CN109576330B - 郁李仁多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

郁李仁多肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种制备郁李仁多肽的方法，包括：1)从郁李仁中分离蛋白质，获取郁李仁分离蛋白；2)对步骤1)获取的郁李仁分离蛋白进行酶解，得到郁李仁蛋白酶解液；3)将步骤2)得到的郁李仁蛋白酶解液进行体外模拟胃肠道消化。4)将步骤3)体外模拟胃肠道消化的产物用超滤膜分离得到不同分子量段多肽。本发明还提供了上述郁李仁多肽及应用。本发明将郁李仁蛋白酶解液进行体外模拟胃肠道消化，并通过超滤膜对体外模拟胃肠道消化得到不同分子量段多肽，获得了对α‑葡萄糖苷酶、α‑淀粉酶及DPP‑IV的活性具有较好的抑制作用的郁李仁多肽。

Description

郁李仁多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及多肽蛋白，特别是郁李仁多肽及其制备方法和应用。
背景技术
郁李仁是蔷薇科植物的干燥成熟种仁，在我国产量非常丰富，是我国传统的药食两用原料。郁李仁性平，味辛、苦、甘，归脾、大肠、小肠经，具有润肠通便，下气利水的功效。郁李仁含有苦杏仁苷、郁李仁苷、脂肪油(50％以上)、有机酸、粗蛋白、纤维素等成分，其中含有丰富的蛋白质，一般平均含量在28％左右。现代药理学研究苦杏仁苷具有祛痰止咳平喘作用、郁李仁苷具有泻下作用，郁李仁油具有润肠通便作用，而含量较高的蛋白质当作药渣废弃，造成极大的资源浪费。
目前常用的制备多肽的方法主要是采用酶解法制备成小分子多肽或大分子玉米多通过选择适当的蛋白酶，水解的蛋白质可以得到大量的具有各种生物功能的生物活性肽，这些活性肽不仅具有极其广泛的活性和多样性，而且其来源丰富、成本低、安全性好。操作简单、便于工业化生产，因此已成为研究的新热点。
另外，部分食物来源活性成分已成为预防和/或治疗神经退行性疾病及抑郁等病症的潜在目标。尤其是对于老年痴呆症，日常饮食治疗更能避免药物干预治疗的不利因素。此外，食物蛋白来源的肽类物质，因具有来源稳定、价格低廉、制备工艺简单、无副作用等优点，逐渐成为人们研究的热点。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及DPP-IV的活性具有较好的抑制作用的郁李仁多肽。
本发明的另一目的是提供上述郁李仁多肽的制备方法和应用。
技术方案：本发明提供一种制备郁李仁多肽的方法，包括以下步骤：
1)从郁李仁中分离蛋白质，获取郁李仁分离蛋白；
2)对步骤1)获取的郁李仁分离蛋白进行酶解，得到郁李仁蛋白酶解液；
3)将步骤2)得到的郁李仁蛋白酶解液进行体外模拟胃肠道消化；
4)将步骤3)体外模拟胃肠道消化的产物依次用截留分子量为30～10KDa和10～1KDa的超滤膜过滤，分离得到不同分子量段的多肽。
优选地，步骤1)中，从郁李仁中分离蛋白质，获取郁李仁分离蛋白的方法包括：向脱脂的郁李仁粉中加入水，调节pH至7.5～12，在25～75℃恒温搅拌10～100分钟，然后2500～5000rpm/min离心5～30分钟，将上清液pH调节至3.5～5.5后2500～5000rpm/min离心5～30分钟，将分离出的蛋白洗涤，用水复溶，调节pH至6.5～7.5，冷冻干燥。
步骤2)中，对步骤1)获取的郁李仁分离蛋白进行酶解的方法包括：配制质量分数为3～5％的郁李仁分离蛋白的水溶液，煮沸3～5min使郁李仁分离蛋白变性后置于30～60℃水浴中，用0.1～1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5～12，加入1～5％(E/S)碱性蛋白酶酶解2～5h，酶解过程中采用0.1～1mol/L盐酸溶液维持pH恒定，酶解结束后，用0.1～1mol/L盐酸溶液调节pH至1.5～4.5。
步骤3)中，将步骤2)得到的郁李仁蛋白酶解液进行体外模拟胃肠道消化的方法包括：向郁李仁蛋白酶解液中加入胃蛋白酶，在温度为32～42℃，转速为140～160rpm/min的条件下孵育1～5h，孵育过程中采用0.1～1mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液维持pH恒定，然后调节pH值至5～7.5并保持30～45℃，加入胰蛋白酶，在温度为30～45℃，转速为140～160rpm/min的条件下孵育1～5h，灭酶，离心去除沉淀。
