurde dann 4 h unter Rühren durchgeführt. Anschließend wurde die Reinigung, wie bei B beschrieben, durchgeführt, wobei die Mengen an 6 n HCl, 4 n NaOH und Wasser zum erneuten Suspendieren die einzigen Parameter mit abweichenden (unterschiedlichen) Werten sind. Die Mengenbilanz ist in Tabelle 3.3 angegeben. 24
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Tabelle 3.3
Berechnung der Mengenbilanz bei dem isoelektrischen Waschen einschließlich des den Rückstand lösenden Enzyms zur Herstellung von p.v.p. Operationen Menge der Protein % (N x 6.25) Feststoffe (%) Ausbeute an Ausbeute an und Fraktion g Protein (%) Feststoffen(%) Fraktionen Waschen: Sojamehl 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Wasser 3540,2 0 0 0 0 6 n HCl 43,7 0 21,3 0 2,3 SPS-ase: KRF 68 Bill 24,0 75,3 96,0 7,7 5,8 1. Zentrifugation: Γ 4043,7 " Zentrifugat I 3420,0 1,7 5,2 24,7 44,4 Feststoffe I 620,0 - - - - Erneutes Waschen Feststoffe 1 620,0 - - - - Wasser 3380,0 0 0 0 0 6nHCI 1,3 0 21,3 0 0,1 2. Zentrifugation: I 4001,3 Zentrifugat II 3400,0 0,2 0,6 2,9 5,1 Feststoffe II 577,0 - - - “ Neutralisation: Feststoffe II 577,0 - - - - Wasser . 1700,0 0 0 0 0 4 n NaOH 25,3 0 16,0 0 1,0 Trocknen: 211,0 87,31) 96,7’> 78,2 51,1 Pulver 86,92) 97,02) 1) Analyse des Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding, Denmark 2) Analyse des Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000, Aarhus C, Denmark Nährstoffeigenschaften
Die Aminosäurezusammensetzungen der drei Proteinprodukte wurden bestimmt siehe Tabelle 3.4. Der Gesamtgehalt an essentiellen Aminosäuren, die chemische Bewertung und der Index der essentiellen Aminosäuren (EAAI) wurde berechnet nach dem FAO Bezugsmuster Von 1957.
Der Gehalt an Trypsininhibitor der drei Produkte wurde bestimmt mit Hilfe des in A.O.C.S. Tentative Method Ba 12 - 75 (A.O.C.S. ist eine Abkürzung für American Oil Chemists' Society) beschriebenen Verfahrens. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.5 angegeben, die auch die Ausbeuten und das Verhältnis Protein zu Feststoffen der drei Produkte zeigt. 25
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Tabelle 3.4 Zusammensetzung äer Aminosäure und Nährbewertung der drei Protein-Produkte A, B und C. A. Sojaprotein- B. Sojaprotein- C. Sojaprotein - Aminosäure Isolat Isolat Isolat (p.v.p.) g/16 g N MS1* g/T 6 g N aas15 g/16 g N aas1 * Nicht-essentiell Aspartinsäure 12,4 - 11,3 - n,9 - Serin 4,62 - 4,69 - 4,81 - Glutaminsäure 21j3 - 18,2 - 17,7 - Prolin 6,07 - 5,19 • - 4,76 - Glycin 4,13 - 4,26 - 4,33 - Alanin 3,54 - 4,27 - 4,55 - Histidin 2,83 - 2,78 - 2,50 - Arginin 8,03 7,57 - 7,04 - Essentiell Isoleucin 4,87 > loo 4,57 >100 5,19 >100 Leucin 7,80 >100 7,98 >100 8,09 >100 Lysin 6,24 >100 6,09 >100 5,57 >100 Phenylalanin 5,47 >100] 5,35 >100) 5,17 >100·] Koo [>100 f»10D Tyrosin 3,.38 >100 j 3,88 >100) 4,44 >100 > Cystin 1,29 64.5] 56.^ 1,32 66,Ol ? 602 1,44 72,01 ’ 7 65.5 Methionin 1,08 49.11 1,21 55, Oj 1,31 59,5 J Threonin 3,10 > 100 3,60 >100 3,97 >100 Tryptophan 1.06 75.7 1,37 97,9 1,32 94,3 Valin 4,90 >100 5,23 >100 5,57 >100 ♦ % Gesärnt-3ehäi.t. äer essentieller Aminosäure 38 .36 / 41 ,31 42 ,31 Chemische Bswertunc 56 .4% / 60 ,2% 65 ,5% J EAAI - 86 .7% 90 ,2% 91 •3% aas = Bewertung der Aminosäure, bezogen auf das FAO-Bezugsmuster (195") 26
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Tabelle 3.5
Verfahrens-Charakteristika und Trypsin-Inhibitor-Gehalt der drei Protein-Produkte A, B und C. A. Sojaprotein -Isolat B. Sojaprotein -Konzentrat C. Sojaprotein-Isolat (p.v.p.) Verfahrens-Charakteristika Protein in den Feststoffen 97,4 % 73,7 % 90,0 % Protein-Ausbeute 51,1 % 86,7 % 78,2 % Trypsin-Inhibitor TUI/g Produkt 34 000 21 000 19 000 TUl/g Protein 36 250 28 970 21 810
Funktionelle Eigenschaften
Der Index der Stickstofflöslichkeit (NSI) wurde in einer 1 %-igen Proteindispersion bei pH 7,0 in 0,2 m NaCl-Lösung bzw. in destilliertem Wasser bestimmt. Nach 45 min langem Rühren mit einem Magnetrührer wurde die Suspension 30 min mit 4000 x g zentrifugiert und die überstehende Lösung auf Stickstoff untersucht. Die Stickstofflösiichkeit wurde berechnet als (lösliches N %/Gesamt N %). Die Ergebnisse dieser Berechnung für die drei Produkte sind in Tabelle 3.6. angegeben.
Die Emulgierfähigkeit wurde dreimal an Jedem Produkt durch eine leicht modifizierte Swift-Titration bestimmt. 4,0 g (N x 6,25) des Produktes wurden in 250 ml 0,5 m NaCI mit einem Sorval Omnimixer bei niederer Geschwindigkeit vermischt. 50 ml der Suspension wurden in ein Mischglas gegeben und 50 ml Sojabohnenöl zugesetzt. Anschließend wurde das gesamte Gemisch gewogen. Das Öl-Wasser-Gemisch wurde dann mit 10 000 UpM homogenisiert, wobei das Glas in einem Eisbad stand. Eine zusätzliche Menge Sojabohnenöl wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,3 ml/s zugegeben, bis die Emulsion zusammenfiel. Die Gesamtmenge an Öl, die vor dem "Endpunkt" zugesetzt wurde, wurde durch Wiegen festgestellt.
Die Emulgierfähigkeit wurde berechnet als ml Öl pro Gramm Protein (N x 6,25). Die Dichte des Öls wurde mit 0,9 g/ ml angenommen.
Die Mittelwerte der Bestimmungen der Emulgierfähigkeit der drei Produkte sind in Tabelle 3.6 angegeben.
Die Aufschlagbarkeit wurde in einer 3 %-igen Proteinlösung bei pH 6,5 bestimmt. 250 ml der wässrigen Dispersion der Proteinproben wurden mit Geschwindigkeit III 4 min in einem Hobart-Mischer (Modell N-50), der mit einem Drahtquirl versehen war, aufgeschlagen. Die Aufschlagbarkeit bzw. Ausdehnung beim Aufschlagen wurde berechnet nach der Formel V-250
Ausdehnung beim Aufschlagen = 2"5Ö x 100 %, in der V das Endvoiumen des aufgeschlagenen Produktes in ml bedeutet. V wurde gemessen durch erneutes Füllen des Mischerglases mit Wasser. Es wurden Doppelversuche für jede der drei Proben durchgeführt. Die erhaltenen Mittelwerte sind in Tabelle 3.6 angegeben.
Die Schaumstabilität wurde als Verhältnis zwischen der Menge Schaum, die nach 3 minütigem Ablaufen verblieb und der ursprünglichen Schaummenge bestimmt. A g des nach dem oben angegebenen Verfahren geschäumten bzw. aufgeschlagenen Produktes wurde in einen Kunststoffzylinder (Durchmesser 7 cm, Höhe 9 cm) mit einem Drahtnetz mit einer Maschenweite von 1 x 1 mm gegeben. Der Zylinder wurde auf einen Trichter auf einem Glaszylinder gegeben und das Gewicht (B) der abgelaufenen Flüssigkeit in dem Glaszylinder bestimmt. Die Schaumstabilität FS ist definiert durch die Gleichung FS = A--,B x 100 %.
A
Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in Tabelle 3.6 angegeben. 27
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Die Gel festigkeit ist in dieser Beschreibung definiert als die Brookfield-Viskosität gemessen mit Hilfe von T-Spindeln in einem Brookfield Helipath-Ständer. Die Gele wurden hergestellt durch Wärmebehandlung von 12 %-igen Proteinsuspensionen in 0,5 m NaCI. Die Wärmebehandlung wurde in geschlossenen Dosen mit einem Durchmesser von 7,3 cm und einer Höhe von 5 cm, die in ein Wasserbad gestellt wurden, das auf 80 und 100*C gehalten wurde, jeweils innerhalb von 30 min. durchgeführt Die Dosen wurden gekühlt und bevor sie geöffnet und (der Inhalt) gemessen wurde .thermostatisch auf 20 *C eingestellt. Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle 3.6 angegeben.
