DE2935315A1 - Hoch waermebestaendige glucoamylase und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Hoch waermebestaendige glucoamylase und verfahren zu ihrer herstellung

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DE2935315A1
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talaromyces
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Description

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER R. F. MEYER-ROXLAU
DIPL-ING. C1934-1974) DIPL.-CHEM. DIPL.-ING.
8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE
TELEFON: (089) 472947 TELEX: S24624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT
16. August 1979 3212
CPC INTERNATIONAL INC.
International Plaza, Englewood Cliffs, N.J. 07632, USA
Hoch wärmebeständige Glucoamylase und Verfahren zu ihrer Herstellung
Derzeit finden Ansatzverfahren Anwendung bei der Produktion von Dextrose durch Verzuckern von Stärkehydrolysaten mit einer Glucoamylase. Viele der im Handel erhältlichen, derzeit erzeugten Glucoamylase-Enzyme stammen von Mikroorganismen der Gattungen Rhizopus und Aspergillus. Werden diese Enzyme zur Produktion von Dextrose eingesetzt, so werden sie im allgemeinen bei 55 - 600C 2 bis 4 Tage zur Reaktion gebracht. Wenn Glucoamylase unbeweglich gemacht und die Verzuckerung kontinuierlich durch eine Säule durchgeführt werden kann, wird die Reaktionszeit herabgesetzt, und ein grosser Reaktorbehälter ist nicht nötig, wodurch Arbeit und Energie eingespart wird. Von Rhizopus und Aspergillus produzierte Glucoamylase-Enzyme können durch Ionenaustauschprozesse, physikalische Adsorption, kovalente Bindung, Geleinfang usw. unbeweglich gemacht werden. Alle nach irgend-
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einem dieser Verfahren unbeweglich gemachten Glucoamylase-Enzyme werden jedoch bei Verwendung über 500C inaktiviert.
In einem Artikel in Biotech. Bioeng. JU5, 483 (1973) berichteten D. R. Marsh, Y. Y. Lee und G. T. Tsao, daß unbeweglich gemachte Glucoamylase-Enzyme ziemlich lange stabil waren, wenn sie unter 500C verwendet wurden, dieses Verfahren ist aber aufgrund der Gefahr mikrobieller Verunreinigung kommerziell nicht durchführbar.
Daher ist die Entwicklung einer bei Temperaturen über 500C stabilen, unbeweglich gemachten Glucoamylase für die kontinuierliche Verzuckerung bei kommerziellen Vorgängen notwendig.
Dazu muß eine Glucoamylase mit merklich höherer Wärmebeständigkeit als bei herkömmlichen entwickelt werden.
Nun wurde ein Mikrobenstamm gefunden, der zur Gattung Talaromyces gehört und eine Glucoamylase produziert, die eine optimale Reaktionstemperatur von 750C hat und sich dadurch auszeichnet, daß sie wenigstens etwa 90 % der anfänglichen Glucoamylaseaktivität beizubehalten vermag, wenn sie 10 min bei 700C und einem pH-Wert von 4,5 gehalten wird. Gegenstand der Erfindung ist ferner das Verfahren zur Herstellung dieser Glucoamylase, wobei ein Mikroorganismus der Gattung Talaromyces, der die Glucoamylase produziert, in einem Medium gezüchtet und das Enzym aus der Kulturbrühe gewonnen wird.
Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Enzymaktivität in den Fällen des erfindungsgemäßen Enzyms und der herkömmlichen Glucoamylasen, produziert von R. niveus und A. niger;
Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Temperatur und der Enzymaktivität in den Fällen des erfindungsgemäßen Enzyms
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und der Glucoamylasen aus A. luchuensis und H. lanuginosa;
Fig. 3 bietet einen Vergleich des erfindungsgemäßen Enzyms und der von H. lanuginosa, A. niger und R. niveus produzierten Glucoamylasen, ausgedrückt in relativen Wärmebeständigkeiten.
Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen neuen wärmebeständigen Glucoamylase sind im einzelnen aufgeführt und stehen im Gegensatz zu denen der bisher bekannten Glucoamylasen.
