Agent de décomposition de la rémanence végétale, procédé
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protéine végétale purifiée obtenue.
La présente invention, concerne un agent amélioré pour la décomposition de la rémanence végétale, particulièrement la rémanence de soja ; elle concerne également un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée ainsi que la protéine végétale purifiée.
Un procédé de préparation d'une protéine végétale purifiée (pvp) par élimination enzymatique de la rémanence, sans dissolution et reprécipitation de la protéine, est décrit dans le brevet belge n[deg.] 882 769.
Dans ce brevet, on décrit également l'importance du fait que l'activité protéolytique doit être maintenue aussi basse que possible. La pureté de la pvp pouvant être obtenue par le procédé connu n'est pas satisfaisante et demande donc à être améliorée. Dans les exemples, on a montré une pureté de la pvp d'environ 85%. Même s'il
est possible d'obtenir une pvp présentant une pureté d'environ 90 % suivant le procédé connu, ceci n'est possible qu'en utilisant certaines substances de départ prétraitées, par exemple un concentré de protéines de soja. Il serait souhaitable d'obtenir une pureté de
pvp supérieure à 90 % en utilisant une gamme de substances de départ beaucoup plus large, particulièrement de la farine de soja décortiquée et dégraissée.
La présente invention repose sur la découverte surprenante consistant en ce qu'une certaine partie du produit de la décomposition de la rémanence tel qu'il apparaît pendant le traitement enzymatique indiqué ci-dessus, à savoir un hydrate de carbone à poids moléculaire élevé soluble dans l'eau se fixe lui-même sur une partie de la protéine ainsi qu'il sera expliqué plus en détail ciaprès. Il en résulte, bien entendu, une pureté moins bonne de la protéine.
Par conséquent, un objet de l'invention consiste à fournir un agent pour la décomposition de la rémanence végétale, en présence d'une protéine végétale, la rémanence végétale étant particulièrement la rémanence de soja, de manière à obtenir une pureté améliorée de la pvp ; un autre objet consiste en un procédé de préparation d'une pvp.
Le principe de l'invention peut être décrit de la manière suivante en référence à la figure 1 qui n'indique que des substances existant en tant que solides nondissous alors que tous les surnageants, sont omis. Une charge de farine de soja a été divisée en deux parties égales, partie I et partie II (colonne a dans la figure 1). La partie I a été décomposée par voie protéolytique à un
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tique produite au moyen de B. licheniformis et vendue par NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvaerd, Danemark) et a ensuite été lavée à un pH d'environ 8 afin d'éliminer la quantité totale de protéine et.la rémanence a été séparée du surnageant et a été lavée (voir partie I, colonne a et b, figure 1). De cette manière, on a isolé une rémanence pure (désignée par rémanence I) (colonne b à la figure 1).
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plus de brièveté, la rémanence de la partie II est dénommée rémanence II (colonne b à la figure 1). Ensuite, la
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pectolytique produite par Schweizerische Ferment A/G, Baie, Suisse) (voir colonnes b et c à la figure 1). On a découvert de manière inattendue, que la partie non dissoute de
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dissoute de la rémanence II, sur base des bilans d'azote et de la masse des matières sèches (voir figure 1 dans laquelle les surfaces hachurées de la colonne c correspondent aux substances insolubles différentes des protéines dans l'étape indiquée ci-dessus). En outre, si le
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; ajouté à la suspension de protéine de soja à pH 4,5, un polysaccharide du surnageant est lié à la protéine de
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qui est une partie du produit de décomposition de la rémanence et qui est nettement soluble dans l'eau en absence de protéine de soja mais est lié à la protéine de soja au point isoélectrique de la protéine de soja ou autour de ce point si celle-ci est présente, est désigné par SPS (soluble polysaccharide), voir figure 1. Le SPS présente une distribution de poids moléculaire comprise entre 5 x 106 et 4,9 x 104. La préparation de SPS isolé apparaît dans le diagramme synoptique représenté à la figure 2 qui recouvre également certains des procédés <EMI ID=9.1>
trouver un agent qui est capable de décomposer le SPS de telle manière que les produits de décomposition de SPS ne lient pas la protéine de soja ou lient celle-ci dans une mesure beaucoup moindre que le SPS ne lie la protéine de soja.
Bien que la description concerne principalement la décomposition d'une protéine de soja, l'invention n'est pas limitée à une telle protéine mais concerne toutes
les espèces de protéines végétales, notamment par exemple les protéines citées dans le brevet belge n[deg.] 882.769,page
1.
Suivant la présente invention, on a, à présent, trouvé qu'en examinant l'aptitude à décomposer du SPS de soja, il est possible de sélectionner des micro-organismes qui sont aptes à produire un composé qui présente une activité enzymatique, qui décompose effectivement le SPS
de soja, composé désigné ci-dessous, pour plus de concision, SPS-ase.
Par conséquent, on peut dire que la SPS-ase est
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soja dans des conditions adéquates en des produits de décomposition qui se fixent eux-mêmes à la protéine végétale, en milieu aqueux, en une mesure moindre
que le SPS de soja avant décomposition ne se serait fixé lui-même à la même protéine végétale dans des conditions correspondantes.
Suivant un premier aspect, la présente invention vise donc à fournir un agent pour la décomposition de la rémanence végétale, notamment de la rémanence de soja, en présence d'une protéine végétale, particulièrement la protéine de soja, cet agent convenant bien pour la préparation d'une pvp présentant une pureté de la protéine d'environ 90 % à partir d'une protéine végétale dégraissée ou partiellement dégraissée, servant de substances de départ et contenant une enzyme à activité de solubilisation de la rémananence, caractérisé, en ce que l'agent contient une enzyme capable de décomposer le SPS de soja (SPS-ase) et en ce qu'il est essentiellement
exempt d'activité protéolytique. L'agent est essentiellement exempt d'activité protéolytique lorsque celle-ci est égale ou inférieure à l'activité protéolytique qui entraînerait une perte de protéine totale dans la pvp obtenue non supérieur à 30 %, de préférence non supérieure à
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environ 65 % de la rémanence a été solubilisée sur base du bilan d'azote et de la masse de matière sèche.
On a trouvé que la SPS-ase, capable de décomposer le SPS de soja, permet de décomposer de manière plus complète que le font les pectinaaes et cellulases commerciales, les polysaccharides semblables au SPS d'origine végétale ou provenant de fruits.
La pureté de la protéine végétale finale nécessairement améliorée par une élimination totale ou partielle du SPS de la protéine végétale finale par rapport a la pureté de la protéine végétale finale obtenue suivant le procédé du brevet belge n[deg.] 882.769 dans la . mesure où cette protéine végétale connue était contaminée par du SPS.
On ne sait pas à présent si la SPS-ase décrite ci-après développe son activité enzymatique à partir d'une seule enzyme ou à partir d'un complexe d'enzymes comprenant au moins deux enzymes. Certaines recherches semblent indiquer qu'au moins deux enzymes sont responsables de l'effet de décomposition de la SPS-ase, une de ces enzymes étant capable de n'effectuer qu'une légère décomposition du SPS, après quoi une ou plusieurs enzymes sont capables d'effectuer une décomposition plus importante du SPS. Une telle hypothèse ou des hypothèses semblables ne doivent cependant pas limiter la portée de l'invention.
Suivant un mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent, la SPS-ase est produite au moyen d'un microorganisme appartenant au genre Aspergillus.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent, le composé actif est dérivé des enzymes pouvant être obtenues au moyen de Asp. aculeatus CBS 101.43. La même SPS-ase peut être obtenue par Asp. japonicus IFO 4408. On a trouvé que Asp. aculeatus CBS
101.43 produit également des enzymes très puissantes solubilisant la rémanence, des çellulases, des pectinases et des hemicellulases. En outre, on a trouvé que toute souche appartenant-à l'espèce Asp. aculeatus ou à
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SPS-ase nécessaire dans le but de l'invention. Ainsi comme il apparaît dans un paragraphe* ultérieur- de la
<EMI ID=13.1> ATCC 20236 ne produit pas suffisamment de SPS-ase pour être détectée par la détermination enzymatique de la SPSase décrite dans le présent mémoire descriptif.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent, la SPS-ase est identique au point
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de Asp.aculeatus CBS 101.43 et identifiable au moyen de la technique de recouvrement électrophorétique, cf. parties 6 et 7.
Suivant un autre mode de réalisation préféré de l'agent suivant la présente invention, le rapport de l'activité protéolytique en unités HUT et de l'activité solubilisante de la rémanence en unités SRUM-120 est inférieur à environ 2:1, de préférence inférieur à 1:1 et
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qu'il existe une relation nette entre l'activité de la
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pH 3,2 (pH d'activité optimale de la protéase) et la perte en protéine. Cette relation est spécifique pour la préparation de SPS-ase obtenue au moyen de Asp. aculeatus CBS 101.43. Il est à noter que cette relation ne peut
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une SPS-ase qui diffère de la SPS-ase obtenue au moyen de CBS 101.43, mais qu'un homme de l'art peut trouver une relation semblable qui remplit les exigences en ce qui concerne la perte en protéine définie dans la revendication principale. L'activité SRUM-120 (à définir plus loin) est une mesure des activités classiques de solubilisation de la rémanence, de cellulase, de pectinase et d'hémicellulase et d'autres activités. Les unités SRUM-120 sont mesurées à pH 4,5. Il est a noter qu'on a' choisi ce pH, étant donné que la décomposition de la rémanence s'effectue à la valeur isoélectrique du pH de la protéine de soja ou aux environs de celle-ci et qu'il faut utiliser un autre procédé de mesure de l'activité enzymatique dans le cas où la décomposition de la rémanence est effectuée à un autre pH.