Tabelle 3.6
Funktionelle Eigenschaften der drei Protein-Produkte. Funktion A. Sojaprotein-Isolat B. C. Sojaprotein-Isolat Sojaprotein-Konzentrat (p.v.p.) % NSIX in 0,2 m NaCI 39,5 20,3 25,6 % NSI in Wasser 53,9 25,1 28,6 Emulgier-Fähigkeit: ml Öl /g (N x 6,25) 218 182 354 Aufschlagbarkeit (%) 120 120 340 Schaumstabilität (%) 50 50 20 Gel -Festigkeit(dPa.s) 80 *C (0,5 m NaCI) 1,7 x 103 1,2x10* 3,3 x 102 100’C (0,5 m NaCI) 2,0 x10* 4,0x10* 1,3x10* x NSI = Stickstofflöslichkeits index
Anwendungsbeispiel 3
Ein p.v.p. wurde hergestellt nach dem in Anwendungsbeispiel 2c beschriebenen Verfahren mit der Ausnahme, daß die Cellulase-Aktivität teilweise von Trichoderma reesei stammt. Die im Handel erhältliche Cellulasezubereitung CELLUCLAST hergestellt von Novo Industri A/S wurde mit einer Base bei niederer Temperatur auf die folgende Weise behandelt. Der pH-Wert einer 10 %-igen Celluciast-Lösung in Wasser wurde mit NaOH auf 9,2 eingestellt und die so erhaltene Lösung auf 5 · C gekühlt. Nach 1 h bei diesem pH-Wert und dieser Temperatur wurde der pH erneut mit 20 %-iger Essigsäure auf 4,7 eingestellt. Die Lösung wurde über Nacht bei 5 * C gehalten und dann steril filtriert. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet. 4 g des gefriergetrockneten Produktes wurden zusammen mit der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 Bill (Herstellungsbeispiel 1) zugegeben. Die beiden Enzyme wurden in 172 g Wasser vor der Zugabe zu dem Wasch-Gemisch gelöst. Die Bestimmung der Mengenbilanz ist in Tabelle 4.1 angegeben.
Der Versuch zeigt, daß diese spezielle SPS-ase-Zubereitung schon eine wirksame Cellulase enthält, da der Zusatz von Celluclast das Verhältnis Protein : Feststoffen nicht beeinflußt. Andere SPS-ase-Zubereitun-gen können jedoch weniger Cellulase enthalten, z.B. KRF 92, siehe die Tabelle unmittelbar vor Anwendungsbeispiel 1. 28
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Tabelle 4.1
Berechnung der Mengenbilanz beim isoelektrischen Waschen einschl. der SPS-ase-Zubereitung und Celiuclast ® zur Herstellung von p.v.p. Operationen Menge der Protein (%) (N x 6,25) Feststoffe (%) Ausbeute an Ausbeute an und Fraktionen Fraktion g. Protein (%) Feststoffen (%) Waschen Sojamehl 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 Wasser 3546,2 0 0 0 0 6n HCl 43,1 0 21,3 0 2,3 SPS-ase: 24,0 75,3 96 7,7 5,8 KRF-68-B-III CELLUCLAST 4,0 43,6 96 0,7 1,0 Zentrifugat Σ 4043,1 - - - - Zentrifugat I 3382,0 1,9 5,5 27,3 46,5 Feststoffe I 661,0 - • erneutes Waschen: Feststoffe I 661,0 - - - - Wasser 3339,0 0 0 0 0 6 n HCl 0 0 0 0 0 2. 4000,0 Zentrifugation: Σ Zentrifugat II 3414,0 0,2 0,7 2,9 6,0 Feststoffe II 582,0 - - “ - Neutralisation: Feststoffe II 582,0 - - - - Wasser 1691,0 0 0 0 0 4 n NaOH 25,3 0 16,0 0 1,0 Trocknen: 206,0 88,8 98,9 77,8 50,9 Pulver
Anwendungsbeispiel 4
Ein p.v.p. wurde nach dem in Anwendungsbeispiel 2c beschriebenen Verfahren hergestellt mit der Ausnahme, daß alle Mengen um den Faktor 5 kleiner waren und daß das Reaktionsgemisch vor dem Zentrifugieren auf ungefähr 5 * C gekühlt wurde. Auf der Grundlage der Analyseergebnisse im Zusammenhang mit den Zentrifugaten wurde eine theoretische Ausbeute an Protein erhalten, wie aus Tabelle 5.1 hervorgeht. 29
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Tabelle 5.1
Bei der Herstellung von p.v.p. erhaltene theoretische Protein-Ausbeute Fraktionen Menge g Protein (N x 6.25) (%) Ausbeute an Anwendungsbeispiel 2c Protein (%) Protein (N x 6.25) % Ausbeute an Protein, % Sojamehl 85,2 55,2 100 55,2 100 SPS-ase KRF-68 B-Ill 4,8 75,3 7,7 75,3 7,7 1. Zentrifugat 639 0,99 13,5 1,7 24,7 2. Zentrifugat 595 0,13 1.6 0,2 2,9 p.v.p. - 87,2a 92,6b 87,1 80,1b a Durchschnitt von 87,5 (Bioteknisk Institut) und 86,9 (Qvist's Laboratorium); entsprechend Feststoffen von 97,6 und 98,0 %. b Berechnet als Gesamtmenge von Protein - Proteinverlust in den Zentrifugaten.
Anwendungsbeispiel 5
Nachweis der Proteinbindung von SPS 40 g (N x 6,25) aus einem im Handel erhältlichen Sojaprotein-Isolat (Purina 500 E der Ralston Purina) wurden in 680 g Wasser gelöst. Das Gemisch wurde im Wasserbad auf 50 · C erwärmt und der pH-Wert mit 6 n HCl auf 4,5 eingestellt. 90 g dieses Gemisches wurden in 5x250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und 10 g wässrige Lösungen, enthaltend 0, 0,2, 0,4, 0,8 bzw. 1,6 g des wie vorher in der Beschreibung angegeben hergestellten SPS wurden zugegeben. Die Kolben wurden dann 240 min mit einem Magnetrührer im Wasserbad bei 50 * C gerührt.
Anschließend wurden die Aufschlämmungen mit 3000 x g 15 min zentrifugiert und die Zentrifugate I nach Kjeldahl auf N sowie auf Feststoffe analysiert. Die festen Phasen wurden in Wasser von Raumtemperatur gewaschen und dann neu zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt. Dann wurden die Feststoffe in 50 ml Wasser dispergiert und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 6 n NaOH auf 6,50 eingestellt. Die neutralisierten Produkte wurden gefriergetrocknet und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Bezogen auf die in Tabelle 6.1 angegebene Analyse wurden das gewonnene Protein und dfer Prozentsatz an SPS, der an das Protein gebunden war, mit Hilfe der in Zusammenhang mit Tabelle 6.2 angegebenen Formeln berechnet.
Dieses Beispiel zeigt, daß das SPS fest an das Protein gebunden ist, so daß das Verhältnis Protein : Feststoffen mit zunehmendem Gehalt an SPS abnimmt. Ein SPS-Gehalt, entsprechend ungefähr 0,4 g in 10 g Wasser, zugegeben zu 5 g Protein-Isolat, ist das in dem Sojamehl vorhandene Verhältnis Protein : SPS.
Die prozentuale Bindung von SPS ist ein berechneter Wert. Die prozentuale Bindung von SPS nimmt aufgrund der Sättigung des Proteins in Beziehung auf SPS bei geringen Verhältnissen Protein : SPS ab. 30 ΑΤ 398 436 Β
1) % Protein-Rückgewinnung = £ i NC 1 = % N in Zantrifugat I x 100, '.st. wobei
Tabelle 6.1 Messungen nach Amendungsbeisoiel 5
Verhältnis Zentrifugate I trockner Niederschlag Protein/SPS % N 1 DK % N % NX 6,25 % DK , N x 6.25 * DM 1 00 25 12,5 6,25 3,125 0,068 0,045 0,038 0,031 0,026 0,62 0,49 0,45 0,45 0,61 13,2 13,4 13,0 12,6 1Ί>? 82,5 83.8 81,3 78.8 73.8 93.1 97,3 97,9 98.1 97;9 88,6 86,1 83,0 80.3 75.3
Tabelle 6.2 Protein-Gewinnung und prozentuale Bindung von SPS
Verhältnis Protein/SPS % Protein-Gewinnung ^ ^ 2) % Bindung von SPS 00 0 25 94,4 77 12,5 95T3 90 6,25 96,1 70. 3,125 96,8 60 2) % Bindung von SPS = RücJr Rück- T 5x (% Protein-^Gewinnufia) 5x (% Protein-^ewinnuna 1 x 100,
L (% P/H) ' (% P/H)^ J £5/Menge an
spsJ
{% P/H) Verhältnis Protein/Feststoff im trockenen Niederschlag und (% ?/H)M gilt für den Niederschlag ohne Zusatz von SPS
Anwendungsbeispeil 6
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines p.v.p. unter Verwendung der SPS-ase-Zubereitung KRF 92 Bl in einer Menge von 5 %, bezogen auf die Feststoffe. Die Art der Herstellung entsprach genau derjenigen von Anwendungsbeispiel 2c mit der Ausnahme, daß alle Mengen um den Faktor 5 verringert 31
AT 398 436 B wurden. Das p.v.p. wurde, wie in Anwendungsbeispiel 1 beschrieben, analysiert. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen -aus Tabelle 7.1 hervor.
