IT8224870A1 - Miglioramento in e relativo a un enzima per decomposizione di un carboidrato ad alto peso molecolare, il carboidrato isolato ad alto peso molecolare, un metodo per la selezione di un microorganismo produttore di tale enzima e un metodo per la produzione di tale enzima - Google Patents

Miglioramento in e relativo a un enzima per decomposizione di un carboidrato ad alto peso molecolare, il carboidrato isolato ad alto peso molecolare, un metodo per la selezione di un microorganismo produttore di tale enzima e un metodo per la produzione di tale enzima Download PDF

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Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:
"MIGLIORAMENTO IN E RELATIVO A UN ENZIMA PER DECOMPOSIZIONE DI UN CARBOIDRATO AD ALTO PESO MOLECOLARE, IL CARBOIDRATO ISOLATO AD ALTO PESO MOLECOLARE, UN METODO PER LA SELEZIONE DI UN MICROORGANISMO PRODUTTORE DI TALE ENZIMA E UN METODO PER LA PRODUZIONE DI TALE ENZIMA"
R I A S S U N T O
La presente invenzione riguarda un miglioramento in e relati vo a un enzima per decomposizione di un carboidrato ad alto peso molecolare, il carboidrato isolato ad alto peso molecolare, un metodo per la selezione di un microorganismo produttore di tale enzima e un metodo per la produzione di tale enzima. L?enzima,in grado di decomporre un carboidrato ad alto peso molecolare, abbreviato SPS (soluble polisaccharide, cio? polisaccaride solubile) ? definito SPS-asi. La SPS-asi ? in grado di decomporre SPS in prod?tti di decomposizione che si attaccano alla proteina in un mezzo acquoso in misura minore dello SPS prima della decomposizione. Il metodo per la selezione di microorganismi produttori di SPS-asi ? basato sul fatto che SPS ? la principale fonte di carbonio in un mezzo di crescita e su un saggio qualitativo su piastra SPS-agar.
E' descritto un metodo per la produzione di una SPS-asi per mezzo di un ceppo depositato di Asp. aculeatus. La SPS-asi ha inoltre utilit? nell'industria ortofrutticola e per la produzione di succhi e di vino.
DESCRIZIONE DELL' INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto miglioramenti in e relativi a un enzima per la decomposizione di un carboidrato ad al to peso molecolare, il carboidrato ad alto peso molecolare iso lato, un metodo per la selezione di un microorganismo produtto re di tale enzima e un .metodo per la produzione di tale enzima. Nel brevetto belga n. 882.769 ? descritto un metodo per la pr? duzione di un prodotto proteico vegetale purificato (pvp) mediante rimozione enzimatica del residuo, senza dissoluzione e riprecipitazione della proteina. La purezza del pvp otteni_ bile mediante il metodo noto non ? soddisfacente e perci? ? aperta a miglioramenti. Negli esempi ? stata dimostrata una purezza del pvp dell'85% circa. Anche se ? possibile ottenere un pvp del 90% circa di purezza, secondo il metodo,noto, ci? ? ottenibile solo con certuni materiali di partenza pretrattati, per esempio concentrato di proteina di soia. Sareb be auspicabile essere in grado di ottenere una purezza del pvp attorno al 90% o superiore con uno spettro molto pi? ampio di materiale di partenza, in particolare farina di soia . sbucciata e sgrassata.
L'invenzione ? basata sulla sorprendente scoperta che una certa parte del prodotto di decomposizione del residuo, come appare durante il trattamento enzimatico sopra indicato, cio? un carboidrato ad alto peso molecolare idrosolubile, si atta? ca alla parte della proteina vegetale, come verr? spiegato pi? avanti dettagliatamente. Questo, naturalmente, si risolve in una minore purezza della proteina. Inoltre ? stato trovato che questo carboidrato ad alto peso molecolare ha la capacit? di legarsi a proteine di origine animale.
Cosi, un oggetto dell'invenzione ? di fornire un enzima per la decomposizione del carboidrato ad alto peso molecolare sopra indicato, che aprir? la possibilit? di produzione di un pvp con aumentata purezza, e un metodo per la produzione di tale enzima.
La base dell'invenzione pu? essere descritta nel seguente modo, facendo riferimento alla figura 1, in cui viene indicato solo il materiale esistente come solidi indisciolti, mentre vengono tralasciati tutti i surnatanti. Un carico di farina di soia fu suddiviso in due parti uguali, la parte I e la parte II (colon na a nella figura 1). La parte I fu decomposta proteoliticamen te a un valore di pH di circa 8 per mezzo di ALCALASE (un enzi_ ma proteolitico prodotto per mezzo di B. licheniformis e commer ciato da NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvaerd, Danimarca), e poi ulteriormente lavato a pH attorno a 8 per eliminare l'intera quantit? di proteina, e il residuo fu separato dal sum atante e lavato (vedi parte I, colonna a e b, figura 1). In questo m<> do fu isolato un residuo puro (indicato come I) (colonna b in figura 1). La parte II della farina di soia non fu trat tata; per brevit? il residuo della parte II viene definito residuo II (colonna b in figura 1). Ora, sia il residuo I sia la parte II sono decomposti per mezzo di una pectinasi commerciale cio? PECTINEX (un enzima pectolitico prodotto da Schweizerische Ferment A/G, Basilea, Svizzera)(vedi colonna b e c in figura 1). E' stato sorprendentemente trovato che la parte indisciolta del residuo I ? molto pi? piccola della parte indisciolta del re9i^ duo II, sulla base di bilanci d'azoto e di massa di materia Becca, vedi figura 1, dove le aree tratteggiate nella colonna c corrispondono a materiali insolubili non-proteici nello stadio sopra indicato. Inoltre, se il sum atante dal residuo I trattato con pectinasi viene posto insieme a una sospensione di proteina di soia a pH 4,5, un polisaccaride nel sum atante viene legato alla proteina di soia. Questo polisaccaride nel sum atante del reeiduo I, che ? una parte del prodotto di decomposizione di residuo e che ? facilmente solubile in acqua in assenza di pr? teina di soia, ma legato alla proteina di soia al punto isoelet. trico della proteina di soia o attorn o ad esso, se ? presente la proteina di soia, viene definito SPS (Soluble Polisaccharide, cio? Polisaccaride Solubile), vedi figura 1. Il SPS ha una distribuzione di peso molecolare tra 5x 10 e 4,9 x 10 . La pr? duzione di SPS isolato appare dallo schema di lavorazione mostrato in figura 2, che comprende anche alcuni dei procedimenti descritti in figura 1. Cos?, il problema ? di trovare un enzima in grado di decomporre SPS in maniera tale che i prodotti di d? composizione dello SPS non leghino la proteina di soia o leghino la proteina di soia in un grado molto inferiore a quello in cui SPS lega la proteina di soia.
Sebbene la descrizione si riferisca specificamente a proteina di soia, l'invenzione non ? ristretta a proteina di soia, ma comprende tutti i tipi di proteine vegetali, vedi per esempio le proteine citate nel brevetto belga n. 882.769, pagina 1.
Ora, in accordo con 1'invenzione, ? stato trovato che mediante screening per la capacit? di decomporre SPS di soia, ? possibi^ le selezionare microorganismi in grado di produrre un composto che mostra un'attivit? enzimatica effettivamente decomponente lo SPS di soia, d'ora in poi definito per brevit? come SPS-asi. Cos? l'invenzione, nel suo primo aspetto, comprende una SPS-asi, una carboidrasi in una forma utilizzabile e capace di decomporre SPS di soia, in condizioni appropriate, in prodotti di decom posizione che si attaccano alla proteina in un mezzo acquoso in misura minore di quanto lo SPS di sola, prima della decomposizione, si attaccherebbe alla stessa proteina, in condizioni corrispondenti.
E' stato inoltre trovato che questa SPS-asi capace di degradare SPS di soia, ? in grado di degradare polisaccaridi simili a SPS e originati da vegetali e da frutti, pi? completamente delle pectinasi e cellulasi commerciali.
L'espressione sopra indicata "in una forma utilizzabile" ? rivolta a escludere dalla invenzione per esempio una SPS-asi con tenente preparazione che contiene sostanze tossiche o che mostra un'attivit? SPS-asica talmente bassa, che necessita l'uso di una preparazione che contenga pi? del 10% di SPS-asi, in relazione al peso di SPS nel substrato, in una reazione condotta per 24 ore e a 50?C, all'optimum di pH della SPS-asi in questio ne, per ottenere una decomposizione di SPS di qualche importanza pratica.
Mediante eliminazione totale o parziale dello SPS dalla proteina vegetale finale, la purezza della proteina vegetale finale viene necessariamente aumentata in paragone con la purezza della proteina vegetale finale ottenibile in accordo con il metodo no to dal brevetto belga n. 882.769? poich? questo prodotto di proteina vegetale noto era contaminato con SPS.
Attualmente non ? noto se la particolare SPS-asi
descritta in quanto segue derivi la sua attivit? en?imatica da un solo enzima o da un complesso enzimatico comprendente almeno due enzimi. Alcuni studi sembrano indicare che almeno due enzimi siano responsabili dell'effetto di degradazione de!L la SPS-asi, per cui uno di questi enzimi ? in grado di realizzare solo una lieve decomposizione di SPS, mentre uno o pi? en zimi sono capaci di effettuare una degradazione pi? estesa dello SPS. La richiedente tuttavia, non intende essere limitata da tale ipotesi o da ipotesi simili.
Una realizzazione preferita della SPS-asi in accordo con la invenzione, ? caratterizzata dal fatto che la SPS-asi h in gra do di decomporre SPS di soia in un mezzo acquoso in prodotti di decomposizione che si attaccano alla proteina vegetale nel mez zo acquoso in misura minore di quanto lo SPS di soia, prima della decomposizione, si attaccherebbe alla stessa proteina ve getale nel mezzo acquoso.
Una realizzazione preferita della SPS-asi secondo l'invenzione ? caratterizzata dal fatto che la SPS-asi ? in grado di decomporre SPS di soia in un mezzo acquoso con un valore di pH che non si scosta pi? di 1,5 da 4?5, in prodotti di decomposizione che si attaccano alla proteina di soia nel mezzo acquoso in misu ra minore di quanto lo SPS di soia, prima della decomposizione, si attaccherebbe alla proteina di soia nel mezzo acquoso.
Una realizzazione preferita della SPS-asi in aocordo con la invenzione ? caratterizzata dal fatto che i prodotti di decomposizione di SPS di Boia, dopo completata la degradazione, si attaccano alla proteina vegetale in misura minore del 50%, particolarmente minore del 20%, di quanto lo SPS di soia, pri_ ma della decomposizione, si attaccherebbe alla proteina vegetale nel mezzo acquoso.
Una realizzazione preferita della SPS-asi in accordoc con l'in venzione, ? caratterizzata dal fatto che la SPS-asi mostra una prova di attivit? SPS-asica positiva, quando esaminata secondo il metodo di determinazione qualitativa e quantitativa della SPS-asi, descritto in questa descrizione.
Una realizzazione preferita della SPS-asi in accordo con l'invenzione, ? caratterizzata dal fatto che la SPS-asi fu prodotta mediante un microorganismo appartenente al genere Aspergillus, preferibilmente appartenent? al gruppo Aspergillus niger.
Una realizzazione preferita della SPS-asi in accordo con l'inven zione, ? caratterizzata dal fatto che la SPS-asi ? derivata dagli enzimi che possono essere prodotti per mezzo di A3p, aculeatus CBS 101.43? La stesea SPS-asi pu? essere prodotta per mezzo di Asp. .japonicus IFO 4408. E' stato trovato che Asp. aculeatus CBS 101.43 produce anche remanasi, cellulasi, pectinasi ed emicellulasi molto potenti. Inoltre, ? stato trovato che non tutti i ceppi appartenenti alle specie Asp. aouleatus o Asp. .laponicus generano una SPS-asi richiesta per l?invenzione. Cos?, come appare pi? avanti in questa descrizione (sezione 5), ? stato dimostrato che il ceppo Asp, japonlous ATCC 20236 non produce quantit? tali di una SPS-asi da poter essere individuate per mezzo della determinazione enzimatica della SPS-asi precisata in questa descrizione.
Una realizzazione preferita della SPS-asi in accordo con L'in venzione, ? caratterizzata dal fatto che la SPS-asi ? identica dal. punto di vista immunoeiettroforetico alla SPS-asi ohe si pu? produrre mediante Asp. aculeatus CBS 101.43? e identificabile per mezzo della tecnica di sovrapposizione immunoelettro foretica, vedi sezione 6 e 7.
Quando una SPS-asi ? prodotta per via microbica? essa viene formata in miscela con molte sostanze secondarie? particolarmente altri enzimi. Se desiderato? la SPS-asi in questione pu? essere purificata? per esempio mediante metodi di separazione cromatografica, come apparir? pi? avanti in questa descrizione (sezione 8).
In Agr. Biol. Chem 40 (1)? 87 - 92? 1976, ? descritto come un ceppo di Asp. .1aponicus, ATCC 20236 produca un complesso enzi^ matioo in grado di effettuare una degradazione parziale di un polisaccaride acido in salsa di soia, tale complesso enzimatico essendo chiamato APS, una frazione del quale viene chiamata APS-I. Questo polisaccaride acido non ? identico allo SPS, cosa ohe verr? mostrata pi? avanti in questa descrizione, pi? det? tagliatamente nella sezione 3? Cos?, i cromatogrammi HPLC per gel filtrazione di SPS e di APS sono chiaramente diversi, e inoltre i cromatogrammi di gel filtrazione di
APS decomposto per mezzo della peotinasi commerciale Pestolyase e di SPS trattato con la peotinasi commerciale Peoto lyase sono chiaramente diversi. Inoltre, dall'articolo di cui sopra, non appare cenno al fatto ohe il polisaccaride acido sia legato alla proteina di soia e che il polisaccaride acido decomposto non sia legato alla proteina di soia o sia legato alla proteina di soia in misura minore di quanto lo sia il polisaccaride acido non decomposto. Inoltre, ? stato dimostrato che questo ceppo non forma SPS-asi in quantit? tali da poter essere individuato mediante la determinazione enzima tica della SPS-asi descritta in questa descrizione. Ci? ha crea to la convinzione che neseun ceppo di Asp. iaponicus fosse un produttore di una SPS-asi, ma ? stato sorprendentemente trova to, in accordo con la presente invenzione, che alcuni ceppi di Asp. ,1aponicus sono produttori di una SPS-asi.
L'invenzione comprende, nel suo secondo aspetto, lo SPS isola to, prodotto sulla base di proteina grezza vegetale oome mat? riale di partenza.
Una realizzazione preferita dello SPS isolato in accordo con l'invenzione, ? caratterizzata dal fatto ohe la proteina grezza vegetale ? farina di soia sgrassata. La produzione di questo SPS isolato ? descritta precedentemente in relazione alla figura 2.
L'invenzione comprende, nel suo terzo aspetto, un metodo per la selezione di un microorganismo produttore di SPS-asi per la produzione della SPS-asi in aooordo con l'invenzione, metodo in oui il microorganismo da sottoporre a test b cresciuto in un mezzo di fermentazione, la cui principale fonte di carbonio b lo SPS, dopo di ohe un campione del mezzo di fermentazione viene analizzato circa la presenza di SPS-asi e il microorganismo in questione viene scelto come microorga nismo produttore di SPS-asi, se l'analisi circa la presenza di SPS-asi b positiva.
L'invenzione comprende, nel suo quarto aspetto, un metodo per la produzione di SPS-asi, in cui un ceppo, selezionabile in accordo con il metodo di selezione di cui sopra, di un mi oroorganismo produttore di SPS-asi b coltivato in un mezzo nutritivo. La coltivazione pu? essere realizzata come fermen tazione sommersa o come fermentazione di superficie.
Una realizzazione preferita del metodo in aooordo con l'inven zione b caratterizzata dal fatto ohe il ceppo di Asp. aculeatus CBS 101.43 o di Asp. .1aponicus IPO 4408 b coltivato in un mezzo nutritivo.