步骤3)中，胃蛋白酶浓度优选为1～5％E/S，胰蛋白酶浓度优选为1～5％E/S，离心转速优选为2500～5000rpm/min，离心时间优选为5～30分钟。
步骤4)的步骤具体包括：将步骤3)体外模拟胃肠道消化的产物经过截留分子量为30～10KDa的超滤膜过滤，操作温度为25～45℃，操作压力为0.1～0.4MPa，得超滤膜截留液和超滤膜透过液；超滤膜截留液是指超滤膜纯化系统截留的液体；超滤膜透过液是指能通过超滤膜纯化系统的液体；截留分子量为30～10KDa的超滤膜纯化系统是指其可以截留分子量大于30～10KDa的分子，使分子量不大于30～10KDa的分子通过；再将超滤膜透过液经过截留分子量为10～1KDa的超滤膜过滤，操作温度为25～45℃，压力为0.2～0.8MPa，得到超滤膜截留液和超滤膜透过液。
本发明另一方面提供一种郁李仁多肽，该郁李仁多肽由上述制备郁李仁多肽的方法制得。
优选地，上述郁李仁多肽分子量段小于10KDa；进一步优选地，上述郁李仁多肽分子量段小于5KDa。
本发明另一方面提供上述郁李仁多肽在抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及DPP-IV的活性中的应用。
有益效果：本发明将郁李仁蛋白酶解液进行体外模拟胃肠道消化，并通过超滤膜对体外模拟胃肠道消化得到不同分子量段多肽，获得了对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及DPP-IV的活性具有较好的抑制作用的郁李仁多肽。
附图说明
图1是郁李仁蛋白及其酶水解物HPLC色谱图；
图2是不同分子量段郁李仁多肽对抑制d-葡萄糖苷酶活性的影响率柱状图；
图3是不同分子量段郁李仁多肽对抑制d-淀粉酶活性的影响率柱状图；
图4是不同分子量段郁李仁多肽对抑制DPP-IV活性的影响率柱状图。
具体实施方式
实施例1
郁李仁多肽的制备方法如下：
1)郁李仁分离蛋白的制备
向脱脂并粉粹处理后的郁李仁粉加入去离子水，调整固液比至1∶12，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至8.0，在30℃的恒温水浴锅中搅拌60分钟，用离心机以4000rpm/min的转速离心20分钟并取出上清液，所得上清液用0.5mol/L盐酸调pH至4.5，再用离心机4000rpm/min离心20分钟，分离出蛋白，并且用去离子水洗涤3次，用去离子水复溶，所得蛋白液用0.5mol/L的NaOH调节pH至7.0，冷冻干燥后得郁李仁分离蛋白。
2)郁李仁分离蛋白酶解
用去离子水配制质量分数为5％的郁李仁蛋白溶液，煮沸5min使变性，置50℃水浴，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，加入2％(E/S)碱性蛋白酶酶解5h，酶解过程中采用0.5mol/L盐酸溶液维持pH恒定，酶水解结束后，用1mol/L盐酸溶液调节pH至3.0，备用。
3)郁李仁蛋白酶解液体外模拟胃肠道消化
取郁李仁蛋白酶解液，调节温度至37℃，加入2％(E/S)胃蛋白酶，于37℃空气浴孵育2h，转速150rpm/min，采用0.2mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液维持pH恒定，消化结束后，采用调节0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0并保持37℃，加入4％(E/S)胰蛋白酶，于37℃空气浴孵育4h，转速150rpm/min，消化结束后，于100℃条件下灭酶15min，冷却后，用离心机4000rpm/min离心20分钟去除沉淀，待超滤分离。
4)郁李仁蛋白酶解液超滤分离
先将微滤膜透过液分别经过截留分子量为10KDa的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为30℃，操作压力为0.2MPa，得超滤膜截留液和透过液。超滤膜截留液是指超滤膜纯化系统截留的液体；超滤膜透过液是指能通过超滤膜纯化系统的液体。截留分子量为：截留分子量为10KDa的超滤膜纯化系统是指其可以截留分子量大于10KDa的分子，使分子量不大于10KDa的分子通过。再将透过液经过截留分子量为5KDa的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为30℃，压力为0.4MPa，得到超滤膜截留液和透过液，分别将不同分子量段的郁李仁多肽液真空冷冻干燥或喷雾干燥，备用。
5)郁李仁多肽分子量分布测定