Tabelle 7.1
In Anwendungsbeispiel 6 erhaltene Ergebnisse Bestandteile Menge g (N x 6,25) (%) Feststoffe (%) Ausbeutean Protein, (%) Ausbeute an Feststoffen (%) Sojamehl 85,2 55,2 94,0 100 100 Enzym-Zubereitung 4,0 71,2 - 6,1 - 1 . Zentrifugat 632 1,88 5,44 25,3 43,0 2. Zentrifugat 673 0,30 0,80 4,3 6,7 p.v.p. 39,8 85,6a 84,4b 98,13 98,1b 71,9 48,8 3 Analyse des Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding b Analyse des Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000
Anwendungsbeispiel 7
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung einer Vorbehandlung von Sojamehl durch Dampfstrahlbehandlung vor der Herstellung von p.v.p.
Vorbehandlung
Eine Aufschlämmung von Sojamehl In Wasser, bestehend aus 10 kg Sojamehl (Sojamel 13 hergestellt von Aarhus Oliefabrik A/S) auf 100 kg wurde durch eine Dampfdüse (Typ Hydroheater B-300) gepumpt und mit Dampf von 8 bar in einer solchen Menge und mit einer solchen Strömungsgeschwindigkeit vermischt, daß eine Endtemperatur von 150” C 25 s in einem rohrförmigen Druckreaktor aufrechterhalten werden konnte. Anschließend wurde der Druck in einer Entspannungskammer (ein Zyklon) aufgehoben und von hier wurde die Aufschlämmung durch einen Plattenwärmeaustauscher geleitet und auf ungefähr 50 ”C gekühlt. Die abgekühlte Aufschlämmung konnte direkt zur Herstellung von p.v.p. nach der Erfindung verwendet werden, aber in diesem Falle wurde die Aufschlämmung mit einer Eintrittstemperatur von 200 · C und einer Austrittstemperatur von 90 ”C sprühgetrocknet. Es zeigte sich, daß das vorbehandelte Produkt einen Feststoffgehalt von 96,5 % und einen Proteingehalt von 56,9 % (N x 6,25) besaß.
Herstellung von p.v.p.
Die Herstellung wurde auf die folgende Weise durchgeführt: 70 g Feststoffe des mit Dampf behandelten und getrockneten Sojamehls wurden in 560 g Wasser suspendiert und bei 50 ” C gerührt und der pH-Wert mit Hilfe von 6,5 mi 6 n HCl auf 4,50 eingestellt. 6 x 90 g dieser Suspension wurden in 6 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und auf einem Wasserbad von 50 ” C mit Hilfe von Magnetrührern gerührt. Zu jedem Kolben wurden 10 g einer Lösung, enthaltend 0, 0,025, 0,050, 0,10, 0,20 bzw. 0,40 g SPS-ase-Zubereitung KRF 68 Bill gegeben. Die Reaktionsgemische wurden dann 240 min bei 50 ”C gerührt. Dann wurde das Gemisch 15 min bei 3000 x g zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde dann nach Kjeldahl auf N analysiert und die feste Phase mit gleichen Volumina Wasser gewaschen und zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt. Die feste Phase wurde dann gefriergetrocknet und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert.
Ein ähnlicher Versuch wurde mit einem nicht behandelten Sojamehl (Sojamel 13 der Aarhus Oliefabrik A/S) als Ausgangsmaterial durchgeführt. In diesem Fall waren die Verhältnisse Enzym : Substrat 0, 1,2, 3, 4 bzw. 8 %.
Bezogen auf den Proteingehalt der überstehenden Flüssigkeiten kann der Prozentgehalt an gewonnenem Protein berechnet werden. Die Ausbeute an Protein beruht auf der Annahme, daß das Enzymprodukt nach der Reaktion 100 % gelöst ist. Die folgende Tabelle zeigt die bei beiden Versuchen erhaltenen Ergebnisse. 32
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Tabelle 8.1
Verhältnis Protein-ausbeute und Protein der Feststoffe des aus dampfbehandeltem oder rohem Sojamehl hergestellten p.v.p. Dampfbehandeltes Sojamehl nicht behandeltes Sojamehl E/S % Protein Feststoffe % Protein der Feststoffe % Protein Feststoffe % Protein der Feststoffe % 0 92,9 76,5 90,7 73,9 0,25 90,1 86,6 - - 0,50 89,3 88,7 - - 1,0 88,1 89,7 87,1 86,2 2,0 86,6 91,7 85,7 88,1 3,0 - - 84,3 89,5 4,0 84,7 92,2 82,6 90,9 8,0 - - 76,2 91,1
Im Zusammenhang mit entweder den Extraktions- (Isolierungs-) Verfahren für andere Materialien als Proteine oder mit den Verflüssigungsverfahren und damit verwandten Verfahren wird auf das allgemeine Verfahrensschema für die Anwendung, wie in dem Fließschema Fig. 19 angegeben, verwiesen.
Das Substrat kann ein oder mehrere Kohlenhydrate in einem Ausgangsmaterial sein oder es kann das gesamte Ausgangsmaterial sein.
Dieses Substrat kann einer chemischen oder physikalischen Vorbehandlung, wie später beispielhaft erläutert, z.B. einer Säune-oder Alkalibehandlung, Einweichen, Benetzen und/oder Kochen mit oder ohne Dampf unterworfen worden sein.
Das Ausgangsmaterial kann eingeweicht (mazerisiert), gehackt, naß gemahlen und/oder homogenisiert sein (alle diese Behandlungen werden in Fließschema 3 als Homogenisierung bezeichnet), wobei Wasser und andere Additive während dieser Stufe zugesetzt oder nicht zugesetzt werden können. Die Homogenisierung kann mit unterschiedlicher Wirkung durchgeführt werden, z.B. bei unterschiedlichen Drücken, die nur ein Bruchteil des für den speziellen Homogenisator angegebenen Maximal-Druckes ausmachen. Unterschiedliche Zusätze bzw. Additive können vor oder während der Homogenisierung zugegeben werden, wie in dem Fließschema Fig.19 durch bi, b2 ... bn angegeben.
Das Reaktionsverfahren einschließlich der SPS-ase-Herstellung wird unter speziellen Bedingungen, z.B. von Temperatur, Druck, Zeit, pH und Enzymmenge durchgeführt. Auch sind Empfehlungen bezüglich des angewandten Reaktors (z.B. für ansatzweises Arbeiten oder Pfropfenströmungsreaktoren) und das Rühren, soweit erforderlich, angegeben. Eine Reihe von Additiven kann für unterschiedliche Ausgangsmaterialien angegeben werden wie durch Ci, C2 ... cn in Fig. 19 angegeben.
Auch die Trennverfahren können mit unterschiedlichen Wirkungen durchgeführt werden. Bei vielen Verfahren wird die Abtrennung weggelassen oder erleichtert, z.B. wenn das Ausgangsmaterial vollständig flüssig (verflüssigt) ist. Unterschiedliche Trennvorrichtungen können angewandt werden (z.B. Zentrifugen, Filter, Ultrafiltrationsvorrichtungen, Hydrozyklone, Eindicker, Siebe oder einfache Dekantiervorrichtungen).
Die Trennungswirkung ist definiert als das Verhältnis zwischen dem absoluten Feststoff-Gehalt in der festenPhase und dem absoluten Feststoff-Gehalt des Reaktionsgemisches.
Die erhaltenen festen oder flüssigen Phasen können weiterbehandelt werden, z.B. eingeengt, getrocknet, mit Lösungsmittel extrahiert, um bestimmte Komponenten wie Fett oder Öl zu entfernen, fermentiert zur Bildung von Biomasse, Alkohol oder anderen Produkten (Enzymen, Antibiotika oder anderen wertvollen Bestandteilen).
Die erhaltenen Produkte können auch zur wiederholten Behandlung entsprechend dem Verfahrensschema zurückgeführt werden.
Im folgenden sind einige Beispiele für die Anwendung von SPS-ase-Zubereitungen angegeben und eine Übersicht dieser Anwendungen geht aus der folgenden Liste hervor.
Auch in der beiliegenden Tabelle I sind verschiedene Charakteristika zusammen mit Fig. 19 zusammengefaßt. 33
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Aufstellung von Anwendungsmöglichkeiten von SPS-ase-Zubereitungen
Art der Be- SPS-ase- 2ugs- Zubereitung Nr. SPS-ase- A 1 Extraktion von Stärke aus Mais, Weizen Zubereitung, und Kartoffeln die im liehen wesent-frei ist A 2 Extraktion von Lipiden aus pflanzlichen Materialien von einer oaer mehreren stören- A 3 Extraktion von'ätherischen Ölen aus den Enzymaktivi- pflanzlichen Materialien täten A 4 Extraktion von natürlichen Farbstoffen aus pflanzlichen Materialien A 5 Extraktionen von Kautschuk von dem Guayul-Busch Voll- Ba 1 Herstellung eines Milchersatz-Stof- stän- fes für Haustiere dige Ver- flüssi- Ba 2 Herstellung von verzuckerte Stärke enthaltenden Rohmaterialien gung Ba 3 Vollständige Verflüssigung von Bir- oder nen und anderen Früchten ähnl. Behand lung Ba 4 Herstellung von Saft durch Behandlung von Früchten und Gemüsen nicht Ba 5 Behandlung im Zusammenhang mit der modi- Extraktion oder dem Pressen von fi- Zuckerrohr oder Zuckerrüben zier te Ba 6 Herstellung von Sojamilch SPS- Ba 7 Behandlung zur Erhöhung der gewinn- ase- ’ baren Menge an löslichen Kaffee- Zu- bestandteilen be- rei- tun- Versr- Bb 1 Verhinderung und/oder Abbau von"Schlei- gen bei- ern" in Apfelsaft tungs- hil- Bb 2 Verwendung zur Klärung von Weißwein fen Bb 3 Herstellung von ISSPH oder anderen pflanzlichen Protein-Hydrolysaten Bb 4 Maische-Enzym in der Brauerei ' Bb 5 Enzym-Zusatz bei der Bierfermentation und/oder Lagerung Bb 6 Mittel zur Entfernung der Mandel-häut^shen 34
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Art der SPS-ase- Zubereitung Be- zugs- Nr. Andere Anwen- Bc 1 Abbau von unterschiedlichen Abfallprodukten nicht modi- fi- dungs arten Bc 2 ' Verzuckerung und gleichzeitige Fermentation zier- Bc 3 Abbau von Cellulose te SPS- Bc 4 Verwendung als Backhilfe ase- Zu- be- rei- Bc 5 Verbesserung der Alkoholausbeute und Ausbeute an Biomasse bei der Fermentation von Sulf itablauge von der Papierherstellung tun- gen Bc 6 Bc 7 Entwässerung von biologischen Schlämmen Silage-Hilfe 35
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10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 A 1. Extraktion von Stärke aus Mais, Weizen und Kartoffeln.
