NL7905604A - Neutraal glucoamylase en werkwijze voor de bereiding daarvan. - Google Patents

Description

N/29.165-Fa/vdM * ^ .

1 > CPC International Inc. te Englewood Cliffs, New Jersey,

Verenigde Staten van Amerika.

Neutraal glucoamylase en werkwijze voor de bereiding daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op een neutraal glucoamylase alsmede op een werkwijze voor de bereiding daarvan.

Momenteel zijn bij de produktie van dextrose op 5 industriële schaal uit zetmeel de belangrijkste gebruikte glucoamylasen voor het versuikeringsproces de glucoamylasen, die geproduceerd worden door micro-organismen die behoren tot Rhizopus en Aspergillus. De omstandigheden, waaronder deze glucoamylasen worden gebruikt zijn een pH van 5,0 en 10 55°C voor het enzym van het Rhizopus micro-organisme en een pH van 4,5 en 60°C voor het enzym van het Aspergillus micro-organisme. Bovendien is het maximumdextrosegehalte van het hydrolysaat ongeveer 96 % (op basis van droge stof) wanneer de glucoamylasen reageren met door enzym vervloeid zetmeel 15 bij een concentratie van 30 %. Een reden waarom de dextrose-opbrengst geen 100 % bereikt is, dat isomaltose accumuleert tengevolge van een omgekeerde reactie door deze glucoamylasen. Er is echter een kort geleden gepubliceerd rapport (Amerikaanse octrooischrift 3.897.305) dat de omgekeerde 20 reactie van glucoamylasen uiterst gering is in de nabijheid van het neutrale punt en dat de dextrose-opbrengst zo kan worden verhoogd tot ca. 98 % door de reactie uit te voeren bij ongeveer een neutrale pH door gelijktijdig gebruik van pullulanase. Het pullulanase werkt door opheffing van de 25 vertakking van het zetmeel en verhoogt de snelheid van de glucoamylase-inwerking onder deze bijna neutrale omstandigheden. Voor zover neutrale glucoamylasen betreft, is er tot nog toe slechts ëën gerapporteerd, n.l. het glucoamylase, geproduceerd door de rijstpest-veroorzakende schimmel 30 (Piricularia oryzae; Kazuo Matsuda en medew.: Amylase Sympo- 7905604 * 2 * sium, vol. 9, 1974) , doch deze glucoamylase bezit een lage thermostabiliteit en kan derhalve niet worden gebruikt onder industriële omstandigheden.

Het is derhalve een primair doel van de uitvin-5 ding een glucoamylase te verschaffen, dat werkzaam is bij een bijna neutrale pH.

Het is een ander doel van de uitvinding een glucoamylase te verschaffen, dat voldoende thermostabiliteit bezit, zodat het kan worden gebruikt onder industriële reac-10 tie-omstandigheden.

Het is nog een ander doel van de uitvinding een glucoamylase te verschaffen, dat reageert met een zetmeel-hydrolysaat, onder vorming van hoge oprbrengsten aan dextrose.

15 Een microbenstam is ontdekt, die een nieuwe glucoamylase produceert met een optimale activiteit bij een pH van 6,0-6,5 en een goede thermostabiliteit. Het nieuwe glucoamylase is in staat om een 30 gew.% oplossing van een 10 D.E. (dextrose-equivalent) vervloeid zetmeel om te zetten 20 in een produkt, dat tenminste ca. 96 % dextrose bevat wanneer het in reactie wordt gebracht met het zetmeelhydroly-saat bij een pH van 6,0-6,5 bij 55°C. De uitvinding omvat de werkwijze voor de produktie van dit glucoamylase, waarbij het micro-organisme van het genus Stachybotrys, dat het 25 glucoamylase produceert, wordt gekweekt in een medium en het .enzym wordt gewonnen uit de cultuurbouillon.

Figuur 1 toont de verhouding tussen de pH en de enzymactiviteit in de gevallen van het enzym van de onderhavige uitvinding en van de conventionele glucoamylasen, ge-30 produceerd door de R. niveus en A. niger micro-organismen.

Figuur 2 toont de verhouding tussen de temperatuur en de enzymactiviteit in het geval van het onderhavige . enzym en van het glucoamylase van P. oryzae.

Figuur 3 geeft de inactiveringskrommen weer voor 35 het enzym volgens de uitvinding, wanneer het wordt behandeld 790 5 6 0 4 3 Λ bij verschillende pH-niveaus.

Figuur 4 verschaft een vergelijking van het onderhavige enzym en de gebruikelijke glucoamylasen, geproduceerd door R. niveus, A. niger en P. oryzae micro-organismen 5 in termen van hun relatieve thermostabiliteiten.

De eigenschappen van de nieuwe neutrale glucoamylasen volgens de onderhavige uitvinding worden in detail weergegeven en hun eigenschappen worden gecontrasteerd met die van de hiervoor bekende glucoamylasen.

10 De term "D.E." is een afkorting van dextrose- equivalent en deze termen worden uitwisselbaar gebruikt om het reducerende suikergehalte aan te duiden van een materiaal, berekend als glucose en uitgedrukt als percentage totaal vaste stof.