Suivant un autre mode d'exécution préféré de l'agent suivant la présente invention, l'agent comporte une activité de cellulase et celle-ci est partiellement ou totalement dérivée de Trachoderma reseei. Cette cellulase permet de dissoudre la cellulose cristalline et cet agent produit une pvp présentant une pureté élevée.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré de l'agent suivant la présente invention,
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se (VECU).
Dans Agr. Biol. Chem. 40 (1), 87 - 92, 1976, on
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un complexe d'enzymes qui est capable d'effectuer une dégradation partielle d'un polysaccharide acide dans la sauce de soja, nommée APS, dont une fraction est désignée par APS-I. Ce polysaccharide acide n'est pas identique au
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ce mémoire descriptif à la partie 3. Ainsi, les chroma-
togrammes HPLC de filtration sur gel du SPS et de l'APS sont nettement différents et, en outre, les chromatogrammes de filtration sur gel de l'APS décomposé par la pectinase. commerciale Pectolyase et du SPS traité avec la pectinase commerciale Pectolyase sont nettement différents. En outre, il n'apparaît pas dans cet article que le polysaccharide acide est lié à la protéine de soja et que le polysaccharide acide décomposé n'est pas lié à la protéine de soja
ou y est lié à un degré nettement inférieur à celui d'un polysaccharide acide non décomposé. On a également prouvé que cette souche ne forme pas de SPS-ase en une quantité suffisante pour une détection au moyen d'une détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans ce mémoire. Ceci
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en tant que producteur de SPS-ase 1 cependant, suivant l'invention, on a trouvé de manière inattendue que
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de SPS-ase.
Suivant un deuxième aspect, la présente invention vise à fournir un procédé pour la préparation d'une protéine végétale purifiée en éliminant la rémanence d'une protéine végétale brute servant de substance de départ, caractérisé en ce que la substance de départ est traitée avec l'agent suivant l'invention dans un milieu aqueux,
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point isoélectrique de la partie principale de la fraction de protéine de la substance de départ, à une température
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qu'au moins environ 60 % de la rémanence/ sur base du bilan d'azote et de la masse de matière sèche, de préférence au moins environ 70 % de celle-ci, plus particulièrement au moins environ 80 % de celle-ci, aient été solubilisés et en ce qu'on sépare du produit surnageant, la phase solide contenant la protéine végétale purifiée.
Suivant un mode particulièrement préféré du procédé de la présente invention, la séparation est effectuée à une température comprise entre la température ambiante et le point de congélation du surnageant. On obtient ainsi un haut rendement en protéines.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est une protéine végétale dégraissée ou une protéine végétale dégraissée et de plus partiellement purifiée. Cette substance de départ est facile à obtenir.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est de la farine de soja. Cette substance de départ est bon marché et facile à obtenir.
Suivant un autre mode d'exécution particuliè-rement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ est une farine de soja traitée thermiquement, de préférence une farine de soja cuite au jet. Dans ce cas, on peut utiliser un dosage moins important de l'enzyme et on peut, en outre, obtenir un rendement plus élevé.
Suivant un autre mode d'exécution particulièrement préféré du procédé de l'invention, la substance de départ peut traverser un tamis ayant une ouverture de mailles d'environ 2,5 mm. Ceci assure un temps de réaction raisonnablement court.
On ne peut fournir que le rapport de dosage (en unités SAE) pour l'activité de SPS-ase dans le traitement de la farine de soja ; au moins environ 35 unités SAE par
100 grammes de farine de soja cuite au jet, et 350 unités SAE par 100 grammes de farine de soja non cuite. En pratique, la relation exacte des activités enzymatiques nécessaires pour décomposer le SPS n'est pas connue et c'est pourquoi on ne peut fournir des dosages et proportions minimum pour la pectinase, la cellulase et
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le traitement de 1,-. farine de soja en unités SRUM peut être fournie, il savoir au moins environ 60 unités SRUM-
120 par 100 grammes pour la farine de soja cuite, environ
600 unités SRUM-L20 par 100 grammes- pour la farine non chauffée. Les valeurs données à titre d'exemples ciaprès semblent être supérieures au dosage minimum. On peut utiliser des essais d'arrêt-mesure pour établir les proportions et temps de réaction opératoires optimum pour convertir le substrat de soja en pvp.
Suivant un troisième aspect, la présente invention vise à fournir une protéine végétale purifiée produite par le procédé suivant la présente invention.
Afin de mieux expliciter la nature de la présente invention, on se référera à la description qui suit et qui est divisée en différentes parties numérotées de 1 à 10 décrivant chacune les détails spécifiques relatifs à la présente invention. Les différentes parties sont comme suit :
1. Préparation du SES.
2. Caractérisation du SPS, en particulier
distribution du poids moléculaire de celui-ci.
3. Essais prouvant la différence entre SPS et APS.
4. Sélection de microorganismes produisant de la
SPS-ase.
5. Caractérisation de certains microorganismes
formant de la SPS-ase.
6. Description générale de la technique de
recouvrement associée à des immunoêlectrophorèses.
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la SPS-ase avec un anticorps polyspécifique et recouvrement.
8. Purification d'une préparation de SPS-ase.
9. Dépendance de l'activité à l'égard du pH et
de la température et stabilité d'une SPS-ase.
10 Détermination de l'activité enzymatique.
PARTIE 1.
PREPARATION DU SPS.
Comme déja mentionné précédemment, la substance de départ pour la préparation du SPS peut être la rémanence de soja. C'est pourquoi, on décrira d'abord la préparation d'une rémanence de soja.
La rémanence de soja est une fraction d'hydrate de carbone exempte de protéines (qui, en pratique, peut contenir de faibles quantités de lignine et matières minérales), contenue dans la farine de soja dégraissée et décortiquée, ladite fraction d'hydrate de carbone étant insoluble.dans un milieu aqueux à pH 4,5 et pouvant être préparée de la manière suivante, en référence au tableau synoptique n[deg.] 1.
La farine de soja dégraissée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) est mise en suspension dans de l'eau
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soja à l'eau de 1:5, dans un réservoir contenant un équipement de stabilisation de pH et de température. On règle
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hydrolyse à pH stationnaire au moyen d'ALCALASE 0,6 L (une enzyme protéolytique à base de B. licheniformis ayant une activité de 0,6 unités Anson par gramme, l'activité étant déterminée suivant la méthode Anson, comme décrit dans NOVO ENZYME INFORMATION IB No. 058 e-GB). Le rapport enzyme/ substrat correspond à 4 % de la quantité de protéines dans la farine de soja (II). Après une hydrolyse pendant une heure, la boue est séparée par centrifugation (III) et on lave (IV), cette opération étant effectuée deux fois (V, VI, VII). La boue ainsi traitée est ensuite hydrolysée une fois de plus pendant une heure au moyen d'ALCALASE 0,6 L (VIII, IX), de manière similaire à ce qui a été dit ci-dessus. Ensuite la boue séparée par centrifugation (X) est lavée deux fois (XI, XII, XIII, XIV), la boue finalement lavée (6) étant sèchée par pulvérisation (XV).
La poudre ainsi produite, sèchée par pulvérisation est la rémanence de soja servant de matériau brut pour la production de SPS.
Le SPS est la fraction soluble à l'eau de polysaccharide qui est obtenue par un traitement classique de la rémanence de soja susmentionnée avec de la pectinase. Le SPS est préparé de la manière suivante au moyen des 14 étapes réactionnelles indiquées ci-dessous, en référence au tableau synoptique n[deg.] 2.
1. On détermine la teneur en matière sèche de la rémanence
susmentionnée et on dilue la rémanence de soja dans de l'eau à raison de 2 % de matière sèche et ladite rémanence de soja est maintenue en suspension à 50[deg.]C dans un réservoir comportant un réglage de température.
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du Pectinex Super concentré L (pectinase commerciale de la Schweizerische Ferment AG, Bâle, Suisse) présentant une activité en pectinase'de 750.000 MOU, déterminée suivant le feuillet "Détermination of the Pectinase units of Apple Juice (MOU)" du 12.6.1981, disponible à la Schweizerische Ferment AG, Baie, Suisse et on ajoute également en quantité de 20 g/kg de matière sèche du Celluclast 200L (cellulase commerciale décrite dans le feuillet NOVO enzymes, information sheet B-153 e-GB 1000 juillet 1981, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S,
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heures en agitant.
5. Les enzymes sont inactivées en augmentant le pH à 9 ,0
au moyen de NaOH 4N. Le mélange réactionnel est maintenu tel quel pendant 30 minutes et le pH est ensuite réglé à 4,5 au moyen de HC1 6N.