Die Extraktion von Stärke aus Mais, Weizen, Kartoffeln und anderen stärkehaltigen Pflanzen wird in einer oder mehreren Stufen durchgeführt: Einweichen, Naß-Mahlen und Trennen. Die Anwendung einer 36
AT 398 436 B SPS-ase-Zubereitung mit im wesentlichen keiner amylolytischen Aktivität führt zu den folgenden Vorteilen, wobei Mais als Beispiel angewandt wird: 1. Die Stärkefreisetzung wird innerhalb einer kürzeren Einweichzeit erleichtert, 2. Der Wasserverbrauch kann verringert werden, 3. Die Freisetzung von Maiskeimen wird erleichtert ohne Freisetzung von Maiskeimöl, 4. Das Protein kann in höherer Reinheit erhalten werden, 5. Die Gewinnung von Maiswasser wird erleichtert. A 2. Extraktion von Lipiden aus Pflanzenmaterial.
Da die Lipide in pflanzlichen Materialien innerhalb der Zellen eingeschlossen und üblicherweise an Proteine gebunden sind, können Lipide in wässriger Phase durch Behandlung mit einer SPS-ase-Zubereitung extrahiert werden, die im wesentlichen frei ist von Lipasen. So wird Maiskeimöl üblicherweise isoliert durch Extraktion der getrockneten Maiskeime mit Hexan. Der Trockenvorgang ist jedoch überflüssig, wenn die nassen Maiskeime mit einer SPS-ase-Zubereitung der oben angegebenen Art behandelt werden. Ähnlich kann die Extraktion von Olivenöl in wässriger Phase verbessert werden, wenn das für die enzymatische Behandlung angewandte Enzym eine SPS-ase-Zubereitung der oben angegebenen Art ist, siehe z.B. Food, Pharmaceutical and Bioengineering, Nr. 172, Bd. 74, S. 93-94. Auch die wässrige Extraktion von z.B. Sojaöl, Rapsöl und Sonnenblumenöl kann auf ähnliche Weise verbessert werden. A 3. Extraktion von ätherischen Ölen aus pflanzlichen Materialien.
Wenn pflanzliche Materialien, die ätherische Öle enthalten, mit einer wässrigen Lösung einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, die im wesentlichen frei ist von Enzymaktivität, die imstande ist, die ätherischen Öle abzubauen oder auf andere Weise zu verändern, werden die ätherischen Öle in hohen Ausbeuten zu sehr geringen Kosten extrahiert. A 4. Extraktion von natürlichen Farbstoffen aus pflanzlichem Material.
Wenn pflanzliche Materialien, enthaltend Farbstoffe z.B. rote Rüben, die den roten Farbstoff Betanin enthalten oder der Farbstoff in Preiselbeeren mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, die im wesentlichen frei ist von Enzymaktivitäten, die imstande sind, die Farbstoffe abzubauen oder auf andere Weise zu verändern, werden die Farbstoffe in hohen Ausbeuten zu niedrigen Kosten gewonnen. A 5. Extraktion von Gummi aus dem Guayul-Busch.
Ein anderes Beispiel für ein Substrat für eine SPS-ase-Zubereitung, die im wesentlichen frei ist von Enzymaktivität, die imstande ist, Rohgummi abzubauen, ist das Zellwandmaterial von Wurzeln und Zweigen des Guayul-Busches.
Ba 1. Herstellung eines Milchaustauschstoffes für Haustiere, vorzugsweise Austauschstoff für Kälbermilch.
Durch vollständige Verflüssigung von Sojabohnen, Sonnenblumensamen, Baumwollsamen, Fababohnen oder Felderbsen, kann ein Kälbermiich-Austauschstoff hergestellt werden, der in kaltem Wasser bei einem pH-Wert von etwa 4,5 löslich ist. Bei Verwendung von stärkehaltigen Rohmaterialien wie Fababohnen oder Felderbsen, muß eine Stärkeverflüssigung mit Hilfe einer α-Amylase vor, nach oder gleichzeitig mit einer Behandlung mit einer SPS-ase durchgeführt werden, die schließlich die Nichtstärke-Polysaccharide in dem Strukturmaterial der Zellwände verflüssigt. Ein detailliertes Beispiel unter Verwendung von Fababohnen ist unten angegeben und bezüglich der Sojabohnen wird auf Tabelle I verwiesen. Die Vorbehandlung der Sojabohnen kann vorzugsweise ein Dampfstrahlkochen sein, das das Löslichmachen des Rückstandes verbessert.
Beispiel 1 15 kg Fababohnenmehl (Farine de Feves der GRANDES MINOTERIES A FEVES DE FRANCE, Paris) wurden in 35 I Wasser suspendiert. 75 g Termamyl 60 L und 18 g CaCh wurden zugegeben. Die Suspension wurde unter Rühren in einem Dampfmantelkessel auf 95 *C erwärmt. Die Suspension wurde dann 60 min bei dieser Temperatur behandelt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt und das 37
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Produkt auf 50 *C gekühlt. 300 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 wurden in 1 I Wasser gelöst und zugegeben. Die Reaktion wurde 440 min lang durchgeführt. Wenn 10 g Fungamyl 800 L mit zugesetzt wurden, wurde die Stärkefraktion im wesentlichen in Disaccharid (Maltose) umgewandelt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 2 min bei 90 · C pasteurisiert. Ein Anteil des Produktes wurde dann gefriergetrocknet und für Stabilitätsuntersuchungen verwendet. Die Probe wurde dann in einer Menge von 10 % Feststoff (Trockensubstanz) gelöst und die Lösung des Produktes blieb tagelang ohne Sedimentation stabil.
Geschmolzenes Fett oder Öl kann leicht in dem Produkt emulgiert werden, wobei ein Endprodukt erhalten werden kann, das Kuhmilch sehr ähnlich ist. Eine Emulsion, enthaltend 3,5 g Öl (Sojabohnenöl) konnte auch tagelang ohne Sedimentation stabil gehalten werden.
Beispiel 2
Sojamehl (Sojamel 13) wurde 25 s , wie in Beispiel 8 beschrieben, bei 150*C mit einem Dampfstrahl gekocht. Das so behandelte Sojamehl wurde sprühgetrocknet und für weitere Untersuchungen, wie im Folgenden beschrieben, verwendet. A: 50 g des mit Wasserdampf behandelten Sojamehls wurden mit 450 g Wasser vermischt und der pH-Wert mit 4,1 ml 6n HCl auf 4,5 eingestellt. Das Gemisch wurde dann im Wasserbad auf 450 C erwärmt und 0,250 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 zu dem erwärmten Gemisch zugegeben, das dann 5 h unter Rühren reagierte. Anschließend wurde das Gemisch 2 min auf 80 *C erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren. Eine 100 ml Probe wurde bei Raumtemperatur 15 min mit 3000 x g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem Ionenaustauscher behandelt und auf die Kohlenhydratzusammensetzung durch HPLC analysiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auch auf den Stickstoffgehalt nach Kjeldahl analysiert und der Feststoffgehalt und der Stickstofflöslichkeitsindex (NSI) und der Feststofflöslichkeitsindex (DSI) berechnet, siehe Ergebnisse in Tabelle Ba I. 100 ml des Reaktionsgemisches, das auf 20°C gekühlt worden war, wurden in ein kalibriertes 100 ml Glas gegeben und 2 Tage bei 4*C gehalten. Die Dispersionsstabiiität (%) wurde gemessen durch Ablesen des Volumens der erhaltenen Dispersionen (Tabelle Ba II) nach 1 und 2 Tagen.
Zu 200 ml des Reaktionsgemisches (bei 20 *C) wurden 8 g Sojabohnenöl gegeben. Es wurde eine Emulsion hergestellt durch 2 min langes Vermischen in einem Waring Blender. Die Emulsionsstabilität (%) wurde, wie oben, nach 1 und 2 Tagen gemessen. B:
Es wurde^ eine Reaktion wie oben durchgeführt, in diesem Falle wurden jedoch 1,00 g der SPS-ase-Zubereitung angewandt. Es wurden die gleichen Arten von Analysen und Stabilitätsmessungen, wie in Absatz A beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabellen Ba I und Ba II angegeben.