15 De term "zetmeeIhydrolysaat" wordt gebruikt op algemene wijze om een stroop of een droog produkt aan te duiden, dat gemaakt is door partiële hydrolyse van zetmeel.

Een dergelijk produkt kan een zure of enzymatische hydrolyse hebben ondergaan.

20 De term "vervloeid zetmeel" wordt gebruikt om een zetmeelhydrolysaat met een lage D.E. aan te duiden (D.E. van ca. 2 tot ca. 20).

1. Activiteit en substraatspecificiteit.

Het onderhavige enzym is in staat om koolhy- 25 draatverbindingen, zoals zetmeel, oplosbaar zetmeel, amylo- se, amylopectine en glycogeen, te hydrolyseren en er dextrose uit te vormen. De opbrengst aan dextrose uit elk van deze substraten is 100 % wanneer de substraatconcentratie 1 % is.

De mutarotatie van de geproduceerde glucose is positief. Dit 30 enzym is derhalve een glucoamylase. De reactiesnelheid van dit enzym werd vergeleken met de snelheden, vertoond door de glucoamylasen geproduceerd door micro-organismen behorende tot Rhizopes en Aspergillus, met betrekking tot verschillende substraten. De resultaten worden voorgesteld in tabel A.

35 Zoals blijkt uit deze tabel is de activiteit van het onder- 7905604 '·» * 4 Η havige enzym opmerkelijk sterker dan de activiteiten van de andere twee glucoamylasen, vooral met betrekking tot de hydrolyse van pullulan.

TABEL A

5 SUBSTRAATSPECIFICITEIT

a j _reactiesnelheid_

Aspergillus Rhizopus niger niveus onderhavig gluco gluco- 10 _substraat enzym amylase*3^ amylase^ dextrine (D.E. 10) 100 100 100 amylpectine 104 113 91 oplosbaar zetmeel 122 95 112 pullulan 922 15 glycogeen 102 100 91 maltotriose 6 12 8 maltohexaose 91 100 146 panose 44 47 48 maltose 14 26 19 20 a) De enzymatische activiteiten van elke gluco- amylase werden bepaald, terwijl de substraten aanwezig waren in een concentratie van 1 %; elke enzymactiviteit met betrekking tot dextrine kreeg de waarde 100 en de activi-25 teiten op de andere substraten worden aange geven als relatieve waarden.

b) Verkrijgbaar bij Enzyme Development Corporation, 2 Penn Plaza, New York, N.Y.

c) Sumyzyme verkrijgbaar bij Sumitomo Shoji 30 Kaisha, Ltd., 1, Kanda Mitoshiro-Cho, Chiyo- da-ku, Tokyo, Japan.

2. Optimale pH en stabiel pH-traject.

Het verband tussen enzymatische activiteit (relatieve waarde) van het onderhavige enzym en de reactie-35 pH werden onderzocht en dan vergeleken met de overeenkomsti- 7905604 « 5 ge verhouding voor de gebruikelijke bekende glucoamylasen, geproduceerd door de Rhizopus en Aspergillus micro-organis-men. De resultaten worden voorgesteld in figuur 1.

Zoals blijkt uit deze figuur is de optimale pH 5 voor dit enzym bij 60°C 6,0-6,5faanzienlijk hoger dan de pH-optima van de andere enzymen. Bovendien vertoont dit enzym zijn beste stabiliteit in de buurt van pH 6,0, maar er werd geen inactivering van dit glucoamylase waargenomen, zelfs wanneer men het liet staan gedurende 24 uur bij kamertempe-10 ratuur over een pH-traject van 4-11.

3. Bepaling van de kracht.

Een 0,5 ml aliquot deel van een geschikt verdunde enzymoplossing werd toegevoegd aan 0,5 ml van een 2 % oplossing van gesproeidroogde maltodextrine (D.E. ca. 10) 15 in 0,1 M acetaatbufferoplossing (pH 6,0) en dit werd geïn-cubeerd bij 60°C gedurende precies 10 min. De enzymreactie werd gestopt door het mengsel 5 min. te verhitten in een kokend waterbad. De hoeveelheid geproduceerd glucose werd bepaald met de glucose-oxidasemethode. De hoeveelheid enzym, 20 die 1 micromol. glucose produceert per min. werd gedefinieerd als 1 eenheid.

4. Optimaal reactietemperatuurstraj eet.

Het effect van temperatuur op de relatieve enzymatische activiteit van het onderhavige enzym bij pH 6,0 25 werd vergeleken met de relatieve activiteit voor het bekende glucoamylase uit de rijstpestschimmel, Piricularia oryzae.

Deze vergelijking wordt aangegeven in figuur 2. Het is daaruit duidelijk, dat de optimale temperatuur voor de reactie van het onderhavige enzym onder deze omstandigheden 65°C is, 30 ongeveer 10°C hoger dan die van het enzym van Piricularia oryzae.

