DK150495B - Middel til nedbrydning af vegetabilsk remanens, isaer sojaremanens - Google Patents

Description

150495

Den foreliggende opfindelse angår et middel til anvendelse ved fremstilling af et renset vegetabilsk proteinprodukt, især et sojaproteinprodukt, med en proteinrenhed på ca>"90% med et vegetabilsk protein, der kan være affedtet eller partielt affedtet, som udgangsmateriale, og hvilket middel omfatter et enzym med remanens-solubiliserende aktivitet.

En fremgangsmåde til fremstilling af et renset vegetabilsk proteinprodukt (pvp) ved enzymatisk fjernelse a£ remanensen, uden opløsning og genbundfældning af proteinet/ er beskrevet i belgisk patentskrift nr. 882 769.

I 'dette patentskrift beskrives også vigtigheden af det forhold, at den proteolytiske aktivitet bør holdes på. et så lavt' -niveau som muligt. Renheden af det pvp, som kan opnås under anvendelse af den kendte metode, er ikke tilfredsstillende, og .det er derfor ønskværdigt, at den forbedres. I eksemplerne blev det påvist, at man kunne opnå en renhed af pvp på ca. 85%. Selvom det i henhold til den kendte metode er muligt at opnå et pvp med en renhed på ca. 90%, er..dette kun muligt med visse forbehandlede udgangsmaterialer, f.eks. sojaproteinkoncentrat. Det ville være ønskværdigt at være i stand til at opnå en renhed af pvp på ca. 90% med et langt bredere spektrum af udgangsmaterialer, især afskallet og affedtet sojamel.

Opfindelsen bygger på den overraskende erkendelse, at en vis del af det nedbrydningsprodukt af remanensen, som foreligger under den før angivne enzymatiske behandling, nemlig et vandopløseligt, højmolekylært - 2 · 150495 kulhydrat, binder sig til en del af proteinet, hvilket vil blive forklaret detaljeret senere i denne beskrivelse.

Dette resulterer naturligvis i en lavere renhed af proteinet.

Det er således opfindelsens formål at tilvejebringe et middel til nedbrydning af vegetabilsk remanens, i nærværelse af vegetabilsk protein, hvorved den vegetabilske remanens især er sojaremanens, hvilket vil resultere i et pvp med forbedret renhed.

Det grundlag, hvorpå opfindelsen bygger, kan . beskrives på følgende måde, idet der henvises til fig. 1, hvorpå kun materialer, der foreligger som uopløste tørstoffer, er angivet, hvorimod alle supernatanter er udeladt. En portion sojamel blev delt i to lige store dele, del I og del II (søjle a på fig. 1). Del I blev nedbrudt proteolytisk ved en pH-værdi på ca. 8 ved hjælp af ALCALASE (et proteolytisk enzym fremstillet ved hjælp af B. licheniformis og markedsført af NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd, Danmark), og derpå yderligere vasket ved pH ca.

8 for at eliminere hele proteinmængden, og remanensen blev separeret fra supernatanten og vasket (se del I, søjle a og b, fig. 1) På denne måde isoleredes en ren remanens (betegnet remanens I) (søjle b på fig. I). Del II af sojamelet blev ikke behandlet; for kortheds skyld betegnes remanensen i del II som remanens II (søjle b på fig. 1).

Nu nedbrydes både remanens I og del II ved hjælp af en kommerciel pectinase. f.eks. PECTINEX (et pectolytisk enzyme fremstillet af Schweizerische Ferment AG, Basel,

Schweiz) (se søjle b og c på fig. 1). Det viser sig overraskende, at den uopløste del af remanens I er meget mindre end den uopløste del af remanens II, på basis af massebalancer af nitrogen og tørstof, se fig. 1, hvor de skraverede arealer i søjle c svarer til uopløselige ikke-proteinmaterialer i det førangivne trin. Hvis yderligere _ 3 - 150495 supernatanten fra den pectinasebehandlede remamens I bringes i kontakt med en sojaproteinsuspension ved pH 4,5, bindes et polysaccharid i supernatanten til sojaproteinet. Dette polysaccharid i supernatanten fra remanens I, som er del af remanensnedbrydningsproduktet, og som er klart opløseligt i vand i fravær af sojaprotein, men som bindes til sojaprotein ved eller omkring sojaproteins isoelektriske punkt, hvis sojaprotein er til stede, betegnes SPS (soluble polysaccharide), se fig. 1.

SPS har en molekylvægtsfordeling mellem 5 x 10 og 4,9 x 10^. Fremstillingen af isoleret SPS fremgår af det på fig.

2 viste strømningsdiagram, som også omfatter nogle af de processer, der er afbildet på fig. 1. Problemet er således at finde et middel, der er i stand til at nedbryde SPS på en sådan måde, at SPS-nedbrydningsprodukterne ikke bindes til sojaprotein eller bindes til sojaprotein i et langt mindre omfang end SPS bindes til sojaprotein.

Skønt der i beskrivelsen hovedsageligt er henvist til nedbrydning af sojaprotein, gælder tilsvarende forhold for alle arter af vegetabilske proteiner, se f.eks. de proteiner, der er anført i belgisk patentskrift nr. 882.769 side 1.

Det har ifølge opfindelsen vist sig, at det ved at screene for evnen til at dekomponere soja-SPS er muligt at selektere mikroorganismer tilhørende slægten Aspergillus, der er i stand til at fremstille en forbindelse, som udviser en enzymatisk aktivitet, der på effektiv måde kan nedbryde soja-SPS, i det følgende for kortheds skyld betegnet en SPS-ase.

I overensstemmelse dermed kan det angives, at en SPS-ase er en carbohydrase, som er i stand til under passende betingelser at nedbryde soja-SPS til nedbrydningsprodukter, der i et vandigt medium binder sig til vegeta- _ 4 - 150495 bilsk protein i mindre omfang end soja-SPS før nedbrydningen ville have bundet sig til det samme vegetabilske protein under tilsvarende betingelser.

Midlet ifølge opfindelsen er således ejendommeligt ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

Midlet er i det væsentlige frit for proteolytisk aktivitet, når den proteolytiske aktivitet er lig med eller mindre end den proteolytiske aktivitet, som vil ledsages af et totalt proteintab i det færdige pvp på ikke over 30%, fortrinsvis ikke over 15%, især ikke over 10%, når ca. 65% af remanensen er blevet solubiliseret, på basis af en nitrogen-tørstofmassebalance.

Det har vist sig, at denne SPS-ase, der er i stand til at nedbryde soja-SPS, kan nedbryde polysaccharider, der er af lignende art som SPS, og som hidrører fra grøntsager og frugter, mere fuldstændigt end kommercielle pectinaser og kommercielle cellulaser.

Ved total eller partiel eliminering af SPS fra det sluttelige vegetabilske protein må renheden af det sluttelige vegetabilske protein nødvendigvis forbedres i sammenligning med renheden af det sluttelige vegetabilske protein, som er opnåeligt i henhold til den fremgangsmåde, der er kendt fra belgisk patentskrift nr. 882.769, fordi dette kendte vegetabilske produkt var kontamineret med SPS.

På nuværende tidspunkt vides det ikke, om den særlige SPS-ase, der beskrives i det følgende, afleder sin enzymatiske aktivitet fra et enkelt enzym eller fra et enzymkompleks omfattende mindst to enzymer. Visse undersøgelser synes at vise, at mindst to enzymer er ansvarlige for den SPS-ase-nedbrydende effekt, hvorved et af disse enzymer kun er i stand til at gennemføre en mindre nedbrydning af SPS, hvorefter et eller flere enzymer er i stand til at gennemføre en mere gennemgribende nedbrydning af SPS.

150495 - 5 -

En foretrukken udførelsesform for midlet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 angivne. Den samme SPS-ase kan fremstilles ved hjælp af Aspergillus japonicus IFO 4408. Det har vist sig, at Aspergillus aculeatus CBS 101.43 også frembringer meget potente remanaser, cellulaser, pectinaser og hemicellulaser. Det har desuden vist sig, at ikke alle stammer hørende til arterne Aspergillus aculeatus eller Aspergillus japonicus giver anledning til dannelsen af SPS-ase ifølge opfindelsen. Det fremgår således af et senere afsnit i denne beskrivelse (sektion 5), at det er påvist, at stammen -Aspergillus japonicus ATCC 20236 ikke giver anledning til dannelsen af sådanne mængder af en SPS-ase, som kan konstateres ved hjælp af den enzymatiske bestemmelsesmetode for SPS-ase, som er beskrevet i denne beskrivelse.

En foretrukken udførelsesform for midlet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 3 angivne*. Denne cellulasé er i stand til at opløse krystallinsk cellulose, og midlet giver anledning til dannelsen af et pvp med høj renhed.

En foretrukken udførelsesform for midlet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 4 angivne.

I Agr.Biol.Chem. 40(1), 87-92, 1976 er det beskrevet, at en stamme af Aspergillus japonicus, ATCC 20236, producerer et enzymkompleks, der er i stand til at frembringe en partiel nedbrydning af et surt polysaccharid i sojasauce, betegnet APS, hvoraf en fraktion er betegnet APS-I. Dette sure polysaccharid er ikke identisk med SPS, hvilket på mere detaljeret måde vil blive vist i sektion 3 i denne beskrivelse. HPLC-gelfiltreringskromatogrammerne af SPS og APS er således tydeligt forskellige, og yderligere er gelfiltrer-ingskromatogrammerne af APS, som er nedbrudt ved hjælp af den kommercielle pectinase Pectolyase, og af SPS, der er behandlet med den kommercielle pectinase Pectolyase, tydeligt forskellige. Desuden fremgår det ikke af artiklen, at det sure “ 6 " 150495

Polysaccharid bindes til sojaproteinet, og at det nedbrudte sure polysaccharid ikke bindes til sojaproteinet i en langt mindre udstrækning end det ikke-nedbrudte, sure polysaccharid. Det er også blevet vist, at denne stamme ikke danner SPS-ase i sådanne mængder, som kan konstateres ved hjælp af den enzymatiske bestemmelsesmetode for SPS-ase, der er beskrevet i denne beskrivelse. Dette skabte en fordom imod, at nogen stamme af Aspergillus japonicus skulle være i stand til at producere en SPS-ase, men det har overraskende vist sig, at nogle stammer af Aspergillus japonicus er SPS-ase-producenter.

SPS-asen i midlet ifølge opfindelsen kan hensigtsmæssigt være immunelektroforetisk identisk med den SPS-ase, der kan fremstilles ved hjælp af Aspergillus aculeatus CBS 101.43, og som kan identificeres ved hjælp af den immun-elektroforetiske overlejringsteknik. Der henvises til sektion 6 og 7.

I midlet ifølge opfindelsen er forholdet mellem den proteolytiske aktivitet i HUT-enheder og den remanens-solubiliserende aktivitet i SRUM-120-enheder hensigtsmæssigt under ca. 2:1, fortrinsvis under 1:1, især under 0.25:1.

Det har vist sig, at der foreligger en tydelig korrelation mellem proteaseaktiviteten udtrykt i HUT-enheder (som senere vil blive defineret) ved pH 3.2 (proteasens pH-aktivitetsoptimum) og proteintabet. Denne korrelation er specifik for det SPS-ase-præparat, som kan fremstilles ved hjælp af Aspergillus aculeatus CBS 101.43. Det må forstås, at denne korrelation ikke nødvendigvis vil foreligge i forbindelse med en anden SPS-ase-dannende mikroorganisme, som danner en SPS-ase, der afviger fra den SPS-ase, som kan produceres ved hjælp af CBS 101.43, men at en sagkyndig på området vil være i stand til at finde en lignende korrelation, som vil opfylde det krav i forbindelse med proteintab, der er angivet i hovedkravet. SRUM-120-aktiviteten (som vil blive defineret senere) er et mål for konventionel remanens-solubiliserende aktivitet, cellulase-, pectinase- og hemi-cellulase-aktivitet og andre aktiviteter. SRUM-120-enhederne måles ved pH 4,5. Det må forstås, at dette pH er valgt, fordi nedbrydningen af remanensen gennemføres ved eller omkring sojaproteinets isoelektriske pH, _ 7 _ 150435 og at man må anvende en anden enzymaktivitetsbestemmelse, hvis nedbrydningen af remanensen gennemføres ved en anden pH-værdi.