Aus der chemischen Analyse der überstehenden Flüssigkeiten geht hervor, daß die Werte für NSI (%) und DSI (%) bei dem Versuch B höher sind als bei dem Versuch A. Die Stabilitätstests, die an den Reaktionsgemischen durchgeführt wurden, zeigen jedoch einen besseren Wert für die Proben A. Dies liegt möglicherweise an der größeren Länge der Peptidkette der Proteine in dem Reaktionsgemisch bei geringerer Enzymmenge.
Aus der durch HPLC gemessenen Kohlenhydratzusammensetzung geht hervor, daß hauptsächlich Mono- und Di-saccharide gebildet worden sind. So sind Oligosaccharide, von denen bekannt ist, daß sie für Diarrhoe und Flatulenz verantwortlich sind, wenn sie Kälbern in zu großen Mengen verabreicht werden, nur in geringen Mengen vorhanden. 38
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Tabelle Ba I
Chemische Eigenschaften der überstehenden Flüssigkeit Versuche Verhältnis von NSI, % * DSI, % HPLC-Ergebnisse Enzymmenge (bei pH = 4,5) (bei pH = 4,5) (Zusammensetzung der neutralen Zucker) zu Substrat % (GewVGew.) A E/S = 0,5% 39,9 62,4 DPi + DP2 79,7% dp3 7,4% DP« 12,2% DP« + 8,1% B E/S = 2,0% 57,0 67,1 DP, + DP2 84,4% dp3 6,1% DP« 3,7% DP«+ 5,7% ’NSI = Stickstofflöslichkeits-Index “ DSI = Feststofflöslichkeits-Index
Tabelle Ba II
Stabilitäts-Tests der Reaktionsmischungen
Versuche Verhältnis von Enzymmenge zu Substrat % (Gew./Gew.) Stabilität-Tests ohne Öl mit Öl Dispersion 1. Tag Dispersion 2. Tag Emulsion 1. Tag Emulsion 2. Tag A E/S = 0,5% 80% 63% 100% 87% B E/S = 2,0% 66% 35% 85% 71%
Ba 2. Herstellung von verzuckerte Stärke enthaltenden Rohmaterialien.
Im Zusammenhang mit der Verzuckerung von Cassava und süßen Kartoffeln und anderen stärkehaltigen pflanzlichen Materialien führt die Zugabe einer SPS-ase-Zubereitung zur Lösung von Viskositätsproblemen. Bei Verwendung einer SPS-ase-Zubereitung ist es möglich, Stärkesuspensionen mit einem Feststoffgehalt Von 25 bis 30 % herzustellen und nach der Verzuckerung kann die Maische fermentiert werden, wodurch ein billiges Äthanol erhalten werden kann.
Beispiel 3
Auf der Basis von frischen und gerösteten süßen Kartoffeln (japanischen) wurde eine Maische mit einem Feststoffgehalt von 24 % hergestellt. Der Stärkegehalt der süßen Kartoffeln betrug ungefähr 70 % des Feststoffgehaltes. Eine Vorverflüssigung mit Hilfe der bakteriellen Amylase von Termamyl ® 60 L in einer Dosis von 0,5 kg/t Stärke wurde durchgeführt durch Erhitzen der Maische auf 90 *C. Die Maische wurde dann 30 min bei 90 *C gehalten. Die Viskosität ψ des Reaktionsgemisches wurde dann mit Hilfe einer Haake-Spindel bei 90 * C gemessen.
Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 55°C gekühlt und der pH-Wert mit 2n H2SO« auf 5,0 eingestellt, Dann wurde eine Verzuckerung eingeleitet durch Zugabe der Glucoamylase SAN 150 (Handelsname der NOVO INDUSTRI A/S) in einer Dosis von 1,75 l/t Stärke. Das Verzuckerungsgemisch wurde dann in drei Teile A, B und C aufgeteilt, die 15 min, wie unten angegeben, mit Enzym behandelt wurden, bevor 39 ΑΤ 398 436 Β die Viskosität gemessen wurde. A: Dieser Teil diente zum Vergleich. Die Viskosität jj2 wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III. B: Die Tricoderma viride-Cellulase von Celluclast® 200 N wurde in einer Dosis von 1 kg/t Feststoffe von süßen Kartoffeln zugegeben. Die Viskosität i»3 wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III. C: Die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 wurde in einer Menge von 0,25kg/t Trockensubstanz der süßen Kartoffeln zugegeben. Die Viskosität m wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III.
Tabelle Ba III
Reaktions-Gemisch Viskosität bei 90 · C Viskosität bei 55 · C vorverflüssigte süße Kartoffeln iji = 770 mPa.s i)2 =2190 mPa.s A - i)2 = 2190 mPa.s B - 7)3 = 1970 mPa.s C - 7)4- = 950 mPa.s
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die Viskosität des Reaktionsgemisches wesentlich verringert werden kann durch die SPS-ase in einer geringen Menge, verglichen mit dem Celluclast® und SAN 150. SAN 150 ist eine von Aspergillus niger produzierte Amyleglucosidase .
Ba 3. Gesamtverflüssigung von Birnen und anderen Früchten.
Wenn ganze Birnen, die mechanisch zerstoßen worden sind, anschließend mit-einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, findet eine vollständige Verflüssigung statt und nach Entfernung von kleineren Mengen Feststoffen wird ein klarer Bimensaft erhalten. Ein ähnliches Verfahren kann auf andere ähnliche Früchte, z.B. Äpfel, angewandt werden.
Beispiel 4
Frische Äpfel wurden mit Hilfe einer Bucher-Zentralmühle grob gemahlen. Die Apfelmaische wurde dann in einem Kessel mit Heizmantel 5 min bei 90 °C pasteurisiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die vermaischten Äpfel wurden dann auf einer Fryma-Mühle mit Korundstein gemahlen, bis die Maische glatt war. Die Maische wurde dann erneut 10 min bei 80'C pasteurisiert und auf 50‘C gekühlt.
Jetzt wurden Enzymreaktionen 30 min bei 50‘C mit einem Contraves-Rheomat 15 durchgeführt, wobei Rühren und Viskositätsmessungen (im Zusammenhang mit einer prozentualen Ablesung auf dem Rheometer bei Geschwindigkeit 13) gleichzeitig durchgeführt wurden. Nach vollständiger Enzym-Reaktion wurden 100 g Proben’ abgezogen und in einem kalibrierten Rohr 15 min bei 3000 x g zentrifugiert. Hierbei wurde der Prozentsatz an Saft und der Prozentsatz an Abscheidungen bzw. Feststoffen gemessen. Der pH-Wert und der Prozentsatz an Refraktometer-Feststoffen als 'Brix wurden ebenfalls gemessen. Tabelle Ba IV zeigt einen Vergleich zwischen der Wirkung von SPS-ase, der Kombination von Celluclast und SPS-ase und der Kombination von Celluclast und Pectinex. Die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 wurde angewandt. 40
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Tabelle Ba IV
Ergebnisse der Gesamt-Verflüssigungsversuche mit Apfel-Maische bei 50 * C, 30 min SPS-ase g/hl Celluclast® 200 Pectinex®* g/hl 3x End-Viskosität Zentrifugation Saft Maische I g/hl Maische (%) % Saft % Feststoffe pH • Brix 0 0 0 100 59 41 3,8 9,7 25 0 0 19 81 19 3,5 10,5 50 0 0 15 79 21 3,5 10,7 50 50 0 4.8 83 17 3,5 10,8 3.8 83 17 3,1 12,5 0 50 200 9.5 83 17 3,2 12,9 0 50 2000 4.0 82 18 3,1 13,2 * Von Abspringen einiger produzierte Pectinase.
Ba 4. Herstellung von Saft durch Behandlung von Früchten und Gemüsen.
Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen gut geeignet sind zur Herstellung von Saft durch Behandlung von verschiedenen Früchten, Beeren und Gemüsen, z.B. Karotten, Erbsen, Tomaten, Äpfeln, Birnen, Schwarze Johannisbeeren, Bohnen und Kohl. Hierbei wird eine bessere Ausbeute an Saft sowie eine bessere Extraktion von Färb- und Geschmacksstoffen erreicht, verglichen mit der handelsüblichen Pectinase-und Cellulase-Zubereitung.
Beispiel 5
Es wird auf Beispiel 4 verwiesen, bei dem die SPS-ase-Zubereitung verglichen worden ist mit den im Handel erhältlichen üblichen Cellulase- und Pectinaseprodukten Celluclast® 200 L und Pectinex® 3x. Aus der Tabelle geht hervor, daß die Ausbeute an Saft leicht verbessert werden kann, wenn so wenig wie 50 g/hl SPS-ase verwendet werden, verglichen mit 2000 g/hl Pectinex®, beide zusammen mit 50 g/hl Celluclast®. Auch war die Viskosität etwas geringer. So scheint es, daß die SPS-ase ungefähr 40 mal wirksamer ist als Pectinex.
Ba 5. Behandlung im Zusammenhang mit der Extraktion oder den Pressen von Zuckerrohr oder Zuckerrüben.
Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, die Ausbeute im Zusammenhang mit einfachen Extraktionsverfahren zu verbessern, wenn die SPS-ase-Zubereitung angewandt wird zur Behandlung von Zuckerrohr oder Zuckerrüben vor und/oder während der Extraktion oder dem Pressen. Auch kann der Rückstand (Bagasse) mit der SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, wodurch er teilweise in fermentierbare Zucker umgewandelt wird, die als Ausgangsmaterial zur Äthanolgärung verwendet werden können.
