DE2928881A1

DE2928881A1 - Neutrale glucoamylase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2928881A1
Application number: DE19792928881
Authority: DE
Inventors: Mizuho Shimizu; Minoru Tago; Masaki Tamura
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1978-07-20
Filing date: 1979-07-17
Publication date: 1980-02-07
Also published as: FR2431535B1; JPS5515720A; IN151398B; NL7905604A; FR2431535A1; JPS6155947B2; US4254225A; BE877754A

Description

PATENTANWÄLTE

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER R. F. MEYER-ROXLAU

DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING.

8000 MÖNCHEN 80 LUCl LE-GRAHN-STHASSE

TELEFON-, (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

29. Juni 1979 3205

CPC INTERNATIONAL INC. International Plaza, Englewood Cliffs, N.J. 07632, USA

Neutrale Glucoamylase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Die Erfindung betrifft eine neue neutrale Glucoamylase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Gegenwärtig sind bei der industriellen Produktion von Dextrose aus Stärke die zur Verzuckerung hauptsächlich eingesetzten Glucoamylasen solche, die von zu Rhizopus und Aspergillus gehörenden Mikroorganismen erzeugt werden. Die Bedingungen, unter denen diese Glucoamylasen verwendet werden, sind ein pH-Wert von 5,0 und 55°C für das Enzym aus Rhizopus-Mikroorganismen und ein pH-Wert von 4,5 und 60⁰C für das Enzym aus Aspergillus-Mikroorganismen. Zudem liegt der maximale Dextrosegehalt des Hydrolysats bei etwa 96 % (auf der Grundlage trockener Feststoffe), wenn diese Glucoamylasen mit enzymverflüssigter Stärke bei 30%iger Konzentration reagieren. Ein Grund dafür, daß die Dextrose-

909886/0728

2928a8

Ausbeute nicht 100 % erreicht, liegt darin, daß sich Isomaltose aufgrund einer Umkehrreaktion durch diese Glucoamylasen ansammelt. Kürzlich wurde jedoch ein Bericht veröffentlicht {US-PS 3 897 305), daß die Umkehrreaktion von Glucoamylasen nahe dem Neutralpunkt extrem gering ist und daß die Dextroseausbeute so auf etwa 98 % gesteigert werden kann, indem die Reaktion etwa bei neutralem pH-Wert unter gleichzeitiger Verwendung von Pullulanase durchgeführt wird. Die Pullulanase wirkt auf die Stärke verzweigungsabbauend und steigert unter diesen nahezu neutralen Bedingungen die Wirkungsgeschwindigkeit der Glucoamylase. Was neutrale Glucoamylasen betrifft, ist bisher nur eine beschrieben worden, nämlich die Glucoamylase, die durch den Reisbrand auslösenden Pilz (Piricularia oryzae; Kazuo Matsuda, et al., Amylase Symposium, Band 9, 1974) erzeugt wird, aber diese Glucoamylase besitzt eine geringe Wärmebeständigkeit und kann somit nicht unter industriellen Bedingungen eingesetzt werden.

Aufgabe der Erfindung ist daher in erster Linie die Schaffung einer Glucoamylase, die bei nahezu neutralem pH-Wert aktiv ist und genügend Wärmebeständigkeit besitzt, so daß sie unter industriellen Reaktionsbedingungen eingesetzt werden kann und die mit einem Stärkehydrolysat zu Dextrose in hohen Ausbeuten reagiert.

Es wurde nun ein Mikrobenstamm gefunden, der eine neue Glucoamylase mit optimaler Aktivität bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 und guter Wärmebeständigkeit produziert. Die neue Glucoamylase vermag eine 30 gewichtsprozentige Lösung einer verflüssigten Stärke mit 10 D.Ä. (Dextroseäquivalent) in ein Produkt zu überführen, das wenigstens etwa 96 % Dextrose enthält, wenn sie mit dem Stärkehydrolysat bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 bei 55°C zur Reaktion ge-

909886/0728

bracht wird. Zur Erfindung gehört ein Verfahren zur Herstellung dieser Glucoamylase, bei dem ein Mikroorganismus der Gattung Stachybotrys, der die Glucoamylase produziert, in einem Medium gezüchtet und das Enzym aus der Kulturbrühe gewonnen wird.

Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Enzymaktivität in den Fällen des erfindungsgemäßen Enzyms und der herkömmlichen Glucoamylasen, produziert von R. niveus und A. niger;

Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Temperatur und der Enzymaktivität in den Fällen des erfindungsgemäßen Enzyms und der Glucoamylase aus P. oryzae;

Fig. 3 stellt die Inaktivierungskurven für das erfindungsgemäße Enzym dar, wenn es bei verschiedenen pH-Werten behandelt wird;

Fig. 4 zeigt einen Vergleich des erfindungsgemäßen Enzyms und der herkömmlichen Glucoamylasen, produziert durch R. niveus, A. niger und P. oryzae, ausgedrückt als relative Wärmebeständigkeiten.

Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen neuen neutralen Glucoamylase sind im einzelnen aufgeführt und ihre Eigenschaften werden denen der bisher bekannten Glucoamylasen gegenübergestellt.

Die Bezeichnung "D.Ä." ist eine Abkürzung für "Dextroseäquivalent", und diese Bezeichnungen werden wahlweise verwendet, um den Gehalt an reduzierendem Zucker eines Materials, berechnet als Dextrose und ausgedrückt als Prozent der gesamten Feststoffe, zu bezeichnen.

909886/0728

Der Begriff "Stärkehydrolysat" wird allgemein verwendet, um einen Sirup oder ein Trockenprodukt zu bezeichnen, der bzw. das durch partielle Stärkehydrolyse anfällt. Ein solches Produkt kann durch saure oder enzymatische Hydrolyse hergestellt werden.

Der Begriff "verflüssigte Stärke" wird verwendet, um ein Stärkehydrolysat mit niedrigem Dextroseäquivalent (D.Ä. von etwa 2 bis etwa 20) zu bezeichnen.

1. Aktivität und Substratspezifitat

Das erfindungsgemäße Enzym vermag solche Kohlenhydratverbindungen wie Stärke, lösliche Stärke, Amylose, Amylopectin und Glycogen, zu hydrolysieren und aus ihnen Dextrose zu bilden. Die Ausbeute an Dextrose aus jedem dieser Substrate ist 100 %, wenn die Substratkonzentration 1 % ist. Die Mutarotation der gebildeten Dextrose ist positiv. Dieses Enzym ist somit eine Glucoamylase. Die Reaktionsgeschwindigkeit dieses Enzyms wurde mit den Geschwindigkeiten der durch zu Rhizopus und Aspergillus gehörende Mikroorganismen produzierten Glucoamylasen in Bezug auf verschiedene Substrate verglichen. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle I. Wie dieser Tabelle zu entnehmen ist, ist die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms merklich höher als die Aktivitäten der anderen beiden Glucoamylasen insbesondere hinsichtlich der Hydrolyse von Pullulan.

9 0 9 8 8 6 / Π 7 0 fl

Tabelle I

Substratspezifität

Reaktionsgeschwindigkeit

Substrat	erf.gem. Enzym	Aspergillus niger Gluco- ,v amylase	Rhizopus niveus Gluco- . amylase
Dextrin (D.Ä. 1	0) 100	100	100
Amylopectin	104	113	91
lösliche Stärke	122	95	112
Pullulan	9	2	2
Glycogen	102	100	91
Maltotriose	6	12	8
Maltohexose	91	100	146
Panose	44	47	48
Maltose	14	26	19

a) Die Enzymaktivitäten jeder Glucoamylase wurden mit den in 1%iger Konzentration vorliegenden Substraten bestimmt; der Aktivität eines jeden Enzyms gegenüber Dextrin wurde der Wert 100 zugeordnet, und die Aktivitäten gegenüber den anderen Substraten sind als Relativwerte wiedergegeben.

b) Erhältlich von der Enzyme Development Corporation, 2 Penn Plaza, New York, N.Y.

c) Sumyzyme, erhältlich von Sumitomo Shoji Kaisha, Ltd., 1, Kanda Mitoshiro-Cho, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan.

2. Optimaler pH-Wert und stabiler pH-Bereich.

Die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität (relativer Wert) des erfindungsgemäßen Enzyms und dem ReaktionspH wurde untersucht und dann mit den entsprechenden Beziehungen für die herkömmlicherweise bekannten Glucoamylasen, produziert von Rhizopus-und Aspergillus-Mikroorganismen,

909886/0728

verglichen. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 1. Wie die Figur zeigt, liegt der optimale pH-Wert dieses Enzyms bei 60⁰C bei 6,0 bis 6,5, erheblich höher als die pH-Optima der anderen Enzyme. Außerdem zeigt dieses Enzym seine beste Stabilität um einen pH-Wert von 6,0, es zeigt sich aber keine Inaktivierung dieser Glucoamylase, selbst wenn es 24 h bei Raumtemperatur absitzen gelassen wird, über einen pH-Bereich von 4 bis 11.

3. Bestimmung des Wirkungsvermögens

Eine 0,5 ml-Teilmenge einer geeignet verdünnten Enzymlösung wurde zu 0,5 ml einer 2%igen Lösung eines sprühgetrockneten Maltodextrins (D.Ä. etwa 10) in 0,1 m Acetatpufferlösung
(pH 6,0) gegeben und dies genau 10 min bei 60⁰C inkubiert. Die Enzymreaktion wurde dann durch 5-minütiges Erwärmen
des Gemischs in einem siedenden Wasserbad gestoppt. Die
Menge an gebildeter Dextrose wurde nach der Glucoseoxydase-Methode bestimmt. Die Menge an Enzym, die 1 μΜοΙ Dextrose/ min produziert, wurde als eine Einheit definiert.