Kun den doserede mængde af SPS-ase-aktiviteten (i SAE-enheder) ved behandling af sojamel kan angives, nemlig mindst ca. 35 SAE-enheder per 100 g jet-kogt sojamel og 350 SAE-enheder per 100 g ikke kogt sojamel. I praksis er det nøjagtige indbyrdes forhold mellem de enzymaktiviteter, der er nødvendige til nedbrydning af en vis mængde SPS, ikke kendt, og derfor kan der ikke angives minimale doser og egenskaber hvad angår pectinase, cellulase og hemicellulase.

Imidlertid kan man angive en sammensat aktivitet ved behandling af sojamel i SRUM-enheder, nemlig mindst ca. 60 SRUM-120 enheder per 100 g kogt sojamel og 600 SRUM-120 enheder for ikke opvarmet mel. Det antages, at de i det følgende i form af eksempler angivne værdier er mere end de minimale doser. Man må forsøge sig frem for at etablere optimale driftsproportioner og reaktionstid for det sojasubstrat, der skal konverteres til pvp.

For at tydeliggøre naturen af opfindelsen skal der henvises til de følgende sektioner 1-10, som alle beskriver detaljer i forbindelse med opfindelsen: - 8 ~ 150495 1. Fremstilling af SPS.

2. Karakterisering af SPS, især molekylvægtsfordelingen deraf.

3. Dokumentation for, at SPS og APS er forskellige.

4. Screening for SPS-ase-producerende mikroorganismer.

5. Karakterisering af nogle SPS-ase-dannende mikroorganismer.

6. Generel beskrivelse af overlejringsteknik i forbindelse med iimvunelektroforese.

7. IiriTTunelektroforetisk karakterisering af SPS-ase med poly-specifikt antistof og overlejring.

8. Rensning af et SPS-ase-pragparat.

9. pH-aktivitets-afhængighed, tenperatur-aktivitetsafhængighed og stabilitet af en SPS-ase.

10. Enzymatiske aktivitetsbesteimelser.

SEKTION 1.

PRODUKTION AF SPS.

Som før anført kan udgangsmaterialet til fremstilling af SPS være sojaremanens. Derfor beskrives fremstillingen af sojaremanens først.

Sojareraahens er den proteinfri kulhydratfraktion (der i praksis kan indeholde mindre mængder lignin og mineraler) i affedtet' og afskallet sojamel, hvilken kulhydratfraktion er uopløselig i -et vandigt medium ved pH 4,5, og den kan fremstilles på følgende måde, hvorved der også henvises til strømningsdiagram 1.

Affedtet sojamel (sojamel 13 fra Aarhus Oliefabrik A/S) suspenderes i afioniseret vand ved 50°C i et vægtforhold sojamel:vand = 1:5 i én tank med pH-stat og temperaturkontrol. pH indstilles på 8,0 med 4 N NaOH (I). Nu gennemføres en pH-stat-hydrolyse med ALCALASE 0,6 L (et proteolytisk enzym på basis af B. licheniformis med en aktivitet af 0,6 Anson-enheder/g, hvorved aktiviteten bestemmes i henhold til Anson- " 9 ’ 150495 metoden, som beskrevet i NOVO ENZYME INFORMATION IB nr. 058 e-GB), hvorved forholdet enzym/substrat er lig med 4% af proteinmængden i sojamelet (II). Efter en hydrolyse på 1 time separeres slammet ved centrifugering (III) og vaskning (IV), hvorved denne operation gennemføres to gange (V, VI, VII).

Det således behandlede slam hydrolyseres endnu en gang i 1 time med ALCALASE 0,6 L (VIII, IX) på lignende måde som angivet i det foregående. Derpå separeres slammet ved centrifugering (X) og vaskes to gange (XI, XII, XIII» XIV), hvorved det sluttelig? slam (6) sprøjtetørres (XV). Det således fremstillede, sprøjtetørrede pulver er den sojaremanens, der tjener som råmateriale til fremstilling af SPS.

SPS er den vandopløselige polysaccharidfraktion, der fremkommer ved konventionel behandling af den ovenfor angivne sojaremanens med pectinase. SPS fremstilles på følgende måde under anvendelse af i det følgende angivne 14 reaktionstrin, idet der også henvises til strømningsdiagram 2.

1· Tørstofindholdet i den ovenfor angivne soja remanens bestemmes, og sojaremanensen fortyndes med vand til 2% tørstof og holdes i suspension ved 50°C i en tank med temperaturkontrol.

2. pH-værdien indstilles på 4,50 med 6 N NaOH.

3· I en mængde af 200 g/kg tørstof tilsætter man

Pectinex Super cone. L (en kommerciel pectinase fra Schweizerische Ferment AG, Basel, Schweiz med en pectinaseaktivitet på 750.000 MOU, bestemt i henhold til brochuren "Determination of the Pectinase Units on Apple Juice (MOU)" af 12.6.1981, som kan rekvireres fra Schweizerische Ferment AG,

Basel, Schweiz), og tillige tilsætter man i en mængde af 20 g/kg tørstof Celluclast 200 L (en kommerciel cellulase, der er beskrevet i brochuren NOVO ENZYMES, information sheet B 153 e-GB 1000 juli, 1981, som kan rekvireres fra NOVO INDUSTRI A/S, Novo Alle, 2880 Bagsværd, Danmark) .

" 10 ' 150435 4. Tankens indhold holdes ved 50°C i 24 timer vander omrøring.

5. Enzymerne inaktivéres ved at hæve pH-værdien til 9/0 med 4 N NaOK. Reaktionsblandingen lades henstå i 30 minutter/ og pH-værdien bliver derpå genindstillet til 4,5 med 6 N HC1.

6. Reaktionsblandingen centrifugeres, og man opsamler både centrifugatet og slammet.

7. Centrifugatet fra trin 6 blankfiltreres på . en filterpresse (filtret vaskes med vand før blankfiltreringen).

8. Blankfiltratet bliver ultrafiltreret, diafiltreret og endnu en gang ultrafiltreret på en membran med en skilleværdi (cut-off value) på 30.000 (DDS GR 60-P fra De Danske Sukkerfabrikker) , hvorved man anvender følgende parametre: 1. Ultrafiltrering svarende til en volumenkoncentration på 6.

2. Diafiltrering indtil tørstofprocenten i permeatet er *0 (~ 0° Brix).

* 3. Ultrafiltrering til ca. 15% tørstof i koncentratet.

Temperaturen er 50°C, pH er 4,5 og det gennemsnitlige tryk er 3 bar.

150495 9. Det ultrafiltrerede koncentrat afkøles til 5°Cf og der tilsættes et ligeså stort volumen 96% ethanol.

- 11 - 10. Bundfaldet opsamles ved hjælp af en centrifuge.

11. Bundfaldet vaskes to gange med 50% v/v ethanol i HjO, svarende til voluminet af cen-irifugat fra trin 10, dvs. der foretages to centrifugeringer.

12. Det vaskede bundfald genopløses i vand med et volumen, der er lig med voluminet af det ultrafiltrerede koncentrat fra trin 9.

13. Væsken fra trin 12 blankfiltreres på et glasfilter. 1

Det klare filtrat indeholdende rent SPS frysetørres.

..150495 - 12 - STRØMNINGSDIAGRAM NR. 1 Affedtet sojamel H-0 NaOH til pH = 8 _A_£ - J/ ...

Hydrolyseblanding I

i' - - -— — .

Alcalase 0.6 I. Hydrolyse 1 time før viderebehandling, (E/S = 4%) ' pH-stat (dH = 8', T = 50°C)_

" ~ M

1. centrifugering III _Centri fuoat. 1 ^ Affald ' X Slam 1

H-O-)|l. vask IV I

* A

2. centrifugering V _Centr i fngat 2 y Affald

_,, Slam 2V

Ho0-/( 2. vask IVI

- - vi'------ 3. centrifugering |VIll_Centr!fngat 3 ^ Affald _s , Slam 3

Ho0 “^ Ny hydrolyseblanding VIII

NaOH til pH = 8 —s»» J, _

Alcalase 0,6 L JHydrolyse i 1 time før viderebehandling,

4 N NaOH_3PH-stat (pH = 8,0 T = 50°C) IX

^ 'i· -------- 4. centrifugering X--Cent-ri fngat. 4 n, Affald y _Slam 4

H~0-^ 1. vask XI

“ · ' ------- ^ -- 5. centrifugering XIl|-Centri fncrat S Affald

Slam 5 _,_SK-- H„0-i 2. vask ΧΙΪΙ I......I- η-i 16. centrifugering {XlVj-Contri fncrat 6 ^ Affald

Slam 6 _k__

Spray-tørring__XV

" 13 " 158495 STRØMNINGSDIAGRAM NR. 2 1000 g Pectinex Super Cone. L 5 kg sprøjtetørret remanens 100 ct Celluclast 250 S, _ --i_jL·_ύί_

Nedbrydning med pectinase og 247 1 HtO „ cellulase 2, 3, 4, 5 50°C; pH = e,5; t = 24 timer Λ - - t Centrifuaering - . -_ slam s 6 i, 1 . 38 kg'

Blankfiltrering --------b— -— J

Ultrafiltrering, diafiltrering, ~ 18 1 H?0_; ultrafiltrering . _241 1 permeat ^ 1 (GR 60P) (19 -~26°C) 8 / *"V" ·), ——- " —-- 5 1 50% C„U,-OH J Bundfældning . SuDernatant^9 ^3 --1-J- :-(Affald) 1 __-it—__

Centrifugering__._ Centri fucrat^. 10 vi/ ' Bundfældning 2 x vask 2 x centr i fuaa t^. 11 3/_ Bundfældning 2 1 H?Q jGenopløsninq 12 1·. ........'ir I—-

Blankf iltrerinq__Proteinslairw 13 -J-:-(Affald)

Frysetørring

310 g frysetørret SPS

" 14 " .150495 SEKTION 2.- 4 KARAKTERISERING AF SPS, ISER MOLEKYLVÆGTFORDELING DERAF.

Ved hjælp af gelkromatografi på HPLOudstyr (Vlaters pumpe model 6000, Waters datamodul 730 og Waters refraktometer R 4 01) bestemmes molekylvægtsfordelingen af det SPS, hvis fremstilling er gennemført som angivet i denne beskrivelse (fig. 4). Ved hjælp af den samme metode bestemmer man også molekylvægtsfordelingen af de nedbrydningsprodukter af SPS, der er fremkommet ved hjælp af SPS-ase {fig. 5). Under anvendelse af den samme metode har man tillige påvist bindingseffekten mellem sojaprotein og SPS {fig. 6) og fraværet af bindingseffekten mellem sojaprotein og SPS, der er nedbrudt ved hjælp af midlet ifølge opfindelsen (fig. 7). 1

KaDibreringskurven (logaritmen til molekylvægten afbildet imod R^, hvor R^-værdien for glucose arbitrært er defineret som 1 og R^-værdien for en specifik dextran er defineret som retentionstiden for denne dex-tran divideret med retentionstiden for glucose) er blevet etableret ved hjælp af adskillige standard-dextraner med kendte molekylvægte (T 4, T 10, T 40, T 70, T 110, .T 500) fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Box 175, S-75104,

Uppsala, Sverige. R^-værdien for maksimet for hver dextran-top er bestemt, og den tilsvarende molekylvægt er beregnet som fø,· hvorved Mw er den gennemsnitlige værdi for molekylvægten efter vægt og er den gennemsnitlige værdi af molekylvægten efter antal. Som eluent for denne kromatografiske metode har man anvendt 0,ϊ M NaNO^. De søjler, der anvendes ved den kromatografiske metode, er 60 cm PW 5000 efterfulgt af 60 cm PW 3000 fra Toyo Soda Manufacturing Co., Japan. På denne måde har man etableret afhængighedsforholdet mellem molekylvægt og R^ for de før angivne dextraner, jfr. fig. 3.

’ 15 ’- 150495 På basis af fig. 4 Han man beregne, at SPS har en molekylvægtfordeling, som svarer til en værdi af M på 5 — Δ w ca. 5,4 x 10 og en værdi af på ca. 4,2 x 10 . Af denne figur fremgår det også, at kromatogrammet udviser to udprægede toppe ved retentions tid 34,5 min. -(6%) svarende til en molekylvægt på ca. 5 x 106 og retentionstid 47,12 min.