Una realizzazione preferita del metodo secondo l'invenzione b caratterizzata dal fatto che la ooltivazione viene effettuata come coltivazione sommersa, a un pH nell'intervallo tra 3 e 7? preferibilmente tra 4 e 6, a una temperatura nell*intervallo da 20 a 40?C, preferibilmente da 25 a 35?C, e ohe di mezzo nutri?nte contiene fonti di aarbonio e di azoto e sali inorganici.
Una realizzazione preferita del metodo secondo l'invenzione ? caratterizzata dal fatto ohe il mezzo nutritivo contiene farina di Boia tostata.
Una realizzazione preferita del metodo secondo l'invenzione ? caratterizzata dal fatto che la farina di soia, viene trattata con un enzima proteolitioo prima dell'uso come componente del substrato, preferibilmente con l'enzima proteolitico prodotto per via microbica per mezzo di Baoillus licheniformis.
Una realizzazione preferita del metodo secondo l'invenzione ? caratterizzata dal fatto ohe una soluzione di pecti^ na viene aggiunta al brodo di fermentazione, in modo asettico, durante la coltivazione.
E' stato trovato ohe Asp. aculeatus CBS 101.43 produce anche enzimi molto potenti solubilizzanti il residuo, oel lulasi, peotinasi ed emicellulasi oltre alla SFS-asi, e che il complesso enzimatico prodotto per mezzo di Asp. apuleatus CBS 101.43 ? adatto in modo eccellente come agente per l'uso nella disintegrazione della parete cellulare di materiali vegetali. Cosi, il complesso enzimatico ohe pu? essere prodotto da Asp. aculeatus CBS 101.43# pu? essere uti_ lizzato nell'industria della lavorazione degli alimenti, per il trattamento di infusi di frutta e di verdura e per fini di ohiarificazione e di riduzione della viscosit? nella lavorazione di succhi e di vini, oon risultati eccellenti; inoltre, osso pu? essere utilizzato come agente disidratante (cio? come agente per la decomposizione di polisaccaridi e quindi per la liberazione dell'acqua legata nella,struttura polimerica del polisaccaride) nella lavorazione di vegetali. Cosi, nel suo quinto aspetto, l'invenzione comprende l'uso di una SPS-asi o un metodo per la decomposizione di polisaocaridi, preferibilmente di polisaccaridi della parete cellulare vegetale, mediante una carboidrasi in cui un preparato di SPS-asi in accordo con l'invenzione, in un mezzo acquoso, viene posto a oontatto con un substrato per detto preparato di SPS?asi.
Cos?, in accordo con l'invenzione, ? stato trovato che prepa rati di SPS-asi costituiscono preziosi preparati enzimatici per la liquefazione parziale o totale o per la deoomposizione di molti materiali, preferibilmente materiali vegetali, come per esempio frutti e residui vegetali, contenenti proteina, cellulosa, emicellulosa (per esempio gluoani, xilano, gaiatta ni e arabano) gomme, pectina, lipidi, inulina, polifenoli, amido e alginati, e per fini correlati ad essi, vedi la tabella mostrata pi? avanti,in questa descrizione. Come esempi di tali soopi correlati possono essere menzionati tutti gli scopi per i quali oggigiorno vengono utilizzate peotinasi e oellulasi oommeroiali. Pi? avanti in questa descrizione verranno dati numerosi esempi? In relazione al processo di estrazio_ ne (isolamento) descritto, per esempio, nell'esempio 2, si nota ohe il preparato di SPS-asi ? essenzialmente libero da proteinasi, per il fatto ohe il prodotto finale desiderato, cio? la proteina, sarebbe altrimenti degradato. Analogamente, qualora si voglia estrarre (isolare) materiali biologici diversi dalla-proteina da un materiale biologico grezzo, il preparato di SPS-asi usato dovrebbe essere essenzialmente pr? vo di qualunque enzima degradante questo diverso materiale biologico. Tali preparati modificati di SPS-asi possono essere prodotti mediante inattivazione selettiva dell'enzima inde siderato, mediante frazionamento o mediante altri metodi di per s? noti.
Cos?, una realizzazione dell'uso preferita in accordo con la invenzione b caratterizzata dell fatto ohe la decomposizione ? accompagnata dall'isolamento o dall'estrazione di un materiale biologico, diverso dalla proteina di soia e dalle proteine vegetali correlate, da un materiale biologico grezzo, per cui il preparato di SPS-asi b essenzialmente libero da qualsia si enzima in grado di degradare detto materiale biologico.
Cosi, in accordo con l'invenzione, ? stato trovato che i preparati modificati di SPS-asi (modificati nel ????? che essi so no essenzialmente liberi da enzimi in grado di degradare il ma teriale biologico da estrarre o da isolare) sono preparati enzimatioi preziosi per l'estrazione (isolamento) di materiali biologici speoifioi, per esempio amido, lipidi, aromi, coloranti e suochi, da materiali biologici grezzi. Pi? avanti in questa descrizione verranno dati numerosi esempi.
Una realizzazione preferita dell-'-uso aeoondo l'invenzione, ? caratterizzata dal Catto ohe uno o pi? prodotti di reazione (non importa ohe essi siano prodotti finali desiderati o prodotti di scarto) sono ulteriormente trattati oontemporaneamen te con il trattamento enzimatico o dopo di esso. Con ci? viene fornito un uso pi? flessibile ed adattabile.
Una realizzazione preferita dell'uso in accordo con l'invenzione, ? caratterizzata dal fatto che l'ulteriore trattamento ? una fermentazione alcoolica, nel caso in cui uno dei prodotti di reazione sia uno zucchero fermentabile. Con ci? viene fornito un metodo per la produzione di alcool semplice ed economico. Per ohiarire la natura dell'invenzione, si fa riferimento alle seguenti sezioni 1-10, che descrivono tutte i dettagli relativi all'invenzione :
1. Produzione di SPS.
2. Caratterizzazione di SPS, specialmente distribuzione del peso molecolare di esso.
3. Documentazione del fatto che SPS e APS sono composti diversi.
4. Screening per microorganismi produttori di SPS-asi. 5. Caratterizzazione di alcuni mioroorganiami produttori di SPS-asi.
6. Descrizione generale della tecnica di sovrapposizione associata all*immunoelettroforasi.
7. Caratterizzazione immunoelettroforetica di SPS-asi con antioorpo polispeoifioo e sovrapposizione, 8? Purificazione di un preparato di SPS-asi.
9? Dipendenza dell*attivit? dal pH, dipendenza dell'atti vit? dalla temperatura e stabilit? di una SPS-asi. 10. Determinazioni di attivit? enzimatica.
SEZIONE 1.
PRODUZIONE DI SPS.
Come sopra menzionato, il materiale di partenza per la produ zione di SPS pu? essere residuo di soia. Perci?,.in primo lu? go, viene descritta la produzione di residuo di soia.
Il residuo di soia ? la frazione carboidratioa libera da proteine (ohe in pratica pu? contenere quantit? minori di lignina e minerali) in farina di soia sgrassata e sbucciata, frazio ne carboidratioa insolubile in un mezzo acquoso a pH 4,5, e che pu? essere prodotta nel modo seguente, facendo riferimento anche al foglio di lavorazione 1).
Farina di soia sgrassata (Sojamel 13 prodotta da Aarhus Oliefabrik A/S) viene sospesa in acqua deionizzata a 50?C in una proporzione ponderale farina di soiaiacqua ? 1*5, in un oontje nitore con pH-stato e controllo di temperatura. Il pH viene regolato a 8,0 con NaOH 4N (i). Poi viene effettuata una idro liei a pH oontrollato oon ALCALASE 0,6 L (un enzima proteolitico basato su B. licheniformia, oon un'attivit? di 0,6 unit? Anson/g, per oui l'attivit? viene determinata in aooordo oon il metodo di Anson, come descritto in NOVO ENZYME INFORMATION IB No. 058 e-GB), cosiocb? il rapporto enzima/substrato sia uguale a 4# della quantit? di proteina nella farina di soia (il). Dopo una idrolisi di 1 ora, la sospensione viene separata per centrifu gazione (ili) e lavaggio (IV), per cui questa operazione viene effettuata due volte (V, VI, VII). La sospensione cos? trattata viene idrolizzata ancora ima volta per un'ora oon ALCALASE 0,6 L (VIII, EX),'in modo simile a quanto indicato precedentemente.
Poi la sospensione viene separata per centrifugazione (X) e lavata due volte (XI, XII, XIII, XIV), dopo di che la sospensione finale (6) lavata viene essiccata a spruzzo (XV). La polvere ei3 siocata a spruzzo cos? prodotta ? il residuo di soia ohe Berve come materiale grezzo per la produzione di SPS.
SPS ? la frazione polisaocaridica idrosolubile che viene prodotta mediante trattamento convenzionale del res?duo di soia sopra indicato oon peotinasi. Lo SPS viene prodotto nel seguen te modo, mediante i 14 stadi di reazione sotto indicati, (si fa riferimento anche al foglio di lavorazione 2).
1. Viene determinato il contenuto d? materia seooa nel residuo di soia sopra menzionato, e il res?duo di soia viene diluito con acqua al 2% di sostanza seooa e mantenuto in sospensione a 50?C, in un serbatoio con controllo di tero peratura*
2. Il valore del pH viene regolato a 4?50 oon NaOH 6N.
3. Viene aggiunto Peotinex Super oono. L in quantit? di 200 g/kg di sostanza seooa (una pastinasi commerciale prodotta da Sohweizerische Perment AG, Basilea, Svizzera), con un'attivit? pectinasioa di 750*000 MOU, come determinato in accordo con l'opuscolo "Determinetion of th? Peotinaee unita on Apple Juice (MOU)"del 12.6.1981, che pu? essere ottenuto da Sohweizerische Perment AG, Ba silea, Svizzera), e viene aggiunta anche Celluclast 200 L, in una quantit? di 20 g/kg di sostanza secca (una cellulari commerciale descritta nell'opuscolo NOVO enzymes, fo_ glio di informazione B 153 e-GB 1000 luglio, 1981, che pu? essere ottenuto da NOVO INDUSTRI A/S, Novo Alle, 2880 Bagsvaer d, Danimarea).
4. Il contenuto del recipiente viene mantenuto a 50?C per 24 ore, sotto agitazione*
5. Gli enzimi vengono inattivati alzando il valore del pH a 9,0 oon NaOH 4N. La miscela di reazione viene mantenuta per 30 minuti, e il valore del pH viene regolato nuovamen te a 4,5 con HC16N.
6. La mieoela di reazione viene centrifugata, e sia il cen trifugato sia la sospensione vengono raccolti.
7? Il centrifugato proveniente dallo stadio 6 viene pre?fil trato su un filtro pressa (il filtro viene lavato con acqua prima della pre-filtrazione).
8. Il pre-filtrato viene ultrafiltrato, diafiltrato e ultrafiltrato ancora una volta su una membrana oon un valore diMout-off " di 30.000 (DDS (3160?P prodot to da De Danske Sukkerfabrikker), per oui vengono utilizzati i seguenti parametri :
1. Ultrafiltrazione corrispondente a una concentrazione di volume di 6.
2. Diaf iltrazione fino a che la percentuale di sostanza secca nel permeato ? 0 (?/0? Brix). 3. Ultrafiltrazione sino al 15# di sostanza secca nel concentrato.
La temperatura ? 50?C, il pH ? 4,5 e la pressione media ? 3 bar.
9. Il concentrato ultrafiltrato viene raffreddato a 5?C, e viene aggiunto un ugual volume di.etanolo al 96%? 10. Il precipitato viene raccolto mediante una centrifuga.
11. Il precipitato viene lavato due volte oon etanolo in acqua al 50% v/v, corrispondente al volume di centrifu gato dallo stadio 10, cio? vengono effettuate due centrifugazioni.
12. Il precipitato lavato viene sciolto di nuovo in acqua oon un volume uguale al volume del concentrato:ultrafiltrato proveniente dallo stadio 9?
13. Il liquido proveniente dallo stadio 12 viene sottoposto a filtrazione su un filtro di vetro.
14. Il filtrato liquido contenente SPS puro viene liofi lizzato.
FOGLIO DI LAVORAZIONE No. 1
FOGLIO DI LAVORAZIONE No. 2
SEZIONE 2.
CARATTERIZZAZIONE DI SPS, IN PARTICOLARE DISTRIBUZIONE DEL SUO PESO MOLECOLARE.
Per mezzo di gal cromatografia su apparecchiatura HPLC (pompa Waters modello 6000, modulo dati Waters 730, e rifra;t tometro Waters R 401), viene determinata la distribuzione del peso molecolare dello SPS, la produzione del quale viene rea lizzata come indicato in questa descrizione (figura 4).
Per mezzo dello stesso metodo, b stata determinata anche la distribuzione del peso moleoolare dei prodotti di decom posizione di SPS per mezzo della SPS-asi (figura 5). Inoltre, per mezzo d?lio stesso metodo, sono stati dimostrati l'effetto legante tra la proteina di Boia e lo SPS (figura 6) e l'assenza di effetto legante tra la proteina di soia e lo SPS decomposto per mezzo dell'agente secondo l'invenzione (figura 7).
La curva di calibratura (il logaritmo del peso molecolare portato in grafico contro Rf, in cui il valoreRf .per il giu cosio b definito arbitrariamente come 1 e il valore diRf. per un destrano specifico b definito oome il tempo di ritenzione per questo destrano diviso per il tempo di ritenzione per il glucosio) ? stata stabilita per mezzo di numerosi destrani standard con pesi molecolari noti (T 4, T 10, T 40, T 70, T 110, T 500) prodotta da Pharmacia Fine?Chemicals AB, Box 175, S-75104,Uppsala, Svezia. E' stato trovato il valore di Rf per il massimo di ciascun picao di destrano, ed
? stato calcolato il corrispondente peso molecolare come
, per oui ? il valore medio del peso mole? colare in accordo con il peso e ? il valore medio del peso molecolare in aooordo con il numero. Come eluente per questa procedura cromatografica ? stato usato NaNO^ 0,1 M.
Le colonne utilizzate nella procedura cromatografica sono colonne PW 5000 da 60 cm, seguite da colonne PW 3000 da
60 om della Toyo Soda Manufacturing Co., Giappone. In questo modo ? stata stabilita la relazione tra peso molecolare e R^., per i destrani sopra indioatif vedi figura 3?
Sulla base della figura 4 si pu? calcolare che SPS ha una distribuzione di peso molecolare che d? origine a un valore di di circa 5,4 x 10<5 >e aun valore di d,i circa 4. r 2 x 10^? Inoltre, da questa figura appare come il cromatogramma mostri due picchi distinti al tempo di ritenzione di 34,5 mi^ nuti (6$) corrispondente a un peso molecolare di circa 5 x 10 e al tempo di ritenzione di 47,12 minuti (67$)? corrispondente ad un peso molecolare di circa 4,9 x 10 . Inoltre da questa curva appare che esiste una spalla tra questi due picchi al tempo di ritenzione di 41,25 minuti (27$), corrispondente ad un peso molecolare di 2,8 x 10 .
Dopo decomposizione di SPS con SPS-asi, la miscela di idre) lisi fu filtrata attraverso membrana, e il filtrato fu ero matografato. E' stato trovato che circa il 55$ di SPS h de^ composto in mono-, di- e trisaccaridi, e che il restante
45 % ? decomposto in un polimero con tre picchi, con i seguenti pesi molecolari: 5x 104, 104 e 4,4 x 103, vedi figura 5.
Per dimostrare 1*effetto legante tra la proteina di soia e lo SPS, e la sostanziale riduzione di effetto legante tra la proteina di soia e SPS decomposto per mezzo di una SPS-asi, sono stati effettuati i seguenti esperimenti.
SPS al 3% in tampone acetato 0,10 M a pH 4?5 ? stato aggiunto a una sospensione di isolato di soia (Purina E 500), per generare una sospensione con un rapporto isolato/SPS di 10:1. Questa sospensione ? incubata per 18 ore in un bagno ad agi tazione a 50?C. Dopo incubazione la sospensione viene centri^ fugata, e il sum atante liquido ? analizzato su HPLC, come de scritto precedentemente. Dalla figura 6, in paragone con la figura 4, appare come SPS sia completamente assorbito sullo isolato di soia.