5. Inactivering tengevolge van pH- en tempera- tuursomstandigheden.

Figuur 3 stelt de inactiveringskromme voor 35 van de relatieve enzymatische activiteit van het onderhavige 7905 6 04 6

'V

enzym wanneer het 60 min. werd behandeld bij 60°C over een pH-traject van 3-8. Zoals blijkt uit de figuur is dit enzym het meest stabiel bij pH 6 en wordt het volledig geïnactiveerd door deze behandeling gedurende 30 min. bij een pH 3 5 en gedurende 1 uur bij een pH 4. Bovendien toont figuur 4 een vergelijking van de thermostabiliteit van het onderhavi- t ge enzym en van de glucoamylasen van de Rhisopus, Aspergillus en Piricularia micro-organsimen. Met name geeft figuur 4 de inactiveringskrommen, verkregen voor deze enzymen, wan-10 neer ze werden behandeld bij 60°C terwijl ze werden gehouden op hun resp. optimale pH's voor de stabiliteit. Er blijkt dat de thermostabiliteit van het onderhavige enzym minder is dan die van het glucoamylase van Aspergillusoorsprong doch beter is dan de thermostabiliteit, vertoond door de gluco-15 amylasen van de Rhizopus en de Piricularia micro-organismen.

6. Inhibitie, activering en stabilisatie.

Dit enzym heeft geen enkel speciaal activeer-of stabiliseermiddel nodig. Het enzym wordt echter evenals in het geval van de meeste andere glucoamylasen, geïnhibeerd 20 door mercurichloride, kaliummanganaat, ferrochloride en an dere metaalzouten en tris.

7. Zuiveringswerkwijze.

Het onderhavige enzym kan worden gezuiverd door middel van een combinatie van een van de gewone zuive-25 ringsmethoden, zoals fractionering met ammoniumsulfaat, fractionering met organisch oplosmiddel, adsorptie aan zetmeel en verschillende chromatografieën. Een illustratief voorbeeld van een dergelijke zuiveringswerkwijze wordt vervolgens gegeven.

30 De cellen en ander onoplosbaar materiaal worden verwijderd uit het gekweekte materiaal en dan wordt de cul-tuurvloeistof gedurende de nacht ingevroren bij -20°C. Dit wordt bij kamertemperatuur gesmolten en het onoplosbare materiaal wordt door centrifugeren verwijderd. Vervolgens 35 worden 2 volumina koude isopropanol toegevoegd en men laat 7905604 *- 7 het mengsel staan gedurende de nacht bij 4°C. Het enzym slaat dan neer en de bovenstaande vloeistof wordt door decanteren verwijderd. Het verkregen neerslag wordt opgelost in een 0,05 M tris-HCl-bufferoplossing (pH 7,5) , die 1 mM 5 EDTA bevat en het opgeloste materiaal wordt vervolgens ge- dialyseerd gedurende een nacht bij 4°C tegen dezelfde buffer. DEAE-cellulose, dat geëquilibreerd is met dezelfde bufferop-lossing, wordt vervolgens toegevoegd aan de gedialyseerde enzymoplossing, zodat het enzym eraan wordt geadsorbeerd.

10 Na het wassen van deze DEAE-cellulose met dezelfde buffer, wordt het enzym geëlueerd uit de hars met een preparaat van dezelfde buffer, dat 0,3 M NaCl bevat. Het enzym wordt dan neergeslagen door toevoeging van 2 volumina koude isopropa-nol aan het eluaat en dit neergeslagen materiaal wordt door 15 centrifugeren gewonnen. Het neerslag wordt opgelost in de 0,05 M tris-HCl-bufferoplossing (pH 7,5), die 1 mM EDTA bevat, gevolgd door een dialyse gedurende de nacht tegen dezelfde buffer. De gedialyseerde enzymoplossing wordt vervolgens gebracht op een DEAE-cellulosekolom, die geëquili-20 breerd is met dezelfde 0,05 M tris-HCl-buffer (pH 7,5), die 1 mM EDTA bevat. Het enzym wordt dan geëlueerd uit deze kolom door het te voeren door een lineaire concentratiegra-dient van dezelfde buffer, die NaCl bevat tot aan 0,5 M. De geëlueerde fracties, die het enzym bevatten, worden samenge-25 voegd en het enzym wordt geconcentreerd door middel van de isopropanolneerslagtechniek. Dit geconcentreerde enzym wordt dan aangebracht op een kolom Sephadex G-150, die geëquilibreerd is met een 0,05 M tris-HCl-buffer (pH 7,0), die 1 mM EDTA bevat en de elutie wordt uitgevoerd met dezelfde buf-30 feroplossing. Wanneer deze werkwijze werd gevolgd, vertoonde het gezuiverde enzym, dat werd verkregen, één enkele band bij schijfelektroforese.

8. Molaculair gewicht.

Het moleculaire gewicht van het onderhavige 35 enzym werd onderzocht met een Sephadex G-150 kolom, overeen- 790 56 04 8 Λ komstig de werkwijze van Dunker, A.K. en Rueckert, R.R., J. Biol. Chem. 244, 5074 (1969). De resultaten geven aan, dat het moleculaire gewicht van het enzym ongeveer 50000 is.