仪器：Waters e2695高效液相色谱仪(四元泵，柱温箱，自动进样器，PDA-W2998检测器Photodiode Array Detector：Waters 2998；美国Waters公司，Empower处理软件)；色谱条件：谱柱TSKgelG3000PWXL(300nm×7.8nm)；流动相：乙腈：纯水：三氟乙酸的体积比为30：69.9：0.1；流速：0.5mL/min，柱温25℃；进样体积20μL，检测波长220/280nm。
样品和标准品溶液制备：精密称定适量样品(本实施例步骤4)制得的郁李仁多肽)和标准品(arginine(147.2Molwt)，vitamin B12(1355.38Molwt)，aprotinin(6511.44Molwt)，cytochrome C(12，400Molwt)，Bovine Serum Albumin(64，300Molwt))，用流动相配制成2mg/mL溶液，备用。相对分子质量校正曲线制作：按色谱条件进样，得到系列标准品的色谱图，以相对分子质量的对数(1gMW)作纵坐标，保留时间作横坐标作图得到相对分子质量校正曲线及其方程。
图1为得到的HPLC色谱图，图1中，S表示标准品HPLC色谱图，U表示郁李仁蛋白及其酶水解物HPLC色谱图(SPP表示郁李仁原蛋白，SPPAPT表示郁李仁蛋白酶水解物，MW＞10KDa，5KDa＜MW＜10KDa及MW＞10KDa分别表示截留分子量大于10KDa、分子量小于10KDa并大于5KDa及透过分子量为5KDa超滤膜的郁李仁酶解物)。
如图1可知，郁李仁原蛋白相比较，酶水解可以使蛋白质肽键裂解变成小分子肽。与郁李仁蛋白酶水解物相比较，超滤膜分离系统可以将多肽分成不同分子量段的多肽，从而有利于多肽功效的评价。
6)体外α-葡萄糖苷酶抑制率的测定
参考KIM的方法，根据实验情况稍加改动。用pH6.9的0.1M磷酸盐缓冲液配制0.1U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和2.5mmol/L的PNPG溶液。将0.1mL磷酸缓冲液、0.1mL样品溶液(本实施例步骤4)制得的郁李仁多肽液)及0.1mL的α-葡萄糖苷酶溶液置于试管中，在37℃水浴锅中恒温水浴10min，加入0.1mL 2.5mmol/L的PNPG溶液，37℃反应40min，加入0.6mL 0.2mol/L的Na2CO3溶液终止反应，于405nm处测定吸光值。反应体系中用0.1mL蒸馏水代替0.1mL样品溶液作为空白实验，用同体积的阿卡波糖溶液作阳性对照。
抑制率计算公式：
抑制率＝(OD blank-OD sample)/OD blank×100％
图2显示了不同分子量段郁李仁多肽对抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响。如图2可知，不同分子量段的郁李仁蛋白酶解物对α-葡萄糖苷酶活性均表现出非常高的抑制活性，与郁李仁原蛋白比较，不同分子量范围的郁李仁多肽的抑制作用显著增强，具有显著性差异(P＜0.05)，分子量段小于5KDa的抑制活性最强，达到83.2％，抑制活性提高了36.4％。
7)体外α-淀粉酶抑制率的测定
取0.2mL用pH6.9的0.1M磷酸盐缓冲液配制0.2U/mL α-淀粉酶溶液与等体积的2mg/mL样品(本实施例步骤4)制得的郁李仁多肽)溶液共培养30min后，加入0.4mL 1％的可溶牲淀粉溶液，37℃水浴继续处理10min后，加入0.2mL的DNS溶液终止反应，迅速经沸水浴处理10min后，用流水冷却，加适量的水定容到一定的体积，540nm下测定吸光值。反应体系中用0.1mL蒸馏水代替0.1mL样品溶液作为空白实验，用同体积的阿卡波糖溶液作阳性对照。抑制率计算公式：
抑制率＝(OD blank-OD sample)/OD blank×100％
图3显示不同分子量段郁李仁多肽对抑制α-淀粉酶活性的影响。如图3可知，不同分子量段的郁李仁蛋白酶解物对α-淀粉酶活性均表现出一定程度的抑制活性，与郁李仁原蛋白比较，郁李仁蛋白酶解物的抑制作用均有所提高，但只有分子量段小于5KDa具有显著性差异(P＜0.05)，抑制活性提高了46.7％。
8)体外DPP-IV抑制率的测定
取40μL用pH8.2的0.1M Tris-HCl配制2.5mU/mL DPP-IV溶液、60μL pH8.2的Tris-HCl溶液、40μL 2mg/mL样品(本实施例步骤4)制得的郁李仁多肽)溶液共培养10min后，加入40μL0.25mM Gly-Pro-pNA于37℃水浴60min，于405nm下测定吸光值。用同体积的DiprotinA去离子水溶液作阳性对照，用等体积的去离子水代替样品作为空白对照。