Der Ausdruck "D.Ä." ist eine Abkürzung für Dextrose-Äquivalent, und diese Begriffe werden im Austausch zur Bezeichnung des Gehalts eines Materials an reduzierendem Zucker verwendet, berechnet als Dextrose und ausgedrückt als Prozent der gesamten Feststoffe.
Der Ausdruck "Stärkehydrolysat" wird allgemein gebraucht, um einen Sirup oder ein Trockenprodukt zu bezeichnen, das durch partielle Hydrolyse von Stärke hergestellt ist. Ein solches Produkt kann durch saure oder enzymatische Hydrolyse hergestellt sein.
Der Ausdruck "verflüssigte Stärke" wird für ein Stärkehydrolysat mit niedrigem D.Ä. (von etwa 2 bis etwa 20) verwendet.
1. Aktivität und Substratspezifität
Das Enzym hydrolysiert Stärke, lösliche Stärke, Amylose/ Amylopectin, Glycogen usw. zu Dextrose. Bei einer Substrat-Konzentration von 1 % ist die Ausbeute an Dextrose 100 %, und die optische Drehung der gebildeten Dextrose ist positiv; folglich ist dieses Enzym eine Glucoamylase.
2. Optimaler pH-Wert und stabiler pH-Bereich
Fig. 1 zeigt die Beziehung zwischen der relativen Enzym-
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aktivität und dem pH-Wert im Vergleich mit denen von durch Rhizopus und Aspergillus produzierten Glucoamylasen. Wie in der Figur gezeigt, ist der optimale pH-Wert dieses Enzyms bei 6O0C 4,0, und die von durch Rhizopus und Aspergillus produzierten Glucoamylasen sind 5,0 bzw. 4,0. Das erfindungsgemäße Enzym ist bei pH-Werten zwischen 3 und 5 äußerst stabil, es wurde aber keinerlei Inaktivierung festgestellt, wenn es 24 h bei Raumtemperatur und einem pH-Wert zwischen 2 und 9 gehalten wurde.
3. Bestimmung der Enzymaktivität
Eine 0,5 ml-Teilmenge einer verdünnten Enzymlösung wird zu 0,5 ml einer 2%igen Maltodextrinlösung (D.Ä. etwa 10) in 0,1 m Acetatpuffer (pH 4,5) gegeben und für genau 10 min bei 6O0C umgesetzt. Nach 10 min wird die Enzymreaktion durch Erwärmen in einem siedenden Wasserbad für 5 min beendet. Die gebildete Dextrose wird unter Anwendung der Glucoseoxidase-Methode bestimmt. Die Enzymmenge, die 1 μΜοΙ Dextrose/min zu produzieren vermag, wird als eine Enzymeinheit definiert.
4. Reaktionstemperaturbereich
Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der relativen Enzymaktivität und der Reaktionstemperatur im Vergleich mit der der von Aspergillus luchuensis U2 (veröffentlichter Hinweis der JA-PS Sho 53-7513) produzierten Glucoamylase und auch der der von Humicola lanuginosa (Carbohydrate Research 6_1_, 301 , 1978) produzierten Glucoamylase, die die bislang bekannten wärmebeständigsten Glucoamylasen sind. Wie in der Figur gezeigt, beträgt die optimale Reaktionstemperatur des erfindungsgemäßen Enzyms 750C, also 100C mehr als von Aspergillus luchuensis und Humicola lanuginosa.
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5. Inaktivierung durch pH- und Temperaturbedingungen
Dieses Enzym wird durch einstündiges Erwärmen auf 700C bei pH-Werten unter 2 oder über 8 inaktiviert. Fig. 3 zeigt die Inaktivierungskurve des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich mit denen der von Humicola lanuginosa, Aspergillus niger und Rhizopus niveus produzierten Glucoamylasen. Die Figur zeigt nämlich die Aktivierungskurven dieser vier Glucoamylasen bei Behandlung bei 700C und ihren für die Stabilität optimalen pH-Werten.
