KR20010015754A

KR20010015754A - α-아밀라제 변이체

Info

Publication number: KR20010015754A
Application number: KR1020007003941A
Authority: KR
Inventors: 스벤센알란; 보르체르트토르벤베델; 비스가르트-프란젠헨리크
Original assignee: 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느; 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 1997-10-13
Filing date: 1998-10-13
Publication date: 2001-02-26
Also published as: DK2206768T3; CA2305191C; JP4358431B2; ES2536878T3; EP2302027A2; EP2302027A3; AR017331A1; CA2745783C; EP2206768A3; EP2206768B1; EP1023439A1; EP1023439B1; CA2745783A1; ES2322825T3; ATE423192T1; CA2305191A1; DE69840577D1; US6187576B1; EP2206768A2; ES2436066T3

Abstract

본 발명은 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 지역/위치의 돌연변이를 포함하는, 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 변이체에 관련된 것이다. 변이체는 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도(부모에 비하여)에서 열안정성이 증가하였다. 본 발명은 또한 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체, 본 발명의 DNA 구조체를 운반하는 재조합 발현 벡터, 본 발명의 DNA 구조체에 의해 형질전환된 세포, 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 포함하는 세탁 및/또는 식기세척, 섬유 풀빼기, 녹말 액화, 세제 첨가제를 위한 본 발명의 α-아밀라제 변이체의 용도, 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 포함하는 수동 또는 자동 식기세척 세척제 조성물, (부모에 비하여) 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 증가된 열안정성을 보이는 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제 변이체의 생산방법에 관련된 것이다.

Description

α-아밀라제 변이체 {α-AMYLASE MUTANTS}

α-아밀라제 (α-1,4-글루칸-4-글루카노히드롤라제, EC 3.2.1.1)는 녹말과 기타 선형 및 분지형 1,4-글루코시딕 올리고- 및 다당류의 가수분해를 촉매하는 효소의 그룹을 구성한다.

산업적으로 매우 중요한 이 효소군에 관련된 특허 및 과학 문헌은 매우 방대하다. Termamyl 유사 α-아밀라제 변이체와 같은 수 많은 α-아밀라제는 예컨데 WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 및 WO 96/23874에 알려져 있다.

α-아밀라제에 관련된 보다 최근 개시들 중에서, WO 96/23874는 B. amyloliquefaciens α-아밀라제의 300 N-말단 아미노산 잔기와 아미노산 서열을 포함하는 B. licheniformis α-아밀라제의 C-말단의 301-483 아미노산 (후자는 Termamyl이라는 상표명으로 시중 구입 가능하다)으로 구성되는 Termamyl 유사 α-아밀라제에 대한 삼차원적 X-선 크리스탈 구조 수치를 제공하고, 따라서 산업적으로 중요한 Bacillus α-아밀라제 (본 문맥에서 Bacillus α-아밀라제는, 특히 B. licheniformis, B. amyloliquefaciens 및 B. stearothermophilus α-아밀라제를 포함하는 "Termamyl 유사 α-아밀라제" 용어의 의미를 포함하는 것이다)에 밀접하게 관련이 있다. WO 96/23874는 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 구조 분석의 기초 위에서, 부모에 비하여 변형된 특성을 보이는 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 변이체 디자인에 대한 방법론을 더 기술한다.

WO 95/35382 (Gist Brocades B.V.)는 사용에 있어서 효소 성능의 저하없이 Ca²⁺농도의 감소를 허용하는 향상된 특성을 지닌 B. licheniformis로부터 유래한 아밀로분해 효소에 관련된 것이다. 아밀로분해 효소는 B. licheniformis α-아밀라제 서열의 104, 128, 187, 188의 군으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산의 변화를 포함한다.

WO 96/23873 (Novo Nordisk)는 여기의 SEQ ID NO: 1에 나타낸 서열의 R181^*, G182^*, T183^*및 G184^*지역에서 쌍으로 결실하여 얻은 열안정성이 증가된 Termamyl 유사 α-아밀라제 변이체를 개시한다.

본 발명은 변이체의 산업적 녹말 가공의 응용에 있어서 특히 유리한 (예컨대 녹말 액화 또는 당화), (부모에 비하여) 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 현저히 증가된 열안정성을 보이는, 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 새로운 변이체에 특히 관련된 것이다.

도 1은 본 발명의 본문에 있는 여섯 개의 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 아미노산 서열의 배열이다. 가장 좌측에 있는 번호는 다음과 같은 각 아미노산 서열을 지시한다.

1: SEQ ID NO: 2,

2: Kaoamyl,

3: SEQ ID NO: 1,

4: SEQ ID NO: 5,

5: SEQ ID NO: 4,

6: SEQ ID NO: 3.

본 발명의 간단한 개시

본 발명은 특히 녹말의 산업적 가공 (녹말 액화, 당화 등)에 있어서 (부모에 비하여) 유리한 증가된 열안정성을 보이는 특이한 변이체인, 새로운 Termamyl 유사 α-아밀라제의 α-아밀로분해 변이체 (돌연변이체)에 관련된 것이다.