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produit de centrifugation ainsi que la boue.
7. Le produit de centrifugation de l'étape 6 subit une
filtration de contrôle sur un filtre presse (le filtre. est lavé à l'eau avant la filtration de contrôle).
<EMI ID=32.1> à une diafiltration et ensuite encore à une ultrafiltration sur une membrane présentant une valeur de coupure de 30.000. (DDS GR 60-P de De Danske Sukkerfabrikker), en ayant recours aux paramètres suivants :
1. Ultrafiltration correspondant à une concentration de
volume de 6.
2. Diafiltration jusqu'à ce que le pourcentage en
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3. Ultrafiltration jusqu'à environ 15 % de matière sèche
dans le concentrat.
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pression moyenne de 3 bars.
9. Le concentrat soumis à l'ultrafiltration est refroidi
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10.On récupère le précipité au moyen d'une centrifugeuse.
11.. Le précipité est lavé deux fois par de l'éthanol dans
l'eau à 50 % v/v, correspondant au volume du produit de centrifugation de l'étape 10, c'est-à-dire qu'on effectue deux centrifugations.
12.Le précipité lavé est remis en solution dans l'eau en un
volume qui correspond au volume de concentrat de l'étape 9 soumis à ultrafiltration.
13.Le liquide de l'étape 12 est soumis à une filtration de
contrôle sur un filtre de verre.
14.Le filtrat clair contenant du SPS pur est lyophylisé.
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TABLEAU SYNOPTIQUE N[deg.] 2
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PARTIE 2
CARACTERISATION DU SPS, EN PARTICULIER DISTRIBUTION DUPOIDS MOLECULAIRE DE CELUI-CI.
On a déterminé (fig. 4), la distribution du poids moléculaire du SPS dont la production est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, au moyen d'une chromatographie sur gel dans un équipement HPLC (pompe Waters, modèle 6000, module de données 730 de Waters et réfractomètre R 401 de Waters). On a également déterminé (fig. 5) la distribution du poids moléculaire des produits de décomposition du SPS par la SPS-ase suivant le même procédé. En outre, on a montré pala même méthode, l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS (fig. 6) et l'absence de l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé par l'agent suivant l'invention (fig. 7),
La courbe de calibrage (le logarithme du poids moléculaire en fonction de Rf, où la valeur Rf pour le glucose est arbitrairement définie comme étant 1 et où la valeur R f d'un dextrane spécifique est définie en tant que temps de rétention de ce dextrane divisé par le temps de rétention du glucose) a été établie au moyen de plusieurs dextranes
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Boite 175, S-75104, Uppsala, Suède. On a trouvé la valeur Rf pour le maximum de chaque pic de dextrane et le poids
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culaire. On a utilisé du NaN03 0,1 M comme éluant pour ce processus chromatographique. Les,colonnes utilisées dans ce processus chromatographique sont la colonne PW 5000 de
60 cm suivie par une colonne PW 3000 de 60 cm vendues par Toyo Soda Manufacturinq Co., Japon. On a établi la relation
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dextranes indiqués ci-dessus de cette manière, cfr. fig. 3.
A partir de la fig. 4, on peut calculer que le SPS présente une distribution de poids moléculaire qui est <EMI ID=41.1>
une valeur M d'environ 4,2 x 10 . Il apparaît également dans cette figure que le chromatogramme présente deux pics distincts 1 un temps de rétention de 34,5 minutes (6 %) correspondant à un poids moléculaire d'environ 5 x 106 et à un temps de rétention de 47,12 minutes (67 %) correspon-
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apparaît également de cette courbe qu'il existe un épaulement entre ces deux pics à un temps de rétention de 41,25 minutes (27 %) correspondant à un poids moléculaire de 2,8 x 105.
-Après la décomposition du SPS par la SPS-ase, le mélange d'hydrolyse a été filtré sur membrane et le filtrat a été soumis à la chromatographie. On a trouvé qu'environ
55 % du SPS est décomposé en monosaccharide, disaccharide et trisaccharide et que le résidu de 45 % a été décomposé en un polymère présentant trois pics correspondant au poids <EMI ID=43.1>
5.
Dans le but de démontrer l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS et la réduction substantielle de l'effet de liaison entre la protéine de soja et le SPS décomposé au moyen de la SPS-ase, on a effectué les essais suivants.
3 % de SPS dans un tampon acétate 0,10 M à pH 4,5 est ajouté à une boue d'un isolat de soja (Purina E 500) afin de générer une suspension présentant le rapport isolat/ SPS correspondant à 10:1. On fait incuber cette suspension
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incubation, la suspension est centrifugée et le surnageant clair est analysé par HPLC comme décrit précédemment. En comparant la fig. 6 à la fig. 4, il apparaît que le SPS est complètement adsorbé sur l'isolat de soja.
Le même processus que celui mentionné dans le paragraphe précédent est mis en oeuvre avec une solution à 3 % de SPS hydrolysé avec une SPS-ase produite par CBS LOI.43 (fig. 7) . En comparant la fig. 7 et la fig. 5, on constate qu'aucun composé du SPS hydrolysé présentant un poids moléculaire inférieur à 10 4 n'est adsorbé sur l'isolat de soja. L'hydrolyse réduit la liaison quantitative jusqu'à environ 10 à 15 % par rapport à la liaison du SPS à la protéine de soja.
Une analyse RMN du SPS, dont la production est effectuée comme indiqué dans ce mémoire, révèle la composition approximative suivante du SPS :
1) acide a-galacturonique en une quantité d'environ 45 %,
approximativement 40 % de la quantité totale d'acide a-galacturonique étant présents en tant qu'ester méthylique.
2) rhamnopyranose en une quantité d'environ 20 %,
3) galactopyranose en une quantité d'environ 15 %, et
4) P-xylopyranose en une quantité d'environ 20 %.
Les constituants semblent être présents suivant une structure comprenant une chaîne principale rhamnogalacturonique et des chaînes latérales de xylose et de galactose.
L'hydrolyse acide complète du SPS (8 heures dans
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également de faibles quantités de monosaccharides fucose et arabinose dans le SPS hydrolysé.
Une analyse HPLC du SPS décomposé par le complexe d'enzymes SPS-ase formé par CBS 101.43 montre une importante réduction du poids moléculaire. De manière semblable, le spectre RMN du SPS décomposé comme indiqué ci-dessus montre qu'une majeure partie des groupes ester a disparu et que, également, la teneur en xylose et galactose dans la substance à poids moléculaire plus élevé a diminué. Le spectre RMN de la partie du produit de décomposition de SPS qui précipite par addition.d'un volume d'éthanol à un volume de produit de décomposition de SPS est semblable au spectre RMN du SPS qui a subi les modifications susmentionnées concernant les groupes ester et la teneur en xylose et galactose.
PARTIE 3
ESSAIS PROUVANT LA DIFFERENCE ENTRE SPS ET APS
On a préparé le APS comme mentionné dans Agr.
Biol. Chem., Vol. 36, No. 4, p. 544 - 550 (1972).
On a ensuite hydrolysé ce polysaccharide et le SPS avec différentes enzymes , puis on a soumis le mélange de décomposition à une chromatographie sur gel par. un équipement HPLC, comme mentionné dans la deuxième partie, "Caractérisation du SPS, en particulier la distribution du poids moléculaire de celle-ci".
Plus précisément, on a effectué l'hydrolyse par un traitement d'une solution de 25 ml de 2% de APS ou de 2 % de SPS dans un tampon acétate 0,1 M ayant un pH de 4,5 par 10 mg de KRF 68 ou 30 mg de Pectolyase KRF 68 est une préparation de SPS-ase dont la fabrication est
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tableau suivant : -
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PARTIE 4.
SELECTION DE MICROORGANISMES PRODUISANT DE LA SPS-ASE.
Le microorganisme à tester est soumis à une incubation sur un substrat incliné d'agar présentant une composition qui permet la croissance du microorganisme. Après une croissance initiale sur le substrat incliné d'agar, le microorganisme est transféré dans un substrat principal liquide dans lequel la source de carbone principale est le SPS (préparé comme indiqué), dans lequel la <EMI ID=48.1>
libres, des protéines ou d'autres composés contenant de l'azote, le substrat contenant en outre un mélange des sels et vitamines nécessaires, de préférence sous la forme d'un extrait de levure. La composition du substrat principal dépend du genre de microorganisme, la considération principale étant que le substrat soit capable de supporter la croissance et le métabolisme du microorganisme. Lorsque la croissance a eu lieu pendant une période de temps adéquate, de l'ordre de 1 à 7 jours, dépendant de la vitesse de croissance du microorganisme en question, on analyse un échantillon du bouillon de fermentation pour déterminer la SPS-ase suivant la détermination enzymatique de la SPS-ase décrite dans ce mémoire.
Afin d'avoir une technique plus sensible pour déterminer l'activité enzymatique, on peut abaisser la température à 40[deg.]C et augmenter le temps d'incubation à 20 heures pendant la détermination de l'activité de la SPS-as� tout en ajoutant aussi des antibiotiques au substrat afin d'empêcher une infection.