Vervolgens worden de verschilpunten tussen het 5 onderhavige enzym en de gebruikelijke bekende glucoamylasen aangegeven en een verklaring zal worden gegeven van de redenen waarom dit enzym moet worden beschouwd als een nieuw enzym met een optimale pH in de buurt van de neutraliteit.

Met betrekking tot de optimale pH van de enzy-10 men blijkt uit de gegevens, voorgesteld in figuur 1 en tabel B, dat de enige glucoamylasen, die hun optimale pH's hebben in de buurt van de neutrale zone, het onderhavige enzym zijn en het glucoamylase, geproduceerd door het ri^tpestmciro-organisne Piricularia oryzae. Het is echter duidelijk uit 15 figuur 2 en tabel B, dat het onderhavige enzym en het rijst-pestglucoamylase optimumreactietemperaturen hebben, die uiterst verschillend zijn. Bovendien duiden de krommen, voorgesteld in figuur 4, erop dat de thermostabiliteit van het onderhavige enzym zeer veel beter is dan die van het 20 rijstpestglucoamylase. Bovendien toont tabel B aan, dat het moleculaire gewicht van het onderhavige enzym veel kleiner is dan het moleculaire gewicht van de andere bekende glucoamylasen.

TABEL· B

25 VERGELIJKING VAN OPTIMUM-pH, OPTIMUMTEMPERATUUR EN MOLECULAIR GEWICHT VAN VERSCHEIDENE GLUCOAMYLASEN.

optimum optimum temp. moleculair glucoamylase pHa^ °C a^ gewicht a 30 onderhavig enzym (Stachybotrys subsimplex) 6,0-6,5* 65* 50.000*

Rhizopus sp. (Sumyzyme) 5,0* 60* 70.000*^

Aspergillus niger 4,5* 70* 97.000c^

Endomyces spd^ 5,0 - 64.000 0 ) 35 Endomyces fibuligera 5,5 60 7905604 9 TABEL B (vervolg) VERGELIJKING VAN OPTIMUM-pH, OPTIMUMTEMPERATUUR EN MOLECULAIR GEWICHT VAN VERSCHEIDENE GLUCOAMYLASEN.

optimum 5 optimum temp. moleculair a) o a) a) glucoamylase pH C ' gewicht

Trichoderma viride^ 5,0 60 75.000

Cephalosporium charticola^ 5,4 60 69.000

Piricularia oryzae*1^ 6,5 55 94.000 10 (rijstpest-org.) a) Alle waarden, behalve de met een ster aangegeven waarden, zijn genomen uit literatuurplaatsen.

b) Hiromi en medew.: Biochem. Biophys. Acta 302, 362 (1973).

c) J.H. Pazur en medew.: J. Biol. Chem. 237, 1002 (1962).

15 d) Hattori en medew.: Agr. Biol. Chem. 2£>, 895 (1961).

e) Harada en medew.: J. Ferment. Tech. J53, 559 (1975).

f) Okada: J. Jap. Soc. Starch Sci, 21, 283 (1974).

g) H. Urbanek en medew.: Appl. Micro. 3£, 163 (1975).

h) Matsuda en medew.: Amylase Symposium i), 105 (1974).

20 Op basis van de boven genoemde feiten kan wor den geconcludeerd dat het met de werkwijze van de onderhavige uitvinding geproduceerde glucoamylase een nieuw neutraal glucoamylase is, dat tot nu toe volledig onbekend was.

Een verklaring zal nu worden gegeven van de 25 werkwijze voor de vervaardiging van het onderhavige enzym.

Een gewenst voorbeeld van het glucoamylase-producerende micro-organisme, dat gebruikt moet worden in de onderhavige uitvinding, is stam G30-1140, die geïsoleerd werd uit de grond door de onderhavige uitvinders. De identi-30 ficatie van deze stam zal eerst worden gegeven.

De morfologische eigenschappen van de onderhavige stam werden bepaald overeenkomstig de methoden, beschreven door de onderstaande onderzoekers:

Gilman, J.C. A MANUAL OF SOIL FUNGI. The Iowa 78056 04 Λ if 10

State University press, Ames. 1971.

Clements, F.E. en Shear, C.L. THE GENERA OF FUNGI. Hafner, New York, 1964.

Barnett, H.L. ILLUSTRATED GENERA OF IMPERFECT 5 FUNGI. 2de ed., Burgess, Minneapolis. 1968.

Bisby, G.R. Trans. Br. Mycol. Soc. 2_6, 133-143 (1943).

Ainsworth, G.C. DICTIONARY OF THE FUNGI. 6de ed. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey. 1971.

10 9. Morfologische eigenschappen van stam G30-1140

De onderhavige stam werd gekweekt op 5 soorten media in petrischalen. De volgende afdelingen geven de morfologische kenmerken weer, die werden waargenomen voor geïsoleerde koloniën.

15 a) Czapek Agarmedium.

Bij incubatie bij 30°C gedurende 10 dagen zijn de koloniën dun en rond met een diameter van 4-5 cm.

De vegetatieve hyfal zijn glasachtig en tonen slechte groei met zwarte conidische trossen, verspreid als poeder over het 20 oppervlak van de koloniën. De onderkanten van de koloniën zijn bruin van kleur en een taankleurig pigment wordt in het medium afgescheiden.