Lo stesso procedimento indicato nel precedente paragrafo viene effettuato con una soluzione di SPS al 3$ idrolizzata con una SPS-asi prodotta per mezzo di CBS 101.43 (figura 7).
Un paragone tra figura 7 e figura 5 mostra ohe nessun composto nello SPS idrolizzato, con peso molecolare inferiore a circa 10<4>, ? assorbito sull'isolato di soia. L'idrolisi ridu ce il legame quantitativo a circa 10?159^? in relazione al le game di SPS con la proteina di soia.
Un'analisi NMR dello SPS, la produzione del quale viene effettuata come indicato in questa descrizione, rivela la seguente oomposizione approssimativa dello SPS:
1) Acido d-galattur?niao in una quantit? -approssimativamen te del 45%, per oui approssimativamente il 40% della quan tlt? totale di acido c(-galatturonieo ? presente come est? re metilico.
2) Ramnopiranosio in una quantit? approssimativamente del 20%, 3 ) galattopiranosio in una quantit? approssimativamente del 15%, e
4) ?-xilopiranosio in una quantit? approssimativamente del 20%.
I costituenti sembrano essere presenti in una struttura com prendente uno scheletro ramnogalatturonioo e catene laterali di xilosio e di galattosio.
L'idrolisi acida completa di SPS (8 ore in H2SO4 1 N) e la successiva analisi TLC, rivelarono che nello SPS idrolizzato erano presenti anche quantit? minori dei monosaocaridi fuc? sio e arabinosio.
Un'analisi HPLC dello SPS decomposto mediante il complesso enzimatico di SPS-asi prodotto da CBS 101.43? mostra una p? tenta riduzione del peso molecolare . In accordo con ci? lo spettro NMR dello SPS decomposto, come sopra indicato, mostra che la parte principale dei gruppi estere! h sparita e che anche il contenuto di xilosio e di galattosio nel materiale a peso molecolare pi?.elevato ? diminuita, lo epettro NMR della parte del prodotto di decomposizione di SPS ohe pre^ cipita per aggiunta di un volume di etanolo a un volume di prodotto di decomposizione di SPS, ? simile allo spettro NMR dello SPS, con le modificazioni sopra indicate, riguar danti gruppi esterei e il contenuto di xilosio e galattosio. SEZIONE 3
DOCUMENTAZIONE DEL FATTO CHE SPS E APS SONO COMPOSTI DIVERSI. APS fu preparato come indicato in Agr. Biol. Ohem., Voi. 36, No. 4, P. 544-550 (1972).
Ora, questo polisaccaride e SPS, furono idrolizzati con enzi ml diversi, dopo di che la miscela d? decomposizione fu sot toposta a gel cromatografia su apparecchiatura di HPLC, come indicato nella sezione 2, "Caratterizzazione di SPS, in particolare distribuzione del suo peso molecolare".
Pi? dettagliatamente, le idrolisi furono effettuate mediante trattamento di soluzione di 25 ml di APS al 2% o di SPS al 2 in tampone acetato 0,1 M di pH 4,5, con 10 mg di KRF 68 o con 30 mg di Pectolyase. KRF 68 ? un preparato di SPS-asi, la preparazione del quale ? descritta nell?esempio 1.1 risulta ti appaiono dalla seguente tabella.
SEZIONE 4.
SCREENING PER MICROORGANISMI PRODUTTORI DI SPS-ASI.
Il microorganismo da sottoporre a test viene incubato su substrato di agar slant (oio? su substrato di agar contenuto in provette a becco di clarino inclinate) con una composizione che permette la crescita del microorganismo* Dopo la crescita iniziale sul substrato di agar slant, il microorganismo viene trasferito a un substrato liquido principale, in cui la fonte principale di carbonio h SPS (preparato come indicato), in cui la fonte di azoto ? ??3 , NH4<+>, urea, aminoacidi liberi, prote_i ne o altri composti contenenti azoto, e ohe contiene inoltre ima miscela di sali necessari e di vitamine, preferibilmente nella forma di estratto di lievito* La composizione del substrato principale dipende dal genere del microorganismo, il principale risultato essendo che il substrato principale dovrebbe essere in grado di sostenere la oresoita e il metaboli smo del microorganismo. Quando la oresoita ? avvenuta in un periodo di tempo adatto, dell'ordine di grandezza di 1-7 gior ni, a seconda della velocit? di crescita del microorganismo in questione, un campione del brodo di fermentazione viene analizzato oiroa la presenza di SPS-asi in aooordo oon la determinazione di SPS-asi enzimatica descritta in questa descrizione, o in aooordo oon qualsiasi altra determinazione di SPS-asi adattata a usi specifici della SPS-asi diversi dal l'uso come componente di un agente per la deoomposizione di residuo di soia.
Per ottenere un metodo pi? sensibile per la determinazione dell'attivit? enzimatica, la temperatura potrebbe essere abbassata a 40?C e il tempo di incubazione potrebbe essere elevato a 20 ore durante la determinazione dell'attivit? di SPS-asi, per cui dovrebbero essere aggiunti antibiotici al substra to per evitare infezioni.
Seguendo questo metodo di test possono essere trovati altri ?? croorganismi produttori di SPS-asi, appartenenti sia al genere Aspergillus sia ad altri generi.
SEZIONE 5.
CARATTERIZZAZIONE DI ALCUNI MICROORGANISMI PRODUTTORI DI SPS-ASI In accordo oon lo screening qui indicato per microorganismi pro duttori di SPS-asi, ? stato trovato che i microorganismi elenca ti nella parte alta della seguente tabella sono produttori di SPS-asi. La tabella contiene anche un ceppo appartenente alla specie Asp. japonious, che non ? un produttore di SPS-asi.
Un breve identifioazione dei ceppi sopra indicati pu? essere tro vata nei seguenti cataloghi di colture:
List of Cultures 1978 Centretaibureau voor Sahimmelaultures, Baam , Olanda.
Institute for Fermentation Osaka, List of Cultures, 1972, 5a edizione, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, YOdogawa-ku, Osaka 532, Giappone.
The American Type Culture Colleotion Catalogue of Strains I, 14& edizione 1980, 12301 Parklawn Drive, Rookville, Maryland
20852.
Tutti i ceppi nella tabella sopra indicata corrispondono strettamente alla descrizione tassonomica delle specie Asp. japonious e Asp. aculeatus che appaiono in The genus Aspergillus of Raper
and Fennell, 1965 (vedi specialmente pagine 327-330).
SEZIONE 6.
DESCRIZIONE GENERALE DI TECNICA DI SOVRAPPOSIZIONE ASSOCIATA
ALLA IMMUNOELETTROFORESI.
Un metodo chiamato tecnica di strati di agar sovrapposti ? stato sviluppato dalla Richiedente per l ? identificazione di componenti Individuali di un complesso enzimatico mediante immunoelettroforesi incrociata con un antioorpo poliepeoifioo contro tutti i componenti enzimatici nel complesso enzimatico. Il metodo ? basato sul fatto ohe gli enzimi sono ancora attivi dopo il legame specifico enzima-anticorpo, o ohe si ? altrimenti stabili^ to ohe il sito enzimatico attivo non ? identico al sito del legame enzima?anticorpo? I complessi enzima-anticorpo precipitano come archi distinti nel gel durante l'elettroforesi. La piastra di gel viene coperta con SPS solubile in un agar sovrapposto. Dopo riscaldamento a 45?C per 20 ore, in un'atmosfera con una umidit? relativa del 100%, l'arco che possiede attivit? SPS-asica apparir? come una zona limpida nello strato di SPS, dopo pre cipitazione con una miscela di uguali voluml di etanolo e di acetone, se esaminato contro uno sfondo scuro. Gli archi privi di attivit? SPS-asica rimangono invisibili.
SEZIONE 7.
CARATTERIZZAZIONE IMMUNOELETTROFORETICA DI SPS-ASI CON ANTICOR-PO POLISPECIFICO E SOVRAPPOSIZIONE.
Furono immunizzati conigli con il complesso enzimatico oontenen te la SPS-asi, ottenuto per fermentazione di Aspergillus acu? leatus CBS 101.43? come indicato nell'esempio 1 (KRF 68), e 1'anticorpo polispecifioo fu raccolto con un metodo di per s? noto. Per mezzo di questo anticorpo polispecifioo, venne effettuata una imraunoslettroforesi incrociata del complesso enzimatico ottenuto mediante ferraentazione di Asp. aculeatus CBS 101.43, come indicato nell*esempio 1 (KRF 68), come descritto in N.H. Axeleen et al., "A Manual of Quantitative Immunoeleotrophoresis", 6' edizione del 1977. Si fa riferimento alla figura 11, che mostra gli archi corrispondenti alle diverse proteine prodotte dal microorganismo. Per mezzo della tecnica di strati di agar sovrapposti, preoedentemente descritta, si ? trovato che l'area tratteggiata corrisponde alla SPS-asi.
Se l'ipotesi precedentemente indicata, comprendente l'asserzione che la SPS-asi consiste di almeno due enzimi ? corretta, l'area tratteggiata ? l'area in cui sono presenti tutti gli enzimi responsabili dell'attivit? SPS-asica. Se questi enzimi, in altre realizzazioni dell'invenzione, vengono separati mediante inumanoelettroforesi in modo tale che essi non coprissero alcuna area reciproca, una parte dell'attivit? SPS-asica pu? essere ancora identificata mediante iraraunoelettroforesi con lana sovrapposizione sia con SPS sia con una peotinasi commerciale.
SEZIONE 8.
PURIFICAZIONE DI UN PREPARATO DI SPS-ASI
La purificazione del preparato KRF 92 di SPS-asi (vedi l'esempio 1) venne effettuata mediante scambio ionico. Il tampone ? Tris 50 mM (tris-idrossimetilamminometano) ohe viene regolato a pH 7?0 con HCl. La colonna ? K 5/30 prodotta da Pharmacia, Svezia. Il materiale di scambio ionico ? DEAE?triBacrile prodotto da LKB, Bromma, Svezia (300 mi). La velocit? di flueso ? di 100 ml/ora?
15 Grammi del preparato di SPS-asi KRF 92 furono Boiolti in 450 ml di H2O a 6*0, e tutte le operazioni indicate qui di seguito furono svolte tra 6*0 e 10?C. Il pH fu regolato a 7?0 con Tris 1M, La colonna fu equilibrata con il tampone, e il campione di SPS-asi fu introdotto nella colonna. Sullo eluato furono misurati OD280 e la oonduttivit?, si fa riferii mento alla figura 12. La frazione 1 ? l'eluato non legato al materiale di scambio ionico. La colonna venne poi lavata con 2000 ml di tampone, cosa che diede origine alla frazione 2. A questo punto si stabili un gradiente di NaCl di 0-500 mM, ohe diede origine alle frazioni 3-9? Tutte le nove frazioni furono concentrate a 200 mi e dializzate contro acqua sino a una oonduttivit? di 2 mSi per mezzo dialisi (Hollow Piber DP 2, prodotto da Amicon, Massachusetts, U.S.A.). Poi le nove frazioni furono liofilizzate. Solo le frazioni 1 e 2 mostraro no attivit? SPS-asica.
La frazione 1 fu purificata ulteriormente mediante gel filtrazione. 1,5 Gramml di frazione 1 furono sciolti in 10 ml di sodio acetato 50 mM, con pH 4?5 (KCl 500 mM). La colonna ? 2,5 x 100 cm della LKB. Il materiale riempitivo di gel filtrazione ? Sephacryl S-200 prodotto da Pharmacia, Svezia.
La velocit? di flusso b di 30 ml/ora. Le frazioni contenenti materiali oon pesi molecolari tra 70.000 e 100.000, calibrate oon proteine globulari, contenevano un complesso enzima tico chiamato fattore G che non poteva decomporre lo SPS, quando sottoposto a test in accordo con il test qualitativo di agar; tuttavia, SPS ? decomposto in accordo con il test qualitativo di agar quando B? miscela il fattore G con una pectinasi. E* stato trovato ohe il fattore G ? in grado di Baiadere galattosio, fuoosio, e una certa porzione di aci do galatturonioo dallo SPS, ma il prodotto principale di de composizione in accordo con l'analisi HPLC ? ancora un prodot, to ad alto peso molecolare molto simile a SPS.
SEZIONE 9?
DIPENDENZA' pH-ATTIVITA', DIPENDENZA DELL'ATTIVIT?' DALLA TEMPERATURA E STABILITA' DI UNA SPS-ASI.
La figura 13 mostra la dipendenza pH-attivit? del preparato di SPS-asi KRF 68. Da pH 2,7 a pH 3,5, venne utilizzato un Bistema tampone di acido formico, e da pH 3,7 a 5,5, fu usato un sistema tampone acetato.
La figura 14 mostra la dipendenza dell'attivit? dalla tempe^ ratura del preparato di SPS-asi KRF 68.
La figura 15 mostra la stabilit? di temperatura del prepara to di SPS-asi KRF 68.
SEZIONE 10.
DETERMINAZIONI DI ATTIVIT?' ENZIMATICA.
La tabella sotto indicata ? un'indagine delle diverse determi, nazioni di attivit? enzimatica riguardanti l'invenzione.
I riferimenti indicati nell*ultima colonna della tabella qui sopra sono esposti dettagliatamente nella tabella indicata qui sotto.
In relazione alla determinazione dell'attivit? oellulaeica,
ai pu? notare che l'analiai venne effettuata come indicato
in AF 149/6-GrB, e che i principi della determinazione ???? spiegati in Analytical Biochemistry.
SEZIONE 10 a.
DETERMINAZIONE ENZIMATICA DI SPS-ASI.
La determinazione enzimatica di SPS-aai viene effettuata in
due stadi, oio? un test qualitativo su piastra di agar e
una determinazione quantitativa dell*attivit? SPS-asica, basata sulla misurazione della quantit? di zuccheri totali liberati. Se il test qualitativo su piastra di agar ? negativo, l'attivit? SPS-asioa ? zero, senza riguardo al valore originato dalla determinazione quantitativa dell'attivit?
SPS-asica.Se il test qualitativo su piastra di agar ? posi^ tivo, l'attivit? SPS-asica ? uguale al valore originato dalla determinazione quantitativa dell'attivit? SPS-asica.
I. Test qualitativo su piastra di agar.
Una piastra di SPS-agar fu preparata nel seguente modo.
Un tampone (B) ? preparato per regolazione di acido aceti co 0,3 M a un valore di pH di 4,5? per mezzo di NaOH.1 N. 1 G di SPS viene sciolto in 20 ml di B. 1 g di agarosio (HSB Litex) viene miscelato con 80 ml di B e scaldato al punto di ebollizione, sotto agitazione. Quando 1'agarosio ? sciolto viene aggiunta lentamente la soluzione di SPS. La soluzione risultante all'1% di SPS-agarosio viene posta in un bagno di acqua di 60?G. Le piastre vengono ora cari cate versando 15 mi della soluzione all'1% di SPS-agarosio su una piastra di vetro orizzontale con dimensioni di 10 cm X 10 om. Poi vengono praticati 9 pozzetti oon una distan za di 2,5 om, nello strato solidificato di SPS-agarosio. In ciascun pozzetto vengono introdotti 10 /ul di una soluzio ne all'1% della proteina enzimatica da sottoporre a test circa l'attivit? SPS-asioa. La piastra viene incubata per 18 ore a. 50?C, con un'umidit? relativa del 100%? Poi lo SPS ancora non decomposto viene precipitato oon una soluzione di uguali parti in volume di etanolo e di aoetone. Il test sulla piastra di agar per la SPS-asi ? positivo, per un campione posto in un pozzetto specifico, se appare una zona anulare limpida attorno a questo pozzetto?
II. Test di determinazione quantitativa dell'attivit? SPS-as_i ca.
Il fine di questo test ? la determinazione di attivit? enzi^ matiohe in grado di decomporre SPS in misura tale che i pro^ dotti di decomposizione mostrino un assorbimento o affinit? di legame alla proteina di soia fortemente ridotto o nullo. Esperimenti hanno mostrato che quella parte dei prodotti di decomposizione di SPS che non sono precipitati da una miscela di uguali volumi d'acqua e di etanolo, non ha alcun assorbimento o affinit? di legame verso la proteina di soia.
