DD213240A5 - Verfahren zum abbau von polysacchariden - Google Patents

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Henrik Guertler
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Abbauverfahren von insbesondere Zellwandpolysacchariden von Pflanzen mittels einer Carbohydrase. Ziel der Erfindung ist es, pflanzliche Proteinprodukte abzubauen und die Abbauprodukte in grosser Reinheit zu erhlten. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Abbauverfahren von Polysacchariden ueber eine Carbohydrase bereitzustellen. Erfindungsgemaess wird ein SPS-ase bildender Mikroorganismus auf einem Fermentationsmedium gezuechtet, dessen Hauptkohlenstoffquelle SPS (loesliches Polysaccharid) ist, das gebildet worden ist auf der Basis von pflanzlichem Rohprotein, vorzugsweise entfettetem Sojamehl, als Ausgangsmaterial, und diese SPS-ase-Zubereitung in einem waessrigen Medium mit einem Substrat fuer die SPS-ase-Zubereitung zusammengebracht wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Abbauverfahren von Polysacchariden mittels eines neuen Enzyms·
Das neue Enzym wird angewandt in der Lebensmittelindustrie, beispielsweise bei der TotalverflDssigung von Vegetabilien* bei der Saft- und Weinindustrie, bei der Zuckergewinnung, bei der Bierherstellung^ für die Backwarenherstellung» bei der Alkoholherstellung und für viele weitere Zwecke»
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten pflanzlichen Proteinprodukts (pvp) durch enzymatische Entfernung des Rückstandes* ohne das Protein zu lösen und wieder auszufällen, ist in der BE-PS 882 769 beschrieben. Die Reinheit des nach dem bekannten Verfahren erhältlichen pvp ist jedoch nicht zufriedenstellend und sollte daher verbessert werden. In den Beispielen ist eine Reinheit des pvp von ungefähr SS % angegeben. Selbst wenn es möglich ist, ein pvp mit einer Reinheit von ungefähr 90 % nach dem bekannten Verfahren zu erhalten, ist dies nur möglich unter Verwendung bestimmter vorbehandelter Ausgangssubstanzen» ζ* B. von Sojaproteinkonzentrat* Es wäre günstig» wenn es möglich wäre, eine Reinheit des pvp von ungefähr oder über 90 % mit einem wesentlich breiteren Spektrum an Ausgangsmaterialien zu erhalten# insbesondere aus enthülstem und entfettetem Sojamehl»
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Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß ein bestimmter Teil des Rückstandzersetzungsproduktes* wie es während der oben angegebenen enzyraatischen Behandlung auftritt, d. h» ein wasserlösliches hochmolekulares Kohlenhydrat sich teilweise an das pflanzliche Protein anlagert (bindet), wie später näher erläutert wird. Das führt natürlich zu einer geringen Reinheit des Proteins· Es hat sich auch gezeigt, daß dieses hochmolekulare Kohlenhydrat die Fähigkeit besitzt, sich an Proteine tierischen Ursprungs anzulagern*
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es» den Abbau eines hochmolekularen Kohlenhydrats zu ermöglichen, um eine pvp mit verbesserter Reinheit herzustellen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde* ein Verfahren zum Abbau von Polysacchariden zur Verfügung zu stellen.
Das Prinzip der Erfindung kann folgendermaßen beschriebe.·! werden,, wobei auf Fig* 1 Bezug genommen wird, in der nur Produkte^ die als ungelöste Feststoffe vorliegen, angegeben sind, während alle überstehenden Flüssigkeiten (und darin gelösten Stoffe) weggelassen worden sind. Eine Menge Sojamehl wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt, Teil I und Teil II (Spalte a in Fig^ 1). Teil I wurde proteolytisch bei einem pH-Wert von ungefähr 8 mit Hilfe von ALCALASE (einem
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proteolytischen Enzym, das gebildet werden ist von 8, licheniformis) abgebaut und dann weiter bei ungefähr pH 8 gewaschen, ura die Gesamtmenge an Protein zu entfernen, und der Rückstand wurde von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und gewaschen (siehe Teil I» Spalten a und b der Fig. 1)» Auf diese Weise wurde ein reiner Rückstand (als Rückstand I bezeichnet) isoliert (Spalte b in Fig, 1), Teil II des Sojamehls wurde nicht behandelt.
Der Rückstand in Teil II wird als Rückstand II bezeichnet (Spalte b in Fig, 1)· 3etzt wurden sowohl Rückstand I als auch Teil II mit Hilfe einer handelsüblichen Pectinase abgebaut (siehe Spalten b und c in Fig, I).
Überraschenderweise hat es sich gezeigt» daß der ungelöste Teil des Rückstands I wesentlich geringer ist als der ungelöste Teil des Rückstandes II auf der Basis der Stickstoff- und Trockensubstanz-Bilanz» siehe Fig* 1» wo die schraffierten Bereiche in Spalte c den unlöslichen nicht-Proteineubstanzen in der oben angegebenen Stufe entsprechen« Wenn darüber hinaus die überstehende Flüssigkeit des mit Pectinase behandelten Rests I mit einer Sojaprötein-Suspension bei pH 4,5 zusammengebracht wird» wird ein Polysaccharid in der überstehenden Flüssigkeit an das Sojaprotein gebunden. Dieses Polysaccharid in dem Überstand von dem Rest I, das ein Teil des Rest-Abbauproduktes ist und das in Wasser in Abwesenheit von Sojaprotein klar löslich ist» aber beim oder ungefähr beim isoelektrischen Punkt des Sojaproteins, soweit ein solches vorhanden ist», an dieses gebunden wirdt wird als SPS (^Soluble !Polysaccharide) bezeichnet (siehe Fig. I)* Das SPS
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besitzt eine Molekulargewichtsverteliung zwischen 5 χ 10 und 4,9 χ 10 · Die Bildung von isoliertem SPS geht aus dem in Fig, 2 angegebenen Schema hervor, das auch einen Teil des in Fig, 1 angegebenen Verfahrens umfaßt. So besteht das Problem darin, ein Enzym zu finden, das imstande ist, das SPS in einer solchen Weise abzubauen, daß die SPS-Abbauprodukte sich nicht an Sojaprotein anlagern bzw, in einem wesentlich geringeren Maß als SPS an Sojaprotein gebunden wird.
Obwohl in der Beschreibung speziell Sojaprotein erwähnt wird, ist die Erfindung nicht auf Sojaprotein beschränkt, sondern umfaßt alle Arten von pflanzlichen Proteinen, siehe z» B« die in der BE-PS 882 769, Seite I9 angegebenen Proteine,
Es hat sich nun erfindungsgemäß gezeigt, daß es durch Untersuchung ihrer Fähigkeit Soja-SPS abzubauen, möglich ist* Mikroorganismen auszuwählen, die imstande sind, eine Verbindung zu bilden, die enzymatische Aktivität besitzt und imstande ist, Soja-SPS abzubauen und die im folgenden kurz als SPS-ase bezeichnet wird·
Die Erfindung arbeitet daher in erster Linie mit einer SPS-ase, eine Carbohydrase (Glycosidase) in geeigneter Form, die imstande ist, Soja-SPS unter entsprechenden Bedingungen zu Produkten abzubauen, die sich in wässrigem Medium in geringerem Maße an Protein anlagern als das Soja-SPS sich vor dem Abbau an das gleiche Protein unter entsprechenden Bedingungen angelagert hätte.
Es hat sich ferner gezeigt, daß diese SPS-ase, dis fähig
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ist, Soja-SPS abzubauen» imstande ist, Polysaccharides die SPS ähnlich sind und aus Pflanzen (Gemüsen und Früchten) stammen, vollständiger abzubauen als übliche Pectinasen und übliche Cellulasen«
Der oben verwendete Ausdruck "in einer geeigneten Form" ist so zu verstehen, daß er z, B# ein SPS-ase haltiges Mittel ausschließte, das toxische Substanzen enthält oder daß eine so geringe SPS-ase Aktivität besitzt, daß mehr als 10 % SPS-ase haltiges Mittel angewandt werden müssen, bezogen auf das Gewicht des SPS in dera Substrat bei einer Reaktion* die 24 h bei 50 0C beim pH-Optimum der betreffenden SPS-ase durchgeführt wird» um einen Abbau von SPS von praktischer Bedeutung zu erreichen»
Durch vollständige oder teilweise Abtrennung des SPS von dem erhaltenen pflanzlichen Protein wird die Reinheit des erhaltenen pflanzlichen Proteins verbessert im Vergleich mit der Reinheit von pflanzlichem Protein» das nach dem aus der BE-PS 882 769 bekannten Verfahren erhalten worden ist, da dieses pflanzliche Proteinprodukt mit SPS verunreinigt war.
Es ist zur Zeit nicht bekannt, ob die im folgenden beschriebene spezielle SPS-ase ihre enzymatische Aktivität aus einem einzigen Enzym bezieht oder aus einem Enzymkomplex, umfassend mindestens zwei Enzyms« Einige Untersuchungen scheinen darauf hinzudeuten» da& zumindest zwei Enzyme für die Abbauwirkung der SPS-ase verantwortlich sind, wobei eines dieser Enzyme nur einen geringen Abbau des SPS hervorrufen kann, woraufhin ein oder mehrere Enzyme imstande sind» einen weiter»
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gehenden Abbau des SPS zu erreichen. Die Erfindung soll jedoch durch diese Hypothese nicht eingeschränkt werden»
Die Erfindung betrifft vorzugsweise den Einsatz einer SPS-ase, die imstande ist, Soja-SPS in einem wäßrigen Medium zu Produkten abzubauen, die sich in dem wäßrigen Medium weniger stark an pflanzliches Protein anlagern als das Soja-SPS vor dem Abbau. Vorzugsweise ist die SPS-ase imstande», Soja-SPS in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert abzubauen, der nicht mehr als 1*5 von 4*5 abweicht. Die SPS-ase führt zu Abbauprodukten, die sich nach beendetem Abbau vorzugsweise zu weniger als 50 %, insbesondere weniger als 20 %* bezogen auf das Soja-SPS vor dem Abbau an pflanzliches Protein in wäßrigem Medium anlagern. Die SPS-ase führt vorzugsweise zu einem positiven SPS-ase-Test* wenn sie nach dem später näher erläuterten Verfahren qualitativ und quantitativ bestimmt wird» Die SPS-ase wird vorzugsweise gebildet mit Hilfe eines Mikroorganismus, der zur Gattung Aspergillus» vorzugsweise zur Art Aspergillus niger, gehört. Günstigerweise ist die SPS-ase abgeleitet von Enzymen , die gebildet werden können mit Hilfe von Asp# aculeatus CBS<101*43* Die gleiche SPS-ase kann gebildet werden mit Hilfe von Asp» japonicus IFO 4408. Es hat sich gezeigt, daß Asp· aculeatus C8S 101.43 auch sehr wirksame Remanasen, Cellulasen, Pectinasen und Hemiceilulasen bildet» Ferner hat es sich gezeigt» daß nicht jeder zu der Art Aspergillus aculeatus oder Arpergillus japonicus gehörende Stamm eine SPS-ase bildet, die für die Erfindung brauchbar ist* So konnte, wie später in der Beschreibung angegeben ist (Abschnitt 5), gezeigt werden, daß der Stamm Asp* japonicus ATCC 20 236 nicht solche Mengen an SPS-ase
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bildet, die mit Hilfe der enzymatischen Bestimmung von SPS-ase} wie sie später beschrieben wird, nachgewiesen werden können. Die SPS-ase ist vorzugsweise immunoelektrophoretisch identisch mit der SPS-ase, die gebildet werden kann von Asp» aculeatus CBS 101*43 und identifizierbar durch Immunoelektrophorese-Oberlagerungsverfahren (siehe Abschnitte 6 und 7),
Wenn eine SPS-ase mikrobiologisch gebildet wird, wird sie gebildet ira Gemisch mit verschiedenen begleitenden Substanzen, insbesondere anderen Enzymen* Wenn dies erwünscht ist, kann die betreffende SPS-ase gereinigt werden, z* B, durch chromatographische Trennungsverfahren, wie später näher erläutert ist (Abschnitt 8).
In Agr, Biol· Chem. 40 (1), 87 - 92, 1976 ist beschrieben, daß ein Stamm von Asp» japonicus, ATCC 20236 einen Enzymkomplex bildet, der imstande ist, einen speziellen Abbau eines sauren Polysaccharids in Sojasoße, das als APS bezeichnet wird,, hervorzurufen, von dem ein Teil als APS-I bezeichnet wird. Dieses saure Polysaccharid ist nicht identisch mit SPS, wie später in Abschnitt 3 näher erläutert wird» So sind die HPLG-GeIfiltrations-Chromatogramme von SPS und APS deutlich verschieden und darüber hinaus sind die GeIfiltrations-Chromatogramme von APS, das mit Hilfe von handelsüblicher Pectinase# Pectolyase* abgebaut worden ist und von SPS, das mit deren üblichen Pectinase» Pectolyase, behandelt worden ist, deutlich verschieden* Darüber hinaus geht aus dem Artikel nicht hervor* daß das saure Polysaccharid an das Sojaprotein gebunden ist und daß das abgebaute saure Polysaccharid nicht an das Sojaprotein oder zu einem wesentlich gerin-
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geren Grad an das Sojaprotein gebunden ist als das nicht abgebaute saure Polysaccharid, Außerdem konnte gezeigt werden, daß dieser Stamm keine SPS-ase in solchen Mengen bildet, die mit Hilfe der enzymatischen Bestimmung von SPS-ase, wie sie später näher beschrieben ist* nachgewiesen werden können. Das führte zu einem Vorurteil gegen die Anwendung irgendeines Stammes von Asp. japonicus als SPS-ase-Bildner· Aber überraschenderweise hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß einige Stämme von Asp» japonicus SPS-ase-Bildner sind* Die Erfindung betrifft auch das isolierte SPS, das auf der Basis von rohem pflanzlichen Protein als Ausgangsmaterial gebildet worden ist#
Bei einem bevorzugten isolierten SPS ist das pflanzliche rohe Protein entfettetes Sojamehl, Die Herstellung des isolierten SPS ist oben mit Bezug auf Fig, 2 beschrieben worden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise der Stamm Asp· aculeatus CBS 101.43 oder Asp* japonicus IFO 4408 in einem Nährmedium gezüchtet. Es ist ferner bevorzugt, daß die Züchtung als Submerskultur bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 7# vorzugsweise von 4 bis 6 bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40, vorzugsweise von 25 bis 35 0C durchgeführt wird, wobei das Nährmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält. Günstigsrweise enthält das Nährmedium zusätzlich gerostetes Sojamehl, Das Sojamehl wird vorzugsweise vor der Verwendung als Komponente des Substrats mit einem proteolytischen Enzym behandelt, vorzugsweise einem solchen, das mikrobiologisch gebildet worden ist, mit Hilfe von Bacillus licheniformis. Es ist eben-
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falls bevorzugt * daß eine Lösung von Pectin aseptisch während der Züchtung zu der Fermentationsbrühe zugesetzt wird*
Es hat sich gezeigt, daß Asp» aculeatus CBS 101.43 auch sehr wirksame den Rückstand löslich machende Enzyme, Cellulasen, Pectinasen und Hemicellulasen neben der SPS-ase bildet» und daß der mit Hilfe von Asp· aculeatus CBS 101.43 gebildete Enzymkomplex außerordentlich gut geeignet ist als Mittel zur Zellwandzerstörung von pflanzlichen Materialien, So kann der von Asp» aculeatus CBS 101.43 gebildete Komplex angewandt werden in der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie zur Behandlung von Frucht- und Gemüsemaische und zur Klärung und Viskositätsverringerung bei der Verarbeitung von Fruchtsaft und Wein mit ausgezeichneten Ergebnissen, Er kann außerdem angewandt werden als Entwässerungsmittel (d· h. Mittel zum Abbau von Polysacchariden und damit zur Freisetzung des in der polymeren Struktur der Polysaccharide gebundenen Wassers (bei der Verarbeitung von Gemüsen). Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer SPS-ase oder ein Verfahren zum Abbau von Polysacchariden» vorzugsweise Pflanzen-Zellwand-Polysacchariden» mit Hilfe einer Carbohydrase, wobei ein SPS-ase haltiges Mittel nach der Erfindung in einem wäßrigen Medium mit einem Substrat für das SPS-ase-Zubereitung zusammengebracht wird·
So hat es sich erfindungsgemäß gezeigt» daß SPS-ase-Zubereitungen wertvolle Enzymzubereitungen zur teilweisen oder vollständigen Verflüssigung oder Abbau von verschiedenen Materialien, vorzugsweise pflanzlichen Materialien, z· B, Früchten- und Pflanzen-Abfällen, die Protein, Cellulose, Hemicellulose (z, B«» Glucane, Xylan, Galactane und Araban), Gummen, Pectin, Lipide, Inulin, Polyphenole, Stärke und Alginate
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enthalten,, sind und für damit verwandte Zwecke können alle Zwecke erwähnt werden, bei denen heute kommerzielle Pectinasen und Cellulasen angewandt werden. Einige Beispiele sind später angegeben.
Im Zusammenhang mit dem Extraktions-(Isolier)-Verfahren, das 2, B, in Beispiel 2 beschrieben ist, wurde festgestellt, daß die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen Proteinase-frei ist, auf Grund der Tatsache* daß das gewünschte Endprodukt, d. h, das Protein, sonst abgebaut würde· Ähnlich sollte, wenn andere biologische Materialien als Protein aus einem biologischen Rohmaterial extrahiert (isoliert) werden, die angewandte SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei sein von Enzymen, die diese anderen biologischen Materialien abbauen. Solche modifizierte SPS-ase-Zubereitungen können gebildet werden durch selektive Inaktivierung des unerwünschten Enzyms, durch Fraktionierung oder andere an sich bekannte Verfahren.