4. Optimaler Reaktionstemperaturbereich

Der Einfluß der Temperatur auf die relative Enzymaktivität des erfindungsgemäßen Enzyms bei pH 6,0 wurde mit der relativen Aktivität für die bekannte Glucoamylase aus dem
Reisbrand-Pilz, Piricularia oryzae, verglichen. Diesen Vergleich zeigt Fig. 2. Es ist augenscheinlich, daß die optimale Temperatur für die Reaktion des erfindungsgemäßen
Enzyms unter diesen Bedingungen 65°C ist, etwa 1O⁰C höher
als die des Enzyms aus Piricularia oryzae.

5. Inaktivierung durch pH- und Temperaturbedingungen

Fig. 3 zeigt Inaktivierungskurven der relativen Enzymaktivität des erfindungsgemäßen Enzyms bei 60-minütiger Behandlung

bei 60⁰C über einen pH-Bereich von 3 bis 8. Aus der Figur wird klar, daß dieses Enzym bei pH 6 am stabilsten ist und durch 30-minütiges Behandeln bei pH 3 und einstündiges Behandeln bei pH 4 vollständig inaktiviert wird. Ferner zeigt Fig. 4 einen Vergleich der Wärmebeständigkeit des erfindungsgemäßen Enzyms und der Glucoamylasen aus Rhizopus-, Aspergillus- und Piricularia-Mikroorganismen. Fig. 4 zeigt nämlich die Inaktivierungskurven, die für diese Enzyme erhalten wurden, wenn sie bei 60⁰C und wegen der Stabilität bei ihren jeweiligen optimalen pH-Werten gehalten, behandelt wurden. Es ist zu ersehen, daß die Wärmebeständigkeit des erfindungsgemäßen Enzyms unter der der aus Aspergillus stammenden Glucoamyläse, aber über der der Glucoamylasen aus Rhizopus und Piricularia liegt.

6. Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung

Dieses Enzym erfordert keine besonderen Aktivierungs- oder Stabilisierungsmittel. Wie jedoch im Falle der meisten der anderen Glucoamylasen wird dieses Enzym durch Quecksilber (II)chlorid, Kaliummanganat, Eisen(II)Chlorid, andere Metallsalze und Tris gehemmt.

7. Reinigungsverfahren

Das erfindungsgemäße Enzym kann durch eine Kombination irgendeiner der gewöhnlichen Reinigungsmethoden, wie der Ammoniumsulfat-Fraktionierung, der Fraktionierung mit organischem Lösungsmittel, Stärkeadsorption, und durch die verschiedenen chromatographischen Methoden gereinigt werden. Nachfolgend findet sich zur Veranschaulichung ein Beispiel einer solchen Reinigung.

Zellen und anderes unlösliches Material werden aus dem gezüchteten Material entfernt, dann wird die Kulturflüssig-

909886/0728

keit über Nacht bei -20°C gefroren. Sie wird dann bei Raumtemperatur geschmolzen und das unlösliche Material abzentrifugiert. Dann werden 2 Volumina kaltes Isopropanol zugesetzt, und es wird über Nacht bei 4⁰C stehengelassen. Die Enzymfällungen und die überstehende Flüssigkeit werden durch Dekantieren entfernt. Die Fällung wird dann in einer 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), die 1 mMol ÄDTA enthält, gelöst, und dann wird das gelöste Material eine Nacht bei 4⁰C gegen den gleichen Puffer dialysiert, DEAE-Cellulose, mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht, wird dann dieser dialysierten Enzymlösung zugesetzt, so daß das Enzym adsorbiert wird. Nach dem Waschen dieser DEAE-Cellulose mit dem gleichen Puffer wird das Enzym aus dem Harz mit dem gleichen Puffer, der 0,3 m NaCl enthält, eluiert. Das Enzym wird dann durch Zusatz von 2 Volumina kaltem Isopropanol zum Eluat ausgefällt, und dieses ausgefällte Material wird durch Zentrifugieren gewonnen. Die Fällung wird in 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) mit 1 mMol ÄDTA gelöst» dann wird über Nacht gegen den gleichen Puffer dialyniert. Die dialysierte Enzymlösung wird sodann auf eine DUAE-Cellulosesäule aufgebracht, die mit dem gleichen 0,05 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit 1 mMol ÄDTA ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Aus dieser Säule wird das Enzym dann eluiert, indem der gleiche Puffer mit bis zu 0,5 m NaCl bei linearem Konzentrationsgradienten hindurchgeführt wird. Die eluierten Fraktionen, die das Enzym enthalten, werden gesammelt und das Enzym nach der Isopropanol-Fällungstechnik konzentriert. Dieses konzentrierte Enzym wird dann auf eine Sephadex G-150-Säule gebracht, die mit einem 0,05 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) mit 1 mMol ÄDTA ins Gleichgewicht gebracht worden ist, und Elution erfolgt mit der gleichen Pufferlösung. Wurde hiernach gearbeitet, zeigte das erhaltene gereinigte Enzym eine einzige Bande bei der Disk-Elektrophorese.

8. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms wurde unter Verwendung einer Sephadex G-150-Säule nach der Arbeitsweise von A. K. Dunker und R. R. Rueckert , J. Biol. Chem. 244, 5074 (1969) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß das Molekulargewicht dieses Enzyms etwa 50.000 ist.

Sodann werden die Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäßen Enzym und den bislang bekannten Glucoamylasen angegeben, und es wird erläutert werden, warum dieses Enzym als neues Enzym mit optimalem pH-Wert in der Nähe des Neutraispunkts anzusehen ist.

Was den optimalen pH-Wert von Enzymen betrifft, ist den in Fig. 1 und Tabelle II wiedergegebenen Daten zu entnehmen, daß die einzigen Glucoamylasen, die ihren optimalen pH-Wert im neutralen Bereich haben, das erfindungsgemäße Enzym und das vom Reisbrand-Mikroorganismus, Piricularia oryzae, produzierte Glucoamylase sind. Wie jedoch aus Fig. 2 und Tabelle II hervorgeht, unterscheiden sich die optimalen Reaktionstemperaturen des erfindungsgemäßen Enzyms und der Reisbrand-Glucoamylase sehr. Außerdem zeigen die Kurven der Fig. 4, daß die Wärmebeständigkeit des erfindungsgemäßen Enzyms der der Reisbrand-Glucoamylase weit überlegen ist. Weiter zeigt Tabelle II, daß das Molekulargewicht des erfinduncjsgemäßen Enzyms viel kleiner ist als das Molekulargewicht der anderen bekannten Glucoamylasen .

909886/0728

2S28881

Tabelle II

Vergleich der verschiedenen Glucoamylasen bezüglich optimalem pH, optimaler Temperatur und Molekulargewicht

Glucoamylase

pH^a)

erfindungsgemäßes
Enzym 6,0-6,5*

(Stachybotrys subsimplex) Rhi2opus sp. (Sumyzyme) Aspergillus nlger
Endomyces sp.

Endomyces fibuligera Trichoderma viride

e)

Cephalosporium
charticola ^g
Plricularia oryzae (Reisbrand-Org.)

h)

5,0*

4,5*

5,0

5,5

5,0

5,4 6,5

optimale Temperatur °ca)	Molekular gewicht a)
65*	50.000*
60*	7Q.000^b>
70*	97.000^C)
-	64.000
60	-
60	75.000
60	69.000
55	94.000

a) Alle Werte, ausgenommen die mit einem Sternchen markierten, stammen aus der Literatur.

b) Hiromi et al.: Biochem. Biophys. Acta 302, 362 (1973).

c) J. H. Pazur et al.: J. Biol. Chem. 232» 1002 (1962),

d) Hattori et al.: Agr, Biol. Chem. 25,1 895 (1961).

e) Harada et al.: J. Ferment. Tech. 53,, 559 (1975).

f) Okada: J. Jap. Soc. Starch Sei. 21_, 283 (1974).

g) H. Urbanek et al.: Appl. Micro, 3_0, 163 (1975), h) Matsuda et al.: Amylase Symposium 9_, 105 (1974).

Aus den vorstehenden Fakten kann geschlossen werden, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Glucoamylase eine neue neutrale Glucoamylase ist, die bisher völlig unbekannt war.

909886/0728

Nachfolgend wird das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms erläutert.

Als wünschenswertes Beispiel für den Glucoamylase erzeugenden Mikroorganismus, der erfindungsgemaß zu verwenden ist, ist der Stamm G30-1140 zu nennen, den die Erfinder aus dem Boden isoliert haben. Zunächst wird die Identifizierung dieses Stammes beschrieben.

Die morphologischen Eigenschaften des erfindungsgemaß verwendeten Stammes wurden nach den von den nachfolgend aufgeführten Forschern beschriebenen Methoden bestimmt:

Gilman, J. C. A Manual of Soil Fungi. The Iowa State University press, Ames. 1971.

Clements, F. E. und Shear, C. L. The Genera of Fungi. Hafner, New York. 1964.

Barnett, H. L. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. 2. Aufl. Burgess, Minneapolis. 1968.

Bisby, G. R. Trans, Br. Mycol. Soc. 2i6, 133-4 3 (1943)

Ainsworth, G. C. Dictionary of the Fungi., 6. Aufl. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, '1971.

9. Morphologische Eigenschaften des Stammes G30-1140

Dieser Stamm wurde auf fünf verschiedenen Medien in Petrlschalen gezüchtet. Die folgenden Abschnitte geben die morphologischen Eigenschaften an, die für isolierte Kolonien beobachtet wurden.

909386/0728

a) Czapeks Agar-Medium

Nach 10-tägiger Inkubation bei 30⁰C sind die Kolonien dünn und rund mit einem Durchmesser von 4 bis 5 cm. Die vegetativen Hyphen sind durchsichtig und zeigen geringes Wachstum mit schwarzen, konidienartigen Gruppen, die pulverartig über die Kolonienoberfläche verteilt sind. Die Unterseiten der Kolonien sind braun, und ein gelbbraunes Pigment wird in das Medium ausgeschieden.

