Enzyme destinée à la décomposition d'un_hydrate de carbone
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procédé de sélection d'un microorganisme produisant ladite enzyme et procédé de production d'une telle enzyme.
La présente invention concerne une enzyme destinée a la décomposition d'un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé, l'hydrate de carbone à poids moléculaire élevé isolé ainsi obtenu, un procédé de sélection d'un microorganisme produisant cette enzyme ainsi qu'un procédé de production d'une telle enzyme.
-Un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée (pvp). par élimination enzymatique de la rémanence, sans dissolution et reprécipitation de la protéine, est décrit dans le brevet belge n[deg.] 882.769. La pureté de la pvp pouvant être obtenue par ce procédé connu n'est pas satisfaisante et demande donc à être améliorée. Dans les exemples, on a mis en évidence une pureté de la pvp d'environ 85 %. Même s'il est possible d'obtenir une pvp présentant une pureté d'environ 90 % suivant le procédé connu, ceci n'est possible qu'en utilisant certaines substances de départ prétraitées, par exemple un concentré de protéines de soja. Il serait souhaitable d'obtenir une pureté de pvp supérieure ou proche de 90% avec une gamme de substances de départ beaucoup plus large, particulièrement de la farine de soja décortiquée et dégraissée.
La présente invention repose sur la découverte surprenante. qu'une certaine partie du produit de la décomposition::de la rêmanence�tel qu'il apparaît pendant le traitement enzymatique précité, à savoir un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé soluble dans l'eau, se fixe lui-même sur une partie de la protéine végétale comme il sera expliqué plus en détail ci-après. Il en résulte, bien entendu, une pureté moins bonne de la protéine. Il
est également apparu que l'hydrate de carbone à poids moléculaire élevé est capable de se fixer à des protéines d'origine animale.
L'invention vise donc tout particulièrement à fournir une enzyme pour la décomposition des hydrates de carbone à poids moléculaire élevé précités et qui ouvrent la possibilité de produire une pvp de pureté améliorée, ainsi qu'un procédé pour la production d'une telle enzyme.
Le principe de l'invention peut être décrit de la manière suivante en référence à la figure 1 qui n'indique que les substances existant en tant que solides non dissous alors que tous les surnageants sont omis. Une charge de farine de soja a été divisée en deux parties égales,partie 1 et partie II (colonne a dans la figure 1).
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ensuite lavée à pH d'environ 8 afin d'éliminer la quantité totale de protéine et la rémanence a été séparée
<EMI ID=4.1> figure 1). De cette manière, on a isolé une rémanence pure
(désignée par rémanence I) (colonne b à la figure 1 ). La partie II de la farine de soja n'a pas été traitée pour plus de concision, la rémanence de la partie II a été dénommée rémanence II (colonne b à la figure 1). Ensuite, <EMI ID=5.1>
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découvert de manière inattendue que la partie non dissoute
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non dissoute de la rémanence II, sur base des bilans d'azote et de la masse de matières sèches (voir figure 1 dans laquelle les surfaces hachurées de la colonne c correspondent aux substances insolubles différentes des protéines dans l'étape indiquée ci-dessus). En outre, si le <EMI ID=8.1>
est ajouté à la suspension de protéine de soja à pH 4,5, un
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Ce polysaccharide du surnageant de la rémanence I, qui est une partie du produit de décomposition de la rémanence et
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isoélectrique de la protéine de soja ou autour de ce point, si celle-ci est présente, est désigné par SPS (soluble, polysaccharide); voir figure 1. Le SPS présente une dis-
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diagramme synoptique représenté à la figure 2 qui recouvre également certains des procédés indiqués à la figure 1. Le problème consiste donc à trouver une enzyme qui est capable de décomposer la SPS de telle manière que les produits de décomposition de SPS ne lient pas la protéine de soja ou lient celle-ci dans une mesure beaucoup moindre que le SPS ne lie la protéine de soja.
Bien que la description concerne principalement la décomposition d'une protéine de soja, l'invention n'est pas limitée à une telle protéine mais concerne toutes . 'les espèces- de protéines végétales, notamment par exemple les protéines citées dans le brevet belge n[deg.] 992.769, page
1.
<EMI ID=13.1> trouvé qu'en examinant l'aptitude à décomposer du SPS de soja, il est possible de sélectionner des microorganismes qui sont aptes à produire un composé qui présente une acti- vité enzymatique, en décomposant effectivement le SPS de soja, composé désigné ci-dessous, pour plus de concision, SPS-ase.
Par conséquent, sous un premier aspect, l'invention concerne une SPA-ase, une carbohydrase sous une forme utilisable et capable de décomposer le SPS de soja dans des conditions. appropriées pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la même protéine dans des conditions correspondantes.
En outre, on a trouvé que cette SPS-ase permettant de dégrader le SPS de soja est capable de dégrader des polysaccharides similaires au SPS et provenant de légumes et ,de fruits, de manière plus complète que ne le font les pectinases commerciales et les cellulases commerciales.
L'expression "forme utilisable" indiquée ci-dessus, vise à exclure de l'invention par exemple une préparation contenant une SPS-ase qui contient des substances toxiques ou qui présente une activité de SPS-ase si basse qu'elle nécessite l'utilisation de plus de 10 % d'une préparation contenant la SPS-ase, par rapport au poids du SPS dans le substrat dans une réaction effectuée pendant 24 heures, à
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nir la décomposition du SPS présentant une importance pratique.
La pureté de la protéine végétale finale est nécessairement améliorée par une élimination totale ou partielle du SPS de la protéine végétale finale par rapport à la pureté de la protéine végétale finale obtenue suivant le procédé du brevet belge n[deg.] 882.769 du fait que cette protéine végétale connue était contaminée avec du SPS.
On ne sait pas à présent, si la SPS-ase particulière décrite ci-après développe son activité enzymatique à partir d'une seule enzyme ou 3 partir d'un complexe d'enzymes comprenant au moins deux enzymes. Certaines recherches semblent indiquer qu'au moins deux enzymes sont responsables de l'effet de décomposition de la SPS-ase, une de ces enzymes étant capable de n'effectuer qu'une légère décomposition du SPS, après quoi une ou plusieurs enzymes sont capables d'effectuer une décomposition plus importante du SPS. Une telle hypothèse ou des hypothèses semblables ne doivent cependant pas limiter la portée de l'invention.
Suivant une forme d'exécution particulièrement préférée de l'invention, la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle est capable de décomposer du SPS de soja, en Milieu aqueux, pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine végétale, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la même protéine végétale, en milieu aqueux.
Suivant une forme d'exécution préférée de la présente invention, la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle
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pH ne s'écartant pas de plus de 1,5 unités de la valeur 4,5 pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine de soja, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la protéine de soja, en milieu aqueux.
Suivant une forme particulièrement préférée de la présente invention la SPS-ase est caractérisée en ce que les produits de décomposition du SPS de soja, après dégradation complète, se fixent eux-mêmes sur la protéine végé-
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en particulier inférieure à 20%, que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la protéine végétale, en milieu aqueux.
Suivant une forme particulièrement préférée de la présente invention la SPS-ase est caractérisée en ce qu'elle réagit positivement au test de la SPS-ase, lors- qu'il est exécuté suivant le procédé de détermination qualitative et quantitative de la SPS-ase décrite dans ce mémoire.
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féré de la présente invention, la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre d'Aspergillus, de préférence appartenant au groupe Aspergillus niger.
Suivant une autre forme d'exécution particulièrecent préféré de la présente invention, la SPS-ase est dérivée des enzymes pouvant être obtenue au moyen de Asp.aculeatus CBS 101.43. La même SPS-ase peut être obtenue par Asp.japonicus IFO 4408. On a trouvé que Asp. .. aculeatus CBS 101.43 produit également des rémanases, des cellulases, des pectinases et des hémicellulases très efficaces. En outre, on a trouvé que toutes les souches appar-
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viennent pas pour produire une SPS-ase nécessaire dans le cadre de l'invention. Ainsi, comme il apparaît dans un paragraphe ultérieur de la présente description (partie 5)
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suffisamment de SPS-ase pour que celle-ci puisse être détectée par la détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans le présent mémoire descriptif.
Suivant une autre forme d'exécution particulière- ment préférée de l'invention, la SPS-ase est identique au
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te au moyen de Asp.aculeatus CBS 101.43 et peut être identifiée au moyen de la technique de recouvrement êlectrophorétique (cfr.parties 6 et 7).
Lorsque la SPS-ase est produite par voie microbiologique, elle est obtenue en mélange avec différentes substances accompagnantes, particulièrement d'autres enzymes. Si on le désire, la SPS-ase en question peut être purifiée, par exemple au moyen des procédés de séparation chromatogra-, phique, comme on le verra plus tard dans ce mémoire (partie :
8).
Dans Agr.Biol.Chem.40 (1), 87-92, 1976, on décrit qu'une souche de Asp.japonicus, ATCC 20236, produit un complexe d'enzymes qui est capable d'effectuer une décomposition partielle d'un polysaccharide acide dans une sauce de soja, nommée APS, dont une fraction est désignée par APS-1. Ce polysaccharide acide n'est pas identique au SPS, ce qui sera montré plus loin et plus en détail dans ce mémoire descriptif à la partie 3. Ainsi, les chromatogrammes HPLC de filtration sur gel du SPS et de l'APS sont
A
nettement différents, et, enoutre, les chromatogrammes de filtration sur gel de l'APS décomposée par la pectinase commerciale Pectolyase et d'un SPS traité avec la pectinase commerciale Pectolyase sont nettement différents. En outre, il n'apparaît pas dans cet article que le polysaccharide acide est lié à la protéine de soja et que le polysaccharide acide décomposé n'est pas lié à la protéine de soja ou y est lié à un degré nettement inférieur à celui d'un polysaccharide acide non décomposé. On a également prouvé que cette souche ne forme pas de SPS-ase en une quantité suffisante pour une détection au moyen d'une détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans ce mémoire. Ceci créait un préjugé à l'égard de toute souche de Asp.
Japonicus en tant que producteur de SPS-ase; cependant, suivant l'invention, on a trouvé de manière inattendue que certaines souches de Asp. japonicus sont des producteurs de SPS-ase.
Suivant un deuxième aspect, la présente invention concerne le SPS isolé, produit à partir d'une protéine végétale brute .servant de substance de départ.
Un mode d'exécution préféré du SPS isolé suivant la présente invention est caractérisé en ce que la protéine végétale brute consiste en une farine de soja dégraissée. La préparation de ce SPS isolé est décrite dans, ce qui précède,. en référence à la figure 2.
Suivant un troisième aspect, la présente invention concerne un procédé de sélection d'un microorganisme produisant une SPS-ase permettant de produire la SPSase suivant l'invention, dans'lequel le microorganisme à tester est cultivé sur - un. milieu de fermentation dont la source principale de carbone est le SPS, après quoi
un échantillon du milieu de fermentation est analysé pour
la détermination de la SPS-ase et le microorganisme en question est choisi en tant que microorganisme produisant une SPS-ase si l' analyse de détermination de la SPS-ase est positive.
Suivant un quatrième aspect, la présente invention concerne un procédé de production de SPS-ase, suivant lequel une souche choisie suivant le.procède ci-dessus
de sélection d'un microorganisme produisant une SPS-ase est cultivée dans un milieu nutritif. La culture ' peut être effectuée e n fermentation noyée (basse) ou en fermentation en surface (haute).
Un mode d'exécution préféré du procède suivant
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aculeatus CBS 101.43 ou Asp. japonicus IFO 4408 est cultivé dans un milieu nutritif.
Suivant un mode d'exécution préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que la culture.
est effectuée e n culture noyée à un pH compris .
dans l'intervalle de 3 à 7 , de préférence de 4 à 6 , à une température comprise dans l'intervalle de 20 à 40 [deg.]C, de préférence de 25 à 35 [deg.]C et en ce que le milieu nutritif contient des sources de carbone et d'azote et des sels inorganiques.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que le milieu nutritif contient de la farine de soja , .de préférence grillée.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de la présente invention, le procédé est caractérisé en ce que la farine de soja est traitée par
une enzyme protéolytique avant d'être utilisée comme composant du substrat, l'enzyme protéolytique étant, de préférence, produite par voie microbiologique au moyen du
B. licheniformis.
Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'on ajoute une solution de pectine de manière aseptique au bouillon
de fermentation pendant la culture.
On a trouvé que la souche Asp. aculeatus Cas 101.43 produit également des enzymes solubilisant la rémanence,des cellulases, des pectinases et des hêmicellulases très efficaces en plus de la SPS-ase et que le complexe d'enzymes produit au moyen de la souche Asp.aculeatus CBS 101.43 convient extrêmement bien en tant qu'agent destiné à la désintégration de parois cellulaires des substances végétales.
Ainsi, le complexe d'enzymes produit par Asp. aculeatus 101.43 peut être utilisé dans l'industrie alimentaire avec d'excellents résultats, pour le traitement de purées de fruits et de légumes et pour clarifier et réduire la viscosité lors de la production de jus et de vins; on peut également l'utiliser comme agent de déshydratation (à savoir un agent de décomposition de polysaccharides et par conséquent de libération de l'eau liée à l'intérieur de la structure polymère des polysaccharides) dans le traitement de végétaux.
Un cinquième aspect de la présente invention concerne l'utilisation d'une SPS-ase ou un procédé de décomposition de polysaccharides, de préférence des polysaccharides de parois cellulaires de plantes, au moyen d'une carbohydrase, procédé dans lequel on met une préparation de SPSase suivant la présente invention en contact avec un substrat pour ladite préparation de SPS-ase, en un milieu aqueux, exception faite des décompositions déjà décrites dans la demande de brevet danois n[deg.] 5691/81.