So ist eine bevorzugte Anwendung nach der Erfindung gekennzeichnet durch die Tatsache* daß der Abbau erreicht wird durch Isolierung oder Extraktion eines anderen biologischen Materials als Sojaprotein und verwandte pflanzliche Proteine aus einem biologischen Rohmaterial, wobei die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei ist von Enzymen, die imstande sind, das biologische Material abzubauen«
So hat es sich erfindungsgemäß gezeigt» daß die modifizierten SPS-ase-Zubereitungen (modifiziert in dem Sinne, daß sie im wesentlichen frei sind von Enzymen, die imstande sind* das
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zu extrahierende oder zu isolierende biologische Material abzubauen) wertvolle Enzymzubereitungen darstellen zur Extraktion (Isolierung) von speziellen biologischen Materialien z, B» Stärke, Lipiden* Geschmacksstoffen, Farbstoffen und Säften aus biologischen Rohmaterialien. Verschiedene Beispiele hierfür sind später angegeben,
Erfindungsgeraäß ist es bevorzugt, daß eines oder mehrere der Reaktionsprodukte (unbeachtlich# ob es erwünschte Endprodukte oder Nebenprodukte sind) gleichzeitig mit oder nach der Enzymbehandlung weiterbehandelt werden. Hierdurch wird eine flexiblere und besser anpaßbare Arbeitsweise ermöglicht* Diese weitere Behandlung ist vorzugsweise eine alkoholische Fermentation, wenn eines der Reaktionsprodukte ein ferjnentierbarer Zucker ist* Hierdurch erhält man ein billiges Verfahren zur Herstellung von Alkohol.
Um das Wesen der Erfindung näher zu erläutern», wird auf die folgenden Abschnitte 1 bis 4 Bezug genommen» die jeweils Details im Zusammenhang mit der Erfindung beschreiben:
i· Herstellung von SPS.
2» Charakterisierung von SPS, insbesondere Molekulargewichts· verteilung»
3* Reinigung eines SPS-ase-Zubereitung»
4* Abhängigkeit der SPS-ase-Aktivität von pH-Wert und Temperatur sowie Stabilität der SPS-ase*
63 376 12 - 12 Abschnitt 1 Herstellung von SPS
Wie oben erwähnt, kann das Ausgangsmaterial für die Herstellung von SPS Sojarückstand (Bestandteile außer Protein) sein» Daher wird in erster Linie die Herstellung von Sojarückstand beschrieben.
Sojarückstand ist die Protein-freie Kohlenhydrat-Fraktion (die in der Praxis kleine Mengen an Lignin und Mineralien enthalten kann) in entfettetem und enthülstem Sojamehl* Diese Kohlenhydratfraktion ist unlöslich in einem wäßrigen Medium bei pH 4,5 und kann auf folgende Weise hergestellt werden* wobei auf das Fließschema 1 verwiesen wird»
Entfettetes Sojamehl wird in entionisiertem Wasser von 50 0C in einem Gewichtsverhältnis Sojamehl zu Wasser = 1 : 5 in einem Tank mit einem pH-Stat unter Temperaturregelung suspendiert, der pH-Wert wird mit 4n NaOH(I) auf 8,0 eingestellt* Oetzt wird mit Hilfe von Alkalase 0,6 L (einem proteolytischen Enzym auf der Basis von B. licheniformis mit einer Aktivität von 0,6 Anson-Einheiten/g, bestimmt nach dem Anson-Verfahren, beschrieben in Novo Enzyme Information IB Nr, 058 e-GB) , eine Hydrolyse unter konstantem pH-Wert durchgeführt» wobei das Verhältnis Enzym : Substrat 4 % der Menge an Protein in dem Sojamehl (II) beträgt. Nach einer Hydrolysezeit von 1 h wird die Aufschlämmung abzentrifugiert (III) und gewaschen (IV), wobei diese Maßnahmen zweimal wiederholt werden (V, VI, VII), Die so
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erhaltene Aufschlämmung wird ein weiteres Mal 1 h mit Alkalse 0f6 L hydrolysiert (VIII* IX) , ähnlich wie oben angegeben. Dann wird die Aufschlämmung abzentrifugiert (X) und zweimal gewaschen (XI, XII, XII, XIV), und die nach der letzten Waschstufe erhaltene Aufschlämmung (6) sprühgetrocknet (XV), Das so erhaltene sprühgetrocknete Pulver ist der Soiarückstand, der als Ausgangsmaterial zur Herstellung von SPS dient»
SPS ist die wasserlösliche Polysaccharid-Fraktion, die erhalten wird durch übliche Behandlung des oben angegebenen Sojarückstandes mit Pectinase» Das SPS wird auf folgende Weise mit Hilfe der im folgenden angegebenen 14 Reaktionsstufen erhalten» Hierbei wird auf das Fließschema 2 Bezug genommen«
1* Der Gehalt an trockenen Bestandteilen in dem oben erwähnten Sojarückstand wird bestimmt und der Sojarückstand mit Wasser auf einen Gehalt von 2 % Feststoffe verdünnt und in einem Tank mit Temperaturregelung auf 50 0C gehalten, .
2« Der pH-Wert wird mit 6n NaOH auf 4,50 eingestellt,
3» Pectinex Super cone· L wird in einer Menge von 200 g/kg Feststoffe zugegeben (eine handelsübliche Pectinase mit einer Pectinase-Aktivität von 750 000 MOU, bestimmt nach dem Prospekt "Determination of the Pectinase units on Apple auice (MOU)" vom 12· 6, 1981), Es wird ferner CeI-luclast 200 L in einer Menge von 20 g/kg Trockensubstanz
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zugegeben (eine handelsübliche Cellulasen beschrieben in dem Prospekt Novo Enzyme, Informationsblatt B 153-e-GB 1000 # OuIi 1981).
4. Der Tankinhalt wird 24 Stunden unter Rühren auf 50 0C gehalten.
5. Die Enzyme werden durch Erhöhung des pH-Wertes auf 9,0 mit 4n NaOH inaktiviert« Das Reaktionsgemisch wird 30 min stehengelassen und der pH-Wert dann wieder mit 6n HGl auf 4*5 eingestellt.
6. Das Reaktionsgeraisch wird zentrifugiert und sowohl das Zentrifugat (überstehende Flüssigkeit) als auch der Rückstand (Schlamm) gesammelt.
7. Das Zentrifugat aus Stufe 6 wird zur Untersuchung über eine Filterpresse filtriert (das Filter wurde vor der Filtration mit Wasser gewaschen),
8. Das Filtrat wird ultrafiltriert» diafiltriert und nochmals ultrafiltriert über eine Membran mit einem Trennwert von 30 000, wobei die folgenden Parameter angewandt werden ί
1* Ultrafiltration auf eine Voluraenkonzentration von 6*
2» Diafiltration* bis der Prozentsatz an Trockensubstanz in dem Permeat O beträgt (O ° Brix) »
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3. Ultrafiltration auf ungefähr 15 % Feststoffgehalt in dem Konzentrat*
Die Temperatur beträgt 50 0C1 der pH-Wert 4*5 und der mittlere Druck 3 bar·
9. Das ultrafiltrierte Konzentrat wird auf 5 0C gekühlt und ein gleiches Volumen 96%iges Ethanol zugegeben,
10» Der Niederschlag wird mit Hilfe einer Zentrifuge gesammelt*
11. Der Niederschlag wird zweimal mit 50 % (Vol/Vol) Ethanol in ΗΛ0 gewaschen, entsprechend dem Volumen des Zentrifugats aus Stufe 10, d. h, es werden zwei Zentrifugierstufen durchgeführt*
12# Der gewaschene Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst,, mit einem Volumen entsprechend dem Volumen des ultrafiltrierten Konzentrats der Stufe 9.
13* Die Flüssigkeit der Stufe 12 wird zur untersuchung über ein Glasfilter filtriert.
14. Das klare Filtrat, enthaltend reines SPS, wird lyophilisiert.
Fließschema I.
Entfettetes Sojamehl H0O NaOH auf pH »
Hydrolysegemisch
Alcalase 0,6 L
(E/S » 4 %) 4n NaOH
H2O
Hydrolyse X In vor dem Austragen pH-Stat (pH = 8, T β 50 0C)
II
1, Zentrifugation 1« Waschstufe III Zentrifugat 1
> Abfall Aufschlämmung 1
IV
2* Zentrifugation j V
Zentrifugat
Aufschlämmung
Abfall
2» Waschstufe
VI
3. Zentrifugation
VII
Zentrifugat 3 Abfall
ι σ>
cn
(Fortsetzung)
NaOH auf pH 8
j Aufschlämmung 3
Neues Hydrolysegemisch
VIII
Alcalase 0,6 L Hydrolyse 1 h vor pH-Stat dem Austragen (PH s 8,0, X Zem IX
4N NaOH ^ T = 50 0C) Aufschlämmung
XI irrifu
4« Zentrifugation 3 4
1* VS/aschstufe
Abfall
5# Zentrifugation
XII
Zentrifugat 5
j Aufschlämmung 5 Abfa11
2« Waschstufe
XIII
6# Zentrifugation
XIV
Zentrifugat 6
Aufschlämmung 6
Abfair
Sprühtrocknen
XV
j4 vj (Tt
Fließschema II
1000 g Pectinex Super cone. L 5 kg sprühgetrockneter
Rückstand
g Celluclast 25O1 S
1
1
1 50 % C2H5OH
Pectinase
Abbau mit und Cellulase
50 0Cj pH - 4,5j t u 24 h
1, 2» 3, 4, 5
Zentrifugetion
Aufschlämmung
Check-Filtration 38
Ultrafiltration, Diafiltration, Ultrafiltration (GR 6OP) (19-26 0C) 1
Permeat
\L
Ausfällung
Überstehende Flüssigkeit
Zentrifugatlon (Abfall) Zentrifugat
-»8
10
Fließschema II (Fortsetzung)
2 x Waschen
Ausfällung
2 χ Zentrifugat
Ausfällung
1 Ho0
erneutes Lösen
9 11
12
Check Filtration
Protein-Aufschlämmung 13 (Abfall)
Lyophilisierung
310 g lyophilisiertes SPS
VD I
vj
cn
S ] i » J
ro
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Abschnitt 2
Charakterisierung von SPS und besonders Molekulargewichtsverteilung
Durch Gel-Chromatographie mit Hilfe einer HPLC-Vorrichtung (Waters Pumpe Model 6000, Waters Daten Modul 730 und Waters Refraktometer R 401) wurde die Molekulargewichtsverteilung des SPS, dessen Herstellung wie in der Beschreibung angegeben, durchgeführt wurde» bestimmt (Fig» 4), Mit Hilfe der gleichen Methode wurde auch die Molekulargewichtsverteilung der mit Hilfe von SPS-ase erhaltenen Abbauprodukte von SPS bestimmt (Fig. 5)· Außerdem wurde mit Hilfe der gleichen Methode der Anlagerungseffekt zwischen Sojaprotein und SPS (Fig# 6) und das NichtVorhandensein des Anlagerungseffektes zwischen Sojaprotein und SPS, das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mittels abgebaut worden war (Fig. 7), gezeigt»
Die Eich-Kurve (der Logarithmus des Molekulargewichts gegen Rf$ wobei der R^-Wert für Glucose willkürlich als 1 definiert ist und der R^-iVert für ein spezielles Dextran als die Retentionszeit für dieses Dextran» dividiert durch die Retenrtionszeit für Glucose, definiert ist) wurde konstruiert mit Hilfe verschiedener Standard-Dextrane mit bekanntem Molekulargewicht (T 4» T 10, T 4O1. T 70, T 110, T 500). Der R^ für das Maximum jedes Dextran-Peaks wurde festgestellt und das entsprechende Molekulargewicht berechnet als V Ff · M , wobei Mw das Gewichtsmittel des Molekulargewichts und M das Zahlenmittel für das Molekulargewicht ist« Als Eluens für dieses Chromatographieverfahren wurde 0,1m NaNO_-Lösung
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angewandt. Die für die Chromatographie angewandten Säulen waren 60 cm PW 5000 und anschließend 60 cm PW 3000. Auf diese Weise wurde die Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und dem Rr-Wert für die oben angegebenen Dextrane aufgestellt, siehe Fig» 3«
Auf der Basis der Fig. 4 kann berechnet werden, daß SPS eine Molekulargewichtsverteilung besitzt, die zu einem Wert von
— 5 —
M von ungefähr 5,4 χ 10 und einem Wert für M von ungefähr 4,2 x 10 führt. Aus dieser Figur geht auch hervor, daß das Chromatogramm zwei deutlich Peaks bei Retentionszeiten von 34*5 min (6 %), entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 5 χ 10 und eine Retentionszeit von 47,12 min (67 %), entsprechend einem Molekulargewicht von rund 4,9 χ 10 zeigt. Aus dieser Kurve geht hervor, daß zwischen diesen beiden Peaks eine Schulter existiert, bei einer Retentionszeit von 41,25 min (27 %), entsprechend einem Molekulargewicht von 2,8 χ 10 ♦
Nach dem Abbau des SPS mit SPS-ase wurde das Hydrolysegemisch durch eine Membran filtriert und das Filtrat chromatographiert* Es zeigte sich, daß ungefähr 55 % des SPS zu Mono-* Di- und Trisacchariden abgebaut waren, und daß die verbleibenden 45 % zu einem Polymer abgebaut worden waren mit drei Peaks rait den folgenden Molekulargewichten: 5 χ 10 , 104 und 4,4 χ ΙΟ3, siehe Fig. 5«
Um den Anlagerungs- bzw. Bindungseffekt zwischen Sojaprotein und SPS zu zeigen und die wesentliche Verringerung des Anlagerungseffektes zwischen Sojaprotein und SPS, das mit
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Hilfe einer SPS-ase abgebaut worden war» wurden die folgenden Versuche durchgeführt:
3 % SPS in O1IOm Acetatpuffer bei pH 4,5 wurden zu einer Aufschlämmung von Sojaisolat (Purina E 500) gegeben, um eine Suspension mit einem Verhältnis Isolat zu SPS von 10 : 1 zu erhalten. Diese Suspension wurde 18 h auf einem Schüttelbad bei 50 0C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Suspension zentrifugiert und die klare überstehende Flüssigkeit durch HPLC, wie oben beschrieben, analysiert. Aus einem Vergleich der Fig, 6 mit Fig, 4 geht hervor* daß das SPS vollständig an das Sojaisolat adsorbiert ist.
Das gleiche Verfahren, wie in dem vorhergehenden Absatz angegeben, wurde mit einer 3prozentigen SPS-Lösung durchgeführt, die mit einer SPS-ase hydrolysiert worden war, die gebildet worden war von CBS 101,43 (Fig* 7), Ein Vergleich zwischen Fig, 7 und Fig» 5 zeigt» daß keine Verbindung in dem hydrolysierten SPS mit einem Molekulargewicht unter etwa 10 an das Sojaisolat adsorbiert war. Die Hydrolyse verringert die quantitative Anlagerung auf etwa 10 bis 15 %, bezogen auf die Anlagerung von SPS an Sojaprotein,
Die NMR-Analyse des SPS, dessen Herstellung wie in der Beschreibung angegeben» durchgeführt wurde» zeigt die folgende ungefähre Zusammensetzung des SPS,
1· c* -GaIcturonsäure in einer Menge von etwa 45 %, wobei ungefähr 40 % der Gesamtmenge aer c< -Galacturonsäure als Methylester vorliegen«
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2. Rhamnopyranose in einer Menge von ungefähr 20 %» 3» Galactopypranose in einer Menge von ungefähr 15 % und 4» ß-Xylopyranose in einer Menge von ungefähr 20 %*
Die Bestandteile scheinen in einer Struktur vorzuliegen, umfassend eine Rhamnogalacturon-Hauptkette und Seitenketten aus Xylose und Galactose,
Eine vollständige saure Hydrolyse von SPS (8 h in 1 η HpSO ) und anschließende Analyse durch Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigte, daß auch kleinere Mengen der Monosaccharide Fucose und Arabinose in dem hydrolysierten SPS vorhanden waren»
Die HPLC-Analyse des SPS1 das durch den SPS-ase-Enzymkomplex, der von CBS 101.43 gebildet war, abgebaut worden war, zeigte eine starke Reduktion des Molekulargewichts. In Obereinstimmung damit, zeigte das NMR-Spektrum des wie oben angegebenen abgebauten SPS, daß der Hauptteil der Estergruppen verschwunden war und daß auch der Gehalt an Xylose und Galactose in dem höhermolekularen Material abgenommen hatte· Das NMR-Spektrum des Teils des SPS-Abbauproduktes, der durch Zugabe von einem Volumen Ethanol zu einem Volumen SPS-Abbauprodukt ausfällt, ist ähnlich dem NMR-Spektrum des SPS mit den oben erwähnten Modifikationen bezüglich der Estergruppen und des Gehalts an Xylose und Galactose»
63 376 12 - 24 Abschnitt 3 Reinigung einer SPS-ase-Zubereitung
Die Reinigung der SPS-ase-Zubereitung KRF 92 (siehe Beispiel 1) wurde durch Ionenaustausch durchgeführt» Der Puffer war 50 mMTris (Tris-hydroxymethylaminomethan), der mit HCl auf pH 7,0 eingestellt war. Die Säule war eine Κ-5/30-Säule, Das lonenaustauschermaterial war DEAE-Trisacryl (300 ml). Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 100 ml/h·
15 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 92 wurden in 450 ml H2O bei 6 C gelöst und alle weiteren angegebenen Verfahrensstufen zwischen 6 und 10 C durchgeführt. Der pH-Wert wurde mit 1 m Tris auf 7,0 eingestellt* Die Säule wurde mit dem Puffer äquilibriert und dann die SPS-ase-Probe auf die Säule aufgegeben. Die optische Dichte (ODp80) und die Leitfähigkeit wurden an dem Eluat gemessen (siehe Fig, 12). Die Fraktion 1 war das Eluat» das nicht an das Ionenaustauschermaterial gebunden war» Dann wurde die Säule mit 2000 ml Puffer gewaschen» wobei man die Fraktion 2 erhielt. Dann wurde ein 0-500 mM NaCl Gradient gebildet, wobei die Fraktionen 3 bis 9 erhalten wurden. Alle 9 Fraktionen wurden auf 200 ml eingeengt und gegen W/asser bis zu einer Leitfähigkeit von 2 mSi dialysiert» Dann wurden die 9 Fraktionen gefriergetrocknet» Nur die Fraktionen 1 und 2 zeigten SPS-ase-Aktivität.