Wie die Figur zeigt, besitzt das erfindungsgemäße Enzym eine merklich höhere Wärmebeständigkeit als die bekannten Glucoamylasen mit 92,5 % Restaktivität nach 10-minütigem Erwärmen auf 700C und 48 % Restaktivität selbst nach einstündigem Erwärmen. Diese Tatsache zeigt an, daß die erfindungsgemäße Glucoamylase wesentlich wärmebeständiger ist als die bekannten Glucoamylasen.
6. Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung
Das erfindungsgemäße Enzym erfordert keinerlei Aktivierungsoder Stabilisierungsmittel. Es wird durch Metallsalze, wie Quecksilberdichlorid, inhibiert.
7. Reinigungsverfahren
Das erfindungsgemäße Enzym kann durch Aussalzen mit einem anorganischen Salz, Fraktionieren mit einem organischen Lösungsmittel, Behandeln mit aktivem Ton, nach verschiedenen chromatographischen Methoden usw. und deren Kombinationen gereinigt werden. Eine Ausführungsform des Reinigungsverfahrens ist im Beispiel beschrieben.
Wenn das gereinigte Enzym durch Plattenelektrophorese nach der Methode von Davis, Ann. New York Acad. Sei. 121, 321,
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(1964) analysiert wurde, wanderte es bei pH 8,8 zur Kathode und zeigte eine einzelne Bande.
8. Molekulargewicht
Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms wurde unter Verwendung einer Sephadex G-150-Säule nach der Arbeitsweise von A. K. Dunker und R. R. Ruechert, J. Biol. Chem. 244, 5074 (1969) untersucht. Die Ergebnisse zeigten an, daß dieses Enzym ein Molekulargewicht von etwa 31000 hat.
Nun werden die Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäßen Enzym und den bisher bekannten Glucoamylasen wiedergegeben, und es folgt eine Erklärung der Gründe dafür, daß dieses Enzym als neues Enzym mit hoher Wärmebeständigkeit anzusehen ist.
Tabelle I zeigt den optimalen Reaktions-pH-Wert, die optimale Reaktionstemperatur und das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich mit den Werten verschiedener bekannter Glucoamylasen. Die optimale Reaktionstemperatur des erfindungsgemäßen Enzyms ist 750C, die damit 5 bis 150C über der der bekannten Glucoamylasen liegt. Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms ist wesentlich kleiner als das der bekannten Glucoamylasen.
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Tabelle I
Vergleich verschiedener Glucoamylasen bezüglich optimalem
pH, optimaler Temperatur und Molekulargewicht Glucoamylase optimaler optimale Molekular-
pH a) Temperatur
0C a)		 gewicht
a)
erfindungsgemäßes
Enzym (Talaromyces) 4,0* 75* 31.000*
Humicola lanuginosa b) 6,5 65 —
Aspergillus luchuensis c) 4,0 65 —
Aspergillus niger 4,5* 70* 97.000 d)
Rhizopus sp. 5,0* 60* 70.000 e)
Endomyces sp. f) 5,0 60 64.000
Trichoderma viride g) 5,0 60 75.000
Cephalosporium cherticola h)5,4 60 69.000
a) Alle Werte, ausgenommen die mit einem * markierten, wurden der Literatur entnommen.
b) P. M. Taylor et al.: Carbohydrate Research 6_[, 301 (1978).
c) T. Kanno et al.: öffentlicher Hinweis der JA-PS Sho 53 (1978) - 7513.
d) J. H. Pazur, et al.: J. Biol. Chem. 237, 1002 (1962).
e) Hiromi et al.: Biochem. Biophys. Acta 302, 362 (1973). -
f) Hattori et al.: Agr. Biol. Chem. 2J5, 895 (1961).
g) Okada: J. Jap. Soc. Starch Sei. 2J_, 283 (1974). h) H. Urbanek: Appl. Microbiol. _3J), 163 (1975).
Fig. 3 zeigt die Inaktivierungskurve des erfindungsgemäßen Enzyms im Vergleich mit denen der Glucoamylasen aus Humicola lanuginosa, Aspergillus niger und Rhizopus niveus. Diese wurden bei dem für jedes Enzym stabilsten pH auf 700C erwärmt. Wie die Figur zeigt, ist die Inaktivierung des erfindungsgemäßen Enzyms erheblich langsamer als die der anderen Glucoamylasen.