De vegetatieve hyfal bestaan uit vertakte vezels, die slechts bij uitzondering tussenschotten bezitten; 25 de conidische structuur wordt uniform ondersteund door de vezels. De conidioforen, die tussenschotten hebben, steken daarvan uit onder rechte hoeken. De lengte van de conidioforen is gewoonlijk van 40-60 jx, doch soms bereiken ze meer dan 100 ^i. De diameter van deze is ca. 3-6 jx en hoewel er 30 gevallen zijn waarin het basale oppervlak ervan glad is, is het meeste van hun oppervlak wratachtig, bedekt met fijne korrelvormige uitsteeksels. Deze conidioforen zijn glasachtig en de meeste zijn niet vertakt.

Op de tophoek van de conidioforen vormen glas-35 achtige fialides kransen van 3-8 eenheden. De vorm van de 7905604 * 11 fialides is ovoxde of flesachtig, ze hebben een lengte van 8-15 yx en een diameter van 2-6 ƒ1? hun oppervlak is glad. De conidia worden gevormd aan de tophoek van de fialides en zijn ovale vormen van 3-5 yx bij 5-10 ƒ1? en ze hebben een 5 glad oppervlak. Ze zijn glasachtig op het moment van vorming doch worden zwartachtig groen wanneer ze rijpen.

Het oppervlak van de conidia is bedekt met een grote hoeveelheid viskeus materiaal. Om deze reden kleven de conidia te samen en vormen grote conidische trossen aan de 10 tophoek van de conidioforen. Het viskeuze materiaal is trans-.parant op het moment van vorming, doch wordt geleidelijk daarna zwart.

b) Gemodificeerd Czapek agarmedium.

% 15 oplosbaar zetmeel 1,0 maisweekwater (op basis droge stof) 0,1 NaN03 0,2 k2hpo4 0,1 KCl 0,05 20 MgS04.7H20 0,001 agar 2,0

pH tot 7,0 met NaOH

De groei van koloniën op dit medium is een beetje langzamer dan op het hiervoor beschreven Czapekme-25 dium, komende tot ca. 3 cm wanneer het geïncubeerd wordt gedurende 10 dagen bij 30°C.

De koloniën zijn circelvormig en dun en hun oppervlakken hebben uitstralend van hun centra een zwart viskeus materiaal, dat de vorm heeft van olie-achtige druppels 30 met een diameter, die 1-3 mm bereikt. Deze ontstaan van het samenkomen van trossen conidia, die ingesloten zijn in het viskeuze materiaal en dan oliedruppelachtige lichamen vormen.

De onderzijden van de koloniën tonen een donkerder bruine kleur dan gezien wordt bij de voorgaande Czapekvoedings-35 bodem en een kleine hoeveelheid bruin pigment wordt in het 790 5 6 04 ’ 12 ψ medium afgescheiden.

c) Aardappel-glucose-agarmedium.

De groei van koloniën op dit medium is een weinig langzamer dan op het hiervoor beschreven Czapekmedium 5 en bereikt 3-4 cm wanneer het wordt geïncubeerd gedurende 10 dagen bij 30°C. Deze koloniën zijn ook circelvormig, doch ze hebben een enigszins grotere dikte dan de koloniën op het Czapekmedium. De groei van de vegetatieve cellen is goed, zich ontwikkelend in een'uitstralend patroon. De op-10 perylakken...van de koloniën zijn zwart met een enigszins groene glans en ze zijn rijk aan hyphae, conidische trossen enz. Na 14 dagen incubatie hebben de oppervlakken van de oude koloniën uitstralende formaties van synnemata, die ongeveer 1-3 mm rechtop staan. De onderzijden van deze kolo-15 niën tonen een zwartachtig bruine kleur en een grote hoeveelheid bruin pigment is afgescheiden in het medium.

d) Speciaal agarmedium.

% oplosbaar zetmeel 1,0 20 maisweekwater (op basis droge stof) 0,2 katoenzaadoliedroesem 0,1 gistextract 0,1 k2hpo4 0,1

MgS04.7H20 0,05 25 agar 0,05

pH tot 7,0 met NaOH

Na 10 dagen incuberen bij 30°C hebben de koloniën van dit medium diameters van 5-6 cm en zijn rond en dun. De vegetatieve hyphae vertonen een goede groei en hebben een 30 zwarte glans. De groei van conidia is slechter dan op de boven genoemde media. De onderzijden van de koloniën zijn taankleurig en een taankleurig pigment wordt in het medium afgescheiden.

e) Davis gistzoutagarmedium.

35 De koloniën op dit medium hebben na 10 dagen 7905604 *· ' 13 xncviberen bij 30°C diameters van 2-3 cm en zijn meer ovaal dan rond van vorm. De hyphae zijn taankleurig met een vleugje wit en vormen enigszins dikke koloniën, die fluweelachtig zijn. De onderzijden van de koloniën zijn taankleurig, doch 5 absoluut geen pigment wordt afgescheiden in het medium.