Die Fraktion 1 wurde weiter durch Gelfiltration gereinigt, 1,5 g der Fraktion 1 wurden in 10 ml 50 mM Natriumacetat, pH 4,5 (500 mM KCl) gelöst. Die Säule war eine 2,5 χ 100-cm-Säule, Das Füllmaterial für die Gelfiltration war Sephacryl
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S-200. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 30 ml/h. Die Fraktionen, die Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 70 000 und 100 000 enthielten, geeicht mit Globular Proteinen, enthielten einen Enzymkomplex, der als Faktor G bezeichnet wird und der bei Untersuchung nach dem qualitativen Agar-Test SPS nicht abbauen kann. SPS wird jedoch nach dem qualitativen Agar-Test abgebaut, wenn der Faktor G mit einer Pectinase vermischt wird« Es hat sich gezeigt, daß der Faktor G imstande ist, Galactose, Fucose und einen Teil der Galacturonsäure von SPS abzuspalten t aber das Hauptabbauprodukt ist entsprechend der HPLC-Analyse noch ein hochmolekulares Produkt, das SPS sehr ähnlich ist,
Abschnitt 4
Abhängigkeit der Aktivität von pH-Wert und Temperatur sowie Stabilität einer SPS-ase
Fig. 13 zeigt die pH-Wert-Abhängigkeit der Aktivität der SPS-ase-ZUbereitung KRF 68. Von pH 2,7 bis pH 3,5 wurde ein Ameisensäure-Puffer angewandt und von pH 3,7 bis 5,5 ein Acetat-Puffer,
Fig» 14 zeigt die Abhängigkeit der Aktivität von der Temperatur der SPS-ase-Zubereitung KRF 63«.
Flg. 15 zeigt die Temperatur-Stabilität der SPS-ase-Zubereltung KRF 68»
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Ausführunqsbeispiel
Zur näheren Erläuterung der Erfindung wird auf die folgenden Beispiele 1 bis 3 verwiesen, wobei Beispiel 1 die Herstellung von SPS-ase erläutert und die Beispiele 2 bis 8 die Anwendung der SPS-ase auf ein Soja-Ausgangsmaterial erläutern, um ein gereinigtes pflanzliches Protein zu erhalten» Andere Anwendungen der SPS-ase sind in dem Abschnitt zwischen Beispiel 8 und der Zusammenfassung der Figuren angegeben.
Es wurden einige Fermentationen mit den hier angegebenen Stämmen von Asp» aculeatus und Asp# japonicus im Labormaßstab durchgeführt* Hierbei erhielt man Mittel, enthaltend SPS-ase# entsprechend dem hier angegebenen SPS-ase-Test. Da jedoch verhältnismäßig große Mengen an SPS-ase erforderlich sind, um Anwendungsversuche durchzuführen * wurden ähnliche Versuche im Pilotmaßstab durchgeführt, siehe das folgende Beispiel 1«
Beispiel 1
Herstellung von SPS-ase in einer Pilotanlage
Eine SPS-ase wurde durch Submers-Fermentation von Aspergillus aculeatus CBS 101.43 hergestellt,
In einem Fernbach-Kolben wurde ein Agar-Substrat der folgenden Zusammenstellung hergestellt:
Pepton Difco 6 g
Aminolin Ortana 4 g
Glucose Ig
Hefeextrakt Difco 3 g
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Fleischextrakt Difco 1,5 g
I<H PO4 Merck 20 g
Malzextrakt Evers 20 g
entmineralisiertes HO ad 1000 rnl
Der pH-Wert wurde zwischen 5,3 und 5,35 eingestellt. Dann wurden 40 g Agar (Difco) zugegeben und das Gemisch 20 min im Autoklaven bei 120 0C behandelt. Das Substrat wird als E-Agar bezeichnet.
Der Stamm GBS 101,43 wurde auf einer E-Agar-Schräge (37 0C) gezüchtet* Die Sporen von der Schräge wurden in sterilisierter Magermilch suspendiert und die Suspension in Gläsern lyophilisiert* Der Inhalt einer Ampulle mit lyophilisiertem Inhalt wurde in den Fernbach-Kolben gegeben. Der Kolben wurde 13 Tage bei 30 0C inkubiert*
Es wurde ein Substrat mit der folgenden Zusammensetzung in einem 500 1 Impf-Fermenter hergestellt»
CaCO3 1 ,2 kg
Glucose 7 ,2 kg
Rofec (Maiswasser-Fest
stoffe) .3 »δ kg
Sojabohnenöl 1 #2 kg
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von ungefähr 240 1 zugegeben* Der pH-Wert wurde vor der Zugabe von CaCO-auf ungefähr 5,5 eingestellt* Das Substrat wurde in dem Impf-Fermenter 1 h bei 121 0C sterilisiert. Das Endvolumen
63 376 12 - 28 vor der Beimpfung betrug ungefähr 300 1«
Die Sporensuspension aus dem Fernbach-Kolben wurde in den Impf-Fermentor überführt. Die Bedingungen der Impf-Fermentation viaren:
Fermentortyp: Üblicher belüfteter und gerührter Fermenter
mit einem Verhältnis Höhe ; Durchmesser von ungefähr 2,3.
Rühren: 300 UpM (zwei Turbinen-Propellerrührer)
Belüftung: 300 Normal Liter Luft pro Minute Temperatur: 30 bis 31 0C
Druck: 1,5 bar (0,5 ato)
Zeit: etwa 28 h
Ungefähr 28 h nach der Beimpfung wurden 150 1 aus dem Impf-Fermenter in den Hauptfermenter überführt»
In einem 2 500 1 Hauptfermentor wurde ein Substrat der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Geröstetes Sojamehl 90 kg
KH2PO4 20 kg
Pluronic 150 ml
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 900 1 zugegeben. Das geröstete Sojamehl wurde in Wasser suspendiert» Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 8,0 eingestellt und die Temperatur auf 50 0C erhöht» Daraufhin wurden etwa 925 Anson-Einheiten Alcalase 0*6 L zu der Suspension gegeben. Das Geraisch wurde 4 h bei 50 0C und pH 8*0
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(Na0CO- Zugabe) ohne Belüftung unter Normaldruck (null ato) und Rühren mit 100 UpM gehalten. Anschließend wurden die restlichen Bestandteile des Substrats zugegeben und der pH-Wert mit Phosphorsäure auf ungefähr 6,0 eingestellt« Das Substrat wurde in dem Hauptfermenter 1,5 h bei 123 C sterilisiert» Das Endvolumen vor der Beimpfung betrug ungefähr 1080 1*
Dann wurden 150 1 Impfkultur zugesetzt» Die Ferraentationsbedingungen waren:
Fermentertyp: Üblicher belüfteter und gerührter Fermenter
mit einem Verhältnis Höhe : Durchmesser von ungefähr 2,7
Rühren: 250 UpM (zwei Turbinen-Propellerrührer)
Belüftung: 1200 Normal Liter Luft pro Minute
Temperatur: 30 0C Druck: 1,5 bar (0,5 ato)
Zeit: etwa 151 h
Zwischen ungefähr 24 und ungefähr 116 h der Fermentation wurde eine Pectinlösung aseptisch zu dem Hauptfermenter mit konstanter Geschwindigkeit von ungefähr 8 l/h zugeführt· Die Pectinlösung der folgenden Zusammensetzung wurde in einem 500 1 Dosierungstank hergestellt:
Pectin genu x^ 22 kg
Phosphorsaure»
konz. 6 kg
Pluronic 50 ml
' Genu pectin (Citrus-Typ NF)
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Leitungswasser wurde auf ein Gesamtvolumen von«etwa 325 1 zugegeben. Das Substrat wurde in dem Dosierungstank 1 h bei 121 0C sterilisiert. Das Endvolumen vor dem Beginn der Dosierung" bzw» Zugabe betrug ungefähr 360 1* Nach Auslauf dieser Menge wurde ein zweiter ähnlicher Ansatz hergestellt. Das Gesamtvolumen an Pectinlösung für eine Fermentation betrug ungefähr 725 1.
Nach ungefähr 151 h langer Fermentation wurde die Fermentation abgebrochen. Die ungefähr 1850 1 Kulturbrühe wurden auf ungefähr 5 0C gekühlt und die Enzyme nach dem folgenden Verfahren gewonnen.
Die Kulturbrühe wurde mit Hilfe eines Vakuum-Trommelfilters (Dorr Oliver), das mit Filterhilfe (Hy-flo-super-cel Diatomeenerde) beschichtet war» filtriert. Das Filtrat wurde durch Eindampfen auf ungefähr 15 % des Volumens der Kulturbrühe eingeengt. Das Konzentrat wurde über eine Seitz-Filterfolie (Type supra 100) mit_0_IL25 % Hy-flo-sup_sr-ceLals Filterhilfe filtriert (in der folgenden Tabelle als Filtration I bezeichnet). Das Filtrat wurde mit 561 g (NH4)2S04/l bei pH 5*5 ausgefällt und 4 % Hy-flo-super-cel Diatomeenerde als Filterhilfe zugegeben. Der Niederschlag und die Filterhilfe wurden durch Filtration über ein Rahraenfilter getrennt» Der Filterkuchen wurde in Wasser gelöst und unlösliche Bestandteile über ein Rahmenfilter abfiltriert* Das Filtrat wurde (check) filtriert», über eine Seitz-Filterf olie (type supra 100) mit 0,25 % Hy-Flo-super-cel als Filterhilfe (in der folgenden Tabelle als Filtration II bezeichnet). Das Filtrat wurde über eine Ultrafiltrationsvorrichtung diafiltriert»
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Nach der Diafiltration wurde die Flüssigkeit auf einen Feststoff gehalt von 12,7 % eingeengt (in der folgenden Tabelle als Feststoffgehalt im Konzentrat bezeichnet)*
Eine fakultative Basenbehandlung zur teilweisen Entfernung der Proteaseaktivität kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Im Fall, daß die Basenbehandlung angewandt wird, wird sie 1 h bei einem pH-Wert von 9,2 durchgeführt, woraufhin der pH-Wert auf 5,0 eingestellt wird.
Oetzt wird die Flüssigkeit (check) filtriert und zum Zwecke der Keimverminderung filtriert und das Filtrat über eine Gefriertrockenvorrichtung von Stokes gefriergetrocknet»
Es wurden vier Fermentationsansätze in der unten angegebenen Weise durchgeführt, wobei der für die Fermentation angewandte Stamm, die Durchführung der fakultativen Basenbehandlung und andere Parameter verändert wurde, wie in der folgenden Tabelle angegeben«
Mikro organismus Basen- Behandlung X Code Nr. Konzentration (%) der Filterhilfe bei Aus fäl lung Fil tra tion II Fest stoff gehalt .ungen
ja nein KRF 68 Fil tra tion I 5 0,2 im Kon zen trat ω ε C <
CBS 101.43 X KRF 74 0,5 4 0,4 28
ATCC 20236 X KRF 83 2,0 5 0,25 7,5
IFO 4408 X KRF 92 1,0 4 0,25 12,4 χ)
CBS 101.43 0,25 12,7
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Nach der Filtration zur Keimverringerung wird das Konzentrat im Verhältnis 1 : 2,3 eingeengt» Ein kleinerer Teil des eingeengten Filtrats wurde sprühgetrocknet und der verbleibende Rest wurde gefriergetrocknet.
Um die Proteaseaktivität weiter zu verringern, wurden einige der oben angegebenen Zubereitungen wie unten angegeben behandelt, wobei nur eine der drei Alternativen A, B und C durchgeführt wurde.
A, 100 g SPS-ase- Zubereitung werden in 1 1 entionisiertem Wasser unter Rühren bei 10 0C - 2 °C gelöst. Der pH-Wert wird mit An NaOH auf 9,1 eingestellt» Diese ßasenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt» Der pH-Wert wird dann mit Eisessig auf 4,5 eingestellt und das Gemisch gegen eiskaltes entionisiertes Wasser bis zu einer Leitfähigkeit von 3 mSi dialysiert, Dann wird (das Produkt) gefroren und lyophilisiert,
S, 500 g SPS-ase-Zubereitung werden in 4 1 entionisiertem Wasser unter Rühren bei 10 0C £ 2 0C gelöst* Der pH-Wert wird mit 4n NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt» Der pH-iVert wird mit Eisessig auf 5,0 eingestellt. Das erhaltene Material wird iyophilisiert*
C* 50 g SPS-ase-Zubereitung werden in 400 ml entionisiertem Wasser unter Rühren bei 10 0C +_ 2 0C gelöst. Der pH-Wert wird mit 4n NaOH auf 9,1 eingestellt. Diese Basenbehandlung wird 1 h lang durchgeführt, Dann wird der pH-Wert mit Eis-
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essig auf 5,7 verringert. Das erhaltene Material wird lyophilisiert.
Als Ausgangssubstanz für die Basen-Behandlung an gewandte SPS-ase-Zuberei- tung Basen- Behandlung X Code-Nr. i
KRF 68 ABC KRF 68 BII
KRF 68 X KRF 68 BIII
KRF 92
Die oben angegebenen Zubereitungen werden in der folgenden Tabelle durch ihre Snzymaktivitäten nach der Erfindung charakterisiert» .
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Enzym-Aktivität .je g
KRF 68
KRF 63 BII. KRF 68 Bill KRF 74
SAE Platten- Test + 350 + 301 + 349 - 0
Quantita tiver Test 737 507 481 142
SSU 2125 1560 1720 578
SRUM 120 67000 105 339 1630
HUT pH 3,2 8000 8044 9396 1320
Cx 10300000 9000000 8800000 840000
PU 119400 72000 77700 4100
PGE - 78100 83700 76900 15130
UPTE 840 910 770 370
PEE 1600000 1100000 1000000 65000
VHCU
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Enzym-Aktivität
Je g Platten- Test KRF 83 KRF 92 KRF 92 BI
SAE Quantita tiver Test
168 476 430
SRU 120 683 626 757
SRUM pH 3,2 753 1640 1030
HUT 12800 5960 397
Cx 8040 5700 3092
PU 7500000 8400000 7600000
PGE 64600 60000 68800
UPTE 327000 44000 62400
PEH 690 1000 790
VHCU 2200000 1100000 742000
63 376 12 - 36 Beispiel 2 (Anwendungsbeispiel)
Dieses Beispiel beschreibt die Bildung eines ρ.ν,ρ« aus einem enthülsten und entfetteten Sojamehl "Sojamel 13". Der Feststoffgehalt dieses Mehls.betrug 94*0 %, und der Gehalt an (N χ 6,25) auf Feststoffbasis betrug .58,7 %* Das Sojamehl wurde mit der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 BII (Beispiel 1) auf die folgende VYeise behandelt:
85,2 g des Sojamehls wurden in 664,8 g Wasser suspendiert und unter Rühren bei 50 0C gehalten und der pH-Wert mit Hilfe von 7,5 ml 6 η HCl auf 4r5 eingestellt, 50 g einer Lösung, enthaltend 4,00 g der erwähnten SPS-ase-Zubereitung, wurden -zugegeben und das Reaktionsgemisch dann 240 min bei 50 0C gerührt* Das Gemisch wurde dann in einer Laborzentrifuge (Beckmann Model 0-6B) 15 min bei 3000 χ g zentrifugiert* Die überstehende Flüssigkeit wurde gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt untersucht, Die feste Phase wurde dann mit einem Volumen Wasser entsprechend der bei der ersten Zentrifugation erhaltenen Menge an überstehender Flüssigkeit gewaschen. Diese Operation wurde zweimal durchgeführt.» Die feste Phase wurde dann gefriergetrocknetj gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt untersucht. Die bei dem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus Tabelle 2*1 hervor;
63 376 12 - 37 -
Tabelle 2 β1 Ergebnisse
Komponente Menge N χ 6,25 Fest- Ausbeute Ausbeute an
g (%) stoffe an Pro- Feststoffen
(%) tein (%) (95)
Sojamehl 85,2 55,2 94,0 100 100
SPS-ase-
Zubereltung 4,00 75,6 - 6,4
1, Zentrifugat 666 1,50 5,04 21,2 42,0
ρ.ν,ρ. 44,5 87,5 95,7 82,7 53,2
So erhielt man ein p.v.p* mit einer Proteinreinheit, d# h, N χ 6,25, bezogen auf die Feststoffe, von 91,4 % und mit einer Gesamtausbeute an Protein von 83 %*
Beispiel 3 (Anwendungsbeispiel)
Dieses Sexspiel wurde durchgeführt, um die Proteinausbeuten, die Nährstoffqualität und einige funktionelle Eigenschaften von Sojaproteinprodukten zu vergleichen, die nach den folgenden drei Verfahren hergestellt worden waren,
A« Übliche isoelektrische Ausfällung zur Herstellung von Sojaprotein-!salat.
Bf Übliche isoeiektrisches Waschverfahren zur Herstellung von Sojaprotein-Konzsntrat·
63 376 12 - 38 -
C» Isoelektrisches Waschverfahren nach der Erfindung, umfassend ein den Rückstand lösendes Enzym zur 3ildung von p.v.p»
Um einen wirklichen Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens (C) mit den üblichen Verfahren für Sojaprotein (A und B) zu erhalten, wurde das gleiche Ausgangsmaterial in allen drei Fällen angewandt» Die Versuche wurden auch so durchgeführt, daß entsprechende Temperaturen und Behandlungszeiten in allen drei Fällen angewandt wurden. Lediglich die pH-Werte waren unterschiedlich auf Grund der fundamentalen Unterschiede zwischen den drei Versuchen,
A, Übliche isoelektrische Ausfällung zur Herstellung von Sojaprotein-Isolat
425,8 g Sojamehl wurden in 3574,2 g Leitungswasser bei 50 0C extrahiert; der pH-Wert wurde mit 20,1 g 4n NaOH auf 8,0 eingestellt* Nach Istündigem Rühren wurde die Aufschlämmung bei 3000 χ g 15 min unter Verwendung von 41-1-Bechern in einer Laborzentrifuge (Beckmann Model 3-6B) zentrifugiert. Das Zentrifugat I und der Niederschlag I wurden gewogen, Der Niederschlag I wurde wieder mit Wasser auf ein Gesamtgewicht von 4000 g extrahiert» Die Temperatur wurde auf 50 0C gehalten * der pH-Wert mit 4n NaOH auf 8 eingestellt und die Aufschlämmung 1 h gerührt« Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Zentrifugat II und der Niederschlag II wie oben gewogen» Von den Zentrifugaten I und II und dem Niederschlag II wurden Proben entnommen nach Kjeldahl und auf den Feststoffgehalt untersucht» Anschließend wurden die Zentrifugate
63 376 12
I und II vermischt und auf 50 0C gehalten. Das Protein wurde dann isoelektrisch bei pH 4,5 mit Hilfe von 45 g 6n HCl ausgefällt. Nach Istündigem Rühren bei 50 0C wurde das Protein durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 χ g gewonnen_. Das Zentrifugat III wurde gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die feste Phase III wurde gewogen und mit Wasser in einer Menge entsprechend dem Gewicht des Zentrifugats I gewaschen. Der Waschvorgang wurde durchgeführt durch 1 stündiges Rühren bei 50 0C, Das gewaschene Protein wurde durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 χ g gewonnen* Das Zentrifugat IV wurde nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert» Die feste Phase wurde in 1550 g Wasser von 50 0C suspendiert und der pH-Wert mit 17 g 4n NaOH auf 6,5 eingestellt* Das Gemisch wurde 1 h gerührt und der pH-Wert, soweit erforderlich» wieder auf 6,5 eingestellt» Schließlich wurde das Produkt gefriergetrocknet» gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die Berechnungen der Mengenbilanz sind in Tabelle 3.1 angegeben.