(67%) svarende til en molekylvægt på ca. 4,9 x 104. Det fremgår også af denne kurve, at der foreligger en skulder mellem disse to toppe ved retentionstiden 41,25 min. (27%) c svarende til en molekylvægt på 2,8 x 10 .

Efter nedbrydning af SPS med SPS-ase blev hydrolyseblandingen membranfiltreret, og filtratet blev kroma-tograferet. Det viste sig, at ca. 55% af SPS nedbrydes til mono-, di- og trisaccharider, og at de resterende 45% nedbrydes til en polymer med tre toppe med følgende molekylvægte: 5 x 104, 104 og 4,4 x 10^, jfr. fig. 5.

For at påvise bindingseffekten mellem sojaprotein og SPS og den væsentlige reduktion af bindingseffekten mellem sojaprotein og SPS, der er nedbrudt ved hjælp af en SPS-ase, udførte man følgende forsøg.

3% SPS i 0,1 M acetatstødpude ved pH 4,5 tilsættes til en opslemning af sojaisolat (Purina E 500) for at danne en suspension med et forhold isolat/SPS på 10:1. Denne suspension inkuberes i 18 timer på et rystebad ved 50°C. Efter inkubering centrifugeres suspensionen, og den klare supernatant analyseres på HPLC som tidligere beskrevet. Det fremgår af fig. 6 i sammenligning med fig. 4, at SPS adsorberes fuldstændigt til sojaisolatet.

Man gennemfører det samme forsøg som angivet i det foregående afsnit med en 3% SPS-opløsning, der er hydrolyseret med en SPS-ase, som er fremstillet ved hjælp af CBS 101.43 (fig. 7). En sammenligning mellem fig. 7 og fig. 5 viser, at der ikke er nogen forbindelse i det hydrolyserede SPS med molekylvægt linder ca. 104, som er adsorberet til sojaisolat. Hydrolysen reducerer den kvantitative binding til ca.

- 16 “ 150495 10 - 15% i forhold til bindingen af SPS til sojaprotein.

En NMR-analyse af SPS/ hvis fremstilling er gennemført som angivet i denne beskrivelse/ afslører følgende approksimative sammensætning af SPS: 1) Of-galacturonsyre i en mængde af ca. 45%/ hvorved ca. 40% af den totale mængde ct-galacturonsyre er tilstede som methylester/ 2) rhamnopyranose i en mængde på ca. 20%/ 3) galactopyranose i en mængde på ca. 15% og 4) ^-xylopyranose i en mængde på ca. 20%.

Bestanddelene synes at foreligge i en struktur, der omfatter et rhamnogalacturonisk skelet og sidekæder af xylose og galactose.

Fuldstændig syrehydrolyse af SPS (8 timer i 1 N H2S04) og påfølgende TLC-analyse afslørede, at der også forelå mindre mængder af monosacchariderne fucose og ara-binose i det hydrolyserede SPS.

En HPLC-analyse af det SPS, der er nedbrudt af det SPS-ase-enzymkompleks, der dannes af CBS 101.43, viser en kraftig reduktion af molekylvægten. I overensstemmelse • dermed viser NMR-spektret af det SPS,'*der er nedbrudt som angivet i det foregående, at hovedparten af estergrupperne er forsvundet, og at også indholdet af xylose og galactose i det højeremolekylære materiale er formindsket. NMR-spektret åf den del af SPS-nedbrydningsproduktet, der bundfældes ved tilsætning af et volumen ethanol til volumen SPS-nedbryd-ningsprodukt, er af lignende art som NMR-spektret af SPS, med de før angivne modifikationer hvad angår estergrupperne og indholdet af xylose og galactose.

150495 - 17 - SEKTION 3.

DOKUMENTATION FOR, AT SPS OG APS ER FORSKELLIGE.

APS blev fremstillet som angivet i Agr.Biol.Chem., vol. 36, nr. 4, p. 544 - 550 (1972).

Herefter blev «lette polysaccharid og SPS hydrolyseret med forskellige enzymer, hvorefter nedbrydningsblandingen blev gelkromatograferet på HPLC-udstyr, som angivet i sektion 2, "Karakterisering af SPS, især molekylvægtsfordeling deraf".

Mere detaljeret anført blev hydrolyserne gennemført ved behandling af 25 ml opløsning af enten 2% APS eller 2% SPS i 0,1 M acetatstødpude med pH 4,5 med 10 mg KRF 68 eller 30 mg Pectolyase. KRF 68‘er et SPS-ase-præparat, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1. Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

Polysac- HPLC-gel- _Polysaccharid_ charid Enzym kromatogram Nedbrudt Ikke nedbrudt APS Pectolyase fig. .8 x APS KRF 68 fig. 9 x SPS Pectolyase fig. 10 x SPS . KRF 68 fig. 5 . x SEKTION 4.

18 ' ' 150435 SCREENING POR SPS-ASE-PRODUCERENDE MIKROORGANISMER.

Den mikroorganisme, som skal undersøges, inkuberes på et skråagarsubstrat med en sammensætning, som muliggør vækst af mikroorganismen. Efter initial vækst på skråagarsubstratet overføres mikroorganismen til et flydende hovedsubstrat, hvori den hovedsagelige carbon-kilde er SPS (fremstillet som angivet), hvori nitrogen- ψ kilden er NO^ , NH^ , urinstof, frie aminosyrer, proteiner eller andre nitrogenholdige forbindelser, og som yderligere indeholder en blanding af nødvendige salte og vitaminer, fortrinsvis i form· af gærekstrakt. Sammensætningen af hovedsubstratet afhænger af mikroorganismen idet det væsentligste kriterium er, at hovedsubstratet skal være i stand til at understøtte mikroorganismens vækst og metabolisme. Når væksten har fundet sted i et passende tidsrum, af størrelsesordenen 1-7 dage, afhængigt af den pågældende mikroorganismes væksthastighed, analyserer man en prøve af gæringsvæsken for SPS-ase i henhold til den enzymatiske SPS-ase-bestemmelsesmetode, der beskrevet i denne beskrivelse.

Fox at opnå en følsommere metode til bestemmelse af enzymatisk aktivitet kunne temperaturen sænkes til 40°C, og inkubationstiden kunne hæves til 20 timer under bestemmelsen af SPS-ase-aktiviteten, hvorved man bør tilsætte antibiotika til substratet for at undgå infektion.

SEKTION 5.

- 19 ' 150495 KARAKTERISERING AF NOGLE SPS-ASE DANNENDE MIKROORGANISMER.

I henhold til den her angivne screening for SPS-ase-producerende mikroorganismer har det vist sig, at de mikroorganismer, der er anført i den øvre del af den nedenfor angivne tabel, er SPS-ase-producenter.

Tabellen omfatter også en stamme, der hører til arten Aspergillus japonicus, og som ikke er nogen SPS-ase-producent.

SPS-ase —— 3C-en--~ct Vor identi- Officiel Første

Asp. Asp. ficerende identifi- depone-

Ja Nei 3aP°” acule- betegnelse cerende ringsår nicus atus betegnelse X X A 805 CBS 101.43; DSM 2344 1943 X X A 1443 IFO 4408; DSM 2346 1950 XX A 1384 ATCC 20236 f DSM 2345 1969 . En kort identifikation af de ovenfor angivne stammer kan findes i følgende kulturkataloger:

List of Cultures 1978 Centraalbureau voor Schimmel-cultures, Baarn, The Netherlands.

‘ 20 " .150495

Institute for Fermentation Osaka, List of Cultures, 1972, 5. udgave, 17 - 85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku,

Osaka 532, Japan.

The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14. udgave 1980, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.

Alle stammerne i den ovenfor anførte tabel svarer nøjagtigt til den taksonomiske beskrivelse'af arterne Asp. japonicus og Asp. aculeatus, som er beskrevet i The genus Aspergillus af Raper and Fenneli, 1965 (se især side 327 - 330).

SEKTION 6.

GENEREL BESKRIVELSE AF OVERLEJRINGSTEKNIK I FORBINDELSE MED IMMUNELEKTROFORESE.

En metode, som betegnes top-agar-overlejringsteknik, er udviklet af ansøgeren med henblik på identifikation af individuelle komponenter i et enzymkompleks ved krydset immun-elektroforese med et polyspecifikt antistof imod alle enzymkomponenter i enzymkomplekset. Metoden er baseret på den kendsgerning, at enzymer stadig er aktive efter den specifikke enzym-antistof-binding, eller med andre ord, at det aktive enzymcentrum ikke er identisk med positionen for enzym-antistof-bindingen. Enzym-antistof-komplekserne bundfældes som tydeligt definerede buer i gelen under elektroforesen.

Gelpladen dækkes med opløselig SPS i et top-agarlag. Efter " 21 " 150495 opvarmning til 45°C i 20 timer i en atmosfære med relativ fugtighed på 100% vil de buer, som udviser SPS-ase-aktivi-tet, foreligge som klaringszoner i SPS-dæklaget efter bundfældning med en blanding af lige volumina ethanol og acetone, når de betragtes mod en sort baggrund. Buer, der ikke har nogen SPS-ase-aktivitet, er usynlige.

SEKTION 7.

IMMUKELEKTROFORETISK KARAKTERISERING AF SPS-ASE MED POLY-SPECIFIKT ANTISTOF OG OVERLEJRING.

Man immuniserede kaniner med det SPS-ase-holdige enzymkompleks, som fremkom ved fermentation af Aspergillus aculeatus CBS 101.43, som angivet i eksempel 1 (KRF 68), og det polyspecifikke antistof blev udvundet på i og for sig kendt måde. Ved hjælp af dette polyspecifikke antistof gennemførte man en krydset immunelektroforese af det enzymkompleks, der fremkom ved fermentation af Aspergillus aculeatus CBS 101.43 som angivet i eksempel!. U®F 68), som beskrevet i N.H. Åxelsen et ai., "Å Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis", 6. optryk 1977. Der henvises til fig. Ϊ1, som viser de buer, der svarer til de forskellige proteiner, som er fremstillet.af mikroorganismen. Ved hjælp af den tidligere beskrevne top-agar-overlejrings-teknik viser det sig, at det skraverede areal svarer til SPS-ase.

Hvis den før angivne hypotese, som involverer den antagelse, at SPS-ase består af mindst to enzymer, er korrekt, er det skraverede areal det areal, hvori alle de enzymer, der er ansvarlige for SPS-ase-aktiviteterv er til stede. Hvis disse enzymer i andre udførelsesformer for opfindelsen ved immunelektroforesen skulle være separeret på en sådan måde, at de ikke dækker noget fælles areal, " 22*~' 150495 kan en del af SPS-ase-aktiviteten alligevel identificeres ved hjælp af immunelektroforese, når man bruger en overlejring med både SPS og en kommerciel pectinase.

SEKTION 8.

RENSNING AF ET SPS-ASE-PREPARAT.

Rensningen af SPS-ase-præparatet KRF 92 (jfr. éksempel 1) blev udført ved ionbytning. Stødpuden er 50 mM Tris (tris-hydroxymethy1aminornethan),hvis pH er indstillet på 7,0 med HC1. Søjlen er K 5/30 fra Pharmacia, Sverige. Ionbj'tningsmatérialet er DEAE-trisacryl fra LKB, Broimaa/

Sverige (300 ml).' Strømningshastigheden ér 100 ml/time.

'*' 15 ’g af SPS-ase-præparatet "KRF 92 blev opløst i 45o ml H2O ved 6°C, og alle dé i det følgende angivne operationer blev gennemført mellem 6°C og 10°C. pH blev indstillet på 7,0 med 1 M Tris. Søjlen blev ækvilibreret med stødpuden, og derpå blev SPS-ase-prøven indført på søjlen.

OD280 k°n^uktiviten blev målt på eluatet, idet der henvises til fig. 12. Fraktion 1 er det eluat, der ikke ér bundet til ionbyttermaterialet. Derpå vaskes søjlen med 2000 ml stødpude,’ hvilket giver anledning til fremkomsten af fraktion 2. Νύ etableres der en 0 - 500 mM NaCl-gradient, hvilket giver anledning til dannelsen af fraktionerne 3-9. Alle ni fraktioner blev koncentreret til 200 ml og dialyseret mod vand til en konduktivitet af 2 mSi ved hjælp af dialyse (Hollow Fiber DP 2 fra Amicori, Massachusetts, U.S.A.). Derpå blev de ni fraktioner frysetørret. Kun·fraktionerne 1 og 2 udviste SPS-ase-aktivitet.