본 발명가들은 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 돌연변이 (하기에서 기술 됨)를 결합하는 경우에, Termamyl 유사 α-아밀라제의 열안정성이 WO 96/23873 (Novo Nordisk)에서 개시된 돌연변이와 같은 단일 돌연변이, 즉 여기의 SEQ ID NO: 1에 나타낸 서열의 R181^*, G182^*, T183^*및 G184^*지역에서의 쌍으로 결실,에 비하여 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 증가되는 것을 발견하였다.

본 발명은 본 발명의 변이체를 암호화하는 DNA 구조체, 본발명의 변이체를 포함하는 조성물, 본 발명의 변이체를 제조하는 방법, 및 본 발명의 변이체 및 조성물을 단독으로 또는 다른 α-아밀로분해 효소와 조합으로 예컨대 녹말 액화와 같은 다양한 산업적 공정의 용도에 더욱 관련된 것이다.

본 발명의 상세한 개시

Termamyl 유사 α-아밀라제

Bacillus spp.에 의하여 생산되는 수 많은 α-아밀라제가 아미노산 레벨에서 상당히 상동성이 있다는 사실은 잘 알려져 있다. 예를들면, SEQ ID NO: 4 (Termamyl™으로 시중 구입 가능하다)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 B. licheniformis α-아밀라제는 SEQ ID NO: 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 B. amyloliquefaciens α-아밀라제와 대략 89%의 상동성을 지니며, SEQ ID NO: 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 B. stearothermophilus α-아밀라제와 79%의 상동성을 지닌다는 것이 발견되었다. 더욱 상동성있는 α-아밀라제는 WO 95/26397 에서 상세히 기술된 Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 또는 DSM 9375의 세균주로부터 유래한 α-아밀라제 및 Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31에서 기술된 α-아밀라제를 포함한다.

역시 더욱 상동성 있는 α-아밀라제는 EP 0252666 (ATCC 27811)에서 기술된 B. licheniformis 세균주에 의하여 생산된 α-아밀라제 및 WO 91/00353와 WO 94/18314에서 확인된 α-아밀라제를 포함한다. 다른 상업용 Termamyl 유사 B. licheniformis α-아밀라제는 Optitherm™ 및 Takatherm™ (Solvay로부터 획득 가능), Maxamyl™ (Gist-brocades/Genencor로부터 획득 가능), Spezym AA™ 및 Spezyme Delta AA™ (Genencor로부터 획득 가능), 및 Keistase™ (Daiwa로부터 획득 가능)이다.

이들 α-아밀라제 사이에서 발견되는 실질적 상동성 때문에, 이들은 동일한 과의 α-아밀라제, 즉 "Termamyl 유사 α-아밀라제" 과에 속하는 것으로 간주된다.

따라서, 본문에서는, "Termamyl 유사 α-아밀라제" 용어는, 아미노산 레벨에서, Termamyl™과 실질적 상동성을 나타내는 α-아밀라제, 즉 여기의 SEQ ID NO: 4에서 나타낸 아미노산 서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제를 지시하기 위한 것이다. 환언하면, Termamyl 유사 α-아밀라제는 여기의 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 및 WO 95/26397의 SEQ ID NO: 1 (여기의 SEQ ID NO: 7과 동일) 또는 WO 95/26397의 SEQ ID NO: 2 (여기의 SEQ ID NO: 8에서 나타낸 아미노산 서열과 동일) 또는 Tsukamoto et al., 1988, (이 아미노산 서열은 여기의 SEQ ID NO: 6에서 나타낸다)에서 나타낸 아미노산 서열, 또는 ⅰ) SEQ ID NOS 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8에 나타낸 상기의 아미노산 서열중 적어도 하나와 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 바람직하게는 적어도 90%, 보다 특히 더욱 바람직하게는 적어도 95% 상동성을 나타내고, 및/또는 ⅱ) 상기의 α-아밀라제의 적어도 하나에 대한 항체와 면역 교차반응성을 나타내며, 및/또는 ⅲ) 각각 본 출원서의 SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 또는 12 (이 암호화 서열은 여기의 각 SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸 아미노산 서열을 암호화한다), WO 95/26397의 SEQ ID NO: 4 (이 DNA 서열은, 정지코돈인 TAA와 함께, 여기의 SEQ ID NO: 13에 나타나 있고 여기의 SEQ ID NO: 8에 나타낸 아미노산 서열을 암호화한다) 및 WO 95/26397의 SEQ ID NO: 5 (여기의 SEQ ID NO: 14에 나타남)로부터 명백한 상기에 특정된 α-아밀라제를 암호화하는 DNA 서열에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 암호화되는 α-아밀라제이다.

ⅰ) 특성과 관련하여, "상동성"은 모든 통상의 알고리즘, 바람직하게는 3.0의 GAP 신설 페널티(penalty) 및 0.1의 GAP 확장 페널티인 GAP 페널티에 대한 기본 값을 사용한 GCG 팩키지 버전 7.3 (June 1993)의 GAP 프로갬(progamme) (Genetic Computer Group (1991) GCG 팩키지에 대한 프로그램 설명서, 버전 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)의 사용에 의해서 결정된다.