Tabelle 3.1 - Berechnung der Mengenbilanz bei der üblichen isoelektrischen
Ausfällung zur Herstellung von Protein Sojaprotein-Isolat Ausbeute 6,6 Ausbeute an 7,0 2,4 I 04
Operationen und Menge der % (Nx6,25) Fest an Pro - tein (%) 31,7 Feststoffen (%) 35,2 •si
Fraktionen Fraktion g 55,2 stoffe (SK) 100,0 100,0 Η· ro
Extraktion: Sojamehl 425,8 O 94,0 0 - 0 -
Wasser 3574,2 O O .0 0 0,8
4n NaOH 20,1 5,9 16,0 100,9 100,4
1, Zentrifugationi £ 4020,1 4,4 10,0 58,8 54,1
Zentrifugat I 3141,0 - 6,9 - -
Niederschlag I 805,0 -
Re-Extraktionj - - -
Niederschlag 1 805,0 O - 0 0
Wasser 3195,0 O
2# Zentrifugationj 0,5
Zentrifugat II 3104,0 9,1 0,9
Niederschlag II 820,0 17,2
Vermischen und Ansäuern -.
Zentrifugate I + II 6245,0 O -
6n HCl 45,0 21,3
Tabelle 3.1 (Fortsetzung)
Operationen und Fraktionen E III III Menge der Fraktion g Protein (°Nx6,25) Fest stoffe Ausbeute an Pro tein (%) Ausbeute an Feststoffen
3# Zentrifugation; Zentrifugat Niederschlag III 6290,0 5650,0 308,0 0,3 7,2 26,8
Waschen Niederschlag Wasser Σ IV IV 308,0 3141,0 O ι O O 0
4# Zentrifugation: Zentrifugat Niederschlag IV 3449,0 3113,0 291,0 0,4 0,15 •Mt 0,5 mm
Neutralisations Niederschlag Wasser 4 η NaOH 291,0 1550,0 17,0 O O O 16,0 0 0 0 0,7
Trocknen: Pulver 128,0 93,8 96,3 51,1 30 ,8
63 376 12 - 42 -
B. Isoelektrisches Waschverfahren zur Herstellung von Sojaprotein-Konzentrat
425,6 g Sojamehl wurden in 3574 g Wasser von 50 C gewaschen. Der pH-Wert wurde mit 44,8 g 6n HCl auf 4,5 eingestellt. Das Waschen wurde 4 h unter Rühren durchgeführt» Die Aufschlämmung wurde dann 15 min in einer Laborzentrifuge (Beckman Model 0-6B) bei 3000 χ g zentrifugiert, wobei 4i-l-8echer verwendet wurden» Das Zentrifugat I wurde gewogen und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert. Die feste Phase I wurde gewogen und erneut mit Wasser bis zu einem Gesamtgewicht von 4000 g gewaschen» Der pH-Wert wurde wieder mit lf7 g 6n HCl auf 4,5 eingestellt und die Aufschlämmung 30 min bei 50 C gerührt» Die Masse wurde zentrifugiert, und das Zentrifugat II und die Feststoffe II wurden wie oben gewogen» Die feste Phase II wurde erneut in 1575 g H2O bei 50 0C suspendiert und der pH-Wert mit 34,5 g 4n NaOH auf 6,5 eingestellt. Das Gemisch wurde 1 h bei 50 C gerührt und der pH-Wert* soweit notwendig, wieder auf 6,5 eingestellt* Schließlich wurde das Proteinprodukt gefriergetrocknet, gewogen und nach Kjeldahl auf H sowie auf den Feststoffgehalt analysiert» Die Mengenbilanz ist in Tabelle 3.2 angegeben.
Tabelle 3,2
Berechnung der Mengenbilanz bei isoelektrischen Waschen zur Herstellung von Sojaprotein-Konzentrat
Operationen und Fraktionen
Menge der Protein Fest- Ausbeute an Ausbeute an Fraktion % stoffe Protein Feststoffen g (Nx6,25) % % %
Waschen
Sojamehl Wasser 6n HCl
Zentrifugation:
Zentrifugat I Feststoffe I
425 .8 55,2 94 ,0 100 .0 100 ,0
3574 .0 0 0 0 0
44 .8 0 21 ,3 0 2 A
4044,6
3150,6 846,0
0,6
8,0
erneutes Waschen 846,0
Feststoffe I 3154,0
Waschen 1.7
6n HCl
0 0
0 0
25,2
0 0,1
2. Zentrifugation: Zentrifugat II Feststoffe II Σ 4001,7 3130,0 863,0 0,1 0,4 1,3 3,2
Neutralisation: Feststoffe II Wasser 4n NaOH 863,0 1575,0 34,5 0 0 0 16,0 0 0 0 1,4
Trocknen: Pulver 281,0 72,5 98,4 86,7 69,1
cn w
vj
cn
I-*
ro
63 376 12
C, Isoelektrisches Waschverfahren unter Verwendung eines den Rückstand lösenden Enzyms zur Bildung von pev»p,
425,8 g Sojamehl wurden in 3524,2 g Wasser bei 50 C gewaschen, der pH-Wert wurde mit Hilfe von 43,7 g 6n HCl auf 4*5 eingestellt. 24 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 BIII (Beispiel 1) wurden in 26 g Wasser gelöst und zu dem Waschgemisch zugegeben» Der Waschvorgang wurde dann 4 h unter Rühren durchgeführt« Anschließend wurde die Reinigung, wie bei B beschrieben t durchgeführt, wobei die Mengen an 6n HCl, 4n NaOH und Wasser zum erneuten Suspendieren die einzigen Parameter mit abweichenden (unterschiedlichen) Werten sind. Die Mengenbilanz ist in Tabelle 3·3 angegeben.
Tabelle 3.3
Berechnung der Mengenbilanz bei dem isoelektrischen Waschen einschließlich des den Rückstand lösenden Enzyms zur Herstellung von ρ,ν,ρ.
Operationen und Fraktionen Menge der Fraktion g Protein (Nx6,25) ι _ Fest stoffe 1 21,3 Ausbeute an Protein Ausbeute an Feststoffen I cn 04
Wäschern O ί Ui OJ Vj cn
Sojamehl 425,8 55,2 O 94,0 100,0 100,0 ro
Wasser 3540,2 O O O 0
6n HCl 43,7 O 21,3 O 2,3
SPS-ase: KRF 68 BIII 24,0 75,3 96,0 7,7 5,8
1„ Zentrifugation: )T 4043,7 - f - -
Zentrifugat I 3420,0 1,7 5*2 24,7 44,4
Feststoffe I 620,0 - -
Erneutes Waschen
Feststoffe I 620,0 - -
Wasser 3380,0 O 0
6n HCl 1.3 O 0,1
Tabelle 3»3 (Fortsetzung)
Operationen und Fraktionen
Hange der Protein Fest- '· Ausbeute an Ausbeute an Fraktion % stoffe: Protein Feststoffen g (N χ 6,25) (%) (%) (%)
2# Zentrifugation: JT 4001,3 0,2 0,6 j 0 2,9 5,1 I
Zentrifugat II 3400,0 - 16,0 j ! - - cn I
Feststoffe II 577,0
Neutralisation: - -
Feststoffe II 577,0 O 0 0
Wasser 1700,0 0 0 1,0
4n NaOH 25,3
Trocknen; Pulver
211,0
87,3 86,9
2)
96,7 97,0
2)
78,2
51,1
Analyse des Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding» Denmark
Analyse des Qvist's Laboratorium, Marseiis Boulevard 169, DK-8000, Aarhus C, Denmark
63 376 12 . - 47 Nährstoff eigenschaften
Die Aminosäurezusammensetzungen der drei Proteinprodukte wurden bestimmt, siehe Tabelle 3«4. Der Gesamtgehalt an essentiellen Aminosäuren, die chemische Bewertung und der Index der essentiellen Aminosäuren (EAAI) wurde berechnet nach dem FAO Bezugsmuster von 1957.
Der Gehalt an Trypsininhibitor der drei Produkte wurde bestimmt mit Hilfe des in A.O»C.S. Tentative Method Ba 12 {A,O«C,S, ist eine Abkürzung für American Oil Chemists' Society) beschriebenen Verfahrens. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3·5 angegeben* die auch die Ausbeuten und das Verhältnis Protein zu Feststoffen der drei Produkte zeigt.
Tabelle 3+4 Zusammensetzung der Aminosäure und Nährbewertung der drei Protein-Produkte A1, B und C ι
Aminosäure
A» Sojaprotein-Isolat
B, Sojaprotein-Isolat
g/16 g N aas
g/16 g N aas
t)
Nicht-essentiell
C* Sojaprotein-Isolat(p#v«p.)
g/16 g N aas"
Aspartinsäure 12,4 - 11,3 - - 11*9 -
Serin 4,62 - 4,69 - - · 4,81 -
Glutaminsäure 21,3 - 18,2 - 17,7
Prolin 6,07 - 5,19 - 4,76 -
Glycin 4,13 - 4,26 4,33 -
Alanin 3 ,.54 - 4,27 > i°° 4,55 -
Histidin 2,83 - 2,78 >100 2,50 -
Arginin 8*09 - 7,57 >100 7,04
Essentiell
Isoleucin 4,87 >100 4,97 5,19 > 100
Leucin 7,80 >100 7,98 8,09 >100
Lysin 6,24 >100 6,09 5,57 >100
Tabelle 3«4 (Fortsetzung)
2 38 3 4 41 5 6 42, 7 I cn
1 5« 47 >100J>100 5,35 >100*>100 5,17 >100*>100 VD
Phenylalanin 3,38 56 >100' 3,88 60 >100; 4,44 65, > 100 ' cn
Tyrosin 1,29 86 64'5*56,4 1,32 90 66'°*60,2 1,44 91, 72>°\ 65,5 to
Cystin 1,08 49,1} 1,21 55,0' 1*31 59, 5}
Methionin 3,10 >100 3,60 >100 3,97 7 100
Threonin 1,06 75,7 1,37 97,9 1,32 94,3
Tryptophan 4,90 7100 5,23 >100 5,57 7100
Valin
% Gesamt-Gehalt ,36 ,31 21
der essentiellen
Aminosäure ,4 % ,2 % 5 %
Chem» Bewertung ,7 % ,2 % 3 %
EAAI
aas =s Bewertung der Aminosäure, bezogen auf das FAO-Bezugsmuster (1957)
63 376 12
- 50 -
Tabelle 3*5 Verfahrens-Charakteristika und Trypsin-Inhibitor-Gehalt der drei Protein-Produkte A, B und C
A. Sojaprotein B. Sojaprotein C, Sojaprotein Isolat Konzentrat Isolat(p,v,p,)
Verfah- Prote
rens- in in
Charak- den
teristi- Fest
ka stof
fen
Prote
in-Aus
beute
97,4 %
7·! 7 O/
90,0 %
51,1 %
86 J Q/-
/Q
78,2 %
Trypsin-Inhibi- tor TU I/ g- PTOdu kt 34 000 21 000 19 000
TUI/g Protein 36 250 28 970 21 810
Funktionelle Eigenschaften
Der Index der Stickstofflöslichkeit (NSI) wurde in einer l^igen Proteindispersion bei pH 7,0 in 0,2 m NaCl-Lösung bzw, in destilliertem Wasser bestimmt* Nach 45 min langem Rühren mit einem Magnetrührer wurde die Suspension 30 min mit 4000 χ g zentrifugiert und die überstehende Lösung auf Stickstoff untersucht. Die Stickstofflöslichkeit wurde berechnet als (lösliches N %/Gesamt N %)♦ Die Ergebnisse dieser Berechnung für die drei Produkte sind in Tabelle 3.6 angegeben.
Die Emulgierfähigkeit wurde dreimal an jedem Produkt durch eine leicht modifizierte Swift-Titration bestimmt* 4,0 g
63 376 12
(N χ 6,25) des Produktes wurden in 250 ml 0,5 m NaCl mit einem Sorval Qmnimixer bei niederer Geschwindigkeit vermischt, 50 ml der Suspension wurden in ein Mischglas gegeben und 50 ml Sojabohnenöl zugesetzt. Anschließend wurde das gesarate Gemisch gewogen. Das ül-Wasser-Gemisch wurde dann mit 10 000 UpM homogenisiert, wobei das Glas in einem Eisbad stand» Eine zusätzliche Menge Sojabohnenöl wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,3 ml/s zugegeben» bis die Emulsion zusammenfiel» Die Gesamtmenge an öl, die vor dem "Endprodukt" zugesetzt wurde, wurde durch Wiegen festgestellt»
Die Emulgierfähigkeit wurde berechnet als ml öl pro Gramm Protein (N χ 6,25)* Die Dichte des Öls wurde mit 0,9 g/ml angenommen.
Die Mittelwerte der Bestimmungen der Emulgierfähigkeit der drei Produkte sind in Tabelle 3.6 angegeben.
Die Aufschlagbarkeit wurde in einer 3%igen Proteinlösung bei pH 6,5 bestimmt· 250 ml der wäßrigen Dispersion der Proteinproben wurden mit Geschwindigkeit III 4 min in einem Hobart-Mischer (Modell N-50), der mit einem Drahtquirl versehen war, aufgeschlagen. Die Aufschlagbarkeit bzw. Ausdehnung beim Aufschlagen wurde berechnet nach der Formel
Ausdehnung beim Aufschlagen = 100 v
in der V das Endvolumen des aufgeschlagenen Produktes in ml bedeutet»
63 376 12 - 52 -
V wurde gemessen durch erneutes Füllen des Mischerglases mit Wasser. Es wurden Doppelversuche für jede der drei Proben durchgeführt. Die erhaltenen Mittelwerte sind in Tabelle 3.6 angegeben«
Die Schaumstabilität wurde als Verhältnis zwischen der Menge Schaum, die nach 3minütigem Ablaufen verblieb und der ursprünglichen Schaumraenge bestimmt, 1 g des nach dem oben angegebenen Verfahren geschäumten bzw» aufgeschlagenen Produktes wurde in einen Kunststoffzylinder (Durchmesser 7 cm, Höhe 9 cm) mit einem Drahtnetz mit einer Maschenweite von 1 χ 1 mm gegeben. Der Zylinder wurde auf einen Trichter auf einem Glaszylinder gegeben und das Gewicht (3) der abgelaufenen Flüssigkeit in dem Glaszylinder bestimmt, Die Schaumstabilität FS ist definiert durch die Gleichung*
FS = χ 100 %.
Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in Tabelle 3.6 angegeben«
Die Gelfestigkeit ist in dieser Beschreibung definiert als die Srookfield-Viskosität gemessen mit Hilfe von T-Spindeln in einem Brookfield Helipath-Ständer« Die Gele wurden hergestellt durch Wärmebehandlung von 12%igen Proteinsuspensionen in 0,5 m NaCl, Die Wärmebehandlung wurde in geschlossenen Dosen mit einem Durchmesser von 7,3 cm und einer Höhe von 5 cm, die in ein Wasserbad gestellt wurden, das auf 80 und 100 C gehalten wurde» jeweils innerhalb von 30 min durchgeführt* Die Dosen wurden gekühlt und bevor sie geöffnet und
53 375 12 - 53 -
(der Inhalt) gemessen wurde, thermostatisch auf 20 C eingestellt» Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle 3.6 angegeben.
Tabelle 3«6 Funktionelle Eigenschaften der drei Protein-Produkte
Funktion A. Sojapro- B, Sojapro- C. Sojapro-
tein-Iso- tein-Iso- tein-Isolat lat lat(p.v.p,)
% NSI in 0,2 ra NaCl % NSI in Wasser 39,5 53,9 20,3 25,1 25,6 28,6
Emulgier-Fähig- keit: ml ül/g (N x 6,25) 218 182 354
Aufschlagbarkeit (95) 120 120 340
Schaumstabilität (SS) 50 50 20
Gel-Festigkeit (dPa„s)
80 0C (0,5m NaCl) 1,7 χ ΙΟ3 1,2 x 104 3,3 χ · 100 0C (0,5m NaCl) 2,0 χ 104 4,0 χ 104 1,3 X
Seispiel 4 (Anwendungsbeispiel)
Ein p.v.p. wurde hergestellt nach dem in Beispiel 3c beschriebenen Verfahren mit der Ausnahme, daß die Cellulase Aktivität teilweise von Trichoderma reseei stammt. Die im Handel erhältliche Cellulasezubereitung CELLUCLAST, herge-
63 376 12 - 54 -
stellt von Novo Industri A/S, wurde mit einer Base bei niederer Temperatur auf die folgende Weise behandelt« Der pH-Wert einer 10%igen Celluclast-Lösung in Wasser wurde mit NaOH auf 9,2 eingestellt und die so erhaltene Lösung auf 5 C gekühlt. Nach 1 h bei diesem pH-Wert und dieser Temperatur wurde der pH erneut mit 20 %iger Essigsäure auf 4,7 eingestellt· Die Lösung wurde über Nacht bei 5 C gehalten und dann steril filtriert» Das Filtrat wurde gefriergetrocknet« 4 g des gefriergetrockneten Produktes zusammen mit der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 BIII (Beispiel 1) zugegeben» Die beiden Enzyme wurden in 172 g Wasser vor der Zugabe zu dem Wasch-Gemisch gelöst» Die Bestimmung der Mengenbilanz ist in Tabelle 4*1 angegeben«
Der Versuch zeigt, daß diese spezielle SPS-ase-Zubereitung schon eine wirksame Cellulase enthält, da der Zusatz von Celluclast das Verhältnis Protein : Feststoffen nicht beeinflußt. Andere SPS-ase-Zubereitungen können jedoch weniger Cellulase enthalten, z. B* KRF 92, siehe, in Tabelle unmittelbar vor Beispiel 2.