Die vegetativen Hyphen bestehen aus verzweigten Fäden, die selten Scheidewände besitzen; die Fäden tragen gleichförmig die konidienartige Struktur. Die Konidiophoren, die Scheidewände haben, ragen hiervon rechtwinklig weg. Die Länge der Konidiophoren beträgt gewöhnlich 40 bis 60 μπι, erreicht aber gelegentlich mehr als 100 μΐη. Ihr Durchmesser ist etwa 3 bis 6 μπι, und wenngleich gelegentlich ihre Grundfläche glatt ist, ist der größte Teil ihrer Oberfläche warzig, weil mit feinen, kornartigen Erhebungen bedeckt. Diese Konidiophoren sind glasartig durchsichtig und die meisten sind unverzweigt.

Auf dem Apex der Konidiophoren bilden durchsichtige Schläuche Quirle von 3 bis 8 Einheiten. Die Gestalt der Schläuche ist eiförmig oder kolbenähnlich; sie sind 8 bis 15 μηι lang und haben einen Durchmesser von 2 bis 6 μπι; ihre Oberfläche ist glatt. Die Konidien werden am Apex der Schläuche gebildet und sind von ovaler Gestalt von 3 bis 5 μΐη χ 5 bis 10 μΐη und haben eine glatte Oberfläche. Bei ihrer Bildung sind diese durchsichtig, werden aber mit zunehmender Reife schwärzlich-grün.

Die Oberfläche der Konidien ist mit einer großen Menge viskosen Materials bedeckt. Deshalb kleben die Konidien zusammen und bilden große Konidienhaufen am Apex der Konidiophoren. Das viskose Material ist bei seiner Bildung transparent, wird dann aber allmählich schwarz.

90988ß/n7?fi

1b

b) Modifiziertes Czapek-Agar-Medium

Lösliche Stärke	NaNO₃	1,0
Maiskeimflüssigkeit (Trockenfeststoff-	K₂HPO₄
basis)	KCl	0,1
MgSO₄·7H₂O	0,2
FeSO₄-7H₂O	0,1
Agar	0,05
pH bis 7,0 mit NaOH	0,05
0,001
2,0

Das Wachstum von Kolonien auf diesem Medium ist etwas langsamer als bei dem zuvor beschriebenen Czapek-Medium und erreicht etwa 3 cm bei 10-tägiger Inkubation bei 30⁰C.

Die Kolonien sind kreisförmig und dünn und ihre Oberflächen haben von ihren Mitten ausgehend ein schwarzes, viskoses Material in Form ölähnlicher Tropfen mit Durchmessern von 1 bis 3 mm. Sie entstehen aus dem Zusammenschluß von Konidienhaufen, die in dem viskosen Material eingeschlossen sind und dann öltropfenähnliche Körper bilden. Die Unterseiten der Kolonien zeigen eine dunklerbraune Farbe als bei dem vorigen Czapek-Medium, und eine geringe Menge, braunen Pigments wird in das Medium ausgeschieden.

c) Kartoffel-Dextrose-Agarmedium

Das Wachstum von Kolonien auf diesem Medium ist etwas langsamer als auf dem zuvor beschriebenen Czapek-Medium und erreicht 3 bis 4 cm bei 10-tägiger Inkubation bei 30⁰C. Diese Kolonien sind auch kreisförmig, sind aber etwas dicker als die Kolonien auf dem Czapek-Medium. Das Wachs-

909886/0728

turn der vegetativen Zellen ist gut und führt zur Entwicklung eines Strahlenmusters. Die Kolonienoberflächen sind schwarz mit einem leicht grünen Schimmer und reich an Hyphen, Konidienhaufen usw. Nach 14-tägiger Inkubation zeigen die Oberflächen der alten Kolonien strahlenförmige Ausbildungen von Synnemata, die etwa 1 bis 3 mm hochstehen. Die Unterseiten dieser Kolonien zeigen eine schwärzlich-braune Farbe, und eine große Menge braunen Pigments wird in das Medium ausgeschieden.

d) Spezial-Agarmedium

lösliche Stärke 1,0

Maiskeimflüssigkeit (Trockenfeststoff-

basis) 0,2

Baumwollsamenölrückstand 0,1

Hefeextrakt 0,1

0,1 0,05 2,0

Auf diesem Medium haben die Kolonien nach 10 Tagen Inkubation bei 30⁰C Durchmesser von 5 bis 6 cm und sind rund und dünn. Die vegetativen Hyphen zeigen gutes Wachstum und haben einen schwarzen Schimmer. Das Wachstum der Konidien ist schlechter als auf den vorgenannten Medien. Die Unterseiten der Kolonien sind gelbbraun, und ein gelbbraunes Pigment wird in das Medium abgegeben.

e) Davis Hefe-Salz-Agar-Medium

Die Kolonien auf diesem Medium nach 10 Tagen Inkubation bei 30⁰C haben Durchmesser von 2 bis 3 cm und sind eher oval als rund. Die Hyphen sind gelbbraun mit einem Anflug

K₂HPO₄	7H	2°
MgSO₄·
Agar	7	,0 mit NaOH
pH auf

- yf-

von Weiß und bilden etwas dicke Kolonien, die samtig sind. Die Unterseiten der Kolonien sind gelbbraun, aber in das Medium wird absolut kein Pigment ausgeschieden.

