JP2011510682A - 発酵性糖及びアルコールの生成のためのｐＨ調製不要システム - Google Patents
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Abstract
本発明は、糖液化工程の前又は後にｐＨ調整をしないで、デンプン含有物質（例えば、穀物）から発酵性糖（例えば、グルコース）及びアルコール（例えば、エタノール）等の分解生成物を生産するための方法に関する。
【選択図】図３
【選択図】図３
Description
本発明の出願は２００８年２月６日に提出された米国特許出願Ｎｏ．６１／０２６，５１０に対して優先権を主張する。該文献を参照により本明細書に援用する。
本発明は、糖液化工程の前又は後にｐＨ調整をしないで、デンプン含有物質（例えば、穀物）から発酵性糖（例えば、グルコース）及びアルコール（例えば、エタノール）等の分解生成物を生産するための方法に関する。
一般的にデンプンから発酵性糖及び／又はアルコールを生成する方法は、数多くの工程を含む。一般的なプロセスにおいて、粒状デンプンを含む穀物及びシリアルを粉砕する。粉砕は通常２つの方法が用いられており、本発明の分野において、湿式粉砕及び乾式粉砕として知られている。粉砕されたデンプン含有物質はその後水性溶液と混合され、２５％乃至４５％の範囲の乾燥固形物を含むスラリーを生成する。通常、乾燥粉砕工程において、粉砕されたデンプン含有物質と混合された水性溶液は水だけでなく各種量の低濃度処理残渣（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）を含む。例えば、粉砕された全粒コーンをデンプン含有物質として使用して水と混合すると、スラリーのｐＨは約５．８乃至６．２になる。しかしながら、このスラリーのｐＨは低濃度処理残渣の添加により約４．８乃至５．２に低められる。この低濃度処理残渣は工業的に使用されており、発酵性糖及び／又はアルコール生成において水の使用を節約する。このデンプンはその後、通常デンプンのゲル化も含まれる液化工程により短鎖低粘性デキストリンに転換され、これと一緒に又は続いてアルファアミラーゼが添加される。
この液化アミラーゼは近年大部分の液化工程で用いられており、ｐＨ４．８乃至ｐＨ５．２では安定ではない。それゆえ、スラリーのｐＨを好適なアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム又はアンモニア）を用いてｐＨを約５．０乃至６．０に調製する。
この液化されたデンプンはその後、グルコアミラーゼを通常用いて酵素的な糖化工程により低分子量の糖に転換される。この低分子量の糖は更に（例えば、精製デキストロースに）精製され、（例えば、フルクトースに）異性化され、又は酵母のような発酵性微生物により代（例えば、エタノールに）代謝される。糖化及び発酵工程はしばしば同時に行われる。ｐＨ５．６乃至６．０で酵母発酵が開始すると、微生物汚染の可能性が高くなり、それゆえ、工業的なアルコール生産は通常、例えば、液化工程の後に希釈酸（例えば、硫酸）を用いてｐＨを５．０未満に調製する。
液化工程の前及び後にｐＨ調整をして液化及び酵母発酵に工程な条件を提供することは、発酵培地への塩の蓄積が高くなり、また廃棄が環境的に問題となる硫酸の含量も高くなる。
数多くの改良がデンプン含有物質から発酵性糖及びアルコールを生成するための液化、糖化、及び発酵工程に対してなされてきたが、これらの工程においてより効果的な手段が依然として必要とされている。
本発明の発明はｐＨ調製を必要としない、発酵性糖及び／又はアルコールの製造のための方法に関する。より具体的には、この方法は液化工程の間にｐＨを高めるためにアルカリを添加すること、及び／又はｂ）発酵工程のためにｐＨを下げるために酸を添加することを必要としない方法である。図１を参照。
本発明の１つの側面は、ｐＨ調整不要である液化工程に関する。液化工程のｐＨは４．５乃至５．４の範囲であり、酸を中和する化合物がこの液化工程で添加されることはない。
他の側面において、本発明はａ）水及び低濃度処理残渣と粉砕したデンプン含有物質を混合する工程、この工程において低濃度処理残渣は１０乃至７０％ｖ／ｖの範囲であり、デンプンを含み、２０乃至５０％ｗ／ｗの乾燥固形含量を有するスラリーを得る、
ｂ）このスラリーをデンプン液化工程の前又は該液化工程と同位にフィターゼで処理する工程、
ｃ）デンプンを液化する工程、
ｄ）工程ｂ）の間及び／又は液化工程と同時にアルファアミラーゼをデンプンに添加する工程、及び
ｅ）液化されたデンプンを糖化して発酵性糖を得る工程、を含む。ここにおいて、工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）のいずれの工程の間でもｐＨは調整しない。幾つかの態様において、発酵性糖は回収され、及び精製又は異性化される。他の態様において、フィターゼは液化工程の前に添加される。更なる態様において、アルファアミラーゼはフィターゼと一緒に添加される。更なる態様において、第二アルファアミラーゼが液化工程の間に添加される。
ｂ）このスラリーをデンプン液化工程の前又は該液化工程と同位にフィターゼで処理する工程、
ｃ）デンプンを液化する工程、
ｄ）工程ｂ）の間及び／又は液化工程と同時にアルファアミラーゼをデンプンに添加する工程、及び
ｅ）液化されたデンプンを糖化して発酵性糖を得る工程、を含む。ここにおいて、工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）のいずれの工程の間でもｐＨは調整しない。幾つかの態様において、発酵性糖は回収され、及び精製又は異性化される。他の態様において、フィターゼは液化工程の前に添加される。更なる態様において、アルファアミラーゼはフィターゼと一緒に添加される。更なる態様において、第二アルファアミラーゼが液化工程の間に添加される。
更なる側面において、本発明は液化及び液化されたデンプンを前述のように糖化して、発酵性糖を得る工程、及びこの発酵性糖を好適な発酵条件下で、発酵微生物を用いてエタノールを得る工程を含む、デンプン含有物質からアルコールを生成する方法に関する。幾つかの態様において、糖化及び発酵工程は同時に行う。幾つかの態様において、アルコールはエタノールである。特定の側面において、本発明は以下の工程を含むデンプンからアルコールを製造する方法に関する：（ａ）デンプンと水及び低濃度処理残渣とを混合して、スラリーを得る工程、（ｂ）フィターゼでスラリーを処理する工程、（ｃ）デンプンを液化する工程、（ｄ）アルファアミラーゼを添加する工程、（ｅ）液化したデンプンを糖化して、発酵性糖を得る工程、及び（ｆ）この発酵性糖を発酵微生物を用いて発酵させてアルコールを得る工程を含む。ここにおいて、ｐＨ調製は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）のいずれの工程においても行わない。
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的用語及び科学的用語は本発明の属する技術分野の当業者が共通して認識している意味と同じ意味に用いられる。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ２Ｄ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は本明細書で用いる用語の一般的な意味を当業者に提供している。更に、特定の用語を明確性及び参照を容易にするために以下で定義する。
本明細書で開示しているものと同じ又は等しい任意の方法及び物質を本発明の実施又は試験に用いることができるけれども、好適な方法及び物質を説明する。
本発明は以下の定義及び実施例を参照するもにより詳細が説明される。本明細書で参照する全ての特許及び刊行物、並びにそのような特許及び刊行物に開示されている全ての配列は参照により本明細書に援用される。
「アルファアミラーゼ」はα−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）であり、（例えば、アミロペクチン又はアミロースポリマーのような）デンプン内の内部α−１，４−グリコシル結合を切断又は加水分解する酵素である。
「液化」又は「液化工程」はデンプンを短い鎖に転化することにより低粘度のデキストリンにする工程を意味する。
「デキストリン」はグルコースの短鎖ポリマーである（例えば、２乃至１０単位）。
「デンプン」の語は植物の複合糖鎖炭化水素からなる、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘで表されるアミロース及びアミロペクチンからなる物質を意味する。式中、ｘは任意の数である。
「ｐＨが調整をしない」又は「ｐＨ調整無し」のフレーズは、粉砕したデンプン含有物質から発酵性糖及び／又はアルコールを生成するいかなる工程においても、追加的な酸又はアルカリを添加して、ｐＨを調整しないことを意味する。
「粒状デンプン」の語は生のデンプン、即ち、ゼラチン化温度に曝されていないデンプンを意味する。
「糖化酵素」及び「グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）の語は本明細書において互換的に用いられ、デンプン及び関連するオリゴ−又はポリサッカライドの非還元末端からＤ−グルコースの放出を促進する能力がある任意の酵素を意味する。
「オリゴサッカライド」の語はグルコシド結合で結合された２乃至１０の単糖単位を有する任意の化合物を意味する。糖単の短鎖ポリマーはデキストリンを含む。
「発酵性糖」の語は酵素転換により最終生成物（例えば、エタノール）における微生物により用いられるモノサッカライド及びジサッカライド等（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース）の単純な糖を意味する。
「ＤＥ」又は「デキストロース当量」の語は緩衝重量ベースでＤ−グルコースとして計算される、総還元糖の濃度を測定するための工業規格である。加水分解されていない粒状デンプンのＤＥは０であり、Ｄ−グルコースのＤＥは１００である。
「総糖含量」の語はデンプン組成物中に存在している総糖含量を意味する。
「乾燥固形分（ｄｓ）」の語は乾燥重量ベースで、％として表される、スラリー中の総固形分を意味する。
本明細書で用いる「粉砕された」の語は、すりつぶし、おしつぶし、分画、又は粒子サイズを減らす任意の他の手段等によりサイズを小さくしたデンプン含有物質を意味する。粉砕は乾燥又は湿式粉砕を含む。「乾燥粉砕」は乾燥全粒を粉砕することである。「湿式粉砕」は穀物を第一に水の中に浸して、軟らかくしてから処理する工程である。
「ゼラチン化」の語は通常、調理によりデンプンの分子を可溶化して、粘性の懸濁液にする工程を意味する。
「ゼラチン化温度」の語はデンプン含有基質がゼラチン化する最も低い温度を意味する。ゼラチン化の正確な温度はデンプンの種類に依存しており、植物種、環境、育成条件等の因子により変化する。
「ゼラチン化温度より低い」は、温度がゼラチン温度未満であることを意味する。
「スラリー」の語は不溶性固形物（例えば、粒状デンプン）を含む水性混合物を意味する。
「発酵」の語は、微生物により有機基質を、酵素的及び嫌気的に壊して、単純な有機化合物を精製することを意味する。発酵は嫌気的条件で行うが、発酵は酸素の存在下でも起こるので、この語を厳密に嫌気的条件で行うものに限定することは意図しない。