Tabelle 4.1
Berechnung der Mengenbilanz beim isoelektrischen Waschen einschl. der SPS-ase-Zubereitung und Cellulast vJV zur Herstellung von ρ,ν,ρ. ι
Operationen und Fraktionen Menge der Fraktion g Protein (%) (Nx6,25) Fest stoffe Ausbeute an Protein Ausbeute an Feststoffen (%) I W
Waschen Ul I
Sojamehl 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 σ>
Wasser 3546,2 0 0 0 0
6n HCl 43,1 0 21,3 0 2,3
SPS-ase: KRF-68-B-III Celluclast 24,0 4,0 75,3 43,6 96 96 7,7 0,7 5,8 1.0
Zentrifugat JT 4043,1 - - - - -
Zentrifugat I 3382,0 1,9 5,5 27,3 46,5
Feststoffe I 661,0
erneutes Waschen?
Feststoffe I 661,0 - -
Wasser 3339,0 0 0 0 0
6n HCl 0 0 0 0 0
Tabelle 4.1 (Fortsetzung)
Operationen und Fraktionen Menge der Fraktion g Protein U) (Nx6,25) Fest stoffe Ausbeute an Protein Ausbeute an Feststoffen (%) Ul cn
2# Zentrifugation: ~ Zentrifugat II Feststoffe II ' 4000,0 3414,0 582,0 0,2 0,7 2,9 6,0
Neutralisation: Feststoffe II Wasser 4 η NaOH 582,0 1691,0 25,3 0 0 0 16,0 0 0 0 1,0
Trocknen: Pulver
206 tO
88,8 98,9
77,8
50,9
63 376 12 - 57 -
Beispiel 5 {Anvvendungsbeispiel)
Ein p.v.p, wurde nach dem in Beispiel 3c beschriebenen Verfahren hergestellt mit der Ausnahme, daß alle Mengen um den Faktor 5 kleiner waren .und daß das Reaktionsgemisch vor dem Zentrifugieren auf ungefähr 5 0C gekühlt wurde, Auf der Grundlage der Analyseergebnisse im Zusammenhang mit den Zentrifugaten wurde eine theoretische Ausbeute an Protein erhalten, wie aus Tabelle 5,1 hervorgeht.
Tabelle 5»! Bei der Herstellung von p*v.p* erhaltene theoretische Protein-Ausbeute
Fraktionen Menge g Protein (Nx6*25) Ausbeute an Pro Beispiel 3 C
tein < Pro tein ;Nx6,25) Protein 0/ /O
Sojamehl SPS-ase KRF-68 B-III 85,2 4,,8 55,2 75,3 100 55,2 75,3 100
!♦ Zentrifugat 2# Zentrifugat ρ,ν.ρ, 639 595 0,99 0,13 87 ,2a 7,7 1,7 0,2 87,1 7,7
13,5 1,6 92,6b 24,7 2,9 80 ,lb
a Durchschnitt von 87,5 (Bioteknisk Institut) und 86,9 (Qvist's Laboratorium) ι entsprechend Feststoffen von 97,6 und 98,0 %,
Berechnet als Gesamtmenge von Protein - Proteinverlust in den Zentrifugaten*
63 376 12 - 58 - '
Beispiel 6 (Anwendungsbeispiel) Nachweis der Proteinbindung von SPS
40 g (N χ 6,25) aus einem im Handel erhältlichen Sojaprotein Isolat (Purina 500 E der Ralston Purina) wurden in 680 g Wasser gelöst, Das Gemisch wurde im Wasserbad auf 50 C erwärmt und der pH-Wert mit 6 η HCl auf 4,5 eingestellt. 90 g dieses Gemisches wurden in 5 χ 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und 10 g wäßrige Lösungen, enthaltend O, 0,2, 0,4, 0,8 bzw. 1,6 g des wie vorher in der Beschreibung angegeben hergestellten SPS wurden zugegeben. Die Kolben wurden dann 240 mii rührt»
240 min mit einem Magnetrührer im Wasserbad bei 50 C ge-
Anschließend wurden die Aufschlämmungen mit 3000 χ g 15 min zentrifugiert und die Zentrifugate I nach Kjeldahl auf N sowie auf Feststoffe analysiert» Die festen Phasen wurden in Wasser von Raumtemperatur gewaschen und dann neu zentrifugiert» Dieses Verfahren wurde wiederholt. Dann wurden die Feststoffe in 50 ml Wasser dispergiert und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 6 η NaOH auf 6,50 eingestellt. Die neutralisierten Produkte wurden gefriergetrocknet und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert* Bezogen auf die in Tabelle 6.1 angegebene Analyse wurden das gewonnene Protein und der Prozentsatz an SPS, der an das Protein gebunden war, mit Hilfe der in Zusammenhang mit Tabelle 6.2 angegebenen Formeln berechnet.
Dieses Beispiel zeigt, daß das SPS fest an das Protein ge-
63 376 12
bunden ist, so daß das Verhältnis Protein : Feststoffen mit zunehmendem Gehalt an SPS abnimmt. Ein SPS-Gehalt, entsprechend ungefähr 0,4 g in 10 g Wasser, zugegeben zu 5 g Protein-Isolat, ist das in dem Sojamehl vorhandene Verhältnis Protein : SP3·
Die prozentuale Bindung von SPS ist ein berechneter Wert« Die prozentuale Bindung von SPS nimmt auf Grund der Sättigung des Proteins in Beziehung auf SPS bei geringen Verhältnissen Protein : SPS ab.
Tabelle 6*1 Messungen nach Beispiel 6
Verhältnis Protein/ SPS Zent rifugat I % N trockener Niederschlag 93,1 , Νχ6,25
% N % DM % Nx6,25 % DM α 97,3 J DM
OO 13,2 /I 97,9 88,6
25 0 ,068 0,62 13,4 82,5 98,1 86,1
12,5 0,045 0,49 13,0 83,8 97,9 83,0
6,25 0 ,038 0,45 12,6 81,3 80,3
3,125 0,031 0,45 11,8 78,8 75,3
0,026 0,61 73,8
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Tabelle 6»2 Protein-Gewinnung und prozentuale Bindung von SPS
Verhältnis % Protein-Gewinnung1' % Bindung von SPS ' Protein/SPS
oc 91,5 O
25 94,4 ^ 77
12,5 95,3 90
6,25 96,1 70
3,125 96,8 60
1^ % Protein-Rückgewinnung = £Ί - J χ 100, wobei NC-1= % N in Zentrifugat I ist.
2) % Bindung von SPS =
r 5x( ^Protein-Rückgewinnq») - SxC^Protein-Rückqewinnq«) "j
L i% p/H) {% p/h) «, ^y
. . , . χ 100,
j/~ 5/Menge an SPS _J7
(% p/M) Verhältnis Protein/Feststoff im trockenen Niederschlag und
(% P/H)co gilt für den Niederschlag ohne Zusatz von SPS
Beispiel 7 (Anwendungsbeispiel)
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines unter Verwendung der SPS-ase-Zubereitung KRF 92 BI in einer Menge von 5 %t bezogen auf die Feststoffe, Die Art der Herstellung
63 376 12
entsprach genau derjenigen von Beispiel 3c mit der Ausnahme, daß alle Mengen um den Faktor 5 verringert wurden. Das p.v.p. wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert» Die .bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus Tabelle 7*1 hervor»
Tabelle 7»! In Beispiel 7 erhaltene Ergebnisse
Bestandteile Menge (Nx6,25) Fest- Ausbeute Ausbeute
g (%) Stoffe an Pro- an Festig) tein stoffen (%) (%)
Sojamehl 85,2 55,2 94,0 100 100
Enzym-Zubereitung 4,0 71,2 - 6,1 - .
1. Zentrifugat 632 1 ,88 5,44 25 ,3 43 ,0
2* Zentrifugat 673 0 »30 0,80 4 #3 6 .7
p. v.p. 39,8 85 ,6* 98, la 71 ,9 48 *8
84 98, lb
a Analyse des Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding
Analyse des Qvist's Laboratorium, Marseiis Boulevard 169* DK-8000
Beispiel 8 (Anwendungsbeispiel)
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung einer Vorbehandlung von Sojamehl durch DampfStrahlbehandlung vor der Herstellung von p»v,p.
63 376 12 - 62 Vorbehandlung
Eine Aufschlämmung von Sojamehl in Wasser» bestehend aus 10 kg Sojamehl (Sojamel 13 hergestellt von Aarhus Oliefabrik A/S) auf 100 kg wurde durch eine Dampfdüse (Typ Hydroheater B-300) gepumpt und mit Dampf von 8 bar in einer solchen Menge und mit einer solchen Strömungsgeschwindigkeit vermischt, daß eine Endtemperatur von 150 C 25 s in einem rohrförmigen Druckreaktor aufrechterhalten werden konnte. Anschließend wurde der Druck in einer Entspannungskamraer (ein Zyklon) aufgehoben und von hier wurde die Aufschlämmung durch einen Plattenwärmeraustauscher geleitet und auf ungefähr 50 0C gekühlt. Die abgekühlte Aufschlämmung konnte direkt zur Herstellung von ρ#ν·ρ, nach der Erfindung verwendet werden aber in diesem Falle wurde die Aufschlämmung mit einer Eintrittstemperatur von 200 C und einer Austrittstemperatur von 90 C sprühgetrocknet. Es zeigte sich, daß das vorbehandelte Produkt einen Feststoffgehalt von 96,5 % und einen Proteingehalt von 56,9 % (N χ 6,25) besaß.
Herstellung von ρ,ν.ρ.
Die Herstellung wurde auf die folgende Weise durchgeführt:
70 g Feststoffe des mit Dampf behandelten und getrockneten Sojamehls wurde in 560 g Wasser suspendiert und bei 50 0C gerührt und der pH-Wert mit Hilfe von 6,5 ml 6 η HCL auf 4»50 eingestellt, 6 χ 90 g dieser Suspension wurden in 6 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und auf einem Wasserbad von 50 0C mit Hilfe von Magnetrührern gerührt. Zu jedem
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Kolben wurden IO g einer Lösung, enthaltend O, 0,025, 0,050, 0,10, 0,20 bzw* 0,40 g SPS-ase-Zubereitung KRF 68 BIII gegeben. Die Reaktionsgemische wurden dann 240 min bei 50 C gerührt· Dann wurde das Gemisch 15 min bei 3000 χ g zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde dann nach Kjeldahl auf N analysiert und die feste Phase mit gleichen Volumina Wasser gewaschen und zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt. Die feste Phase wurde dann gefriergetrocknet und nach Kjeldahl auf N sowie auf den Feststoffgehalt analysiert.
Ein ähnlicher Versuch wurde mit einem nicht behandelten Sojamehl (Sojamel 13 der Aarhus Oliefabrik A/S) als Ausgangsmaterial durchgeführt. In diesem Fall waren die Verhältnisse Enzym : Substrat O1, 1, 2, 3, 4 bzw, S %,
Bezogen auf den Proteingehalt der überstehenden Flüssigkeiten kann der Prozentgehalt an gewonnenem Protein berechnet werden. Die Ausbeute an Protein beruht auf der Annahme, daß das Enzymprodukt nach der Reaktion lOO % gelöst ist. Die folgende Tabelle zeigt die bei beiden Versuchen erhaltenen Ergebnisse,
63 376 12
Tabelle 3.1
- 64 -
Verhältnis Proteinausbeute und Protein der Feststoffe des aus dampfbehandeltem oder ro> hera Sojamehl hergestellten p.v.p.
Dampfbehandeltes Sojamehl Protein der Feststoffe O/ /D nicht behandeltes Sojamehl Protein der Feststoffe
E/S % Protein Fest stoffe % 76,5 Protein Fest stoffe % 73,9
O 92,9 86 ,6 90,7 -
0,25 90,1 88 ,7 - —
0,50 89*3 89,7 - 86,2
1,0 88,1 91,7 87,1 88,1
2,0 86,6 - 85,7 89,5
3,0 - 92,2 84,3 90,9
4,0 84,7 — 82,6 91,1
8,0 — 75,2
Im Zusammenhang mit entweder den Extraktions- (Isolierungs-) Verfahren für andere Materialien als Proteine oder mit den Verflüssigungsverfahren und damit verwandten Verfahren wird auf das allgemeine Verfahrensschema für die Anwendung, wie in dem Fließschema 3 angegeben» verwiesen.
Das Substrat kann ein oder mehrere Kohlenhydrate in einem Äusgangsraaterial sein oder es kann das gesamte Ausgangsmaterial sein.
Dieses Substrat kann einer chemischen oder physikalischen
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Vorbehandlung» wie später beispielhaft erläutert, z. B, einer Säure- oder Alkalibehandlung, Einweichen, Benetzen und/oder Kochen mit oder ohne Dampf unterworfen worden sein.
Das Ausgangsmaterial kann eingeweicht (mazerisiert), gehackt, naS gemahlen und/oder homogenisiert sein (alle diese Behandlungen werden in Fließschema 3 als Homogenisierung bezeichnet) , wobei Wasser und andere Additive während dieser Stufe zugesetzt oder nicht zugesetzt werden können» Die Homogenisierung kann mit unterschiedlicher Wirkung durchgeführt werden, z* B, bei unterschiedlichen Drücken, die nur ein Bruchteil des für den speziellen Homogenisator angegebenen Maximal-Druckes ausmachen· Unterschiedliche Zusätze bzw. Additive können vor oder während der Homogenisierung zugegeben werden, wie in dem Fließschema 3 durch b., bp ... bn angegeben.
Das Reaktionsverfahren einschließlich der SPS-ase-Herstellung wird unter speziellen Bedingungen, z. B. von Temperatur, Druck, Zeit, pH und Enzymmenge durchgeführt. Auch sind Empfehlungen bezüglich des angewandten Reaktors (z« B. für ansatzweises Arbeiten oder Kolbenströmungsreaktoren) und das Rühren, soweit erforderlich, angegeben, Eine Reihe von Additiven kann für unterschiedliche Ausgangsmaterialien angegeben werden wie durch c-, C2 ·♦♦ c in Fließschema 3 angegeben.
Auch die Trennverfahren können mit unterschiedlichen Wirkungen durchgeführt werden. Bei vielen Verfahren wird die Abtrennung weggelassen oder erleichtert, z. B. wenn das Aus-
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gangsraaterial vollständig flüssig (verflüssigt) ist. Unterschiedliche Trennvorrichtungen können angewandt werden (z« 3, Zentrifugen, Filter» Ultrafiltrationsvorrichtungen, Hydrozyklone, Eindicker, Siebe oder einfache Dekantiervorrichtungen) .
Die Trennungswirkung ist definiert als das Verhältnis zwischen dem absoluten Feststoff (sludge)-Gehalt in der festen Phase und dem absoluten Feststoff (sludge)-Gehalt des Reaktionsgemisches*
Die erhaltenen festen oder flüssigen Phasen können weiterbehandelt werden, z* B# eingeengt, getrocknet, mit Lösungsmittel extrahiert, um bestimmte Komponenten wie Fett oder Öl zu entfernen, fermentiert zur Bildung von Biomasse, Alkohol oder anderen Produktes (Enzymen, Antibiotika oder anderen wertvollen Bestandteilen).
Die erhaltenen Produkte können auch zur wiederholten Behandlung entsprechend dem Verfahrensschema zurückgeführt werden»
Fließschema III
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Substrat
SPS-ase
Vorbehandlung
Horaogenisierung
Reaktion
Homogenisierung
Trennung
flüssig Horn
=0-100 %)
(spezielle Reaktions-Bedingungen)
S ep
= 0 - 100
Feststoffe
Weitere Behandlung (siehe Text) oder erneute Verwendung als Substrat
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Im folgenden sind einige Beispiele für die Anwendung von SPS-ase-Zubereitungen angegeben und eine Übersicht dieser Anwendungen geht aus der folgenden Liste hervor,
Auch in der beiliegenden Tabelle I sind verschiedene Charakteristika zusammen mit dem Fließschema 3 zusammengefaßt«
63 376 12
Aufstellung von Anwendungsmöglichkeiten von SPS-ase-Zubereitunaen
Art der SPS-ase- VoIl- 3e- 1 - --^,.=^__
Zubereitung stän- Extraktion von Stärke aus Hais»
SPS-ase-Zuberei- dige zugs- Nr, 2 Weizen und Kartoffeln
tungt die im we Verflüs A Extraktion von Lipiden aus pflanz
sentlichen frei sigung 3 lichen Materialien
ist von einer oder oder A Extraktion von ätherischen Ölen
mehreren störenden ähnl. 4 aus pflanzlichen Materialien
Enzymaictivitäten Behand A Extraktion von natürlichen Farb-
lung stoff-«n_..aus pflanzlichen Materia
A 5 lien
Extraktionen von Kautschuk von dem
1 Guayul-8usch
A Herstellung eines Milchersatz-
2 Stoffes für Haustiere .
3a Herstellung von verzuckerte Stär
3 ke enthaltenden Rohmaterialien
Ba Vollständige Verflüssigung von
4 Birnen und anderen Früchten
Ba Herstellung von Saft durch Behand
5 lung von Früchten und Gemüsen
Ba Behandlung im Zusamraenhnag mit der
nicht Extraktion oder dem Pressen von
modi- Ba 6 Zuckerrohr oder Zuckerrüben
fi- 7 Herstellung von Sojamilch
zier- Behandlung zur Erhöhung der gewinn
te Ba baren Menge an löslichen Kaffee-
SPS- Ba , bestandteilen
3se-
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Art der SPS-ase- Bearbei- Be- 1 Verhinderung und/oder Abbau von
Zubereitung tungs- "Schleiern" in Apfelsaft
Zube- hilfen zugs- Nr. 2 Verwendung zur Klärung von Weiß
rei- Bb wein
tun- 3 Herstellung von ISSPH oder anderen
gen Bb pflanzlichen Protein-Hydrolysaten
4 Maische-Enzym in der Brauerei
Bb 5 . Enzym-Zusatz bei der Bierfermenta
tion und/oder Lagerung
Bb 6 Mittel zur Entfernung der Mandel-
Bb häutchen
Andere 1 Abbau von unterschiedlichen Abfall
Anwen Bb produkten
nicht dungs- 2 Verzuckerung und gleichzeitige
modi arten Bc Fermentation
fi 3 Abbau von Cellulose
zierte Bc 4 Verwendung als Backhilfe
SPS- 5 Verbesserung der Alkoholausbeute
ase- Bc und Ausbeute an Biomasse bei der
Zube- Bc Fermentation von Sulfitlauge von
rei- Bc der Papierherstellung
tungen 6 Entwässerung von biologischen
Schlämmen
7 Silage-Hilfe
Bc
Bc
Tabelle I
Sub-Lit, strat
Zusätze
a.