Par cette technique, on peut trouver d'autres nicroorganismes produisant' de la SPS-ase pouvant apparteair au genre Aspergillus et à d'autres genres.
?ARTIE 5.
:ARACTERISATION DE CERTAINS MICROORGANISMES FORMANT DE LASPS-ASE.
Par la technique de sélection pour des microorgaiismes produisant de la SPS-ase indiquée dans ce mémoire descriptifs on a trouvé que les microorganismes cités dans La partie supérieure du tableau suivant sont des producteurs le SPS-ase. Le tableau contient également une souche tppartenant à l'espèce Asp. japonicus qui n'est pas un 'réducteur de SPS-ase.
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Une identification courte des souches indiquées ci-dessus peut être trouvée dans les catalogues de culture suivants :
List of Cultures 1978, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas.
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The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14è édition 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Amérique.
Toutes les souches du tableau indiqué ci-dessus correspondent étroitement à la description taxonomique des espèces Asp. japonicus et Asp. aculëatus décrites dans "The genus Aspergillus" de Raper and Fennell, 1965, voir particulièrement les pages 327 à 330.
PARTIE 6
DESCRIPTION GENERALE DE LA TECHNIQUE DE RECOUVREMENTASSOCIEE ADESIMMUNOELECTROPHORESES.
On a développé un procédé dénommé technique de recouvrement de top-agar pour identifier les composants
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composants d'enzyme du complexe d' enzymes. Le procédé est basé sur le fait que les enzymes sont encore actives après la liaison spécifique entre l'enzyme et l'anticorps ou, exprimé de manière différente, le procédé est basé sur le fait que le site enzymatique actif n'est pas identique au site de la liaison enzyme-anticorps. Les complexes enzyme-anticorps précipitent en tant qu'arcs distincts dans le gel pendant l'électrophorèse. La plaque de gel est recouverte avec du SPS soluble dans du top-agar. Après chauffage à 45[deg.]C pendant 20 heures dans une atmosphère ayant une humidité relative de 100 %, l'arc qui possède une activité de SPS-ase apparaît en tant que zone claire dans la couverture de SPS après précipitation par un mélange de parts égales en-'volume d'éthanol et d'acétone, lorsqu'on regarde du dessus contre ur fond noir.
Les arcs qui ne présentent pas d'activité SPS-ase restent invisibles.
PARTIE 7.
CARACTERISATION IMMUNOELECTROPHORETIQUE DE LA SPS-ASE AVECUN ANTICORPS POLYSPECIFIQUE ET RECOUVREMENT.
On a immunisé des lapins par le complexe d'enzymes contenant la SPS-ase obtenu par fermentation de
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l'exemple 1 (KRF 68) et on a récupéré l'anticorps polyspécifique d'une manière connue en soi. Au moyen de cet anticorps polyspécifique on a effectué une immunoélectrophorèse croisée du complexe d'enzymes obtenu par fermentation de l'Aspergillus aculeatus CBS 101.43, comme indiqué à l'exemple 1 (KRF 68), l'immunoélectrophorèse
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<EMI ID=54.1>
1977. On se réfère à la fig. 11 qui montre les arcs correspondant aux différentes protéines produites par le microorganisme. On a trouvé, au moyen de la technique de recouvrement de top-agar décrite précédemment, que la surface hachurée correspond à la SPS-ase.
Si l'hypothèse susmentionnée supposant que la SPS-ase consiste en au moins deux enzymes est correcte,
la surface hachurée est la surface dans laquelle se trouvent toutes les enzymes responsables de l'activité de SPS-ase. Si, suivant d'autres modes d'exécution de la présente invention, on peut séparer des enzymes par immunoêlectrophorèse de telle manière qu'elles ne couvrent aucune surface mutuelle, on peut encore identifier une
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phorèse avec un recouvrement avec à la fois le SPS et une pectinase commerciale.
PARTIE 8.
PURIFICATION D'UNE PREPARATION DE SPS-ASE.
On a effectué la purification de la préparation de SPS-ase KRF 92 (voir exemple 1) par échange d'ions.
Le tampon est le Tris 50 mMolaire (tris-hydroxyméthylamino-
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est une colonne K 5/30 vendue par Pharmacia, Suède. La substance d'échange d'ions est du DEAE-trisacryl vendu par LKB, Bromma, Suède (300 ml). La vitesse de passage est de
100 ml/heure.
On a dissous 15 g de la préparation de SPS-ase
<EMI ID=57.1>
On règle le pH à 7,0 au moyen de Tris 1 Molaire. La colonne a été équilibrée au moyen du tampon et on a ensuite introduit l'échantillon de SPS-ase dans la colonne. On a mesuré OD280 et la conductivité de l'éluat; voir à
la fig. 12. La fraction 1 correspond à l'éluat qui n'est pas lié à la substance d'échange d'ions,. Ensuite la colonne a été lavée avec 2000 ml de tampon, ce qui donne la fraction 2. On a ensuite établi un gradient de NaCl 0-500 mMolaire ce qui donne les fractions 3 - 9. Les neuf fractions ont été concentrées à 200 ml et ont été dyalisées contre l'eau aune conductivité de 2mSi par dialyse (Hollow Fiber DP 2 de Amicon, Massachussetts, U.S.A.). Ensuite les neuf fractions ont été lyophilisées. Uniquement les fractions 1 et 2 présentaient une activité de SPS-ase.
La fraction 1 a été purifiée ultérieurement par une filtration sur gel. On a dissous 1,5 g de la fraction 1 dans 10 ml d'acétate de sodium 50mMolaire ayant un pH de
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x 100 cm de LKB.. La substance servant à la filtration sur gel est le Sephacryl S-200 de Pharmacia, Suède. La vitesse de passage est de 30 ml/heure. Les fractions contenant des substances ayant un poids moléculaire compris entre 70.000 et 100..000, calibrées avec des protéines globulaires, contenaient un complexe d'enzymes désigné pàr facteur G qui ne peut décomposer le SPS lorsque l'on pratique l'essai suivant le test qualitatif d'agar.; cependant, le SPS est décomposé suivant le test qualitatif d'agar lorsque l'on mélange le facteur G avec une pectinase. On a trouvé que le facteur G est capable de séparer le galactose, le ,fucose et certains acides galacturoniques du SPS ; mais le produit de décomposition principal suivant l'analyse HPLC est un produit à poids moléculaire élevé ressemblant très fort au SPS.
PARTIE 9.
DEPENDANCE DE L'ACTIVTE A L'EGARD DU.pH ET DE LA TEMPERA-TURE ET STABILITE D'UNE SPS-ASE
La fig. 13 montre l'activité en fonction du pH de la préparation de SPS-ase KRF 68. De pH 2,7 à 3,5 on a utilisé un système de tampon à l'acide formique et de pH 3,7 à 5,5 on a utilisé un système de tampon à l'acétate.
La fig. 14 montre l'activité en fonction- de la température delà préparation de SPS-ase KRF 68.
La fig. 15 montre la stabilité thermique de la. préparation de SPS-ase KRF 68.
PARTIE 10
DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE.
Le tableau repris ci-dessous donne un aperçu des différentes déterminations de l'activité enzymatique relevant de la présente invention.
<EMI ID=59.1>
Les références indiquées dans la dernière
.colonne du tableau susmentionné sont détaillées dans le tableau suivant.
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En ce qui concerne la détermination de l'activi.té de cellulase, il est à noter que l'analyse a été effectuée comme indiqué dans AF 149/6-GB et que les principes de détermination sont expliques dans Analytical Biochemistry.
A. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE SPS-ASE.
La détermination enzymatique de SPS-ase est effectuée en deux étapes, c'est-à-dire un essai qualitatif sur plaque d'agar et une détermination quantitative de l'activité SPS-ase, basée sur la mesure de la quantité totale de sucres libérée. Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est négatif, l'activité SPS-ase est nulle quelle que soit la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase. Si l'essai qualitatif sur plaque d'agar est positif, l'activité en SPS-ase est égale à la valeur provenant de la détermination quantitative de l'activité en SPS-ase.
I. Essai qualitatif sur plaque d'agar.
On a préparé une plaque de SPS-agar de la manière suivante. On a préparé un tampon (B) en amenant de
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On dissout 1. g de SPS dans 20 ml de B. On mélange 1 g d'agarose (HSB Litex) avec 80 ml de B et on chauffe jusqu'au point d'ébullition en agitant. Lorsque l'agarose est dissoute,la solution de SPS est lentement ajoutée. La solution qui en résulte à 1 % SPS-agarose. est disposée dans un bain d'eau à 60[deg.]C. Les plaques sont ensuite coulées en versant 15 ml de la solution à 1 % de SPS-agarose sur une plaque en verre horizontale ayant les dimensions de 10 cm x 10 cm. Ensuite
on estampe 9 "puits" dans la couche solidifiée de SPS-agarose à une distance de 2,5 cm. Dans chaque
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téine d'enzyme à tester en ce qui concerne l'activité en SPS-ase. On fait incuber la plaque pendant 18 heures à
50[deg.]C et à une humidité relative de 100 %: Ensuite le SPS . non encore décomposé est précipité par une solution à parts égales en volumesd'éthanol et d'acétone. L'essai de la SPS-ase sur plaque d'agar est positif pour un échantillon placé dans un puits spécifique si une zone annulaire claire apparaît autour de ce puits.
II. DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'ACTIVITE DE SPS-asa
Le but de cet essai est de déterminer les activités enzymatiques qui sont capables de décomposer le SPS d'une telle façon.. que les produits de décomposition présentent une affinité à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja fortement réduite ou ne présentent pas d'affinité, à l'adsorption ou à la liaison de protéine de soja. Des essais ont montré que la partie des produits de décomposition de SPS qui n'est pas précipitée par le mélange de parts égales en volumes d'eau et d'éthanol ne présente aucune affinité à l'adsorption ou à la liaison à la protéine de soja.
La détermination de la SPS-ase est basée sur une hydrolyse du SPS dans des conditions standard suivie par une précipitation de la partie de SPS qui n'a pas été hydrolysée par l'éthanol. Après la précipitation, la teneur en hydrate de carbone qui n'est pas précipitée est déterminée par une analyse quantitative pour le sucre total (suivant AF 169/1, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S, 2880 Bagsvaerd).
Les conditions standard sont :
<EMI ID=63.1>
pH 4,5
Temps de réaction : contrôle pendant 210 minutes uniquement avec le substrat, suivi par 2 minutes l'enzyme étant additionnée.
Temps de réaction : valeur principale 212 minutes L'équipement comprend :
<EMI ID=64.1>
Agitateur Whirlimixer
Centrifugeuse
Un bain d'eau glacé.
Les réactifs comprennent :
Tampon : acide acétique 0,6 M dans l'eau <EMI ID=65.1>
Substrat :la valeur pH de 50 ml de a est
réglée à 4,5 au moyen de b, ensuite on ajoute 4,0 g de SPS et après dissolution de celui-ci, le pH est réglé une nouvelle fois à 4,5 et le volume
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désionisée.
Réactif d'arrêt Ethanol absolu.
Une unité d'activité SPS-ase (SAE ou SPSu) est définie comme l'activité SPS-ase qui libéré
une quantité d'hydrate de carbone soluble dans de l'éthanol à 50 % équivalente à 1 mole de galactose par minute, dans les conditions standard susmentionnées.
Même si la partie initiale de la courbe standard de l'enzyme est une ligne droite, il faut noter qu'elle
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B. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE SOLUBILISANT
LA REMANENCE EXPRIMEE EN SRUM 120.
Principe.
Dans le procédé pour la détermination de l'activité d'hydrolyse, la partie insoluble de la farine de soja dégraissée, déprotéinisée et décortiquée est hydrolysée dans des conditions standard. La réaction de l'enzyme est arrêtée avec un réactif d'arrêt. et la fraction insoluble.est séparée par filtration. La quantité de polysaccarides dissous est déterminée par spectrophotométrie après une hydrolyse acide suivant AF 169/1, disponible chez Novo Industri A/S, 2880 Bagsvaerd.
Les carbohydrases présentant une activité endo ainsi que celles présentant une activité exo sont déterminées suivant le procédé.
Le substrat faisant partie de cette détermination enzymatique est identique au substrat de la rémanence décrit pour la méthode SRU. Le substrat est -dissous sous forme d'une solution à 3 % dans le tampon au citrate indiqué ci-dessous :
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Art 6580)
Amené à 1 litre par de l'eau déminéralisée
<EMI ID=69.1>
Stable pendant 14 jours.
Le réactif d'arrêt . présente la composition suivante :
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200 ml d' éthanol à 96 %
A garder dans un réfrigérateur jusqu'au moment de l'utilisation.
Conditions standard :
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Définition de l'unité :
Une unité d'activité solubilisante la rémanence de soja (SRUM) 120 (M pour manuel) correspond à la quantité d'enzyme qui, dans les conditions de réaction données, libère, par minute, des polysaccharides solubilisés équivalant à une micro-mole de galactose.
C. DETERMINATION ENZYMATIQUE DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
MESURE HUT
Procédé pour la détermination de protêinase dans un milieu acide.
Le procédé est basé sur la digestion d'hémoglo-
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pendant 30 minutes. L'hémoglobine non digérée est précipitée au moyen d'acide trichloracétique à 14 %
(poids/volume) .
Tous les échantillons d'enzymes sont préparés en dissolvant celles-ci dans un tampon acétate 0, 1M, à pH 3,2.
Le substrat d'hémoglobine est préparé en utilisant 5,0 g de poudre d'hémoglobine bovine lyophilisée,
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déminéralisée qui est agitée pendant 10 minutes, avant de règler le pH à 1,7 au moyen de HC1 0,33 N.
Après une agitation ultérieure de 10 minutes, on
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cette solution est porté à 200 ml au moyen d'un tampon acétate 0,2 M. Ce substrat d'hémoglobine doit être refroidi pour être gardé pendant 5 jours.
'Le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante. Au temps zéro, 5 ml du substrat sont introduitsdans une éprouvette contenant 1 ml d'enzyme. Après agitation d'une seconde, l'éprouvette est mise dans un bain d'eau à 40[deg.]C pendant 30 minutes. Après exactement
30 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique à
14 % dans l'éprouvette, qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes.
Pour l'essai à blanc, le substrat d'hémoglobine est porté à température ambiante. Au temps zéro, on ajoute 5 ml du substrat dans l'éprouvette contenant 1 ml d'enzyme. Après une agitation d'une seconde,
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5 minutes. Après exactement 5 minutes, on ajoute 5 ml d'acide trichloroacétique â 14 % dans l'éprouvette, qui est ensuite agitée et portée à température ambiante pendant 40 minutes.
Après 40 minutes, les essais à blanc et les échantillons sont agités, filtrés une ou deux fois à
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spectrophotomètre. L'échantillon est lu par rapport à l'essai à blanc à 275 nm en ajustant le spectrophotomètre ;par rapport à de l'eau.
Etant donné que l'absorbance de la tyrosine à 275 nm est un facteur connu, il n'est pas nécessaire d'établir une courbe standard de tyrosine à moins qu'il ne soit nécessaire de contrôler le speetrophotomètre de Beckman.
Calculs:
1 HUT est la quantité d'enzyme, qui forme, en une minute, un hydrolisat équivalent en ce qui concerne l'absorbance à 275 nm à une solution de 1,10 microgramme/ml de tyrosine dans du HC1 0,006 N. Cette valeur de l'absorbance est de 0,0084. La réaction s'effectue à 40[deg.]C, à pH 3,2 et pendant 30 minutes.
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Un essai pour déterminer la dépendance de la stabilité du pH de la protëase dans le KRF 68, effectué
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8,0 a montré que la stabilité de la protéase à pH supérieur à 8,0 était très faible, cfr. fig. 16.
Dans le but d'illustrer la présente invention,on se référera . aux exemples suivants 1 à 10, dans lesquels l'exemple 1 illustre la préparation de SPS-ase et dans lesquels les exemples 2 à 10 illustrent l'application de la SPS-ase.
On a effectué de nombreuses fermentations avec des
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laboratoire. Ainsi on a obtenu des préparations qui contenaient la SPS-ase suivant les essais de SPS-ase indiqués ci-dessus. Cependant, étant donné qu'on a besoin de quantités assez importantes de SPS-ase afin d'exécuter les essais, on a effectué des fermentations
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exemple 1 suivant.
Exemple 1
Production d'une SPS-ase à l'échelle d'une installation pilote.
On a préparé une SPS-ase par fermentation submergée d'Aspergillus aculeatus CBS 101.43.
On a préparé un substrat d'agar présentant la composition suivante dans un flacon Fernbach :
<EMI ID=81.1>
On a réglé le pH à une valeur entre 5,30 et 5,35. Ensuite on a ajouté 40 g d'agar Difco et on a maintenu le mélange dans un autoclave pendant 20 minutes à 120[deg.]C (le substrat est dénommé E-agar).
La souche CBS 101.43 a été cultivée sur un plan incliné de E-agar (37[deg.]C). Les spores du plan incliné ont été mis en suspension dans du lait écrémé stérilisé et la suspension a été lyophilisée dans des fioles. La teneur d'une fiole lyophilisée a été transvasée dans un flacon de Fernbach. Le flacon a ensuite été soumis à une incubation
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On a préparé un substrat ayant la composition suivante, dans un réservoir de fermentation de 500 litres :
<EMI ID=83.1>
On a ajouté de l'eau de robinet jusqu'à un volume
<EMI ID=84.1> le fermentateur d'inoculation pendant, une heure à 121[deg.]C.
Le volume final avant inoculation était d'environ 300 litres.
La suspension de spores dans le flacon de
<EMI ID=85.1>
tion. Les.conditions de fermentation de l'inoculât étaient :
Type de fermentateur ,: Réservoir de fermentation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,3.
<EMI ID=86.1>
Environ 28 heures après l'inoculation, on a transféré 150 litres du fermentateur d'inoculationvers le réservoir de fermentation principal.