10. Physiologische Eigenschaften des Stamms G30-1140

a) Wachstumstemperatur

Dieser Stamm vermag über einen Temperaturbereich von 10 bis 37°C zu wachsen, seine optimale Wachstumstemperatur liegt aber bei 30⁰C.

b) Wachstums-pH

Dieser Stamm vermag über einen pH-Bereich von 3 bis 10 zu wachsen, sein optimaler Wachstums-pH liegt aber bei pH

c) Kohlenstoffquelle

Dieser Stamm vermag solche Kohlenstoffquellen wie Dextrose, Fructose, Galactose, Mannose, Saccharose, Maltose und Stärke zur Unterhaltung seines Wachstums zu verwerten.

Auf der Grundlage der obigen mikrobiologischen Feststellungen wurde der Stamm G30-1140 alsGliobotrys alboviridis identifiziert, nachdem "Genera of Fungi" und "A Manual of Soil Fungi" zu Rate gezogen worden waren. Nach dem "Dictionary of the Fungi" und G. R. Bisby (Trans.Br. Mycol. Soc. 2£, 133-43 (1943)) ist dieser Organismus jedoch der gleiche wie Stachybotrys subsimplex, und deshalb wurde der Stamm G30-1140 als Stahybotrys subsimplex identifiziert.

Der Stamm G30-1140 hat Konidiophoren, die aufrecht von den

909886/0728

vegetativen Hyphen wegstehen, Verzweigung kommt nahezu nicht vor, und sie haben Scheidewände. Gelegentlich ist der Basalteil glatt, aber der Apex ist mit Vorsprüngen bedeckt. Am Apex bilden Schläuche (Phialide) einen Quirl von 3 bis 8 Einheiten. Konidien mit glatten länglichen Oberflächen teilen sich von diesen Schläuchen ab, und sie sind in einer reichlich viskosen Substanz eingeschlossen. Diese Eigenschaften stimmen gut mit denen überein, die für Stachybotrys subsimplex von G. R. Bisby (Trans. Br. Mycol. Soc. 2j6, 133-43 (1943)) beschrieben worden sind.

Dieser Stamm G30-1140 von Stachybotrys subsimplex wird beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Chiba City, Japan, unter der Hinterlegungsnummer 4377 aufbewahrt.

Was das Züchten des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus betrifft, so sind die allgemeine Kenntnis und Techniken, wie sie beim Züchten von Schimmelpilzen angewandt werden, anwendbar.

Als Nährquellenmedium können nämlich die Medien verwendet werden, die zum Züchten gewöhnlicher Schimmelpilze verwendet werden. Beispielsweise können verschiedene Stärken, Stärkehydrolysate, Maismehl, Weizenmehl, fertige Melassen usw. als Kohlenstoffquellen verwendet werden, während der Stickstoff bedarf in Form von Pepton, Baumwollsamenölrückständen, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Kasein, Maiskeimflüssigkeit, Malzextrakt, Sojabohnenabfällen, Magermilch, anorganischen Ammoniumsalzen, anorganischen Nitraten usw. zugeführt werden kann. Als anorganische Salze können Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Phosphate, Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw. verwendet werden. Ferner können diese Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Salze entweder einzeln oder in geeigneten Kombinationen verwendet werden.

90938S/n7?ft

-yf-

^a(r 2328881

Wenn das Wachstum des Mikroorganismus gefördert und seine Enzymproduktion gesteigert werden soll, können außerdem Spurenmengen Metallsalze, Vitamine, Aminosäuren usw. verwendet werden.

Die gewöhnlich für Schimmelpilze angewandten Kulturbedingungen sind auch auf das Züchten dieses Mikroorganismus anwendbar. Wenn diese Mikrobe in Flüssigkultur 7 bis 14 Tage bei pH 5 bis 8 und 20 bis 37⁰C unter Rühren zur Belüftung gezüchtet wird, sammelt sich das erfindungsgemäße Enzym in der Kulturflüssigkeit an. Außerdem kann, wenn feste Materialien, wie Kleie verwendet werden, auch eine Festkultur erfolgen.

Nachfolgend wird ein Beispiel für ein Verfahren wiedergegeben, wonach die neue neutrale Glucoamylase, die Gegenstand der Erfindung ist, aus dem Kulturmaterial gewonnen werden kann. Im Falle einer Flüssigkultur werden die Mycelien nach irgendeiner der allgemein bekannten Methoden entfernt; dann kann das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert werden oder das Enzym kann mit den anderen Proteinen durch Zusatz anorganischer Salze, wie Ammoniumsulfat, zum Filtrat ausgesalzen werden, oder das Enzym kann durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton oder Isopropanol, ausgefällt und konzentriert werden.