10. Fysiologische eigenschappen van stam G3Q- 1140.

a) groeitemperatuur

Deze stam is in staat tot groei over een 10 temperatuurstraject van 10-37°C, doch zijn optimale groei temperatuur ligt in de buurt van 30°C.

b) Groei-pH

Deze stam is in staat tot groei over een pH-traject van 3-10, doch zijn optimale groei-pH ligt in de 15 buurt van pH 7.

c) koolstofbron

Deze stam is in staat om als koolstofbron glucose, fructose, galactose, mannose, saccharose, maltose en zetmeel te gebruiken, teneinde zijn groei te onderhouden.

20 Op de basis van de boven genoemde microbiologi sche vondsten, werd stam G30-1140 geïdentificeerd als Gliobotrys alboviridis na consultering van de Genera of Fungi en van A Manual of Soil Fungi. Echter is dit organisme volgens de Dictionary of the Fungi en G.R. Bisby (Trans. Br.

25 Mycol. Soc. 26^, 133-143 (1943)) hetzelfde als Stachybotrys subsimplex en om deze reden werd stam G30-1140 geïdentificeerd als Stachybotrys subsimplex.

De stam G30-1140 heeft conidioforen, die rechtop staan van zijn vegetatieve hyphae, vertakking komt bijna 30 niet voor en ze hebben tussenschotten. Er zijn gevallen, waarin het basale deel glad is, doch de top is bedekt met uitsteeksels. Aan de top vormt een niveau van fialides een krans van 3-8 eenheden. Conidia met gladde langwerpige oppervlakken verdelen deze fialides en ze zijn omsloten in een 35 rijkelijk viskeuze stof. Deze eigenschappen komen goed over- 7905604 , 14 een met die welke zijn beschreven voor Stachybotrys sub-simplex door G.R. Bisby (Trans. Br. Mycol. Soc. 2(5, 133-143 (1943)) .

Deze Stachybotrys subsimplex stam G30-1140 5 wordt opgeslagen in het Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science & Technology, Chiba City, Japan als depot nr. 4377.

Met betrekking tot het kweken van het te gebruiken micro-organisme in de onderhavige uitvinding, zijn 10 de algemene kennis en technieken van toepassing, die gebruikt worden bij het kweken van schimmels.

Met name is het als voedingsbodem mogelijk te gebruiken de media, die worden gebruikt voor het kweken van gewone schimmels. Bijv. kunnen verschillende soorten zetmeel, 15 zetmeelhydrolysaten, maismeel, tarwebloem, eindmelassen, enz. worden gebruikt als koolstofbronnen, terwijl de stikstofbehoef te kan worden voldaan in de vorm van pepton, katoenzaad-oliedroesem, vleesextractA gistextract, caseïne, maisweek-water, möutextract, sojabonendroesem, afgeroomde melk, anor-20 ganische ammoniumzouten, anorganische nitraten, enz. Als anorganische zouten is het mogelijk calciumchloride, magne-siumsulfaat, fosfaten, natriumchloride, kaliumchloride enz. te gebruiken. Verder kunnen deze koolstofbronnen, stikstof-bronnen en anorganische zouten hetzij alleen, hetzij in ge-25 schikte combinaties worden gebruikt. Bovendien is het mogelijk sporehoeveelheden metallische zouten te gebruiken, alsmede vitaminen, aminozuren, enz., wanneer het gewenst is om de groei van het micro-organisme te bevorderen en een stijging te bewerkstelligen van zijn enzymproduktie.

30 De kweekomstandigheden, die gewoonlijk worden gebruikt voor schimmels, zijn ook toepasbaar op het kweken van dit micro-organisme. Met name wordt in een vloeibare cultuur, wanneer dit micro-organisme wordt gekweekt gedurende 7-14 dagen bij een pH 5-8 en bij 20-37°C te samen met 35 roeren, waarbij beluchting wordt verschaft, het enzym van de 790 5 6 04 ► 15 onderhavige uitvinding geaccumuleerd in de cultuurvloeistof. Wanneer bovendien vaste materialen, zoals zemelen, worden gebruikt, is het mogelijk een vaste cultuur uit te voeren.

Vervolgens zal een voorbeeld worden gegeven van 5 een werkwijze, waarbij het nieuwe neutrale glucoamylase, dat het doel is van de onderhavige uitvinding, kan worden gewonnen uit het gekweekte materiaal. In het geval van een vloeibare cultuur worden de mycelia geëlimineerd door een van de algemeen bekende methoden; en dan wordt het filtraat gecon-10 centreerd onder verminderde druk, of kan het enzym worden uitgezouten met de andere eiwitten dogr toevoeging van anorganische zouten, zoals ammoniumsulfaat aan het filtraat, of kan het enzym worden neergeslagen en geconcentreerd door toevoeging van een organisch oplosmiddel, zoals aceton of 15 isopropano1.

In het geval van een vaste cultuur wordt het enzym eerst geëxtraheerd uit het gekweekte materiaal door gebruik van water of een bufferoplossing. Dan wordt evenals in het geval van een vloeibare cultuur het mogelijk om het 20 enzym te verkrijgen in een geconcentreerde vorm.

De ruwe preparaten van dit nieuwe neutrale enzym, die op deze wijze zijn verkregen, kunnen dan worden gezuiverd door de hiervoor genoemde zuiveringstechnieken uit te voeren.