On a préparé un substrat ayant la composition suivante dans un réservoir de fermentation principal de
2500 litres :
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On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 900 1. La farine de soja grillé a été mise en suspension dans l'eau. On a réglé le pH à 8,0 au moyen
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une pression relative de zero atmosphère relative et une
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ajouté les composants restants de substrat et on a réglé le pH à environ 6 au moyen d'acide phosphorique. On a stérilisé le substrat dans le réservoir de fermentation principal pendant 1 1/2 heure à 123[deg.]C. Le volume final avant inoculation était d'environ 1080 litres.
Ensuite on a ajouté 150 litres de culture ' d'inoculation.
Les conditions de fermentation sont :
Type de fermentateur : Réservoir de fermentation classique aéré et agité présentant un rapport hauteur/diamètre d'environ 2,7.
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A partir de 24 heures de fermentation jusqu'à environ 116 heures de fermentation on a ajouté une solution de pectine de manière. aseptique au réservoir de fermentation principal à raison d'une vitesse constante d'environ
8 litres par heure. La solution de pectine ayant la composition suivante a été préparée dans un réservoir de dosage de 500 litres.
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x Genu pectin (du genre citrus NF de "The Copenhagen
pectin factory Ltd").
On a ajouté de l'eau de robinet à un volume total d'environ 325 litres. Le substrat a été stérilisé dans un réservoir de dosage pendant 1 heure à 121[deg.]C. Le volume final avant le début du dosage était d'environ 360 litres. Lorsque cette partie a été épuisée, on a préparé une autre partie similaire. Le volume total de la solution de pectine pour une fermentation était d'environ 725 litres.
Après environ 151 heures de fermentation on a arrêté le processus de fermentation. Le bouillon de culture d'environ 1850 litres a été refroidi à environ 5[deg.]C et on a récupéré les enzymes selon la technique ..suivante.
Le bouillon de culture a été filtré sur un titre tambour sous vide (Dorr Oliver), qui était enrobé d'une terre de diatomées Hy-flo-super-cel (adjuvant de filtration). Le filtrat a été concentré par évaporation à environ 15 % du volume du bouillon de culture. Le concentré a été filtré sur une feuille de filtre Seitz
(type supra 100) comportant 0,25 % de Hy-flo-super-cel à
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le tableau suivant). Le filtrat a été précipité au moyen
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filtration. Le précipité et l'adjuvant de filtration sont séparés par filtration sur un. filtre à cadre. Le
gâteau de filtre est dissous dans de l'eau et les fractions insolubles sont séparées par filtration sur un. filtre à cadre. Le filtrat est soumis à un essai de filtration sur une feuille filtrante Seitz (de type supra 100) avec 0,25 % de Hy-flo-super-cel à titre d'adjuvant de filtration (dénommé filtration II dans le tableau suivant). Le
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d'ultrafiltration. Après diafiltration, le liquide est concentré jusqu'à une teneur en matière sèche de 12,7 %
(dénommée, dans le tableau suivant, teneur en matière sèche du concentré).
,Un traitement de base facultatif pour éliminer partiellement l'activité de protéase peut être effectué à cette étape. Dans le cas d'un traitement de base, celui-ci est effectué à un pH de 9,2 pendant une heure, le pH étant ensuite règle à 5,0.
Ensuite le liquide est soumis à une filtration d'essai et filtré dans le but d'une réduction de germes et le filtrat est lyophilisé dans un équipement de lyophilisation de Stokes.
On a effectué quatre fermentations de la manière indiquée ci-dessous; la souche utilisée pour la fermentation, l'utilisation facultative d'un traitement de base et d'autres paramètres variant, comme indiqué dans le tableau suivant.
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.x Après filtration de réduction des germes, le filtrat est, concentré par évaporation en un rapport de 1:2,3. Une faible partie du filtrat concentré a été séchée par pulvérisation et la partie restante a été lyophilisée.
Afin de réduire encore plus l'activité de protéase, certaines préparations indiquées ci-dessus sont traitées comme indiqué ci-dessous, en n'utilisant qu'une des trois possibilités A, B, ou C.
A. On dissout 100 g de préparation de SPS-ase
<EMI ID=97.1>
règle le pH à 9,1 au moyen de NaOH 4N. Ce traitement de base est effectué pendant une heure. On règle ensuite le pH à 4,5 au moyen d'acide acétique glacial et on dialyse en
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té de 3 mSi. Ensuite on effectue la congélation et la lyophilisation.
B. On dissout une préparation de 500 g de SPS-
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de base est effectué pendant une heure. On règle ensuite le pH à 5,0 au moyen d'acide acétique glacial. La substance obtenue est lyophilisée.
C. On dissout 50 g d'une préparation de SPS- ase dans 400 ml d'eau désionisée en agitant à 10 [deg.]C + 2[deg.]C. On règle le pH à 9,1 au moyen de NaOH 4 N. Ce traitement de base est effectué pendant une heure. Ensuite on règle - le pH à 5,7 au moyen d'acide acétique glacial. La substance obtenue est lyophilisée.
<EMI ID=100.1>
Les préparations indiquées ci-dessus sont caractérisées par leur activité des enzymes selon la. présente invention dans le..tableau suivant.
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Exemple 2 (exemple d'application)
Cet exemple décrit la fabrication de p.v.p. à partir de farine de soja dégraissée et décortiquée, "Sojamel 13" (disponible dans le commerce de Aarhus Oliefabrik A/S). La teneur en matière sèche de cette farine était de 94,0 % et la teneur en (N x 6,25) sur base des matières sèches était de 58,7 %. La farine de soja a été traitée avec les préparations de SPS-ase KRF 68 BII
(exemple 1) de la manière suivante :
On a mis 85,29 g de la farine de soja en suspen-
<EMI ID=102.1>
d'eau et on a réglé le pH à 4,5 au moyen de 7,5 ml de HC1 6 N. On y a ajouté 50 g d'une solution contenant 4,00 g de ladite préparation de SPS-ase et on a ensuite agité le
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a ensuite été centrifugé dans une centrifugeuse de laboratoire
<EMI ID=104.1>
pesé le surnageant et on l'a analysé suivant la méthode de Kjeldahl afin de déterminer l'azote et les matières sèches. La phase solide a ensuite été lavée avec un volume d'eau équivalent à la masse de surnageant obtenue lors de la première centrifugation. Cette opération a été effectuée deux fois. La phase solide a ensuite été lyophilisée, pesée et analysée suivant la méthode de Kjeldahl pour déterminer l'azote et les matières sèches chez Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danemark.
Ce laboratoire est agrée par l'E.tat pour les analyses d'aliments pour bétail et des produits laitiers. Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau 2.1 :
Tableau 2.1 Résultats obtenus
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On a donc obtenu une p.v.p. présentant une pureté de protéine, c'est-à-dire N x 6,25 sur base des matières sèches, de 91,4 % et avec un rendement total- en protéine de 83 %.
Exemple 3 (exemple d'application)
Cet exemple a été effectué afin de comparer les rendements en protéine, la qualité nutritive et certaines propriétés fonctionnelles de produits à base de protéine de soja préparés suivant les trois techniques suivantes :
A: La précipitation isoélectrique classique
pour la préparation d'un isolat de protéine de soja.
B: Le lavage isoélectrique classique pour la
préparation de concentré de protéine de soja.
C: Le lavage isoélectrique suivant l'invention
<EMI ID=106.1>
nence, pour la préparation d'une p.v.p.
Afin de créer une comparaison valable du procédé
de l'invention (C) avec les procédés classiques de préparation de protéine de soja (A et B), on a utilisé la même substance brute dans les trois cas. De même, les essais ont été effectués de telle manière que les températures correspondantes et les durées de traitement soient les mêmes dans les trois cas. Uniquement les valeurs de pH étaient différentes étant donné les différences fondamentales entre les trois essais.
A. La précipitation isoélectrique classique pour la
préparation d'un isolat de protéine de soja.
On a extrait 425,8 g de farine de soja (Sojamel
13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3574,2 g d'eau
<EMI ID=107.1>
NaOH 4 N. Après une agitation d'1 heure, on a centrifugé la suspension à 3000 x g pendant 15 minutes en utilisant
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à une nouvelle extraction avec de l'eau jusqu'à atteindre Un poids total de 4000 g. On a maintenu la
<EMI ID=109.1>
4 N et on a agité la suspension pendant 1 heure. On a effectué la centrifugation et le pesage du produit de centrifugation II et du précipité II comme décrit ci-dessus. On a retiré des échantillons des produits de centrifugation I et II et du précipité II pour les analysés . suivant Kjeldahl et pour la mesure des matières sèches. Ensuite, les produits de centrifugation I et II ont été agités et maintenus à 50[deg.]C. La protéine a ensuite été précipitée isolélectriquement à pH 4,5 au moyen de 45 g de HC1 6 N.