「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」の語はエタノール生成微生物等の発酵有機体及び糖化酵素等の少なくとも１つの酵素を同じ発酵管の同じ工程で組み合わせて、最終生成物を精製するプロセスを意味する。
「低濃度処理残渣（ｔｈｉｎ ｓｔｉｌｌａｇｅ）」の語は懸濁された細かい粒子及び溶解された物質を含む固形物から（例えば、スクリーニング又は遠心分離により）調製された処理残渣（ｓｔｉｌｌａｇｅ）の液体部分を意味する。
「バックセット」の語は再利された低濃度処理残渣を意味する。
蒸留物原料（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ ｆｅｅｄ）の語は穀物顆粒の発酵の副生成物を意味し、可溶性蒸留乾燥穀物（ＤＤＧＳ）及び／又は蒸留乾燥穀物（ＤＤＧ）を含む。
「最終生成物」の語は発酵可能基質から酵素的に転換された炭素源由来生成物を意味する。幾つかの好適な態様において、この最終生成物はアルコール（例えば、エタノール）である。
「由来」の語は「〜起源の」「得られた」、又は「〜より得られた」、及び「〜から単離された」の語を含む。幾つかの態様において、本明細書では、核酸配列によりエンコードされるポリペプチドが天然に存在している核酸を有する細胞から、又は核酸が挿入された細胞から生成されたことを意味する。
本明細書で用いる「発酵有機体」の語は最終生成物を直接又は間接的に生成するための発酵に用いるのに好適な、任意の微生物又は細胞を意味する。
本明細書で用いる「回収された」、「単離された」、及び「分離された」の語は、自然状態において関係している少なくとも１つの成分が取り除かれた、タンパク質、核酸、又はアミノ酸を意味する。
本明細書において「タンパク質」及び「ポリペプチド」は互換的に使用される。本明細書及び特許請求の範囲において、従来用いられているアミノ酸残渣の１文字及び３文字コードを用いる。アミノ酸の３文字コードはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢジョイントコミッション、オンバイオケミカル、ノーメンキュラー（ＪＣＢＮ）に従い定義する。ポリペプチドは遺伝子コードの退縮によって１つ以上の核酸配列によりコードされることは理解されている。
本明細書で用いる、[フィターゼ]の語はフィチン酸塩ならびに放出している無機リン酸塩及びイノシトールを含むリン酸エステルを加水分解することができる酵素を意味する。幾つかの態様において、フィチン酸塩に加えて、フィターゼはリン酸化が中程度のイノシトール−リン酸の少なくとも１つを加水分解することができる。
「熱安定性」及び「熱耐性」の語は互換的に用いられ、熱安定性を意味する。
ｐＨ安定性の語は、所与のｐＨにおける酵素の安定性を意味する。
「フィチン酸抑制」の語は、フィチン酸の高いレベルに依存するアルファアミラーゼ活性のロスを意味する。「ＩＰ６」は６リン酸基を含むイノシトールであると定義される。ＩＰ６は通常１乃至５リン酸基（ＩＰ１−ＩＰ５）を有する各誘導体の各種量で存在している。
本明細書で説明されるものに似た又は等価である任意の方法及び物質を本発明の実施又は試験に用いることができるけれども、代表的及び好適な方法及び物質を説明する。本発明の明細書で言及されている全ての刊行物を参照により本明細書に援用して、刊行物で引用している方法及び／又は物質との関係を説明する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲用いられるように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は別に明確に定義しない限り、複数も意味する。従って、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）は当業者に１つ以上の細胞及びこれと等しいと認識されているものを意味する。
数値範囲が提供される場合、別に定義しない限り、各中間の値、最低値の単位の十分の一まで、範囲の上限値と下限値の間の値も開示されているものとする。開示されている値の間のより小さい範囲、又は開示されている範囲の中間の値、及び他の開示されている又は開示されている範囲の中間の値も発明の範囲内に包含される。これらのより小さい範囲に含まれる上限値及び下限値は範囲に含まれるか、排除され、範囲のいずれか一方、あるいは両方がより小さい範囲に含まれる場合、それらに含まれた限界の両方又はいずれか一方も本発明に含まれる。
用語の他の定義は明細書全体を通じて理解される。例示的な態様が詳細な説明で説明されるが、本発明をこれらの態様に限定することを意図してはいない。
本明細書で言及されている刊行物は本発明の出願前に開示されているものを提供するために用いられる。従来の発明の利点により、そのような刊行物に先行する資格がないということを了承することを意図するものではない。
デンプン含有基質
本発明に有用なデンプン含有基質物質は任意のデンプン含有物質を意味する。好適なデンプン含有物質はコムギ、コーン、ライムギ、ソルガム（マイロ）、ライス、ミレット、オオムギ、トリチカル、キャッサバ（タピオカ）、ポテト、甘藷、シュガービート、サトウキビ、及びダイズ及びエンドウマメ等のマメ科の植物から得られたものである。好適な物質は、コーン、オオムギ、コムギ、ライス、マイロ、及びこれらの組み合わせを含む。植物物質はハイブリッド変異体及び遺伝的に修飾された変異体（例えば、異種遺伝子を含むトランスジェニックコーン、大麦、又はダイズ）を含む。植物の任意の部分をデンプン含有物質をして用いることができ、例として葉、茎、ヘタ、サヤ、塊茎、穂軸、穀物等を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、必ず植物全体を用いる、例えば、コーンストーバー全体が用いられる。幾つかの態様において、穀粒全体がデンプン含有物質として用いられる。好適な全体穀物は、コーン、コムギ、ライムギ、ソルガム、及びこれらの組み合わせを含む。他の態様において、デンプン含有物質は繊維、内胚乳、及び胚部分を含む分画化された穀粒穀物から得られる。コーン及びコムギなど植物物質を分画化するための方法は当業者に知られている。幾つかの態様において、異なる源から得られたデンプン含有物質も本発明の方法に用いる物質を得るために一緒に混合してもよい（例えば、コーン、及びマイロ、又はコーン及びオオムギ）。
デンプン含有物質の粉砕
本発明に有用なデンプン含有基質物質は任意のデンプン含有物質を意味する。好適なデンプン含有物質はコムギ、コーン、ライムギ、ソルガム（マイロ）、ライス、ミレット、オオムギ、トリチカル、キャッサバ（タピオカ）、ポテト、甘藷、シュガービート、サトウキビ、及びダイズ及びエンドウマメ等のマメ科の植物から得られたものである。好適な物質は、コーン、オオムギ、コムギ、ライス、マイロ、及びこれらの組み合わせを含む。植物物質はハイブリッド変異体及び遺伝的に修飾された変異体（例えば、異種遺伝子を含むトランスジェニックコーン、大麦、又はダイズ）を含む。植物の任意の部分をデンプン含有物質をして用いることができ、例として葉、茎、ヘタ、サヤ、塊茎、穂軸、穀物等を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、必ず植物全体を用いる、例えば、コーンストーバー全体が用いられる。幾つかの態様において、穀粒全体がデンプン含有物質として用いられる。好適な全体穀物は、コーン、コムギ、ライムギ、ソルガム、及びこれらの組み合わせを含む。他の態様において、デンプン含有物質は繊維、内胚乳、及び胚部分を含む分画化された穀粒穀物から得られる。コーン及びコムギなど植物物質を分画化するための方法は当業者に知られている。幾つかの態様において、異なる源から得られたデンプン含有物質も本発明の方法に用いる物質を得るために一緒に混合してもよい（例えば、コーン、及びマイロ、又はコーン及びオオムギ）。
デンプン含有物質の粉砕
幾つかの態様において、デンプン含有物質は粉砕等の手段により調整される。２つの一般的な粉砕方法は湿式粉砕と乾式粉砕を含む。例えば、乾式粉砕において、全粒が粉砕され本発明の方法に用いられる。湿式粉砕において、穀粒は分離される（例えば、粉末からの胚）。特に、全流穀物の粉砕の手段は良く知られており、ハンマーミル及びロールミルを含む。粉砕の方法は当業者によく知られており、文献はＴＨＥ ＡＬＣＯＨＯＬ ＴＥＸＴＢＯＯＫ：Ａ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ ＦＯＲ ＴＨＥ ＢＥＶＥＲＡＧＥ，ＦＵＥＬ ＡＮＤ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＡＬＣＯＨＯＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ ３ｒｄ ＥＤ． Ｋ．Ａ．Ｊａｃｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ，（１９９９）Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓである。Ｃｈａｐｔｅｒｓ２及び４参照。幾つかの態様において、本発明に用いる粉砕された粒は物質の５０％以上が０．５ｍｍメッシュの篩を通過できるように、他の態様においては物質の７０％以上が０．５ｍｍメッシュの篩を通過できるような粒子サイズを有している（例えば、ＷＯ２００４／０８１１９３参照）。
デンプン含有物質のスラリーの調製
粉砕されたデンプン含有物質は水及び再利用された低濃度処理残渣と組み合わされて水溶性スラリーとなる。このスラリーは１５乃至５５％ｄｓｗ／ｗ（例えば、２０乃至５０％、２５乃至５０％、２５乃至４５％、２５乃至４０％、及び２１乃至３５％ｄｓ）を含む。幾つかの態様において、再利用された低濃度処理残渣（バックセット）は１０乃至７０％ｖ／ｖ（例えば、１０乃至６０％、１０乃至５０％、１０乃至４０％、１０乃至３０％、１０乃至２０％、２０乃至６０％、２０乃至５０％、２０乃至４０％、及び２０乃至３０％）の範囲で含まれる。
粉砕されたデンプン含有物質は水及び再利用された低濃度処理残渣と組み合わされて水溶性スラリーとなる。このスラリーは１５乃至５５％ｄｓｗ／ｗ（例えば、２０乃至５０％、２５乃至５０％、２５乃至４５％、２５乃至４０％、及び２１乃至３５％ｄｓ）を含む。幾つかの態様において、再利用された低濃度処理残渣（バックセット）は１０乃至７０％ｖ／ｖ（例えば、１０乃至６０％、１０乃至５０％、１０乃至４０％、１０乃至３０％、１０乃至２０％、２０乃至６０％、２０乃至５０％、２０乃至４０％、及び２０乃至３０％）の範囲で含まれる。
一旦粉砕されたデンプン含有物質が水及びバックセットと一緒に組み合わされると、スラリーのｐＨは調整しない。更に、ｐＨはフィターゼ、及び任意でアルファアミラーゼをスラリーに添加したあとでも、ｐＨは調整しない。好適な態様において、スラリーのｐＨは４．５乃至６．０未満（例えば、４．５乃至５．８、ｐＨ４．５乃至５．６、ｐＨ４．８乃至５．８、ｐＨ５．０乃至５．８、ｐＨ５．０乃至５．４、及びｐＨ５．２乃至５．５）である。スラリーのｐＨはスラリーに添加される低濃度処理残渣の量及び低濃度処理残渣を含む物質のタイプに依存してｐＨ４．２乃至５．２の間である。例えば、低濃度処理残渣のｐＨが３．８乃至４．５の間である。表１に示したように、６８．３℃で２時間撹拌した後の全粒コーンスラリーに低濃度処理残渣の添加量が増えるとｐＨが変化する。