25 Het is mogelijk dit nieuwe neutrale glucoamyla se van de onderhavige uitvinding te gebruiken voor de ver-suikering van vervloeid zetmeel wanneer glucose uit zetmeel wordt bereid. Vooral wanneer het onderhavige enzym wordt gebruikt en de versuikering wordt uitgevoerd bij een pH van 30 6,0-6,5 is er, zoals reeds eerder vermeld, weinig optreden van een terugreactie en dit resulteert in een toegenomen opbrengst aan glucose, die verkrijgbaar is in vergelijking met de gevallen waarbij de gebruikelijke glucoamylasen worden toegepast en de versuikering wordt uitgevoerd onder zure om-35 s tandigheden.

790 5 6 04 * 16

De uitvinding wordt verder geïllustreerd onder verwijzing naar de volgende voorbeelden, waarin alle delen en percentages per gewicht zijn, tenzij anders aangegeven.

VOORBEELD I

5 Een vloeibaar kweekmedium, dat 5 % oplosbaar zetmeel, 2 % maisweèkwater,. 0,5 % katoenzaadoliedroesem, 0,5 % gistextract, 0,1 % dikaliumfosfaat, 0,05 % magnesium-sulfaat en 0,01 % calciumchloride bevat, werd ingestelcL op een pH 7,0 en 100 ml van deze oplossing werd gebracht in een 10 Erlenmeyerkolf van 500 ml. Dit medium werd gesteriliseerd bij 121°C gedurende 10 min., geïnoculeerd met Stachybotrys subsimplex stam G30-1140 en geïncubeerd bij 30°C gedurende 7 dagen op een schudmachine. Nadat de kweek was voltooid, werden de mycelia verwijderd uit de cultuurvloeistof door 15 filtratie. Gevonden werd dat het filtraat 70 eenheden gluco-amylase-activiteit per ml bevatte.

Dit filtraat werd vervolgens gedurende een nacht bevroren gehouden bij -20°C en dan ontdooid tot kamertemperatuur. Het onoplosbare materiaal werd door centrifuge-20 ren verwijderd. Aan deze oplossing werden 2 volumina koude isopropanol toegevoegd en men liet het mengsel staan bij 4°C gedurende een nacht, waardoor het enzym neersloeg. De bovenstaande vloeistof werd verwijderd door decantatie en het neerslag werd opgelost in een 0,05 M tris-HCl-bufferoplossing 25 die 1 mM EDTA bevatte en een pH had van 7,5. Deze enzym-bevattende oplossing werd dan gedialyseerd tegen dezelfde buffer bij 4°C gedurende 1 nacht. Aan de gedialyseerde en-zymoplossing werd DEAE-cellulose toegevoegd, die geëquili-breerd was met dezelfde bufferoplossing en het enzym werd 30 geadsorbeerd aan deze drager. Na wassen van deze DEAE-cellu-lose met dezelfde buffer, werd het enzym geëlueerd met een oplossing van dezelfde buffer, die NaCl bevatte bij een concentratie van 0,3 M. Vervolgens werden aan het eluaat 2 volumina koude isopropanol toegevoegd, waardoor het enzym 35 weer neersloeg en het neerslag werd verzameld door centrifu- 7905604 17 geren. Dit neerslag werd dan opgelost in de 0,05 M tris-HCl-buffer (pH 7,5), die 1 mM EDTA bevatte, gevolgd door dialyse gedurende de nacht tegen dezelfde buffer. De gedia-lyseerde enzymoplossing werd vervolgens gebracht in een 5 kolom DEAE-cellulose, die geëquilibreerd was met dezelfde 0,05 M tris-HCl-buffer (pH 7,5), die 1 mM EDTA bevatte. Elutie van het enzym uit deze kolom werd uitgevoerd door de concentratie aan NaCl lineair te doen stijgen in dezelfde bufferoplossing tot aan 0,5 M. De fracties van het eluaat, 10 die het enzym bevatten, werden dan samengevoegd en er werden 2 volumina koude isopropanol aan toegevoegd, teneinde het enzym uit de oplossing neer te slaan en te concentreren. Het geconcentreerde enzym werd vervolgens aangebracht op een kolom Sephadex G-150, die geëquilibreerd was met een 0,05 M 15 tris-HCl-bufferoplossing (pH 7,0), die 1 mM EDTA bevatte en de elutie werd uitgevoerd met dezelfde buffer. De geëlueerde fracties, die enzymactiviteit vertoonden, werden samengevoegd en 2 volumina koude isopropanol werden toegevoegd, teneinde het enzym neer te slaan. Dit resulteerde in het 20 winnen van het enzym in een gezuiverde en geconcentreerde vorm. De specifieke activiteit van dit gezuiverde enzym bleek 127 eenheden per mg eiwit te zijn.