Termamyl 과 Termamyl 유사 α-아밀라제 사이의 구조 배열은 다른 Termamyl 유사 α-아밀라제에서 동등한/대응하는 위치를 확인하는데 사용. 상기 구조 배열을 획득하는 한가지 방법은 gap 페널티의 기본값, 즉 3.0의 gap 신설 페널티 및 0.1의 gap 확장 페널티를 사용한 GCG 팩키지의 Pile Up 프로그램을 사용하는 것이다. 다른 구조 배열 방법은 소수성 무리 (hydrophobic cluster) 분석 (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) 및 역 스레딩(reverse threading) (Huber, T ; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998))을 포함한다.

α-아밀라제의 ⅱ) 특성, 즉 면역 교차 반응성은, Termamyl 유사 α-아밀라제와 관련있는 적어도 하나의 에피톱에 대해 생산된 항체 또는 반응성 항체를 사용하여 분석한다. 단일큰론성이거나 다클론성인 항체는, 예컨대 Hudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publications에 기술된 것과같은, 본 분야에 공지된 방법에 의해서 생산된다. 면역 교차 저항성은 예를들면 웨스턴 블롯팅 또는 방사상 면역확산 (radial immunodiffusion) 분석 , 즉 Hudson et al., 1989에 의해 기술된 것과같은 본 분야에 공지된 분석을 사용하여 결정한다. 이러한 점에서, 각각 아미노산 서열 SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8을 가지는 α-아밀라제 사이의 면역 교차 저항성은 발견되었다.

상기의 ⅲ) 특성과 일치하여 Termamyl 유사 α-아밀라제의 묘사에 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 문제되는 α-아밀라제의 전체 또는 일부 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 기초하에 적절하게 준비된다.

혼성화 시험에 적절한 조건은 5xSSC에 미리 담그고 ~40℃에서 20% 포름아미드, 5xDenhardt's 용액, 50mM 인산나트륨의 용액에서, pH 6.8 및 50mg의 융해하고 소니케이트한 (sonicated) 송아지 흉선 DNA를 1시간 동안 미리 혼성화한 후, 100mM ATP로 보충되는 동일한 용액에서 ~40℃로 18시간동안 혼성화하고, 이어서 40℃에서 (낮은 스트린전시(stringency)), 바람직하게는 50℃ (중간 스트린전시)에서, 더욱 바람직하게는 65℃ (높은 스트린전시)에서, 보다 더욱 바람직하게는 ~75℃ (매우 높은 스트린전시)에서 30분간 2xSSC, 0.2% SDS 내의 필터의 세척을 세번한다. 혼성화 방법에 대한 보다 자세한 사항은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989에서 찾을 수 있다.

본문에서, "유래된 형태"는 문제된 생물의 세균주에 의해서 생산된 또는 생산될 수 있는 α-아밀라제를 지시할 뿐만 아니라, 그러한 세균주로부터 분리된 DNA 서열에 의해 암호화된 α-아밀라제 및 상기 DNA 서열로 형질전환된 숙주 생물에서 생산된 α-아밀라제를 지시한다. 마지막으로, 이 용어는 합성 및/또는 cDNA 오리진 (origin)의 DNA 서열에 의해서 암호화된 α-아밀라제 및 문제된 α-아밀라제의 확인된 특성을 가지는 α-아밀라제를 지시하는 것이다. 이 용어는 또한, 부모 α-아밀라제는 자연에 존재하는 α-아밀라제의 변이체, 즉 자연에 존재하는 α-아밀라제의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형 (삽입, 치환, 결실)의 결과인 변이체,를 지시하려는 것이다.

부모 잡종 α-아밀라제

부모 α-아밀라제는 잡종 α-아밀라제, 즉 적어도 두개의 α-아밀라제로부터 유래된 부분 아미노산 서열의 조합을 포함하는 α-아밀라제이다.

부모 잡종 α-아밀라제는 아미노산 상동성 및/또는 면역 교차 반응성 및/또는 DNA 혼성화 (상기에서 정의된 바와 같은)의 기초하에서 Termamyl 유사 α-아밀라제 과에 속하는지 결정될 수 있다. 이러한 경우, 잡종 α-아밀라제는 전형적으로 적어도 Termamyl 유사 α-아밀라제의 한 부분 및 Termamyl 유사 α-아밀라제 또는 미생물 (박테리아 또는 균류)및/또는 포유동물 오리진의 비-Termamyl 유사 α-아밀라제로부터 선택된 하나 이상의 다른 α-아밀라제로 구성된다.

따라서, 부모 잡종 α-아밀라제는 적어도 두개의 Termamyl 유사 α-아밀라제, 또는 적어도 하나의 Termamyl 유사와 적어도 하나의 비-Termamyl 유사 박테리아 α-아밀라제, 또는 적어도 하나의 Termamyl 유사와 적어도 하나의 균류 α-아밀라제로부터 유래된 부분 아미노산 서열의 조합으로 구성된다. 부분 아미노산 서열로부터 유래된 Termamyl 유사 α-아밀라제는 예컨대, 여기에서 언급된 모든 특정 Termamyl 유사 α-아밀라제이다.