エタノール生成の間、酸をより低いｐＨのビールに添加して蒸留の又は塩の微生物汚染の危険性を低めることができる。
幾つかの態様において、フィターゼをスラリーに添加する。他の態様において、フィターゼに加えて、アルファアミラーゼをこのスラリーに添加する。幾つかの態様において、このフィターゼ及びアルファアミラーゼはスラリーに連続的に添加される。他の態様において、このフィターゼ及びアルファアミラーゼは同時に添加される。幾つかの態様において、フィターゼ及び任意でアルファアミラーゼを含むスラリーを５分乃至８時間の間インキュベートする（例えば、５分乃至６時間、５分乃至４時間、５分乃至２時間、及び１５分乃至４時間）。他の態様において、このスラリーは４０乃至１１５℃の範囲の温度（例えば、４５乃至８０℃、５０乃至７０℃、５０乃至７５℃、６０乃至１１０℃、６０乃至９５℃、７０乃至１１０℃、及び７０乃至８５℃）の範囲の温度でインキュベートされる。
他の態様において、スラリーは０乃至３０℃（例えば、０乃至２５℃、０乃至２０℃、０乃至１５℃、０乃至１０℃、０乃至５℃）のデンプン含有物質のデンプンゼラチン化温度以下の範囲の温度でインキュベートされる。幾つかの態様において、温度は６８℃以下、６５℃以下、６２℃以下、６０℃以下、及び５５℃以下である。幾つかの態様において、温度は４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、及び６０℃以上である。幾つかの態様において、デンプンゼラチン化温度以下の温度でのフィターゼ及びアルファアミラーゼを含むスラリーのインキュベーションは一次（１ｏ）液化とも言われる。
幾つかの態様において、粉砕されたデンプン含有物質はコーン又はマイロである。このスラリーは２５乃至４０％ｄｓを含み、４．８乃至５．２の範囲のｐＨである。このスラリーはフィターゼ及び任意でアルファアミラーゼと共に、５分乃至２時間、６０乃至７５℃でインキュベートされる。
近年、液化工程に用いられる市販の利用可能な微生物アルファアミラーゼは８０℃以上の温度及び５．６未満のｐＨ範囲で全粒穀物を用いた乾燥粉砕工程からのデンプン基質を液化するのには安定性が不十分であると信じられている。多くの市販の利用可能なアルファアミラーゼの安定性は約４．０未満のｐＨにおいて減少する。
更なる液化工程において、インキュベートされた又は前処理されたデンプン含有物質をデンプン含有物質のデンプンゼラチン化温度の０乃至４５℃より高い温度に（例えば、７０乃至１２０℃、７０乃至１１０℃、及び７０乃至９０℃）、約４．０乃至５．５のｐＨで、２分乃至６時間、（例えば、２分乃至４時間）、より好ましくは１時間乃至２時間曝す。この温度は、例えば、１乃至１５分の短い時間の間の従来の高温ジェットクッキングシステムにより高めることができる。その後、デンプンは更に、７５℃乃至９５℃（例えば、８０℃乃至９０℃、及び８０℃乃至８５℃）の範囲で１５乃至１５０分（例えば、３０乃至１２０分）更に加水分解される。好適な態様において、ｐＨはこれらの工程の間に調整しない、液化されたマッシュのｐＨは４．０乃至５．８の間（例えば、ｐＨ４．５乃至５．８、ｐＨ４．８乃至５．４、及びｐＨ５．０乃至５．２）である。幾つかの態様において、熱安定性アルファアミラーゼは二次的に液化工程に添加される。他の態様において、これらは追加的なアルファアミラーゼを含まない。
本発明のインキュベーション及び液化工程は当業者に良く知られている糖化及び発酵工程が行われる
糖化及び発酵
液化されたデンプン含有物質はグルコアミラーゼ等の糖化酵素の存在下で糖化される。この糖化工程は１２時間乃至１２０時間（例えば、１２乃至９０時間、１２乃至６０時間、及び１２乃至４８時間）行われる。しかしながら、３０乃至６５℃、通常６０℃前後の温度範囲で３０分乃至２時間（例えば、３０乃至９０分）の間予備糖化工程を行うのが通常であり、この後同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）をいわれる発酵の間の完全な糖化を行う。
液化されたデンプン含有物質はグルコアミラーゼ等の糖化酵素の存在下で糖化される。この糖化工程は１２時間乃至１２０時間（例えば、１２乃至９０時間、１２乃至６０時間、及び１２乃至４８時間）行われる。しかしながら、３０乃至６５℃、通常６０℃前後の温度範囲で３０分乃至２時間（例えば、３０乃至９０分）の間予備糖化工程を行うのが通常であり、この後同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）をいわれる発酵の間の完全な糖化を行う。
発酵可能糖（例えば、デキストリン、モノマーサッカライド、特にグルコース）は酵素的な糖化から生成される。これらの発酵性糖は更に生成及び／又は回収された有用な糖製品になる。更に、糖類はアルコール（例えば、エタノール及びブタノール）、有機酸（例えば、コハク酸及び酪酸）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、及び２−ケト−Ｌ−グルコン酸）、アミノ酸（例えば、リジン）、タンパク質（例えば、抗体及び抗体フラグメント）等の最終製品を製造するための微生物発酵工程における発酵原料として用いることもできる。
好適な態様において、液化工程の間に得られた発酵性糖はアルコール、特にエタノールを生成するために用いる。エタノール生成において、ＳＳＦプロセスは、糖化酵素と発酵微生物（例えば、酵母）一緒に添加して、その後３０乃至４０℃の温度で行う工程にである。
発酵に用いる微生物は所望の最終製品に依存している。通常、エタノールが所望の最終生成物である場合、酵母を発酵微生物として用いる。幾つかの好適な態様において、エタノール生成微生物は酵母であり、特にサッカロマイセス．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＵＳＰ４，３１６，９５６）の株等のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である。各種サッカロマイセス．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が利用されており、これらはＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ Ｙｅａｓｔ）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、ＲＥＤ ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）、及びＡｎｇｅｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｙｅａｓｔ （Ａｎｇｅｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｎａ）を含むがこれらに限定されない。本発明の方法で用いる開始酵母の量は、好適な時間内に商業的に十分な量のエタノールを生産するのに効果的な量である（例えば、７２時間未満で２５乃至４０％ｄｓの基質から少なくとも１０％のエタノールを生成することができる）。酵母細胞は通常、発酵ブロス１ｍｌ当たり１０４乃至１０１２、好ましくは１０７乃至１０１０の利用可能酵母数の量で供給される。発酵は発酵微生物（例えば、酵母）、栄養素、任意でフィターゼを含むがこれらに限定されない追加的な酵素への添加を含む。発酵中の酵母の使用は良く知られており、文献はＴＨＥ ＡＬＣＯＨＯＬ ＴＥＸＴＢＯＯＫ，Ｋ．ＪＡＣＱＵＥＳ ＥＴ ＡＬ．， ＥＤＳ．１９９９，ＮＯＴＴＩＮＧＨＡＭ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ，ＵＫである。
更なる態様において、当業者に知られている好適な発酵微生物の使用により、発酵最終生成物は、グリセロール、１，３−プロパンジオール、グルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、２−ケト−Ｌ−グルコン酸、コハク酸、酪酸、アミノ酸及びこの誘導体を含むがこれらに限定されない。より具体的には、酪酸が所望の最終生成物である場合、ラクトバチルス．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）のようなラクトバチルス株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）が用いられ、グリセロール又は１，３−プロパンジオールが所望の生成物である場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が用いられる。２−ケト−Ｄ−グルコネート、２，５−ジケト−Ｄ−グルコネート、及び２−ケト−Ｌ−グルコン酸が所望の最終生成物である場合、パントエア．シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）が発酵微生物として用いられる。前記列挙リストは例示的なものであり、当業者は所望の最終生成物を得るために用いるのに適した多くの微生物が存在していることを理解している。
回収
任意で、発酵に続いて、アルコール（例えば、エタノール）が典型的な蒸留、及び任意で１つ以上の工程により抽出される。
任意で、発酵に続いて、アルコール（例えば、エタノール）が典型的な蒸留、及び任意で１つ以上の工程により抽出される。
幾つかの態様において、本発明に包含される方法により生成されたエタノールの生産性は少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、及び少なくとも１８％（ｖ／ｖ）、及び少なくとも２３％ｖ／ｖである。本発明の方法により得られたエタノールは燃料エタノール、ポータブルエタノール、又は工業用エタノールとして用いられる。
更なる態様において、最終生成物は蒸留乾燥穀物（ＤＤＳ）及び蒸留乾燥穀物及び可溶分（ＤＤＧＳ）等の発酵副生成物を含み、これらの態様において、動物飼料として利用される。
フィターゼ処理工程に用いる酵素
本発明に有用なフィターゼはインキュベーション及び液化工程の限られた条件下で、フィチン酸を加水分解することができる酵素を含む。幾つかの態様において、このフィターゼは、イノシトール５リン酸（フィチン酸）から少なくとも無機リン酸塩を放出することができる。フィターゼは加水分解を開始するフィターゼ分子のリン酸エステル基の特定の位置に対して、優先的に結合する（例えば、３−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）又は６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）。フィターゼの典型的なタイプはｍｙｏ―イノシトール−ヘキサキフォスフェート−３−リン酸ヒロドラーゼである。
本発明に有用なフィターゼはインキュベーション及び液化工程の限られた条件下で、フィチン酸を加水分解することができる酵素を含む。幾つかの態様において、このフィターゼは、イノシトール５リン酸（フィチン酸）から少なくとも無機リン酸塩を放出することができる。フィターゼは加水分解を開始するフィターゼ分子のリン酸エステル基の特定の位置に対して、優先的に結合する（例えば、３−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）又は６−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）。フィターゼの典型的なタイプはｍｙｏ―イノシトール−ヘキサキフォスフェート−３−リン酸ヒロドラーゼである。