* 23 ' 150495 #

Fraktion 1 blev yderligere renset ved gelfiltrering. 1,5 g af fraktion 1 blev opløst i 10 ml 50 mM natriumacetat med pH 4,5· (500 mM KC1). Søjlen er 2,5 x 100 cm fra LKB. Fyld_stofmaterialet i gelfiltreringen er Sephacryl S-200 fra Pharmacia, Sverige. Strømningshastigheden er 30 ml/time. De fraktioner, der indeholder materialer med molekylvægte mellem 70.000 og 100.000, i henhold til kalibrering med global ære proteiner, indeholdt et enzymkompleks, som betegnes faktor G, og som ikke kan nedbryde SPS, når man undersøger i henhold til den kvalitative agartest; imidlertid nedbrydes SPS under udførelsen af den kvalitative agarprøve, når man blander faktor G med en pectinase. Det har vist sig, at faktor G kan fraspalte galactose, fucose og noget galacturonsyre fra SPS, men størstedelen af nedbrydningsproduktet er i henhold til HPLC-analysen stadig et højmolekylært produkt, som har stor lighed, med SPS.

•SEKTION 9.

pH-AKTIVITETSAFHSNGIGHED, TEMPERATUR-AKTIVITETSAFHÆNGIGHED OG STABILITET AF EN SPS-ASE. .....

. . -Fig. 13 viser pH-aktivitets-afhængigheden af SPS-ase-præparatet KRF 68. Fra pH 2,7 til pH 3,5. anvendtes et myresyre-stødpudesystem, og fra pH 3,7 til 5,5 anvendtes et- acetat-stødpudesystem.

Fig. 14 viser temperatur-aktivitets-afhængighed af SPS-ase-præparatet KRF 68.

Fig. 15 viser temperatur-stabiliteten af SPS-ase-præparatet KRF 68.

SEKTION 10.

150495 - 24 - % ENZYMATISKE AKTIVITETSBESTEMMELSER.

Den nedenfor angivne tabel er en oversigt over de forskellige enzymatiske aktivitetsbestemmelser/ som har relation til opfindelsen.

Definition af aktivitetsenhed og beskrivelse af enzymatisk aktivitetsbestemmelse i

Beskrevet

Art' af akti- senere vitet, kort Offent-' i denne ! betegnel- lig til- beskrivel-

Enzym se gængelig se Reference SPS-ase . SPS-ase" x

Remanens- SRU x 1 solubili---:--- serende SRUM-120 x

Protease HUT x

Cellulase 0χ x . 2 PU x 3 PGE x 4

Pectinase-:---- UPTE x '5 PEE · X 6 VHCD __X '__7

De referencer, som er angivet i den sidste søjle i den ovenfor angivne tabel, er beskrevet detaljeret i den følgende tabel.

150495 - 25 -

Referencen kan rekvireres fra NOVO INDU- Schwei-STRI A/S, zerische Novo Allé, Ferment 7" 2880 Bag- AG, Ba-

Reference Identifikation af sværd, sel,. Et bib- nr. reference Danmark Schweiz liotek . Analyseforskrift 1 AF 154/4 fra 1981- x 12-01

Analytical Biochemistry 84, 522 - x 2 532, (1978)

Analytical method AF 149/6-GB fra x 1981-05-25

Determination of Pectinase Activi- 3 ty with Citrus χ

Pectin (PU) fra ,23.3.1976

Viskosimetrische .. · Polygalacturonase- v

. Bestimmung (PGE) X

fra 10.11.1977 . .

i · ·

Bestimmung der - Pectintranseli- -. minase (UPTE/g) x -fra 24.Sept. 1975 - -

Determination of the Pectineste- 6 rase activity x (udateret) med .. .

initialerne WJA/GW

_ Analytical method

' AF 156/1-GB X

I relation til cellulaseaktivitetsbestemmelsen kan det bemærkes, at analysen blev gennemført som angivet i AF 149/6-GB, og at principperne for bestemmelsen er forklaret i Analytical Biochemistry.

SEKTION 10 a.

150495 - 26 - ENZYMATISK BESTEMMELSE AF SPS-ASE.

\

Den enzymatiske bestemmelse af SPS-ase gennemføres i to trin, nemlig en kvalitativ agarplade-test og ~en kvantitativ SPS-ase-aktivitetsbestemmelse baseret på måling af mængden af totalt frigjort sukker. Hvis den kvalitative agarplade-test er negativ, er SPS-ase-aktiviteten lig nul, uanset den værdi, der hidrører fra den kvantitative SPS-ase-aktivitetsbestemmelse. Hvis den kvalitative agarplade-test er positiv, er SPS-ase-aktiviteten lig den værdi, der hidrører fra den kvantitative SPS-ase-aktivitetsbestemmelse.

I. Kvalitativ agarplade-test.

Man fremstillede en SPS-agarplade på følgende måde. En stødpude (B) fremstilles ved at indstille pH af en 0,3 M eddikesyre på en værdi af 4,5 ved hjælp af 1 N NaOH.

1 g SPS opløses i 20 ml B. 1 g agarose (HSB Litex) blandes med 80 ml B og opvarmes til kogepunktet under omrøring. Nåf agarosen går i opløsning, tilsættes SPS-opløsningen 'langsomt. Den resulterende 1% SPS-agarose-opløsning indføres i et vandbad på 60°C.

Pladerne støbes nu ved at hælde 15 ml af en 1% SPS-agarose-opløsning på en vandret glasplade med dimensionerne 10 cm x 10 cm.

Derpå udstanser man 9 huller med en afstand på 2,5 cm i det størknede lag af SPS-agarose.

I hvert hul indfører man 10 jil af en 1% opløsning af det enzymprotein, der skal undersøges for SPS-ase-aktivitet. Pladen inkuberes i 18 timer ved 50°C og med en relativ fugtighed på 100%. Nu bundfældes endnu ikke nedbrudt SPS med en opløsning af lige volumen- 4 ’ 27 " 150495 dele ethanol og acetone. SPS-ase-agar-pladetesten er positiv for en prøve, der er indført i et specifikt hul, hvis der omkring dette hul fremkommer en klar, .ringformet zone.

II. Kvantitativ SPS-asé-aktivitetsbestemmelse.

Formålet med denne prøve er bestemmelsen af enzymatiske aktiviteter, som er i stand til at nedbryde SPS i et sådant omfang, at nedbrydningsprodukterne udviser en stærkt reduceret eller overhovedet ingen adsorptions- eller bindingsaffinitet til sojaprotein. Forsøg har vist, at den del af SPS-nedbrydningsprodukterne, som ikke bundfældes af en blanding af lige volumendele vand og ethanol, ikke har nogen adsorptionseller bindingsaffinitet til sojaprotein.

SPS-ase-bestemmelsen er baseret på en hydrolyse af SPS under standardbetingelser efterfulgt af en bundfældning af den del af SPS, som ikke er hydrolyseret, med ethanol. Efter bundfældningen bestemmer man indholdet af det kulhydrat, som ikke er bundfældet, ved kvantitativ analyse for totalt sukker (i henhold til AF 169/1, som kan rekvireres fra NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd).

Standardbetingelserne_er:

Temperatur: 50°C

pH: 4,5

Reaktionstid: Kontrol 210 minutter, kun med substrat, efterfulgt af 2 minutter med tilsat enzym.

Hovedværdi 212 minutter.

" 28 ' 150495 U§§t^ret_omfatter:

Rystevandbad termostatteret ved 50°C

Whirlimixer-omrører

Centrifuge

Isvandbad

Stødpude : 0,6 H eddikesyre i afmineraliseret vand (a) 1.0 M NaOH (b)

Substrat : pH-værdien af 50 ml a indstilles til 4,5 med b, derpå tilsættes 4,0 g SPS, og efter opløsning 1 af SPS bliver pH genindstillet på 4,5., og voluminet indstilles på 100 ml med afioniseret vand.

- Stopreagens: Absolut ethanol.

1 SPS-ase-aktivitetsenhed (SAE eller SPSU) er defineret som den SPS-ase aktivitet, som under de ovenfor angivne standardbetingelser frigør en så stor mængde kulhydrat,der er opløseligt i 50% ethanol, som er ‘ækvivalent med 1 pnol galactose per minut.

Selvom den første del af enzymstandardkurven er en ret linie, bør det bemærkes, at den ikke skærer punktet 0,0.

SEKTION 10 b.

ENZYMATISK BESTEMMELSE AF REMANENS-SOLUBILISERENDE AKTIVITET

UDTRYKT SOM SRUM 120.

Princip

Ved fremgangsmåden til bestemmelse af hydrolytisk “ 29 ” 150495 • aktivitet hydrolyseres den uopløselige del af affedtet, afproteiniseret og afskallet sojamel under standardbetingelser. Den enzymatiske reaktion standses‘med stopreagens, og den uopløselige del filtreres fra. Mængden af opløste poly-saccharider bestemmes ad spektrofotometrisk vej efter syrehydrolyse i henhold til AF 169/1, som kan rekvireres fra NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd.

Man bestemmer både carbohydraser med endo- og med exo-aktivitet i henhold til denne metode.

Det substrat, som anvendes ved denne enzymatiske bestemmelse, er identisk med det remanens-substrat, der er beskrevet i forbindelse med SRU-metoden. Substratet opløses som en 3% opløsning i den nedenfor angivne citrat-stødpude: 0,1 N citrat-fosfat-stødpude med pH 4,5 5,24 g citronsyre-l-hydrat (Merck Art 244) 8,12 g dinatriumhydrogenfosfat-2-hydrat (Merck Art 6580)

Ad 1 1 med afmineraliseret 1^0 pH 4,5 + 0,05 Stabil i 14 dage

Stopreagenset ftar følgende sammensætning:

100 ml 0,5 N NaOH

200 ml 96% ethanol

Skal holdes i køleskab indtil brug.

Standardbetingelser

Temperatur 50°C

.PH . 4,5

Reaktionstid, prøve 120 minutter - , blindprøve 5 - 150495 - 30 -

Enhedsdefinition

En sojaremanens-solubiliserende enhed (SRUM) 120 (M forkortelse for manuel) er den mængde enzym, der under de givne reaktionsbetingelser per minut frigør solu-biliserede polysaccharider i en mængde, der er ækvivalent . med 1 ^tmol galactose.

SEKTION 10 c.

ENZYMATISK BESTEMMELSE AF PROTEOLYTISK AKTIVITET.

HUT-metoden til bestemmelse af proteinase i surt medium.

Metoden er baseret på nedbrydningen af denatureret hæmoglobin· ved hjælp af enzymet ved 40° C og pH 3,2 i 30 min.

Det ikke nedbrudte hæmoglobin bundfældes med 14% trichloreddike-syre (vægt/volumen-%).

Alle enzymprøverne fremstilles ved at opløse dem i 0,1 M acetat-stødpude med pH 3,2.

Hæmoglobinsubstratet fremstilles under anvendelse af 5,0 g lyophiliseret, bovint hæmoglobinpulver, som er konserveret med 1% Thiomersalat og 100 ml afmineraliseret vand, som holdes under omrøring i 10 min., hvorefter pH indstilles på 1,7 med 0,33 N HCl.

Efter yderligere 10 min. omrøring indstilles pH på 3,2 med 1 N NaOH. Voluminet af denne opløsning forøges til 200 ml med 0,2 M acetat-stødpude. Dette hæmoglobin-substrat skal afkøles, og i den afkølede tilstand vil det holde sig 5 dage.

Hæmoglobinsubstratet indstilles på stuetemperatur.

Ved tiden 0 tilsættes 5 ml substrat til et reagensglas, der - 31 - 150495 indeholder 1 ml enzym.' Efter rystning i 1 sekund indføres reagensglasset i et 40° C varmt vandbad, hvor det bliver i 30 min.

Efter nøjagtig 30 minutters forløb tilsættes 5 ml 14% trichlor-eddikesyre til reagensglasset, som derpå omrystes og indstilles på stuetemperatur, i hvilken tilstand det forbliver i 40 minutter.

Blindprøven fremstilles ved, at haemoglobinsubstratet indstilles på stuetemperatur. Til tidspunktet 0 tilsættes 5 ml af substratet til et reagensglas, der indeholder 1 ml enzym.