예를들면, 부모 α-아밀라제는 B. licheniformis의 세균주로부터 유래된 α-아밀라제의 C-말단 부분, 및 B. amyloliquefaciens의 세균주 또는 B. stearothermophilus의 세균주로부터 유래된 α-아밀라제의 N-말단 부분을 포함한다. 예를들면, 부모 α-아밀라제는 B. licheniformis α-아밀라제의 C-말단 부분의 적어도 430 아미노산 잔기로 구성되고, 예컨대 a) SEQ ID NO: 5에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 B. amyloliquefaciens α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 단편과 SEQ ID NO: 4에서 나타낸 아미노산 서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 단편, 또는 b) SEQ ID NO: 3에서 나타낸 아미노산 서열을 가지는 B. stearothermophilus α-아밀라제의 68 N-말단 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 단편과 SEQ ID NO: 4에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제의 415 C-말단 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 단편으로 구성된다.

비-Termamyl 유사 α-아밀라제는, 예컨대 균류 α-아밀라제, 포유류 또는 식물 α-아밀라제 또는 박테리아 α-아밀라제 (Termamyl 유사 α-아밀라제와는 다름) 이다. 그러한 α-아밀라제의 구체적 예는 Aspergillus oryzae TAKA α-아밀라제, A. niger acid α-아밀라제, Bacillus subtilis α-아밀라제, 돼지 췌장 α-아밀라제 및 보리 α-아밀라제를 포함한다. 이들 모든 α-아밀라제는 여기에서 언급된 전형적 Termamyl 유사 α-아밀라제의 구조와는 현저하게 다른 구조를 보이고 있다.

상기에서 언급된, 균류 α-아밀라제, 즉 A. niger 및 A. oryzae로부터 유래된,는 아미노산 레벨에서 상당히 상동성이 있고 일반적으로 동일한 α-아밀라제 과에 속하는 것으로 간주된다. Aspergillus oryzae로부터 유래된 균류 α-아밀라제는 Fungamyl™이라는 상표명으로 시중 구입 가능하다.

게다가, 특정 Termamyl 유사 α-아밀라제의 아미노산 서열에서의 특정 아미노산 잔기의 변형 (예컨대 결실 또는 치환)의 언급에 의해서-통상적인 방법으로-Termamyl 유사 α-아밀라제의 특별한 변이체를 언급할 때, 동등한 위치 (각 아미노산 서열 사이에서 가장 가능한 아미노산 서열 배열로부터 결정된)가 변형된 다른 Termamyl 유사 α-아밀라제의 변이체는 그것에 의해서 둘러싸여 지는 것으로 이해된다.

본 발명의 변이체의 바람직한 구체예는 B. licheniformis α-아밀라제 (부모 Termamyl 유사 α-아밀라제와 같은)로부터 유래된 것, 예컨대 SEQ ID NO: 4에 나타낸 아미노산 서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제와 같은 상기에서 언급된 것 중의 하나이다.

본 발명의 변이체의 생산

관심있는 변이체의 생산은 변이체 생산을 유도할 수 있는 환경하에서 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 미생물을 배양함으로서 달성된다. 변이체는 그 후 결과된 배양 액체배지로부터 회수된다. 이것은 아래에 상세히 서술되어 있다.

본 발명의 변이체의 변형된 특성

이하에서는 본 발명의 변이체에 존재하는 돌연변이와 그로부터 결과된 특성 (그들 부모에 비하여, Termamyl 유사 α-아밀라제)의 바람직한 변형 사이의 관계를 논의한다.

산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서의 증가된 열안정성

산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 증가된 열안정성을 가지는 본 발명에 따른 변이체를 획득하는 하는 것과 관련된 특정 관련성의 돌연변이는 다음의 위치에서의 돌연변이를 포함한다 (B. licheniformis α-아밀라제와 관계있는, SEQ ID NO: 4): H156, N172, A181, N188, N190, H205, D207, A209, A210, E211, Q264, N265.

본 발명의 본문에서 용어 "산성 pH"는 pH 7.0 미만, 특히 산업적 녹말 액화 가공이 통상적으로 수행되는, pH 5.5 내지 6.2 사이의 pH 범위 미만을 의미한다.

본 발명의 본문에서 용어 "낮은 칼슘 농도"는 산업적 녹말 액화에 사용되는 보통 레벨 미만의 농도를 의미한다. 보통 농도는 옥수수에 있는 유리 Ca²⁺의 농도에 따라 변화한다. 통상적으로 1mM (40ppm)에 대응되는 투여량은 옥수수가 주는 40 내지 60ppm 사이의 유리 Ca²⁺의 레벨과 함께 추가된다.

본 발명의 본문에서 용어 "높은 온도"는 95℃ 내지 160℃ 사이의 온도, 특히 산업적 녹말 액화 공정이 통상적으로 수행되는 95℃ 내지 105℃ 사이의 온도 범위를 의미한다.

본 발명가들은 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 열안정성은 상기에서 언급된 돌연변이 및/또는 이들 서로서로와 함께 I201을 포함하는 특정 돌연변이를 조합함으로써 더욱 증가될 수 있다는 것을 발견하였다.

상기 "특정" 돌연변이는 다음과 같다 (B. licheniformis α-아밀라제와 관계있는, SEQ ID NO: 4) : N190, D207, E211, Q264 및 I201.