フィターゼは糸状菌及びバクテリア微生物等の微生物か得ることができる。これらの微生物の幾つかはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、アスペルギルス．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス．フイカム（Ａ．ｆｉｃｕｍ）及びアスペルギルスフミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、ミセリオフィソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ミセリオフィソラ．セルモフィリア (Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ), タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス．セルモフィリス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓ）、トリコデルマ株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）トリコデルマ．レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、及び セルロマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）（ＷＯ９９／４９７４０）を含む。フィターゼはペニシリウム株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、ペニシリウム．ホルデイ（Ｐ． ｈｏｒｄｅｉ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２２０５３）、ペニシリウム．ピセウム（Ｐ．ｐｉｃｅｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１０５１９）、又はペニシリウム．ブレビコンパクタム（Ｐ．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４８９４４）も利用可能である。例えば、ＵＳＰ６，４７５，７６２参照。更に、フィターゼはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、バチルス．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ペニフォラ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シトロバクテリア（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）、及びブチラウキシラ（Ｂｕｔｔｉａｕｉｘｅｌｌａ）（ＷＯ２００６／０４３１７８参照）からも利用可能である。
市販のフィターゼはＮＡＴＵＰＨＯＳ（ＢＡＳＦ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ Ｐ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＰＨＺＹＭＥ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ，Ｄｉｖｅｒｓａ）、及び ＦＩＮＡＳＥ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ）がある。微生物フィターゼ活性を決定するための方法及びフィターゼの定義は、Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，７７：７６０−７６４に記載されている。フィターゼは野生型フィターゼでもよいし、変異体、又はそれらのフラグメントでもよい。
１つの態様において、本発明に有用なフィターゼはバクテリア、ブチラキセラ株（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ ｓｐｐ）である。ブチラキセラ株はブチラキセラ．アグレスティス（Ｂ．ａｇｒｅｓｔｉｓ）、ブチラキセラ．ブネネラエ（Ｂ．ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブチラキセラ．フェラグティラーゼ（Ｂ．ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｓｅ）、ブチラキセラ．ガビニアエ（Ｂ．ｇａｖｉｎｉａｅ）、ブチラキセラ．イザルディ（Ｂ．ｉｚａｒｄｉｉ）、ブチラキセラ．ノアキアエ（Ｂ．ｎｏａｃｋｉａｅ）、及びブチラキセラ．ワームボルディアエ（Ｂ．ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅ）を含む。ブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ）種の株はＤＳＭＺ、ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から利用可能である。登録番号ＮＣＩＭＢ ４１２４８のブチラキセラ株Ｐ１−２９はフィターゼを得るのに特に有用な株であり、本発明に用いることができる。幾つかの態様において、このフィターゼはＢＰ野生型タイプ、ＷＯ０６／０４３１７８に記載のこれらの変異体（ＢＰ−１１等）、又は２００７年６月３日に出願された（出願番号ＵＳ２００８−０２２０４９８）に記載の変異体である。例えば、ＢＰ野生型タイプ及びこれらの変異体はＷＯ０６／０４３１７８の表１に開示されている。ここにおいて、ナンバリングはＰＣＴ出願の配列番号３に基づいている。
１つの好適な態様において、本発明に有用なフィターゼは表２に示す配列番号１で定義されるアミノ酸配列に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するもの及びそれらの変異体である。より好ましくは、フィターゼは配列番号１で定義されるアミノ酸配列に少なくとも９５％乃至９９％の配列同一性を有するフィターゼ又はそれらの変異体である。幾つかの態様において、このフィターゼは配列番号１で定義されるアミノ酸配列を有するか、又はこのアミノ酸から構成される。
幾つかの態様において、インキュベーション及び／又は液化工程に用いるフィターゼの量は約０．００１乃至５０ＦＴＵ／ｇｄｓ（例えば、約０．０１乃至２５ＦＴＵ／ｇｄｓ、約０．０１乃至１５ＦＴＵ／ｇｄｓ、約０．０１乃至１０ＦＴＵ／ｇｄｓ、約０．０５乃至１５ＦＴＵ／ｇｄｓ、及び約０．０５乃至５．０ＦＴＵ／ｇ）である。
アルファアミラーゼ
幾つかの好適な態様において、アルファアミラーゼは効果的な量を投与したときに、３．０乃至７．０、好ましくは３．５乃至６．５のｐＨ範囲で活性を示す酸安定性アルファアミラーゼである。本発明に有用なアルファアミラーゼは糸状菌アルファアミラーゼ又はバクテリアアルファアミラーゼである。更に、このアルファアミラーゼは野生型アルファアミラーゼ、変異体又はこれらのフラグメント、あるいはある微生物由来の触媒ドメインと他の微生物由来のデンプン結合ドメインとを含むハイブリッドアルファアミラーゼでもよい。
幾つかの好適な態様において、アルファアミラーゼは効果的な量を投与したときに、３．０乃至７．０、好ましくは３．５乃至６．５のｐＨ範囲で活性を示す酸安定性アルファアミラーゼである。本発明に有用なアルファアミラーゼは糸状菌アルファアミラーゼ又はバクテリアアルファアミラーゼである。更に、このアルファアミラーゼは野生型アルファアミラーゼ、変異体又はこれらのフラグメント、あるいはある微生物由来の触媒ドメインと他の微生物由来のデンプン結合ドメインとを含むハイブリッドアルファアミラーゼでもよい。
幾つかの態様において、本発明の方法は高温（例えば、８５℃以上、又は８０℃以上）でｐＨ６．５以下で不安定なアルファアミラーゼに対して有用である。
糸状菌アルファアミラーゼはアスペルギルス株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）(例えば、 アスペルギルス．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス．カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉ）、及びアスペルギルス．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）；トリコデルマ株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）、リゾプス株（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）、ムコール株（Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．）、及びペニシリウム株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）を含むがこれらに限定されない。
バクテリアアルファアミラーゼの例としては、バチルス．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス．ステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、及びバチルス．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）等のバチルス株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）である。特に、バチルス．リケニフォルミス（Ｂ．ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス．ステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びバチルス．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）が好ましい。好ましくは、本発明の方法に用いられるバクテリアアルファアミラーゼはＵＳＰ５，０９３，２５７；ＵＳＰ５，７６３，３８５；ＵＳＰ５，８２４，５３２；ＵＳＰ５，９５８，７３９；ＵＳＰ６，００８，０２６；ＵＳＰ６，０９３，５６３；ＵＳＰ６，１８７，５７６；ＵＳＰ６，３６１，８０９；ＵＳＰ６，８６７，０３１；ＵＳ２００６／００１４２６５；ＷＯｓ９６／２３８７４；ＷＯ ９６／３９５２８； ＷＯ９７／１４１２１３；ＷＯ ９９／１９４６７；及び ＷＯ０５／００１０６４に記載のアルファアミラーゼを含む。
本発明に包含される方法に用いるための市販のアルファアミラーゼはＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ；ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ；ＳＰＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ；ＧＺＹＭＥ（商標）９９７； 及びＣＬＡＲＡＳＥ（商標）Ｌ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）１２０、又はＬ，ＬＣ、及びＳＣ、並びにＳＵＰＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）Ｘ、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ ＳＣ及びＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、及びＦｕｅｌｚｙｍｅ（商標）ＬＦ（Ｄｉｖｅｒｓａ）を含む。