Ainsi, on a trouvé, suivant la présente invention, que les préparations de SPS-ase sont des préparations d'enzymes efficaces pour la liqu"faction ou la décomposition partielle ou totale de différentes substances, de préférence des substances végétales, par exemple des fruits et des déchets de plantes, contenant des protéines, de la cellulose, de l'hémicellulose,(par exemple des glucannes, du xylane, des galactanes et de l'arabanne), des gommes, de la pectine, des lipides, de l'inuline, des polyphénols,
de l'amidon et des alginates; elles peuvent également être utilisées pour des applications qui y sont apparentées, voir le tableau ci-dessous dans la description. A titre d'exemple pour de telles applications on peut citer toutes les applications pour lesquelles les pectinases et cellulases commerciales sont utilisées de nos jours. Différents exemples seront donnés plus loin dans cette description.
En ce qui concerne le procédé d'extraction
(d'isolation) décrit dans l'exemple 2, par exemple, il faut noter que la préparation de SPS-ase est essentiellement exempte de protéinase, étant donné que le produit final
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contraire. De même, si l'on désire extraire (isoler),
d'une substance biologique brute, des substances biologiques différentes de la protéine, la préparation de SPS-ase utilisée sera essentiellement exempte de toute enzyme dégradant cette autre substance biologique. Une telle préparation de SPS-ase modifiée peut être produite par inactivation sélective de l'enzyme indêsirêe, par fractionnement ou par un autre procédé connu en soi.
Ainsi, un mode d'exécution préféré de la présente invention est caractérisé en ce que la composition est accompagnée par l'isolation ou l'extraction d'une substance biologique différente d'une protéine de soja et de protéines végétales apparentées d'une substance biologique brute, la préparation de SPS-ase étant essentiellement exempte de toute enzyme capable de décomposer ladite substance biologique.
Suivant la présente invention, on a donc trouvé que les préparations modifiées de SPS-ase (modifiées dans
le sens qu'elles sont essentiellement exemptes d'enzymes capables de décomposer la substance biologique à extraire
ou à isoler) sont des préparations d'enzymes efficaces pour l'extraction (isolation) de substances biologiques spécifiques, par exemple l'amidon, les lipides, les arômes, les pigments et les essences de substances biologiques brutes. Plusieurs exemples seront donnés plus tard dans cette description.
Suivant un mode particulièrement préféré de la présente invention, l'utilisation suivant l'invention est caractérisée en ce que l'un ou plusieurs des produits de réaction (sans distinguer s'ils sont des produits .finals recherchés ou des déchets) sont traités ultérieurement en même temps que le traitement par enzyme ou après celui-ci. Ceci fournit une utilisation plus flexible et pouvant être mieux adaptée.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de la présente invention, l'utilisation est caractérisée en ce que le traitement ultérieur consiste en une fermentation alcoolique dans le
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fournit un procédé simple et bon marché pour la production d'alcool.
Afin de mieux expliciter la nature de la présente invention, on se référera à la description qui suit et qui est divisée en différentes parties numérotées de 1 à 10 décrivant chacune les détails spécifiques relatifs à la présente invention. Les différentes parties sont couine suit:
1. Préparation du SPS.
2. Caractérisation du SPS, en particulier la distribution
du poids moléculaire de celui-ci.
3. Essais prouvant la différence entre SPS et APS.
4. Sélection de microorganismes produisant de la SPS-ase.
5. Caractérisation de certains microorganismes formant de
la SPS-ase.
6. Description générale de la technique de recouvrement
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avec un anticorps polyspécifique et recouvrement.
8. Purification d'une préparation de SPS-ase.
9. Dépendance de l'activité à l'égard du pH et de la température et stabilité d'une SPS-ase.
10. Détermination de l'activité enzymatique.
PARTIE 1.
PREPARATION DU SPS.
Comme déja mentionné précédemment, la substance de départ pour la préparation du SPS peut être la rémanence de soja. C'est pourquoi, on décrira d'abord la préparation d'une rémanence de soja.
La rémanence de soja est une fraction d'hydrate de carbone exempte de protéines (qui, en pratique, peut contenir de faibles quantités de lignine et matières minérales), contenue dans la farine de soja dégraissée et décortiquée, ladite fraction d'hydrate de carbone étant insoluble.dans un milieu aqueux à pH 4,5 et pouvant être préparée de la manière suivante, en référence au tableau synoptique n[deg.] 1.
La farine de soja dégraissée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) est mise en suspension dans de l'eau désionisée à 50[deg.]C dans un proportion pondérale de farine de soja à l'eau de 1:5, dans un réservoir contenant un équipement de stabilisation de pH et de température. On règle le pH à 8,0 au moyen de NaOH 4N (I). On effectue une hydrolyse à pH stationnaire au'. moyen d'ALCALASE 0,6 L (une enzyme protéolytique à base de B. Licheniformis ayant une activité de 0,6 unités Anson par gramme, l'activité étant déterminée suivant la méthode Anson, comme décrit dans NOVO ENZYME INFORMATION IB No. 058 e-GB). Le rapport enzyme/ substrat correspond à 4 % de la quantité de protéines dans la farine de soja (II).
Après une hydrolyse pendant une heure, la boue est séparée par centrifugation (III) et on lave (IV), cette opération étant effectuée deux fois (V, VI, VII). La boue ainsi traitée est ensuite hydrolysée une fois de plus pendant une heure au moyen d'ALCALASE 0,6 L (VIII, IX), de manière similaire à ce qui a été dit ci-dessus. Ensuite la boue séparée par centrifugation (X) est lavée deux fois (XI, XII, XIII, XIV), la boue finalement lavée (6) étant sêchée par pulvérisation (XV). La poudre ainsi produite, sèchée par pulvérisation est la rémanence de soja servant de matériau brut pour la production de SPS.
Le SPS est la fraction soluble à l'eau de polysaccharide qui est obtenue par un traitement classique de la rémanence de soja susmentionnée avec de la pectinase. Le SPS est préparé de la manière suivante au moyen des 14 étapes réactionnelles indiquées ci-dessous, en référence au tableau synoptique n[deg.] 2.
1. On détermine la teneur en matière sèche de la rémanence
susmentionnée et on dilue la rémanence de soja dans de l'eau à raison de 2 % de matière sèche et ladite
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dans un réservoir comportant un réglage de température.
2. On règle la valeur du pH à 4,50 au moyen de NaOH 6N.
3. On ajoute en une quantité de 200 g/kg de matière sèche
du Pectinex Super concentré L (pectinase commerciale de la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse) présentant une activité en pectinase de 750.000 MOU, déterminée suivant le feuillet "Détermination of the Pectinase
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ajoute également en quantité de 20 g/kg de matière sèche du Celluclast 200L (cellulase commerciale décrite dans le feuillet NOVO enzymes, information sheet B-153 e-GB 1000 juillet 1981, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S,
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au moyen de NaOH 4N. Le mélange réactionnel est maintenu tel quel pendant 30 minutes et le pH est ensuite règle à 4,5 au moyen de HC1 6N.
6. Le mélange réactionnel est centrifugé et on récupère le
produit de centrifugation ainsi que la boue.
7. Le produit de centrifugation de l'étape 6 subit une
filtration de contrôle sur un filtre presse (le filtre est lavé 1 l'eau avant la filtration de contrôle).
8. Le filtrat de contrôle est soumis à une ultrafiltratiory <EMI ID=29.1>
tion sur une membrane présentant une valeur de coupure de 30.000. (DDS GR 60-P de De Danske Sukkerfabrikker),
en ayant recours aux paramètres suivants :
1. Ultrafiltration correspondant à une concentration de
volume de 6.
2. Diafiltration jusqu'à ce que le pourcentage en '
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3. Ultrafiltration jusqu'à environ 15 % de matière sèche
dans le concentrât.
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pression moyenne de 3 bars.
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10.On récupère le précipité au moyen d'une centrifugeuse.
.!!..Le précipité est lavé deux fois par de l'éthanol dans l'eau à 50 % v/v, correspondant au volume du produit de centrifugation de l'étape 10, c'est-à-dire qu'on effectue deux centrifugations.
12.. Le précipité lavé est remis en solution dans l'eau en un
volume qui correspond au volume de concentrat de l'étape 9 soumis à ultrafiltration.
13.Le liquide de l'étape 12 est soumis à une filtration de
contrôle sur un filtre de verre.
14.Le filtrat clair contenant du SPS pur est lyophylisé.
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PARTIE 2
CARACTERISATION DU SPS, EN PARTICULIER DISTRIBUTION DUPOIDS MOLECULAIRE DE CELUI-CI.
On a déterminé (fig. 4), la distribution du poids moléculaire du SPS dont la production est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, au moyen d'une chromatographie sur gel dans un équipement HPLC (pompe Waters, modèle 6000, module de données 730 de Waters et réfractomètre R 401 de
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du poids moléculaire des produits de décomposition du SPS par la SPS-ase suivant le même procédé. En outre, on a montré pa la même méthode, l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS (fig. 6) et l'absence de l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé par l'agent suivant l'invention (fig. 7).
La courbe de calibrage (le logarithme du poids moléculaire en fonction de Rf, où la valeur Rf pour le glucose est arbitrairement définie comme étant 1 et où la valeur Rf d'un dextrane spécifique est définie en tant que temps de rétention de ce dextrane divisé par le temps de rétention du glucose)a été établie au moyen de plusieurs dextranes étalons ayant des poids moléculaires connus (T 4, T 10,T 40, T 70, T 110, T 500) vendus par Pharmacia Fine Chemicals AB, Botte 175, S-75104, Uppsala, Suède. On a trouvé la valeur Rf pour le maximum de chaque pic de dextrane et le poids
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où est la valeur moyenne pondérale du poids moléculaire. et est la valeur moyenne numérique du poids molé-
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processus chromatographique. Les colonnes utilisées dans ce processus chromatographique sont la colonne PW 5000 de
60 cm suivie par une colonne PW 3000 de 60 cm vendues par Toyo Soda Manufacturing Co., Japon. On a établi la relation entre le poids moléculaire et la valeur Rf pour les dextranes indiqués ci-dessus de cette manière, cfr. fig. 3.
A partir de la fig. 4, on peut calculer que le SPS présente une distribution de poids moléculaire qui est <EMI ID=38.1>
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dans cette figure que le chromatogramme présente deux pics distincts à un temps de rétention de 34,5 minutes (6 %) correspondant à un poids moléculaire d'environ 5 x 106 et à un temps de rétention de 47,12 minutes (67 %) correspondant à un poids moléculaire d'environ 4,3 x 10 . Il apparaît également de cette courbe qu'il existe un épaulement entre ces deux pics à un temps de rétention de 41,25 minutes (27 %) correspondant à un poids moléculaire de 2,8 x 105.
.Après la décomposition du SPS par la SPS-ase, le mélange d'hydrolyse a été filtré sur membrane et le filtrat a été soumis à la chromatographie. On a trouvé qu'environ
55 % du SPS est décomposé en monosaccharide, disaccharide <EMI ID=40.1>
en un polymère présentant trois pics correspondant au poids
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5.
Dans le but de démontrer l'effet de liaison entre la pro-
téine de soja et le SPS et la réduction substantielle de l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé au moyen de la SPS-ase, on a effectué les essais suivants.
3 % de SPS dans un tampon acétate 0,10 M à pH 4,5 est ajouté à une boue d'un isolat de soja (Purina E 500) afin de générer une suspension présentant le rapport isolat/ SPS correspondant à 10:1. On fait incuber cette suspension
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incubation, la suspension est centrifugée et le surnageant clair est analysé par HPLC comme décrit précédemment. En comparant la fig. 6 à la fig. 4, il apparaît que le SPS est complètement adsorbé sur l'isolat de soja.
Le même processus que celui mentionné dans le paragraphe précédent est mis en oeuvre avec une solution à 3 % de SPS hydrolysé avec une SPS-ase produite par CBS
101.43 (fig. 7). En comparant la fig. 7 et la fig. 5, on constate qu'aucun composé du SPS hydrolyse présentant un poids moléculaire inférieur à 10 n'est adsorbé sur l'isolat de soja. L'hydrolyse réduit la liaison quantitative jusqu'à environ 10 à 15 % par rapport à la liaison du SPS à la protéine de soja.
Une analyse RMN du SPS, dont la production est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, révèle la composition approximative suivante du SPS :
1) acide a-galacturonique en une quantité d'environ 45 %,
approximativement 40 % de la quantité totale d'acide a-galacturonique étant présents en tant qu'ester méthylique.
2) rhamnopyranose en une quantité d'environ 20 %,
3) galactopyranose en une quantité d'environ 15 %, et
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Les constituants semblent être présents suivant une structure comprenant une chaîne principale rhamnogalacturonique et des chaînes latérales de xylose et de galactose.
L'hydrolyse acide complète du SPS (8 heures dans
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également de faibles quantités de monosaccharides fucose et arabinose dans le SPS hydrolysé.
Une analyse HPLC du SPS décomposé par le complexe d'enzymes SPS-ase formé par CBS 101.43 montre une importante réduction du poids moléculaire. De manière semblable, le spectre RMN du SPS décomposé comme indiqué ci-dessus montre qu'une majeure partie des groupes ester a disparu et que, également, la teneur en xylose et galactose dans la substance à poids moléculaire plus élevé a diminué. Le spectre RMN de la partie du produit de décomposition de SPS qui précipite par addition.d'un volume d'éthanol à un volume de produit de décomposition de SPS est semblable au spectre RMN du SPS qui a subi les modifications susmentionnées concernant les groupes ester et la teneur en xylose et galactose* PARTIE 3 :
ESSAIS PROUVANT LA DIFFERENCE ENTRE SPS ET APS
On a préparé le APS comme mentionné dans Agr. Biol. Chem., Vol. 36, No. 4, p. 544 - 550 (1972).