<EMI ID=110.1>
protéine par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation III a été pesé et analysé pour les déterminations Kjeldahl-N et les mesures de matière sèche. La phase solide III a été pesée et lavée
à l'eau en une quantité correspondant au poids du produit
<EMI ID=111.1>
par centrifugation à 3000 x g pendant 15 minutes. Le produit de centrifugation IV et la phase solide IV ont été pesés. Le produit de centrifugation IV a été analysé pour la détermination de Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. La phase solide a été mise en suspension
<EMI ID=112.1>
moyen de 17 g de NaOH 4 N. Le mélange a été maintenu en agitation pendant 1 heure et on a de nouveau règle le pH à 6,5, si nécessaire. Finalement, le produit a été lyophilisé, pesé et analysé pour la détermination suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. Les calculs de bilan massique sont représentés au tableau 3.1.
Tableau 3.1 :Calculs du bilan massique de la précipitation
isolélectrique classique pour la préparation d'un isolat de protéine de soja.
<EMI ID=113.1>
B. Lavage isoélectrique pour la préparation d'un concentré
de protéine de soja.
On a lavé 425,6 g de farine de soja (Sojamel 13
<EMI ID=114.1>
C. On a réglé le pH à 4,5 au moyen de 44,8 g de HC1 6 N. On a effectué le lavage pendant 4 heures en agitant. La suspension a ensuite été centrifugée à 3000 x g pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (modèle Beckman J-6B) utilisant 4 bechers d'1 1. Le produit de centrifuga-
<EMI ID=115.1>
suivant Kjeldahl-N et la mesure des matières sèches. La
<EMI ID=116.1>
l'eau jusqu'à un poids total de 4000 g. Le pH a de nouveau été règle à 4,5 au moyen de 1,7 g de HC1 6N et on a main-
<EMI ID=117.1>
On a effectué une centrifugation et une pesée du produit de centrifugation II et des solides II comme précédemment.
La phase solide II a été remise en suspension dans 1575 g
<EMI ID=118.1>
C pendant une heure et on a de nouveau règle le pH à 6,5, si nécessaire. Finalement le produit de protéine a été lyophilisé, pesé et analysé suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matières sèches. Le bilan massique est '. représenté dans le tableau 3.2.
<EMI ID=119.1> . pour la préparation d'un concentré de protéine de soja.
<EMI ID=120.1>
C. Lavage isoélectrique comprenant une enzyme solubilisant
la rémanence, pour la préparation d'une p.v.p.
On a lavé 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) dans 3524,2 g d'eau à
<EMI ID=121.1>
6 N. On a dissous 24 g de la préparation SPS-ase, KRF
68 Bill .(exemple 1) dans 26 g d'eau et on l'a ajoutée au mélange de lavage. On a ensuite effectué le lavage pendant 4 heures sous agitation. On a ensuite effectué la purifi-
<EMI ID=122.1>
de NaOH 4 N et d'eau pour la nouvelle suspension étant les seuls paramètres présentant des valeurs différentes. Le bilan massique est représenté dans le tableau 3.3.
Tableau 3.3.: Calcul du bilan massique du lavage isoélec-
trique comportant une enzyme solubilisant la rémanence pour la préparation d'une p.v.p.
<EMI ID=123.1>
1) Analysé par Bioteknisk Institut, Holbersvej 10, DK-6000
Kolding, Danemark
2) Analysé par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169,
DK-8000, Aarhus C, Danemark
Propriétés nutritives
Les compositiors en acides aminés des trois produits de protéine ont été déterminées, voir tableau 3.4. La teneur totale en acides aminés essentiels, la teneur chimique et l'indice d'acides aminés essentiels (EAAI) sont calculés en utilisant le document de référence FAO de 1957.
La teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits a été déterminée au moyen de la méthode décrite dans A.O.C.S. Tentative Method Ba 12-75 (A.O.C.S. est une abréviation pour American Oil Chemists' Society). Les résultats sont représentés dans le tableau 3.5 qui comporte également les rendements et le rapport protéine/matière sèche des trois produits.
Tableau 3.4.: Conposition d'acides aminés et évaluation nutritive
des trois produits de protéine A, B, et C
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
sur le- document de référence FAO de 1957.
Tableau 3.5.: Caractéristiques du processus et teneur en
inhibiteur de trypsine des trois produits de protéine A, B et C
<EMI ID=126.1>
Propriétés fonctionnelles
<EMI ID=127.1>
Nitrogen solubility index) a été déterminé respectivement, dans une dispersion de protéine à 1 % à pH 7,0 dans NaCl 0,2M et dans l'eau distillée. Après avoir agité pendant 45 minutes au moyen d'un agitateur magnétique, on a centrifugé la suspension à 4000 x g pendant 30 minutes et on a analysé le surnageant pour déterminer l'azote. La solubilité de l'azote a été calculée c omme , le rapport ... % N soluble/ % N total. Les résultats de cette détermination effectuée sur les trois produits sont représentés dans le tableau 3.6.
<EMI ID=128.1>
trois fois sur chaque produit par un titrage de Swift légèrement modifié. 4,0 g de (N x 6,25) du produit ont été
<EMI ID=129.1>
la suspension dans un récipient mélangeur en verre et on y a ajouté 50 ml d'huile de soja. Le mélange total a ensuite été pesé. Le mélange huile-eau a ensuite été homogénéisé à 10.000 tours/minute, le récipient étant disposé dans un bain de glace. On a ajouté une quantité supplémentaire d'huile de soja à une vitesse de 0,3 ml par seconde jusqu'à ce que l'émulsion s'effondre. La quantité totale d'huile ajoutée avant le "point final" a été déterminée par pesage.
La capacité d'émulsification est calculée comme le nombre de ml d'huile par gramme de protéine
(N x 6,25). La densité de l'huile a été supposée égale à Or 9 g/ml.
Les résultats moyens de la détermination de la capacité d'émulsification des trois produits sont représentés au tableau 3.6.
<EMI ID=130.1>
250 ml d'une dispersion aqueuse des échantillons de protéine à la vitesse III pendant 4 minutes dans un agitateur Hobart (modèle N-50) comportant un fouet en forme de fil. L'expansion au fouettement a été calculée selon la formule
Expansion au fouettement = V-250 x 100 %
250
dans laquelle V représente le volume de fouettement final en ml.
<EMI ID=131.1>
cipient mélangeur avec de l'eau. On a doublé les essais de chacun des trois échantillons. Les résultats moyens sont représentés au tableau 3.6.
La_stabilité_de_la mousse est déterminée en tant que rapport entre la quantité de mousse abandonnée après égouttage pendant 30 minutes et la quantité de mousse à l'origine. Un gramme de mousse produite parle procédé précédent a été introduit dans un cylindre en plastique
(diamètre 7 cm, hauteur 9 cm) comportant un filet à mailles de 1 mm x lmm. Le cylindre a été disposé au-dessus d'un entonnoir monté sur un cylindre en verre et le poids (B) du liquide égoutté dans le cylindre en verre est mesuré. La stabilité de la mousse FS (foam stability) est déterminée par l'équation
<EMI ID=132.1>
Les résultats de la mesure sont représentés au tableau 3.6.
<EMI ID=133.1>
description en tant que la viscosité de Brookfield mesurée au moyen de mandrins T sur un statif de Brookfield . Helipath. Les gels sont produits par traitement thermique de suspensions de protéine à 12 % dans du NaCl 0,5 M. Le traitement thermique a été effectué dans des bidons fermés ayant un diamètre de 7,3 cm et une hauteur de 5,0 cm, plongés dans un bain d'eau, pendant 30 minutes, maintenus à
80 et 100[deg.]C. Les bidons ont été refroidis et thermostati-
<EMI ID=134.1>
mesures. Les résultats de ces mesures sont représentés dans le tableau 3.6.
Tableau 3.6.: Propriété fonctionnelles des trois substances
de protéine A, B, et C
<EMI ID=135.1>
Exemple 4 (exemple d'application)
On a produit une p.v.p. suivant.le processus décrit à l'exemple 3 C sauf que l'activité de cellulase était partiellement dérivée du Trichoderma reseei. La préparation de cette cellulase commerciale CELLUCLAST, produite par Novo Industri A/S, a été traitée au moyen d'une base à faible température de lamanière suivante. Le pH d'une solution à 10 % de CELLUCLAST dans l'eau a été réglé à 9,2 au moyen de NaOH, et la solution résultante a été
<EMI ID=136.1>
pendant la nuit et ensuite été filtrée de manière stérile. Le produit de filtration a été lyophilisé. On a ajouté 4g du produit lyophilisé à la préparation ae SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1). Les deux enzymes ont été dissoutes dans 172 g d'eau avant d'être ajoutées au mélange de lavage. Les déterminations du bilan massique de cet : exemple sont.représentées dans le tableau 4.1.
L'essai prouve que cette préparation particulière de SPS-ase contient déjà une ceLlulase efficace étant donné qu'une addition de CELLUCLAST ne semble pas affecter le rapport protéine/matière sèche. Cependant, d'autres préparations de SPS-ase peuvent contenir moins de cellulase, par exemple KRF 92, voir le tableau précédant immédiatement l'exemple 2.