幾つかの態様において、本発明の方法に有用なアルファアミラーゼの量は、０．１乃至５０ＡＡＵ／ｇｄｓ（例えば、０．１乃至２５ＡＡＵ／ｇｄｓ、０．５乃至１５ＡＡＵ／ｇｄｓ、及び／又は好ましくは１．０乃至１０ＡＡＵ／ｇｄｓ）のような当業者に有効な量であると認識されている量である。
本発明の方法に用いる酵素組成物はフィターゼ及びアルファアミラーゼ、並びに特定の熱安定性アルファアミラーゼのブレンド又は製剤化された酵素組成物を含む。
幾つかの態様において、アルファアミラーゼはＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ、又はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ等のバチルス．ステアロセレモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアルファアミラーゼを含む。
幾つかの態様において、有用な酵素組成物はＢＰ−ＷＴ、又はＢＰ−１７、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ、及び任意でＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤを含む。特定の態様において、フィターゼはＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）ＳＣ又はＳＵＰＲＡ ａｎｄ Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ ＳＣ等のアルファアミラーゼと組み合わせて用いられる。
幾つかの態様において、フィターゼ組成物及びアルファアミラーゼ組成物を本発明の方法に用いる場合、フィターゼ（ＦＴＵ／ｇｄｓ）対アルファアミラーゼ（ＡＡＵ／ｇｄｓ）の比は約１５：１乃至１：１５である。他の態様において、フィターゼとアルファアミラーゼの量は約１０：１乃至１：１０、５：１乃至１：５、３：１乃至１：３、２：１乃至１：２、及び３：１乃至１：２である。
ブレンドされた製剤又は別個にフィターゼ及びアルファアミラーゼを含む酵素組成物は、例えば、ＭＡＸＡＬＩＱ（商標）Ｏｎｅ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）のようなデンプン転換組成物を含む。
幾つかの非限定的な態様において、酵素ブレンド又は組成物はａ）配列番号１に少なくとも９５％、又は少なくとも０７％、又は少なくとも９９％同一なＢＰ−１７フィターゼ及び熱安定性バクテリアアルファアミラーゼ；ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉフィターゼ（例えば、ＰＨＹＺＹＭＥ ＸＰ）及び酸安定性アルファアミラーゼ、及びｃ）アスペルギルスニガーフィターゼ及び熱安定性バクテリアアルファアミラーゼを含む。
インキュベーション工程で追加的なアルファアミラーゼと同時に又は連続的にフィターゼを添加することは、低いｐＨにおいてアルファアミラーゼの熱安定性及び／又はｐＨ安定性を高めることになるので、本発明の方法は追加的な値を動物用飼料に付与する。追加的なフィチン酸、シリアル／穀粒及びオイルシードに蹴るリン酸の一次的な所蔵形態であるミオイノシトールヘキサキスリン酸は単胃動物（例えば、家禽及び豚）により部分的にのみ利用され、それ故、飼料製剤において、穀物又はシリアルの好ましくない成分であることが知られている。フィチン酸塩は亜鉛、鉄、カルシウム、マグネシウム、及びタンパク質等の必要な成分と結合して、生物利用性を減少させることも知られている。更に、フィチン酸及びタンパク質のｍｙｏ−イノシトールリン酸エステルはデンプンの加水分解に対してアルファアミラーゼ抑制効果があることも知られている。その結果として、おおくの飼料製剤に微生物フィターゼを使用することが長い間検討されてきた（例えば、Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＰｈｙｚｙｍｅ（商標）ＸＰ５０００、ＡＢ ＥｎｚｙｍｅｓのＦｉｎａｓｅ（商標）、Ｇｏｄｏ Ｓｈｕｓｅｉ ＪａｐａｎのＧＯＤＯ ＰＨＹ（商標）、ＡｌｔｅｃｈのＡｌｌｚｙｍｅ（商標） Ｐｈｙｔａｓｅ；ＢＡＳＦのＮａｔｕｐｈｏｓ（商標）；及びＤＳＭ／ＮｏｖｏｚｙｍｅのＲｏｎｏｚｙｍｅ（商標）Ｐ）。しかしながら、本発明の方法においてフィターゼのインキュベーションにより、ＤＤＧＳ等の副生成物が高い値を示す。
糖化酵素
グルコアミラーゼ（ＧＡ）（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）は糖化酵素として有用であり、これらはバクテリア、植物、及び糸状菌源の異種又は内性例えば、発現に由来する。本発明の組成及び方法に好適なグルコアミラーゼは糸状菌及び酵母の幾つかの株により生成される。特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの株から分泌されるグルコアミラーゼは市販的に重要である。
グルコアミラーゼ（ＧＡ）（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）は糖化酵素として有用であり、これらはバクテリア、植物、及び糸状菌源の異種又は内性例えば、発現に由来する。本発明の組成及び方法に好適なグルコアミラーゼは糸状菌及び酵母の幾つかの株により生成される。特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの株から分泌されるグルコアミラーゼは市販的に重要である。
好適なグルコアミラーゼは天然野生型グルコアミラーゼのほかに、変異体及び遺伝的に修飾された変異グルコアミラーゼ（例えば、ハイブリッドグルコアミラーゼ）を含む。
グルコアミラーゼはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（アスペルギルス．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ．３：１０９７−１１０２；ＷＯ ９２／００３８１及びＵＳＰ６，３５２，８５１参照）；アスペルギルス．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：９４１−９４９参照）及びアスペルギルス．シロウサミ（Ａ．ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ）Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５）；タラロマイセス．エメルソニ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロマイセス．レイセタヌス（Ｔ．ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）、タラロマイセス．ヂュポンチ（Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ）及び タラロマイセス．セルモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 等のタラロマイセス株（ＷＯ９９／２８４８８；ＵＳＰ Ｎｏ．ＲＥ：３２，１５３；ＵＳＰ Ｎｏ．４，５８７，２１５）；トリコデルマ．レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）等のトリコデルマ株、特にＵＳＰａｔ．Ｎｏ．７，４１３，８８７に記載の配列番号４に少なくとも８０％、８５％、９０％、及び９５％同一なグルコアミラーゼ；リゾプス．ニバース（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ ）リゾプス．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）等のリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）；ムコール株、及びフミコーラ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）等のフミコーラ株 (Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１０９７−１１０２；ＷＯ９２／００３８１；ＷＯ００／０４１３６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６） Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．６１：３０１−３０８；ＵＳＰ．４，５１４，４９６；ＵＳＰ４，０９２，４３４；ＵＳＰ４，６１８，５７９；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ３４：２１８−２２３、及びＷＯ２００５／０５２１４８の配列番号３参照)。幾つかの態様において、グルコアミラーゼはＷＯ０５／０５２１４８の配列番号３アミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９２５、９４５、９６％、９７％、９８％、及び９９％の配列同一性を有する。本発明に有用な他のグルコアミラーゼはＡｔｈｅｌｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ及びそれらの変異タンパク質幾つかの由来のものを含む（ＷＯ０４／１１１２１８）。
市販されているグルコアミラーゼ活性を有する酵素は、例えば、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ，Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎより販売されている、商標 ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ、ＯＰＴＩＤＥＸ Ｌ−４００、及びＧＺＹＭＥＧ９９０４Ｘ) またはリゾプス株（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ） (Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｊａｐａｎの商標 ＣＵ．ＣＯＮＣ)。市販の消化酵素、Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎの商標ＧＬＵＣＺＹＭＥ(Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９８：６６３−６７１)も用いることができる。追加的な酵素はリゾプス株（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）の３つのグルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）の酵素、即ち、「Ｇｌｕｃｌ」（ＭＷ７４，０００）、「Ｇｌｕｃ２」（ＭＷ ５８，６００）、及び「Ｇｌｕｃ３」（ＭＷ６１，４００）も含む。酵素調製物ＧＣ４８０（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ， Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）も本発明に用いることができる。前述のグルコアミラーゼ及び市販の酵素に本願発明を限定する意図ではない。これらは例示のために提供される。