On a ensuite hydrolysé ce polysaccharide et le SPS avec différentes enzymes , puis on a soumis le mélange de décomposition à une chromatographie sur gel par. un équipement HPLC, comme mentionné dans la deuxième partie, "Caractérisation du SPS, en particulier la distribution du poids moléculaire de celle-ci".
Plus précisément, on a effectué l'hydrolyse par un traitement d'une solution de 25 ml de 2% de APS ou de 2 % de SPS dans un tampon acétate 0,1 M ayant un pH de
4,5 par 10 mg de KRF 68 ou 30 mg de Pectolyase KRF 68 est une préparation de SPS-ase dont la fabrication est décrite à l'exemple 1. Les résultats sont repris dans le tableau suivant :
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PARTIE 4.
SELECTION DE MICROORGANISMES PRODUISANT DE LA SPS-ASE.
Le microorganisme à tester est soumis à une incubation sur un substrat incliné d'agar présentant une composition qui permet la croissance du microorganisme. Après une croissance initiale sur le substrat incliné d'agar, le microorganisme est transféré dans un substrat principal liquide dans lequel la source de carbone principale est le SPS (préparé comme indiqué), dans lequel la <EMI ID=46.1>
aminés libres, des protéines ou d'autres composés contenant de l'azote et qui contient en outre, un mélange de sels nécessaires et de vitamines, de préférence sous forme d'un extrait de levure. La composition du substrat principal dépend du genre du microorganisme, la considération principale consistant en ce que le substrat principal est capable de supporter la croissance et le métabolisme du microorganisme.
Lorsque la croissance a eu lieu pendant une durée adéquate, de l'ordre de 1 à 7 jours, en fonction de la vitesse de croissance du microorganisme en question, on analyse un échantillon du bouillon de culture pour la détermination de la SPS-ase suivant la détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans cette description ou suivant toute autre détermination de SPS-ase adaptée à des utilisations spécifiques de la SPS-ase différentes de l'utilisation en tant que composant d'un agent de décomposition de la rémanence de soja.
Afin d'avoir une technique plus sensible pour la détermination de l'activité enzymatique, on peut abaisser
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bation à 20 heures pendant la détermination de l'activité de SPS-ase, des antibiotiques pouvant être ajoutés au substrat dans le but d'éviter une infection.
Par cette technique, on peut trouver d'autres microorganismes produisant de la SPS-ase appartenant au genre Aspergillus airisi qu'à d'autres ,genres.
PARTIE 5
<EMI ID=48.1>
Par la technique de sélection pour des microorganismes produisant de la SPS-ase indiquée dans ce mémoire descriptif, on a trouvé que les microorganismes cités dans la partie supérieure du tableau suivant sont des producteurs de SPS-ase. Le tableau contient également une souche appartenant à l'espèce Asp. jàponicus'qui n'est pas un producteur de SPS-ase
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Une identification courte des souches indiquées ci-dessus peut être trouvée dans les catalogues de culture suivants :
List of Cultures 1978, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas.
<EMI ID=50.1>
l'"Institute for Fermentation" Osaka, 17-85, Juso-honmachi 2-Chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japon.
<EMI ID=51.1>
Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Amérique.
Toutes les souches du tableau indiqué ci-dessus correspondent étroitement à la description taxonomique des
<EMI ID=52.1>
"The genus Aspergillus" de Raper and Fennell, 1965, voir
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PARTIE 6
DESCRIPTION GENERALE DE LA TECHNIQUE DE RECOUVREMENT
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On a développé un procédé dénommé technique de recouvrementde top-agar pour identifier les composants individuels d'un complexe d'enzymes par immunoelectrophorèse croisée au moyen d'un anticorps polyspécifique pour tous les 1- Gants d'enzyme du complexe d'enzymes. Le procédé est basé sur le fait que les enzymes sont encore actives après la liaison spécifique entre l'enzyme et l'anticorps ou, exprimé de manière différente, le procédé est basé sur le fait que le site enzymatique actif n'est pas identique au site de la liaison enzyme-anticorps. Les complexes enzyme-anticorps précipitent en tant qu' arcs distincts dans le gel pendant l'électrophorèse. La plaque de gel est recouverte avec du SPS soluble dans du top-agar.
Après chauffage à 45[deg.]C pendant 20 heures dans une atmosphère ayant une humidité relative de 100 %, l'arc qui possède une activité de SPS-ase apparaît en tant que zone claire dans la couverture de SPS après précipitation par un mélange de parts égales. en- volume d'éthanol et d'acétone, lorsqu'on
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tent pas d'activité SPS-ase restent invisibles.
PARTIE 7.
<EMI ID=56.1>
UN ANTICORPS POLYSPECIFIQUE ET RECOUVREMENT.
On a immunisé des lapins par le complexe d'enzymes contenant la SPS-ase obtenu par fermentation de Aspergillus aculéatus CBS.101.43, comme indiqué dans l'exemple 1 (KRF 68) et on a récupéré l'anticorps polyspécifique d'une manière connue en soi. Au moyen de cet anticorps polyspécifique on a effectué une immunoélectrophorèse croisée du complexe d'enzymes obtenu par fermentation de l'Aspergillus acaleatus CBS 101.43, comme
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1977. On se réfère à la fig. 11 qui montre les arcs' correspondant aux différentes protéines produites par le microorganisme. On a trouvé, au moyen de la technique de recouvrement de top-agar décrite précédemment, que la surface hachurée correspond à la SPS-ase.
Si l'hypothèse susmentionnée supposant que la SPS-ase consiste, en au moins deux enzymes est correcte, la surface hachurée est la surface dans laquelle se trouvent toutes les enzymes responsables de l'activité de ; SPS-ase. Si, suivant d'autres modes d'exécution de la présente invention, on peut séparer des enzymes par immunoêlectrophorêse de telle manière qu'elles ne couvrent aucune surface mutuelle, on peut encore identifier une
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PARTIE 8.
PURIFICATION D'UNE PREPARATION DE SPS-ASE.
On a effectué la purification de la préparation de SPS-ase KRF 92 (voir exemple 1) par échange d'ions.
Le tampon est le Tris 50 mMolaire (tris-hydroxymêthylaminométhane) qui est règle à pH 7 au moyen de HC1. La colonne est une colonne K 5/30 vendue par Pharmacia, Suède. La substance d'échange d'ions est du DEAE-trisacryl vendu par LKB, Bromma, Suède (300 ml). La vitesse de passage est de
100 ml/heure.
On a dissous 15 g de la préparation de SPS-ase KRF 92 dans 450 ml de H20 at 6[deg.]C et toutes Les opérations
<EMI ID=59.1>
On règle le pH à 7,0 au moyen de Tris 1 Molaire. La colonne a été équilibrée au moyen du tampon et on a ensuite introduit l'échantillon de SPS-ase dans la colonne. On a mesuré OD280 et la conductivité de l'éluat; voir à
la fig. 12. La fraction 1 correspond à l'éluat qui n'est pas lié à la substance d'échange d'ions. Ensuite la colonne a été lavée avec 2000 ml de tampon, ce qui donne la fraction 2. On a ensuite établi un gradient de NaCl 0-500 mMolaire ce qui donne les fractions 3 - 9. Les neuf fractions ont été concentrées à 200 ml et ont été dyalisées <EMI ID=60.1>
Fiber DP 2 de Amicon, Massachussetts, U.S.A.). Ensuite les neuf fractions ont été lyophilisées. Uniquement les fractions 1 et 2 présentaient une activité de SPS-ase.
La fraction 1 a été purifiée ultérieurement par une filtration sur gel. On a dissous 1,5 g de la fraction
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x 100 cm de LKB.. La substance servant à la filtration sur gel est le Sephacryl S-200 de Pharmacia, Suède. La vitesse de passage est de 30 ml/heure. Les fractions contenant des substances ayant un poids moléculaire compris entre 70.000
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contenaient un complexe d'enzymes désigné par facteur G qui ne peut décomposer le SPS lorsque l'on pratique l'essai suivant le test qualitatif d'agar.; cependant, le SPS est décomposé suivant le test qualitatif d'agar lorsque l'on mélange le facteur G avec une pectinase. On a trouvé que le facteur G est capable de séparer le galactose, le .fucose et certains acides galacturoniques du SPS ; mais le produit de décomposition principal suivant l'analyse HPLC est un produit à poids moléculaire élevé ressemblant très fort au SPS.
PARTIE 9.
DEPENDANCE DE L'ACTIVTE A L'EGARD DU.pH ET DE LA TEMPERA-TURE ET STABILITE D'UNE SPS-ASE
La fig. 13 montre l'activité en fonction du pH delà préparation de SPS-ase KRF 68. De pH 2,7 à 3,5 on
a utilisé un système de tampon à l'acide formique et de pH 3,7 à 5,5 on a utilisé un système de tampon à l'acétate.
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température de la préparation de SPS-ase KRF 68.
.La fig. 15 montre la stabilité thermique de la préparation de SPS-ase KRF 68....
PARTIE 10 DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE.
Le tableau repris ci-dessous donne un aperçu des différentes déterminations de l'activité enzymatique relevant de la présente invention.
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Les références indiquées dans la dernière
.colonne du.tableau susmentionné sont détaillées dans le tableau suivant.
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En ce qui concerne la détermination de l'activité de cellulase', il est à noter que l'analyse a été effectuée comme indiqué dans AF 149/6-GB et que les principes de détermination sont expliqués dans Analytical Biochemistry.
A. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE SPS-ASE.
La détermination enzymatique de SPS-ase est effectuée en deux étapes, c'est-à-dire un essai qualitatif sur plaque d'agar et une détermination quantitative de l'activité SPS-ase, basée sur la mesure de la quantité totale de sucres libérée. Si l'essai qualitatif sur plaque
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que soit la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase. Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est positif, l'activité en SPS-ase est égale à la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase.
I. Essai qualitatif . sur plaque d'agar.
On a préparé une plaque de SPS-agar de la manière suivante. On a préparé un tampon (B) en amenant de
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On dissout 1. g de SPS dans 20 ml de B. On mélange 1 g d'agarose (HSB Litex) avec 80 ml de B et on chauffe jusqu'au point d'ébullition en agitant. Lorsque l'agarose est dissoute,la solution de SPS est lentement ajoutée. La solution qui en résulte à 1 % SPS-agarose
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sont ensuite coulées en versant 15 ml de la solution à 1 % de SPS-agarose sur une plaque en verre horizontale ayant les dimensions de 10 cm x 10 cm. Ensuite
on estampe 9 "puits" dans la couche solidifiée de SPS-agarose à une distance de 2,5 cm. Dans chaque puits on introduit 10 !.Il. d'une solution a 1 % de la pro-
<EMI ID=69.1> . non encore décomposé est précipité par une solution à parts égales en volumes d'éthanol et d'acétone. L'essai de la SPS-ase sur plaque d'agar est positif pour un échantillon placé dans un puits spécifique si une zone annulaire claire apparaît autour de ce puits.
II. DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'ACTIVITE DE SPS-ase.
Le but de cet essai est de déterminer les activités enzymatiques qui sont capables de décomposer le SPS d'une telle façon.. que les produits de décomposition présentent une affinité à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja fortement réduite ou ne
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de protéine de soja. Des essais ont montré que la partie des produits de décomposition de SPS qui n'est pas précipitée par le mélange de parts égales en volumes d'eau et d'éthanol ne présente aucune affinité à l'adsorption ou à la liaison à la protéine de soja.
La détermination de la SPS-ase est basée sur une hydrolyse du SPS dans des conditions standard suivie par une précipitation de la partie de SPS qui n'a pas été hydrolysée par l'éthanol. Après la précipitation, la teneur en hydrate de carbone qui n'est pas précipitée est déterminée par une analyse quantitative pour le
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INDUSTRIE A/S, 2880 Bagsvaerd).
Les conditions standard sont :
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pH : 4,5 Temps de réaction : contrôle pendant 210 minutes uniquement avec le substrat, suivi par 2 minutes l'enzyme étant additionnée.
Temps de réaction : valeur principale 212. minutes , L'équipement comprend :
<EMI ID=73.1>
Agitateur Whirlimixer
Centrifugeuse ! Un bain d'eau glacé.
Les réactifs comprennent :
Tampon acide acétique 0,6 M dans l'eau <EMI ID=74.1>
Substrat :la valeur pH de 50 ml de a est
réglée à 4,5 au moyen de 2, ensuite on ajoute 4,0 g de SPS et après disso� lution de celui-ci, le pH est réglé ;
une nouvelle fois à 4,5 et le volume est porté à 100 ml au moyen d'eau désionisée.
Réactif d'arrêt :Ethanol absolu.
Une unité d'activité SPS-ase (SAE ou SPSu) est :
définie comme l'activité SPS-ase qui libéré ' une quantité d'hydrate de carbone soluble dans de l'éthanol à 50 % équivalente à 1 mole de galactose par minute, dans les conditions standard susmentionnées.
Même si la partie initiale de la courbe standard de l'enzyme est une ligne droite, il faut noter qu'elle n'intersècte pas le point (0,0).
B. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE SOLUBILISANT
LA REMANENCE EXPRIMEE EN SRUM 120.
Principe.