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— Jo —
Auf der Grundlage der obigen Tatsachen kann geschlossen werden, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren produzierte Glucoamylase eine neue thermophile Glucoamylase ist, die bislang völlig unbekannt war.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms erklärt.
Als ein wünschenswertes Beispiel des erfindungsgemäß einzusetzenden, Glucoamylase produzierenden Mikroorganismus sei der Stamm G45-632 genannt, der von den Erfindern aus dem Boden isoliert wurde. Die mikrobiellen Merkmale und Eigenschaften dieses Stammes werden nachfolgend beschrieben.
Die morphologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes wurden nach den Methoden bestimmt, wie sie von den nachfolgend aufgeführten Forschern beschrieben wurden:
Cooney, D. G., und Emerson, R. Thermophilic Fungi. W. H. Freeman and Company, San Francisco & London, 1964.
Raper, K. B., und Thorn. C. A Manual of Penicillia. Hafner Publishing Company, New York und London (1968)
Awao, T., und Mitsugi, K., Trans. Mycol. Soc. Japan _1£# 145-160 (1973).
Minoura, K., Yokoe, M., Kizima, T., Nehira, T. Trans. Mycol. Soc. Japan JU, 352-361 (1973).
9. Morphologische Eigenschaften des Stammes G45-632
Der erfindungsgemäße Stamm wurde auf zwei Arten von Medien in Petrischalen gezüchtet. Die folgenden Abschnitte geben die morphologischen Eigenschaften wieder, die für isolierte Kolonien beobachtet wurden.
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a) Kartoffeldextrose-Agar-Medium
Nach 3-tägiger Inkubation bei 400C sind die Kolonien kreisförmig mit einem Durchmesser von 6 bis 7 cm. Die vegetativen Hyphen sind farblos. Sie wachsen dünn im Randbereich der Kolonien, werden aber flockig in der Mitte mit einer Dicke von 1 bis 2 mm und haben zahlreiche Konidien. Sie sind gräulich-weiß mit schwach grünen Cleistothecien von weniger als 0,3 mm Durchmesser, statistisch im zentralen und peripheren Teil der Kolonie liegend.
Der Boden der Kolonien ist gelblich-braun, aber der Teil, der die Cleistothecien bildet, ist rötlich-braun und sondert ein gelblich-braunes Pigment ab. Die vegetativen Hyphen sind 2 bis 4,5 μΐη groß und haben Scheidewände. Sie bestehen aus verzweigten Fasern, von denen Konidiophoren mit Scheidewänden vorspringen. Die Konidiophoren haben eine glatte Oberfläche und sind 30 bis 2000 μΐη χ 2 bis 3 μΐη groß; die längeren sind häufig statistisch verzweigt.
Die Bildung der Konidien ist sehr unregelmäßig, sie spriessen zuweilen direkt aus der Spitze der Koniäiophoren und zuweilen aus dem oberen Ende von 1 bis 4 Phialiden. Manchmal sind die Phialide doppelt. Sie sind 10 bis 15 um χ 2 bis 3,5 um groß und haben geschwollene Böden.
Die Konidien laufen in einer Reihe, manchmal mit mehr als 10 Einheiten. Sie sind oval oder lang-oval mit glatter Oberfläche und von 5 χ 3 um oder weniger Größe und zeigen eine bräunliche Farbe unter transparentem Licht.
Die Sporenschläuche sind rund oder elliptisch-rund und haben weniger als 300 um Durchmesser. Die Asci haben keine Askus-Wandung und sind 10 χ 8 um groß. Die Askussporen sind gelblich und von 3 bis 4 um Größe, von oben gesehen rund, zeigen aber von der Seite betrachtet eine äquatoriale Furche.