1 Homogenisie rung 0/r\Hom h
2' Homo- Trennung
genisie-
rung
flussige Phase
weitere Behandlungen
feste Phase
Vereinigte Phase (keine Trennung
Mais Wasser SOn
Was- NaOH ser oder HCl
- 50 10 - 30 20 - 50 (enthält Wasch-
Keime Waschen, Ölgewinnung
Vorgang
A 2 Mais- - keime NaOH oder HCl O 0 100 - Pasteurisierung Konzentrierung Sprühtrocknung
Ba 1 Soja- Vi/as- mehl ser (ent fettet) HCl O 0 0 - Hefe für Alkohol- Fermentation, Destillation
Ba 2 süße Was- Kar- ser toffeln NaOH oder HCl 0 Kri stalli sation -
Ba 5 Zucker rüben Was ser NaOH oder HCl 10 - 100
Bc 1 Soja- Wasquark ser o.
Sojamilchrückstände
HCl
10
Hefe für Alkohol-Fermentation, Destillation
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A 1. Extraktion von Stärke aus Mais,, Weizen und Kartoffeln
Die Extraktion von Stärke aus Mais» Weizen, Kartoffeln und anderen stärkehaltigen Pflanzen wird in einer oder mehreren Stufen durchgeführt: Einweichen, Naß-Mahlen und Trennen» Die Anwendung einer SPS-ase-Zubereitung mit im wesentlichen keine amylolytischen Aktivität führt zu den folgenden Vorteilen,, wobei Mais als Beispiel angewandt wird:
1, Die Stärkefreisetzung wird innerhalb einer kürzeren Einweichzeit erleichtert,
2* Oer Wasserverbrauch kann verringert werden,
3, Die Freisetzung von Maiskeimen- wird erleichtert ohne Freisetzung von Maiskeimöl
4* Das Protein kann in höherer Reinheit erhalten werden, 5» Die Gewinnung von Maiswasser wird erleichtert, A 2» Extraktion von Lipiden aus Pflanzenmaterial
Da die Lipide in pflanzlichen Materialien innerhalb der Zellen eingeschlossen und üblicherweise an Proteine gebunden sind, können Lipide in wäßriger Phase durch Behandlung mit einer SPS-ase-Zubereitung extrahiert werden, die im wesentlichen frei ist von Lipasen, So wird Maiskeimöl üblicherweise isoliert durch Extraktion der getrockneten Maiskeime mit Hexan. Der Trockenvorgang ist jedoch überflüssig,- wenn die nassen Maiskeime mit einer SPS-ase-Zubereitung der oben
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angegebenen Art behandelt werden. Ähnlich kann die Extraktion von Olivenöl in wäßriger Phase verbessert werden, wenn das für die enzymatische Behandlung angewandte Enzym eine SPS-ase-Zubereitung der oben angegebenen Art ist, siehe z* 3, Food» Pharmaceutical and Sioengineering» Nr. 172, Bd. 74* S. 93 - 94« Auch die wäßrige Extraktion von z» B* Sojaöl, Rapsöl und Sonnenblumenöl kann auf ähnliche Weise verbessert werden.
A 3· Extraktion von ätherischen ölen aus pflanzlichen Materialien
Wenn pflanzliche Materialien, die ätherische Öle enthalten, mit einer wäßrigen Lösung einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden» die im wesentlichen frei ist von Enzymaktivität f die imstande ist, die ätherischen öle abzubauen oder auf andere Weise zu verändern, werden die ätherischen öle in hohen Ausbeuten zu sehr geringen Kosten extrahiert»
A 4» Extraktion von natürlichen Farbstoffen aus pflanzlichem Material
yVenn pflanzliche Materialien, enthaltend Farbstoffe z« B. rote Rüben, die den roten Farbstoff Betanin enthalten oder der Farbstoff in Preiselbeeren mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werderi., die im wesentlichen frei ist von Enzymaktivitäten, die imstande sind, die Farbstoffe abzubauen oder auf andere Weise zu verändern, werden die Farbstoffe in hohen Ausbeuten zu niedrigen Kosten gewonnen.
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A 5* Extraktion von Gummi aus dem Guayul-Susch
Ein anderes Beispiel für ein Substrat für eine SPS-ase-Zubereitung, die im wesentlichen frei ist von Enzymaktivitäten, die imstande ist, Rohgummi abzubauen, ist das Zellwandmaterial von Wurzeln und Zweigen des Guayul-Busches.
Ba 1* Herstellung eines Milchaustauscnstoffes für Haustiere, vorzugsweise Austauschstoffe für Kälbermilch
Durch vollständige Verflüssigung von Sojabohnen, Sonnenblumensamen,, Baumwollsaraen, Fababohnen oder Felderbsen kann ein Kälberrailch-Austauschstoff hergestellt werden, der in kaltem Wasser bei einem pH-l/Vert von etwa 4,5 löslich ist. Bei Verwendung von stärkehaltigen Rohmaterialien wie Fababohnen oder Felderbsen muß eine Stärkeverflüssigung mit Hilfe einer <X -Amylase vor, nach oder gleichzeitig mit einer Behandlung mit einer SPS-ase durchgeführt werden» die schließlich die Nichtstärke-Polysaccharide in dem Strukturmaterial der Zellwände verflüssigt. Ein detailliertes Beispiel unter Verwendung von Fababohnen ist unten angegeben* und bezüglich der Sojabohnen wird auf Tabelle I verwiesen» Die Vorbehandlung der Sojabohnen kann vorzugsweise ein Dampfstrahlkochen sein, das das Löslichmachen des Rückstandes verbessert*
Beispiel Ba 1*1
15 kg Fababohnenmehl wurden in 35 1 Wasser suspendiert. 75 g Termamyl 60 L und 18 g CaClp wurden zugegeben. Die Suspension wurde unter Rühren in einem Dampfmantelkessel auf 95 0C
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erwärmt* Oie Suspension wurde dann 60 min bei dieser Temperatur behandelt* Anschließend wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt und das Produkt auf 50 0C gekühlt, 300 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 wurden in 1 1 Wasser gelöst und zugegeben» Die Reaktion wurde 440 min lang durchgeführt. Wenn 10 g Fungamyl 300 L mit zugesetzt wurden, wurde die Stärkefraktion im wesentlichen in Disaccharid (Maltose) umgewandelt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 2 min bei 90 C pasteurisiert* Ein Anteil des Produktes wurde dann gefriergetrocknet und für Stabilitätsuntersuchungen verwendet. Die Probe wurde dann in einer Menge von 10 % Feststoff (Trockensubstanz) gelöst und die Lösung des Produktes blieb tagelang ohne Sedimentation stabil»
Geschmolzenes Fett oder öl kann leicht in dem Produkt emulgiert werden, wobei ein Endprodukt erhalten werden kann, das Kuhmilch sehr ähnlich ist» Eine Emulsion, enthaltend 3*5 g öl (Sojabohnenöl) konnte auch tagelang ohne Sedimentation stabil gehalten werden,
Beispiel 8a 1,2
Sojamehl (Sojamel 13) wurde 25 s» wie in Beispiel 3 beschriebens bei 150 0C mit einem Dampfstrahl behandelt» Das so behandelt© Sojamehl wurde sprühgetrocknet und für weitere Untersuchungen» wie im Folgenden beschrieben» angewandt.
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50 g des mit Wasserdampf behandelten Sojamehls wurden mit 450 g Wasser vermischt und der pH-Wert mit 4,1 ml 6n HCl auf 4,5 eingestellt» Das Gemisch wurde dann im Wasserbad auf 45 0C erwärmt und 0,250 g der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 zu dem erwärmten Gemisch zugegeben» das dann 5 h unter Rühren reagierte. Anschließend wurde das Gemisch 2 min auf 80 0C erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren· Eine 100 ml Probe wurde bei Raumtemperatur 15 min mit 3000 χ g zentrifugiert« Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem Ionenaustauscher behandelt und auch die Kohlenhydratzusammensetzung durch HPLC analysiert* Die überstehende Flüssigkeit wurde auch auf den Stickstoffgehalt nach Kjeldahl analysiert und der Feststoffgehalt und der Stickstofflöslichkeitsindex (NSI) und der Feststof flöslichkeitsindex (DSI) berechnet,. siehe Ergebnisse in Tabelle Ba I» 100 ml des Reaktionsgemisches * das auf 20 C gekühlt worden war, wurden in ein kalibriertes 100 ml Glas gegeben und 2 Tage bei 4 C gehalten» Die Dispersionsstabilität (%) wurde gemessen durch Ablesen des Volumens der erhaltenen Dispersionen (Tabelle Ba II) nach 1 und 2 Tagen♦
Zu 200 ml des Reaktionsgemisches (bei 20 0C) wurden 8 g Sojabohnenöl gegeben* Es wurde eine Emulsion hergestellt durch 2 min langes Vermischen in einem Waring Blender. Die Emulsionsstabilität (%) wurde» wie oben, nach 1 und 2 Tagen gemessen*
Es wurde eine Reaktion wie oben durchgeführt, in diesem Falle wurden jedoch 1,00 g der SPS-ase-Zubersitung angewandt*
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Es wurden die gleichen Arten von Analysen und Stabilitätsmessungen, wie in Absatz A beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabellen Ba I und 3a II angegeben«
Aus der chemischen Analyse der überstehenden Flüssigkeiten geht hervor» daß die Werte für NSI (%) und DSI (%) bei dem Versuch B hoher sind als bei dem Versuch A. Die Stabilitätstests» die an den Reaktionsgemischen durchgeführt wurden, zeigen jedoch einen besseren Wert für die Proben A* Dies liegt möglicherweise an der größeren Länge der Peptidkette der Proteine in dem Reaktionsgemisch bei geringerer Enzymmenge»
Aus der durch HPLC gemessenen Kohlenhydratzusammensetzung geht hervor, daß hauptsächlich Mono- und Disaccharide gebildet worden sind· So sind Oligosaccharide, von denen bekannt ist, daß sie für Diarrhöe und Flatulenz verantwortlich sind» wenn sie Kälbern in zu großen Mengen verabreicht werden, nur in geringen Mengen vorhanden.
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Tabelle Ba I
Chemische Eigenschaften der überstehenden Flüssigkeit
Ver-
XX
Verhältnis NSI, %Λ DSI, %ΛΛ HPLC-Ergebnisse (Zusamvon Enzym- (bei pH (bei pH raensetzung der neutralen
menge zu = 4,5) = 4,5) Zucker)
Substrat
%(Gew./Gew.)
A E/S = O ,5 % 39 ,9 62,4 DP1 + DP2 : 79,7 "A
DP3 7,4 %
DP4 12,2 %
DP 4+ 8,1 O/ Λ)
B E/S = 2 ,0 % 57 ,0 67,1 DP1 + DP2 j * 84,4 %
°P3 : 6,1 %
DP4 : 3,7 Of /Q
DP4+ : 5,7 %
NSI - Stickstofflöslichkeits-Index DSI = Feststofflöslichkeits-Index
Tabelle Ba II Stabilitäts-Test der Reaktionsmischungen
Ver- Verhältnis suche
Stabilitätstest
ohne öl
Mit 0Γ
menge zu Dispersion Dispersion Emulsion Emulsion Substrat 1. Tag 2. Tag 1, Tag 2, Tag» %(Gew./Gew.)
A E/S=0,5 % 80 % 63 % 100 % 87 %
B E/S=2,O % 66 % 35 % 85 % 71 %
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Ba 2. Herstellung von verzuckerto Stärke enthaltenden Rohmaterialien
Im Zusammenhang mit der Verzuckerung von Cassava und süßen Kartoffeln und anderen stärkehaltigen pflanzlichen Materialien führt die Zugabe einer SPS-ase-Zubereitung zur Lösung von Viskositätsproblemen. Bei Verwendung einer SPS-ase-Zubereitung ist es möglich, Stärkesuspensionen mit einem Feststoff gehalt von 25 bis 30 % herzustellen, und nach der Verzuckerung kann die Maische fermentiert werden, wodurch ein billiges Ethanol erhalten werden kann*
Beispiel Ba 2«!
Auf der Basis von frischen und gerösteten süßen Kartoffeln (japanischen) wurde eine Maische mit einem Feststoffgehalt von 24 % hergestellt* Der Stärkegehalt der süßen Kartoffeln betrug ungefähr 70 % des Feststoffgehaltes. Eine Vorverflüssigung mit Hilfe der bakteriellen Aroylase von Termamyl ^ 60 L in einer Dosis von 0,5 kg/t Stärke wurde durchgeführt durch Erhitzen der Maische auf 90 C» Die Maische wurde dann 30 min bei 90 0C gehalten. Die Viskosität y\ . des Reaktionsgemisches wurde dann mit Hilfe einer Haake-Spindel bei 90 0C gemessen*
Anschließend wurde das Reaktionsgeraiseh auf 55 0C gekühlt und der pH-Wert mit 2n H2SO. auf .5,0 eingestellt» Dann wurde eine Verzuckerung eingeleitet durch Zugabe der Glucoaraylase SAN 150 (Handelsname) in einer Dosis von 1,75 l/t Stärke» Das Verzuckerungsgemisch wurde dann in drei Teile A, B
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und C aufgeteilt, die 15 rain, wie unten angegeben, mit Enzym behandelt wurden, bevor die Viskosität gemessen wurde.
A: Dieser Teil diente zum Vergleich. Die Viskosität η 2 wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III.
B: Die Tricoderma viride-Cellulase von Celluclast ^^^200 N wurde in einer Dosis von 1 kg/t Feststoffe von süßen Kartoffeln zugegeben» Die Viskosität ^_ wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III.
G: Die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 wurde in einer Menge von 0,25 kg/t Feststoffe der süßen Kartoffeln zugegeben. Die Viskosität ^ wurde gemessen, siehe Tabelle Ba III.
Reaktionsgemisch Viskosität Viskosität
bei 90 0C bei 55 0C
vorverflüssigte h 1 = 770 mPa.s Ί ? = 2i9° mPa.s süße Kartoffeln
A - *l 2 = 2190 mPa.s
B - ^ 3 = 1970 mPa*s
η 4 = 950 mPa«s
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die Viskosität des Reaktionsgemisches wesentlich verringert werden kann durch die SPS-ase in einer geringen Menge, verglichen mit dem
Celluclast KrJ und SAN 150.
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- 81 Ba 3. Gesamtverflüssigunq von Birnen und anderen Früchten
Wenn ganze Birnen, die mechanisch zerstoßen worden anschließend mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, findet eine vollständige Verflüssigung statt und nach Entfernung von kleineren Mengen Feststoffen wird ein klarer Birnensaft erhalten. Ein ähnliches Verfahren kann auf andere ähnliche Früchte, z, B. Äpfel, angewandt werden*
Beispiel Ba 3»!
Frische Äpfel wurden mit Hilfe einer Bucher—Zentralmühle grob gemahlen. Die Apfelmaische wurde dann in einem Kessel mit Heizmantel 5 min bei 90 0C pasteurisiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt» Die verraaischten Äpfel wurden dann auf einer Fryma-Mühle mit Korundstein gemahlen* bis die Maische glatt war· Die Maische wurde dann erneut 10 min bei 80 0C pasteurisiert und auf 50 °C gekühlt»
Oetzt wurden Enzymreaktionen 30 min bei 50 0C mit einem Con traves-Rheomat 15 durchgeführt, wobei Rühren und Viskositätsmessungen (im Zusammenhang mit einer prozentualen Ablesung auf dem Rheometer bei Geschwindigkeit 13) gleichzeitig durchgeführt wurden. Nach vollständiger Enzym-Reaktion wurden 100 g Proben abgezogen und in einem kalibrierten Rohr 15 min bei 3000 χ g zentrifugiert# Hierbei wurde der Prozentsatz an Saft und der Prozentsatz an Abscheidungen bzw. Feststoffen gemessen. Der pH-Wert und der Prosentsatz an Refraktometer-Feststoffen als °Brix wurden ebenfalls gemessen* Tabelle Ba IV zeigt einen Vergleich zwischen der
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Wirkung.von SPS-ase, der Kombination von Celiuclast und SPS-ase und der Kombination von Celluclast und Pectinex» Die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 wurde angewandt,
Tabelle Ba IV Ergebnisse der Gesamt-Verflüssigungsversuche
mit Apfel-Maische bei 50 0C, 30 min
SPS- ase- CelluclastCf)Pectinex C 200 1 3x g/hl 0 9 End- ViS- Zentrifugation 41 Saf t
g/hi Maische g/hl Maische 0 kosi- tät % Saft % Fest stoffe 19 pH ° 3rix
O 0 0 100 59 21 3,8 9,7
25 0 0 19 81 17 3,5 10,5
50 0 15 79 17 3,5 10,7
50 50 200 4.8 83 17 3,5 10,8
2000 3.8 83 18 3,1 12,5
0 50 9.5 83 3,2 12,9
0 50 4.σ 82 3,1 13,2
Ba 4. Herstellung von Saft durch Behandlung von Früchten und Gemüsen
Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen gut geeignet sind zur Herstellung von Saft durch Behandlung von verschiedenen Früchten* Beeren und Gemüsen, z. 8, Karotten, Erbsen, Tomaten» Äpfeln, Birnen, Schwarze Johannisbeeren, Bohnen und Kohl. Hierbei wird eine bessere Ausbeute an Saft sowie eine bessere Extraktion von Färb- und Geschraacksstoffen erreicht» verglichen mit der handelsüblichen Pectinase- und
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Cellulase-Zubereitunge Beispiel Sa 4*1
Es wird auf Beispiel 3a 3«1 verwiesen, bei dem die SPS-ase-Zubereitung verglichen worden ist mit den im Handel erhältlichen üblichen Cellulase- und Pectinaseprodukten Celluclast ^ 200 L und Pectinex ^ 3x* Aus der Tabelle geht hervor, daß die Ausbeute an Saft leicht verbessert werden kann, wenn sowenig wie 50 g/hl SPS-ase verwendet werden, verglichen mit 2000 g/hl Pectinex ^ , beide zusammen mit 50 g/hl Celluclast ^ . Auch war die Viskosität etwas geringer. So scheint es, daß die SPS-ase ungefähr 40 mal wirksamer ist als Pectinex»
Ba 5» Behandlung im Zusammenhang mit der Extraktion oder dem Pressen von Zuckerrohr oder Zuckerrüben.
Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, die Ausbeute im Zusammenhang mit einfachen Extraktionsverfahren zu verbessern, wenn die SPS-ase-Zubereitung angewandt wird zur Behandlung von Zuckerrohr oder Zuckerrüben vor und/oder während aer Extraktion oder dem Pressen. Auch kann der Rückstand (Bagasse) mit der SPS-ase-Zubereitung behandelt werden, wodurch er teilweise in fermentierbare Zucker umgewandelt wird» die als Ausgangsraaterial zur Ethanolfermentation verwendet werden können.
63 376 12 - 34 Beispiel Ba 5*1
10 kg Rückstand von Zuckerrüben (Pulpe), der erhalten worden war durch kontinuierliche Gegenstromextraktion in einem DDS-Diffuser bei Nakskov Sugar Factory, wurden zweimal in einer Fryma-Mühle (Typ MZ-IlO) vermählen» Während des Mahlvorganges wurde Prozeßwasser zugegeben,
300 g Anteile der Pulpe wurden jetzt 18 h bei 45 0C mit Enzym behandelt unter Verwendung der in Tabelle Ba V angegebenen Mengen, Das trockene Enzymprodukt (KRF 68) wurde zu der Pulpe zugegeben, die während der ersten Stunde mit einem Stab gerührt wurde. Daraufhin war die Pulpe so weit verflüssigt, daß die restliche Zeit erfolgreich magnetisch gerührt werden konnte. Am Ende der Reaktion wurde der pH-Wert gemessen (während des Beginns der Reaktion wurde keine pH-Korrektur vorgenommen) und das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, bis eine klare überstehende Flüssigkeit erhalten wurde· Die Bestimmung des Feststoffgehalts wurde an Reaktionsgemischen und an den überstehenden Flüssigkeiten vorgenommen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde der Prozentsatz an gelösten Feststoffen berechnet, Korrekturen für den Gehalt an löslichen Feststoffen des Enzymproduktes wurden bei allen Berechnungen vorgenommen.
Die überstehenden Flüssigkeiten 2, 3 und 4 wurden durch Ionenaustauscher behandelt und durch HPCL auf die Kohlenhydratzusammensetzung untersucht.
63 376 12
Tabelle Ba V Ergebnisse bei der enzymatischen Verflüssigung von Rüben-Pulpe
Ver- Verhältsuch nis dar Nr, Enzymmenge zu Feststoffen E/S %
End-Messungen
Reaktionsmischung
überstehende Flüssigkeit
pH
(Endwert)
% Feststoffe
% Feststoffe
gelöste Feststoffe
α' /ο
1 O 5,5 4,18 0,0 0,0
2 0,35 3,6 3,85 2,58 66,9
3 0,56 3,5 3,81 2,56 66,2
4 1,02 3,5 3,86 2,73 70,4
5 1,58 3,3 3,17 2,34 73,4
6 3,10 3,4 3,23 2,49 76,4
7 7,52 3,4 2,66 2,18 80,5
Reaktionsbedingungen:
H = 300 g
S = 4,18 % Feststoffe
E/S wie oben angegeben
pH nicht eingestellt
T = 45 0C
t =
63 376 12
Tabelle Ba VI HPLC-Werte
Versuch Nr. 2 3 43,6 31,9 4
Zucker-Art % neutrale Zucker 4,6 4,8
(Neutral) 20,4 23,7 25,3
5,0 5,9 -
Hochmolekular (DP4+) 26,4 32,2 27,8
Disaccharide nicht gemessen • 7,3
Glucose 33,2
Galactose
Fructose/Arabinose
Galacturonsäure
Alle entsprechend der obigen Tabelle Va VI entstandenen Zukker konten zu Alkohol fermentiert oder für andere Zwecke verwendet werden.
Sa 6. Herstellung von Sojamilch
Sojamilch kann leicht durch vollständige Verflüssigung von gemahlenen Sojabohnen und anschließende Homogenisierung des erhaltenen Gemisches hergestellt werden. Sojamilch wird häufig hergestellt durch Einweichen von Sojabohnen in siedendes Wasser, Mahlen der eingeweichten 3ohnen und Extraktion mit Wasser und anschließende Trennung des unlöslichen Rückstandes, ζ* B, von Proteinen und Polysacchariden. Um die Ausbeute an Sojamilch zu verbessern, können diese unlöslichen Rückstände
63 376 12
durch Umsetzung mit der SPS-ase verflüssigt werden* Beispiel Ba 6,1
Das Sojamilchverfahren wird durch die folgende Reihe von Enzymreaktionen erläutert, wobei Berechnungen des Protein-Löslichkeitsindex (PSI, %) und des Feststoff-Löslichkeitsindex (DSI, %), die nach Abtrennung bei pH 7 erhaltenen Ausbeuten zeigen (siehe Tabelle Ba VII). Die Enzymreaktionen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Substrat:
Vollfettes Sojamehl
(Dansk Sojakagefabrik A/S)
Menge des Reaktionsgemisches: 220 g
Menge des Substrats: 20 g
Temperatur: 50 0C
pH: 4,5 (6n HCl)
Reaktionszeit: Reihe AIh
Reaktionszeit: Reihe B 0,5 -6h
Enzym: SPS-ase (KRF 68)
Enzymmenge: Reihe A: E/S-Verhältnis
(Gew./Gew.) O - 8,0 Reihe B: E/S-Verhältnis (Gew./Gew.) 1,0
Nach der Reaktion wurde der pH-Wert mit Hilfe von 4 η NaOH auf 7 eingestellt und die Trennung durch 15 min langes Zentrifugieren bei 3000 χ g durchgeführt*
63 376 12 - 88 -
8a 7. Behandlung zur Erhöhung der zurückgewinnbaren Menge an löslichen Kaffeebestandteilen
Es hat sich gezeigt, daß die Behandlung von Kaffeebohnen bei unterschiedlichen Stufen während der Herstellung von Instantkaffee zu einer erhöhten Ausbeute an löslichen Kaffeebestandteilen führt. So können z, B, verbrauchte Kaffeerückstände (Kaffeesatz) oder grüne Bohnen enzymatisch mit günstigen Ergebnissen behandelt werden»
Tabelle Ba VII
Reihen
Berechnung der Mengen-Bilanz im Zusammenhang mit dem enzymatischen Sojamilch-Verfahren
Reak- Enzym tions- menge
Reaktionsmischung
überstehende Flüssigk» Löslichkeits-Indices
zeit h E/S % % Protein % Fest stoffe % Protein % Fest stoffe PSI % DSI % CU
1,0 O 3,65 8,70 1,87 5,72 49,6 63,7 KQ •
I1O 0,5 3,68 8,74 2,41 6,28 63,7 70,0 I
A 1,0 1,0 3,71 8,78 2,48 6,43 65,1 71,4
1,0 2,0 3,78 8,86 2,98 7,18 77,5 79,5
1,0 4,0 3,92 9,03 3,36 7,69 84,6 83,9
1,0 8,0 4,19 9,37 3,76 8,08 88,5 85,0 cn
0,5 1,0 3,64 8,78 2,39 6,41 64,0 71,1 W C/l
1,0 1,0 3,64 8,78 2,56 6,60 68,7 73,4 Nj cn
B 2,0 1,0 3,63 8,78 2,79, 6,91 75,2 77,1 to
4,0 1,0 3,63 8,78 3,1O1 7,29 84,0 81,7
6,ο 1,0 3,63 8,78 3,39 7,69 92,3 86,5
I
63 376 12
Bb 1. Verhinderung und/oder Abbau des "Schleiers" in Apfeloder Birnensaft
Nach der Herstellung von Apfelsaft oder Birnensaft und anderen Fruchtsäften, die klar sein sollen und die vorher mit üblichen Pectinase- und Cellulasezubereitungen behandelt worden sind» um die Bildung einer Trübung zu vermeiden, können "Schleier" auftreten. Es hat sich gezeigt, daß die SPS-ase-Zubereitungen gut geeignet sind zum Abbau derartiger Schleier* die hauptsächlich aus Araban, das an Proteine gebunden ist, bestehen.
Beispiel Bb 1
Birnensaftkonzentrat, das hergestellt worden war durch enzymatische Verflüssigung von Rückständen von der Herstellung von Birnenkonserven unter Verwendung von Celluclast ^ und Pectinex ^, wurden beim Stehen wolkig» Der "Schleier" wurde isoliert und mit 0,01 η H-SO^ 24 h hydrolysiert und durch HPLC analysiert. Das Chromatogramm zeigte Arabinose und kleine Mengen an Oligosacchariden.
Durch Inkubation von 0,5 % (Gew.-/VoL) dieses Kohlenhydrats in 1 mMol Acetatpuffer, 3 h bei pH 4,5 und 40 0C mit SPS-ase (KRF 68 und KRF 92 1 : 1) mit einer Enzyrakonzentration von 0,05 % (Gew./Vol.) zeigte es sich, daß 84 % der ursprünglichen schleierbildenden Kohlenhydrate (Feststoffe) in Arabinose umgewandelt wurden.
Auch ein verdünntes Birnenkonzentrat (20° Brix) wurde 2 h
63 376 12
bei 40 0C mit einer Enzymmenge von 0,15 % (Gevv./Vol«) der oben erwähnten SPS-ase oder mit 1 % (Gew./Vol.) eines Handelsproduktes» das als Clarex ^ bezeichnet wird, behandelt. Es zeigte sich, daß die SPS-ase imstande war, den relativen HPLC-Spitzenbereich eines arabanartigen Schleiers um 86 % zu verringern, während die entsprechende Verringerung mit Clarex ^(in einer wesentlich höheren Menge als die SPS-ase-Zubereitung) nur 78 % betrug,
Bb 2. Anwendung als Klärmittel für Weißwein
Es hat sich gezeigt, daß Weißweine» die eine„sehr unerwünschte Trübung zeigen, wirksam mit Hilfe von SPS-ase geklärt werden können. Es hat sich gezeigt, daß das Trübung bildende Material hauptsächlich aus Arabinogalactanen besteht» die an Hydroxyprolinreste in einem Zellwand-Strukturprotein gebunden sind»
Bb 3. Herstellung von ISSPH oder anderen pflanzlichen Proteinhydrolysaten
Vor der Abtrennung des ISSPH (isoelektrisch löslichen Sojaproteinhydrolysats) oder anderer pflanzlicher Proteinhydrolysate aus der Aufschlämmung, wie in der US-PS 4 100 024 oder in Process Biochemistry, 8d, 14, Nr. 7 (1979), S. 6 - 8 und 10 - 11 beschrieben, kann das Reaktionsgemisch mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt werden. Hierdurch wird eine leichtere Trennung erzielt.
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Bb 4, Maische-Enzym für die Brauereiindustrie
Bei der Herstellung von Bier beeinflussen Kohlenhydrate der Ausgangsraaterialien z, B. der S-Glucane Malz und Gerste die Viskosität und Filtrierbarkeit des Extrakts» Die Zugabe von SPS-ase während des Maischens verringert die Viskosität des Extrakts und verbessert die Filtrierbarkeit und die Ausbeute an Extrakt» Darüber hinaus führt die Zugabe von SPS-ase während des Maischvorganges zu einer Verbesserung der Fermentierbarkeit des Extrakts und des Stickstoffgehalts in dem Extrakt»
Beispiel Bb 4»!
Im Labor wurden 50 g gemahlene Körner» bestehend aus 50 % Malz und 50 % Gerste mit 275 g Wasser (15 % Feststoffgehalt) nach dem folgenden Maischdiagramm vermaischt: 52 C (60 min) /63 0C (60 min)/76 0C (30 min)»
Um die Wirkung der SPS-ase zu zeigen, wurden vier Versuche durchgeführt» siehe die im folgenden angegebene Tabelle, wobei die Enzyme während des Maischvorgangs zugegeben wurden (pH der Maische 5#5 bis 6tO)»
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Enzym
keines Cereflo
SPS-ase (KRF 68)
Aktivität der B- Glucanase/g 0 200 BGU 1630 FBG 1630 FBG
Menge an Enzym per kg Körner 0 1*5 g 0,05 g 0*18 g
Gesamtmenge der Enzym-Aktivitätseinheiten 0 per kg Körner
300 BGU
80 FBG 300 FBG
Filtrationsgeschwindigkeit 120 ml 135 ml des Extrakts nach 10 min
160 ml 170 ml
Viskosität des 1,52 Extrakts 10 Balling (25 °C)
mPa.s
1*36 snPa.s 1,36 mPa.s 1,30
mPa.s
3GU = ß-Glucanase-Einheiten, bestimmt nach der analytischen Methode AF 70/4-GB,. erhältlich von NOVQ Industri A/S.
FBG = Pilz-ß-Glucanase-Einheiten, bestimmt nach der analytischen Methode AF 70.1/2-GB4 erhältlich von NOVO Industri A/S,
Einziger Unterschied zwischen BGU und FBG ist der pH-Wert, bei dem die Enzymbestimmung durchgeführt wurde: pH 7,5 für BGU und pH 5,0 für FBG,
63 376 12
Cereflo ist eine bakterielle ß-Glucanasezubereitung, wie sie beschrieben ist in dem Informationsblatt B 214b-GS 1500 Juli 1931, erhältlich von NOVO Industri A/S,
Beispiel Sb 4.2
Im Labor wurden 50 g gemahlene Körner, bestehend aus 40 % Malz und 60 % Gerste mit 150 g Wasser (25 % Feststoffgehalt) entsprechend dem folgenden Schema vermaischt: 45 C (60 min) /63 0C (90 mxn)/75 0C (15 min).
Um die Wirkung der SPS-ase nachzuweisen, wurden drei Versuche durchgeführt» siehe die im folgenden angegebene Tabelle» wobei die Enzyme während des Vermaischens zugegeben wurden (pH-Wert der Maische 5,5 bis 6,0),
Enzym
keines
SPS-ase (KRF 68) + Ceremix wie im vor-
rprom·?ν hergehenden Versuch
Leremxx zugegeben
Aktivität der ß-Glucanase/g
Enzymmenge per kg Körner
Gesamtmenge de-r Enzym-Aktivitäts-Einheiten per kg Körner
Filtrationsgeschwindigkeit des Extrakts nach 30 min
Extrakt* °Balling
Viskosität des Extrakts 10° Balling (25 0C)
48 ml
200 BGU
1,65 g 330 BGU 98 ml
18 «6 19,0
1 ,72 1,37
mi mPa.s
1630 FBG 0,033 g
50 FBG
111 ml
19,5 1,27
63 376 12 - 95 -
Die Definition von BGU und FBG ist wie in Beispiel Sb 4» 1 angegeben. In der letzten Spalte der obigen Tabelle ist nur die Menge und Aktivität von SPS-ase angegeben.
Ceremix ist eine bakterielle S-Glucanasezubereitung,, wie sie beschrieben ist in dem Informationsblatt B 216 b-GB 1000 Feb. 1982 erhältlich von NOVO Industri A/S.
Bb 5. Enzymatischer Zusatz zur Anwendung während der Bierfermentation und/oder Lagerung,
SPS-ase kann während der Fermentation von Extrakt oder während der Lagerung von Bier zugesetzt werden, um den Gehalt an ß-Glucanen zu verringern und dadurch die Filtrierbarkeit und Stabilität gegenüber einer Schleierbildung von Bier zu verbessern. SPS-ase zeigt auch eine Wirkung auf Proteine, die für die beim Kühlen auftretende Trübung verantwortlich sind*
8b 6. Mittel zur leichteren Entfernung von Mandelhäutchen
Während der mechanischen Entfernung von Mandelhäutchen nach dem Blanchieren von Mandelnf wird ein bestimmter Anteil von Mandelhäutchen nicht entfernt. Es hat sich gezeigt, daß eine Enzymbehandlung der Mandeln zu einer Verringerung des erwähnten Prozentsatzes führt*
Bc 1* Zersetzung unterschiedlicher Abfallprodukte
Im Zusammenhang mit bestimmten Herstellungsverfahren werden
63 376 12 - 96 -
große Mengen kohlenhydrathaltiger Abfallprodukte gebildet, Z. B. ist dies der Fall im Zusammenhang mit der Herstellung von Sojaisolat durch Wasserextraktion und Säureausfällung, Sojamilch und Sojaquark (einer speziellen Art von japanischem Käse)♦ Auch in diesem Zusammenhang kann Abfallpulpe aus z, B, Äpfeln,, Birnen oder Zitrusfrüchten erwähnt werden. Es hat sich gezeigt» daß eine SPS-asa-Zubereitung imstande ist, diese kohlenhydrathaltigen Abfallprodukte vollständig zu verflüssigen und fermentierbare Zucker zu bilden» die als Ausgangsmaterial zur Ethanolfermentation verwendet werden können,
Beispiel Bc 1*1
Bei der üblichen Herstellung von Sojamilch oder Sojaquark werden Sojabohnen häufig in siedendem Wasser eingeweicht, gemahlen und mit heißem Wasser extrahiert, woraufhin eine Trennung durchgeführt wird. Der Rückstand von dieser Trennung ist das Material, das für diesen Versuch angewandt wird. Die flüssige Phase ist die Sojamilch, die weiter zur Herstellung von Sojaquark angewandt werden kann»
IO kg ganze Sojabohnen wurden gleichzeitig mit 70 1 siedendem Wasser in einer Fryma-Mühle Typ ΜΣ 110 vermählen. Die gemahlene Aufschlämmung wurde dann 15 min oberhalb 85 0C gehalten» um die natürlichen Bohnenenzyme zu inaktivieren, die den bekannten Sojabohnenbeigeschmack erzeugen. 5 1 dieser Sojabohnenaufschlämmung wurden dann im Labor 15 min mit 3000 χ g zentrifugiert. Die Analyse zeigte, daß der Rückstand 20,45 % bzw, 20,06 % Feststoffe (Doppelbestimmungen, berechnetes Mittel 20,26 %) enthielt. Es wurde langsam 6n HCl zugegeben und mit einem Spatel in den Rückstand eingearbeitet, bis ein pH-Meter 4,50 zeigte, wenn die Elektrode
63 376 12 - 97 direkt in die Masse eingetaucht wurde,
In einem 500-ml-Becher Giss wurden bei 50 0C Enzymreaktionen an 2 χ 200 g der Masse mit zwei verschiedenen Mengen an SPS-ase (KRF 68) durchgeführt, nämlich E/S =0,5 %t bezogen auf die Feststoffe und E/S = 3 t0 %s bezogen auf die Feststoffe. Das trockene Enzym wurde zu der Nasse zugegeben. Während der ersten 1 bis 2 h wurde mit einem Spatel gerührt, und anschließend war die Menge soweit verflüssigt, daß mit einem Magnetrührer erfolgreich gerührt werden konnte» Die Gesamtreaktionszeit betrug 21 h. Während der ReaktxorLJ/vurde. die Osmolalität mit einem Osmometer gemessen. Die Ergebnisse in Tabelle Bc Izeigen den Verlauf der Reaktion.