Dans le procédé pour la détermination de l'activité d'hydrolyse, la partie insoluble de la farine de soja dégraissée, déprotéinisée et décortiquée est hydrolysée dans des conditions standard. La réaction
de l'enzyme est arrêtée avec un réactif d'arrêt et la fraction insoluble est séparée par filtration. La quantité de polysaccarides dissous est déterminée par spectrophotométrie après une hydrolyse acide suivant
AF 169/1, disponible chez Novo Industri A/S, 2880 Bagsvae rd.
Les carbohydrases présentant une activité endo ainsi que celles présentant une activité exo sont déterminées suivant le procédé.
Le substrat faisant partie de cette détermination enzymatique est identique au substrat de la rémanence décrit pour la méthode SRU. Le substrat est dissous sous forme d'une solution à 3 % dans le tampon au citrate indiqué ci-dessous :
Tampon au citrate-phosphate 0,1 N de pH 4,5
5,24 g d'acide citrique-monohvdraté (Merck Art 2441
8,12 g d'hydrogène-phosphate disodique bihydraté (Merck Art 6580)
Amené à 1 litre par de l'eau déminéralisée
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Stable pendant 14 jours.
Le réactif d'arrêt présente la composition suivante :
100 ml de NaOH 0,5 N
200 ml d'éthanol à 9 6 %
A garder dans un réfrigérateur jusqu'au moment de l'utilisation.
Conditions standard :
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Temps de réaction, échantillon :120 minutes
" " , à blanc 5 minutes Définition de l'unité :
Une unité d'activité solubilisant la rêmanence de soja (SRUM) 120 (M pour manuel) correspond à la quantité d'enzyme qui, dans les conditions de réaction données, libère, par minute, des polysaccharides solubilisés équivalant à une micro-mole de galactose.
C. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
MESURE HUT
Procédé pour la détermination de protéinase dans un milieu acide.
Le procédé est basé sur la digestion d'hémoglobine dénaturée par l'enzyme à 40[deg.]C, à pH 3,2, pendant 30 minutes. L'hémoglobine non digérée est
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(poids/volume).
Tous les échantillons d'enzymes sont préparés
<EMI ID=78.1> à pH 3,2.
Le substrat d'hémoglobine est préparé en utilisant 5,0 g de poudre d'hémoglobine bovine lyophilisée, conservée avec du Thicmersalate à 1 % et 100 ml d'eau déminéralisée qui est agitée pendant 10 minutes, avant
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Après une agitation ultérieure de 10 minutes, on
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cette solution est porté à 200 ml au moyen d'un tampon acétate 0,2 M. Ce substrat d'hémoglobine doit être refroidi pour être gardé pendant 5 jours.
'Le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante. Au temps zéro, 5 ml du substrat sont introduits dans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme. Après agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un
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30 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à
14 % dans l'éprouvette, qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes.
Pour l'essai à blanc, le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante. Au temps zéro, on ajoute 5 ml du substrat dans l'éprouvette contenant 1 ml d'enzyme. Après une agitation d'une seconde,
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5 minutes. Après exactement 5 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à 14 % dans l'éprouvette, qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes.
Après 40 minutes, les essais à blanc et les échantillons sont agités, filtrés une ou deux fois à
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spectrophotomètre. L'échantillon est lu par rapport à l'essai à blanc à 275 nm en ajustant le spectrophotomètre:par rapport à de l'eau.
Etant donné que l'absorbance de la tyrosine à 275 nm est un facteur connu, il n'est pas nécessaire d'établir une courbe standard de tyrosine à moins qu'il ne soit nécessaire de contrôler le spectrophotomètre de Beckman. Calculs:
1 HUT est la quantité d'enzyme qui forme, en une minute, un hydrolisat équivalent en ce qui concerne l'absorbance à 275 nm à une solution de 1,10 microgramme/ml de tyrosine dans du HC1 0,006 N. Cette valeur de l'absorbance est de 0,0084. La réaction s'effectue à 40[deg.]C, à pH 3,2, et pendant 30 minutes.
<EMI ID=84.1>
Un essai pour déterminer la dépendance de la stabilité du pH de la protéase dans le KRF 68, effectué au
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montré que la stabilité de la protéase à pH supérieur à 8,0 est très faible, cfr. fig. 16.
Dans le but de mieux illustrer la présente invention, on se référera aux exemples 1 à 8 suivants, dans lesquels l'exemple 1 illustre la production d'une SPS-ase et dans lesquels les exemples 2 à 8 illustrent l'application de SPS-ase à une substance brute à base de soja afin de produire une protéine végétale purifiée. D'autres applications de SPS-ase sont indiquées dans ladite partie entre l'exemple 8 et le tableau récapitulatif des.figures.
On a effectuera l'échelle de laboratoire, différentes fermentations avec les souches de Asp. aculeatus et Asp. japonicus,indiquées ci-dessus. Ainsi on a obtenu des préparations qui contenaient de la SPS-ase suivant l'essai de SPS-ase indiqué ici. Cependant, canne on doit disposer de quantités assez grandes en SPS-ase dans le but d'effectuer des essais d'application, on effectue des fermentations similaires à l'échelle d'une installation pilote, cfr. exemple 1 suivant.
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Production d'une SPS-ase à l'échelle d'une installation pilote.
On a préparé une SPS-ase par fermentation submergée d'Aspergillus aculeatus CBS 101.43.
On a préparé un substrat d'agar présentant la composition suivante dans un flacon Fernbach :
<EMI ID=87.1>
On a règle le pH à une valeur entre 5,30 et 5,35. Ensuite on a ajouté 40 g d'agar Difco et on a maintenu le mélange dans un autoclave pendant 20 minutes à 1200C (le substrat est dénommé E-agar}.
La souche CBS 101.43 a été cultivée sur un plan incliné de E-agar (37[deg.]C). Les spores du plan incliné ont été mis en suspension dans du lait écrémé stérilisé et la suspension a été lyophilisée dans des fioles. La teneur d'une fiole lyophilisée a été transvasée dans un flacon de Fernbach. Le flacon a ensuite été soumis à une incubation
<EMI ID=88.1>
On a préparé un substrat ayant la composition suivante, dans un réservoir de fermentation de 500 litres :
<EMI ID=89.1>
On a ajouté de l'eau de robinet jusqu'à un volume
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1> <EMI ID=92.1>
Le volume final avant inoculation était d'environ 300 litres.
La suspension de spores dans le flacon de
<EMI ID=93.1>
tion. Les.conditions de fermentation de l'inoculât étaient
Type de fermentateur .: Réservoir de fermentation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,3.
Agitation : 300 tours/minute (2 hélices de turbine)
<EMI ID=94.1>
<EMI ID=95.1>
Pression : 0,5 atmospère relative
Temps ; Environ 28 heures.
Environ 28 heures après l'inoculation, on a transféré 150 litres du fermentateur d'inoculationvers le réservoir de fermentation principal.
On a préparé un substrat ayant la composition suivante dans un réservoir de fermentation principal de
2500 litres :
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On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total
<EMI ID=97.1>
suspension. On a maintenu le mélange pendant 4 heures à
<EMI ID=98.1>
une pression relative de zero atmosphère relative et une agitation à raison de 100 tours/minute. Ensuite on a ajouté les composants restants de. substrat et on a réglé le pH à environ 6 au moyen d'acide phosphorique. On a stérilisé le substrat dans le réservoir de fermentation principal pendant 1 1/2 heure à 123*C. Le volume final avant inoculation était d'environ 1080 litres.
Ensuite on a ajouté 150 litres de culture d'inoculation.
Les conditions de fermentation sont :
Type de fermentateur :Réservoir de fermentation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,7.
Agitation : 250 tours/minute (2 hélices de turbine) Aération : 1200 IN d'air/minute ...
Température : 30 [deg.]C
Pression : 0,5 atmosphère relative
Temps : environ 151 heures.
A partir de 24 heures de fermentation jusqu'à environ 116 heures de fermentation on a ajouté une solution de pectine de manière. aseptique au réservoir de fermentation principal à raison d'une vitesse constante d'environ
8 litres par heure. La solution de pectine ayant la composition suivante a été préparée dans un réservoir de dosage de 500 litres.
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<EMI ID=100.1>
pectin factory Ltd").
On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total ! d'environ 325 litres. Le substrat a été stérilisé dans un réservoir de dosage pendant 1 heure à 121[deg.]C. Le volume final avant le début du dosage était d'environ 360 litres. Lorsque cette partie a été épuisée, on a préparé une autre partie similaire. Le volume total de la solution de pectine pour ; une fermentation était d'environ 725 litres.
Après environ 151 heures de fermentation on a arrêté le processus de fermentation. Le bouillon de '
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et on a récupéré les enzymes selon la technique ..suivante.
Le bouillon de culture a été filtré sur un titre tambour sous vide (Dorr Oliver), qui était enrobé d'une terre de diatomées Hy-flo-super-cel (adjuvant de filtration). Le filtrat a été concentré par évaporation. à environ 15 % du volume du bouillon de culture. Le concentré a été filtré sur une feuille de filtre Seitz
(type supra 100) comportant 0,25 % de Hy-flo-super-cel à
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le tableau suivant). Le filtrat a été précipité au moyen
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filtration. Le précipité et l'adjuvant de filtration sont séparés par filtration sur un.filtre à.cadre. Le . gâteau de filtre est dissous dans de l'eau et les fractions insolubles sont séparées par filtration sur un.filtre à cadre. Le filtrat est soumis à un essai de filtration sur une feuille filtrante Seitz (de type supra 100) avec 0,25 % de Hy-flo-super-cel à titre d'adjuvant de filtration (dénommé filtration II dans le tableau suivant). Le filtrata été soumis à une diafiltration dans un appareil d'ultrafiltration. Après diafiltration, le liquide est concentré jusqu'à une teneur en matière sèche de 12,7 %
(dénommée, dans le tableau suivant, teneur en matière sèche:
du concentré).
Un traitement de base facultatif pour éliminer partiellement l'activité de protéase peut être effectué à cette étape. Dans le cas d'un traitement de base, celui-ci est effectué à un pH de 9,2 pendant une heure, le pH étant ensuite règle à 5,0.
Ensuite le liquide est soumis à une filtration d'essai et filtré dans le but d'une réduction de germes et le filtrat est lyophilisé dans un équipement de lyophilisation de Stokes.
On a effectué quatre fermentations de la manière indiquée ci-dessous; la souche utilisée pour la fermentation, l'utilisation facultative d'un traitement de base et d'autres paramètres variant, comme indiqué dans le tableau suivant.
<EMI ID=104.1>
.x Après filtration de réduction des germes, le filtrat est , concentré par évaporation en un rapport de 1:2,3. Une faible partie du filtrat concentré a été sèchée par pulvérisation et la partie restante a été lyophilisée.
Afin de réduire encore plus l'activité de protéase, certaines préparations indiquées ci-dessus sont traitées comme indiqué ci-dessous, en n'utilisant qu'une des trois possibilités A, B, ou C.
A. On dissout 100 g de préparation de SPS-ase
<EMI ID=105.1>
règle le pH à 9,1 au moyen de NaOH 4N. Ce traitement de base est effectué pendant une heure. On règle ensuite le pH à 4,5 au moyen d'acide acétique glacial et on dialyse en opposition à . l'eau désionisée glaciale à une conductivité de 3 mSi. Ensuite on effectue la congélation et la lyophilisation.
B. On dissout une préparation de 500 g de SPS-
<EMI ID=106.1>
On règle le pH à 9,1 au moyen de NaOH 4N. Ce traitement de base est effectué pendant une heure. On règle ensuite
<EMI ID=107.1>
substance obtenue est lyophilisée.
C. On dissout 50 g d'une préparation de SPS-ase
<EMI ID=108.1>
règle le pH à 9,1 au moyen de NaOH 4 N. Ce traitement de base est effectué pendant une heure. Ensuite on règle ' le pH à 5,7 au moyen d'acide acétique glacial. La substance obtenue est lyophilisée.
<EMI ID=109.1>
Les préparations indiquées ci-dessus sont caractérisées par leur activité des enzymes selon la présente invention dans le..tableau suivant.
<EMI ID=110.1>
Exemple 2 (exemple d'application)
Cet exemple décrit la fabrication de p.v.p. à partir de farine de soja dégraissée et décortiquée, "Sojamel 13" (disponible dans le commerce de Aarhus Oliefabrik A/S) . La teneur en matière sèche de, cette farine était de 94,0 % et la teneur en (N x 6,25) sur base des matières sèches était de 58,7 %. La farine de soja a été traitée avec les préparation de SPS-ase KRF 68 BII
(exemple 1) de la manière suivante :
On a mis 85,29 g de la farine de soja en suspen-
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
6 N. On y a ajouté 50 g d'une solution contenant 4,00 g de ladite préparation de SPS-ase et on a ensuite agité le
<EMI ID=113.1>
a ensuite été centrifugé dans une centrifugeuse de laboratoire
(modèle Beckman J-6B) pendant 15 minutes à 3000 x g. on a pesé le surnageant et on l'a analysé suivant la méthode de Kjeldahl afin de déterminer l'azote et les matières sèches. La phase solide a ensuite été lavée avec un volume d'�au équivalent à la masse de surnageant obtenue lors de la première centrifugation. Cette opération a été effectuée deux fois.. La phase solide a ensuite été lyophilisée, pes�e et analysée suivant la méthode de Kjeldahl pour déterminer l'azote et les matières sèches chez Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danemark. Ce laboratoire est agrée par l'E.tat pour les analyses d'aliments pour bétail et des produits laitiers. Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau 2.1 :
Tableau 2.1 Résultats obtenus
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On a donc obtenu une p.v.p. présentant une pureté de protéine, c'est-à-dire N x 6,25 sur base des matières sèches, de 91,4 % et avec un rendement total - en protéine de 83 %.