상기 돌연변이는 하나의 결실, 바람직하게는 WO 96/23873에서 기술된 바와 같은 (즉, 여기의 SEQ ID NO: 1에서 R181, G182, T183, G184 위치에서) 둘 또는 심지어 세 위치의 결실이 더 조합될 수 있다. 본 발명에 따라 상기 위치의 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 돌연변이를 포함하는 α-아밀라제 활성을 지니는 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 변이체를 주의깊게 관찰하였다.

아래에서 구체적으로 언급된 Termamyl 유사 α-아밀라제를 주의깊게 관찰한 것 뿐만 아니라 다른 상업용 Termamyl 유사 α-아밀라제도 주의깊게 관찰한 것이 강조된다. 그러한 α-아밀라제의 불완전한 목록이 다음과 같다:

EP 0252666 (ATCC 27811)에 기술된 B. licheniformis 세균주에 의해서 생산되는 α-아밀라제, 및 WO 91/00353 및 WO 94/18314에 밝혀진 α-아밀라제. 다른 상업용 Termamyl 유사 B. licheniformis α-아밀라제는 Optitherm™ 및 Takatherm™ (Solvay로부터 획득 가능), Maxamyl™ (Gist-brocades/Genencor로부터 획득 가능), Spezym AA™ Spezyme Delta AA™ (Genencor로부터 획득 가능), 및 Keistase™ (Daiwa로부터 획득 가능) 이다.

각각 SEQ ID NO: 4의 N190, I201, D207 및 E211에 대응하는 위치에서 아미노산 잔기는 수 많은 Termamyl 유사 α-아밀라제에 보존되어 있는 아미노산 잔기를 구성한다는 것을 여기에서 언급한다. 따라서, 예를들면, 이미 언급된 수 많은 Termamyl 유사 α-아밀라제의 아미노산 서열에 있는 이러한 잔기의 대응되는 위치는 다음과 같다:

이러한 보존된 아미노산 잔기의 돌연변이는 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 열안정성을 증가시키는 것과 관련하여 대단히 중요하며, 다음의 돌연변이는 이 관련성에 특히 관심을 둔 것이다 (SEQ ID NO: 4에 나타낸 B. licheniformis 아미노산 서열의 번호를 참조).

SEQ ID NO: 4의 갭 (gap)에 대응되는 SEQ ID NO: 5의 R179-G182에 대응되는 위치에서 쌍으로 아미노산 결실. 수 많은 Termamyl 유사 α-아밀라제와 배열될 때, 따라서, 예를들면, 이미 언급된 수 많은 Termamyl 유사 α-아밀라제 (상기참조)의 아미노산 서열에 있는 이들 잔기의 대응되는 위치는 다음과 같다:

뼈대로서 (즉 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로서) SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 6을 이용할 때 본 발명에 따른 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 돌연변이는 (부모에 비하여) 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 열안정성을 증가시키기 위해 다음 지역/위치에 만들어질 수 있다:

(여기의 SEQ ID NO: 1과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 2과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 3과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 4과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 5과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 6과 관계있는):

본 발명에 따라 잘 관찰된 것은 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 돌연변이를 조합하는 것이다.

SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 6을 뼈대로 한 특정 이중 돌연변이는 다음에 나열하였다.

SEQ ID NO: 1을 뼈대로 사용하여 희망하는 효과의 결과된 다음의 이중 돌연변이는 본 발명에 따라 잘 관찰되었다:

SEQ ID NO: 2를 뼈대로 사용하여 희망하는 효과의 결과된 다음의 이중 돌연변이는 본 발명에 따라 잘 관찰되었다:

SEQ ID NO: 3을 뼈대로 사용하여 희망하는 효과의 결과된 다음의 이중 돌연변이는 본 발명에 따라 잘 관찰되었다:

SEQ ID NO: 4를 뼈대로 사용하여 희망하는 효과의 결과된 다음의 이중 돌연변이는 본 발명에 따라 잘 관찰되었다:

SEQ ID NO: 5를 뼈대로 사용하여 희망하는 효과의 결과된 다음의 이중 돌연변이는 본 발명에 따라 잘 관찰되었다:

SEQ ID NO: 6을 뼈대로 사용하여 희망하는 효과의 결과된 다음의 이중 돌연변이는 본 발명에 따라 잘 관찰되었다:

상기에서 정의된 모든 Termamyl 유사 α-아밀라제는 본 발명의 변이체를 제조하는데 있어서 뼈대로서 적절히 사용된다.

그러나, 바람직한 구체예에서 변이체는 다음의 돌연변이를 포함한다: SEQ ID NO: 4에서 N190F/Q264S 또는 다른 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제에서 대응되는 위치.