抑制率计算公式：
抑制率＝(OD blank-OD sample)/OD blank×100％
图4显示了不同分子量段郁李仁多肽对抑制DPP-IV活性的影响。由图4可知，不同分子量段的郁李仁蛋白酶解物对α-淀粉酶DPP-IV活性均表现出不同程度的抑制活性，与郁李仁原蛋白比较，郁李仁蛋白酶解物的抑制作用均有所提高，分子量段小于10KDa有显著性差异(P＜0.05)，分子量段小于5KDa抑制活性最强，抑制活性提高了172％。
实施例2
郁李仁多肽的制备方法如下：
1)郁李仁分离蛋白的制备
向脱脂并粉粹处理后的郁李仁粉加入去离子水，调整固液比至1：12，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5，在25℃的恒温水浴锅中搅拌100分钟，用离心机以2500rpm/min的转速离心30分钟并取出上清液，所得上清液用0.5mol/L盐酸调pH至3.5，再用离心机2500rpm/min离心30分钟，分离出蛋白，并且用去离子水洗涤3次，用去离子水复溶，所得蛋白液用0.5mol/L的NaOH调节pH至6.5，冷冻干燥后得郁李仁分离蛋白。
2)郁李仁分离蛋白酶解
用去离子水配制质量分数为4％的郁李仁蛋白溶液，煮沸4min使蛋白变性，置30℃水浴，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5，加入5％(E/S)碱性蛋白酶酶解5h，酶解过程中采用0.5mol/L盐酸溶液维持pH恒定，酶水解结束后，用1mol/L盐酸溶液调节pH至1.5，备用。
3)郁李仁蛋白酶解液体外模拟胃肠道消化
取郁李仁蛋白酶解液，调节温度至32℃，加入5％(E/S)胃蛋白酶，于32℃空气浴孵育5h，转速140rpm/min，采用0.2mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液维持pH恒定，消化结束后，采用调节0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.5并保持30℃，加入5％(E/S)胰蛋白酶，于30℃空气浴孵育5h，转速140rpm/min，消化结束后，于100℃条件下灭酶15min，冷却后，用离心机2500rpm/min离心30分钟去除沉淀，待超滤分离。
4)郁李仁蛋白酶解液超滤分离
先将微滤膜透过液分别经过截留分子量为30KDa的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为25℃，操作压力为0.1MPa，得超滤膜截留液和透过液。超滤膜截留液是指超滤膜纯化系统截留的液体；超滤膜透过液是指能通过超滤膜纯化系统的液体。截留分子量为：截留分子量为30KDa的超滤膜纯化系统是指其可以截留分子量大于30KDa的分子，使分子量不大于30KDa的分子通过。再将透过液经过截留分子量为1KDa的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为25℃，压力为0.2MPa，得到超滤膜截留液和透过液，分别将不同分子量段的郁李仁多肽液真空冷冻干燥或喷雾干燥，备用。
实施例3
郁李仁多肽的制备方法如下：
1)郁李仁分离蛋白的制备
向脱脂并粉粹处理后的郁李仁粉加入去离子水，调整固液比至1∶12，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至12，在75℃的恒温水浴锅中搅拌10分钟，用离心机以5000rpm/min的转速离心5分钟并取出上清液，所得上清液用0.5mol/L盐酸调pH至5.5，再用离心机5000rpm/min离心5分钟，分离出蛋白，并且用去离子水洗涤3次，用去离子水复溶，所得蛋白液用0.5mol/L的NaOH调节pH至7.5，冷冻干燥后得郁李仁分离蛋白。
2)郁李仁分离蛋白酶解
用去离子水配制质量分数为3％的郁李仁蛋白溶液，煮沸3min使蛋白变性，置60℃水浴，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至12，加入1％(E/S)碱性蛋白酶酶解2h，酶解过程中采用0.5mol/L盐酸溶液维持pH恒定，酶水解结束后，用1mol/L盐酸溶液调节pH至4.5，备用。
3)郁李仁蛋白酶解液体外模拟胃肠道消化