VOORBEELD II

Aan een 30 % oplossing van een gesproeidroogde 25 maltodextrine (D.E. ongeveer 10) in 0,05 M acetaatbuffer bij een pH van 6,5 werd het gezuiverde glucoamylase van voorbeeld I toegevoegd. Het enzym werd toegevoegd in een dosering van 0,20 eenheden enzym per gram substraat op droge-vaste-stofbasis. Nadat de oplossing geïncubeerd was bij 30 55°C gedurende 72 uur, was het glucosegehalte van het gefil treerde hydrolysaat, bepaald met krachtige vloeistofchroma-tografie, 96,5 % van het totale koolhydraat.

VOORBEELD III

Zetmeel werd omgezet in een 10,2 D.E. zetmeel-35 hydrolysaat met een bacteriële alfa-amylase uit B. Licheni- 7905(04 18 * formis volgens de algemene werkwijze, als aangegeven in het Amerikaanse octrooischrift 3.912.590. De oplossing werd 5 min. lang gekookt na instelling van de pH op 2,0 met 2N HC1 ter inactivering van de restanten alfa-amylase. De zetmeel-5 hydrolysaatoplossing werd dan ingesteld op pH 6,2 en verdund tot de gewenste concentratie vöór de behandeling met 0,20 eenheden van het gezuiverde glucoamylase van voorbeeld I per gram substraat (op basis van droge vaste stof). De oplossing werd geïncubeerd bij 55°C in een afgedichte buis. De pH werd 10 ingesteld op 6,2 na 5 uur en 48 uur. Nadat de oplossing gedurende 72 uur geïncubeerd was, was het glucosegehalte van het gefiltreerde hydrolysaat, bepaald met krachtige vloeistof chromatograf ie, 97,6 % van het totale koolhydraat. De uiteindelijke concentratie van de oplossing was 31,2 % op 15 een basis van droge vaste stof.

Wanneer versuikeringsproeven bij dezelfde sub-straatconcentratie werden uitgevoerd met handelsglucoamylase uit A. niger onder zijn optimale voorwaarden (pH 4,3 bij 60°C), was de overeenkomstige glucose-opbrengst 96,5 %. Op 20 overeenkomstige wijze gaf het glucoamylase van R. niveus bij pH 5,0 en 55°C een glucose-opbrengst van 97 %. De glucose-' opbrengsten waren ongeveer 1 % lager wanneer de versuikeringsproeven werden uitgevoerd met de commerciële glucoamy-lasen onder de omstandigheden, die gebruikt worden voor het 25 nieuwe enzym. De resultaten tonen aan, dat het nieuwe glucoamylase volgens de uitvinding hogere opbrengsten aan glucose geeft dan de commerciële glucoamylasen, zelfs wanneer elk enzym wordt gebruikt onder zijn optimale reactie-omstandig-heden.

30 790 5 8 04

Claims (11)

1. Een glucoamylase-enzympreparaat, met het kenmerk, dat het een optimumglucoamylase-activiteit heeft in het pH-traject van 6,0-6,5 bij 60°C en 5 dat het een maximumglucoamylase-activiteit heeft bij ongeveer 65°C, gemeten volgens een 10-minuten reactie op een 2 % maltodextrine-oplossing bij pH 6,0.

2. Enzympreparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het wordt verkregen uit een 10 stam van de schimmel Stachybotrys subsimplex.

3. Enzympreparaat volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het is verkregen uit de stam Stachybotrys subsimplex, Fermentation Research Institute, depot nr. 4377.

4. Werkwijze voor de produktie van een gluco amylase-enzympreparaat, met het kenmerk, dat cellen worden gekweekt van een stam van Stachybotrys subsimplex in een voedingsbodem en het glucoamylase-enzympreparaat wordt geïsoleerd uit de voedingsbodem.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t h e t kenmerk , dat de stam van Stachybotrys subsimplex Fermentation Research Institute depot nr. 4377 is.

6. Glucoamylase, bereid volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het een optimale gluco- 25 amylase-activiteit heeft in het traject van pH 6,0-6,5.

7. Glucoamylase, bereid volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het een maximumglucoamylase-activiteit heeft bij ongeveer 65°C, gemeten met een 10-minuten reactie op een 2 % maltodextrine-oplossing bij 30 pH 6,0.

8. Glucoamylase, bereid volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het in staat is om een 30 gew.% oplossing van een 10 D.E. zetmeelhydrolysaat om te zetten tot een produkt, dat tenminste 96 % dextrose op basis 35 van droge vaste stof bevat, wanneer het in reactie wordt ge- 790 5 6 04 bracht met het zetmeelhydrolysaat bij een pH van 6,0-6,5 bij 55°C.

9. Werkwijze voor de produktie van een stroop met een hoog glucosegehalte door versuikering van een ver-5 vloeid zetmeel tot glucose, met het kenmerk, dat het vervloeide zetmeel wordt versuikerd bij een pH tussen 6,0 en 6,5 in aanwezigheid van een glucoamylase, verkregen uit het genus Stachybotrys, waardoor een verbeterde glucose-opbrengst wordt verkregen.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het glucoamylase is verkregen uit de stam van Stachybotrys subsimplex, Fermentation Research Institute depot nr. 4377.

11, Werkwijze volgens conclusie 10, met 15 het kenmerk, dat de versuikering wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 50-65°C. 4 790 5 6 04