第二酵素
本発明の幾つかの態様はアルファアミラーゼとフィターゼとの酵素組成物又はブレンドの使用を含むが、追加的なグルコアミラーゼ、任意で他の酵素も本発明において使用される。例えば、液化工程の間に有用な酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オペクチナーゼ、ベータグルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシダーゼ（ＣＧＴアーゼ）、ベータアミラーゼ、及びこれらの組み合わせを含む。
本発明の幾つかの態様はアルファアミラーゼとフィターゼとの酵素組成物又はブレンドの使用を含むが、追加的なグルコアミラーゼ、任意で他の酵素も本発明において使用される。例えば、液化工程の間に有用な酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オペクチナーゼ、ベータグルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシダーゼ（ＣＧＴアーゼ）、ベータアミラーゼ、及びこれらの組み合わせを含む。
幾つかの態様において、追加的な酵素はバクテリア又は糸状菌アルファアミラーゼ等の第二アルファアミラーゼである。他の態様において、アルファアミラーゼは糸状菌又はバクテリアアルファアミラーゼの誘導体、突然変異体、変異体である。本発明に有用な追加的なアルファアミラーゼの例としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）株由来のアルファアミラーゼを含む前述のアルファアミラーゼを含む。
幾つかの好適な態様において、アルファアミラーゼはバチルス．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス．ステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びこれらのハイブリッド、突然変異体、及び変異体を含む（ＵＳＰ５，７６３，３８５；ＵＳＰ ５，８２４，５３２；ＵＳＰ ５，９５８，７３９；ＵＳＰ ６，００８，０２６、及びＵＳＰ６，３６１，８０９)。これらのアミラーゼの幾つかは市販されており、例えば、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／ＳのＴＥＲＭＡＭＹＬ及びＳＵＰＲＡ、ＤｉｖｅｒｓａのＵＬＴＲＡＴＨＩＮ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ のＬＩＱＵＥＺＹＭＥ ＳＣ、及びＤａｎｉｓｃｏ ＵＳ，Ｉｎｃ，ＧＥＮＥＮＣＯＲ ＤｉｖｉｓｉｏｎのＳＰＥＺＹＭＥ ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ ＸＴＲＡ、 及びＧＺＹＭＥ Ｇ９９７がある。
他の態様において、本発明は本発明の工程に用いられるフィターゼと同じか異なる、第二のフィターゼを添加してもよい。フィターゼについての議論で開示されている任意のフィターゼを用いることができる。
セルラーゼはアルファアミラーゼ及びグルコアミラーゼに取り込まれる。セルラーゼはセルロース（β−１，４−Ｄ−グルカン結合）及び／又はリン酸膨張セルロース等のこれらの誘導体を加水分解する酵素組成物である。セルラーゼはエキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）（ＥＣ３．２．１９１、ＥＣ３．２．１．４、及びＥＣ３．２．１．２１）のクラスも含む。セルラーゼの例としては、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、セルロモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、 クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）及び アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のセルラーゼを含む。飼料用として販売されているセルラーゼはＲＯＶＡＢＩＯ（Ａｄｉｓｓｅｏ）、ＮＡＴＵＧＲＡＩＮ（ＢＡＳＦ）、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ ＢＧＬ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ，Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ)等のベータグルカナーゼ、及びＥＣＯＮＡＳＥ(ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ)等のベータグルカナーゼがある。
キシラナーゼは方法工程に含まれる。キシラン骨格鎖を加水分解するキシラナーゼ（例えば、エンド−β−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８））はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、アシドーサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ミクロテトラプソラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｐｓｏｒａ）又はセルモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ）等のバクテリア源由来でもよい。追加的なキシラナーゼはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、又は フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）(例えば、ＥＰ４７３５４５；ＵＳＰ５，６１２，０５５； ＷＯ９２／０６２０９；及びＷＯ９７／２０９２０)等の糸状菌由来である。市販の調製物はＭＵＬＴＩＦＥＣＴ及びＦＥＥＤＴＲＥＡＴ Ｙ５（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ， Ｉｎｃ， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ ＷＸ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、及びＮＡＴＵＧＲＡＩＮ ＷＨＥＡＴ (ＢＡＳＦ)を含む。
プロテアーゼを本発明の方法に含んでいてもよい。プロテアーゼはバチルス．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、及びバチルス．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のＢａｃｉｌｌｕｓ由来でもよい。これらの源はバチルス．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られたスブチリシン及びこれらの変異体等のスブチリシンを含む（ＵＳＰ４，７６０，０２５）。好適な市販のプロテアーゼはＭＵＬＴＩＦＥＣＴ Ｐ３０００（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ， Ｉｎｃ．， Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）及びＳＵＭＩＺＹＭＥ ＦＰ （Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ）を含む。プロテアーゼはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）等の糸状菌由来でもよい。幾つかの好適な他の態様において、酸糸状菌プロテアーゼが本発明の方法で用いられる。１つの態様において、この酸糸状菌プロテアーゼはＷＯ０６／０７３８３９に記載の酸糸状菌プロテアーゼである。
実施例
実施例
本発明は以下の実施例でより詳細に説明される。これらの実施例は特許請求の発明を限定する目的で用いるものではない。添付の図は明細書の一部であり、本発明を説明するものである。本明細書に記載の全ての文献は参照により本明細書に援用される。以下の実施例は例示的なものであり、発明の範囲を限定するものではない。
以下の開示及び実験の記載において、以下の略語を用いる：ｗｔ％(重量パーセント)；℃（摂氏）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過）；ｇ又はｇｍ（グラム）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｌ（マイクロリットル）；ｍＬ及びｍｌ（ミリリットル）；μｍ （マイクロメーター）；Ｍ (モル)；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；Ｕ（単位）； ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）； ｈｒ（ｓ）（時間）；ＤＯ（溶存酸素）； Ｗ／Ｖ（重量対容量）；Ｗ／Ｗ（重量対重量）；Ｖ／Ｖ（容量対容量）；ＩＫＡ（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．２６３５ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈａｓｅ Ｐａｒｋｗａｙ ＳＥ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）；Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；Ｎｃｍ（Ｎｅｗｔｏｎ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ）；ＥＴＯＨ （エタノール）；ｅｑ（等しい）；Ｎ（ノルマル）；ｄｓ又はＤＳ （乾燥固形含量）；ＳＡＰＵ (光学的酸性プロテアーゼ単位：１ＳＡＰＵはアッセイ条件下で１分間にカゼイン基質から１マイクロモルのチロシンを遊離させることができるプロテアーゼの活性である)；ＧＡＵ (グルコアミラーゼ単位：ｐＨ４．２及び６０℃で、可溶性デンプン基質から、グルコースとして計算される１ｇの還元糖を１時間に生産する酵素の量)。
方法
粘度測定：ガラスクッカー粘度計、ＬＲ−２．ＳＴシステムＩＫＡを用いて粘度を決定した。簡単に説明すると、この粘度計はＥｕｒｏｓｔａｎ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ パワーコントロール粘度計（Ｖｉｓｃｏｋｌｉｃｋ粘度計の測定粘度範囲は０−６００Ｎｃｍ）により撹拌されるアンカーミキサーを有する２０００ｍｌの二重壁ガラス管で構成される。本明細書で開示さているように、例えば、デンプンと所定の酵素とを含むスラリーをこの反応管の中に注ぐ。８５℃まで加熱する間、温度と粘度を記録して、そこから、６０乃至１２０分間インキュベートを続けた。Ｎｃｍとして測定される粘度を定期的に記録した。