Tableau 4.1: Calculs du bilan massique du lavage isoélectrique comportant une préparation de SPS-ase
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
Exemple 5 (exemple d'application)
On a produit une p.v.p. suivant le procédé décrit dans l'exemple 3 C sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur de 5 et que le mélange réactionnel est <EMI ID=139.1>
des résultats analytiques en rapport avec les produits de centrifugation, on obtient un rendement théorique en protéine précipitée, comme montré dans le tableau 5.1. Tableau 5.1.: Rendements théoriques en protéine obtenus
lors de la prpduction d'une p.v.p.
<EMI ID=140.1>
aMoyenne de 87,5 (Bioteknisk Institut) et 86,9 (Qvist's Laboratorium) ; la teneur en matière sèche est respectivement 97,6 et 98,0 %.
Calculé en tant que masse totale de protéine - la perte en protéine dans les produits de centrifuqations.
Exemple 6 : (exemple d'application)
Démonstration de la liaison protéique du SPS.
<EMI ID=141.1>
On a dissous 40 g de (Nx6,25) d'un isolat d'une protéine de soja commerciale (Purina 500E de Ralston Purina) dans 680 g d'eau. On a chauffé le mélange dans un bain d'eau à 50 [deg.]C et on a réglé le pH à 4,50 au moyen de
<EMI ID=142.1>
solution aqueuse contenant respectivement 0 g, 0,2 g, 0,4g 0,8 g et 1,6 g du SPS préparé comme décrit précédemment dans ce mémoire. Les flacons ont ensuite été maintenus sous agitation au moyen d'un aimant dans un bain
<EMI ID=143.1> pendant 15 minutes et les produits de centrifugation I ont été analyses suivant Kjeldahl-N et pour la détermination des matières sèches. Les phases solides ont été lavées à l'eau à température ambiante et centrifugées une nouvelle fois. Cette étape a été répétée. Ensuite on a dispersé les solides dans 50 ml d'eau et on a règle le pH à 6,50 par une addition goutte à goutte de NaOH 6 N. Les produits neutralisés ont été lyophilisés et analysés suivant Kjeldahl-N et pour déterminer les matières sëches(MS). En se basant sur les analyses représentées au tableau 6.1, on a calculé le pourcentage de protéine récupérée et le pourcentage de SPS qui a été lié à la protéine au moyen des formules représentées en relation au tableau 6.2.
Cet exemple démontre que le SPS est lié intimement à la protéine de telle sorte que le rapport protéine/ matière sèche diminue pour une teneur croissante en SPS.
Le rapport protéine/SPS présent dans la farine de soja correspond à une teneur en SPS comparable à environ 0,4 g dans 10 g d'eau, ajouté à 5 g d'isolat de protéine.
Le pourcentage de liaison du SPS est une valeur calculée. Le pourcentage de liaison du SPS diminue à cause de la saturation de la protéine en SPS aux faibles rapports protéines/SPS.'.
rableau 6.1.: Mesures suivant l'exemple 6
<EMI ID=144.1>
Tableau 6.2.: Récupération de protéine et pourcentage de
liaison du SPS
<EMI ID=145.1>
Pourcentage de récupération de protéine =
<EMI ID=146.1>
NC 1 = pourcentage d'azote dans le produit de centrifugation I.
<2>) pourcentage de liaison du SPS =
<EMI ID=147.1>
où,. (%, P/H) est le rapport protéine/matière sèche dans le précipité séché, et
(% P/H)� se rapporte au précipité sans addition de SPS. Exemple 7 (exemple d'application)
Cet exemple décrit la préparation d'une p.v.p. en utilisant la préparation de SPS-ase KRF 92 B-I comportant 5 % de matière sèche. Le procédé de préparation est le même que celui de l'exemple 3 C, sauf que toutes les masses sont divisées par un facteur 5. La p.v.p. a été analysée comme décrit à l'exemple 2. Les résultats obtenus dans l'essai apparaissent dans le tableau 7.1.
Tableau 7.1.: Résultats obtenus à l'exemple 7
<EMI ID=148.1>
<EMI ID=149.1>
Kolding.
Analyse par Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C.
Exemple 8 (exemple d'application) :
Cet exemple montre l'effet d'un pré-traitement de la farine de soja par une cuisson au jet de vapeur avant la préparation de la p.v.p.
<EMI ID=150.1>
Une suspension de farine de soja dans l'eau consistant en 10 kg de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik A/S) par 100 kg a été pompée à travers un êjecteur de vapeur (type Hydroheater B-300) et mélangée avec de la vapeur à 8 Bar en une telle quantité et à une telle vitesse qu'on a pu maintenir une température finale
<EMI ID=151.1>
pressurisé. Ensuite la pression a été réduite dans une chambre de détente (un cyclone) d'où la suspension a été envoyée dans un échangeur de chaleur à plaque dans lequel elle a été refroidie à environ 50[deg.]C. La boue refroidie a pu être utilisée telle quelle pour la préparation de p.v.p. suivant l'invention, mais, dans ce cas, la suspension a été sèchée par pulvérisation à une température d'entrée
<EMI ID=152.1>
Préparation de la p.v.p.
Cette préparation a été effectuée de la manière suivante :
On a mis 70 g de matière sèche de farine de soja cuite au jet de vapeur et sèchée en suspension et on a
<EMI ID=153.1>
règle le pH à 4,50 au moyen de 6,5 ml d'HCl 6N. On a transféré 6 x 90 g de cette suspension dans 6 Erlenmeyexs de
<EMI ID=154.1>
d'eau au moyen d'agitateurs magnétiques. A chaque flacon d' Erlenmeyer on a ajouté 10 g d'une solution contenant respectivement 0 g, 0,025 g, 0,050 g, 0,10 g, 0,20 g et
0,40 g de la préparation de SPS-ase KRF-68-B-III. Les mélanges réactionnels sont ensuite agités pendant 240 minutes
<EMI ID=155.1>
15 minutes à 3000 x g.
Le surnageant a ensuite été analysé suivant la méthode de Kjeldahl-N et la phase solide a été lavée à l'eau à volumes égaux et a été centrifugée. cette opération
a été effectuée deux fois. La phase solide a ensuite été lyophilisée et analysée pour la détermination de Kjeldahl-N et des matières sèches.
Un essai semblable a été effectué avec une farine de soja non traitée (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) utilisée en tant que substance de départ. Dans ce cas, les rapports de l'enzyme au substrat étaient de 0 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % et 8 %.
En se basant sur la teneur en protéine des surnageants, on a pu calculer le pourcentage de protéine récupérée . Le rendement en protéine est basé sur l'hypothèse: que la substance d'enzyme est solubilisée à 100 % après la réaction. Le tableau ci-dessous indique les résultats obtenus par les deux essais.
Tableau 8.1.: Rendements en protéine et rapport protéine/
matière sèche pour une p.v.p. préparée à partir de farina de soja cuite ou brute.
<EMI ID=156.1>
Exemple 9
Isolement de protéine à partir du gluten de mais.
Le gluten de mais est habituellement produit en tant que produit secondaire dans le processus de fabrication d'amidon de mais. Ce gluten de maïs brut n'est pas efficacement séparé de la fraction fibreuse et c'est là
une des raisons pour lesquelles il ne présente aucune propriété fonctionnelle intéressante.De même, différents polysaccharides dégradables accompagnent le gluten de mais brut.
<EMI ID=157.1>
avec une préparation de SPS-ase produite suivant l'exemple 1, sauf qu'une ultrafiltration a été effectuée au lieu de
<EMI ID=158.1>
isolée a été soumise à un traitement de base suivant le procédé A (pour des raisons de brièveté cette préparation de SPS-ase soumise à un traitement de base est dénommée dans la suite PPS 1305). La PPS 1305 ne contient pratiquement pas d'activité protéolytique.
<EMI ID=159.1>
utilisées :
<EMI ID=160.1>
La substance de protéine a été purifiée par centrifugation, lavée deux fois et finalement lyophilisée.
Les résultats sont repris dans le tableau 9. Tableau 9.
<EMI ID=161.1>
Exemple 10 : Isolement de protéine à partir de farine de
coton brut, de farine de tournesol ou de farine de colza
Les protéines provenant de farine de graines de coton, de farine de tournesol ou de farine de colza peuvent être séparées de la même manière que les protéines provenant d'une farine de soja ou de gluten de mais. L'isolement de protéines provenant de différentes autres substances brutes végétales renfermant des protéines peut être effectué de la même manière. Naturellement, l'isolement et/ou la séparation doivent être effectués de préférence au point isolélectrique de la partie principale de la part de protéine de la substance de départ, le rendement en
protéine étant de cette façon maximal.
Afin d'être plus clair, on donne ci-dessous un aperçu des figures auxquelles on a déjà fait référence.
<EMI ID=162.1>
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
1. Agent pour la décomposition de la rémanence végétale, notamment de la rémanence de soja, en présence d'une protéine végétale, en particulier de la protéine de soja, et convenant pour la préparation d'une p.v.p.
<EMI ID=165.1>
partir d'une protéine végétale qui peut être dégraissée ou partiellement dégraissée, agent contenant une enzyme à activité de 'solubilisation de la rémanence, caractérisé* en ce qu'il contient une enzyme capable de décomposer le SPS de soja (SPS-ase) et en ce qu'il est essentiellement exempt d'activité protéolytique.