Exemple 3 (exemple d'application)
Cet exemple a été effectué afin de comparer les rendements en protéine, la qualité nutritive et certaines propriétés fonctionnelles de produits à base de protéine de soja préparés suivant les trois techniques suivantes :
A: La précipitation isoélectrique classique
pour la préparation d'un isolat de protéine de soja.
<EMI ID=115.1>
préparation de concentré de protéine de soja.
C: Le lavage isoélectrique suivant l'invention
<EMI ID=116.1>
nence, pour la préparation d'une p.v.p.
Afin de créer une comparaison valable du procédé de l'invention (C) avec les procédés classiques de préparation de protéine de soja (A et B), on a utilisé la même substance brute dans les trois cas. De même, les essais ont été effectués de telle manière que les températures correspondantes et les durées de traitement soient les mêmes dans les trois cas. Uniquement les valeurs de pH étaient différentes étant donné les différences fondamentales entre les trois essais.
A. La précipitation isoélectrique classique pour la
préparation d'un isolat de protéine de soja.
On a extrait 425,8 g de farine de soja (Sojamel
13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574,2 g d'eau
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NaOH 4 N. Après une agitation d'1 heure, on a centrifugé la suspension à 3000 x g pendant 15 minutes en utilisant quatre bechers d' 1 litre dans une -centrifugeuse de laboratoire
<EMI ID=118.1>
le précipité I ont été pesés. Le précipité I a été soumis à une nouvelle extraction avec de l'eau jusqu'à atteindre Un poids total de 4000 g. On a maintenu la
<EMI ID=119.1>
4 N et on a agité la suspension pendant 1 heure. On a effectué la centrifugation et le pesage du produit de centrifugation II et du précipité II comme décrit ci'dessus.
<EMI ID=120.1>
I et II et du précipité II pour les analyses suivant Kjeldahl et pour la mesure des matières sèches. Ensuite, les produits de centrifugation I et II ont été agités et
<EMI ID=121.1>
protéine par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation III a été pesé et analysé pour les déterminations Kjeldahl-N et les mesures de matière sèche. La phase solide III a été pesée et lavée à 7,'eau en une quantité correspondant au poids du produit de centrifugation I. Le lavage a été effectué en agitant
<EMI ID=122.1>
par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation IV et la phase solide IV ont été pesés. Le produit de centrifugation IV a été analysé pour la détermination de Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. La phase solide a été mise en suspension
<EMI ID=123.1>
moyen de 17 g de NaOH 4,N. Le mélange a été maintenu en agitation pendant 1 heure et on a de nouveau réglé le pH à 6,5, si nécessaire. Finalement, le produit a été lyophilisé, pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. Les calculs de bilan massique sont représentés au tableau 3.1.
Tableau 3.1 :Calculs du bilan massique de la précipitation
isolélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja. ,
<EMI ID=124.1>
B. Lavage isoélectrique pour la préparation d'un concentre
de protéine de soja.
On a lavé 425,6 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574 g d'eau à 50[deg.] C. On a réglé le pH à 4,5 au moyen de 44,8 g de HC1 6 N. On a effectué le lavage pendant 4 heures en agitant. La suspension a ensuite été centrifugée à 3000 x g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6B) utilisant 4 bechers d'1 1. Le produit de centrifuga-
<EMI ID=125.1>
suivant Kjeldahl-N et la mesure des matières sèches. La phase solide I a été pesée et lavée une nouvelle fois à l'eau jusqu'à un poids total de 4000 g. Le pH a de nouveau été réglé à 4,5 au moyen de 1,7 g de HC1 6N et on a main-
<EMI ID=126.1>
On a effectué une centrifugation et une pesée du produit de centrifugation II et des solides'Il comme précédemment.
La phase solide II a été remise en suspension dans 1575 g
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1>
C pendant une heure et on a de nouveau réglé le pH à 6,5, si nécessaire. Finalement le produit de protéine a été lyophilisé, pesé et analysé suivant Kjeldahl-N et pour
la mesure des matières sèches. Le bilan massique est '. représenté dans le tableau 3.2.
Tableau 3.2. :Calculs du bilan massique, du lavage isoélectrique
pour la préparation d'un concentré de protéine de soja..
<EMI ID=129.1>
C. Lavage isoélectrique comprenant une enzyme solubilisant
la rémanence, pour la préparation d'une p.v.p.
On a lavé 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3524,2 g d'eau à <EMI ID=130.1> 6 N. On a dissous 24 g de la préparation SPS-ase, KRF
68 Bill (exemple 1) dans 26 g d'eau et on l'a ajoutée au mélange de lavage. On a ensuite effectué le lavage pendant 4 heures sous agitation. On a ensuite effectué la purification comme décrit dans l'essai B, les quantité de HC1 6N, de NaOH 4 N et d'eau pour la nouvelle suspension étant les seuls paramètres présentant des valeurs différentes. Le bilan massique est représenté dans le tableau 3.3. Tableau 3.3.: Calcul du bilan massique du lavage isoêlectrique comportant une enzyme solubilisant la rémanence pour la préparation d'une p.v.p.
<EMI ID=131.1>
1) Analysé par Bioteknisk Institut, Holbersvej 10, DK-6000
Kolding, Danemark
2) Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis BOulevard 169,
DK-8000, Aarhus C, Danemark
Propriétés nutritives
<EMI ID=132.1>
de protéine ont été déterminées, voir tableau 3.4. La teneur totale en acides aminés essentiels, la teneur chimique et l'indice d'acides aminés essentiels (EAAI) sont calculés en utilisant le document de référence FAO de 1957.
La teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits a été déterminée au moyen de la méthode décrite dans A.O.C.S. Tentative Method Ba 12-75 (A.O.C.S. est une abréviation pour American Oil Chemists' Society). Les résultats sont représentés dans le tableau 3.5 qui comporte également les rendements et le rapport protéine/matière sèche des trois produits.
Tableau 3.4.: Composition d'acides aminés et évaluation nutritive
des trois produits de protéine A, B, et C
<EMI ID=133.1>
<EMI ID=134.1>
sur le- document de référence FAO de 1957.
Tableau 3.5.: Caractéristiques du processus et teneur en
inhibiteur de trypsine des trois produits de protéine A, B et C
<EMI ID=135.1>
Propriétés fonctionnelles
<EMI ID=136.1>
Nitrogen solubility index) a été déterminé respectivement, dans une dispersion de protéine à 1 % à pH 7,0 dans NaCl 0,2M et dans l'eau distillée. Après avoir agité pendant 45 minutes au moyen d'un agitateur magnétique, on a centrifugé la suspension à 4000 x g pendant.30 minutes et on a analysé le surnageant pour déterminer l'azote. La solubilité de l'azote a été calculée comme le rapport :. % N soluble/ % N total. Les résultats de cette détermination effectuée sur les trois produits sont représentés dans le tableau 3.6.
<EMI ID=137.1>
trois fois sur chaque produit par un titrage de Swift légèrement modifié. 4,0 g de (N x 6,25) du produit ont été mélangés dans 250 ml de NaCl 0,5 M au moyen d'un agitateur Sorval Omnimixer à vitesse lente. On a transféré 50 ml de la suspension dans un récipient mélangeur en verre et on y a ajouté 50 ml d'huile de soja. Le mélange total a ensuite été pesé. Le mélange huile-eau a ensuite été homogénéisé à 10.000 tours/minute, le récipient étant disposé dans un bain de glace. On a ajouté une quantité supplémentaire d'huile de soja à une vitesse de 0,3 ml par seconde jusqu'à ce que l'émulsion s'effondre. La quantité totale d'huile ajoutée avant le "point final" a été déterminée par pesage.
<EMI ID=138.1>
comme le nombre de ml d'huile par gramme de protéine
(N x 6,25). La densité de l'huile a été supposée égale à 0,9 g/ml.
Les résultats moyens de la détermination de la capacité d'émulsification des trois produits sont représentés au tableau 3.6.
<EMI ID=139.1>
250 ml d'une dispersion aqueuse des échantillons de protéine à la vitesse III pendant 4 minutes dans un agitateur Hobart (modèle N-50) comportant un fouet en forme de fil. L'expansion au fouettement a été calculée selon la formule
<EMI ID=140.1>
dans laquelle V représente le volume de fouettement final en ml.
La valeur V est mesurée en .remplissant le .récipient mélangeur avec de l'eau. On a doublé les essais de chacun des trois échantillons. Les résultats moyens sont représentés au tableau 3.6.
La stabilité de la mousse est déterminée en tant que rapport entre la quantité de mousse abandonnée après égouttage pendant 30 minutes et la quantité de mousse
<EMI ID=141.1>
précèdent a été introduit dans un cylindre en plastique
(diamètre 7 cm, hauteur 9 cm) comportant un filet à mailles
<EMI ID=142.1>
entonnoir monté sur un cylindre en verre et le poids (B) du liquide égoutté dans le cylindre en verre est mesuré. La stabilité de la mousse FS (foam stability) est déterminée par l'équation
<EMI ID=143.1>
<EMI ID=144.1>
tableau 3.6.
<EMI ID=145.1>
description en tant que la viscosité de Brookfield mesurée au moyen de mandrins T sur un statif de Brookfield.. Helipath. Les gels sont produits par traitement thermique de suspensions de protéine à 12 % dans du NaCl 0,5 M. Le traitement thermique a été effectué dans des bidons fermes ayant un diamètre de 7,3 cm et une hauteur de 5,0 cm, plongés dans un bain d'eau, pendant 30 minutes, maintenus à
<EMI ID=146.1>
mesures. Les résultats de ces mesures sont représentés dans le tableau 3.6.
Tableau 3.6.: Propriété fonctionnelles des trois substances
de protéine A, B, et C
<EMI ID=147.1>
Exemple 4 (exemple d'application)
On a produit une p.v.p. suivant.le processus décrit à l'exemple 3 C sauf que l'activité de cellulase était partiellement dérivée du Trichoderma reseei. La préparation de cette cellulase commerciale CELLUCLAST, produite par Novo Industri A/S, a été traitée au moyen d'une base à faible température de la manière suivante. Le pH d'une solution à 10 % de CELLUCLAST dans l'eau a été réglé à 9,2 au moyen de NAOS, et la solution résultante a été
<EMI ID=148.1>
cette température, on a réglé le pH à 4,7 au moyen d'acide acétique à 20 %. Cette solution a été maintenue à 5 [deg.]C pendant la nuit et ensuite été filtrée de manière stérile. Le produit de filtration a été lyophilisé. On a ajouté 4g
<EMI ID=149.1>
Bill (exemple 1). Les deux enzymes ont été dissoutes dans 172 g d'eau avant d'être ajoutées au mélange de lavage. Les déterminations du bilan massique de cet exemple sont. représentées dans le tableau 4.1.
L'essai prouve que cette préparation particulière de SPS-ase contient déjà une cellulase efficace étant donné qu'une addition de CELLUCLAST ne semble pas affecter le rapport protéine/matière sèche. Cependant, d'autres préparations de SPS-ase peuvent contenir moins de cellulase, par exemple KRF 92, voir le tableau précédant immédiatement l'exemple 2.
Tableau 4.1: Calculs du bilan massique du lavage isoëlectrique comportant une préparation de SPS-ase
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
Exemple 5 (exemple d'application)
<EMI ID=152.1>
dans l'exemple 3 C sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur de 5 et que le mélange réactionnel est <EMI ID=153.1>
des résultats analytiques en rapport avec les produits de centrifugation, on obtient un rendement théorique en protéine précipitée, comme montré dans le tableau 5.1. Tableau 5.1.: Rendements théoriques en protéine obtenus
lors de la production d'une p.v.p.
<EMI ID=154.1>
aMoyenne de 87,5 (Bioteknisk Institut) et 86,9 (Qvist's Laboratorium) ; la teneur en matière sèche est respective- ment 97,6 et 98,0 %. Calculé en tant que masse totale de protéine - la perte en protéine dans les produits de centrifuqations.
Exemple 6 : (exemple d'application)
Démonstration de la liaison protéique du SPS.
On a dissous 40 g de (Nx6,25) d'un isolat d'une protéine de soja commerciale (Purina 500E de Ralston Purina) dans 680 g d'eau. On a chauffé le mélange dans un
<EMI ID=155.1>
<EMI ID=156.1>
solution aqueuse contenant respectivement 0 g, 0,2 g, 0,4g 0,8 g et 1,6 g du SPS préparé comme décrit précédemment dans ce. mémoire. Les flacons ont ensuite été maintenus sous agitation au moyen d'un aimant dans un bain
<EMI ID=157.1>
On a ensuite centrifugé les. suspensions à 3000 x g pendant 15 minutes et les produits de centrifugation 1 ont été analysés suivant Kjeldahl-N et pour la détermination des matières sèches. Les phases solides ont été lavées à l'eau à température ambiante et centrifugées une nouvelle fois. Cette étape a été répétée. Ensuite on a dispersé les solides dans 50 ml d'eau et on a réglé le pH à 6,50 par une addition goutte à goutte de NaOH 6 N. Les produits neutralisés ont été lyophilisés et analysés suivant Kjeldahl-N et pour déterminer les matières sèches(MS). En se basant sur les analyses représentées au tableau 6.1, on a calculé le pourcentage de protéine. récupérée et le pourcentage de SPS qui a été lié à la protéine au moyen des formules représentées en relation au tableau 6.2.
Cet exemple démontre que le SPS est lié intimement à la protéine de telle sorte que le rapport protéine/ matière sèche diminue pour une teneur croissante en SPS.
Le rapport protéine/SPS présent dans la farine de soja correspond à une teneur en SPS comparable à environ 0,4 g dans 10 g d'eau, ajouté à 5 g d'isolat de protéine.