粘度測定：ガラスクッカー粘度計、ＬＲ−２．ＳＴシステムＩＫＡを用いて粘度を決定した。簡単に説明すると、この粘度計はＥｕｒｏｓｔａｎ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ パワーコントロール粘度計（Ｖｉｓｃｏｋｌｉｃｋ粘度計の測定粘度範囲は０−６００Ｎｃｍ）により撹拌されるアンカーミキサーを有する２０００ｍｌの二重壁ガラス管で構成される。本明細書で開示さているように、例えば、デンプンと所定の酵素とを含むスラリーをこの反応管の中に注ぐ。８５℃まで加熱する間、温度と粘度を記録して、そこから、６０乃至１２０分間インキュベートを続けた。Ｎｃｍとして測定される粘度を定期的に記録した。
本明細書の幾つかの実施例で用いるフィターゼは、配列番号１で定義されるブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ）フィターゼ、ＢＰ−１７である（２００７年３月６日に出願されたＵＳ特許出願１１／７１４，４８７も参照）。該文献を参照により本明細書に援用する。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による糖質解析
オリゴサッカライドの反応生成物の組成は屈折率検出器（ＲＩ）（ＥＲＣ−７５１５Ａ、ＲＩ検出器（Ａｎｃｐｅｃ Ｃａｍｐｏｎｙ Ｉｎｃ．）を装着し、５０℃に維持されたＨＰＬＣカラム（Ｒｅｚｅｘ ８ｕ８％、モノサッカライド）を備えたベックマンシステム、Ｇｏｌｄ３２Ｋａｒａｔ（Ｆｕｌｌｅｒｔａｎ，ＣＡ）により測定した。糖類は分子量に基づいて分離した。ＤＰ１はグルコース等の単糖である。ＤＰ２はマルトース等の二糖を示す。ＤＰ３はマルトトリオース等の三糖を示す。ＤＰ４＋は重合度（ＤＰ）が４以上のオリゴサッカライドを示す。
オリゴサッカライドの反応生成物の組成は屈折率検出器（ＲＩ）（ＥＲＣ−７５１５Ａ、ＲＩ検出器（Ａｎｃｐｅｃ Ｃａｍｐｏｎｙ Ｉｎｃ．）を装着し、５０℃に維持されたＨＰＬＣカラム（Ｒｅｚｅｘ ８ｕ８％、モノサッカライド）を備えたベックマンシステム、Ｇｏｌｄ３２Ｋａｒａｔ（Ｆｕｌｌｅｒｔａｎ，ＣＡ）により測定した。糖類は分子量に基づいて分離した。ＤＰ１はグルコース等の単糖である。ＤＰ２はマルトース等の二糖を示す。ＤＰ３はマルトトリオース等の三糖を示す。ＤＰ４＋は重合度（ＤＰ）が４以上のオリゴサッカライドを示す。
フィターゼ活性（ＦＴＵ）は無機リン酸の放出により測定する。無機リン酸はモリブデン酸塩／バナジウム酸塩、試薬と黄色い複合体を形成し、この黄色い複合体が比色計の４１５ｎｍの波長で測定され、放出された無機リン酸がリン酸標準曲線を用いて定量化される。フィターゼの１単位（ＦＴＵ）はヨーロッパ標準における反応条件（ＣＥＮ／ＴＣ３２７、２００５−ＴＣ３２７ＷＩ００３２７０ＸＸ）下で１分当たりにフィチン酸塩から１マイクロモルの無機リン酸を放出することができる酵素の量である。
フィチン酸含量
フィチン酸は５％スラリー（乾燥サンプルの場合）のｐＨをｐＨ１０に調製したサンプルから抽出して、イオン交換カラムを用いてＨＰＬＣ法で検出した。フィチン酸はＮａＯＨ勾配システム（Ｍｉｋｅ ペプチドｐ新ｆｏｒＨＰＬＣ ｓｏｕｒｃｅ）を用いてカラムから溶出させた。液体中のフィチン酸含量をその後フィチン酸標準と比較することにより計算した。
フィチン酸は５％スラリー（乾燥サンプルの場合）のｐＨをｐＨ１０に調製したサンプルから抽出して、イオン交換カラムを用いてＨＰＬＣ法で検出した。フィチン酸はＮａＯＨ勾配システム（Ｍｉｋｅ ペプチドｐ新ｆｏｒＨＰＬＣ ｓｏｕｒｃｅ）を用いてカラムから溶出させた。液体中のフィチン酸含量をその後フィチン酸標準と比較することにより計算した。
アルファアミラーゼ活性（ＡＡＵ）
アルファアミラーゼ活性（ＡＡＵ）は分光光度敵に測定されるヨード染色が減少することに反映される、デンプンの加水分解の速度により決定される。バクテリアアルファアミラーゼ活性の１ＡＡＵは標準的な条件下で１分間当たりデンプン１０ｍｇを加水分解するのに必要な酵素の量である。
アルファアミラーゼ活性（ＡＡＵ）は分光光度敵に測定されるヨード染色が減少することに反映される、デンプンの加水分解の速度により決定される。バクテリアアルファアミラーゼ活性の１ＡＡＵは標準的な条件下で１分間当たりデンプン１０ｍｇを加水分解するのに必要な酵素の量である。
アルファアミラーゼ活性はデンプン可溶性単位（ＳＳＵ）として決定され、ｐＨ４．５、５０℃で酵素サンプルのアリコートにより可溶性ポリマーテルデンプン基質（４％ＤＳ）の程度に基づいている。還元糖含量はＭｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．（１９５９）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３１：４２６−４２８に記載のＤＮＳ法を用いて測定する。
グルコアミラーゼ活性単位（ＧＡＵ）はＰＮＰＧアッセイをもちいて決定される。ＰＮＰＧアッセイはｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）をグルコース及びｐ−ニトロフェノールに加水分解すること触媒するグルコアミラーゼの能力に基づいている。アルカリ性ｐＨにおいて、ニトロフェノールは黄色に呈色し、４００ｎｍを分光光度計で測定して、ＧＡＵを計算する。１グルコアミラーゼ単位はアッセイのための特定の条件下で、可溶性デンプン基質からグルコースとして計算される還元糖１グラムを放出する酵素の量である。
実施例１：アルファアミラーゼ熱安定性のおけるフィチン酸抑制の除去効果
実施例１：アルファアミラーゼ熱安定性のおけるフィチン酸抑制の除去効果
液化熱安定性アルファアミラーゼの熱安定性の増加におけるフィチン酸抑制を除去することをこの実施例で研究する。
全粒粉砕コーン（Ｂａｄｇｅｒ Ｓｔａｔｅ Ｅｔｈａｎｏｌ，Ｍｏｎｒｏｎ，ＷＩより入手）のスラリーを５０％ｖ／ｖ低濃度処理残査を含む水と混合して、約３２％ｄｓの最終濃度にした。コーン固形物は二重釜の中で調製された。このスラリーはよく混合され、スラリーのｐＨは５．８に調整された。このｐＨは炭酸ナトリウム又は水酸化ナトリウムを用いた市販のエタノールプロセスの液化で用いるｐＨである。このスラリーを二重釜の中でよく混合し、前処理温度の６０乃至７０℃にした。７０℃になる直前に、液化酵素ＳＰＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ（乾燥コーン１グラム当たり１０ＡＡＵ）又はバチルス．ステアロセレモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ）由来の遺伝的に修飾されたアルファアミラーゼを加え、タイマーをクタートさせ、インキュベーション又は一次液化工程をスタートさせた。このスラリーをフィターゼ添加又は無添加の酵素（乾燥コーン１グラム当たり１２ＦＴＵ）の存在下で、４０分インキュベートした。インキュベーションしたスラリーをスチーム及び水を用いて所望の温度に予備加熱した、ジェットクッカー（８２―１０７℃）を通した。このスラリーを約４リットル／分の最大スピード（１．５セット）ジャケットを通して送った。ホールドコイルの最初の３ループを用いて、ホールド時間が３分以上になるようにした。全ての水が置き換わり、所望の温度に安定したときに、可溶化させたコーンマッシュのアリコートを収集し、８０℃の第二バスの中に置き、第二液化工程を開始した。０、３０、６０、及び９０分にサンプルを採取し、粘度（ブルックフィールド）、ブリックス、及びＤＥ（Ｓｃｈｏｏｒｌｓ）を測定した。得られた結果を表３にまとめた。
インキュベーション（第一液化）の間に、ＢＰ−１７フィターゼを添加すると、全粒コーンのフィチン酸含量が０．６０％ｄｓから０．０９％ｄｓコーン（＞８５％減少）に減らされた。表３のデータからＤＥ生成及び粘度減少からアルファアミラーゼは１７０℃のスチーム処理の温度で失活することが明らかである。しかしながら、ジェットクック前にフィターゼを添加すると、フィチン酸抑制を除去するようであり、第二液化工程の８５℃でＤＥ生成及び粘度減少により示されるように、アルファアミラーゼの熱安定性が有意に高くなった。
実施例２ アルファアミラーゼｐＨ安定性におけるフィチン酸抑制の除去の影響
アルファアミラーゼのフィチン酸抑制による熱安定性の上昇を更に研究する。フィチン酸は全粒コーンの第二液化の前にフィターゼを用いて加水分解し、低ｐＨにおけるｐＨ安定性の改善を決定した。
アルファアミラーゼのフィチン酸抑制による熱安定性の上昇を更に研究する。フィチン酸は全粒コーンの第二液化の前にフィターゼを用いて加水分解し、低ｐＨにおけるｐＨ安定性の改善を決定した。
典型的な実験において、全粒粉砕コーンを５０：５０の水と低濃度処理残渣を用いて３２％（乾燥コーン）のスラリーを得た。このスラリーｐＨを測定し、ｐＨ５．１５であることを確認した。二重釜中で、水蒸気を用いて、７０℃まで加熱した。この液化酵素、ＳＰＥＺＹＭＥ Ｘｔｒａ及びＢＰ−１７をこのスラリーに加え、このスラリーを７０℃で４０分間維持し、予備加熱した。４０分の予備加熱の後、このスラリーを大容量のパイロットプラントジャケット（Ｍ１０３水熱ヒーターを備えた）を用いて、３分間のホールド時間で、１７０℃の維持したジェットクックを通した。液化物をジェットから収集し、８５℃のウォーターバス中に置いた。アルファアミラーゼの第二投与分を添加し、加水分解を完了した。
液化物を連続的に撹拌し、８５℃で９０分間維持した。サンプルを０、３０、６０、及び９０分に収集した。全てのサンプルをブリックス、ＤＥ（スカラー法を用いて）、及び粘度（２０ｒｐｍのブルックフィールド粘度計スピンドル）を測定した。この液化実験はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）エチル及びＢＰ−１７を用いて行った。ＤＥプログレッション及び粘度のデータを表４にまとめた。
表４は、ｐＨ調整を行わない全粒粉砕コーンの液化工程の間のＤＥプログレッションと粘度の低下を示す。
表３及び表４の結果は、全粒粉砕コーンの１７０℃での高温ジェットクッキングの前に、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ及びＳＰＥＺＹＭＥ（商標）エチルのフィチン酸抑制を減少させると、液化工程の粘度の減少に付随する８５℃でのＤＥプログレッションが安定して上昇した。このことにより証明されるように、活性の低ｐＨ安定性が有意に上昇した。このデータは、明らかにＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａ又はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）エチルはフィチン酸抑制が排除された場合には、ｐＨ５．２における全粒粉砕コーンの液化に有利に用いることができることを示している。
実施例３ アルファアミラーゼのｐＨ安定性における他のフィターゼの使用の影響