Am Ende des Versuchs wurde das Gemisch 15 min bei 3000 χ g zentrifugiert. An der Oberfläche der überstehenden Flüssigkeit trat eine ölschicht auf* deren Volumen bestimmt wurde. Als Bodenschicht trat eine lockere Schlammschicht auf. Die überstehende Flüssigkeit einschließlich des DIs wurde mit einer Pipette entfernt» Das Öl würde mit der klaren wäßrigen Phase durch Homogenisieren zusaramengegeben und eine Probe zur Bestimmung des Feststoffgehaits abgezogen. Die in Tabelle Bc I angegebenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß dieses Abfallprodukt durch enzymatische Reaktion verflüssigt werden kann und daß rohes öl, wie in Abschnitt A 4 angegeben, erhalten werden kann. Mach Gewinnung des Öls kann der gelöste Rückstand auf verschiedene Weise verwendet werden, z. 8, zur Fermentation zu wertvollen Verbindungen oder zum Einengen und Trocknen und anschließende Verwendung als Futtermittel oder Nahrungsmittelprodukt oder nach weiterer Reinigung zur Herstellung wertvoller Produkte.
63 376 12
- SS -
Tabelle 3c I Bei der Verflüssigung von Sojamilch und Sojaquark erhaltene Ergebnisse
Reaktionsbedingungen und Ergebnisse
Versuch A
Versuch B
Menge des Rückstands t " min 200 g g C t min 200 g ) Δ Os mola lität mOsm 8 - 10 %
Menge an SPS-ase (KRF-68) 0 0,20 O 1,20 c O 93,5 %
Temperatur IO 50 ° 10 50 0C 86
pH 40 95 4,50 Λ Os mola lität mOsm 25 45 95 4,50 215 319
Reaktionszeit 250 21 h O 250 21 h 436
Ergebnisse geraessen mit dem Osmometer während der Reaktion 1260 Osmo lali tät mOsm 26 1260 Osmo lali tät mOsm 593
287 104 214 282 863
313 347 368
•^ Osmolalität ist d* korrigierte Wert für die Osmolalität der Mischung bei t = 0 391 501 620 497 601 718
634 % 875
t = ο 907 1145
Reaktionsmischung Feststoffe 20,3 % 20,7 %
überstehende Flüssig Q/
keit: Feststoffe 18,0 % 19,4 %
Oberstehende Flüssig keit: ölgehalt 8-10
Berechnung % Lösliche Feststoffe 88,6
53 376 12 - 99 Sc 2. Verzuckerung und gleichzeitige Fermentation
Kohlenhydrathaltige Pflanzenmaterialien, z. B, Knollen, wie Oerusalem-Artischocken, Kartoffeln, süße Kartoffeln» Cassawa oder Pulpe von solchen Knollen, d. h, das nach Entfernung der extrahierten Komponenten verbleibende Material können durch Behandlung mit einer SPS-ase-Zubereitung verzuckert und gleichzeitig die erhaltenen fermentierbaren Saccharide zu Ethanol fermentiert werden.
Beispiel Bc 2,1
Die Herstellung von Ethanol durch Fermentation der abgebauten inulinhaltigen Derusalem-Artischocken wurde im Labormaßstab durch gleichzeitige Verzuckerung mit SPS-ase und Inulinase und bei vier unterschiedlichen Vorbehandlungen der Oerusalem-Artischocken untersucht.
SPS-asej Es wurde die SPS-ase-Zubereitung KRF 68 angewandt.
Inulinase: Die Inulinase wurde gebildet durch Fermentation von Asp. ficuum (CBS 55 565), Die Inulinaseaktivität wurde bestimmt, wie auf S, 99 von Research Disclosure Nr. 21 234 (Dezember 1981) S. 456 - 458 angegeben.
Fermentation im Labor: 150 g Anteile der vorbehandelten Maische (später beschrieben) wurden nach Zugabe von 4,5 g Bäckerhefe und 1 ml einer 4%igen Lösung von Pluronic als Antischaummittel fermentiert» Die Fermentationskolben waren mit COp-Fallen, enthaltend 98 % Schwefelsäure» versehen und
63 376 12 - 100 -
die Fermentation wurde durch Messung des Gewichtsverlustes auf Grund von freigesetztem CO2verfolgt. Der Kolbeninhalt wurde während der bei 30 C durchgeführten Fermentation gerührt« Es wurden für jeden untersuchten Parameter drei Kolben angewandt.
In Tabelle Bc II ist der durch Freisetzung von CO2 auftretende Gewichtsverlust in Ethanol umgerechnet» angenommen daß 1 Hol freigesetztes CO 1 Mol C7H1-QH, d. h. 1 g CO ~
~ g C2H5OH entspricht. Vorbehandlung der Artischocken:
Behandlung A: 14,1 kg Artischocken (22,8 % Feststoffgehalt) wurden 20 min bei 140 0C und 4 bis 5 bar gekocht (Henze). Das Gewicht nach dem Kochen betrug 19,0 kg ( ^ 16,9 % Feststoffgehalt). Die Fermentation wurde direkt an der Maische durchgeführt.
Behandlung B: Gewaschene und in Scheiben geschnittene Artischocken wurden mit Wasser (1:1) vermischt in einem Waring-Mischer. Die Maische wurde dann 1 h bei 85 0C und pH 4,5 behandelt.
Behandlung C: Wie B, jedoch ohne Einstellung des pH-Werts.
Behandlung D: Wie S, aber ohne Wärmebehandlung und ohne pH-Wert-Einsteilung.
63 376 12
Ergebnisse: In Tabelle Bc II zeigen die Ergebnisse die Wirkung des Zusatzes von SPS-ase zu der vorbehandelten Maische auf die Ethanolausbeute, Eine deutliche Verbesserung der cthanolausbeute wurde bei allen vorbehandelten Maischen erzielt, wenn SPS-ase zugesetzt wurde,
Tabelle Bc II
Fermentations-Ergebr.isse im Zusammenhang mit der gleichzeitigen Fermentation und enzymatischen Verzuckerung von Oerusalera-Artischocken
Vorbe hand lung Zugabe von Inulinase zu 1 g Feststoff SPS-ase E/S % Verlust nach 42 Fermenta an CO (g) - 44 Π tion 0/ /O entstandenes Ethanol im Verhältnis zu Feststoffen
A 1*5 1,5 0 0,27 7,65 + 8,07 £ 0,05 0 3,08 31,5 33,2
1.5 0 4*85 +_ 0*03 29 ,7
3 1,5 0,40 5,41 +, 0,03 33,1
1*5 0 5*70 i 0,05 34,8
1,5 0,10 5,97 +_ 0,01 36,5
C 1,5 0,20 6f13 +, 0,06 37,5
1*5 0,30 6,13 ± 0,00 37,5
1*5 0,40 6,18 ζ 0Λ05 37,8
1,5 0 5,77 £ 0,02 35,3
1,5 0 ,10 5,S9 +. O1OO 36,0
1*5 0,20 6,04 ± 0,11 36,9
D 1,5 0,30 6,01 +, 0*01 36,7
1*5 0,40 6,02 ± 0,03 36,8
0 0,40 ' 5*4S ± 0,02 33,5
63 376 12 - 102 Sc 3» Abbau von Cellulose
Es hat sich gezeigt* daß cellulosehaltige Materialien» wie Stroh» ζ* B. Weizenstroh, Sägespäne, Papier und Lignocellulose in einem größeren Ausmaß mit einer SPS-ase-Zubereitung hydrolysiert werden können als mit üblichen Cellulasen. Das wird durch das folgende Beispiel gezeigt, bei dem ein kristallines Cellulosematerial (AVICEL) mit Hilfe einer übliehen Cellulase Celluclast^ 200 erzeugt von Trichoderma reesei sowie der SPS-ase-Zubereitung KRF 68 behandelt, worden ist.
Beispiel 3c 3«!
Avicel wurde in Wasser suspendiert (20 % Feststoffe), der pH-Wert auf 5 eingestellt und die Temperatur auf 50 C gehalten. Nach 24 h langer Reaktion wurde die Aufschlämmung filtriert und der Gehalt an reduzierendem Zucker (mg Glucose/g Avicel) gemessen» Bei Verwendung von Enzymmengen von 5 und 20 % wurden die folgenden Werte für den Cellulosegehalt gefunden:
Tabelle Bc III
E/S % mg Glucose/g AVICEL
Enzym 5 5 80 200
Celluclast SPS-ase 20 20 100 340
Celluclast SPS-ase
63 376 12
Bc 4« Anwendung als Backhilfs
Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen ausgezeichnet geeignet sind als Backhilfen, So ist es» wenn eine SPS-ase-Zubereitung zu dem trockenen Mehl vor der Herstellung eines Teiges zugesetzt wird* möglich, ein Brot mit einer besseren Qualität bezüglich Volumen t Krume und Geschmack zu erhalten« So ist es möglich ein Brot hoher Qualität aus einem Weizenmehl geringer Qualität herzustellen, wenn eine SPS-ase-Zubereitung als Zusatz verwendet wird,
Bc 5« Verbesserung der Ausbeute an Alkohol und an Biomasse
während der Fermentation von.Sulphitlauge von der
Papierherstellung
Es hat sich gezeigt» daß die Ausbeute an Ethanol verbessert werden kann, wenn Sulphitlauge von der Papierherstellung mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt wird, bevor sie als Kohlenhydratquelle zur Fermentation von Ethanol verwendet wird, Sulphitlauge von der Papierherstellung kann auch angewandt werden zur Herstellung von Biomasse* z. B. Einzelzellprotein durch Fermentation und auch in diesem Falle wird die Ausbeute an Biomasse verbessert, wenn die Sulphitlauge vorher mit einer SPS-ase-Zubereitung behandelt worden ist. Auch können der Abbau auf Grund des Vorhandenseins der SPS-ase-Zubereitung sowie die Fermentation gleichzeitig durchgeführt werden.
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Sc 6. Entwässerung von biologischen Schlammprodukten
Während der üblichen Wasserextraktion von vielen biologischen Materialien aus Pflanzenrohmaterialien entstehen große Volumina an unlöslichem Rückstand, bestehend aus großen Mengen gequollener Polysaccharide. Das ist z« B, der Fall* wenn Sojamilch, Sojaquark oder Sojaisolat durch Wasserextraktion von Sojabohnen, entfettetem Sojamehl oder weißen Flocken hergestellt werden. Das strukturell gequollene PoIysaccharidmaterial kann dann in geringem Ausmaß mit SPS-ase behandelt werden, wodurch die Netzstruktur des Materials geöffnet wird und nur geringe Mengen Kohlenhydrate gelöst werden. Dadurch wird das Material entwässert und folglich ein höherer Feststoffgehalt in dem Schlamm erhalten im Vergleich mit einem Produkt, das ohne Enzymbehandlung erhalten wird. So führt das Enzymverfahren zu dem Vorteil eines wesentlich geringeren Energieverbrauchs zur Entfernung von Wasser durch Trocknen und es eröffnet auch die Möglichkeit» ein billigeres trockenes Tierfuttermittel oder massebildendes Mittel für Futterzwecke herzustellen,
3c 7, Silage-Hilfsmittel
Es ist bekannt,, Enzyme als Silage-Hilfsmittel zuzusetzen, um die Geschwindigkeit des Silierungsprozesses und die Fermentation der Silage zu verbessern. Es hat sich gezeigt, daß SPS-ase-Zubereitungen besser sind im Vergleich mit bekannten enzymatischen Silag_e-Hilfen.
63 376 12 - 105 -
Übersicht über die Figuren,, auf die vorher Bezug genommen worden ist.
Fig. bezieht sich auf Nr.
stellt dar
allgemeinen Teil der Beschreibung Bindungswirkung zwischen SPS und Sojaprotein
allgemeinen Teil der Beschreibung Fließschema, das die Herstellung von SPS beschreibt
Abschnitt 2 Eichkurve für HPLC-Gel-Filtrations-Chromatographie
Abschnitt 2 HPLC-Gel-Filtra tions-Ch romatograrnm von SPS
Abschnitt 2 HPLC-Gel-Filtrations-Chroraatogramm von durch SPS-ase abgebautem SPS
Abschnitt 2 und 3
HPLC-Gel-Filt ra tions-Ch romatograram der überstehenden Flüssigkeit von SPS, inkubiert mit Sojaprotein
Abschnitt 2 HPLC-Gel-Filt ra tions-Ch romatogramm der überstehenden Flüssigkeit von abgebautem SPS, inkubiert mit Sojaprotein
63 376 12
Fig,
Nr.
bezieht sich auf
stellt dar
Abschnitt 3
HPLC-Gel-FiI trations-Chroraatogramm von APS1 abgebaut durch Pectolyase
Abschnitt 3
HPL C-G el-FiIt ration s-Ch roniatogramm von APS t abgebaut durch SPS-ase"
Abschnitt 3
HPLC-Gel-Filtrations-Chromatogramm von SPS, behandelt mit Pectolyase
11-
Abschnitt 7
Immunoelektrophoretische Peaks einschließlich einem SPS-ase-Peak, identifiziert durch Öberlagerungstechnik
12 Abschnitt 8 Ionenaustausch-Chromatogramm einer SPS-ase
13 Abschnitt 8 pH-Abhängigkeit der Aktivi tät einer SPS-ase
14 Abschnitt 9 - Teraperaturabhängigkeit der Aktivität einer SPS-ase
15 Abschnitt 9 Temperaturstabilität einer SPS-ase
16 Abschnitt 10 pH-Stabilität von Protease in einer SPS-ase-Zubereitung

Claims (11)

1.. Verfahren sum Abbau von Polysacchariden, vorzugsweise Zellwandpolysacchariden von Pflanzen mit Hilfe einer Garbohydrase, gekennzeichnet dadurch, daß ein 3P3-ase bildender Mikroorganismus, der dadurch auswählbar ist, daß der su untersuchende Mikroorganismus auf einem Fermentationsmedium gesuchtet wird, dessen Hauptkohlenstoffquelle SPS, das gebildet worden ist auf der 3a3is von pflanzlichem Rohp-rotein, vorzugsweise entfettetem Sojamehl, als Ausgangsmaterial, woraufhin eine Probe des Fermentationsmediums auf SPS-ase untersucht wird und der fragliche Mikroorganismus als SPS-ase bildender Mikroorganismus angesehen, wird, wenn die Analyse auf SPS-ase positiv ist, in einem liährmedium gezüchtet wird, wonach die daraus hergestellte 3PS-ase-Zubereitung in einem wäßrigen Medium mit einem Substrat für die SPS-ase-Zubereitung zusammengebracht wird*
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die SPS-ase imstande ist, SoJa-SPS in einem wäßrigen Medium su Abbauprodukten abzubauen, die sich an pflanzliches Protein in dem wäßrigen Medium in geringerem Maße anlagern, als sich das SoJa-SPS vor dem Abbau an das gleiche pflanzliche Protein in dem wäßrigen Medium angelagert hätte.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2j gekennzeichnet dadurch, daß die SPS-ase imstande i3t, SoJa-SPS in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert, der nicht mehr als 1,5 von 4,5 abweicht, zu Abbauprodukten abzubauen, die sich an Sojaprotein in dem wäßrigen Medium in einem geringeren Ausmaß anlagern, als sich das SoJa-SPS vor dem Abbau an das Sojaprotein in dem wäßrigen Medium angelagert hätte.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3y gekennzeichnet dadurch,
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daß die Abbauprodukte von Soja-SPS nach vollständigem Abbau sich an pflanzliches Protein in einem Ausmaß von weniger als 50 %, insbesondere weniger als 20 %, anlagern, als sich das Soja-SPS vor dem Abbau an das pflanzliche Protein in dem wäßrigen Medium angelagert hätte.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4,. gekennzeichnet dadurch, daß die SPS-ase einen positiven SPS-ase-Test ergibt t wenn sie nach dem qualitativen und quantitativen SPS-ase-3estimmungsverfahren untersucht wird.
6» Verfahren nach Punkt 1 bis 5» gekennzeichnet dadurch* daß die SPS-ase gebildet worden ist mit Hilfe eines Mikroorganismus* der zu der Gattung Aspergillus gehört, vorzugsweise zu der Art Aspergillus niger.
7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6* gekennzeichnet dadurch, daß die SPS-ase abgeleitet ist von dem Enzym» das gebildet werden kann mit Hilfe von Asp» aculeatus CBS 101,43.
8« Verfahren nach Punkt 1 bis 7 t gekennzeichnet dadurch, daß die SPS-ase immunoelektrophoretisch identisch ist mit der SPS-ase» die gebildet werden kann mit Hilfe von Asp, aculeatus CBS 101.43 und identifizierbar mit Hilfe eines immunoelektrophoretischen Oberlagerungsverfahrens.
9. Verfahren zum Abbau von Polysacchariden nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Abbau durchgeführt wird durch Isolierung oder Extraktion eines anderen biologischen Bestandteils als Sojaprotein und verwandten Pflan-
63 376 12 - 109 -
zenproteinen aus einem biologischen Rohmaterial, wobei die SPS-ase-Zubereitung im wesentlichen frei ist von irgendeinem Enzym, das imstande ist, das biologische Material abzubauen♦
10, Verfahren zum Abbau von Polysacchariden nach Punkt Ί oder 9* gekennzeichnet dadurch, daß ein oder mehrere Reaktionsproduktee), unabhängig davont ob sie erwünschte Endprodukte oder Abfallprodukte sind» weiter gleichzeitig mit oder nach der Enzyrabehandlung behandelt werden,
11« Verfahren zum Abbau von Polysacchariden nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß die weitere Behandlung eine alkoholische Fermentation ist» wenn eines der Reaktionsprodukte ein fermentierbarer Zucker ist»
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