또 다른 구체예에서 본 발명의 변이체는 다음의 돌연변이를 포함한다: SEQ ID NO: 3 (TVB146)에서 I181^*/G182^*/N193F 또는 다른 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제에서 대응되는 위치. 상기 변이체는 E214Q 위치의 치환을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제는 SEQ ID NO: 4와 SEQ ID NO: 5의 잡종 α-아밀라제이다. 구체적으로, 부모 잡종 Termamyl 유사 α-아밀라제는 SEQ ID NO: 4에 나타낸 B. licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기와 적절하게 다음의 돌연변이 : H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEQ ID NO: 4의 번호를 사용),를 더 가질 수 있는, SEQ ID NO: 5에 나타낸 B. amyloliquefaciens로부터 유래한 α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기로 구성되는 잡종 알파-아밀라제이다. 후자에 언급된 잡종은 아래의 실시예에 사용되며 LE174로 칭한다.

본 발명의 변이체의 일반적 돌연변이

본 발명의 변이체는 상기에서 개괄한 것들에 부가하여 하나 이상의 변형을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 변형된 α-아밀라제 변이체의 부분에 존재하는 하나 이상의 프롤린 잔기는 어느 것이나 가능한, 모든 자연적으로 발생하는 비프롤린 잔기이며, 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린 또는 류신인 비프롤린 잔기로 교체하는 것이 유리하다.

유사하게, 변형된 부모 α-아밀라제에 있는 아미노산 잔기 중의 하나 이상의 시스테인 잔기는 세린, 알라닌, 트레오닌, 글리신, 발린 또는 류신과 같은 비-시스테인 잔기로 교체되는 것이 바람직하다.

더욱이, 본 발명의 변이체는 - 단일 변형으로 또는 상기에서 개괄한 변형의 어느 것과 조합으로서 - SEQ ID NO: 4의 아미노산 단편 185-209에 대응하는 아미노산 단편에 존재하는 하나 이상의 Asp 및/또는 Glu을 각각 Asn 및/또는 Gln으로 교체하기 위하여 변형된다. Termamyl 유사 α-아밀라제에서, 또 다른 관심사는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 단편 185-209에 대응되는 아미노산 단편에 존재하는 하나 이상의 Lys 잔기를 Arg으로 교체하는 것이다.

두개 이상의 상기 개괄된 변형이 삽입된 변이체를 포함하는 본 발명은 이해가 될 것이다.

더욱이, 여기에 기술된 모든 변이체에 점 돌연변이를 도입하는 것은 유리하다.

α-아밀라제 변이체 제조방법

유전자에 돌연변이를 도입하는 여러 방법은 본 분야에 공지이다. α-아밀라제 암호화 DNA 서열의 클로닝의 간단한 논의 후에, α-아밀라제 암호화 서열 내에서의 특정 위치에 돌연변이를 발생시키는 방법을 논의한다.

α-아밀라제 암호화 DNA 서열 클로닝

부모 α-아밀라제 암호화 DNA 서열은 본 분야의 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여, 문제의 α-아밀라제를 생산하는 세포 또는 미생물로부터 분리한다. 첫째, 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 연구될 α-아밀라제를 생산하는 생물의 염색체 DNA 또는 전령 RNA를 사용하여 만들어진다. 그리고나서, 만약 α-아밀라제의 아미노산 서열을 안다면, 상동성이고 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하여 문제된 생물로부터 준비된 게놈 라이브러리에서 α-아밀라제를 암호화하는 클론을 확인하는데 사용한다. 대안으로서, 공지의 α-아밀라제 유전자와 상동성인 서열을 가지는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 낮은 스트린전시의 혼성화 및 워싱 (washing) 조건을 사용하여, α-아밀라제 암호화 클론을 확인하는 프로브로서 사용된다.

α-아밀라제 암호화 클론을 확인하는 또 다른 방법은 플라스미드와 같은 발현벡터에 게놈 DNA의 단편을 삽입하고, α-아밀라제 음성 박테리아에 결과된 게놈 DNA 라이브러리로 형질전환 시키고난 후, α-아밀라제를 위한 기질을 함유하는 한천 위에 형질전환된 박테리아를 플레이팅하여, 클론이 확인될 α-아밀라제를 발현하도록 하는 것을 포함한다.

대안으로서, DNA 서열 암호화 효소는 확립된 표준 방법, 예컨데 S.L. Beaucage 및 M.H. Caruthers (1981)에 의하여 기술된 포스포로아미디트 방법 또는 Mattes et al.(1984)에 의하여 기술된 방법에 의하여 합성하여 제조된다. 포스포로아미디트 방법에서는, 올리고뉴클레오티드가 합성되고, 예컨데 자동 DNA 합성기에서, 정제되고, 어닐링되어, 적절한 벡터에 접착되어 클로닝된다.

마지막으로, DNA 서열은 표준 기술에 따라서, 합성, 게놈 또는 cDNA 오리진 (적절하게는, 전체 DNA 서열의 다양한 부분에 대응하는 단편)의 접착 단편으로 준비된, 게놈 및 합성 오리진의 혼합, 합성 및 cDNA 오리진의 혼합 또는 게놈 및 cDNA 오리진의 혼합이 될 수 있다. DNA 서열은, 예컨데 US 4,683,202 또는 R.K. Saiki et al. (1988)에 기술된 것과 같은, 특이적 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 역시 준비될 수 있다.