La determinazione di SPS-asi ? basata su una idrolisi di SPS in condizioni standard, seguita da una precipitazione di quel la parte di SPS ohe non ? idrolizzata oon etanolo. Dopo precipitazione, il contenuto di carboidrato che non ? precipitato, viene determinato mediante analisi quantitativa dello zucchero totale,(in accordo con AF 169/1, ohe pu? essere ottenuto da NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvaerd).
Le condizioni standard sono:
una linea retta, bisogna notare ohe essa non interseca il
punto (0,0).
SEZIONE 10b.
DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELL'ATTIVIT?' SOLUBILIZZANTE IL RESIDUO ESPRESSA COME SRUM 120.
Principio
Nel metodo per la determinazione dell'attivit? di idrolisi
la parte insolubile della farina di soia sgrassata, deproteneiz^ zata e sbucciata, viene idrolizzata in condizioni standard. La reazione enzimatica viene fermata con un agente di arresto e la parte insolubile viene eliminata per filtrazione. La quanti t? di polisaccaridi sciolti viene determinata spettrofotometri^ camente, dopo,idrolisi acida, in accordo con AP 169/1, disponi bile presso Novo Industri A/S, 2880 Bagsvaerd.
Le carboidrasi con endo- e eso-attivit? sono determinate in ac cordo con questo metodo.
Il substrato ohe si riferisce a questa determinazione enzimat? ca, ? identico al substrato del residuo descritto per il metodo SRU. Il substrato viene sciolto come soluzione al 3 % nel tampone citrato sotto indicato:
tampone citrato-fosfato 0,1 N a pH 4,5
L' apparecchiatura comprende:
Bagno d'acqua termostatato a 50?G con agitazione
Agitatore Whirlimixer
Centrifuga
Bagno di aoqua ghiacciata
I reagenti comprendono:
1 Unit? di attivit? SPS-asioa (SAE oppure SPSu)? definita come l'attivit? SPS-asioa ohe, nelle condizioni standard sopra indi oate, rilascia una quantit? di carboidrato solubile in etanolo al 50%, equivalente a 1 yumol di galattosio al minuto.
Anche se la parte iniziale della curva standard dell'enzima h
Definizione di unit?
Una unit? solubilizzante il residuo di soia (SRUM) 120 (M per manuale) ? la quantit? di enzima,che, nelle determinate condizioni di reazione per minuto, libera polisaccaridi solubilizzati equivalenti a una mioromole di galattosio.
SEZIONE 10c.
DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELL'ATTIVIT?* FROTEOLITICA.
Misurazione di HUT
Metodo per la determinazione di proteinasi in un mezzo acido.
Il metodo ? basato sulla digestione di emoglobina denaturata con l'enzima a 40?C, pH 3,2, per 30 minuti. La proteina non dige rita viene precipitata con acido tricloroaoetico al 14% (p/v%). Tutti i campioni di enzimi sono preparati sciogliendoli in tamp? ne acetato 0,1 M, pH 3,2.
Il substrato di emoglobina ? preparato usando 5,0 g di polvere di emoglobina bovina liofilizzata, conservata con tlomersalato all'1%, e 100 ml di acqua demineralizzata ohe viene agitata per 10 minuti, dopo 1 quali il pH viene rego lato a pH 1,7 con H010,33 N?
Dopo altri 10 minuti di agitazione, il pH viene regolato a 3,2 con NaOH 1N. Il volume di questa soluzione viene aumentato sino a 200 mi oon tampone acetato 0,2 M. Questo substra to di emoglobina deve essere refrigerato e tenuto cosi per 5 giorni.
Il substrato di emoglobina viene portato a temperatura ambien te. Al tempo zero, 5 ml di substrato vengono aggiunti a una provetta contenente 1 ml di enzima. Dopo agitazione per 1 secondo, la provetta viene posta in un bagno di acqua a 40?C per 30 minuti. Esattamente dopo 30 minuti, vengono aggiunti 5 ml di acido tricloroacetico al 14% alla provetta, che viene poi agitata e portata a temperatura ambiente per 40 minuti. Per la prova in bianco, il substrato di emoglobina viene por tato a temperatura ambiente. Al tempo zero, 5 mi del substrato vengono aggiunti a una provetta contenente 1 ml di enzima. Dopo agitazione per 1 secondo, la provetta viene posta in un ba gno di acqua a 40?C per 5 minuti. Esattamente dopo 5 minuti, vengono aggiunti 5 ml di acido trioloroaoetico al 14% alla pr? vetta, ohe viene poi agitata e portata a temperatura ambiente per 40 minuti
Dopo 40 minuti, le prove in bianco e i oampioni vengono agitati, filtrati una o due volte attraverso filtro Berzelius No. 0, e posti in uno spettrofotometro. Il campione viene letto contro la prova in bianco a 275 nm, regolando lo spettrofotometro oon acqua come riferimento.
Poich? l'assorbenza della tirosina a 275 nm ? un fattore noto, non ? necessario preparare una curva standard di tirosina a me no che aia richiesto per controllare lo spettrofotometro Beokman.
Calcoli
1 HUT ? la quantit? di enzima ohe, in 1 minuto, forma un idro lizzato equivalente, in assorbanza a 275 nm, a una soluzione di 1,10 miorogrammi/ml di tirosina in HCl 0,006 N. Questo valore di assorbanza ? 0,0084# La reazione dovrebbe avvenire a 40?C, pH 3,2, e in 30 minuti.
Una indagine sulla dipendenza della stabilit? della proteasi in KRF 68 dal pH, effettuata per mezzo di un'analisi HUT oon valori di pH da 2,0 a 8,0, mostr? che la stabilit? della proteasi, al di sopra di pH 8,0, era molto bassa, vedi figura 16. Per illustrare 1'invenzione, si fa riferimento ai seguenti e? sempi 1-8, dove l'esempio 1 illustra la produzione di SPS-asi, e gli esempi 2-8 illustrano 1'applicazione di SPS-asi, con un materiale grezzo a base di soia, per produrre una proteina vegetale purificata. Altre applicazioni della SPS-asi sono indicate nella .sezione tra l'esempio 8 e l'esame dei dati della figura 5.
Molte fermentazioni oon ceppi di Asp. aouleatus e Aap. japonicus qui indicati, vennero effettuate su scala di laboratorio. In tal modo vennero ottenute preparazioni ohe contenevano SPS-asi in accordo con il test di attivit? SPS-asioa qui indicato. Tuttavia, poich? vengono richieste quantit? piuttosto alte di SPS-asi per svolgere i tests di applicazione, fermentazioni simili vennero svolte su scala pilota, vedi il seguente esempio 1.
ESEMPIO 1
Produzione di una SPS-asi su scala pilota.
Una SPS-asi fu preparata mediante fermentazione sommersa di Aspergillus aouleatus CBS 101.43.
Un substrato di agar oon la seguente composizione fu preparato in un pallone Pem baoh:
Il pH fu regolato tra 5?30 e 5?35. Poi furono aggiunti 40 g di Agar Difoo, e la miscela fu poeta in autoclave per 20 minuti a 120?C (il substrato viene chiamato E-agar).
Il ceppo CBS 101.43 fu coltivato su E-agar slant (37?0).
Le spore provenienti dallo slant furono sospese in latte scm mato sterilizzato, e la sospensione fu liofilizzata in fiale. Il contenuto di una fiala liofilizzata fu trasferita nel pallone Fernbach'. Il pallone fu poi incubato per 13 giorni a 30?C.
In un fermentatore a inseminazione da 500 litri, venne preparato un substrato con la seguente composizione:
Venne aggiunta aoqua di rubinetto sino ad un volume totale di circa 240 litri. Il pH fu regolato a circa 5?5 prima della aggiunta di CaCO3. Il substrato fu sterilizzato in un fermenta tore a inseminazione per un?ora a 121?G. Il volume finale pr:L ma dell?inoculazione fu di circa 300 litri.
La sospensione di spore in pallone di Pem bach fu trasferita al fermentatore a inseminazione. Le condizioni di fermentazione a inseminazione erano!
Circa 28 ore dopo lfinoculazione 150 litri furono trasferiti flu? fermentatore a inseminazione al fermentatore principale.
In un fermentatore principale da 2500 litri venne preparato un substrato con la seguente composizione:
Venne aggiunta acqua di rubinetto a un volume totale di circa 900 litri. La farina di soia tostata fu sospesa in acqua* Il pH venne regolato a 8,0 con NaOH, e la temperatura fu innalzata a 50?C. Dopo di che alla sospensione vennero aggiunte circa 925 unit? Anson di ALCALASE ? 0,6 L. La miscela fu tenuta per 4 ore a 50?C e pH 8,0 (aggiunta di Na2CO3) senza areazione, a zero ato e 100 rpm di agitazione. Dopo di ohe i componenti del substrato rimanente furono aggiunti e il pH fu regolato a cir oa 6,0 oon acido fosforico. Il substrato fu sterilizzato nel fermentatore principale e per 1? ore a 123?C. Il volume finale, mila. Il volume totale di soluzione di pectina per una fermentazione era di oiroa 725 litri.
Dopo oiroa 151 ore di fermentazione, il prooesso di fermentazione fu arrestato* I oiroa 1850 litri di brodo di coltura fu rono raffreddati a oiroa 5?C e gli enzimi furono raccolti in aooordo oon il seguente metodo.
Il brodo di coltura fu filtrato su un filtro a tamburo a pressione (Dorr Oliver), che fu prerivestito oon farina fossile (terra di diatomee) Hy-flo-super-oel (coadiuvante di filtrazione). Il filtrato fu concentrato per evaporazione a circa il 15# del volume del brodo di coltura. Il concentrato fu filtrato su un foglio di filtrazione Seitz (tipo supra 100), con 0,25# di Hy-flo-super-cel come coadiuvante di filtrazione (nel la seguente tabella definito come filtrazione I). Il filtrato fu precipitato oon 561 g di (NH42SO4/l a pH 5,5? e venne aggiunto il 4# di farina fossile Hy-flo-super-oel come coadiuvante di filtrazione. Il precipitato e il coadiuvante di filtrazione vennero separati per filtrazione su un filtro a telaio. Il panello di filtrazione viene sciolto in acqua, e le parti insolubili vengono separate per filtrazione su un filtro a telaio. Il filtrato viene pre-filtrato su un foglio per fil_ trazione Seitz (tipo supra 100) oon 0,25# di Hy-flo-super-cel come coadiuvante di filtrazione (nella seguente tabella definii to filtrazione II). Il filtrato viene diafiltrato su una apparato per ultrafiltrazione. Dopo diafiltrazione, il liquido vie? prima dell?inoculazione, fu di ciroa 1080 litri.
Poi vennero aggiunti 130 litri alla coltura di inseminazione. Le condizioni di fermentazione erano:
Da 24 ore -di fermentazione a oiroa 116 ore di fermentazione, la soluzione di pectina fu aggiunta in modo asettico al fermen tatore principale, a una velocit? costante di circa 8 litri per ora. In un serbatoio di dosaggio da 500 litri venne prepa
rata la soluzione di pectina con la seguente composizione:
Venne aggiunta acqua di rubinetto sino ad un volume totale di oiroa 325 litri. Il substrato venne sterilizzato in un serbatoio di dosaggio per 1 ora a 121?C. Il volume finale, prima dell?inizio del dosaggio, era di circa 360 litri. Quando questa porzione fu esaurita, venne preparata un?altra porzione si^ ne concentrato sino a un contenuto in sostanza seooa del 12,7fi (nella seguente tabella definito oome contenuto di sostanza seooa nel concentrato)?
A questo stadio pu? essere effettuato un trattamento facoltativo di base per la rimozione parziale dell'attivit? proteasioa. Nel oaso in cui il trattamento di base sia utilizzato, esso viene effettuato a pH di 9,2 per 1 ora, dopo
di che il valore di pH viene regolato a 5,0,
Ora il liquido viene prefiltrato e filtrato allo scopo di ridurre la carica batterica, e il filtrato viene liofilizzato in un'apparecchiatura per liofilizzazione prodotta da Stokes.
Vennero effettuate quattro fermentazioni nel modo sotto indicato, in cui vennero variati il ceppo utilizzato per la fer mentazione, l'uso per il trattamento facoltativo di base e altri parametri, oome indicato nella seguente tabella.
Dopo la filtrazione per ridurre la oarioa batterica, il filtrato viene concentrato per evaporazione in un rapporto di 1*2,3? Una parte minore del filtrato concentrato fu essi? oato a spruzzo e la parte rimanente fu liofilizzata.
Per ridurre ulteriormente l'attivit? proteasioa, alcuni
dei preparati sopra indicati vennero trattati oome indicato sotto, per oui venne utilizzata solo una delle tre alternative A, B e C.
A. 100 gramml di preparato di SPS-asi sono soiolti in
I litro di aoqua deionizzata, sotto agitazione, a 10?C 2?C. II pH viene regolato a 9,1 con NaOH 4 N. Questo trattamento di base viene effettuato per 1 ora. Poi il valore di pH viene regolato a 4?5 con acido acetico glaciale, ed esso viene dializzato contro acqua ghiacciata deionizzata fino ad una condut^ tivit? di 3 mSi. Poi vengono effettuati il congelamento e la liofilizzazione.
B. 500 Gramml di preparato di SPS-asi vengono sciolti in 4 litri di acqua deionizzata, sotto agitazione, a 10?C 2?C. Il pH viene regolato a 9?1 con NaOH 4 N. Questo trattamento di base viene effettuato per un'ora. Il valore di pH viene poi re^ golato a 5?0 con acido acetico glaciale. Il materiale ottenuto viene liofilizzato.
C. 50 Gramml di preparato di SPS-asi vengono soiolti in 400 ml di aoqua deionizzata, sotto agitazione, a 10?C+2?C. Il pH vie ne regolato a 9,1 con NaOH 4 N. Questo trattamento di base viene effettuato per un'ora. P?i il pH viene ridotto a 5,7 con acido acetico glaciale. Il materiale ottenuto viene liofilizzato.
I preparati sopra indicati sono caratterizzati dalle loro attivit? degli enzimi relativi all'invenzione nella seguen te tabella.
ESEMPIO 2 (esempio di applicazione)
Questo esempio desorive la produzione di un ?????? da farina di soia sbuooiata e sgrassata, "Sojamel 13" (commercialmente disponibile presso Aarhus Oliefabrik A/S). Il contenuto di sostanza Becca di questa farina era del 94,0# e il contenuto di (N x 6,25) in base alla sostanza seooa era del 58,7#? La farina di soia fu trattata con i preparati di SPS-asi KRF 68 BII (esempio 1) nel seguente modo:
85,2 g della farina di soia furono sospesi e mantenuti sot to agitazione a 50?C in 664,8 g di acqua, e il pH fu regolato a 4,5 per mezzo di 7,5 ml di HC16 N. Vennero aggiunti 50 g di una soluzione contenente 4,0 g di detto preparato di SPS-asi, e la miscela di reazione fu poi agitata per 240 minuti a 50?G. La miscela fu poi centrifugata in una centrifuga da laboratorio (modello Beekman J-6B) per 15 minuti a 3000 x g. Il surnatante fu pesato e analizzato per l'N Kjeldahl e per la sostanza seooa. La fase solida fu poi lavata con un volume di acqua equivalente alla massa di sum atante ottenuto dalla pri ma centrifugazione. Questa operazione venne effettuata due volte. La fase solida fu poi liofilizzata, pesata e analizzata per l'N Kjeldahl e la sostanza secca presso il Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus 0, Danimarca. Questo laboratorio ? autorizzato dallo Stato per analisi di mangimi e prodotti caseari, I risultati ottenuti nell'espe rimento appaiono dalla Tabella 2,1:
TABELLA 2.1 Risilitati ottenuti
Cos? venne ottenuto un p.v.p. con una purezza di proteina,
cio? N x 6,25 in base alla sostanza secca, del 91,4%, e
con una resa totale eli proteina dell'83%*
ESEMPIO 3 (esempio di applicazione)
Questo esempio venne effettuato per paragonare le rese di proteina, la qualit? nutrizionale e alcune propriet? funzionali dei prodotti di proteina di soia preparati mediante i
tre seguenti procedimenti:
A: La tradizionale precipitazione isoelettrica per la pr? duzione di isolato di proteina di soia.