Im Falle einer Festkultur wird das Enzym zuerst aus dem Kulturmaterial durch Verwendung von Wasser oder einer Pufferlösung extrahiert. Dann kann wie im Falle der Flüssigkultur das Enzym in einer konzentrierten Form erhalten werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Rohpräparate dieses neuen neutralen Enzyms können dann unter Anwendung der zuvor erwähnten Reinigungstechniken gereinigt werden.

90988B/Ü728

Die erfindungsgemäße neutrale Glucoamyläse kann zur Verzuckerung verflüssigter Stärke eingesetzt werden, wenn Dextrose aus Stärke produziert wird. Insbesondere wenn das erfindungsgemäße Enzym verwendet und die Verzuckerung bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 durchgeführt wird, tritt, wie bereits früher erwähnt, wenig Umkehrreaktion ein, und dies führt zu einer erhöhten Ausbeute an Dextrose im Vergleich mit den Fällen der Verwendung der herkömmlichen Glucoamylasen und unter Durchführung der Verzuckerung unter sauren Bedingungen.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, in denen alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind, sofern nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Ein flüssiges Kulturmedium mit 5 % löslicher Stärke, 2 % Maiskeimflüssigkeit, 0,5 % Baumwollsamenölrückständen, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Dikaliumphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,01 % Calciumchlorid wurde auf pH 7,0 eingestellt, und 100 ml hiervon wurden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht. Dieses Medium wurde bei 121⁰C 10 min sterilisiert, mit Stachybotrys subsimplex, Stamm G30-1140, beimpft und 7 Tage bei 30⁰C auf einem Schüttler inkubiert. Nach dem Abschluß der Kultur wurden die Mycele aus der Kulturflüssigkeit abfiltriert. Das Filtrat enthielt 70 Einheiten Glucoamy lase-Aktivität/ml .

Dieses Filtrat wurde dann eine Nacht bei -20⁰C gefroren und dann bei Raumtemperatur aufgetaut. Das unlösliche Material wurde abzentrifugiert. 2 Volumina kaltes Isopropanol wurden dann zu dieser Lösung gegeben und eine Nacht bei 4⁰C stehen-

gelassen, so daß das Enzym ausfiel. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert \ind der Niederschlag in einer 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung mit 1 ml ÄDTA und einem pH von 7,5 gelöst. Diese enzymhaltige Lösung wurde dann gegen den gleichen Puffer bei 4⁰C eine Nacht dialysiert. DEAE-Cellulose, die mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, wurde dann der dialysierten Enzymlösung zugesetzt und das Enzym an diesen Träger adsorbiert. Nach dem Waschen dieser DEAE-Cellulose mit dem gleichen Puffer wurde das Enzym unter Verwendung einer Lösung des gleichen Puffers mit NaCl bei einer Konzentration von 0,3 m eluiert. Dann wurden 2 Volumina kaltes Isopropanol dem Eluat zugesetzt, um das Enzym auszufällen, und die Fällung wurde durch Zentrifugieren gesammelt. Diese Fällung wurde dann in 0,05 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit 1 mMol ÄDTA gelöst, danach wurde über Nacht gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert. Die dialysierte Enzymlösung wurde dann auf eine DEAE-Cellulose-Säule aufgebracht, die mit dem gleichen 0,05 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit 1 mMol ÄDTA ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Elution des Enzyms aus dieser Säule erfolgte unter linearem Anstieg der Konzentration von NaCl in der gleichen. Pufferlösung bis auf 0,5 m. Die Fraktionen des Eluats, die das Enzym enthielten, wurden dann vereinigt, und 2 Volumina kaltes Isopropanol wurde zur Fällung des Enzyms aus dieser Lösung und zum Konzentrieren zugesetzt. Das konzentrierte Enzym wurde dann auf eine Sephadex G-150-Säule gebracht, die mit einer 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) mit 1 mMol ÄDTA ins Gleichgewicht gebracht worden war, und die Elution erfolgte unter Verwendung des gleichen Puffers. Die eluierten Fraktionen, die Enzymaktivicät zeigten, wurden dann vereinigt und 2 Volumina kaltes Isopropanol wurden zugesetzt, um das Enzym auszufällen. Dies führte zur Gewinnung des Enzyms in einer gereinigten und konzentrierten Form. Die spezifische Aktivität dieses gereinigten

909386/0728

13/888]

Enzyms wurde zu 127 Einheiten/mg Protein ermittelt. Beispiel 2

Zu einer 30%igen Lösung eines sprühgetrockneten Maltodextrins (D.Ä. etwa 10) in 0,05 m Acetatpuffer bei pH 6,5 wurde die gereinigte Glucoamylase des Beispiels 1 gegeben. Das Enzym wurde bei einer Dosierung von 0,20 Einheiten Enzym/g Substrat auf Trockenfeststoffbasis zugesetzt. Nach 72-stündiger Inkubation der Lösung bei 55⁰C lag der Dextrosegehalt des filtrierten Hydrolysats, wie durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmt, bei 96,5 % des gesamten Kohlenhydrats.