Efter omrystning i 1 sekund indføres reagensglasset i et 40* C varmt vandbad, hvor det forbliver i 5 min. Efter nøjagtig 5 minutters forløb tilsættes 5 ml 14% trichloreddikesyre til reagensglasset, som derpå omrystes og indstilles på stuetemperatur, i hvilken tilstand det forbliver i 40 minutter.

Efter 40 minutters forløb omrystes blindprøverne og prøverne, filtreres 1 eller 2 gange gennem Berzelius-filter nr. 0, og indføres i et spektrofotometer. Prøverne aflæses mod blindprøven ved 275 nm, medens man indstiller spektrofotometret mod vand.

Da absorbansen.af tyrosin ved 275 nm er en kendt faktor, er det ikke nødvendigt at optegne en tyrosin-standard-kurve, med mindre det er påkrævet at kontrollere Beckman-spektro-fotometret.

1 HUT er den enzymmængde, som i løbet af 1 minut danner et hydrolysat, der hvad angår absorbans ved 275 nm er ækvivalent med en opløsning af 1,10 mikrogram tyrosin/ml i 0,006 N HC1. Denne absorbansværdi er 0,0084. Reaktionen skal foretages ved 40° C, pH 3,2 og i 30 minutter.

H0T _ Prøve - Blindprøve Volumen i ml_ 0,0084 Reaktionstiden i minutter «**. x os.es HOT/g enzym -

En undersøgelse af pH-stabilitets-afhængigheden af proteasen i KRF 68 udført ved hjælp af HUT-analysen med pH-værdier. fra. 2,0. - 8,D..yiste, at stabiliteten af proteasen var meget lille over pH 8,0 jfr. fig. 16.

..150495 - 32 -

For at illustrere opfindelsen skal der henvises til de følgende eksempler 1-10 hvor eksempel 1 illustrerer fremstillingen af SPS-ase, og hvor eksempel 2 -10 illustrerer anvendelsen af SPS-ase.

Man gennemførte adskillige fermentationer med de her angivne stammer af Aspergillus aculeatus og Aspergillus japonicus i laboratorieskala. Herved fremkom der præparater, son/indeholdt SPS-ase i henhold til den her angivne SPS-ase-test. Da man imidlertid kræver ret store mængder SPS-ase for at gennemføre anvendelsesforsøg, udførte man lignende fermentationer i pilot plant skala, jfr. det følgende eksempel 1.

Eksempel 1

Produktion af en SPS-ase i pilot plant skala.

En SPS-ase blev fremstillet ved' submers fermentation af Aspergillus aculeatus'CBS 101/43/ 'Et 'agarsubstrat med følgende sammensætning fremstilledes i en Fernbach-kolbe:'

Pepton Difco - .6 g

Amino.lin Ortana 4 g

Glucose 1 g Gærekstrakt Difco 3 g Kø.dekstrakt Difco 1,5 g KH2P04 Merck 20 g

Maltekstrakt Evers 20. g .lonbyttervand HjO ad 1000, ml pH blev indstillet på mellem 5,30 og 5,35. Derpå tilsattes 40 g agar Difco, og blandingen blev autoklaveret i 20 minutter ved 120°C (substratet benævnes E-agar).

- 33 - • 150495

Stammen CBS 101.43 blev dyrket på et skråglas med E-agar (37°C). Sporerne fra skråglasset blev suspenderet i steriliseret skummetmælk, og suspensionen blev frysetørret i hætteglas. Indholdet i et frysetørret hætteglas blev overført til Fernbachkolben. Kolben blev derpå inkuberet i 13 dage ved 30°C.

Et substrat med følgende sammensætning blev fremstillet i en 500 1 pode-fermentationsbeholder:

CaC03 1,2 kg

Glucose 7,2 kg

Rofec (tørstof fra majsstøbevand) 3,6 kg

Sojabønneolie 1,2 kg

Han tilsatte ledningsvand til et totalt volumen på ca. 240 1. pH blev indstillet på ca. 5,5 før tilsætningen af CaCOj. Substratet blev steriliseret i podefermentationsbeholderen i 1 time ved 121°C. Det sluttelige volumen før podningen var ca 300 1.

.Sporesuspensionen i Fernbach-kolben blev overført til pode-fermentationsbeholderen. Betingelserne for podefermentationen, var som følger:

Type af fermentationsbeholder: Konventionel beluftet og omrørt fermentations-beholder med et forhold højde/diameter på ca. 2,3.

Omrøringer: 300 omdrejninger/minut (to turbineskovle)

Beluftning: 300 normalliter luft/minut

Temperatur: 30 - 31°C

Tryk: 0,5 ato

Tid: Ca. 28 timer ” 34 * 150495

Ca. 28 timer efter podning overførtes 150 1 fra podefermentationsbeholderen til hovedfermentationsbeholderen .

Man fremstillede et substrat med følgende sammensætning i en 2500 liter hovedfermentationsbeholder:

Ristet sojamel 90 kg KH2P04 20 kg

Pluronic® 150 ml

Der tilsattes ledningsvand til et totalt volumen på ca. 900 1. Det ristede sojamel blev suspenderet i vand. pH blev indstillet på 8,0 med NaOH, og temperaturen blev hævet til 50°C. Derefter tilsattes ca. 925 Ansonenheder af ALCALASE 0,6 L til suspensionen. · Blandingen blev i 4 timer holdt ved 50°C og pH = 8,0 (.tilsætning af ^200^)

Uden beluftning, nul’ato og en omrøring på 100 omdrejninger per- minut. -Derpå tilsattes de resterende substratbestanddele, og-pH blev indstillet på ca. 6,0 med fosforsyre. Substratet blev steriliseret i hovedfermentationsbeholderen i 1½ time ved 123°C. Det sluttelige volumen før podningen var ca.

1080 liter.

- Uer’på ’talsattes 150 liter podekultur.

Gæringsbetingelserne var:

Type af fermentationsbeholder: Konventionel beluftet og omrørt fermentationsbeholder med et forhold højde/diameter på ca. 2,7.

Omrøring: 250 omdrejninger/minut (to turbineskovle)

Beluftning: 1200 normalliter luft per minut.

Temperatur: 30°C

Tryk: 0,5 ato

Tid: Ca. 151 timer • “ 35 ’ 150485

Fra den 24. fermentationstime til ca. den 116. fermentationstime tilsattes pectinopløsning aseptisk til hovedfermentationsbeholderen med en konstant hastighed af ca. 8 liter per time. Pectinopløsningen med følgende sammensætning blev fremstillet i en 500 1 doseringstank.

Pectin genu 22 kg

Koncentreret fosforsyre 6 kg

Pluronic® 50 ml

JQ

'Genu pectin (NF af citrustypen fra Københavns

Pectinfabrik).

Man tilsatte ledningsvand til et totalt volumen af ca. 325 liter. Substratet blev steriliseret i doseringstanken i 1 time ved 121°C. Det sluttelige volumen før doseringens påbegyndelse var ca. 360 liter. Når denne portion var opbrugt, fremstilledes en anden, lignende portion. Det totale volumen af pectinopløsningen til en gæring var ca.

725 liter.

Efter ca. den 151. fermentationstime blev fermentationen afbrudt. De ca. 1850 liter kulturvæske blev afkølet til ca. 5°C, og enzymerne blev udvundet i henhold til følgende metode.

Kulturvæsken blev tromlefiltreret på et vakuum- tromlefilter (Dorr Oliver), der var forovertrukket med dia- \ · toméjord (Hy-flo-super-cel, filterhjælpemiddel). Filtratet blev koncentreret ved fordampning til ca. 15% af kultur- s' væskens volumen. Koncentratet blev filtreret på en Seitz- . filterplade .(type supra 100) med 0,25% By-flo-super-cel som filterhjælpemiddel (i den følgende tabel betegnet filtrering I). Filtratet blev bundfældet med 561 g NH^SO^/1 ved pH 5,5, og der tilsættes 4% diatome jord (Hy-f lo-super-cel) som filterhjælpemiddel. Bundfaldet og filterhjælpemidlet separeres ved filtrering på et varmefilter. Filterkagen " 36 " 150435 opløses i vandr og uopløselige dele separeres ved filtrering på et rairmefilter. Filtratet blankfiltreres på en Seitz filterplade (type supra 100) med 0,25% Hy-flo-super-cel som filterhjælpemiddel '(i den følgende tabel betegnet filtrering II). Filtratet diafiltreres på et ultrafiltreringsapparat. Efter diafiltrering bliver væsken koncentreret til et tørstofindhold af 12,7% (i den følgende tabel betegnet tørstofindhold i koncentrat).

Man kan på dette stadium gennemføre en fakultativ basebehandling med henblik på partiel fjernelse af proteaseaktiviteten. /Når man gør brug af basebehandlingen, gennemføres den ved pH på 9,2 i en time, hvorefter pH-vær-dien indstilles på 5,0.

Nu bliver væsken blankfiltreret og filtreret med henblik på kimtalsreduktion, og filtratet frysetørres på et frysetørringsapparat fra Stokes. Man gennemførté fire fermentationer på den i det følgende angivne måde, hvorved den stamme, der anvendes til fermentationen, anvendelsen af den fakultative basebehandling og andre parametre blev varieret, som angivet i den følgende tabel.

Tør-

Koncentration (%) af stof-f iltert jeelpemiddel i . ind-forbindelse med told

Fil- Bund- Fil- '*

Basebehandling ^ tre- field- tre- kon-, msrk- — . rat- T __ een- nin-

Mikroorganisme Anvendt Ikke anvendt kode nxngen rang li trat CBS 101.43 X KRF 68 0.5 5 0.2 28 ATOC 20236 x KRF 74 2.0 4 0.4 7.5 IPO 4408 x KRF 83 1.0 5 0.25 12.4 x) CBS 101.43 x KER 92 0.25 4 0.25 12.7 x)

Efter filtrering med henblik på kimtalsreduktion koncentreres filtratet ved fordampning i et forhold på 1:2,3. En mindre del af det koncentrerede filtrat blev sprøjtetørret, og den resterende del blev frysetørret.

- 37 - 150495

For yderligere at reducere proteaseaktiviteten blev nogle af de ovenfor angivne præparater behandlet som angivet i det følgende, hvorved man kun anvendte et af de tre alternativer A, B og C.

A. 100 g SPS-ase-præparat opløses i 1 liter afioniseret vand under omrøring ved 10°C + 2°C. pH indstilles på 9,1 med 4 N NaOH. Denne basebehandling gennemføres i 1 time. pH-værdien indstilles derpå til 4,5 med iseddikesyre, og der dialyseres mod iskoldt, afioniseret vand til en konduk- . tivitet af 3 mSi. Derpå fryses og frysetørres.

B. 500 g SPS-ase-præparat opløses i 4 liter afioniseret vand under omrøring ved 10°C + 2°C. pH indstilles på 9,1 med 4 NNaOH. Denne basebehandling gennemføres i 1 time. pH-værdien indstilles derpå på 5,0 med iseddikesyre. Det fremkomne materiale frysetørres.

C. 50 g SPS-asé-præparat opløses i 400 ml afioniseret vand under omrøring ved 10°C + 2°C. pH indstilles til 9,1 med 4 N NaOH. Denne basebehandling gennemføres i 1 time.

Derpå reduceres pH til 5,7 med iseddikesyre. Det fremkomne materiale frysetørres.