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b) Hefeextrakt-Stärke-Agar-Medium
Difco-Hefeextrakt 0,4
lösliche Stärke 1,5
K3HPO4 0,1
MgSO4.7H2O 0,05
Agar 2
Nach 3-tägiger Inkubation bei 4O0C sind die Kolonien rund mit einem Durchmesser von 6 bis 7 cm. Sie sind flockig und 1 bis 2 mm dick. Junge Kolonien sind weiß, werden aber allmählich gräulich-weiß mit schwacher grüner Farbe. Parallel dazu bilden sich zahlreiche Konidien, und die Oberfläche wird staubig. Der Boden der Kolonien ist rötlich-braun im Anfangsstadium des Wachstums, wird aber allmählich dunkelbraun und sondert ein dunkelbräunliches Pigment in das Medium ab. Auf diesem Kulturmedium bilden sich keine Sporenschlauchfrüchte.
10. Physiologische Eigenschaften des Stammes G45-632
a) Wachstumstemperatur
Dieser Stamm vermag über einen Temperaturbereich von 25 bis 500C zu wachsen, wächst aber nicht bei 550C, und die optimale Wachstumstemperatur liegt nahe 4O0C.
b) Wachstums-pH
Dieser Stamm vermag über einen pH-Bereich von 3 bis 9 zu wachsen, sein optimaler Wachstums-pH liegt aber zwischen 6 und 7.
c) Kohlenstoffquelle
Dieser Stamm vermag Kohlenstoffquellen wie Dextrose, Fructose,
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Galactose, Mannose, Saccharose, Maltose und Stärke zu assimilieren.
Aufgrund der obigen mikrobiologischen Befunde und der Beschreibung in "Thermophilic Fungi" (D. G. Cooney und R. Emerson) und "Trans. Mycol. Soc. Japan, J_4." (τ· Awao und K. Mitsugi) wurde der Stamm 45-632 als Talaromyces duponti identifiziert.
Der Talaromyces duponti-Stamm G45-632 wird beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Chiba City, Japan, unter der Hinterlegungsnummer 4566 aufbewahrt .
Der Stamm Talaromyces duponti G45-632 stellt eine der Ausführungsformen des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus dar, und jeder zur Gattung Talaromyces gehörige Mikroorganismus, der die vorerwähnte neue wärmebeständige Glucoamylase zu produzieren vermag, kann ebenso wie der Stamm G45-632 und seine mutierten Stämme eingesetzt werden.
Was das Züchten des erfindungsgemäß zu verwendenden Mikroorganismus betrifft, so sind die allgemeine Kenntnis und Techniken, wie sie beim Züchten von Schimmelpilzen Anwendung finden, anwendbar.
So können nämlich als Nährquellenmedium die Medien verwendet werden, die zum Züchten gewöhnlicher Schimmelpilze verwendet werden. Beispielsweise können verschiedene Stärken, Stärkehydrolysate, Maismehl, Weizenmehl, Molasse usw. als Kohlenstoffquelle verwendet werden, während Pepton, entfettetes Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Casein, Maisexnweichflüssigkeit, Malzextrakt, Sojabohnenmehl, Magermilch, anorganische Ammoniumsalze, anorganische Nitrate usw. als Stickstoffquelle eingesetzt werden können. Als anorganische Salze können Calciumchlorid, Magnesiumsulfat,
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Phosphate, Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw. verwendet werden. Ferner können diese Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Salze entweder einzeln oder in geeigneten Kombinationen verwendet werden. Wenn außerdem das Wachstum des Mikroorganismus gefördert und eine Steigerung seiner Enzymproduktion bewirkt werden soll, können Spurenmengen Metallsalze, Vitamine, Aminosäuren usw. verwendet werden.
Die bei Schimmelpilzen gewöhnlich angewandten Kulturbedingungen sind auch auf das Züchten dieses Mikroorganismus anwendbar. Wird nämlich dieser Mikroorganismus in flüssiger Kultur 3 bis 10 Tage bei einem pH von 5 bis 8 und 30 bis 450C gezüchtet, sammelt sich das erfindungsgemäße Enzym in der Kulturbrühe an. Festkultur ist auch möglich, wozu feste Materialien, wie Kleie, verwendet werden.