Le pourcentage de liaison du SPS est une valeur calculée. Le pourcentage de liaison du SPS diminue à cause de la saturation de la protéine en SPS aux faibles rapports protêines/SPS.
Tableau 6.1.: Mesures suivant l'exemple 6
<EMI ID=158.1>
Tableau 6.2.: Récupération de protéine et pourcentage de
liaison du SPS
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
NC 1 = pourcentage d'azote dans le produit de centrifugation I.
<2>) pourcentage de liaison du SPS =
<EMI ID=162.1>
<EMI ID=163.1>
le précipité séché, et
(% P/H)� se rapporte au précipité sans addition de SPS. Exemple 7 (exemple d'application)
Cet exemple décrit la préparation d'une p.v.p. en utilisant la préparation de SPS-ase KRF 92 B-I comportant 5 % de matière sèche. Le procédé de préparation est le même que celui de l'exemple 3 C, sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur 5. La p.v.p. a été analysée comme décrit à l'exemple 2. Les résultats obtenus dans l'essai apparaissent dans le tableau 7.1.
Tableau 7.1.: Résultats obtenus à l'exemple 7
<EMI ID=164.1>
aAnalysé par Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding.
Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C.
Exemple 8 (exemple d'application :
Cet exemple montre l'effet d'un pré-traitement de la farine de soja par une cuisson au jet de vapeur avant la préparation de.la p.v.p.
<EMI ID=165.1>
Une suspension de farine de soja dans l'eau consistant en 10 kg de farine de soja (Sojamel '13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) par 100 kg a été pompée à travers -un éjecteur de vapeur (type Hydroheater B-300) et mélangée avec de la vapeur à 8 Bar en une telle quantité et à une telle vitesse qu'on a pu maintenir une température finale de 150[deg.]C pendant 25 sec, dans un réacteur tubulaire pressurisé. Ensuite la pression a été réduite dans une chambre de détente (un cyclone) d'où la suspension a été envoyée dans un échangeur de chaleur à plaque dans lequel elle a été refroidie à environ 50[deg.]C. La boue refroidie a pu être utilisée telle quelle pour la préparation de p.v.p. suivant l'invention, mais, dans ce cas, la suspension .
a été séchée par pulvérisation à une température d'entrée
<EMI ID=166.1>
Préparation de la p.v.p.
Cette préparation a été effectuée de la manière suivante :
On a mis 70 g de matière sèche de farine de soja cuite au jet de vapeur et sèchée en suspension et on a maintenu sous agitation à 50[deg.]C dans 560 g d'eau et on a réglé le pH à 4,50 au moyen de 6,5 ml d'HCl 6N. On a
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
Erlenmeyer on a ajouté 10 g d'une solution contenant respectivement 0 g, 0,025 g, 0,050 g, 0,10 g, 0,20 g et 0,40 g de la préparation de SPS-ase KRF-68-B-III. Les mélanges réactionnels sont ensuite agités pendant 240 minutes
à 50[deg.]C. On a ensuite effectué une centrifugation pendant
15 minutes à 3000 x g.
Le surnageant a ensuite été analyse suivant la méthode de Kjeldahl-N et la phase solide a été lavée à l'eau à volumes égaux et a été centrifugée. cette opération
a été effectuée deux fois. La phase solide a ensuite été lyophilisée et analysée pour la détermination de Kjeldahl-N et des matières sèches.
Un essai semblable a été effectué avec une farine de soja non traitée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) utilisée en tant que substance de départ. Dans ce cas, les rapports de l'enzyme au substrat étaient de 0 %, 1 %, 2 %,
3 %, 4 % et 8 %.
En se basant sur la teneur en protéine des surnageants, on a pu calculer le pourcentage de protéinerécupérée . Le rendement en protéine est basé sur <EMI ID=169.1>
% après la réaction. Le tableau ci-dessous indique les résultats obtenus par les deux essais.
Tableau 8.1.: Rendements en protéine et rapport protéine/
matière sèche pour une p.v.p. préparée à .partir de farine:, de soja cuite ou brute.
<EMI ID=170.1>
En ce qui concerne les processus d'extraction
(isolation) appliqués à des substances différentes des protéines ou les processus de liquéfaction et les techniques qui y sont apparentées, on se référera au schéma général de procédés pour des applications, comme représente au tableau
<EMI ID=171.1>
Le substrat peut consister en un ou plusieurs hydrates de carbone présents dans la substance brute ou bien il peut consister en la totalité de la substance brute.
Ce substrat peut être soumis à un prétraitement de nature chimique ou physique, comme expliqué plus loin à
titre d'exemple, constitué par un traitement acide ou alcalin, un trempage ou un mouillage et/ou une cuisson avec ou sans vapeur.
La'substance brute peut être macérée, coupée, moulue
à l'état humide et/ou homogénéisée (tous ces traitements
<EMI ID=172.1> avec ou sans addition d'eau, d'autres additifs pouvant
être ajoutés pendant cette étape. L'homogénéisation peut être effectuée avec différents degrés d'efficacité, différentes pressions n'étant, par exemple, qu'une fraction de la pression maximum donnée pour l'équipement d'homogénéisation spécifique utilisée. On peut ajouter différents additifs avant ou pendant l'homogénéisation, comme représen-
<EMI ID=173.1>
Le processus réactionnel y compris la préparation de la SPS-ase est effectué dans des conditions spécifiques, par exemple de température, de pression, de durée, de pH et; de dosage d'enzyme; de même, des recommandations concernant le réacteur utilisé (par exemple discontinu,écoulement tamponné) et l'agitation, si nécessaire, sont importantes. On peut utiliser une série d'additifs pour différentes substances
<EMI ID=174.1>
De même, les opérations de séparation peuvent être effectuées avec différents degrés. d'efficacité. Dans de nombreux cas, la séparation est omise ou facilitée, par exemple lorsque la substance brute est complètement liquéfiée. On peut utiliser différents dispositifs de séparation (par exemple des centrifugeuses, des filtres, des dispositifs d'ultrafiltration, des hydrocyclones, des épaississeurs, des tamis ou cribles ou des simples décanteurs) .
L'efficacité de la séparation est définie comme la proportion entre la teneur absolue en boues dans la phase des solides et la teneur absolue en boues du mélange réactionnel.
Les phases liquides ou solides obtenues peuvent être traitées ultérieurement,par exemple concentrées, séchées ou .être extraites par solvant, afin d'éliminer certaines composants comme la graisse ou l'huile; elles peuvent également fermenter pour produire une biomasse, de l'alcool ou d'autres produits (des enzymes, des antibiotiques ou d'autres composants utilisables).
De même, les produits obtenus peuvent être recyclés dans le processus de manière à répéter le traitement.
<EMI ID=175.1>
ou réutilisation en tant que substrat Les exemples qui suivent montrent des applications des préparations de SPS-ase et la liste suivante donne un résume de ces applications.
De même, le tableau 1 annexé indique certaines caractéristiques concernant le tableau synoptique n[deg.] 3.
<EMI ID=176.1>
d'exemples.
<EMI ID=177.1>
<EMI ID=178.1>
A 1. Extraction d'amidon de mais, de blé et de pommes de
terre.
L'extraction d'amidon de maïs, de blé, de pommes de terre et d'autres plantes contenant de l'amidon est ; effectuée par l'une ou plusieurs des étapes suivantes :
macération, broyage à l'eau et séparation. L'utilisation d'une préparation de SPS-ase ne comportant essentiellement aucune activité amylolytique fournit les avantages suivants, le maïs étant utilisé à titre d'exemple :
1. La libération d'amidon est facilitée pour
une période de macération plus courte,
2. La consommation d'eau peut être réduite,
3. La libération du germe de mais est facilitée
sans libération de l'huile du germe de mais,
<EMI ID=179.1>
plus élevée,
5. La récupération de l'eau de macération de
mais est facilitée.
A 2. Extraction de lipides de substances végétales.
Etant donné que les lipides d'une substance végétale sont enfermés à l'intérieur de cellules et généralement liés aux protéines, on peut extraire les lipides en phase aqueuse en les traitant avec une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte de lipases. Ainsi, l'huile de germe de mais est normalement isolée par extraction à l'hexane des germes sèches de maïs. Cependant, l'opération de séchage est superflue si les germes de maïs humides sont
<EMI ID=180.1>
tionné. De manière analogue, l'extraction de l'huile d'olive en phase aqueuse peut être améliorée, si .?'enzyme utilisée pour le traitement enzymatique est une préparation de SPS-ase du genre susmentionné, voir, par exemple, Food, Pharmaceutical and Bioengineering, No. 172, volume 74, pages 93 à 94. De même, l'extraction aqueuse, par exemple, de l'huile de soja, l'huile de colza et l'huile de tourne-sol peut être améliorée de manière analogue.
A 3. Extraction d'huiles éthériques de substances végétales
Si des substances végétales contenant des huiles éthériques sont extraites au moyen d'une solution aqueuse d'une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'activité enzymatique capable de décomposer ou de modifier d'une autre manière les huiles ëthériques, celleci sont récupérées en des rendements élevés, à des frais très bas.
A.4. Extraction de colorants naturels de substances végétales.
Si l'on traite des substances végétales contenant des colorants, par exemple des racines de betteraves contenant le colorant rouge bëtanine ou le colorant contenu dans les airelles, avec une préparation de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'activités enzymatiques capables de décomposer ou de modifier d'une autre manière. les colorants, ceux-ci sont récupérés en de hauts rendements, à des frais très bas.
A 5. Extraction de caoutchouc du buisson guayul.
Un autre exemple de substrat pour une prépara-.. tion de SPS-ase qui est essentiellement exempte d'une activité enzymatique capable de décomposer le caoutchouc naturel est la substance de parois cellulaires dans les racines et branches du buisson guayul.
Ba.l. Production d'un substitut de lait pour animaux domestiques, de préférence un substitut de lait pour veau..
On peut produire un- substitut de lait pour veau qui est soluble dans l'eau froide à un pH d'environ 4,5 par une liquéfaction complète en milieu aqueux de fèves de soja, de graines de tournesol, de graines de cotcn, de fèves faba ou de pois. des champs. En utilisant une
substance brute contenant de l'amidon comme des fèves faba ou pois des champs, on peut 'accomplir la liquéfaction de l'amidon au moyen d'une alpha-amylase avant, après ou pendant le traitement avec la SPS-ase qui solubilise fins- . lement les polysaccharides qui ne sont pas de l'amidon et qui sont présents en tant que substance formant la structure des parois cellulaires. On montre un exemple détaillé ci-dessous, en utilisant des fèves faba, qui sont comparées au
<EMI ID=181.1>
soja peut, de préférence, consister en une cuisson par jet de vapeur, ce qui améliore la solubilisation de la rémanence.
Exemple Ba 1.1
On met 15 kg de farine de fève faba (Farine de Fèves des GRANDES MINOTERIES A FEVES DE FRANCE, Paris) en sus�ension dans 35 litres d'eau. On ajoute 75 g de Termamyl
<EMI ID=182.1>
en utilisant un. récipient à chemise de vapeur et en agitant.
La suspension a ensuite été traitée à cette température pendant 60 minutes. Ensuite on a réglé le pH à 4,5 et le
<EMI ID=183.1>
la préparation de SPS-ase KRF 68 dans 1 litre d'eau et on l'a ajouté à la suspension. La réaction a été effectuée pendant 440 minutes. Lorsqu'on a introduit 10 g de Fungamyl 800 L la fraction d'amidon a été transformée principalement en disaccharide (maltose). Ensuite, le mélange
<EMI ID=184.1>
aliquote du produit est ensuite lyophilisée et utilisée pour des essais de stabilité.. L'échantillon a ensuite été solubilisé à 10 % de matière sèche et la solution du produit a pu être maintenue stable sans sédimentation pendant plusieurs jours.
De la graisse ou de l'huile fondue peut être facilement émulsifiée dans le produit en obtenant une composition finale très semblable au lait de vache. Une émulsion contenant 3,5 % d'huile (huile de soja) a également pu être maintenue stable sans sédimentation pendant plusieurs jours.
Exemple Ba 1.2
<EMI ID=185.1>
25 secondes, comme décrit à l'exemple 8, de la farine de soja (Sojamel 13). La farine de soja cuite au jet de vapeur a été sèchée par pulvérisation et utilisée pour des recherches ultérieures décrites ci-après.
A:
On a mélangé 50 g de farine de soja cuite au jet de vapeur avec 450 g d'eau et on a réglé le pH à 4,5 au moyen de 4,1 ml de HC1.6 N. Le mélange a ensuite été chauffé à 45[deg.]C dans un bain d'eau, et on a ajouté 0,250 g de la préparation de SPS-ase KRF-68 au mélange chauffé que . l'on a fait réagir pendant 5 heures sous agitation. Ensuite, on a chauffé le mélange à 80[deg.]C pendant 2 minutes afin d'inactiver l'enzyme. On a centrifugé un échantillon de 100 ml à température ambiante pendant 15 minutes à 3000
x g (g = gravité). Le surnageant a été soumis à un échange ionique et a été analysé par HPLC pour déterminer la composition de l'hydrate de carbone. Le surnageant a également été analysé pour la détermination de l'azote par la méthode de Kjeldahl, des matières sèches et du degré de solubilité ; de l'azote (nitrogen solubility index NSI); on a également calculé le degré de solubilité des matières sèches (dry matter solubility index DSI) ; voir les résultats du tableau Ba I. On a introduit 100 ml du mélange réaction-
<EMI ID=186.1>
<EMI ID=187.1>
dispersion ( % ) a été mesurée en lisant le volume des dis- . persions obtenues (tableau Ba II) après 1 et 2 jours.