특정부위 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)

일단 α-아밀라제 암호화 DNA 서열이 분리되면, 돌연변이를 위한 바람직한 위치가 밝혀지고, 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 돌연변이가 도입된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 희망하는 돌연변이 위치 주위의 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 돌연변이체 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성동안 삽입된다. 특이적 방법에서, DNA의 단일가닥 갭, α-아밀라제 암호화 서열 이음은 α-아밀라제 유전자를 운반하는 벡터 내에서 생성된다. 그리고 나서 희망하는 돌연변이를 가진 합성 뉴클레오티드는 단일가닥 DNA의 상동성 위치에 어닐링된다. 나머지 갭은 DNA 중합효소 Ⅰ(Klenow 단편)으로 채운 후 구조체는 T4 리가아제를 사용하여 접착된다. 이 방법의 구체적 예는 Morinaga et al. (1984)에 기술되어 있다. US 4,760,025는 카세트의 적은 변화를 수행함으로써 다중 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시하고 있다. 그러나, 다양한 길이의 올리고뉴클레오티드의 다수가 도입될 수 있기 때문에, Morinaga 방법에 의해서 더욱 큰 다양성의 돌연변이가 어느 한 시기에 도입될 수 있다.

α-아밀라제 암호화 DNA 서열에 돌연변이를 도입하는 또 다른 방법은 Nelson 및 Long (1989)에 기술되어 있다. 이 방법은 화학합성 DNA 가닥을 PCR 반응의 프라이머중 하나로서 사용하여 희망하는 돌연변이를 도입하는 PCR 단편의 3 단계 발생을 포함한다. PCR-발생 단편으로부터, 돌연변이를 수반하는 DNA 단편은 제한 엔도뉴클라제에 의한 절단 및 발현 플라스미드로의 재삽입에 의해서 분리된다.

무작위 돌연변이법

무작위 돌연변이법은 문제로 나타난 아미노산 서열로 번역되는 유전자의 적어도 세부분 또는 전체 유전자 내에서, 지역 한정적 또는 지역 특이적 무작위 돌연변이법중 어느 것이나 적절하게 수행된다.

부모 α-아밀라제를 암호화하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이법은 본 분야의 공지된 방법의 사용으로 편리하게 수행된다.

상기와 관련하여, 본 발명의 더 나아간 측면은 부모 α-아밀라제의 변이체, 예컨데 여기서 변이체는 부모에 비하여 변형된 또는 증가된 열안정성을 보인다,를 생산하는 방법에 관련된 것으로, 그 방법은 :

(a) 부모 α-아밀라제를 암호화하는 DNA 서열을 무작위 돌연변이법으로 수행하는 단계,

(b) (a)단계에서 획득한 변이된 DNA 서열을 숙주세포에서 발현하는 단계, 및

(c) 부모 α-아밀라제와 관계있는 변형된 특성 (즉, 열안정성)을 가지는 α-아밀라제 변이체를 발현하는 숙주세포를 스크리닝하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기의 방법의 (a) 단계는 바람직하게는 약물처리 프라이머를 사용하여 수행한다.

예를들면, 무작위 돌연변이법은 적절한 물리적 또는 화학적 돌연변이원의 사용, 적절한 올리고뉴클레오티드의 사용, 또는 DNA 서열을 PCR 발생 돌연변이법에 사용으로 수행된다. 게다가, 무작위 돌연변이법은 이들 돌연변이원을 조합한 사용으로 수행될 수 있다. 돌연변이원은 예컨데 트랜지션 (transition), 트랜스버전 (transversion), 역위, 섞이기, 결실 및/또는 삽입을 유도하는 것이 된다.

본 목적에 적절한 물리적 또는 화학적 돌연변이원의 예는 자외선 (UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 설포네이트 (EMS), 나트륨 비설파이트, 포름산 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이러한 작용제가 사용될 때, 돌연변이법은 전형적으로 돌연변이법이 발생하기 적절한 환경에서 선택된 돌연변이원의 존재하에서 돌연변이된 부모 효소를 암호화하는 DNA 서열을 배양하고, 희망하는 특성을 가진 변이된 DNA를 스크리닝함으로써 수행된다.

올리고뉴클레오티드의 사용에 의하여 돌연변이법이 수행될 때, 올리고뉴클레오티드는 변경될 위치에서의 올리고뉴클레오티드의 합성동안 세 개의 비부모 뉴클레오티드로 약물처리 또는 스파이크(spiked) 된다. 약물처리 또는 스파이킹은 원하지 않는 아미노산에 대한 코돈이 회피되도록 처리한다. 약물처리 또는 스파이크된 올리고뉴클레오티드는 공표된 기술, 예컨데 PCR, LCR 또는 DNA 중합효소 및 적절하다고 생각되는 리가아제를 사용, 에 의해서 α-아밀라제 효소를 암호화하는 DNA 에 삽입된다.

바람직하게는, 약물처리는 각 위치에서의 야생형과 돌연변이의 퍼센트가 미리 결정된 "지속적 무작위 약물처리"를 사용하여 수행된다. 게다가, 약물처리는 특정 뉴클레오티드의 도입이 선호되게 하여, 그에따라서 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입이 선호되게 수행할 수 있다. 약물처리는, 예컨데 각 위치에서 90% 야생형과 10% 돌연변이의 도입이 되도록 한다. 약물처리 계획의 선택에 있어서 부가적 고려사항은 유전적 뿐만 아니라 단백질 구조적 제약에 기초한다. 약물처리 계획은, 특히 정지 코돈의 도입 회피를 보장하는, DOPE 프로그램을 사용하여 할 수 있다.