SPS-ase-præparat anvendt Anvendt basesom udgangsmateriale til behandling Præparat- basebehandlingen “ g c kode

KRF 68 X KRF 68 BII

KRF 68 x KRF 68 Bill ..... ——I·" '! "-I .! 11" r* ""I " ' '

KRF 92 x KRF 92 BI

De ovenfor angivne præparater karakteriseres i den følgende tabel ved aktiviteterne af de enzymer, der har relevans til opfindelsen.

r ~ 38 " .150495

H OI-Ol^CMOOOOO

(Q cninrocr>ø\oooc\0

srr'Oroooco'Tt^o ΓΜ+ H CO O CD CM CM

ΟΙ O ID <X> ^ ID Γ» fc r~~

PS

« _______

VOIDOOOOOOOO r'tNi^TVDoooooo + «g· VO ID σ> C" O O' O O O

r\j ρ-ίιηιηοο^ΓιΗΟ a\ o id o

C H

00 1-1 t<____________ cocomooooooo iDcoinorrooocno t-fior^coooiDOioo

CO + CM CO Ο «3· t" O

to ι-H O ID CM O

in co cm tu r- m « «____________

OCMCDOOOOOOO

^r'-cocNoocor^o i-itniorioi-ii-imo Η Η O ΙΠ ΙΠ

t" I 'S' i—I ID

CO

£ «

OliHOm ID O 00 0-0 H «a-coiMcoo\ooor^o

h m-q-t^mmor'or'O

H ·-! cn o r- id o cq o r~ o + CO o CO CO 1-1

ID

Uj

E

«___;_________

ΗΓ'ΟιΛ^ΓΟΟΟΟΟ H OOlDO'TOOOf-iO

m mintDr-iooor'trio CQ ·—1 co o cm ro o + o r- co o

CO Ο rH

ID O iH

£ X________________

ot^mooooooo inmcMooooovo CO t^r-IOOO*3*.-lCOO CO + CM Γ'· CO O CTl CO O

ID ID ο r-f η* O

CO ι-i ID

fe O r-i

E rH

K

Ο» +> η H · 0) β) +> °* >

4J -H

« m 4J

ri S 4J

► ί» -H CM

H <U -P -

4* Ό C CO

AS « « O

C r-J > N s E ft rJ»S H D,

£i -S W D

nh dph ω η m u d < K K D X D ϋ Λ « S3 fato(Q(osufeP<POi> - 39 - 150485 .

Eksempel 2 (anvendelseseksempel)

Dette eksempel beskriver produktionen af et p.v.p. fra et afskallet og affedter sojamel, "Sojamel 13" (kommercielt rekvirerbart fra Aarhus Oliefabrik A/S). Tørstofindholdet af dette mel var 94,0%, og indholdet af (N x 6,25) på tørstofbasis var 58,7%. Sojamelet blev behandlet med SPS-ase-præparatet KRF 68 Eli (eksempel 1) på følgende måde: 85,2 g af sojamelet blev suspenderet og holdt under omrøring ved 50°C i 664,8 g vand, og pH blev indstillet på 4,5 ved hjælp af 7,5 ml 6 K HC1. 50 g af en opløsning indeholdende 4,00 g af det angivne SPS-ase-præ-parat blev tilsat, og reaktionsblandingen blev derpå holdt under omrøring i 240 minutter ved 50°C. Blandingen blev derpå centrifugeret i en laboratoriecentrifuge (Beckman Model J-6B) i 15 minutter ved 3000 x g. Super-natanten blev vejet og analyseret for Kjeldahl N og tørstof. Den faste fase blev derpå vasket med et volumen af vand, der var ækvivalent med massen af supernatant fremkommet ved den første centrifugering. Denne operation blev gennemført to gange. Den faste fase blev derpå frysetørret, vejet og analyseret for Kjeldahl N og tørstofindhold i Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danmark. Dette laboratorium er statsautoriseret for analyser af foderstoffer og mejeriprodukter. De ved forsøgene opnåede resultater fremgår af tabel 2.1:

Tabel 2.1 Opnåede resultater

Masse, N x 6,25 Tørstof Udbytte af Udbytte af Komponent g % % protein, % tørstof, % -Sojamel 85,2 55,2 94,0 100% ' 100% SPS-ase præparat 4,00 75,6 - 6,4% - 1. Centrifugat 666 1,50 5,04 21,2% 42,0% p.v.p. 44,5 87,5 95,7 82,7% 53,2% - 40 ' 1504S5

Der opnåedes således et p.v.p. med en proteinrenhed, d.v.s. N x 6,25 på tørstofbasis, på 91,4%, og med et totalt proteinudbytte på 83%.

Eksempel 3 (anvendelseseksempel)

Dette eksempel blev gennemført for at sammenligne proteinudbytterne, næringskvaliteten og visse funktionelle egenskaber af sojaproteinprodukter fremstillet under anvendelse af følgende tre metoder: A: Den traditionelle isoelektriske bundfældning til fremstilling af sojaproteinisolat.

B: Den traditionelle isoelektriske vask til fremstilling af sojaproteinkoncentrat.

Os,- Den isoelektriske vask omfattende et remanens-solubiliserende enzym til . fremstilling af p.v.p.

For at frembringe en sand sammenligning mellem fremgangsmåden (C) og de konventionelle sojaprotein-processer (A og B) har man i alle tre tilfælde anvendt det samme råmateriale. Desuden er forsøgene blevet gennemført på en sådan måde, at tilsvarende temperaturer og behandlingstider er de samme i .alle tre tilfælde. Det var kun pH-værdierne, der var forskellige p.g.a. de fundamentale forskelle mellem de tre forsøg.

Ά. Den traditionelle' isoelektriske bundfældning til _ fremstilling af sojaproteinisolat._· 425,8 g sojamel (Sojamel 13 produceret af Aarhus Oliefabrik A/S) blev ekstraheret i 3574,2 g ledningsvand ved --41- 1504S5 • 50°C. pH blev indstillet på 8,0 roed 20,1.g 4N NaOH. Efter omrøring i 1 time blev opslemningen centrifugeret ved 3000 x g i 15 minutter under anvendelse af fire ét-literbægre i en laboratoriecentrifuge (Beckman Model J-6B). Man vejede centrifugat I og bundfald I. Bundfald I blev genekstraheret roed vandjtil en total vægt af 4000 g. Temperaturen blev holdt på 50°C, pH blev indstillet på 8 roed 4N NaOH, og opslemningen blev holdt under omrøring i 1 time. Man gennemførte en centrifugering og vejning af centrifugat II og bundfald II som ovenfor angivet. Man udtog prøver fra centrifugat I og II og bundfald II med henblik på Kjeldahlbestemmelser og tørstofbestemmelser.'Herefter blev centrifugaterne I og II blandet og holdt ved 50°C. Proteinet blev derpå isoelektrisk bundfældet ved pH 4,5 ved hjælp af 45 g 6N HC1. Efter omrøring i 1 time ved 50°C blev proteinet udvundet ved centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter. Centrifugat III blev vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Den faste fase III blev vejet og vasket med vand i en mængde svarende til vægten af centrifugat I. Vaskningen blev gennemført ved omrøring i 1 time ved 50°C. Det vaskede protein blev udvundet ved centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter. Centrifugat IV og den faste fase IV blev vejet. Centrifugat IV blev analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Den faste fase blev suspenderet i 1550 g vand ved 50°C, og pH blev indstillet på 6,5 med 17 g 4N NaOH.

Blandingen blev holdt under omrøring i 1 time, og om nødvendigt blev pH genindstillet på 6,5. Slutteligt blev produktet frysetørret, vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Massebalanceberegningerne er vist i tabel 3.1.

- 42 - 150Λ55

Tabel 3.1 Massebalanceberegninger i forbindelse med den traditionelle isoelektriske bundfældning til fremstilling af sojaproteinisolat.

Masse af Protein, Tør- Udbytte Udbytte

Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør*· og fraktioner g (N x 6,25) % tein, % stof, %

Ekstraktion:

Sojamel 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 '

Vand 3574,2 000 0 4 NNaOH__20,1__0__16,0 0__0,8 / 1. Centrifugering: Σ 4020,1__5/9__10,0 100,9 100,4

Centrifugat I 3141,0 4,4 6,9 58,8 54,1

Bundfald I__805,0__-____-__3_

Gen-ekstrak tion:

Bundfald I 805,0 -

Vand__3195,0__0__0__0__0 2. Centrifugering:

Centrifugat II 3104,0 0,5 0,9 6,6 7,0

Bundfald II__820,0__9,1 17,2 31,7__35,2

Blanding og syrning:

Centrifugater I + II 6245,0 - - 6N HC1__45,0__0_ 21,3 0__2,4 3. Centrifugering: Σ 6290,0

Centrifugat III 5650,0 0,3 1,9 7,2 26,8

Bundfald III 308,0__-__-__-__-

Vask:

Bundfald III 308,0 - - -

Vand__3141,0__0^0__0__0 4. Centrifugering: Σ 3449,0

Centrifugat IV 3113,0 0,04 0,15 0,5 1,2

Bundfald IV__291,0____-__-

Neutralisation:

Bundfald IV 291,0.

Vand 1550,0 0 0 0 0 4 NNaOH__17,0__0_ 16,0 0__0/7 Tørring: Pulver 128,0__93,8__96,3 51,1__30,8 ·- 43 - ' 150495 B. Den isoelektriske vask til fremstilling af soja- _proteinkoncentrat._ 425,6 g sojamel (Sojamel 13 fremstillet af Aarhus Oliefabrik A/S) blev vasket i 3574 g vand ved 50°C. pH blev indstillet på 4,5 med .44,8 g 6 NHCl. Vasken blev gennemført i 4 timer under omrøring. Omrøringen blev derpå centrifugeret ved 3000 x g i 15 minutter i en laboratoriecentrifuge (Beckman Model J-6B) under anvendelse af fire ét-liter bægre. Centrifugat I blev vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Den faste fase I blev vejet og genvasket med vand til en totalvægt af 4000 g. pH blev genindstillet på 4f5 med 1,7 g 6N HC1, og opslemningen blev holdt under omrøring i 30 minutter ved 50°C. Man gennemførte en centrifugering og vejning af centrifugat II og tørstofferne II som ovenfor angivet. Den faste fase II blev resuspenderet i 1575 g ^0 ved 50°C, og pH blev indstillet på 6,5 med 34,5 g 4 N.NaOH. Blandingen blev holdt under omrøring ved 50°C i 1 time, og om nødvendigt blev pH genindstillet til 6,5. Slutteligt blev proteinproduktet frysetørret, vejet og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Massebalancen er vist i tabel 3.2.

" 44 ” · 150435

Tabel 3.2 Massebalanceberegninger i forbindelse med den isoelektriske vask til fremstilling af soja-proteinkoncentrat.

Masse af Protein, Tør- Udbytte Udbytte . Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør- og fraktioner g (N x 6,25) % tein, % stof, %

Vask:

Sojamel 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0

Vand 3574,0 000 0 6 N HCl__44,8__0__21,3__0 2,4 1. Centrifuge-' ring: Σ. 4044,6 - - - -

Centrifugat I 3150,0 0,6 3,2 8,0 25,2 Tørstoffer I__846,0__-__2!__-__-_

Genvask: Tørstoffer I 846,0 - - - -

Vand 3154,0 0 0 0 0 6 NHCl__1,7__0__21,3__0___0,1 2. Centrifugering: Z 4001,7

Centrifugat II 3130,0 0,1 0,4 1,3 3,2 Tørstoffer II 863,0__-__-__-__-__

Neutralisering: Tørstoffer II 863,0

Vand 1575,0 0 0 0 0 4 NNaOH__34,5__0__16,0__0__1,4 Tørring: Pulver 281,0__72,5 98,4__86,7 * 69,1 C. Den isoelektriske vask omfattende et remanens-so- lubiliserende enzym til·'fremstilling af p.v.p.

425,8 g sojamel (Sojamel 13 fremstillet af Aarhus Oliefabrik A/S) blev vasket i 3524,2 g vand ved 50°C. pH blev indstillet på 4,5 under anvendelse af 43,7 g6N HCl.

- 45 - 150495 24 g af SPS-ase-præparatet KRF 68 Bill (eksempel 1) blev opløst i 26 g vand og tilsat til vaskeblandingen.

Derpå blev rensningen gennemført som beskrevet for B, idet mængderne af 6 N HClf 4NNaOH og vand til resuspension er de eneste parametre med afvigende værdier. Massebalancen er vist i tabel 3.3.

Tabel 3.3 Massebalanceberegninger i forbindelse med den isoelektriske vask omfattende et remanens-so-lubiliserende enzym til fremstilling af p.v.p.