取郁李仁蛋白酶解液，调节温度至42℃，加入1％(E/S)胃蛋白酶，于42℃空气浴孵育1h，转速160rpm/min，采用0.2mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液维持pH恒定，消化结束后，采用调节0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.5并保持45℃，加入1％(E/S)胰蛋白酶，于45℃空气浴孵育1h，转速160rpm/min，消化结束后，于100℃条件下灭酶15min，冷却后，用离心机5000rpm/min离心5分钟去除沉淀，待超滤分离。
4)郁李仁蛋白酶解液超滤分离
先将微滤膜透过液分别经过截留分子量为10KDa的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为45℃，操作压力为0.4MPa，得超滤膜截留液和透过液。超滤膜截留液是指超滤膜纯化系统截留的液体；超滤膜透过液是指能通过超滤膜纯化系统的液体。截留分子量为：截留分子量为10KDa的超滤膜纯化系统是指其可以截留分子量大于10KDa的分子，使分子量不大于10KDa的分子通过。再将透过液经过截留分子量为5KDa的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为45℃，压力为0.8MPa，得到超滤膜截留液和透过液，分别将不同分子量段的郁李仁多肽液真空冷冻干燥或喷雾干燥，备用。

Claims (8)

1.一种制备郁李仁多肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)从郁李仁中分离蛋白质，获取郁李仁分离蛋白；
2)对步骤1)获取的郁李仁分离蛋白进行酶解，得到郁李仁蛋白酶解液；所述对步骤1)获取的郁李仁分离蛋白进行酶解的方法包括：配制质量分数为3～5％的郁李仁分离蛋白的水溶液，煮沸3～5min后在30～60℃温度下调节pH至7.5～12，然后加入1～5％E/S碱性蛋白酶，在30～60℃温度下酶解2～5h，酶解过程中维持pH恒定，酶解结束后，调节pH至1.5～4.5；
3)将步骤2)得到的郁李仁蛋白酶解液进行体外模拟胃肠道消化；其中，体外模拟胃肠道消化是向所述郁李仁蛋白酶解液中加入胃蛋白酶，在温度为32～42℃，转速为140～160rpm/min的条件下孵育1～5h，孵育过程中维持pH恒定，然后调节pH值至6.5～7.5，在30～45℃温度下加入胰蛋白酶，在温度为30～45℃，转速为140～160rpm/min的条件下孵育1～5h，灭酶，离心去除沉淀；
4)将步骤3)体外模拟胃肠道消化的产物依次用截留分子量为10KDa和5KDa的超滤膜过滤，分离得到不同分子量段的多肽。
2.根据权利要求1所述的制备郁李仁多肽的方法，其特征在于，步骤1)中，所述从郁李仁中分离蛋白质，获取郁李仁分离蛋白的方法包括：向脱脂的郁李仁粉中加入水，调节pH至7.5～12，在25～75℃恒温搅拌10～100分钟，然后2500～5000rpm/min离心5～30分钟，将上清液pH调节至3.5～5.5后2500～5000rpm/min离心5～30分钟，将分离出的蛋白洗涤，用水复溶，调节pH至6.5～7.5，冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的制备郁李仁多肽的方法，其特征在于，所述胃蛋白酶浓度为1～5％E/S，所述胰蛋白酶浓度为1～5％E/S，所述离心转速为2500～5000rpm/min，离心时间为5～30分钟。
4.根据权利要求1所述的制备郁李仁多肽的方法，其特征在于，步骤4)的步骤具体包括：将步骤3)体外模拟胃肠道消化的产物经过截留分子量为10KDa的超滤膜过滤，操作温度为25～45℃，操作压力为0.1～0.4MPa，得超滤膜截留液和透过液；再将透过液经过截留分子量为5KDa的超滤膜过滤，操作温度为25～45℃，压力为0.2～0.8MPa，得到超滤膜截留液和透过液。
5.一种郁李仁多肽，其特征在于，该郁李仁多肽由权利要求1～4中任意一项所述的制备郁李仁多肽的方法制得。
6.根据权利要求5所述的郁李仁多肽，其特征在于，该郁李仁多肽分子量段小于10KDa。
7.根据权利要求5所述的郁李仁多肽，其特征在于，该郁李仁多肽分子量段小于5KDa。
8.权利要求5～7中任意一项所述的郁李仁多肽在抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及DPP-Ⅳ的活性中的应用。
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