B: Il tradizionale lavaggio isoelettrico per la produzione di concentrato di proteina di soia
C* Il lavaggio isoelettrico in accordo con l'invenzione, comprendente un enzima solubilizzante il residuo, per
la produzione di p.v.p.
Per dare vita a un paragone veritiero tra il procedimento in accordo con l'invenzione (C) e i procedimenti convenzionali
per la proteina di soia (A e B), ? stato utilizzato lo stesso materiale grezzo in tutti e tre i oasi? Anche gli esperi^ menti sono stati oondotti in maniera tale ohe le temperature corrispondenti e i tempi di trattamento fossero gli stessi in tutti e tre i casi? Solo i valori di pH furono diversi, a causa delle differenze fondamentali tra i.tre esperimenti? A? La precipitazione isoelettrica tradizionale per la produzione di isolato di proteina di soia
425,8 Gramml di farina di soia (Sojamel 13 prodotta da Aarhus Oliefabrik A/S), furono estratti in 3574,2 g di acqua di rubinetto a 50?G. Il pH fu regolato a 8,0 con 20,1 g di NaOH 4 N, Dopo 1 ora di agitazione, la sospensione fu centri^ fugata a 3000 x g per 15 minuti, utilizzando quattro bicchieri (beakers) da 1 litro in una centrifuga da laboratorio (mo dello Beckman J-6B). Il centrifugato I e il precipitato I furono pesati? Il precipitato I fu estratto di nuovo con ac qua, sino a un peso totale di 4000 g* La temperatura fu mante: nuta a 50?C, il pH fu regolato a 8 con NaOH 4 N, e la sospensione fu mantenuta sotto agitazione per 1 ora. Vennero effettuate una centrifugazione e una pesata del centrifugato II e del precipitato II, come sopra. Vennero prelevati campioni dal centrifugato I e II, e dal precipitato II per le determinazioni Kjeldahl e di sostanza secca. Successivamente i centrifugati I e II furono miscelati e tenuti a 50?C. La pro^ teina fu precipitata isoelettrioamente a pH 4,5, per mezzo di 45 g di HOl 6 N. Dopo agitazione per 1 ora a 50?C, la proteina fu raccolta per centrifugazione a 3000 x g per 15 minuti. Il centrifugato III fu pesato e analizzato per l'N Kieldahl e la sostanza seooa. La fase solida III fu pesata e lavata oon acqua? in una quantit?,oorrispondente al peso del centrifugato I. Il lavaggio fu effettuato mediante agitazione per 1 ora a 50?C. La proteina lavata fu raooolta mediante centrifugazione a 3000 x g per 15 minuti. Il oentrifu gato IV e la fase solida XV furono pesate. Il centrifugato IV fu analizzato per l'N Kieldahl e la sostanza secca. La fase solida fu sospesa in 1550 g d'acqua a 50?C, e il pH fu regolato a 6,5 con 17 g di NaOH 4 N. La miscela fu mantenuta sotto agitazione per 1 ora, e il pH fu di nuovo regolato a 6,5, oc necessario. Infine il prodotto fu liofilizzato, pesa to e analizzato per l'N Kjeldahl e la sostanza secca. I cal coli di bilancio di massa sono mostrati nella Tabella 3.1.
ABELLA 3.1 Calcoli di bilancio di massa della precipitazione isoelettrioa tradizionale per la produzione di iso lato di proteina di soia.
B. Lavaggio isoelettrioo per la produzione di concentrato _ di proteina di sola_
425,6 gramml di farina di soia (Sojamel 13, prodotta da Aarhue Oliefabrik A/S), furono lavati in 3574 g di aoqua a 50?C. Il pH fu regolato a 4?5 oon 44,8 g di H016 N.
Il lavaggio fu effettuato per 4 ore per agitazione. La sospensione fu poi oentrifugata a 3000 x g per 15 minuti? in una centrifuga da laboratorio (Beckman, modello J-6B) utilizzando quattro bicchieri da 1 litro. Il dentrifugato I fu pesato e analizzato per l'N Kjeldahl e la sostanza secca.
La fase solida I fu pesata e rilavata oon aoqua sino a un peso totale di 4000 -g. Il pH fu di nuovo regolato a 4,5 con 1,7 g di HC16 N, e la sospensione fu tenuta sotto agitazione per 30 minuti a 50?C, Vennero effettuate una centrifugazione e una pesata del centrifugato H e dei solidi II, come sopra. La fase solida II fu risospesa in 1575 g di ac-HgO a 50?C, e il pH fu regolato a 6,5 con 34,5 g di NaOH 4 N. La miscela fu mantenuta sotto agitazione a 50?C per 1 ora, e riportata a pH = 6,5, se necessario. Infine il prodotto proteico fu liofilizzato, pesato, e analizzato per l'N Kiel dahl e la sostanza secca. Il bilancio di massa ? riportato in Tabella 3.2.
TABELLA 3.2 Calcoli di bilancio di massa del lavaggio isoelettrico per la produzione di concentrato di proteina di soia?
C. Lavaggio isoelettrioo comprendente un enzima solu-_ bilizzante il residuo per la produzione di p.v.p.
425?8 Gramml di farina di soia (Sojamel 13, prodotta da Aarhus Oliefabrik A/S), furono lavati in 3524,2 g di aoqua
a 50?C. Il pH fu regolato a 4?5 utilizzando 43,7 g di HC1
6 N, 24 Grammi del preparato di SPS-asi KRF 68 BU I (esem
pio 1) furono solubilizzati in 26 g di aoqua e aggiunti alla miscela di lavaggio. Il lavaggio fu poi effettuato per
4 ore, sotto agitazione. Successiv?mente, venne effettuata
la purifioazione come descritto per B, le quantit? di HC16 N, NaOH 4 N e di acqua per la^risospensione essendo i soli para-
metri oon valori discostantisi. Il bilancio di massa ? mostra-
to nella Tabella 3,3.
TABELLA 3*3 Calcoli di bilancio di massa del lavaggio isoelettrico comprendente un enzima "solubilizzante il residuo per la produzione di p.v.p.
1) Analizzato presso Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10,
DK-6000 Kolding, Danimarca
2) Analizzato presso Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000, Aarhus C, Danimarca,
Propriet? nutrizionali
Furono determinate le composizioni in aminoacidi dei tre prodotti proteici, vedi tabella 3?4? Il contenuto totale di aminoacidi essenziali, la classificazione chimica e lo indice di aminoacidi essenziali (EAAl) sono calcolati utilizzando il modello di riferimento della FAO dal 1957? Il contenuto di inibitore di tripsina dei tre prodotti fu determinato per mezzo del metodo descritto in A.O,C.S. Tentativo Method Ba 12-75 (A.O.C.S., ? un*abbreviazione per American Oil Chemista? Society),
I risultati sono mostrati nella tabella 3?5 che comprende anche le rese e il rapporto proteina/sostanza seooa dei tre prodotti.
TABELLA 3.4 Composizione in aminoacidi e valutazione nutrizionale dei tre prodotti proteici A, B e C.
aas = indice di amino acidi basato sul modello di riferimento della PAO (1957).
TABELLA 3.5 Caratteristiche di procedimento e contenuto
di inibitore di tripsina dei tre prodotti
proteici A? B e C,
Propriet? funzionali
Indice di solubilit? in azoto (NSl) fu determinato in una dispersione di proteina all'1% a pH = 7?0 in NaCl 0,2 M e rispet tivamente in acqua distillata. Dopo agitazione per 45 minuti con un agitatore magnetico, la sospensione fu centrifugata a 4000 x g per 30 minuti, e il sum atante fu analizzato per l'azo to. La solubilit? dell'azoto fu calcolata come (% di N solubile/ % totale di N). I risultati di questa valutazione sui tre prodotti sono mostrati in tabella 3.6.
Capacit? emulsionante fu determinata tre volte su ciascun prodotto mediante una titolazione Swift leggermente modificata.
4,0 Gramml di (N x 6,25) del prodotto furono miscelati in 250 ml di NaCl 0,5 M con un Sorvai Omnimixer a bassa velocit?.
50 MI della sospensione furono trasferiti in un vibratore miscelatore in vetro, e vennero aggiunti 50 ml di olio di soia. Quindi la miscela totale fu pesata. La miscela olioacqua fu poi omogeneizzata a 10.000 rpm con il vibratore in un bagno di ghiaccio. Una quantit? supplementare di olio di soia fu aggiunta a una velocit? di 0,3 mi al secondo sino a che l'emulsione si invert?. La quantit? totale di olio aggiunta prima del ''punto finale" fu trovata per pesata.
La capacit? emulsionante fu calcolata come ml di olio per gramml di proteina (N x 6,25)? La densit? dell'olio fu presa come 0,9 g/ml.
I risultati medi della determinazione della 'capacit? emulsio^ nante sui tre prodotti sono mostrati nella tabella 3.6.
Espansione di vibrazione fu determinata in una soluzione di proteina al 3% a pH = 6,5? 250 MI della dispersione acquosa dei oampioni di proteina furono frullati a velocit? III per 4 minuti in un miscelatore Hobart (modello N?50) mon tato con un vibratore a frusta. L'espansione di vibrazione fu calcolata secondo la formula
in cui V = volume finale di vibrazi?ne in mi.
V fu misurato riempiendo di nuovo il vibratore di miscela zione con acqua. Vennero effettuati duplicati per ciascuno dei tre oampioni. I risultati medi sono mostrati in tabella 3.6
La stabilit? di schiuma fu determinata come il rapporto tra la quantit? di schiuma lasciata dopo scolamento per 30 minuti e la quantit? originale di schiuma. Un grammo di schiu ma prodotto secondo il metodo di cui sopra, venne introdotto in un cilindro di plastica (diametro 7 cm, altezza 9 om) avente una rete di fili metallici con una dimensione delle maglie di 1 mm x 1 mm. Il cilindro fu posto su un imbuto sul la sommit? di un cilindro di vetro e venne determinato il pei so (B) di liquido drenato nel cilindro di vetro. La stabilit? della schiuma.ES ? determinata dalla equazione
I risultati della determinazione sono mostrati nella tabella 3.6.
La resistenza del gel b definita in questa descrizione come la viscosit? Brookfield misurata per mezzo di mandrini a T su una gabbia Brookfield Helipath. I gels furono prodotti me_ diante trattamento con calore, di sospensioni di proteina al 12# in NaCl 0,5 M. Il trattamento con calore venne effettuato in lattine chiuse oon un diametro di 7,3 cm e un'altezza di 5,0 om, poste in un bagno di acqua mantenuta a 80?C e 100?C, ciascuna per 30 minuti. Le lattine furono raffreddate e termo statate a 20?C, prima di essere aperte e misurate. I risultati delle misurazioni sono illustrati nella tabella 3.6.
TABELLA 3.6 Propriet? funzionali dei tre prodotti proteici
A, B e C.
ESEMPIO 4 (esempio di applicazione)
Un p.v.p. fu prodotto secondo il procedimento descritto nell'esempio 3 C, tranne che l'attivit? cellulasica fu parzialmente derivata da Trichoderma resesi. IL preparato oell?lasico commerciale CELLUCLAST, prodotto da Novo Industri A/S, fu trattato con una base a bassa temperatura nel seguente modo. Il valore di pH di una soluzione di CELLUCLAST al 10% in acqua, fu regolato a 9,2 con NaOH, e la soluzione cos? risultante venne raffreddata a 5?C, Dopo un'ora a questo pH e a questa temperatura, il pH venne di nuovo regolato a 4,7 oon acido noetico al 20#, Questa soluzione fu mantenuta a 5?C per ima notte, e poi sottoposta a filtrazione sterile. Il filtrato fu liofilizzato, 4 Grammi del prodotto liofilizzato furono aggiunti al preparato KRF 68 BU I di SP5 (esem
pio 1). I due enzimi vennero solubilizzati in 172 g di aaqua, prima dell'aggiunta alla miscela di lavaggio. Le determinazioni del bilancio di massa di questo esempio sono riportate nella tabella 4?1?
L'esperimento dimostra che questo particolare preparato di SPS-asi, contiene gi? una oellulasi efficiente, poich? l'aggiunta di CELLUCLAST non sembra influenzare il rapporto proteina/sostanza secca. Tuttavia, altre preparazioni di SPS-asi possono contenere meno cellulasi, per esempio KRF 92, vedi la tabella immediatamente precedente l'esempio 2.
TABELLA 4.1 Determinazioni del bilancio di massa del lavaggio isoelettrico comprendente un prepara to di SPS-asi e CELLUCLAST ? per la produzione di p.v.p.
ESEMPIO 5 (esempio di applicazione)
Un p.v.p. fu prodotto in accordo con il metodo descritto nell'esempio 3 C, tranne che tutte le masse furono diminuite con un fattore di 5? e che la miscela di reazione fu raffreddata a oirca 5?C prima della centrifugazione. Sulla base dei risultati analitici, in rapporto ai centrifugati si ottiene una resa teorica della proteina precipata, come illustrato nella tabella 5.1.
TABELLA 5.1 Rese teoriche di proteina ottenute nella produ?
zione di pv p
a Media di 87,5 (Bioteknisk Institut) e di 86,9 (Qvist's Laboratorium); la sostanza secca ? rispettivamente 97,6 e 98,0%.
13 Calcolato oome masea totale di proteina - proteina persa nei centrifugati.
ESEMPIO 6 (esempio di applicazione)
Dimostra zione del legame proteico di SPS
40 Gramml di (N x 6,25) proveniente da un isolato commerciale di proteina di soia (Purina 500 E prodotto da Ralston Purina) fu sciolto in 680 g di acqua. La miscela fu scaldata in un bagno di aoqua a 50?C, e il pH fu regolato a 4?50 oon HC1 6 N, 90 Gramml di questa miscela furono trasferiti in palloni di Erlenmeyer da 5 x 250 mi e vennero aggiunti 10 g di soluzioni acquose contenenti rispettivamente 0 g, 0,2 g, 0,4 g, 0,8 g, e 1,6 g dello SPS prodotto come descritto precedentemente in questa descrizione. I palloni furono poi tenuti sotto agitazione con un magnete in un ba gno d'acqua a 50?C per 240 minuti.
Quindi le sospensioni furono centrifugate a 3000 x G per 15 minuti, e i c?ntrifugati I vennero analizzati per l'N Kjeldahl e la sostanza secca. Le fasi solide vennero lavate in acqua a temperatura ambiente e ri-centrifugate. Questo procedimento venne ripetuto. Poi i solidi furono di spersi in 50 ml di acqua, e il pH fu regolato a 6,50 per aggiunta di NaOH 6 N a goccia a goccia. I prodotti neutralizzati furono liofilizzati e analizzati per l'N Kjeldahl e la sostanza secca. In base alle analisi mostrate in tabella 6.1, il recupero di proteina e la percentuale di SPS che ? stata legata alla proteina sono calcolate mediante le for mule riportate in r lazione alla tabella 6.2.
Questo esempio dimostra che lo SPS ? strettamente legato al la proteina, cosicch? il rapporto proteina/sostanza secca diminuisce con l'aumentane del contenuto di SPS. Un contenuto di SPS paragonabile a circa 0,4 g in 10 g di acqua aggiun ti a 5 g di isolato di proteina ? il rapporto proteina/SPS presente nella farina di soia.
La percentuale di legame di SPS ? un valore calcolato. La percentuale di legame di SPS diminuisce a causa della saturazione della proteina rispetto a SPS, a bassi rapporti proteina/SPS.
TABELLA 6.1 Misurazioni in accordo con l?esempio 6
TABELLA 6,2 Ricupero di proteina e percentuale di legame
di SPS
ESEMPIO 7 (esempio di applicazione)
Questo esempio descrive la produzione di un p.v.p. Utilizzando il preparato di SPS-asi KRF 92 B-I, in un dosaggio d?i 5% della sostanza secca. Il modo di produzione fu esattamente come nell'esempio 3 C, fatta eccezione per il fatto che tutte le masse furono diminuite con un fattore di 5. Il p.v.p. fu analizzato come descritto nell'esempio 2, I risultati ottenuti nell'esperimento appaiono dalla tabella 7,1,
TABELLA 7.1 Risultati ottenuti nell'esempio 7
Analizzato presso il Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10,
DK-6000 Kolding
Analizzato presso il Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C
ESEMPIO 8 (esempio di applicazione)
Questo?esempio dimostra l?effetto del pretrattamento della
farina di soia mediante cottura a getto prima della produzio
ne di p.v.p.