On a ajouté 8 g d'huile de soja à 200 ml du mélange réactionnel (à 20[deg.]C). On a préparé une émulsion en mélangeant pendant 2 minutes dans un mélangeur de Waring. La 'stabilité de l'émulsion (%) a été mesurée comme cidessus après 1 et 2 jours.
B:
On a effectué une réaction comme ci-dessus, dans ce cas, cependant, on a utilisé 1,00 g de la préparation de SPS-ase. On a effectué les mêmes genres d'analyse et de mesures de stabilité que ceux décrit à la partie A. Les
<EMI ID=188.1>
Des analyses chimiques des surnageants, il
<EMI ID=189.1>
dans l'essai B sont plus élevées que celles obtenues pour l'essai A. Cependant, les essais de stabilité effectués sur les mélanges réactionnels donnent une meilleure valeur pour les échantillons A. Ceci est probablement dû à la plus grande longueur de la chaine de peptides des protéines du mélange réactionnel résultant du dosage plus faible en enzymes.
De la composition de l'hydrate de carbone déterminée par HPLC, il apparaît que l'on produit principalement des monosaccharides et des disaccharides. De ce fait, des oligosaccharides dont il est connu qu'ils provoquent la diarrhée et la flatulance lorsqu'on les donne aux veaux en de quantités trop importantes, ne sont présentes qu'en de faibles quantités.
Tableau Ba I. Propriétés chimiques du surnageant.
<EMI ID=190.1>
*NSI = Degré de solubilité de 'azote
<EMI ID=191.1> Tableau Ba II. Essais de stabilité des mélanges réactionnels
<EMI ID=192.1>
Ba 2. Production de substances brutes contenant de l'amidon
saccharifié.
En ce qui concerne la saccharification du manioc et de patates douces et d'autres substances végétales contenant de l'amidon, l'addition d'une préparation de SPSase peut résoudre des problèmes de viscosité. En utilisant une préparation de SPS-ase, il est possible de produire des ,
<EMI ID=193.1>
sèches de 25 à 30 %, et après saccharification, la pâte peut fermenter pour obtenir un éthanol bon marché.
Exemple Ba 2.1
On prépare une purée présentant une teneur en matières sèches de 24 % à partir de patates douces (Japon) fralches et râpées. La teneur en amidon des patates douces se situe aux environs de 70 % de la teneur en matières sèches de celles-ci. Une première liquéfaction au moyen
<EMI ID=194.1>
0,5 kg/t. d'amidon a été effectuée en chauffant la purée à
<EMI ID=195.1>
<EMI ID=196.1>
réactionnel au moyen d'un fuseau HAAKE à 90[deg.] C.
On a ensuite fait refroidir le mélange réaction-
<EMI ID=197.1>
en un dosage de 1,75 litre/tonne d'amidon. Le mélange de saccharification a ensuite été divisé en trois parties, A, B et C qui ont été traitées pendant 15 minutes par des enzymes comme représenté ci-dessous avant qu'on ne mesure la viscosité : <EMI ID=198.1> viscosité � 2 a été mesurée, voir tableau Ba III.
B: On a ajouté la cellulase Tricoderma viride
<EMI ID=199.1>
par tonne de matières sèches de patates douces.
La viscosité ^ - a été mesurée, voir tableau Ba III.
C: On a ajouté la préparation de SPS-ase KRF-68
en une quantité de 0,25 kg/tonne de matières sèches de patates douces. On a mesuré la
<EMI ID=200.1>
Tableau Ba III : Viscosités
<EMI ID=201.1>
Ainsi, on peut donc constater que la viscosité du mélange réactionnel peut effectivement être réduite au moyen de la SPS-ase à dosage faible . par rapport au CELLUCLAST R et au SAN 150.
Ba 3. Liquéfaction complète de poires ou d'autres fruits.
Si l'on traite ultérieurement avec une préparation de SPS-ase des poires entières qui ont été écrasées mécaniquement, on effectue une liquéfaction complète et on produit un jus de poires clair après avoir éliminé de faibles quantités de matières solides. Un procédé analogue peut être utilisé pour d'autres fruits semblables, par exemple les pommes.
exemple Ba 3.1.
Des pommes fraîches sont grossièrement broyées au moyen d'un broyeur central Bûcher. La purée de pommes
<EMI ID=202.1>
pendant 5 minutes, et elle est ensuite refroidie à température ambiante. Les pommes pré-broyées sont ensuite écrasées une deuxième fois dans un broyeur Fryma comportant un appa-
<EMI ID=203.1>
Contraves Rheomat 15 en agitant et en effectuant simultanément la mesure de viscosité (par rapport à un pourcentage lu sur le Rhéomètre à vitesse 13). Après la fin de la réaction enzymatique on a retiré un échantillon de 100 g et on l'a centrifugé dans un tube gradué à 3000 x g pendant
15 minutes. A ce stade, on a mesuré le pourcentage de jus et le pourcentage de dépôt. On a également mesuré le pH et le pourcentage en matières sèches au réfractomètre, en
<EMI ID=204.1>
l'effet de la SPS-ase, la combinaison de Celluclast et de SPS-ase et la combinaison de Celluclast et de Pectinex. On a utilisé la préparation de SPS-ase KRF-68.
Tableau Ba IV: Résultats des essais de liquéfaction totale
avec une purée de pommes à 50 [deg.]C pendant 30 minutes
<EMI ID=205.1>
Ba 4.Production de jus par traitement de fruits et de
végétaux.
On a trouvé que des préparation de SPS-ase conviennent bien pour la production de jus par traitements de différents fruits, baies et de végétaux, par exemple la .carotte, les pois , les tomates, les pommes, les poires, le cassis, les fèves et le choux. Dans ce cas, on obtient des rendements améliorés en jus et une meilleure extraction des pigments et arômes par rapport aux préparations commerciales de pectinase et de cellulase.
;Exemple Ba 4.1.
On se réfère à l'exemple Ba 3.1 dans lequel on a comparé la préparation de SPS-ase aux produits commerciaux
<EMI ID=206.1>
être légèrement amélioré avec seulement 50 g/hl de SPS-ase par rapport à 2000 g/hl de Pectinex � les deux étant en combinaison avec 50 g/hl de Celluclast � La viscosité était également légèrement plus basse. De ce fait, iL semble que la SPS-ase est environ 40 fois plus efficace que le Pectinex.
Ba 5. Traitement concernant l'extraction ou le pressage de
la canne à sucre ou de la betterave à sucre.
On a trouvé qu'il est possible d'améliorer le rendement de processus de simple extraction, si l'on utilise la préparation de SPS-ase pour le traitement de la canne à sucre ou de la betterave à sucre avant et/ou pendant l'extraction ou le pressage de celles-ci. De même, la rémanence (la bagasse) peut être traitée avec la préparation de SPS-ase, ladite rémanence étant partiellement convertie en sucres fermentables qui peuvent être utilisés en tant que substance brute pour une fermentation d'éthanol.
Exemple Ba 5.1
On a broyé 2 fois, dans un broyeur Fryma (type MZ-110), 10 kg de rémanence de betterave sucriëre (pulpe) obtenue par une extraction continue à contre-courant dans un diffuseur-DDS chez Nakskov Sugar Factory. On a ajouté de l'eau de. traitement pendant l'opération de broyage.
On a traité par enzyme des fractions de 300 g de pulpe à 45[deg.]C pendant 18 heures au moyen des dosages d'enzymes représentés au tableau Ba V. On a ajouté le produit enzymatique sec (KRF-68) à la pulpe qui a été agitée par une tige pendant la première heure. Ensuite, la pulpe a été liquéfiée de manière à pouvoir effectuer une agitation par agitateur magnétique pendant le temps restant. A la fin de la réaction on a mesuré le pH (on n'a pas effectué de correction de pH pendant le début de la réaction) et on a centrifugé le mélange réactionnel jusqu'à ce que l'on obtienne un surnageant clair. On a effectué des déterminations de matières sèches du mélange réactionnel et des surnageants. Les pourcentages de matières sèches solubilisées ont été calculés sur base de ces résultats. Les corrections ont
<EMI ID=207.1>
tous les calculs.
Les surnageants N[deg.]s 2, 3 et 4 ont été soumis à un échange ionique et ont été analysés par HPLC pour déterminer La composition des hydrates de carbone.
Tableau Ba V. Résultats obtenus par une liquéfaction
enzymatique d'une pulpe de betterave
<EMI ID=208.1>
Conditions de réaction : M = 300 g
S = 4,18 % de matières sèches E/S comme montré ci-dessus pH non réglé T = 450C
t = 18 heures Tableau Ba VI : Données HPLC
<EMI ID=209.1>
Tous les sucres formés suivant le tableau Ba VI ci-dessus peuvent fermenter en alcool ou être utilisés dans d'autres buts.
Ba 6. Production de lait de soja
On peut facilement produire du lait de soja par une liquéfaction totale de soja broyé et par une homogénéisation ultérieure du mélange obtenu. Le lait de soja est souvent produit en trempant les fèves de soja dans de l'eau bouillante, en broyant les fèves imprégnées .en extrayant l'eau et . en . séparant ensuite les résidus insolubles, par exemple les protéines et les polysaccharides. Afin d'améliorer le rendement en lait de soja, ces résidus insolubles peuvent être liquéfiés par réaction avec la SPS-ase
Exemple Ba 6.1
Le procédé de production de lait de soja est expliqué plus en détail par les séries de réaction enzymatique suivantes, les calculs du degré de solubilité de protéine (PSI, %, protein solubility index) et du degré de solubilité de matières sèches (DSI, %, dry matter solubility index) représentent les rendements obtenus après séparation à pH 7 (voir tableau Ba VII). Les réactions enzymatiques ont été effectuées dans les conditions suivantes :
Substrat : farine de soja non dégraissée (Dansk Sojakage-
fabrik A/S)
Masse du mélange réactionnel 220 g
Masse du substrat 20 g
<EMI ID=210.1>
Temps de réaction : Séries A: 1 heure Temps de réaction Séries B: 0,5 à 6 heures Enzyme SPS-ase (KRF-68) Quantité d'enzyme Séries A: rapport E/S
(poids/poids) 0 à 8,0 % Séries B: rapport E/S
(poids/poids) : 1,0 %
<EMI ID=211.1>
et on a effectué une séparation par centrifugation à 3000x g, pendant
<EMI ID=212.1>
<EMI ID=213.1>
<EMI ID=214.1>
Ba 7. Traitement destiné à accroître la quantité
récupérable de .matières.solubles de café.
On a trouvé que le traitement de graines de café à différentes étapes, pendant la production de café instantané, résulte en une 'augmentation du rendement ..de matières solubles de café.. Ainsi , par exemple,.le marc de café épuisé ou des graines vertes peuvent être traitées par des enzymes avec des résultats avantageux.
Bb 1. Prévention et/ou décomposition du louche de pomme
Après la production d'un jus de pomme ou de poire ou d'autres jus de fruits, qui doivent être clairs et qui ont antérieurement été traités avec des préparations de pectinase et cellulase classiques afin d'éviter la forma-' tion de turbidité, il peut apparaître un louche de pomme
ou des louches de fruits analogues. On a trouvé que des préparations'de SPS-ase conviennent bien pour .la décomposition de tels louches qui consistent principalement en arabanne liée aux protéines.
Exemple Bb 1
On a constaté que le concentrat de jus de poire produit par liquéfaction enzymatique de déchets de conser-
<EMI ID=215.1>
été analysé par HPLC. Le chromatogramme montre de l'arabinose et de faibles quantités d'oligosaccharides.
En faisant incuber 0,5 % poids/volume de cet hydrate de carbone dans 1 mM de tampon acétate à pH 4,5,
<EMI ID=216.1>
1:1) présentant une concentration en enzyme de 0,05 % poids/volume, on a trouvé que 84 % de l'hydrate de carbone du louche initial (matière sèche) ont été transformés en arabinose.
On a également traité un concentré de poire dilué
<EMI ID=217.1> d'enzyme SPS-ase susmentionée de 0,15 % poids/volume ou
<EMI ID=218.1>
de 1 % poids/volume. On a trouvé que la SPS-ase était capable de réduire de 86 % la surface relative du pic HPLC du louche semblable à l'arabanne, alors que la réduction correspondante au noyen de Clarex � (utilisé en une quantité nettement supérieure à la préparation de SPS-ase) n'était que de 78 %.
Bb 2. Utilisation en tant que agent clarifiant de vin
blanc.
On a trouvé que les vins blancs présentant une turbidité très indésirable peuvent être clarifiés efficacement au moyen d'une SPS-ase. On a montré que la substance trouble consiste principalement en arabinogalactanes qui sont liés à des résidus d'hydroxyproline dans une protéine structurelle de parois cellulaires.
Bb 3. Production de ISSPH ou d'autres hydrolisats de
protéine végétale.
Avant la séparation du ISSPH (isoelectric soluble soy protein hydrolyzate - hydrolisat de protéine de soja, isoélectriquement soluble) ou d'autres hydrolysats de protéine végétale de la boue, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis N[deg.] 4.100.024 ou dans Process Biochemistry, vol.
<EMI ID=219.1>
le mélange réactionnel avec une préparation de SPS-ase.
Ceci permet d'obtenir une séparation plus facile.
Bb 4. Enzyme de brassage pour l'industrie de la bière.
Dans la production d'hydrates de carbone de bière à partir de substances brutes, par exemple les beta-glucannes de malt et d'orge,on observe une influence sur la viscosité et la filtrabilité du moût. L'addition d'une SPS-ase pendant le brassage réduit la viscosité du moût et améliore sa filtrabilité ainsi que le rendement à l'extraction. En outre, l'addition d'une SPS-ase pendant le brassage augmente la fermentabilité du moût ainsi que la teneur en azote dans le moût.