Masse af Protein, Tør- Udbytte Udbytte Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør- og fraktioner g (N x 6,25) % tein, % stof, %

Vask:

Sojamel 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0

Vand 3540,2 0 000 6N HC1 43,7 0 21,3 0 2,3 SPS-ase:KRF 68

Bill__24,0 75,3__96,0__V7__5,8 1. Centrifugering: 4043,7 - -

Centrifugat I 3420,0 1,7 5,2 24,7 44,4 Tørstoffer I 620,0__-__-____-_

Genvask: Tørstoffer I 620,0 - - - -

Vand 3380,0 0 000 6K HC1__1^3__0_. 21,3__0__0,1 2. Centrifugering: 4001,3

Centrifugat II 3400,0 0,2 0,6 2,9 5,1 Tørstoffer II 577,0__=__-__-__-_

Neutralisering: Tørstoffer II 577,0 - - - -

Vand 1700,0 0 000 4N NaOH__25,3__0 16,0____1.0 Tørring: Pulver 211,0 87,3,i 96,7^! 78,2 51,1 __ 86,9z; 97,0 Ί . _ 1) Analyseret i Det Biotekniske Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding, Danmark 2) Analyseret i Ovist's Laboratorium, MarseliS Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C, Danmark.

- 46 - 150495 β

Ngringsværdimæssige' egenskaber

Man bestemte aminosyresammensætningerne af de tre proteinprodukter, jfr. tabel 3.4. Det totale indhold af essentielle aminosyrer, det-kemiske karaktertal og index,. for essentielle aminosyrer (EAAI) beregnes under anvendelse af FAO Reference Pattern fra 1957.

Indholdet af trypsininhibitor i de tre produkter blev bestemt ved hjælp af den metode, der er beskrevet i A.O.C.S. Tentative Method Ba 12 - 75 (A.O.C.S. er en forkortelse for American Oil Chemists' Society). Resultaterne er vist i tabel 3.5, der også inkluderer udbytterne og forholdene protein/tørstof i de tre produkter.

- 47 - 150495 •

Tabel 3.4 Aminosyresammentsætning og næringsværdimæssig evaluering af de tre proteinprodukter A, B og _C.___ _ A. Sojaprotein- B. Sojaprotein- C. Sojaprotein- isolat koncentrat isolat (p.v.p.) ,*minosyre)'g/l6 g m| aas^ I g/16 g n| aas^ | g/16 g n| aas1^ |

Ikke-essentielle: ...... .....

Asparaginsyre 12,4 - 11,3 - 11,9

Serin 4,62 - 4,69 - 4,81 - utaminsyre 21,3 - 18,2 - 17,7

Prolin 6,07 - 5,19 - 4,76

Glycin 4,13 - 4,26 - 4,33

Alanin 3,54 - 4,27 - 4,55

Histidin 2,83 - 2,78 - 2,50

Arginin 8,09 - 7,57 - 7,04

Essentielle:

Isoleucin 4,87 >100 4,97 >100 5,19 >100

Leucin 7,80 >100 7,98 >100 8,09 >100

Lysin 6,24 >100 6,09 >100 5,57 >100

Phenylalanin 5,47 i0c)>100 5,35 aoS.^ 5,17 Ίθδ>1()0 .

nrrosin 3,38 »lOg 3,88 >100J 4,44 >10cf

Lystin 1,29 64,9 56j4 1,32 66,0) g0 2 1,44 72,9 g5 g

Methionin 1,08 49,1J * 1,21 55,gf ' 1,31 59,g '

Ihreonin 3,10 >100 3,60 >100 3,97 >100

Tryptophan 1,06 75,7 1,37 97,9 1,32 94,3

Valin 4,90 >100 5,23 >100 5,57 >100 % totalt ind- hold af essen- 38,36 4ι,Μ 42,21 tielle ammo- * ' syrer

Kemisk karaktertal 56,4% 60,2% 65,5% EAAI 86,7% . 90,2% 91,3% ^ aas = aminosyre-karaktertal (amino acid score) baseret på FAO reference pattern (1957) ‘ 48 " 150495

Tabel 3.5 Procesegenskaber og indhold af trypsininhibitor i forbindelse med de tre proteinprodukter A, B og C.

A. Sojaprotein- B. Sojaprotein- C. Sojaproteir isolat koncentrat isolat (p.v.p,

Proces- t”Ko? 1 97'«% 73'7* 90'°* egen- protein- ’ skaber SgyUe ' S7·»__«·«__7e'2t r2PWg^roaSkt 34·000 21·000 19·000 TUI/g protein 36.250 28.970 21.810

Funktionelle egenskaber (NSI) blev bestemt i en 1% proteindispersion med pH = 7,0.i henholdsvis 0,2 H NaCl og destilleret vand. Efter omrøring i 45 minutter med en magnetisk omrører blev suspensionen centrifugeret ved 4000 x g i 30 minutter, og supernatanten blev analyseret for nitrogen. Nitrogen-opløseligheden blev beregnet som (% opløseligt N/% total N). ’ Resultaterne af denne evaluering af de tre produkter er vist i tabel 3.6.

5?)il9§£i59§lS§B§2it§£ blev bestemt tre gange på hvert produkt ved en let modificeret Swift titrering. 4,0 g (N x 6,25) af produktet blev blandet i 250 ml 0,5 M NaCl med en Sorval Qmnimixer ved lav hastighed. 50 ml af suspensionen blev overført til en glasblandebeholder, og der blev tilsat 50 ml sojabønneolie. Herefter vejedes den totale blanding. Olie-i-vand-blåndingen blev derpå homogeniseret ved 10.000 omdrejninger/minut, medens beholderen var placeret i et isbad. Der tilsattes en supplerende mængde sojabønneolie med en hastighed af 0,3 ml per sekund, indtil emulsionen kollaberer. Den totale mængde olie, som tilsættes før "endepunktet!1, blev fundet ved vejning.

- 49 - ' 150495

Emulgeringskapacitet blev beregnet som ml olie per g protein (N x 6,25). Det blev antaget, at oliens massefylde var 0,9 g/ml.

De gennemsnitlige resultater af bestemmelsen af emulgeringskapaciteten af de tre produkter er vist i tabel 3.6.

blev bestemt i en 3% proteinopløsning ved pH = 6,5. 250 ml af den vandige dispersion af proteinprøverne blev pisket med hastighed III i fire minutter i en Hobarfc-blander (model N-50), hvori der var monteret et piskeris. Piskeekspansion blev beregnet i henhold til formlen V-250

Piskeekspansion = x 100%, hvor V = slutteligt piskevolumen i ml.

V blev målt ved efterfølgende indfyldning af vand i blandebeholderen. Man udførte dobbeltforsøg i forbindelse med hver af de tre prøver. De gennemsnitlige resultater er vist i tabel 3.6.

Skumstabiliteten blev bestemt som forholdet mellem mængden af det skum, som blev tilbage efter dræning i 30 minutter, og den oprindelige skummængde. 1 g skum fremstillet under anvendelse af den ovenfor angivne metode blev indført i en formstofcylinder (diameter 7 cm, højde 9 cm) med et trådnet med en maskestørrelse på 1 mm x 1 mm. Cylinderen blev anordnet på en tragt ovenpå en glascylinder, og vægten (B) af drænet væske i glascylinderen bestemmes.

.. ___ Skumstabiliteten FS bestemmes ved hjælp af formlen FS = —-T— x 100%.

Λ - 50 - 150495

Resultaterne af bestemmelsen er vist i tabel 2»$» 9§l§tYi]S§2 er ^ denne beskrivelse defineret som Brookfieid-viskositeten målt ved hjælp af T-spindler på et Brookfield Helipath stativ. Gelerne blev fremstillet _ ved varmebehandling af 12% proteinsuspensioner i 0,5 M NaCl. Varmebehandlingen blev gennemført i lukkede dåser, der havde en diameter på 7,3 cm og en højde på 5,0 cm, og som blev anbragt i vandbade, hvis temperatur blev holdt på 80°C og 100°C, i 30 minutter.

i Dåserne blev afkølet og termostatteret til 20°C, før de blev åbnet og målt. Resultaterne af målingerne er vist i tabel 3.6.

- Tabel 3.6 Funktionelle egenskaber af de tre proteinprodukter A, B og C. 1 i t I »- ’ — I !— ........ 1 ' "Γ Ί ! — i........ -' —*j

Funktionalitet A. Sojaprotein- B. Sojaprotein- C. Sojaprotein- isolat koncentrat isolat (p.v.p.) % NSI i 0,2 MNaCl 39,5 20,3 25,6 % NSI i vand 53,9 25,1 28,6-

Emulgeringskapa- citet: ml olie/g 218 182 354 (N x 6,25)

Piskeekspansion, % 120 120 340

Skumstabilitet, % 50 50 20

Gelstyrke (poise) 80°C (0,5 M NaCl) 1,7 x 10* 1,2 x 10* 3,3 x 10* 100°C (0,5 M NaCl) 2,0 x HT 4,0 χ 10* 1,3 x 10 * 150495 - 51 -

Eksempel 4 (anvendelseseksempel.)

Man fremstillede et p.v.p. i henhold til den i eksempel 3 C angivne metode med undtagelse af, at cellu-laseaktiviteten delvist hidrørte fra Trichoderma reseei.

Det kommercielle cellulasepræparat CELLUCLAST fremstillet af NOVO INDUSTRI A/S blev behandlet med en base ved lav temperatur på følgende måde. pH-værdien af en 10% opløsning af CELLUCLAST i vand blev indstillet på 9,2 med NaOH, og den således resulterende opløsning blev afkølet til 5°C. Efter 1 time ved dette pH og denne temperatur blev pH genindstillet på 4,7 med 20% eddikesyre. Denne opløsning blev holdt ved 5°C natten over og derpå ste-rilfiltreret. Filtratet blev frysetørret. 4 g af det frysetørrede produkt blev tilsat sammen med SPS-ase-præ-paratet KRF 68 Bill (eksempel 1). De to enzymer blev opløst i 172 g vand før tilsætning til vaskeblandingen. Massebalancebestemmelserne svarende til dette eksempel er vist i tabel 4.1.

Forsøget viser, at dette særlige SPS-ase-præparat allerede indeholder en effektiv cellulase, fordi tilsætningen af CELLUCLAST ikke synes at påvirke forholdet protein/ tørstof. Imidlertid kan andre SPS-ase-præparater indeholde mindre cellulase, f.eks. KRF 92, jfr. den tabel, der figurerer umiddelbart før eksempel 2.

- 52 - 150495 φ

Tabel 4,1 Massebalancebestemmelser i forbindelse med den isoelektriske vask omfattende et SPS-ase-præ-parat og CELLUCLAST® til fremstilling af p.v.p.

Masse af Protein Tør- Udbytte Udbytte Operationer fraktion, % stof, af pro- af tør- og fraktioner - g (N x 6,25) % tein, % stof, %

Vask:

Sojamel 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0

Vand 3546,2 0 00 0 SNHC1 43,1 0 21,3 0 2,3 SPS-ase: KRF 68

Bill 24,0 75,3 96 7,7 5,8 CELLUCLAST 4,0 43,6 96 0,7 1,0

Centrifugering:Σ 4043,1 - -

Centrifugat I 3382,0 1,9 5,5 27,3 46,5 Tørstoffer I 661,0 - -

Genvask: Tørstoffer I 661,0 - - -

Vand 3339,0 0 00 0 6 N HC1 0 0 0 0 0 2. Centrifugering: Σ 4000,0

Centrifugat II 3414,0 0,2 0,7 2,9 6,0 Tørstoffer II 582,0 --

Neutralisering: .

Tørstoffer II 582,0

Vand 1691,0 0 000 4 NNaOH 25,3 0 16,0 0 1,0 Tørring: Pulver 206,0 88,8 98,9 77,8 50,9

Eksempel 5 (anvendelseseksempel)

Man fremstillede et p.VTp. i henhold til den metode, der er beskrevet i eksempel 3C, med undtagelse af, at alle masser var formindsket med en faktor 5, og at reaktionsbian- - 53 - 150495 dingen blev afkølet til ca. 5°C før centrifugeringen. På basis af de analytiske resultatet i relation til centri-fugaterne opnås der et teoretisk udbytte af bundfældet protein, som er vist i tabel 5.1.

Tabel 5.1 Teoretiske proteinudbytter opnået ved fremstilling af p.v.p.

Protein Udbytte Eksempel 3 C

Masse (NX6.25) af pro- Ί53Ϊ5ΪΚ- udbytte-

Fraktioner , g * tein, % χ 6 2S) af >roteini _____%_ %_

Sojamel 85f2 55,2 100 55,2 100 SPS-ase KRF-68 B-IXI 4,8 75,3 7,7 75,3 7,7 1. Centrifugat 639 0,99 13,5 1,7 24,7 2. Centrifugat 595 0,13 1,6 0,2 2,9 p.v.p. - 87,2a 92,6b 87,1 80,lb a Gennemsnit af 87,5 (Bioteknisk Institut) og 86,9 (Ouist's Labo-torium)j tørstofbestemmelserne er henholdsvis 97,6 og 98,0%.