Pretrattamento
Una sospensione di farina di soia in acqua, costituita da 10
kg di farina di soia (Sojamel 13 prodotta da Aarhus Oliefabrik A/S) per 100 kg, fu pompata attraverso un eiettore di va
pore (tipo Hydroheater B-300) e miscelata con vapore di 8 Bar
in quantit? tale e mediante un flusso tale che la temperatura finale di 150?C pot? essere mantenuta per 25 secondi in un reattore tubolare pressurizzato. Dopo di che la pressione fu liberata in una "flash chamber" (un oiclone) e da qui la sospensione fu inviata attraverso uno scambiatore di calore a piastra e raffreddata a oiroa 50?C* La sospensione raffreddata sarebbe potuta essere usata direttamente per la produzione di p.v.p. secondo l'invenzione, ma in questo caso la sospensione fu essiccata a spruzzo ad una temperatura di entrata di 200?C e a lina temperatura di uscita di 90?C. Si trov? che il prodotto pretrattato aveva un con tenuto di sostanza secca del 96,5% e un contenuto di proteina del 56,9% (N x 6,25).
Produzione di ?,?,?,
Questa produzione venne realizzata nel seguente modo:
70 g di sostanza secca della farina di soia cotta a getto ed essiccata, furono sospesi e mantenuti sotto agitazione a 50?C in 56? g di acqua, e il pH fu regolato a 4?50 mediante 6,5 ml di HCl 6 N. 6 x 90 Gramml di questa sospensione furono trasferiti a 5 palloni di Erlenmeyer da 250 mi e mantenuti sotto agitazione in un bagno di acqua di 50?C mediante agitatori ma gnetici. Ciascun pallone fu addizionato di 10 g di una soluzione contenente rispettivamente 0 g; 0,025 g; 0,050 g; 0,10 g; 0,20 g, e 0,40 g del preparato di SPS-asi KRF-68-B-IH . Le miscele di reazione furono poi agitate per 240 minuti a 50?C. Quindi venne effettuata una centrifugazione a 3000 x g per 15 minuti.
Il surnatante venne poi analizzato per l'N Kjeldahl e la fase solida fu lavata oon aoqua a uguali volumi e centrifugata. Questo procedimento venne effettuato 2 volte. La fase solida fu poi liofilizzata ed analizzata per l?N Kjeldahl e la sostan za seooa.
Un esperimento simile venne realizzato oon ima farina di soia non trattata (Sojamel 13 prodotta da Aarhus Oliefabrik A/S) come materiale di partenza. In questo caso i rapporti enzima substrato furono 0; 1%; 2%; 3%; 4%; e 8%.
In base al contenuto di proteina dei surnatanti, pu? essere calcolata la percentuale di proteina raccolta. La resa di proteina ? basata sulla supposizione che il prodotto enzimatico ? solubilizzato al 100% dopo la reazione. La tabella qui sotto mostra i risultati ottenuti da entrambi gli esperimenti. TABELLA 8.1 Rese di proteina e rapporto proteina sostanza secca per p.v.p. prodotta da farina di soia cotta o grezza.
In relazione ai procedimenti di estrazione (isolamento) per materiali diversi dalle proteine o di liquefazione e correlato a questi processi, si fa riferimento allo schema generale di procedimento per applicazioni come illustrato nel foglio di lavorazione n. 3?
Il substrato pu? essere uno o pi? carboidrati presenti in un materiale grezzo, o pu? essere l'intero materiale grezzo. Questo substrato pu? essere sottoposto a un pre-trattamento di natura chimica o fisica, come spiegato pi? avanti, per esempio trattamento acido o basico, lavaggio o macerazione, e/o cottura con o senza vapore.
Il materiale grezzo pu? essere macerato, triturato, macinato a umido, e/o omogeneizzato (tutti questi trattamenti essendo definiti omogeneizzazione nel foglio di lavorazione n. 3), con o senza aggiunte di acqua, e durante questo stadio poss? no essere aggiunti altri additivi. L'omogeneizzazione pu? e? sere effettuata con diverse efficienze, cio? con diverse pres sioni, essendo solo una frazione della pressione massima data per 1'omogenizzatore specifico utilizzato. Possono essere aggiunti diversi additivi prima o durante l'omogeneizzazione, come simbolizzato mediante b , b,,, ... b^ nel foglio di lavo razione n. 3.
Il procedimento di reazione comprendente la preparazione di SPS-asi ? realizzato in condizioni specifiche, per esempio temperatura, pressione, tempo, pH e dosaggio di enzima; sono importanti anche raccomandazioni riguardanti il reattore utilizzato (per esempio reattore discontinuo, reattore con flui so a tappo, cio? " plug-flow")? e l'agitazione, se neoessari. Pu? essere data una serie di additivi per diversi materiali grezzi, come indicato da c1 , c2, ??? cn nel foglio di lavorazione n. 3,
Anche i procedimenti di separazione possono essere realizzati con differenti efficienze. Durante molti procedimenti, la separazione viene eliminata o facilitata, per esempio quando il materiale grezzo ? completamente liquefatto. Possono essere utilizzati differenti apparati di separazione (per esempio cen trifughe, filtri, apparecchi per ultrafiltrazione, idrocicloni, concentratori, setacci o vagli, oppure semplici decantatori).
L'efficienza di separazione ? definita come la proporzione tra il contenuto assoluto di sospensione nella fase solida e il con tenuto assoluto di sospensione della miscela di reazione.
Le fasi liquide o solide ottenute possono essere trattate ulteriormente, per esempio concentrate, essiccate, oppure estratte con solvente, per rimuovere alcuni componenti come grasso od olio, fermentate per la produzione di biomassa, di alcool o di altri prodotti (enzimi, antibiotici, o altri componenti prezi?si)
I prodotti ottenuti possono anche essere riciclati a ripetere
il trattamento attraverso lo schema di procedimento.
FOGLIO DI LAVORAZIONE N. 3
In quanto segue vengono dati alcuni esempi di applicazione dei preparati di SPS-asi, e un?indagine di questa applicazione appare dalla lista seguente.
Inoltre, nella tabella I unita, vengono indicate alcune caratteristiche in relazione con il foglio di lavorazione n. 3 Lista di applicazioni esemplificative di preparati di SPS-asi
Segue : Lista di applicazioni esemplificative di preparati
di SPS-asi
TABELLA I
A 1? Estrazione di amido da grano, frumento e patate.
L'estrazione di amido da grano, frumento, patate e altre piante contenenti amido viene realizzata mediante
imo o pi? degli stadi di : macerazione, macinazione a umido, e separazione. L'applicazione di un preparato di SPS-asi, es senzialmente privo di attivit? amilolitioa, fornir? i seguen ti vantaggi, por esempio utilizzando il grano:
1. La liberazione dell'amido sar? facilitata duran te un periodo di macerazione pi? breve, 2. Il consumo di acqua pu? essere ridotto,
3. La liberazione del germe di grano verrebbe faoi^ litata senza liberazione di olio di germe di grano, 4. La proteina pu? essere ottenuta con purezza pi? elevata,
5. Il ricupero di acqua di macerazione del grano ver rebbe facilitato.
A 2, Estrazione di lipidi da materiale vegetale.
Poich? i lipidi nei materiali vegetali sono rinchiusi all'interno delle cellule, e generalmente legati alle proteine, i lipidi possono essere estratti in fase acquosa per trattamen to con un preparato di SPS-asi che sia essenzialmente libero da lipasi. Cos?, l'olio di germe di grano viene normalmente usa to mediante estrazione con esano dei germl di grano essiccati. Tuttavia, l'operazione di essicoamento b superflua se i germi di grano bagnati vengono trattati con un preparato SPS?asico del tipo sopra indicato. Analogamente, l?estrazione dell'olio di oliva in fase aoquosa pu? essere migliorata, se l'enzima Utilizzato per il trattamento enzimatico ? un preparato SPS-asi co del tipo sopra indicato, vedi per esempio Food, Pharmaoeu tioal and Bioengineering, No, 172, voi. 74, p. 93 - 94? Inoltre, in modo simile pu? essere migliorata l'estrazione acquosa, per esempio, dell'olio di soia, dell'olio di seme di ravizzone e dell'olio di girasole.
A 3. Estrazione di olii eterei da materiali vegetali.
Se materiali vegetali contenenti olii eterei sono estratti con una soluzione acquosa di un preparato di SPS-asi, essenzialmente privo di attivit? enzimatica in grado di decomporre o altrimenti di cambiare gli olii eterei, gli olii eterei verranno ricuperati con rese alte a un costo molto basso.
A 4. Estrazione di agenti coloranti naturali da materiale vegetale.
Se materiali vegetali contenenti agenti coloranti, per esempio barbabietole contenenti l'agente colorante rosso beta nina o l'agente colorante nei mirtilli, vengono trattati con un preparato SPS-asico essenzialmente privo di attivit? enzima tiohe in grado di decomporre o altrimenti di cambiare gli agen ti coloranti, questi ultimi verranno ricuperati in alte rese a un costo molto basso.
A.5. Estrazione di gomma dall'arbusto guaiule.
Un altro esempio di un substrato per un preparato di SPS-aei ohe eia essenzialmente privo di attivit? enzimatica in grado di degradare la gomma nativa, ? il materiale della parete cellulare nelle radici e nei rami dell'arbusto guaiule. Ba 1. Produzione di un sostituto di latte per animali dome.
stioi, preferibilmente un sostituto di latte per vitelli.
Mediante una liquefazione totale in mezzo acquoso di soia, seml di girasole, seml di cotone, fave o oeoi, pu? essere prodotto un sostituto di latte per vitelli, solubile in acqua fredda ad un valore d? pH di circa 4,5? Utilizzando i materiali grezzi contenenti amido quali le fave o i caci, bisogna realizzare una liquefazione dell'amido per mezzo di una alfa-amilasi prima, dopo o contemporaneamente oon il trattamento con una SPS-asi, ohe solubilizza infine i polisaccaridi non amilacei presenti come materiale strutturale nelle pareti cellulari.
Un esempio dettagliato h mostrato qui sotto utilizzando fave, e per quanto riguarda la soia si fa riferimento alla tabella I. Il pretrattamento di detta soia pu? essere preferibilmente una cottura a getto che migliora la solubilizzazione del residuo. ESEMPIO Ba 1.1
15 Chilogramml di farina di fave (Parine de Feves prodotta da GRANDES MINOTERIES A FEVES DE FRANCE, Parigi) furono sospesi in 35 litri di acqua. 75 Gramml di Termamyl 60 L e 18 g di GaCl2 vennero aggiunti. La sospensione fu scaldata a 95?C uti_ lizzando un recipiente con camicia di riscaldamento a vapore, e fu agitata. La sospensione fu poi trattata a questa temperatura per 60 minuti. Quindi il pH fu regolato a
pH =s 4,5, e il prodotto fu raffreddato a 50?C. 300 Grammi del preparato di SPS-asi KRF 68 furono solubilizzati in
I litro di acqua e aggiunti. La reazione fu effettuata per 440 minuti.
Quando vennero aggiunti 10 g di Fungamyl 800 L, la frazio- i ne amilacea principale venne convertita a disaccaride (mal tosio). Successivamente la miscela di reazione fu pastori^ zata a 90?C per 2 minuti. Una certa quantit? del prodotto fu poi liofilizzata e utilizzata per prove di stabilit?.
II campione fu poi solubilizzato al 10% di sostanza secca, e la soluzione del prodotto pot? essere mantenuta stabile senza sedimentazione per giorni.
I grassi fusi o gli olii possono essere emulsionati facilmen te nel prodotto, per cui pu? essere ottenuta una composizione finale molto simile al latte ?i mucca. Anche un'emulsione con tenente il 3,5% di olio (olio di soia) pu? essere mantenuta sta bile, senza sedimentazione, per giorni.
ESEMPIO Ba 1.2
Farina di soia (Sojamel 13) fu cotta a getto a 150?C per 25 secondi, come descritto nell'esempio 8. La farina di soia cotta a getto fu essiccata a spruzzo e utilizzata per ulteriori studi descritti in quanto segue.
Al
50 Grammi della farina di soia cotta a getto furono miscelati con 450 g di acqua, e il pH fu regolato a 4,5 con 4,1 ml di HC1 6 N. La miscela fu poi scaldata a 45?C in un bagno di acqua, e 0,250 g del preparato SPS-asico KRF-68 furono aggiunti alla miscela riscaldata, ohe fu poi posta a reagire per 5 ore, sotto agitazione. Dopo di che la miscela fu trattata termicamente a 80?G per 2 minuti, per inattivare l'enzima. Un campione di 100 mi fu oentrifugato a temperatura ambiente per 15 minuti a 3000 x g (g = gravit?). Il surnatante fu sottoposto a scambio ionico e analizzato per quanto riguarda la composizione in carboidrati, mediante HPLC. Il surnatante fu anche analizzato per l'N Kjeldahl e per la sostanza secca, e vennero calcolati l'indice di solubilit? dell'azoto (NSl) e l'indice di solubilit? della sostanza secca (DSI); vedi i risultati nella tabella Ba I. 100 MI della miscela di reazione, raffreddata a 20?C, furono versati in un recipiente di vetro graduato da 100 mi, e mantenuti a 4?C per 2 giorni. La stabilit? di dispersione (%) fu misurata leggendo il volume della dispersione ottenuta (tabella Ba II) dopo 1 e 2 giorni.
A 200 mi della miscela di reazione (a 20?C) vennero aggiunti 8 g di olio di soia. Venne preparata un'emulsione miscelando per 2 minuti in un miscelatore Waring. La stabilit? dell'emul sione (%) fu misurata come sopra, dopo 1 e 2 giorni.
Venne effettuata una reazione come sopra, tuttavia, in questo caso, vennero utilizzati 1,00 g del preparato SPS-asico.
Vennero effettuati gli stessi tipi di analisi e misurazioni di stabilit? di quelli descritti nella sezione A. I risultati sono illustrati nelle tabelle Ba I e Ba II.
Dalle analisi chimiche dei sum atanti appare ohe i valori per NSI (%) e DSI (%) ottenuti nell'esperimento B, sono pi? alti di quelli per l'esperimento A. Tuttavia, le prove di stabilit?, effettuate sulle miscele di reazione, mostrano un valore migliore per i campioni A. Questo fatto probabilmente ? dovuto alla maggiore lunghezza della catena peptidica delle proteine nella miscela di reazione con basso dosaggio di enzima.
Dalla composizione di carboidrati misurata mediante HPLC appa re che sono prodotti principalmente mono? e disaccaridi. Cos? gli oligosaccaridi, noti responsabili della diarrea e della flatulenza quando somministrati a vitelli in quantit? troppo elevate, sono presenti solo in piccole quantit?.
TABELLA Ba I Propriet? chimiche del sum atante.
* NSI = Indice di solubilit? dell'azoto
*? DSI = Indice di solubilit? della sostanza secca
TABELLA Ba II. Prove Ai stabilit? delle miscele Ai reazione.
Ba 2* Produzione di amido saccarificato contenente materiali grezzi?
In relazione con la sacoarifioazione di maniooa e di patate doloi e di altri materiali vegetali contenenti amido, l?aggiunta di un preparato di SPS-asi ? in grado di risolvere i probleml di viscosit?* Utilizzando un preparato di SPS-asi, ? possibile produrre sospensioni di amido con un contenuto di sostanza secca del 25-30#, e, dopo la saccarificazione, la poltiglia pu? essere fermentata, per cui pu? essere ottenuto un etanolo molto economico?
ESEMPIO Ba 2.1
Partendo da patate doloi (giapponesi) fresche e grattuggia te, fu prodotta una poltiglia con un contenuto in sostanza sec ca del 24#? Si trov? ohe il contenuto in amido delle patate dolci era approssimativamente il 70# del contenuto di sostanza secca in esse? Una pre-liquefazione, per mezzo dell'amilasi batterica di Termamyl? 60 L, nel dosaggio di 0,5 kg/ton di amido, fu effettuata per riscaldamento dell'infuso a 90?C.