Beispiel 3

Stärke wurde unter Verwendung von bakterieller a-Amylase aus B. licheniformis nach der allgemeinen Arbeitsweise der US-PS 3 912 590 in ein 10,2 D.Ä.-Stärkehydrolysat überführt. Die Lösung wurde 5 min zum Sieden erhitzt, nachdem der pH mit 2 η HCl auf 2,0 zur Inaktivierung der restlichen a-Amylase eingestellt worden war. Die Stärkehydrolysatlösung wurde dann auf pH 6,2 eingestellt und auf die gewünschte Konzentration verdünnt, bevor mit 0,20 Einheiten der gereinigten Glucoamylase des Beispiels 1 pro g Substrat (Trockenfeststoffbasis) behandelt wurde. Die Lösung wurde in einem mit einem Stopfen verschlossenen Rohr bei 55⁰C inkubiert. Der pH wurde nach 5 h und 48 h auf 6,2 eingestellt. Nach 72-stündiger Inkubation der Lösung war der Dextrosegehalt des filtrierten Hydrolysats, bestimmt durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, 97,6 % des gesamten Kohlenhydrats. Die Endkonzentration der Lösung war 31,2 % auf Trockenfeststoffbasis.

Wurden be? gleicher Substratkonzentration mit kommerzieller Glucoamylase aus A. niger unter optimalen Bedingungen (pH 4,3 bei 60⁰C) Verzuckerungstests durchgeführt, betrug die entsprechende Dextroseausbeute 96,5 %. Ebenso lieferte die Glucoamylase aus R. niveus bei pH 5,0 und 55⁰C eine Dextroseausbeute von 97 %. Dextroseausbeuten lagen etwa 1 % tiefer, wenn die Verzuckerungstests mit den kommerziellen Glucoamylasen unter den für das neue Enzym angewandten Bedingungen durchgeführt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die neue Glucoamylase gemäß der Erfindung höhere Ausbeuten an Dextrose liefert als die kommerziellen Glucoamylasen, selbst wenn jedes Enzym unter optimalen Reaktionsbedingungen verwendet wird.

9098 8 6/0728

2.

Leer seife

Claims

3205 2 9 2 8 d 8 Patentansprüche

1. Glucoamylase-Enzympräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es eine optimale Glucoamylase-Aktivität im Bereich von etwa pH 6/0 bis 6,5 bei 60⁰C hat und daß es maximale Glucoamylase-Aktivität bei etwa 65⁰C, gemessen durch eine 10 min-Reaktion an einer 2%igen Maltodextrinlösung, bei pH 6,0 aufweist.

2. Glucoamylase-Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Stamm des Schimmelpilzes Stachybotrys subsimplex erhalten wurde.

3. Glucoamylase-Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Stamm Stachybotrys subsimplex, Fermentation Research Institute, Hinterlegungsnummer 4377, erhalten wurde.

4. Glucoamylase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine optimale Glucoamylase-Aktivität im Bereich von etwa pH 6,0 bis 6,5 aufweist.

09886/0728

2¹3 2 8 8 8 Ί

5. Glucoamylase nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine maximale Glucoamylase-Aktivität bei etwa 65°C, gemessen durch eine 10 min-Reaktion an einer 2%igen Maltodextrinlösung bei pH 6,0 aufweist.

6. Glucoamylase nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine 30 gewichtsprozentige Lösung eines 10 D.Ä.-Stärkehydrolysats in ein Produkt mit wenigstens etwa 96 % Dextrose auf Trockenfeststoffbasis bei Reaktion mit dem Stärkehydrolysat bei einem pH von 6,0 bis 6,5 bei 55⁰C zu überführen vermag.

7. Verfahren zur Herstellung eines Glucoamylase-Enzympräparats nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen eines Stammes von Stachybotrys subsimplex in einem Nährmedium gezüchtet werden und das Glucoamylase-Enzympräparat aus dem Kulturmedium isoliert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Stachybotrys subsimplex mit der F.R.I.-Hinterlegungsnummer 4377 verwendet wird.

9. Verwendung des Glucoamylase-Enzympräparats bzw. der Glucoamylase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem Verfahren zur Herstellung eines Sirups mit hohem Dextrosegehalt durch Verzuckern einer verflüssigten Stärke zu Dextrose, wobei die verflüssigte Stärke bei pH 6,0 bis 6,5 in Gegenwart der aus der Gattung Stachybotrys erhaltenen Glucoamylase mit verbesserter Dextrose-Ausbeute verzuckert wird.

10. Verwendung nach Anspruch 9 unter Einsatz einer aus dem Stamm Stachybotrys subsimplex, F.R.IrHinterlegungsnummer 4377, erhaltenen Glucoamylase.

909886/0728

11. Verwendung nach Anspruch 10 unter Verzuckern bei einer Temperatur von etwa 50 bis etwa 65⁰C.