Im Falle einer Flüssigkultur werden die Mycelien nach irgendeiner der gut bekannten Methoden entfernt, wie durch Filtrieren, dann kann das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert oder das Enzym mit den anderen Proteinen durch Zugabe anorganischer Salze, wie Ammoniumsulfat, ausgesalzen oder durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton oder Isopropanol, ausgefällt werden.
Im Falle einer Festkultur wird das Enzym zuerst aus dem Kulturmaterial durch Wasser oder eine Pufferlösung extrahiert. Dann kann, wie im Falle der Flüssigkultur, das Enzym in einer konzentrierten Form erhalten werden.
Die Rohpräparate dieser so erhaltenen neuen, wärmebeständigen Glucoamylase können nach der im Beispiel beschriebenen Methode gereinigt werden.
Die erfindungsgemäße neue, wärmebeständige Glucoamylase kann
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zur Verzuckerung beim Produktionsverfahren von Dextrose aus Stärke verwendet werden.
Insbesondere wenn diese Glucoamylase unbeweglich gemacht und kontinuierliche Verzuckerung unter Verwendung der unbeweglich gemachten Glucoamylase durchgeführt wird, ist dies so vorteilhaft, daß eine verlängerte Dauer kontinuierlicher Verzuckerung bei 60 bis 650C mit hoher Ausbeute möglich ist.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel weiter veranschaulicht, in dem alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind, sofern nicht anders angegeben.
Beispiel
Ein flüssiges Kulturmedium, bestehend aus 5 % löslicher Stärke, 2 % Maiseinweichflüssigkeit, 0,5 % Baumwollsamenmehl, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Dikaliumphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,01 % Calciumchlorid, wurde auf pH 7,0 eingestellt, und 100 ml hiervon wurden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht. Dieses Medium wurde 20 min bei 1210C sterilisiert, mit Talaromyces duponti, Stamm G45-632, beimpft und 7 Tage auf einem Schüttler bei 400C inkubiert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Mycelien aus der Kulturflüssigkeit abfiltriert. Das Filtrat enthielt 60 Einheiten Glucoamylase-Aktivität/ml.
Der pH-Wert dieses Filtrats wurde mit 2 η HCl auf 6,0 eingestellt, dann wurde aktiver Ton zu 0,01 g/ml Filtrat zugesetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde der aktive Ton abfiltriert. 2 Volumina kaltes Isopropanol wurden dann dem Filtrat zugesetzt, um das Enzym auszufällen. Die Fällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und in einer kleinen Menge Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst. Diese enzymhaltige Lösung
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wurde dann gegen den gleichen Puffer eine Nacht bei 40C dialysiert. DEAE-Cellulose, die mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, wurde dann der dialysierten Enzymlösung zugesetzt,und das Enzym wurde an diesen Träger adsorbiert. Das Enzym wurde unter Verwendung einer Lösung des gleichen Puffers mit linear ansteigendem NaCl-Gehalt von 0 bis 0,5 m daraus eluiert. Dann wurden 2 Volumina kaltes Isopropanol dem Eluat zur Ausfällung des Enzyms zugesetzt, und diese Fällung wurde in einem 0,05 m Tris-HCl-Puffer (pH 5,5) gelöst.
Diese Enzymlösung wurde an eine CM-Cellulosesäule adsorbiert, und das Enzym wurde unter Verwendung einer Lösung des gleichen Puffers mit linear ansteigendem NaCl-Gehalt von 0 bis 0,5 m daraus eluiert. Die eluierten Fraktionen, die das Enzym enthielten, wurden gesammelt und das Enzym mit 2 Volumina Isopropanol ausgefällt.
Die Fällung wurde dann in 0,05 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst, und diese Enzymlösung wurde an einer Sephadex G-150-Säule, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, adsorbiert und das Enzym unter Verwendung des gleichen Puffers eluiert. Die enzymatische Aktivität zeigenden Fraktionen wurden gesammelt, und das Enzym wurde durch Zusatz von 2 Volumina Isopropanol ausgefällt. Die Fällung wurde dann in einer kleinen Menge 0,05 m Acetatpuffer (pH 4,5) gelöst. Die so hergestellte gereinigte Enzymlösung hatte eine Glucoamylase-Aktivität von 110 Einheiten/mg Protein.