^ Beregnet som totalmasse af protein - protein tabt i centrifu- , gaterne.

Eksempel 6 (anvendelseseksempel) 1 g (N x 6,25) fra et kommercielt sojaproteinisolat (Purina 500 E fra Ralston Purina) blev opløst i 680 g vand. Blandingen blev i et vandbad opvarmet til 50°C, og pH blev indstillet på 4,50 med 6 N HC1. 90 g-af denne blanding blev overført til 5 x 250 ml Erlenmeyer-kolber, og man tilsatte 10 -g af vandige opløsninger, der indeholdt henholdsvis 0 g, 0,2 g, 0,4 g, 0,8 g og 1,6 g af det SPS, der er fremstillet som beskrevet tidligere i denne beskrivelse. Kolberne blev derpå ’ 54 " 150495 holdt under omrøring med en magnet i et vandbad ved 50°C i 240 minutter.

Herefter blev opslemningerne centrifugeret ved 3000 x g i 15 minutter, og centri fugaterne I blev analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. De faste faser blev vasket i vand ved stuetemperatur og recentrifugeret. Denne proces blev gentaget. Derpå blev tørstofferne dispergeret i 50 ml vand, og pH blev indstillet til 6,50 ved dråbevis tilsætning afeNNaOH.

De neutraliserede produkter blev frysetørret og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof. Baseret på de analyser, der er vist i tab§l 6.1,beregner man proteinudvindingen og den procentdel af SPS, der er blevet bundet til proteinet, ved hjælp af de formler, der er vist i relation til tabel 6.2.

Dette eksempel viser, at SPS bindes fast til proteinet, således at forholdet protein/tørstof aftager med voksende indhold af SPS. Et SPS-indhold, der omtrentligt svarer til 0,4 g i 10 g vand tilsat til 5 g proteinisolat, svarer til det forhold protein/SPS, som foreligger i sojamel.

Den procentiske binding af SPS er en beregnet værdi.

Den procentiske binding af SPS aftager på grund af mætning af proteinet med SPS ved de lavere forhold protein/SPS.

Tabel 6.1 Målinger i henhold til eksempel 6

Forhold Centrifugater I Tørret bundfald protein/SPS %N I DM IN IN x 6,25 % DM % N *p^f·2- 00 0,068 0,62 13,2 82,5 93,1 88,6 25 0,045 0,49 13,4 83,8 97,3 86,1 12,5 0,038 0,45 13,0 81,3 97,9 83,0 6,25 0,031 0,45 12,6 78,8 98,1 80,3 3,125 0,026 0,61 11,8 73,8 97,9 75,3 55 ' 150495

Tabel 6.2 Proteinudvinding og procentisk binding af SPS

protein/SPS % udvinding af protein ^ % binding af SPS ^ 09 · 91,5 0“ 25 94,4 77 12,5 95,3 90 6,25 96,1 70 3,125 96,8 60 ^ % udvinding af protein = JjL - x 100, hvor

NC 1 = % N i centrifugat I

^ % binding af SPS = [5 x (% udvundet_protein? 5 x (% udvundet ; protein)} (% P/H) UP/Hjøo j -- - -_ x 100, [5/(forhold protein/SPSjj (% P/H) er forholdet protein/tørstof i det tørrede bundfald, og (% P/HJøq er det tilsvarende forhold for bundfaldet uden tilsætning af SPS.

Eksempel 7 (anvendelseseksempel)

Dette eksempel beskriver fremstillingen af et p.v.p. under anvendelse af SPS-ase-præparatet KRF 92 B-I i en dosering på 5% af tørstoffet. Fremstillingsmetoden var nøjagtig som angivet i eksempel 3 C, med undtagelse af, at alle masser var reduceret med en faktor 5. p.v.p. blev analyseret som beskrevet i eksempel 2. De resultater, der fremkom ved forsøget, figurerer i tabel 7.1.

- 56 - 150495

Tabel 7.1 Resultater opnået i eksempel 7.·

Odbytte Odbytte Masse (N x 6,25) Tørstof af pro- af tør-Komponent g % % tein, % stof, %

Sojamel 85,2 55,2 94,0 100 100

Ensympræparat 4,0 71,2 . - 6,1 1. Centrifugat 632 1,88 5,44 25,3 43,0 2. Centrifugat 673 0,30 0,80 4,3 6,7 p.v.p. 39,8 85,6* 98,1* 71,9 48,8 84,4° 98,1° * Analyseret på Bioteknisk Institut, Holbergsvej 10, DK-6000 Kolding

^ Analyseret på Qvist's Laboratorium, Marselis Boulevard 169, DK-8000 Aarhus C

. Eksempel 8 (anvendelseseksempel)

Dette eksempel viser virkningen af at forbehandle sojamelet ved jet-kogning før fremstillingen af p.v.p.

Forbehandling

En opslemning af sojamel i vand bestående af 10 kg sojamel (Sojamel 13 produceret af Aarhus Oliefabrik A/S) per 100 kg blev pumpet gennem en damp-ejector (type Hydroheater B-300) og blandet med damp med et tryk på 8 bar i en 'sådan mængde og med en sådan strømningshastighed, at man kunne opretholde en sluttelig temperatur på 150°C i 25 sekunder i en tubulær, under tryk stående reaktor. Herefter blev trykket frigjort i et trykudligningskammer (en cyclon), og herfra blev opslemningen sendt gennem en pladevarmeudveksler og afkølet til ca. 50°C. Den afkølede opslemning kunne anvendes direkte til fremstilling af p.v.p., men i dette tilfælde blev opslemningen sprøjtetørret med en indgangstemperatur på 200°C og en udgangstemperatur på 90°C. Det forbehandlede produkt viste sig at have et tørstofindhold på 96,5% og et proteinindhold på 56,9% (N x 6,25) .

150495 - 57 -

Fremstilling af p.v.p.

Denne produktion gennemførtes på følgende måde: 70 g tørstof af det jet-kogte og tørrede sojamel blev suspenderet og holdt under omrøring, ved 50°C i 560 g vand, og pH blev indstillet på 4,50 ved hjælp af 6,5 ml 6NHC1. 6 x 90 g af denne suspension blev overført til seks 250 ml Erlenmeyer-kolber og holdt under omrøring i et 50°C vandbad ved hjælp af magnetiske omrørere.

Til hver beholder tilsattes 10 g af en opløsning indeholdende henholdsvis 0 g, 0,025 g, 0,050 g, 0,10 g, 0,20 g og 0,40 g af SPS-ase-præparatet KRF-68-B-III. Reaktionsblandingerne blev derpå holdt under omrøring i 240 minutter ved 50°C. Derpå gennemførtes en centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter.

Supernatånten blev derpå analyseret for Kjeldahl-N, og den faste fase blev vasket med vand i lige store volumina og centrifugeret.

Denne metode blev gennemført to gange. Den faste fase blev derpå frysetørret og analyseret for Kjeldahl-N og tørstof.

Et lignende forsøg blev gennemført med ' et ubehandlet sojamel (Sojamel 13 fra Aarhus Oliefabrik A/S) som udgangsmateriale. I dette tilfælde var forholdene enzym/substrat 0, 1%, 2%, 3%, 4% og 8%.

Baseret på proteinindholdet af supematanterne kan man beregne procentdelen af udvundet protein. Proteinudbyttet er baseret på den antagelse, at enzymproduktet er 100% solubi-liseret efter reaktionen. Den følgende tabel viser de resultater, som opnåedes ved begge forsøg.

- 58 - •150495

Tabel 8.1

Kogt sojamel Ubehandlet sojamel a Protein- Protein af Protein- Protein af E's udbytte % tørstof % udbytte % tørstof % 0 92,9 76,5 90,7 73,9 0,25 90,1 86,6 0,50 89,3 88,7 1.0 88,1 89,7 87,1 86,2 2.0 86,6 91,7 85,7 88,1 3.0 - - 84,3 89,5 4.0 84,7 92,2 82,6 90,9 8.0 - - 76,2 91,1

Tabel 8.1. Proteinudbytter og forhold protein/tørstof for p.v.p. fremstillet ud fra kogt eller råt sojamel.

Eksempel 9

Isolation af protein fra majsgluten.

Majsgluten fremstilles sædvanligvis som biprodukt ved majsstivelsesfremstilling. Dette rå majsgluten er ikke separeret effektivt fra fiberfraktionen, og dette er en af grundene til, at det ikke udviser nogen værdifulde funktionelle egenskaber. Hertil kommer, at det rå majsgluten ledsages af forskellige nedbrydelige polysaccharider.

En serie af SPS-ase-behandlinger blev gennemført med et SPS-ase-præparat fremstillet i henhold til eksempel 1, med undtagelse af, at man gennemførte en ultrafiltrering 1 stedet for bundfældningen med (NH^)2S0^, hvorved det isolerede enzym blev basebehandlet i henhold til metode A (dette basebehandlede SPS-ase-præparat bliver i det følgende for kortheds skyld benævnt PPS 1305). PPS 1305 indeholder praktisk taget ingen proteolytisk aktivitet.

" 59 “ 150495

Man anvendte følgende reaktionsbetingelser:

Substratkoncentration: S = 10% tørstof (Staley Corn Gluten) pH = 4,50 T = 50° C t = 240 minutter

Enzym : PPS 1305 E/S% = 0; 1; 2; 3; 4; 81

Proteinproduktet blev renset ved centrifugering, vasket to gange og slutteligt frysetørret.

Resultaterne fremgår af den følgende tabel 9.

Tabel 9

Forsøg Enzymdosis Protein- Opløst poly- Protein-nr. E/S% renhed % saccharid % renhed (N x 6,2 5/DM)% 873 0 96 0 64 874 1 .· 95 40 75 875 2 95 50 78 876 3 95 52 79 877 4 95 63 83

Eksempel 10

Isolation af protein fra bomuldsfrømel, solsikkemel eller rapsmel.

Proteinet fra bomuldsfrømel, solsikkemel eller rapsmel kan isoleres på samme måde som proteinet fra sojabønnemel og majsgluten. Isolation af protein fra adskillige andre proteinholdige, vegetabilske råmaterialer kan gennemføres på samme måde. Naturligvis bør isolationen og/eller separationen fortrinsvis gennemføres ved det isoelektriske punkt for størstedelen af proteindelen af udgangsmaterialet, hvorved proteinudbyttet er maksimalt.

Λ

* 60 - ICA/QR

Bi oversigt over* de figurer, hvortil der allerede har været henvist, fremgår af det nedenstående skema for at tilvejebringe et bedre overblik.

Pig. nr. Hører til Beskriver 1 Beskrivelses- Påvisning af bindingseffekten indledningen mellem SPS og sojaprotein 2 Beskrivelses-' Strømningsdiagram, som beskri-

indledningen ver fremstillingen af SPS

3 Sektion 2 Kalibreringskurve for HPLC- gelf iltreringskromatogra f i 4 Sektion 2 HPLC-gelfiltreringskromatogram

af SPS

5 Sektion 2 HPLC-gelfiltreringskromatogram af SPS nedbrudt af SPS-ase 6 Sektion 2 og 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af supernatant fra SPS inkuberet med sojaprotein 7 Sektion 2 HPLC-gelfiltreringskromatogram af supernatant fra nedbrudt SPS inkuberet med sojaprotein 8 Sektion 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af APS nedbrudt med Pectolyase 9 Sektion 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af APS nedbrudt med SPS-ase 10 Sektion 3 HPLC-gelfiltreringskromatogram af SPS behandlet med Pectolyase 11 Sektion 7 Immunelektroforetiske toppe, herunder en SPS-ase-top identificeret ved overlejringsteknik 12 Sektion 8 Ionbytningskromatogram af en SPS-ase 13 Sektion 9 pH-aktivitets-afhængighed af en SPS-ase 14 Sektion 9 Temperatur-aktivitets-afhængig- hed af en SPS-ase 15 Sektion 9 Temperaturstabilitet af en SPS- ase 16 Sektion 10 pH-stabilitet af protease i et SPS-ase-præparat