Exemple Bb 4.1
<EMI ID=220.1>
gruau d'avoine moulu consistant en 50 % de malt et 50 % d'orge avec 275 gr d'eau (15 % de matières sèches) selon
<EMI ID=221.1>
Afin de prouver l'effet de la SPS-ase on a effectué quatre essais, voir le tableau donné ci-dessous, dans lesquels les enzymes ont été ajoutés pendant le brassage
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
BGU représente des unités de bêta-glucanase déterminées selon le procédé analytique AF 70/4-GB, disponible chez NOVO Industri A/S.
FBG représente des unités de béta-glucanase fongiques déterminées selon le procédé analytique AF 70.1/ 2-GB disponible chez NOVO Industri A/S.
La seule différence entre BGU et FBG est le pH auquel on effectue la détermination de l'enzyme : pH 7,5 pour BGU et pH 5,0 pour FBG.
<EMI ID=224.1>
bactérielle décrite dans le document d'information B 214bGB 1500, Juillet 1981, disponible chez NOVO Industri A/S.
Exemple Bb 4.2'
Au laboratoire, on a brassé ensemble 50 g de gruau d'avoine moulu consistant en 40 % de malt et 60 % d'orge avec 150 g d'eau (25 % de matières sèches) selon le schéma de brassage suivant : 45[deg.]C (60 minutes)/63[deg.]C
<EMI ID=225.1>
Afin de prouver l'effet de la SPS-ase on a effectué .trois essais, cfr. le tableau ci-dessous, dans lesquels on a ajouté les enzymes pendant le brassage (pH de la boue 5, 5 - 6,0).
<EMI ID=226.1>
La définition de BGU et FBG est la même que celle donnée à l'exemple Bb 4.1 La dernière colonne du tableau ci-dessus ne donne que l'activité et la quantité provenant de la SPS-ase comme indiqué.
Ceremix est une préparation de béta-glucanase bactérielle décrite dans le document d'information B 216 b-GB 1000, Février 1982, disponible chez NOVO Industri A/S.
<EMI ID=227.1>
la fermentation et/ou le stockage de la bière.
On peut ajouter de la SPS-ase pendant la fermentation du motlt ou pendant le stockage de la bière afin de réduire la teneur en béta- glucannes et pour améliorer la filtration de la bière et la stabilité de celle-ci par rapport au louché. La SPS-ase exerce également un effet sur les protéines responsables d'un louche se formant à froid.
Bb 6. Agent destiné à enlever la peau de l'amande.
Pendant l'étape mécanique qui consiste à enlever la peau des amandes, qui suit l'étape d'émondage .. les amandes, un certain pourcentage de peau d'amandes n'est pas éliminé. On a trouvé qu'un traitement enzymatique des amandes provoque une diminution du pourcentage indiqué cidessus.
Bc 1. Décomposition de différents déchets.
Dans certains procédés de fabrication, on produit de grandes quantités de carbohydrates -contenus dans des déchets,. Ceci est le cas, par exemple, lors de la production d'un isolat de soja par extraction à l'eau et précipitation au moyen de l'acide, de lait de soja et de tofu
(un type particulier de fromage japonais) .'A cet égard, on peut également citer la pulpe résiduelle des pommes, des poires ou des agrumes. On a trouvé qu'une préparation de SPS-ase est capable de liquéfier complètement ces déchets contenant des hydrates de carbone et de produire des sucres fermentables qui peuvent être utilisés en tant que substance de départ pour une fermentation d'éthanol.
Exemple Bc 1.1
Lors de la production classique de lait de soja
ou de tofu, on plonge souvent les fèves de soja dans l'eau bouillante, mélange et extrait avec de l'eau chaude, après quoi on effectue une séparation. Le résidu de cette séparation est la substance utilisée dans cet essai. La phase liquide est constituée par le lait de soja qui peut être traité ultérieurement pour produire du tofu.
On a broyé 10 kg de fèves de soja entières obtenues chez Aarhus Oliefabrik A/S simultanément avec 70 litres d'eau bouillante dans un broyeur Fryma du type. MZ
110. La boue de broyage a été maintenue au-dessus de 85[deg.]C pendant 15 minutes afin d'inactiver les enzymes de graines naturelles qui développent l'odeur désagréable connue du soja. Ensuite. on.. centrifuge 5 litres de cette boue de soja dans le laboratoire pendant 15 minutes à 3000 x g (g = gravité).
<EMI ID=228.1>
et 20,06% de matières sèches (mesures faites en double, moyenne calculée : 20,26%). On a ajouté lentement du HC1 6 N qui a été trituré dans la rémanence au moyen d'une spatule jusqu'à ce qu'un pH-mêtre indique 4,50, lorsque l'électrode est introduite directement dans la masse.
<EMI ID=229.1>
des réactions d'enzyme avec 2 x 200 g de la masse avec les deux dosages de SPS-ase (KRF-68), E/S = 0,5 % par rapport aux matières sèches et E/S = 3,0 % par rapport aux matières sèches. L'enzyme sèche a été ajoutée à la masse. Pendant les 1 à 2 premières heures, on a effectué l'agitation au moyen d'une spatule et ensuite la masse a été liquéfiée à une telle mesure que l'on puisse efficacement effectuer l'agitation au moyen d'un agitateur magnétique. Le temps de réaction total était de 21 heures. On
<EMI ID=230.1>
durée de la réaction (Advanced Digimatic 3DII disponible chez Advanced Instruments Inc.). Les résultats du tableau <EMI ID=231.1>
l'essai, les mélanges ont été centrifugés à 3000 x g pendant 15 minutes. Une couche d'huile est apparue à la surface du surnageant et le volume de celle-ci a été déterminé. Une couche de boue non tassée :est.apparue comme couche de fond. Le surnageant contenant l'huile a été retiré au moyen d'une pipette. L'huile a été combinée avec la phase d'eau claire par homogénéisation et on
a retiré un échantillon pour la détermination des matières
<EMI ID=232.1>
clairement que ce déchet peut être liquéfié par une réaction enzymatique et que l'on peut produire de l'huile brute comme, mentionné à la partie A 4. Après avoir récupéré.l'huile, on peut utiliser de différentes manières la rémanence solubilisée, par exemple pour une fermantation en composés utilisables ou par une utilisation en tant que aliment pour bétail ou produit alimentaire après concentration et séchage ou pour des produits -utiles après une purification ultérieure.
Tableau Bc I. Résultats obtenus lors de la liquéfaction
de lait de soja et de boue de tofu.
<EMI ID=233.1>
Bc 2. Saccharification et fermentation simultanées.
Les substances végétales contenant des hydrates de carbone, par exemple les tubercules comme les topinambours, les pommes de terre, les patates douces, le manioc ou la pulpe de tels tubercules, à savoir la substance restant après avoir éliminé les composants extraits, peuvent être saccharifiés par un traitement avec une préparation de SPS-ase et, simultanément, les saccharides fermentables obtenus peuvent être fermentés en éthanol.
Exemple Bc 2.1
La production d'éthanol par fermentation des topinambours décomposés contenant de l'inuline à été expérimentée à l'échelle de laboratoire par une saccharification simultanée avec une SPS-ase et une inulinase et par quatre prétraitements différents des topinambours. SPS-ase : On a utilisé la préparation de SPS-ase KRF-68. Inulinase : L'inulinase a été produite par fermentation de Asp. ficuum (CBS 55 565). L'activité d'inulinase est déterminée comme décrit dans Research Disclosure No. 21234
(Décembre 1981) p. 456 à 458.
Fermentation au laboratoire : On a fait fermenter des fractions de 150 gr de purée prétraitée (décrite plus loin) après avoir ajouté 4,5 g de levure de boulangerie et 1 ml d'une solution de Pluronic à 4 % en tant qu' agent antimoussant. Les flacons de fermentation sont munis de pièges de C02 contenant de l'acide sulfurique à 98 % et la fermentation est suivie par une mesure de la perte en poids
<EMI ID=234.1>
pendant la fermentation qui est effectuée à 30[deg.]C. On a utilisé trois flacons pour chaque paramètre étudié.
Dans le tableau Bc II, la perte en poids due à
<EMI ID=235.1>
Prétraitements des topinambours :
Traitement A : On a effectué une cuisson suivant le procédé
de Henze de 14,1 kg de topinambours à 140[deg.]C
<EMI ID=236.1>
poids après cuisson était de 19,0 kg
( 16,9 % de matière sèche). Les fermen- <EMI ID=237.1>
la purée.
Traitement B : Des topinambours lavés et coupés en tranches
ont été mélangés avec de l'eau (1:1) et ont été mêlés dans un mélangeur Waring. La purée a ensuite été soumise à un traitement thermique pendant une heure, à 85[deg.]C et à pH=4,5. Traitement C : Comme le traitement B, mais le pH n'a pas
été réglé.
Traitement D : Comme le traitement B, mais on n'a pas effectué de traitement thermique et on n'a pas règle le pH.
Résultats : Les résultats du tableau Bc II montrent l'effet de l'addition d'une SPS-ase à la purée prétraitée sur le rendement en éthanol. On a obtenu une amélioration nette du; rendement en éthanol sur toutes les purées prétraitées lorsqu'on a ajouté une SPS-ase.
Tableau Bc II. Résultats de fermentation lors d'une fermentation
simultanée et d'une saccharification enzymatique de topinambours.
<EMI ID=238.1>
Bc 3. Décomposition de cellulose
On a trouvé que des substances contenant de la cellulose comme de la paille, par exemple la paille de blé, la sciure, du papier et de la lignocellulose, peuvent être hydrolysées en une mesure plus grande au moyen d'une préparation de SPS-ase qu'avec des cellulases 'classiques .Ceci est montré par l'exemple suivant dans lequel une substance de cellulose cristalline (AVICEL) est traitée au moyen
<EMI ID=239.1>
Exemple Bc 3.1
On a mis l' Avicel en suspension dans l'eau (20%
<EMI ID=240.1>
heures, on a filtré la boue et on a mesuré la teneur en sucre réducteur (mg de glucose/g AVICEL). En utilisant des quantités d'enzyme de 5 et 20 % de la teneur en cellulose, on a obtenu les valeurs suivantes.
Tableau Bc III.
<EMI ID=241.1>
Bc 4. Application en tant que additif de cuisson.
On a également constaté que les préparations, de SPS-ase conviennent particulièrement comme additifs
(adjuvants) de cuisson de boulangerie. Ainsi, lorsqu'on ajoute une préparation de SPS-ase à une farine sèche, avant production de la pâte, il est possible d'obtenir ur. pain présentant une qualité supérieure en ce qui concerne le volume, la mie et le goût. De ce fait, il est possible d'obtenir un pain de haute qualité avec une farine de blé de moins bonne qualité si on utilise la préparation de ' SPS-ase en tant que additif.
Bc 5. Amélioration du rendement en alcool et en biomasse pendant la fermentation de la liqueur de sulfite dans la production du papier.
On a également trouvé que le rendement en éthanol peut être amélioré si l'on traite la liqueur de sulfite du papier avec une préparation de SPS-ase avant qu'elle ne soit utilisée à titre de source d'hydrate de carbone pour la fermentation 'en éthanol. La liqueur de sulfite du papier peut également être utilisé pour la production de biomasse, par exemple une protéine unicellulaire, par fermentation : même dans ce cas, le rendement en biomasse a été amélioré lorsqu'on a traité préalablement la liqueur de sulfite avec une préparation de SPS-ase. De même, la décomposition due à la présence de la préparation de SPS-ase et la fermentation peuvent être effectuées simultanément.
Bc 6. Assèchement de produits de boue biologique.
Lors d'extraction classique à l'eau de nombreuses substances biologiques provenant de substances végétales brutes, on obtient de grands volumes de résidus insolubles consistant en grande partie de polysaccharides gonflés.
Ce cas se présente, par exemple lorsqu'on produit du lait de soja, du tofu ou un isolat de soja par extraction à l'eau :de fèves de'soja,de farine de soja dégraissée ou de flocons blancs . La substance de polysaccharides gonflés structurée, peut ensuite être traitée en une petite mesure avec une SPS-ase, ce qui ouvre la structure en réseau de la substance et, de ce fait, il n'y a que de faibles quantités d'hydrates de carbone qui sont solubilisés. Ainsi, la
<EMI ID=242.1>
une teneur en matière sèche plus élevée dans la boue par rapport au produit obtenu sans traitement enzymatique. De ce fait, le procédé enzymatique présente l'avantage qui consiste en une consommation en énergie considérablement plus faible pour éliminer l'eau par séchage et ledit traitement permet également de produire un aliment pour bétail sec meilleur marché ou un agent de masse pour
des applications alimentaires.
Bc 7..Additif pour aliment de bétail ensilé.
Il est connu d'ajouter des additifs enzymatiques au fourrage ensilé afin d'accroître la vitesse du processus d'ensilage et la digestibilité du fourrage ensilé. On a
<EMI ID=243.1>
paré . aux additifs enzymatiques connus pour le fourrage ensilé.
. Afin d'être plus clair, on donne ci-dessous un aperçu des figures auxquelles on a déjà fait référence.
<EMI ID=244.1>
<EMI ID=245.1>
REVENDICATIONS
1. A titre de produit industriel nouveau, la SPS-ase, à savoir une carbohydrase sous une forme utilisable et capable de décomposer le SPS de soja dans des conditions appropriées pour donner des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes sur une protéine, en milieu aqueux, à un degré moindre que celui auquel le SPS de soja se serait fixé lui-même, avant décomposition, sur la même protéine dans des conditions correspondantes.