La poltiglia fu poi portata a 90?C per 30 minuti. La viscosit? della miscela di reazione fu poi misurata per mezzo di un apparecchio HAAKE-a 90?C.
Successivamente la miscela di reazione fu raffreddata a 55?C, e il pH fu regolato a pH 5?0 con H2SO4 2N. Venne poi iniziata una sacoarifioazione per aggiunta della gluco-amilasi SAN 150 (marchio registrato da NOVO INDUSTRI A/S), al dosaggio di 1,75 litri/ton di amido. La misoela di saccarifioazione fu poi divisa in tre parti, A, B e C, ohe furono trattate oon l'enzima per 15 minuti, come illustrato sotto prima delle misurazioni di visoosit?:
Si pu? ooai vedere come la viscosit? della miscela di reazione possa essere efficacemente ridotta con la SPS-asi in un dosaggio baeso paragonato a Celluolast ? e SAN 150. Ba 3? Liquefazione totale di pere e di altri frutti.
Se pere intere, che sono state schiacciate mecoanicernente, vengono successivamente trattate con un preparato di SPS-asi, si verifica la liquefazione totale, e viene pro dotto un succo di pera limpido dopo rimozione di quantit? minori di sostanza solida. Un metodo simile pu? essere uti lizzato relativamente ad altri frutti simili, per esempio mele.
ESEMPIO Ba 3.1
Mele fresche vennero macinate grossolanamente per mezzo di un mulino Bucher Central. La poltiglia di mele fu poi pastorizzata in un serbatoio a camicia di riscaldamento a 90?C per 5 minuti, e quindi raffreddata a temperatura ambiente* Le mele pre-macerate furono poi macinate in un mulino Fryma con attrezzatura di corindone, finch? la poltiglia fu uniforme al tatto. La poltiglia fu poi ri-pastorizzata a 80?C per 10 minuti, e raffreddata a 50?C.
Vennero poi effettuate reazioni enzimatiche a 50?C per 30 minuti con ContraveB Rheomat 15? effettuando contemporanea mente agitazione e misurazione della viscosit? (in relazione alla lettura percentuale sul Rheometer a velocit? 13)? Dopo completamento delle reazioni enzimatiche, 100 g di campioni vennero prelevati e centrifugati in un tubo graduato a 3000 x g per 15 minuti. Con ci? vennero misurate la percentuale di succo e la percentuale di deposito. Vennero mi aurati anche il pH e la percentuale di sostanza secca al ri frattometro come ?Brix. La tabella Ba IV mostra un paragone tra l'effetto della SPS-asi, la combinazione di Celluolast e di SPS-asi, e la oombinazione di Celluolast e Fectinex.
Venne utilizzato il preparato SPS-asico KRF-68.
TABELLA Ba IV. Risultati degli esperimenti di liquefazione totale con poltiglia di mele a 50?C per 30 minuti
Ba 4. Produzione di succo per trattamento di frutti e di verdure.
E* stato trovato che preparati di SPS-asi sono ben utilizzati per la produzione di succo mediante trattamento di molti frutti, bacche e verdure, per esempio carote, piselli, pomodori, mele, pere, ribes nero, fagioli e cavoli. Vengono ottenuti in questo modo una migliorata resa in sucoo, e una estrazione di componenti coloranti e aromatizzanti migliore di quelle ottenute oon preparazioni di pectinasi e di oellulasi commercialmente disponibili.
ESEMPIO Ba 4.1
Si fa riferimento all'esempio Ba 3*1, in cui il prepanato di SPS-asi ? stato paragonato ai prodotti convenzionali di cellulasi e di pectinasi commercialmente disponibili Celluclast ? 200 L e Pectinex? 3x. Dalla tabella appare evidente che la resa in succo pu? essere leggermente miglio rata con meno di 50 g/hl di SPS-asi, paragonato a 2000 g/hl di Pectinex?, entrambi in combinazione con 50 g/hl di Celluclast'"1'. Anche la viscosit? ? leggermente pi? bassa. Cos? sembra che la SPS-asi sia circa 40 volte pi? efficace di Pectinex.
Ba 5. Trattamento in relazione all'estrazione e alla pressione di canna da zucchero o di barbabietola da zucchero.
E' stato trovato che ? possibile migliorare la resa relativa a semplici procedimenti di estrazione, se il preparato SPS?asico viene utilizzato per il trattamento di canna da zucchero o di barbabietola da zucchero prima e/o durante l'estrazione o la pressione di essi. Inoltre, il residuo (la bagassa) pu? essere trattato con il preparato di SPS-asi per mezzo del quale esso viene parzialmente convertito a zuccheri fermentabili che possono essere utilizzati come materiale grezzo per la fermentazione di etanolo.
ESEMPIO Ba 5.1
10 Kg di residuo (polpa) di barbabietola da zucchero, ottenuti da estrazione continua in controcorrente in un diffusore Nakskov Sugar Factory della DDS, furono macinati due volte in un mulino Fryraa (tipo MZ-110). Venne aggiunta acqua di procedimento durante l'operazione di macinazione. 300 Gramml di porzione della polpa vennero poi trattati enzimaticamente a 45?C per 18 ore per mezzo dei dosaggi enzimatici mostrati nella tabella Ba V. Il prodotto enzimatico secco (KRF-68) fu aggiunto alla polpa, che venne agitata con un'asta durante la prima ora. Dopo di che la polpa fu liquefatta in misura tale che potesse essere successivamente effettuata un'agitazione magnetica per il tempo restante. Alla fine della reazione venne misurato il pH (durante l'ini^ zio della reazione non vennero effettuate correzioni del pH) e la miscela di reazione fu centrifugata finch? venne ottenuto un eum atante limpido. Vennero effettuate determinazio^ ni della sostanza secca sulle mi'scele di reazione e sui surnatanti. In base ai risultati, vennero calcolate le percentuali di sostanza secca solubilizzata. Vennero effettuate correzioni per la sostanza secca solubile del prodotto enzi atico, in tutti i calcoli. I surnatanti N. 2/ 3 e 4 furono ottoposti a scambio ionico e analizzati mediante HPLC per la composizione in carboidrati.
TABELLA Ba V. Risultati ottenuti mediante liquefazione en zimatica di polpa di barbabietola.
Condizioni di reazione:!* = 300 g
S = 4,18% sostanza secca
E/s come mostrato sopra
pH non regolato
T = 45?C
t = 18 ore
TABELLA Ba VI. Dati HPLC
Tutti gli zuccheri prodotti in accordo con la tabella Ba VI di sopra, possono essere fermentati ad alcool o usati per altri scopi.
Ba 6. Produzione di latte di soia.
Il latte di soia pu? essere facilmente prodotto mediante liquefazione totale di soia macinata e successiva omogeneizzazione della miscela risultante. Il latte di soia viene spesso prodotto mediante lavaggio di soia in acqua bollente, macinazione dei seml di soia lavati ed estrazione con acqua, seguita da una separazione dei residui insolu bili, per esempio proteine e polisaccaridi. Per migliorare la resa di latte di soia, questi residui insolubili possono essere liquefatti per reazione oon la SPS-asi.
ESEMPIO.Ba 6,1
Il procedimento per il latte di soia ? illustrato dalla seguen te serie di reazioni enzimatiche, per cui calcoli dell'india ce di solubilit? della proteina (PSI, %) e dell'indice di so lubilit? della sostanza secca (USI, %) illustrano le rese o;t tenute dopo separazione a pH = 7 (vedi tabella Ba VII), Le reazioni enzimatiche furono effettuate nelle seguenti condizionis
Dopo la reazione, il pH fu regolato a pH = 7 per mezzo di NaOH 4 N, e venne effettuata una separazione mediante centrifugazione a 3000 x g per 15 minuti.
BELLA Ba VII. Calcoli di bilancio di massa in relazione al procedimento enzimatico per il lat
te di soia.
Ba 7. Trattamento per aumentare la quantit? ricuperabile di solubili di caff?*
E* stato trovato che il trattamento di chicchi di caff? a stadi diversi, durante la produzione di caff? espres so, si risolve in un aumento della resa di solubili di caff?. Cos?, per esempio, fondi di caff? esauriti o chicchi verdi possono essere trattati con l?enzima con risultati favorevoli.
Bb 1. Prevenzione e/o decomposizione dell'annebbiamento di succo di mela e pera.
Dopo la produzione di succo di mela o di pera o di suc chi di altri frutti, che devono essere limpidi, e che vengono preventivamente trattati con preparati convenzionali a base di pectinasi e di cellulasi, per prevenire la formazione di tor bidezza, pu? apparire un annebbiamento (intorbidamento) del succo di mela o di frutti simili. E' stato trovato che i preparati di SPS-asi sono notevolmente utili per la decomposizione di tali intorbidamenti, che consistono principalmente di arabano legato a proteine.
ESEMPIO Bb 1
Concentrato di succo di pera prodotto mediante liquefazione en zimatica di residui di pera provenienti dall?industria conserviera, utilizzando Celluclast? e Pectinex?, fu scoperto tor bido se lasciato a s?. La torbidezza fu isolata e idrolizzata con H^SO^ 0,01 N per 24 ore, e analizzata per HPLC. Il cromatogramma mostr? arabinosio e piccole quantit? di oligosaccaridi.
Per incubazione dello 0,5% p/v di questo carboidrato in tampone acetato 1 mM a pH 4,5? per 3 ore, a 40?C, con SPS-asi (KRF-68 KRF-92 1s1) con una concentrazione di enzima di 0,05% p/v, si trov? che l'84# del carboidrato iniziale che costituiva l'intorbidamento (sostanza secca) era convertito ad arabinosio. Anche un concentrato diluito di pera (20?Brix) fu trattato per 2 ore a 40?C con un dosaggio di enzima della SPS-asi sopra menzionata, di 0,15# p/v, o con un prodotto commerciale chiamato Clarex? , in un dosaggio di 1# p/v. Si trov? che la SPS-asi era in grado di ridurre l'area del picco relativo in HPLC di un intorbidamento di tipo arabano per l'86#, mentre la corrispondente riduzione con Clarex? (utilizzato a dosaggi molto pi? elevati del preparato di SPS-asi) era solamente del 78#. Bb 2. Uso come agente chiarificante per vino bianco.
E* stato trovato che i vini bianchi mostrano una tor bid?zza estremamente indesiderabile che pu? essere efficacemen te chiarificata mediante SPS-asi. E' stato dimostrato che il materiale di intorbidamento consiste principalmente di arabino galattani legati a residui di idrossiprollna, in una proteina strutturale della parete cellulare.
Bb 3. Produzione di ISSPH o di altri idrolizzati di proteina vegetale.
Prima della separazione di ISSPH (isoelectric soluble soy protein hydrolyzate, oio? idrolizzato isoelet? trico di proteina di soia solubile) ? di altri idrolizzati di proteine vegetali dalla sospensione, come descritto nel brevetto statunitense n. 4*100.024 o in Prooess Bioohemistry, Voi.
14? No, 7 (1979)? pagine 6-6 e 10-11, la miscela di reazione pu? essere trattata con un preparato SPS-asico. In questo modo si ottiene una separazione pi? facile*
Bb 4. Enzima di infusione nell'industria della preparazione della birra.
Nella produzione di carboidrati di birra di materiali grezzi, per esempio beta-glucani di malto e di orzo, influiscono la viscosit? e la filtrabilit? del mosto. L'aggiunta di SPS-asi durante la fermentazione, riduce la viscosit? del mosto e aumen ta la filtrabilit? e la reea dell'estratto. Inoltre l'aggiunta di SPS-asi durante la fermentazione aumenta la fermentabilit? del mosto e il contenuto di azoto nel mosto.
ESEMPIO Bb 4*1
In laboratorio, 50 g di chicchi macinati, costituiti dal 50% di malto e dal 50% di orzo, furono posti in infusione con 275 g di acqua (15% di sostanza secca) in accordo con il seguente diagramma di infusione: 52?C (60 minuti)/63?C (60 minuti)/76?C (30 minuti).
Per dimostrare l'effetto della SPS-asi, vennero effettuate qu?t tro prove, vedi la tabella sotto indicata, per cui gli enzimi furono aggiunti durante la infusione (pH dell?infusione 5,5-6,0).
BGU ? un?unit? beta?glucanasica determinata in accordo con
il metodo analitico AF 70/4-GB che pu? essere ottenuto dalla NOVO Industri A/S.
FBG ? l'unit? fungina di beta?glucanasi determinata in accor
do con il metodo analitico AF 70.1/2-GB ottenibile
da NOVO Industri A/S.
La sola differenza fra BGU e FBG, b il pH al quale viene effettuata la determinazione dell'enzima: pH 7,5 per BGU e pH
5,0 per FBG,
Cereflo ? un preparato batterico beta-glucanasico, descritto nell'opuscolo informativo B 214b-GB 1500, del luglio 1981, ot tenibile da NOVO Industri A/S.
ESEMPIO Bb 4.2
In laboratorio, 50 g di chicchi macinati costituiti dal 40%
di malto e dal 60% di orzo furono posti in infusione con 150 g di acqua (25% di sostanza secca) in acoordo con il seguente dia
grarama di infusione : 450c (60 minuti )/63?C (90 minuti )/75 ?C ( 15 minuti ) .
Per dimostrare l'effetto della SPS-asi, vennero effettuate tre prove, vedi la tabella sotto indicata, per cui gli enzimi ven
nero aggiunti durante l?infusione (pH dell?infuso 5,5-6,0).
La definizione di BGU e FBG ? come indicata nell?esempio Bb 4.1, Nell?ultima colonna della tabella qui sopra sono indicati solo l'attivit? e il dosaggio originati dalla SPS-asi.
Ceremix ? un preparato batterico di beta-glucanasi descritto nel l'opuscolo di informazione B 216 b-GB 1000 del febbraio 1982, disponibile preseo NOVO Industri A/S.
Bb 5. Additivo enzimatico per l?uso durante la fermentazione della birra e/o l'immagazzinamento.
La SPS-asi pu? essere aggiunta durante la fermentazione del mosto o durante l'immagazzinamento della birra, per ridurre il contenuto di beta-glucani e quindi migliorare la filtrazione della birra e la stabilit? della birra verso l'intorbida mento. La SPS-asi eserciter? anche un effetto Bulle pr? teine responsabili dell'intorbidamento da raffreddamento. Bb 6. Agente di rilascio della pelle delle mandorle.
Durante lo stadio di rimozione meccanica,della pelle delle mandorle, che segue la pelatura delle mandorle, una certa percentuale di pelli di mandorla non viene eliminata* E' stato trovato che il trattamento enzimatico delie mandorle si risolve in una diminuzione della percentuale sopra indicata,
Bc 1. Decomposizione di diversi materiali di scarto.
In relazione a certi processi di preparazione, si formano grandi quantit? di materiali di scarto conte nenti carboidrati. E' per esempio il caso della produzio ne di isolato di soia mediante estrazione con acqua e prie cipitazione con acidi, del latte di soia e del tofu (un ti^ po speciale di formaggio giapponese). A questo riguardo pos sono anche essere menzionate le polpe di scarto provenienti per esempio da mele, pere e agrumi. E' stato trovato che un preparato di SPS-asi b in grado di liquefare completameli te questo materiale di scarto contenente carboidrati, e di produrre zuccheri fermentabili che possono essere utilizzati come materiali di partenza per la fermentazione dell'etanolo. ESEMPIO Bc 1.1
Per la produzione tradizionale di latte di soia o di tofu, i seml di soia vengono spesso lavati in acqua bollente, macinati ed estratti con acqua.bollente, dopo di che viene realizzata una separazione. Il residuo proveniente da questa separazione costituisce il materiale utilizzato per questo esperimento. La fase liquida h il latte di soia, che pu? essere trattato ulteriormente a produrre tofu. 10 Kg di seml di soia interi, otte nuti da Aarhue Ol?efabrik A/S, vennero macinati contemporaneamente con 70 litri di acqua bollente in un mulino Fryma tipo MZ 110. La sospensione macinata fu poi tenuta sopra 85?C per 15 minuti, per inattivare gli enzimi naturali della soia che sviluppano il ben noto odore della soia. 5 Litri di questa sospensione di seml di soia furono poi centrifugati in laboratorio per 15 minuti a 3000 x g (g = gravit?). Si trov?, con analisi, che il residuo conteneva 20,45% e 20,06% di sostanza sec ca (determinazioni duplici, media calcolata 20,26%). HC16 N fu aggiunto lentamente e lavorato nel residuo con una spatola fino a che un pH-metro indic? 4?50, quando poi l'elettrodo fu introdotto direttamente nella massa.