Dann wurde die obige Enzymlösung in Tris-HCl-Puffer, die durch Lösen des Niederschlags mit Isopropanol nach der Aktivtonbehandlung hergestellt worden war, durch Binden an AE-Cellulose unter Verwendung von Glutaraldehyd nach der Methode von Glassmeyer et al., Biochemistry 10, 786 (1971) unbeweg-
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lieh gemacht. So wurde ein unbeweglich gemachtes Enzym mit 2000 Einheiten Enzymaktivität/g Träger erhalten. 3 g dieses unbeweglich gemachten Enzyms wurden in eine Säule gepackt, die bei 600C gehalten wurde, und ein Verzuckerungstest erfolgte unter kontinuierlichem Durchlauf einer 25 %igen Lösung eines Stärkehydrolysats (D.Ä. etwa 10), die mit 2 η HCl auf pH 5,0 eingestellt worden war, durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Bettvolumina/h. Der Dextrosegehalt dieser verzuckerten Lösung wurde als Ergebnis der Bestimmung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zu 96,5 % bestimmt. Nach 1-monatiger kontinuierlicher Verzuckerung wurde keinerlei Abfall der Dextroseausbeute festgestellt.
Zum Vergleich wurde eine A. niger-Glucoamylase, die die höchste Wärmebeständigkeit der bisher bekannten Glucoamylasen aufweist, ebenfalls nach den gleichen Arbeitsweisen wie oben unbeweglich gemacht, und eine 25%ige Lösung eines Stärkehydrolysats (pH 4,5) wurde unter den gleichen Bedingungen verzuckert. Der anfängliche Dextrosegehalt war 95,5 %, fiel aber rasch ab und wurde nach 2-wöchiger Verzuckerung 85 %.
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ee

Claims (10)

3212 Patentansprüche
1. Glucoamylase-Enzympräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens etwa 90 % der anfänglichen Glucoamylase-Aktivität beibehält, wenn es 10 min bei 700C bei pH 4,5 gehalten wird, und daß es eine maximale Glucoamylase-Aktivität bei etwa 75°C, gemessen in einer 10 min-Reaktion an einer 2%igen Maltodextrin-Lösung bei pH 4,5, aufweist.
2. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Stamm des Pilzes Talaromyces duponti erhalten wurde.
3. Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Talaromyces duponti-Stamm mit der Hinterlegungsnummer 4566 des Fermentation Research Institute erhalten wurde.
4. Verfahren zur Herstellung eines Glucoamylase-Enzympräparats gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen eines Stammes von Talaromyces duponti in einem Nährmedium gezüchtet werden und das Glucoamylase-Enzympräparat aus dem Kulturmedium isoliert wird.
030011/0882
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Talaromyces duponti-Stamm mit der Hinterlegungsnummer 4566 des Fermentation Research Institute verwendet wird.
6. Glucoamylase, hergestellt gemäß Anspruch 4, mit einer maximalen Glucoamylase-Aktivität bei etwa 750C, gemessen durch eine 10 min-Reaktion an einer 2%igen Malte— dextrin-Lösung bei pH 4,5.
7. Glucoamylase, hergestellt gemäß Anspruch 4, die wenigstens etwa 90 % ihrer anfänglichen Glucoamylase-Aktivität behält, wenn sie 10 min bei 700C und pH 4,5 gehalten wird.
8. Verfahren zur Herstellung eines Sirups mit hohem Dextrosegehalt durch Verzuckern einer verflüssigten Stärke zu Dextrose, dadurch gekennzeichnet, daß eine verflüssigte Stärke bei einer Temperatur über etwa 6O0C in Gegenwart einer aus der Gattung Talaromyces erhaltenen Glucoamylase verzuckert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoamylase aus dem Stamm Talaromyces duponti mit. der Hinterlegungsnummer 4566 des Fermentation Research Institute erhalten wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Verzuckerung bei einem pH von etwa 4,5 bis etwa 5,0 erfolgt.
03001 1/0882
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