Beispiel 6 10 kg Rückstand von Zuckerrüben (Pulpe), der erhalten worden war durch kontinuierliche Gegenstromextraktion in einem DDS-Diffuser bei Nakskov Sugar Factory, wurden zweimal in einer Fryma-Mühle (Typ MZ-110) vermahlen. Während des Mahlvorganges wurde Prozeßwasser zugegeben. 300 g Portionen Pulpe wurden jetzt 18 h bei 45 "C mit Enzym behandelt unter Verwendung der in Tabelle Ba V angegebenen Mengen. Das trockene Enzymprodukt (KRF 68) wurde zu der Pulpe zugegeben, die während der ersten Stunde mit einem Stab gerührt wurde. Daraufhin war die Pulpe so weit verflüssigt, daß die restliche Zeit erfolgreich magnetisch gerührt werden konnte. Am Ende der Reaktion wurde der pH-Wert gemessen (während des Beginns der Reaktion wurde keine pH-Korrektur vorgenommen) und das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, bis eine klare überstehende Flüssigkeit erhalten wurde. Die Bestimmung des Feststoffgehalts wurde an den Reaktionsgemischen und an den überstehenden Flüssigkeiten vorgenommen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde der Prozentsatz an gelösten Feststoffen 41
AT 398 436 B berechnet. Korrekturen für den Gehalt an löslichen Feststoffen des Enzymproduktes wurden bei allen Berechnungen vorgenommen.
Die überstehenden Flüssigkeiten 2, 3 und 4 wurden durch Ionenaustauscher behandelt und durch HPCL auf die Kohlenhydratzusammensetzung untersucht.
Tabelle Ba V
Reaktionsbedingungen: M = 300 g S = 4,18% Feststoffe E/S wie oben angegeben pH nicht eingestellt T = 45 *C t = 18
Ergebnisse bei der enzymatischen Verflüssigung von Rüben-Pulpe
Versuch Nr. Verhältnis der Enzymmenge zu Feststoffen E/S % End-Messungen Reaktionsmischung überstehende Flüssigkeit pH (Endwert) % Feststoffe % Feststoffe % gelöste Feststoffe 1 0 5,5 4,18 0,0 0,0 2 0,35 3,6 3,85 2,58 66,9 3 0,56 3,5 3,81 2,56 66,2 4 1,02 3,5 3,86 2,73 70,4 5 1,58 3,3 3,17 2,34 73,4 6 3,10 3,4 3,23 2,49 76,4 7 7,52 3,4 2,66 2,18 80,5
Tabelle Ba VI HPLC-Werte
Zucker-Art (Neutral) Versuch Nr. 2 3 4 % neutrale Zucker Hochmolekular (DP4 + ) 43,6 31,9 25,3 Disaccharide 4,6 4,8 - Glucose 20,4 23,7 27,8 Galactose 5,0 5,9 7,3 Fructose/Arabinose 26,4 32,2 33,2 Galacturonsäure nicht gemessen
Alle entsprechend der obigen Tabelle Ba VI entstandenen Zucker konnten Zu Alkohol vergoren oder für andere Zwecke verwendet werden. 42
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Ba 6. Herstellung von Sojamilch.
Sojamilch kann leicht durch vollständige Verflüssigung von gemahlenen Sojabohnen und anschließende Homogenisierung des erhaltenen Gemisches hergestellt werden. Sojamilch wird häufig hergestellt durch Einweichen von Sojabohnen in siedendes Wasser, Mahlen der eingeweichten Bohnen und Extraktion mit Wasser und anschließende Trennung des unlöslichen Rückstandes, z.B. von Proteinen und Polysacchariden. Um die Ausbeute an Sojamilch zu verbessern, können diese unlöslichen Rückstände durch Umsetzung mit der SPS-ase verflüssigt werden.
Beispiel 7
Das Sojamilch verfahren wird durch die folgende Reihe von Enzymreaktionen erläutert, wobei Berechnungen des Protein-Löslichkeitsindex (PSI, %) und des Feststoff-Löslichkeitsindex (DSI, %), die nach Abtrennung bei pH 7 erhaltenen Ausbeuten zeigen (siehe Tabelle Ba VII). Die Enzymreaktionen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Substrat: Vollfettes Sojamehl (Dansk Sojakagefabrik A/S) Menge des Reaktionsgemisches: 220 g Menge des Substrats: 20 g Temperatur: 50 °C pH: 4,5 (6n HCl) Reaktionszeit: Reihe A1 h Reaktionszeit: Reihe B 0,5 - 6 h Enzym: SPS-ase (KRF 68) Enzymmenge: Reihe A: E/S-Verhältnis (Gew./Gew.) 0 - 8,0 Reihe B: E/S-Verhältnis (Gew./Gew.) 1,0
Nach der Reaktion wurde der pH-Wert mit Hilfe von 4n NaOH auf 7 eingestellt und die Trennung durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 x g durchgeführt. 43
5AT 398 436 B
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ba 7. Behandlung zur Erhöhung der rückgewinnbaren Menge an löslichen Kaffeebestandteilen.
Es hat sich gezeigt, daß die Behandlung von Kaffeebohnen bei verschiedenen Verfahrensstufen während der Herstellung von Instantkaffee zu einer erhöhten Ausbeute an löslichen Kaffeebestandteilen 44
AT 398 436 B führt. So können z.B. verbrauchte Kaffeerückstände (Kaffeesatz) oder grüne Bohnen enzymatisch mit günstigen Ergebnissen behandelt werden.
Bb 1. Verhinderung und/oder Abbau des "Schleiers" in Apfel- oder Birnensaft.
Nach der Herstellung von Apfelsaft oder Bimensaft und anderen Fruchtsäften, die klar sein sollen und die vorher mit üblichen Pectinase- und Cellulasezubereitungen behandelt worden sind, um die Bildung einer Trübung zu vermeiden, können "Schleier” auftreten. Es hat sich gezeigt, daß die SPS-ase-Zubereitüngen gut geeignet sind zum Abbau derartiger Schleier, die hauptsächlich aus Araban, das an Proteine gebunden ist, bestehen.
Beispiel 8
Birnensaftkonzentrat, das hergestellt worden war durch enzymatische Verflüssigung von Rückständen von der Herstellung von Birnenkonserven unter Verwendung von Celluclast® und Pectinex®, wurden beim Stehen wolkig. Der "Schleier" wurde isoliert und mit 0,01 n H2SO4. 24 h hydrolysiert und durch HPLC analysiert. Das Chromatogramm zeigte Arabinose und kleine Mengen an Oligosacchariden.
Durch Inkubation von 0,5 % (GewTVol.) dieses Kohlenhydrats in 1 mMol Acetatpuffer, 3 h bei pH 4,5 und 40 *C mit SPS-ase (KRF 68 und KRF 92 1 : 1) mit einer Enzymkonzentration von 0,05 % (Gew./Vol.) zeigte es sich, daß 84 % der ursprünglichen schleierbildenden Kohlenhydrate (Feststoffe) in Arabinose umgewandelt wurden.
Auch ein verdünntes Birnenkonzentrat (20* Brix) wurde 2 h bei 40’C mit einer Enzymmenge von 0,15 % (Gew./Vol.) der oben erwähnten SPS-ase oder mit 1 % (Gew./Vol.) eines-Handelsproduktes, das eine Pilz pectinase ist und als Clarex® bezeichnet wird, behandelt. Es zeigte sich, daß die SPS-ase imstande war, die relative HPLC-peak-Fläche eines arabanartigen Schleiers um 86 % zu verringern während die entsprechende Verringerung mit Clarex® (in einer wesentlich höheren Menge als die SPS-ase-Zubereitung) nur 78 % betrug.
Bb 2. Anwendung als Klärmittel für Weißwein.
Es hat sich gezeigt, daß Weißweine, die eine sehr unerwünschte Trübung zeigen, wirksam mit Hilfe von SPS-ase geklärt werden können. Es hat sich gezeigt, daß das Trübung bildende Material hauptsächlich aus Arabinogalactanen besteht, die an Hydroxyprolinreste in einem Zellwand-Strukturprotein gebunden sind.
Bb 3. Herstellung von ISSPH oder anderen pflanzlichen Proteinhydrolysaten.
Vor der, Abtrennung des ISSPH (isoelektrisch löslichen Sojaproteinhydrolysats) oder anderer pflanzlicher Proteinhydrolysate aus der Aufschlämmung, wie in der US-PS 4 100 024 oder in Process Biochemistry, Bd. 14, Nr. 7 (1979), S. 6 - 8 und 10-11 beschrieben, kann das Reaktionsgemisch mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden. Hierdurch wird eine leichtere Trennung erzielt.
Bb 4. Maische-Enzym für die Brauereiindustrie.
Bei der Herstellung von Bier beeinflussen Kohlenhydrate der Ausgangsmaterialien, z.B. die ß-Glucane von Malz und Gerste, die Viskosität und Filtrierbarkeit des Extrakts. Die Zugabe von SPS-ase während des Maischens verringert die Viskosität des Extrakts und verbessert die Filtrierbarkeit und die Ausbeute an Extrakt. Darüberhinaus führt die Zugabe von SPS-ase während des Maischvorganges zu einer Verbesserung der Vergärbarkeit des Extrakts und des Stickstoffgehalts in dem Extrakt.
Beispiel 9
Im Labor wurden 50 g gemahlene Körner , bestehend aus 50 % Malz und 50 % Gerste mit 275 g Wasser (15 % Feststoffgehait) nach dem folgenden Maischdiagramm vermaischt: 52'C (60 min)/63* C (60 min)/76’C (30 min).