Le reazioni enzimatiche su 2 x 200 g della massa con i due dosaggi di SPS-asi (KRF-68) E/S = 0,5% in relazione alla sostanza seoca e E/S = 3>0% in relazione alla sostanza secca, furono effettuate in un bicchiere da 500 mi a 50?C. L'enzima secco fu aggiunto alla massa. Durante le prime 1-2 ore, l'agitazione ven ne effettuata con una spatola, e successivamente la massa fu ljL quefatta in misura tale che l'agitazione con un magnete potesse essere realizzata con successo. Il tempo di reazione totale fu di 21 ore. Fu misurata la osmolalit? con un osmometro (Advanced Digimatic 3DII della Advanced Instruments Inc.)y durante la reazione.
I risultati nella tabella Bc I mostrano il corso della rea zione. Alla fine dell?esperimento, le miscele vennero cen trifugate a 3000 x *g per 15 minuti. Alla superficie dei sur natanti apparve uno strato di olio, e venne determinato il vo lume di esso. Un rado strato di sospensione apparve come atra to sul fondo. Il surnatante comprendente l'olio fu rimosso con una pipetta. L'olio fu combinato con la fase acquosa lim pida per omogeneizzazione, e fu prelevato un campione per le determinazioni della sostanza secca, I risultati mostrati in tabella Bc I, dimostrano chiaramente che questo prodotto di scarto pu? essere liquefatto con una reazione enzimatica e che l?olio grezzo pu? essere prodotto, come citato nella sezione A 4? Dopo ricupero dell'olio, il residuo solubilizzato pu? essere utilizzato in vari modi, per esempio per fermenta zione di composti importanti o per la concentrazione e l'essiccamento e l?uso successivo di un prodotto per alimentazione o per mangimi, o dopo un 'ulteriore purificazione e per la produzione di preziosi prodotti.
ELLA Bc I. Risultati ottenuti durante la liquefazione di latte di soia e di sospensione di tofu.
Bc 2. Saccarificazione e fermentazione contemporanea.
Materiali vegetali contenenti carboidrati, per esempio tuberi oome topinambur, patate, patate dolci, manioca, o polpa proveniente da tali tuberi, cio? il materiale rimanen te dopo la rimozione dei componenti estratti, possono essere saccarificati per trattamento con un preparato SPS-asico, e simultaneamente i saccaridi fermentabili prodotti possono essere fermentati a etanolo.
ESEMPIO Bc 2.1
La produzione di etanolo per fermentazione dei topinambur contenenti inulina decomposta, fu esaminata su scala di labo ratorio per la saccarificazione simultanea con SPS-asi e inu linasi e per quattro pretrattamenti diversi dei topinambur. SPS-a3i : venne utilizzato il preparato SPS-asico KRF-68.
Inulinasi: la inulinasi fu prodotta per fermentazione di Asp. ficuum (CBS 55565). L?attivit? di inulinasi ? determinata come descritto in Research Disclosure No. 21234 (Dicembre 1981) p. 456-458.
Fermentazione di laboratorio: 150 g di porzione dell?infuso pretrattato (descritto pi? avanti) furono fermentati dopo aggiunta di 4,5 g di lievito e 1 ml di una soluzione al 4% di Pluronic come agende entischiumogeno. I palloni di fermen tazione sono dotati di trappole di C02 contenenti acido sol forico al 98%, e la fermentazione viene seguita dalla misurazione del peso perduto a causa della CO2 liberata. Il conte nuto dei palloni viene agitato durante la fermentazione effettuata a 30?C. Vennero utilizzati tre palloni per ciascun parametro studiato.
Nella tabella Bo II il peso perduto a oausa della liberazione di C02 ? convertito a etanolo, assumendo che 1 mole di CO2 liberata ? equivalente a 1 mole di C2H 0H, cio?
Pretrattamento dei carciofi;
Trattamento A: 14,1 kg di carciofi (22,8% di sostanza secca) furono cotti (Henze) a 140?C e 4-5 atm. per 20 minuti. Il peso dopo cottura era di 19,0 kg ( ~ 16,9% di sostanza secca). Le fermentazioni furono effettuate direttamente sull'infuso.
Trattamento B: carciofi lavati e tagliati a pezzi furono miscelati con acqua (1;1) e mescolati in un misce latore Waring. L'infuso fu poi trattato con ca lore per 1 ora a 85?C e a pH = 4,5.
Trattamento C: come B, ma il pH non fu regolato.
Trattamento D: come B, ma non furono effettuati trattamenti con calore e regolazione del pH;
Risultati : nella tabella Bc II, i risultati mostrano l'effetto di aggiunta di SFS-asi all'infuso pretrattato sulla resa in etanolo. Un miglioramento significativo della resa in etanolo fu ottenuto su tutti gli infusi pretrattati quando venne aggiun ta SPS-asi
BELLA Bc II. Risultati della fermentazione in relazione alla fermentazione e alla contemporanea saccarificazione dell'enzima sui topinambur
Bc 3. Decomposizione della cellulosa
E' stato trovato che materiali contenenti cellulosa, come paglia, per esempio paglia di grano, segatura, carta e lignocellulosa, possono essere idrolizzati con un preparato di SPS-asi in misura maggiore di quanto lo possano essere con cellulasi convenzionali. Questo ? illustrato dal seguente esempio in cui un materiale celluloso cristallino (AVICEL) ? trattato per mezzo di una cellulasi convenzionale Celluolast ? 200 prodotta da Triohoderma reesei e con il preparato SPS-asico KRF 68.
ESEMPIO Bo 3.1
Avicel fu sospeso in acqua (20% di sostanza secca); il pH fu regolato-a 5?>e la temperatura fu mantenuta a 50?C. Dopo un tempo di reazione di 24 ore, la sospensione fu filtrata, e venne misurato il contenuto di zucchero riducente (mg glucosio/g AVICEL).Utilizzando dosaggi di enzima di
5% e di 20% del contenuto di cellulosa, vennero trovati i seguenti valori:
TABELLA Bc III
Bc 4 Applicazione come coadiuvante di cottura
E? stato trovato che i preparati di SPS-asi sono eccellentemente utilizzati come coadiuvanti di cottura. Cos?, quando un preparato di SPS-asi ? aggiunto alla farina asciutta, prima della produzione dell*impasto, ? possibile ottenere un pane con qualit? superiore per quanto riguarda il volume, la mollica e il gusto. Cos? ? possibile ottenere un pane di elevata qualit? con una farina di grano di bassa qualit? se viene utilizzato, come additivo, un preparato SPS-asi?o.
Bc 5* Miglioramento nella resa di alcool e nella resa di biomassa durante la fermentazione di liquido di solfi^ to dalla produzione di carta.
E' stato anche trovato che la resa di etanolo pu? essere migliorata se il liquido di solfito della carta viene trattato con un preparato di SPS-asi prima che esso venga utilizzato come fonte di carboidrati per la fermentazione di et? nolo. Il liquido di solfito della carta pu? anche essere utilizzato per la produzione di biomassa, per esempio proteina di cellula singola, per fermentazione, e anche in questo caso la resa di biomassa ? stata migliorata quando il liquido di sol fito ? stato trattato preventivamente con un preparato di SPS-asi. Cos?, la decomposizione dovuta alla presenza del preparato di SPS-asi e la fermentazione possono essere effettuate simultaneamente .
Bc 6. Disidratazione di prodotti biologici in sospensione.
Durante la tradizionale estrazione di acqua di molti materiali biologici da materiali grezzi vegetali, si formano grandi voluml di residui insolubili costituiti da grandi propor zioni di polisaccaridi gonfiati. Questo, per esempio, avviene quando il latte di s?ia, il tofu, o l'isolato di soia vengono prodotti mediante estrazione di seml di soia, di fa rina di soia sgrassata, o di fiocchi bianchi. Il materiale strutturale polisaccaridico gonfiato pu? essere trattato in piccola misura con SPS-asi, per cui la struttura a rete del materiale viene aperta, e solo piccole quantit? di carboidrati vengono solubilizzate. In questo modo il materiale viene disi^ dratato, e di conseguenza viene ottenuto un contenuto di sostanza secca pi?.elevato, nella sospensione, in paragone al prodotto ottenuto senza trattamento enzimatico. Cos?, il pro cesso enzimatico mostra il vantaggio di un consumo di energia considerevolmente minore per la rimozione dell'acqua mediante essiccamento, e apre anche la possibilit? di produzione di un materiale secco per alimentazione animale di minor costo o per agenti per aumentare la massa per applicazioni in campo alimen tare,
Bc 7, Adiuvante di insilamento,
E' nota l'aggiunta di coadiuvanti enzimatici.di insi lamento al silaggio, per aumentare la velocit? del processo di insilamento e la raccolta del silaggio. E' stato trovato che preparati di SPS-asi sono superiori in paragone a coadiuvanti di insilamento noti.
Un'indagine delle figure, alle quali ? gi? stato fatto rifer? mento, ? data qui sotto allo scopo di fornire una veduta pi? globale.

Claims (20)

RIVENDICAZIONI
1. Una SPS-asi, una oarboidrasi in forma utilizzabile e in grado di decomporre SPS di soia, in condizioni appro priate, in prodotti di decomposizione ohe si attaccano al la proteina in un mezzo acquoso in misura minore di quanto lo SPS di soia, prima della decomposizione, si attaccherei) be alla stessa proteina, in condizioni corrispondenti.
2. Una SPS-asi secondo la rivendicazione 1, caratterizza ta dal fatto che la SPS-asi ? in grado di decomporre SPS di soia, in un mezzo acquoso, in prodotti di decomposizione che si attaccano alla proteina vegetale nel mezzo acquoso in misura minore di quanto lo SPS di soia, prima della decora posizione, si attaccherebbe alla stessa proteina vegetale nel mezzo acquoso.
3. Una SPS-asi secondo la rivendicazione 1 o 2, caratteriz zata dal fatto che la SPS-asi ? in grado di decomporre SPS di soia in un mezzo acquoso, con un valore di pH che non si scosta per pi? di 1,5 da 4,5, in prodotti di decomposizione che si attaccherebbero alla proteina di soia nel mezzo acquoso in misura minore di quanto lo SPS di soia, prima della decomposizione, si attaccherebbe alla proteina di soia nel mezzo acquoso.
4. Una SPS-asi secondo le rivendicazioni 1-3, caratteri^ zata dal fatto che i prodotti di decomposizione di SPS di so ia, dopo completa degradazione, si attaccano alla proteina vegetale in misura minore del 50%, in particolare minore del 20%, di quanto lo SPS di soia, prima della decomposi^ zione, si attaccherebbe alla proteina vegetale nel mezzo acquoso.
5. Una SPS-asi secondo le rivendicazioni 1-4, caratterizzata dal fatto che la SPS-asi mostra un test positivo circa la presenza di SPS-asi, quando esaminata secondo il metodo di determinazione qualitativo e quantitativo di
SPS-asi.
6. Una SPS-asi secondo le rivendicazioni 1-5, carattja rizzata dal fatto che la SPS-asi fu prodotta per mezzo di un microorganismo appartenente al genere Aspergillus, preferibilmente appartenente al gruppo Aspergillus niger.
7. Una SPS-asi secondo le rivendicazioni 1-6, caratteri^ zata dal fatto che la SPS-asi ? derivata dagli enzimi che possono essere prodotti per mezzo di Asp. acu?eatus CBS 101.43.
8. Una SPS-asi secondo le rivendicazioni 1-7, caratterizzata dal fatto che la SPS-asi ? identica dal punto di vista iminunoelettroforetico alla SPS-asi ohe pu? essere prodotta per mezzo di Asp. acu?eatus CBS 101.43, ed ? identificabile per mezzo della tecnica di sovrapposizione imraunoelettroforetica.
9. SPS isolato, caratterizzato dal fatto che lo SPS isolato viene prodotto sulla base di proteina vegetale grezza come materiale grezzo
10. SPS isolato secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto ohe la proteina grezza vegetale ? farina di soia sgrassata,
11. Metodo per la selezione di un microorganismo produtt? re di SPS-asi, per la produzione della SPS-asi secondo le rivendicazioni 1-8, caratterizzato dal fatto che il microor ganismo da sottoporre a test ? cresciuto in un mezzo di fer mentazione, la principale fonte di carbonio del quale ? SPS secondo le rivendicazioni 9 o 10, dopo di che un campione del mezzo di fermentazione viene sottoposto ad analisi circa la presenza di SPS-asi, e il microorganismo in questione vi? ne selezionato come microorganismo produttore di SPS-asi, se l?analisi circa la presenza di SPS-asi ? positiva.
12. Metodo per la produzione di SPS-asi secondo le rivendicazioni 1-8, caratterizzato dal fatto che un ceppo selezionabile in accordo con il metodo di selezione secondo la rivendicazione 11, viene coltivato in un mezzo nutritivo.
13. Metodo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che il ceppo di Asp. aculeatus CBS 101.43 o di Asp. .1aponicus IFO 4408 viene coltivato in un mezzo nutritivo.
14. Metodo secondo la rivendicazione 12 o la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto ohe la ooltivazione viene effet tuata come coltivazione sommersa, a un pH nell?intervallo tra 3 e 7, preferibilmente tra 4 e 6, e a una temperatura nello intervallo da 20 a 40?C, preferibilmente da 25 a 35?C, e che il mezzo nutritivo contiene fonti di carbonio e di azoto e sali inorganici.
15. Metodo secondo le rivendicazioni 12-14? caratterizzato dal fatto che il mezzo nutritivo contiene farina di soia.
16. Metodo secondo la rivendicazione 15* caratterizzato dal fatto che la farina di soia viene trattata con un enzima proteolitioo prima dell*uso come componente del substrato, preferibilmente con l'enzima proteolitico prodotto per via microbica mediante il Bacillus lioheniformis.
17. Metodo secondo le rivendicazioni 12-16, caratterizzato dal fatto che una soluzione sterile di pectina viene aggiunta, in modo asettico, al brodo di fermentazione durante la coltivazione.
18. Metodo per la decomposizione di polisaccaridi, prefer?^ bilmente di polisaccaridi di parete cellulare vegetale, per mezzo di una carboidrasi, caratterizzato dal fatto che un preparato di SPS-asi in accordo con le rivendicazioni 1-8, in un mezzo acquoso, viene posto a contatto con un substrato per detto preparato di SPS-asi.
19. Metodo per la deoomposizione di polisaccaridi secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che la decomposizione ? accompagnata dall'isolamento o dall'estrazione di un materiale biologico, diverso dalla proteina di soia e dalle proteine vegetali correlate, da un materiale biologico grezzo, per cui il preparato di SPS-asi ? essenzialmente privo di qualsiasi enzima in grado di degradare detto materiale biologioo.
20. Metodo per la decomposizione di polisaccaridi secondo le rivendicazioni 18 o 19? caratterizzato dal fatto che uno o pi? prodotti di reazione (non importa se essi siano prodot ti finali desiderati o prodotti di scarto) vengono ulterior mente trattati? contemporaneamente con il trattamento enzimatico, o dopo di esso.
21, Metodo per la decomposizione di polisaccaridi secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che il tratta mento ulteriore ? una fermentazione alcoolica nel caso in cui uno dei prodotti di reazione sia uno zucchero fermentabile.
Lista di applicazioni esemplificative di preparati di SPS-asi Tipo di pre N. di rife
IT24870/82A 1981-12-22 1982-12-21 Miglioramento in e relativo a un enzima per decomposizione di un carbo-idrato ad alto peso molecolare, il carboidrato isolato ad alto peso molecolare, un metodo per la selezione di un microorganismo produttore di tale enzima e un metodo per la produzione di tale enzima IT1153863B (it)

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