ダニスコＰｈｙｚｙｍｅ（商標）ＸＰ５００（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＤＳＭ、オランダのＤＳＭ Ｐｈｙｔａｓｅ Ｌ（アスペルギルスニガー）等の市販の微生物フィターゼも、フィチン酸抑制の除去について第一液化工程で試験をした。液化トライアルは、１０ＡＡＵ／ｇｄｓのＳＰＥＺＹＭＥ（商標）エクストラ及び１２ＦＴＵ／ｇｄｓのフィターゼを用いて、実施例１のように行った。液化サンプルを採取し、残余フィチン酸含量を測定した。ｐＨ５．２でのＤＥ生成、粘度減少、及びフィチン酸抑制を表５に示す。
ダニスコＰｈｙｚｙｍｅ（商標）ＸＰ５００（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＤＳＭ、オランダのＤＳＭ Ｐｈｙｔａｓｅ Ｌ（アスペルギルスニガー）等の市販の微生物フィターゼも、フィチン酸抑制の除去について第一液化工程で試験をした。液化トライアルは、１０ＡＡＵ／ｇｄｓのＳＰＥＺＹＭＥ（商標）エクストラ及び１２ＦＴＵ／ｇｄｓのフィターゼを用いて、実施例１のように行った。液化サンプルを採取し、残余フィチン酸含量を測定した。ｐＨ５．２でのＤＥ生成、粘度減少、及びフィチン酸抑制を表５に示す。
表５は全粒粉砕コーンを用いて、ｐＨ調整をしていない液化の間の異なる市販フィターゼの比較を示す。
表５のデータはＥ．ｃｏｌｉ（ｐｈｙｚｙｍｅ（商標）ＸＰ５００）又はアスペルギルスニガー（ＤＭＳＰｈｙｔａｓｅ（商標）Ｌ）由来のフィターゼが、全粒粉砕コーンスラリーの第一液化でこれらが添加されたときに、ＢＰ−１７フィターゼ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ）と同様に、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｅｔｈｙｌを安定化させることを示している。
実施例４ エタノール生成の影響
液化物はアルコール生成のための、エタノール発酵における発酵原料として用いた。第一液化工程において、フィターゼを添加していないｐＨ５．８で、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａからの液化物―１（５０％低濃度処理残渣を含む３２％ｄｓコーン）を用いた。第一液化工程で、フィターゼ処理をした、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａを用いた、実施例２からの液化物も用いた。液化物―１のｐＨは、従来のエタノールプロセスにおける希釈硫酸を用いて、４．２に調整した。一方、実施例２からの液化物はｐＨ調整を行わないで用いた。実施例２からの液化物は本発明の方法におけるｐＨ調整を行わない実験として用いた。各実験において、媒体（溶媒）を調整する前に、反応管の風袋重量を測定した。３２％ＤＳコーンｄｓ液化物（２リットル）を２Ｌフラスコに入れた。ＲｅｄＳｔａｇｅエタノールＲｅｄ酵母（ＲＥＤ ＳＴＡＲ（Ｌａｓａｆｆｒｅ）ｉｎｏｃｕｌｕｍｓ）接種材料を、１０グラムの酵母と１グラムのグルコースとを４０グラムの水に添加して、１時間ゆるやかに撹拌して調整した。各接種物５ｍｌを平衡化した発酵槽に添加して、次いで、０．４ＧＡＵ／ｇｄｓ．コーンのＧＺｙｍｅ（商標）４８０エタノール（ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコア デビジョン）を添加して、糖化と発酵とを同時に開始した。初期の総重量を記録し、フラスコを３２℃に維持した。水浴中に置いた。このサンプルを異なる時間で採取し、ＨＰＬＣを用いて、炭化水素及びエタノール含量を解析した。各液化物の１キロガロンを用いて、発酵も実施し、発酵の間の重量ロスを異なる時間間隔で測定した。炭酸のロスに依存する重量ロスに基づいてアルコールを測定した（表６）。発酵の終了時に、最終総重量を測定した。同じ量の両者を５Ｌの丸底反応管に移した。減圧下で蒸留を行って、２００ｍｌの水を含む容器に、約８００ｍｌのエタノールを収集するまで、蒸留を行った。エタノールを２Ｌに希釈し、ＨＰＬＣで解析した。重量を測定し、ボトムに残っているＤＳを乾燥前に採取した。残りのデンプン解析をＤＤＧＳに基づいて行った。重量ロス、蒸留、及び残りのデンプン解析に基づいて、化学平衡量論的計算を行った。
液化物はアルコール生成のための、エタノール発酵における発酵原料として用いた。第一液化工程において、フィターゼを添加していないｐＨ５．８で、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａからの液化物―１（５０％低濃度処理残渣を含む３２％ｄｓコーン）を用いた。第一液化工程で、フィターゼ処理をした、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）Ｘｔｒａを用いた、実施例２からの液化物も用いた。液化物―１のｐＨは、従来のエタノールプロセスにおける希釈硫酸を用いて、４．２に調整した。一方、実施例２からの液化物はｐＨ調整を行わないで用いた。実施例２からの液化物は本発明の方法におけるｐＨ調整を行わない実験として用いた。各実験において、媒体（溶媒）を調整する前に、反応管の風袋重量を測定した。３２％ＤＳコーンｄｓ液化物（２リットル）を２Ｌフラスコに入れた。ＲｅｄＳｔａｇｅエタノールＲｅｄ酵母（ＲＥＤ ＳＴＡＲ（Ｌａｓａｆｆｒｅ）ｉｎｏｃｕｌｕｍｓ）接種材料を、１０グラムの酵母と１グラムのグルコースとを４０グラムの水に添加して、１時間ゆるやかに撹拌して調整した。各接種物５ｍｌを平衡化した発酵槽に添加して、次いで、０．４ＧＡＵ／ｇｄｓ．コーンのＧＺｙｍｅ（商標）４８０エタノール（ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコア デビジョン）を添加して、糖化と発酵とを同時に開始した。初期の総重量を記録し、フラスコを３２℃に維持した。水浴中に置いた。このサンプルを異なる時間で採取し、ＨＰＬＣを用いて、炭化水素及びエタノール含量を解析した。各液化物の１キロガロンを用いて、発酵も実施し、発酵の間の重量ロスを異なる時間間隔で測定した。炭酸のロスに依存する重量ロスに基づいてアルコールを測定した（表６）。発酵の終了時に、最終総重量を測定した。同じ量の両者を５Ｌの丸底反応管に移した。減圧下で蒸留を行って、２００ｍｌの水を含む容器に、約８００ｍｌのエタノールを収集するまで、蒸留を行った。エタノールを２Ｌに希釈し、ＨＰＬＣで解析した。重量を測定し、ボトムに残っているＤＳを乾燥前に採取した。残りのデンプン解析をＤＤＧＳに基づいて行った。重量ロス、蒸留、及び残りのデンプン解析に基づいて、化学平衡量論的計算を行った。
ＣＯ２重量ロスを用いたエタノール計算：
エタノール生成（ｍｍｏｌ）＝ＣＯ２ロス（ｇ）／８８
エタノール生成（ｇ）＝（ＣＯ２ロス（ｇ）／８８）＊９２＝＞ＣＯ２ロス（ｇ）＊１．０４５
エタノール生成（ｍｌ）＝（（ＣＯ２ロス（ｇ）／８８）＊９２）／０．７８９
＝＞ＣＯ２ロス（ｇ）ｘ１．３２５
エタノール生成（ｍｍｏｌ）＝ＣＯ２ロス（ｇ）／８８
エタノール生成（ｇ）＝（ＣＯ２ロス（ｇ）／８８）＊９２＝＞ＣＯ２ロス（ｇ）＊１．０４５
エタノール生成（ｍｌ）＝（（ＣＯ２ロス（ｇ）／８８）＊９２）／０．７８９
＝＞ＣＯ２ロス（ｇ）ｘ１．３２５
表６ 本発明のｐＨ調整しない方法と従来の液化工程由来のＤＤＧＳの比較
表６のデータは従来方法と本発明のｐＨ調整しない方法との間の有利硫酸をフィチン酸含量における主な違いを示している。インキュベーションにおける熱安定アルファアミラーゼのフィチン酸抑制の除去は、減らされたフィチン酸含量、高い利用可能なリン酸、及び減らされた硫酸を伴うＤＤＧＳとなった。従って、ｐＨ調整を行わない方法は、デンプンの液化において、熱安定性アルファアミラーゼの液化において、低ｐＨでのｐＨ安定性を付与する。
本明細書において言及されている全ての刊行物及び特許は参照により本明細書に援用されている、説明された方法及び本発明のシステムの、各種修飾及び変更は本発明の範囲及び精神を逸脱せずに当業者が行うことができるだろう。特定の好適な態様を用いて本発明を説明してきたけれども、本発明はこのような態様に限定されるものではない。即ち、本発明を実施する説明された態様の各種変更は当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内である。
Claims (18)
- ｐＨ調製をしない液化工程を含む、デンプン処理の方法。
- 前記液化工程が約４．５乃至５．４の範囲のｐＨで行われる、請求項１の方法。
- デンプンを発酵性糖に転化する糖化工程、及びｐＨ調整をしないで発酵性糖からアルコールを生成する工程を更に含む、請求項１の方法。
- デンプンから発酵性糖を生成する方法であって、
（ａ）デンプンを水と低濃度処理残渣と混合してスラリーを得る工程
（ｂ）このスラリーをフィターゼで処理する工程
（ｃ）このデンプンを液化する工程
（ｄ）アルファアミラーゼを添加する工程
（ｅ）液化されたデンプンを糖化して発酵性糖を得る工程、ここで、ｐＨ調整を上記いずれの工程においても行わないことを特徴とする方法。 - 前記低濃度処理残渣が約１０乃至７０％ｖ／ｖの範囲である、請求項４の方法。
- このスラリーが約２０乃至５０％ｖ／ｖの乾燥固形含量である、請求項４の方法。
- フィターゼがデンプンの液化工程の前に、又はこの工程と同時に添加される、請求項４の方法。
- このフィターゼがブチラキセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ）ＢＰ−１７フィターゼに対して少なくとも７５％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項４の方法。
- このデンプンが約４．５乃至５．４の範囲のｐＨで液化される、請求項４の方法。
- 前記アルファアミラーゼが工程（ｂ）及び／又はデンプンの液化工程において添加される、請求項４の方法。
- 更に、発酵性糖を精製及び／又は異性化する工程を更に含む請求項４の方法。
- 前記発酵性糖を精製及び／又は異性化する工程を更に含む、請求項４の方法。
- セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ベータアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータグルカナーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスフェラーゼ、又はこれらの任意の組み合わせをデンプンの液化の間に、混合する工程を更に含む、請求項４の方法。
- 前記デンプンがコーン、コムギ、ライムギ、オオムギ、ソルガム、及びこれらの任意の組み合わせである請求項４の方法。
- デンプンがコーン又はコーンマッシュである、請求項４の方法。
- デンプンからアルコールを製造する方法であって、
（ａ）デンプンを水及び低濃度処理残渣と混合してスラリーを得る工程
（ｂ）スラリーをフィターゼで処理する工程
（ｃ）デンプンを液化する工程
（ｄ）液化したデンプンを糖化して発酵性糖を得る工程
（ｅ）発酵性微生物を用いて発酵性糖を発酵してアルコールを得る工程、
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）のいずれの工程においてもｐＨ調製を行わないことを特徴とする、方法。 - 糖化及び発酵工程を同時に行うことを特徴とする、請求項１６の方法。
- アルコールがエタノールである、請求項１６の方法。
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