Um die Wirkung der SPS-ase zu zeigen, wurden vier Versuche durchgeführt, siehe die im folgenden angegebene Tabelle, wobei die Enzyme während des Maischvorgangs zugegeben wurden (pH der Maische 5,5 bis 6,0). 45
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Enzym keines Cereflo SPS-ase (KRF 68) Aktivität der /S-Glucanase/g 0 200 BGU 1630 FBG 1630 FBG Menge an Enzym per kg Körner 0 1,5 g 0,05 g 0,18 g Gesamtmenge der Enzym-Aktivitäts einheiten per kg Körner 0 300 BGU 80 FBG 300 FBG Filtrationsgeschwindigkeit des Extrakts nach 10 min 120 ml 135 ml 160 ml 170 ml Viskosität des ExtraktslO* Balling (25° C) 1,52 mPa.s 1,36 mPa.s 1,36 mPa.s 1,30 mpa.s bildung von Bier zu verbessern. SPS-ase zeigt auch eine Wirkung auf Proteine, die für die beim Kühlen auftretende Trübung verantwortlich sind.
Bb 6. Mittel zur leichteren Entfernung von Mandelhäutchen. Während der mechanischen Entfernung von Mandelhäutchen nach dem Blanchieren von Mandeln, wird ein bestimmter Anteil von Mandelhäutchen nicht entfernt. Es hat sich gezeigt, daß eine Enzymbehandlung der Mandeln zu einer Verringerung des erwähnten Prozentsatzes führt.
Bc 1. Zersetzung unterschiedlicher Abfallprodukte.
Im Zusammenhang mit bestimmten Herstellungsverfahren werden große Mengen kohlenhydrathaltiger Abfallprodukte gebildet. Z.B. ist dies der Fall im Zusammenhang mit der Herstellung von Sojaisolat durch Wasserextraktion und Säureausfällung, Sojamilch und Sojaquark (einer speziellen Art von japanischem Käse). Auch in diesem Zusammenhang kann Abfailpulpe aus z.B. Äpfeln, Birnen oder Zitrusfrüchten erwähnt werden. Es hat sich gezeigt, daß eine SPS-ase-Zubereitung imstande ist, diese kohlenhydrathaltigen Abfallprodukte vollständig zu verflüssigen und vergärbare Zucker zu bilden, die als Ausgangsmaterial zur Äthanolgärung verwendet werden können.
Beispiel 11
Bei der üblichen Herstellung von Sojamilch oder Sojaquark werden Sojabohnen häufig in siedendem Wasser eingeweicht, gemahlen und mit heißem Wasser extrahiert, woraufhin eine Trennung durchgeführt wird. Der Rückstand von dieser Trennung ist das Material, das für diesen Versuch angewandt wird. Die flüssige Phase ist die Sojamilch, die weiter zur Herstellung von Sojaquark angewandt werden kann. 10 kg ganze Sojabohnen, erhalten von Aarhus Oliefabrik A/S, wurden gleichzeitig mit 70 I siedendem Wasser in einer Fryma-Mühle Typ MZ 110 vermahlen. Die gemahlene Aufschlämmung wurde dann 15 min oberhalb 85 °C gehalten, um die natürlichen Bohnenenzyme zu inaktivieren, die den bekannten Sojabohnenbeigeschmack erzeugen. 5 I dieser Sojabohnenaufschlämmung wurden dann im Labor 15 min mit 3000 x g zentrifugiert. Die Analyse zeigte, daß der Rückstand 20,45 % bzw. 20,06 % Feststoffe (Doppelbestimmungen, berechnetes Mittel 20,26 %) enthielt. Es wurde langsam 6n HCl zugegeben und mit einem Spatel in den Rückstand eingearbeitet, bis ein pH-Meter 4,50 zeigte, wenn die Elektrode direkt in die Masse eingetaucht wurde.
In einem 500 ml-Becher Glas wurden bei 50 * C Enzymreaktionen an 2 x 200 g der Masse mit zwei verschiedenen Mengen an SPS-ase (KRF 68) durchgeführt, nämlich E/S = 0,5 %, bezogen auf die Feststoffe und E/S = 3,0 %, bezogen auf die Feststoffe. Das trockene Enzym wurde zu der Masse zugegeben. Während der ersten 1 bis 2 h wurde mit einem Spatel gerührt und anschließend war die Menge soweit verflüssigt, daß mit einem Magnetrührer erfolgreich gerührt werden konnte. Die Gesamtreaktionszeit betrug 21 h. Während der Reaktion wurde die Osmolalität mit einem Osmometer (Advanced Digimatic 3DII von Advanced Instruments Inc.) gemessen. Die Ergebnisse in Tabelle Bc I zeigen den Verlauf der Reaktion. Am Ende des Versuchs wurde das Gemisch 15 min bei 3000 x g zentrifugiert. An der Oberfläche der überstehenden Flüssigkeit trat eine Ölschicht auf, deren Volumen bestimmt wurde. Als Bodenschicht trat eine lockere Schlemmschicht auf. Die überstehende Flüssigkeit einschließlich des Öls wurde mit einer Pipette entfernt. Das Öl wurde mit der klaren wässrigen Phase durch Homogenisieren zusammengegeben und eine Probe zur Bestimmung des Feststoffgehalts abgezogen. Die in Tabelle Bc I angegebenen 46
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Ergebnisse zeigen deutlich, daß dieses Abfallprodukt durch enzymatische Reaktion verflüssigt werden kann und daß rohes Öl, wie in Abschnitt A 4 angegeben, erhalten werden kann. Nach Gewinnung des Öls kann der gelöste Rückstand auf verschiedene Weise verwendet werden, z.B. zur Fermentation zu wertvollen Verbindungen oder zum Einengen und Trocknen und anschließende Verwendung als Futtermittel oder Nahrungsmittelprodukt oder nach weiterer Reinigung zur Herstellung wertvoller Produkte.
Tabelle Bc I Bei der Verflüssigung von Sojamilch und Sojaquark erhaltene Ergebnisse.
Reaktionsbedingungen und Ergebnisse Versuch A Versuch B Menge des Rückstands 200 g 200 c Menge anSPS-ase (KRF-68) 0 ,20 g 1 ,20 g Temperatur. 50°C 50eC pH 4 I50 4 »5° Reaktion saei.t 21 h 21 h. Ergebnisse gemessen Osmo- £Os- Osmo- ^ Os- mit dem Osmometer w lalität mola- L· lalität molali- während der Reaktion min mOsm lität min mOsm tat mOsm mOsm · 0 287 0 0 282 0 10 313 26 10 368 86 Δ Osmolalitätist der - - - 25 497 215 korrigierte Wert für die Osmolalität der Mischung bei t * 0 40 2?! 391 ffl 104 ?H 45 lIS 601 H! 319 ti? 1260 907 620 1260 1145 863 t * 0
Reaktionsmischung Feststoffe 20,3 % 20,7% überstehende Flüssig- keit: Feststoffe 18,0% 19,4% überstehende Flüssigkeit: Ölgehalt 8 - 10% 8 - 10% ^Berechnung % Lösliche Feststoffe 88,6% 03 os 1
Bc 2. Verzuckerung und gleichzeitige Fermentation.
Kohlenhydrathaltige Pflanzenmateriaiien, z.B. Knollen, wie Jerusalem-Artischocken, Kartoffeln, süße Kartoffeln, Cassawa oder Pulpe von solchen Knollen, d.h. das nach Entfernung der extrahierten Komponenten verbleibende Material können durch Behandlung mit einer SPS-ase-Zubereitung verzuckert und gleichzeitig die erhaltenen vergärbaren Saccharide zu Äthanol vergoren werden. 47
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Beispiel 12
Die Herstellung von Äthanol durch Vergärung der abgebauten inulinhaltigen Jerusalem-Artischocken wurde im Labormaßstab durch gleichzeitige Verzuckerung mit SPS-ase und inulinase und bei vier unterschiedlichen Vorbehandlungen der Jerusalem-Artischocken untersucht. SPS-ase: Es wurde die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 angewandt.
Inulinase: Die Inulinase wurde gebildet durch Fermentation von Asp. ficuum (CBS 55 565). Die Inulinaseaktivität wurde bestimmt, wie auf S. 99 von Research Disclosure Nr. 21234 (Dezember 1981) S. 456 - 458 angegeben.
Vergärung im Labor: 150 g Anteile der vorbehandelten Maische (später beschrieben) wurden nach Zugabe von 4,5 g Bäckerhefe und 1 ml einer 4 %-igen Lösung von Pluronic als Antischaummittel vergoren. Die Fermentationskolben waren mit C02-Fallen, enthaltend 98 % Schwefelsäure, versehen und die Gärung wurde durch Messung des Gewichtsverlustes aufgrund von freigesetztem CO2 verfolgt. Der Kolbeninhalt wurde während der bei 30 · C durchgeführten Gärung gerührt. Es wurden für jeden untersuchten Parameter drei Kolben angewandt.
In Tabelle Bc II ist der durch Freisetzung von CO2 auftretende Gewichtsverlust in Äthanol umgerechnet, angenommen daß 1 Mol freigesetztes CO2 1 Mol C2H5OH, d.h. 1 g CO2 ~ ^ g C2H5OH entspricht.
Vorbehandlung der Artischocken:
Behandlung A: 14,1 kg Artischocken (22,8 % Feststoffgehalt) wurden 20 min bei 140‘C und 4 bis 5 bar gekocht (Henze). Das Gewicht nach dem Kochen betrug 19,0 kg (~ 16,9 % Feststoffgehalt). Die Gärung wurde direkt an der Maische durchgeführt.
Behandlung B: Gewaschene und in Scheiben geschnittene Artischocken wurden mit Wasser (1 : 1) vermischt in einem Waring-Mischer. Die Maische wurde dann 1 h bei 85 · C und pH 4,5 behandelt.
Behandlung C: Wie B, jedoch ohne Einstellung des pH-Werts.
Behandlung D: Wie B, aber ohne Wärmebehandlung und ohne pH-Wert-Einstellung.
Ergebnisse: In Tabelle Bc II zeigen die Ergebnisse die Wirkung des Zusatzes von SPS-ase zu der vorbehandelten Maische auf die Äthanolausbeute. Eine deutliche Verbesserung der Äthanolausbeute wurde bei allen vorbehandelten Maischen erzielt, wenn SPS-ase zugesetzt wurde.
Tabelle Bc II
Fermentations-Ergebnisse im Zusammenhang mit der gleichzeitigen Vergärung und enzymatischen Verzuckerung von Jerusalem Artischoken. Vorbehandlung Zugabe von Inulinase SPS-ase E/S Verlust an CO2 (g) % entstandenes zu 1 g Feststoff % nach 42 - 44 h Gärung Äthanol im Verhältnis zu Feststoffen A 1,5 0 7,65 ± 0,05 31,5 1,5 0,27 8,07 ± 0,08 33,2 B 1,5 0 4,85 ± 0,03 29,7 1,5 0,40 5,41 ± 0,03 33,1 C 1,5 0 5,70 ± 0,05 34,8 1,5 0,10 5,97 t 0,01 36,5 1,5 0,20 6,13 ± 0,06 37,5 1,5 0,30 6,13 ±0,00 37,5 1,5 0,40 6,18 ± 0,05 37,8 D 1,5 0 5,77 ± 0,02 35,3 1,5 0,10 5,89 ± 0,00 36,0 1,5 0,20 6,04 ± 0,11 36,9 1,5 0,30 6,01 ± 0,01 36,7 1,5 0,40 6,02 ± 0,03 36,8 0 0,40 5,48 ± 0,02 33,5 48
AT 398 436 B
Bc 4. Anwendung als Backhilfe.
Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen ausgezeichnet geeignet sind als Backhilfen. So ist es, wenn eine SPS-ase-Zubereitung zu dem trockenen Mehl vor der Herstellung des Teiges zugesetzt wird, möglich, ein Brot mit einer besseren Qualität bezüglich Volumen, Krume und Geschmack zu erhalten. So ist es möglich, ein Brot hoher Qualität aus einem Weizenmehl geringer Qualität herzustellen, wenn eine SPS-ase-Zubereitung als Zusatz verwendet wird.
Bc 5. Verbesserung der Ausbeute an Alkohol und an Biomasse während der Vergärung von Sulfitablauge von der Papierherstellung.
Es hat sich auch gezeigt, daß die Ausbeute an Ethanol verbessert werden kann, wenn Sulfitablauge von der Papierherstellung mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt wird, bevor sie als Kohlenhydratquelle zur Äthanolgärung, verwendet wird. Sulfitablauge von der Papierherstellung kann auch angewandt werden zur Herstellung von Biomasse, z.B. Einzelzellprotein durch Fermentation und auch in diesem Falle wird die Ausbeute an Biomasse verbessert, wenn die Sulfitablauge vorher mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt worden ist. Auch können der Abbau aufgrund des Vorhandenseins der SPS-ase-Zubereitung sowie die Fermentation gleichzeitig durchgeführt werden.
Bc 6. Entwässerung von biologischen Schlammprodukten. Während der üblichen Wasserextraktion von vielen biologischen Materialien aus Pflanzenrohmaterialien entstehen große Volumina an unlöslichem Rückstand, bestehend aus großen Mengen gequollener Polysaccharide. Das ist z.B. der Fall, wenn Sojamiich, Sojaquark oder Sojaisolat durch Wasserextraktion von Sojabohnen, entfettetem Sojamehl oder weißen Flocken hergestellt werden. Das strukturell gequollene Polysaccharidmaterial kann dann in geringem Ausmaß mit SPS-ase behandelt werden, wodurch die Netzstruktur des Materials geöffnet wird und nur geringe Mengen Kohlenhydrate gelöst werden. Dadurch wird das Material entwässert und folglich ein höherer Feststoffgehalt in dem Schlamm erhalten im Vergleich mit einem Produkt, das ohne Enzymbehandlung erhalten wird. So führt das Enzymverfahren zu dem Vorteil eines wesentlich geringeren Energieverbrauchs zur Entfernung von Wasser durch Trocknen und es eröffnet auch die Möglichkeit, ein billigeres trockenes Tierfuttermittel oder Ballaststoffe für Futterzwecke herzustellen.
Bc 7. Silage-Hilfsmittel.
Es ist bekannt. Enzyme als Silage-Hilfsmittel zuzusetzen, um die Geschwindigkeit des Silierungsprozesses und dje Fermentation der Silage zu verbessern. Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen besser sind im Vergleich mit bekannten enzymatischen Silage-Hilfen. Übersicht über die Figuren, auf die vorher Bezug genommen worden ist. 49

Claims (7)

  1. AT 398 436 B Fig. Nr. Bezieht sich auf stellt dar 1 allgemeinen Teil der Beschreibung Bindungswirkung zwischen SPS und Sojaprotein 2 allgemeinen Teil der Beschreibung Fließschema, das die Herstellung von SPS beschreibt 3 Abschnitt 2 Eichkurve für HPLC-Gel-Filtrations-Chromatographie 4 Abschnitt 2 HPLC-Gei-Filtrations-Chromatogramm von SPS 5 Abschnitt 2 HPLC-Gel-Filtrations-Chromatogramm von durch SPS-ase abgebautem SPS 6 Abschnitt 2 und 3 HPLC-Gel-Filtrations-Chromatogramm der überstehenden Flüssigkeit von SPS, inkubiert mit Sojaprotein 7 Abschnitt 2 HPLC-Gel-Filtrations-Chromatogramm der überstehenden Flüssigkeit von abgebautem SPS inkubiert mit Sojaprotein 8 Abschnitt 3 HPLC-Gel-Filtrations-Chromatogramm von APS, abgebaut durch Pectolyase g Abschnitt 3 HPLC-Gel-Filtraticns-Chromatogramm von APS, abgebaut durch SPS-ase 10 Abschnitt 3 HPLC-Gel-Filtrations-Chromatogramm von SPS, behandelt mit Pectolyase Patentansprüche 1. Verfahren zum Abbau von Polysacchariden, vorzugsweise von Zellwandpolysacchariden von Pflanzen, mit Hilfe einer Carbohydrase, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carbohydrase (SPS-ase), die gebildet worden ist mit Hilfe von Aspergillus aculeatus CBS 101.43 und/oder Aspergillus japonicus IFO 4408, oder eine davon abgeleitete SPS-ase, und die fähig ist zum Abbau von löslichen Soja-Polysacchariden (Soja-SPS) unter geeigneten Bedingungen zu Abbauprodukten, die sich an Protein in einem wässerigen Medium in einem geringeren Ausmaß anlagern, als sich das Soja-SPS vor dem Abbau an das gleiche Protein unter entsprechenden Bedingungen anlagern würde, in einem wässerigen Medium mit dem abzubauenden Substrat zusammengebracht wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carbohydrase, die fähig ist, Soja-SPS in einem wässerigen Medium zu Abbauprodukten abzubauen, die sich an pflanzliches Protein in dem wässerigen Medium in geringerem Maß anlagern, als Soja-SPS vor dem Abbau sich an das gleiche pflanzliche Protein in dem wässerigen Medium angelagert hätte, in einem wässerigen Medium mit dem abzubauenden Substrat zusammengebracht wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carbohydrase, die fähig ist, Soja-SPS in einem wässerigen Medium mit einem pH-Wert, der nicht mehr als 1,5 von 4,5 abweicht, zu Abbauprodukten abzubauen, die sich an Sojaprotein in dem wässerigen Medium in einem geringeren Ausmaß anlagern, als das Soja-SPS sich vor dem Abbau an das Sojaprotein in dem wässerigen Medium angelagert hätte, in einem wässerigen Medium mit dem abzubauenden Substrat zusammengebracht wird.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carbohydrase, die fähig ist, Soja-SPS zu Abbauprodukten abzubauen, die nach voll ständigem Abbau sich an pflanzliches Protein in einem Ausmaß von weniger als 50 %, insbesondere weniger als 20 %, anlagern, als das Soja-SPS sich vor dem Abbau an das pflanzliche Protein in dem wässerigen Medium angelagert hätte, in einem wässerigen Medium mit dem abzubauenden Substrat zusammengebracht wird.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Abbau durchgeführt wird durch Isolierung oder Extraktion eines anderen biologischen Bestandteils als Sojaprotein und verwandten Pflanzenproteinen aus einem biologischen Rohmaterial, wobei die SPS-ase-Zubereitung im 50 AT 398 436 B wesentlichen frei ist von irgendeinem Enzym, das imstande ist, das biologische Material abzubauen.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Reaktionsprodukte der Polysaccharide unabhängig davon, ob sie erwünschte Endprodukte oder Abfallprodukte sind, gleichzeitig mit oder nach der Enzymbehandlung weiter behandelt werden.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als weitere Behandlung eine Alkoholgärung durchgeführt wird, wenn eines der Reaktionsprodukte ein vergärbarer Zucker ist. Hiezu 10 Blatt Zeichnungen 51
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