PCR-발생 돌연변이법이 사용될 때, 화학적인 처리 또는 부모 α-아밀라제를 암호화하는 비처리 유전자는 뉴클레오티드의 잘못된 삽입을 증가시키는 환경하에서 PCR이 수행된다 (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15).

E. coli의 돌연변이유발 세균주 (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae 또는 다른 미생물이, 예컨데 부모 글리코실라제를 포함하는 플라스미드를 돌연변이유발 세균주내에 형질전환, 플라스미드를 가진 돌연변이유발 세균주를 배양 및 돌연변이유발 세균주로부터 변이된 플라스미드의 분리, 하는 것에 의한 α-아밀라제 암호화 DNA의 무작위 돌연변이법에 사용될 수 있다. 변이된 플라스미드를 그 후 발현 생물내에 형질전환한다.

돌연변이될 DNA 서열은 부모 α-아밀라제를 발현하는 생물로부터 준비된 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 편리하게 존재한다. 대안으로서, DNA 서열은, 플라스미드 또는 박테리오파지와 같은 적절한 벡터에 존재하는데, 그렇게 적절한 것은 배양이 되고 그렇지않은 것은 돌연변이원에 노출된다. 돌연변이될 DNA는 상기 세포의 게놈에 삽입되어 있거나 세포내에 잠복된 벡터에 존재하여 숙주 세포내에 역시 존재한다. 결론적으로, 돌연변이될 DNA는 분리된 형태이다. 무작위 돌연변이법에 사용될 DNA 서열은 바람직하게는 cDNA 또는 게놈 DNA 서열이라고 이해된다.

어떠한 경우는 발현 단계 b) 또는 스크리닝 단계 c)를 수행하기에 앞서서 돌연변이된 DNA 서열을 증폭하는 것이 편리하다. 그러한 증폭은 본 분야의 공지된 방법에 따라 수행될 수 있고, 현재 선호되는 방법은 부모 효소의 아미노산 서열 또는 DNA의 기초하에서 준비된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR-발생 증폭이다.

배양 또는 돌연변이원에 노출 후에, 변이된 DNA는 발현이 일어나도록 하는 환경하에서 DNA 서열을 운반하는 적절한 숙주세포를 배양하여 발현시킨다. 이 목적에 사용되는 숙주세포는 돌연변이된 DNA 서열로 형질전환된 것이며, 선택적으로는 벡터에 존재하는 것, 또는 돌연변이법 처리중에 부모 효소를 암호화하는 DNA 서열을 운반하는 것이다. 적절한 숙주세포의 예는 다음과 같다: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Sterptomyces lividans 또는 Sterptomyces murinus와 같은 그람 양성 박테리아; 및 E. coli와 같은 그람 음성 박테리아.

돌연변이된 DNA 서열은 돌연변이된 DNA 서열의 발현을 허락하는 기능을 암호화하는 DNA 서열을 더 포함한다.

지역 한정적 무작위 돌연변이법

무작위 돌연변이법은 유리하게도 문제의 부모 α-아밀라제의 부분에 한정적일 수 있다. 이것은, 예컨데 효소의 특정 위치가 효소의 주어진 특성에 대해 특히 중요한 것으로 밝혀졌을 때, 및 변형된 것이 향상된 특성을 가지는 변이체가 될 것으로 예상되는 때 유리하다. 그러한 지역은 부모 효소의 삼차원적 구조가 해명되었고 효소의 기능과 관련있을 때 통상적으로 밝혀진다.

지역 한정적, 또는 지역 특이적 무작위 돌연변이법은 상기에서 기술한 PCR 발생 돌연변이법 기술의 이용에 의하거나 또는 본 분야에 알려진 다른 적절한 기술을 이용하여 편리하게 수행된다. 대안으로서, 변형될 DNA 서열의 부분을 암호화하는 DNA 서열은, 예컨데 적절한 벡터내에 삽입에 의해, 분리되며, 그 후 상기 부분은 상기에서 논의된 돌연변이법의 사용으로 돌연변이 된다.

α-아밀라제 변이체 제공의 대안적 방법

본 발명의 변이체 제공을 위한 대안적 방법은, 예컨데 WO 95/22625 ( Affymax Technologies N.V.사 출원) 및 WO 96/00343 (Novo Nordisk A/S사 출원)에 기술된, 방법을 포함하는 본 분야에 공지된 유전자 셔플링 (shuffling) 방법을 포함한다.

α-아밀라제 변이체의 발현

본 발명에 따라, 상기에서 기술한 방법 또는 본 분야에 공지인 다른 대안적 방법에 의해 생산된 변이체를 암호화하는 DNA 서열을, 전형적으로 프로모터를 암호화하는 조절서열, 오퍼레이터, 리보솜 부착위치, 번역시작 신호, 및 선택적으로는 억제 유전자 또는 다양한 활성 유전자를 포함하는 발현벡터를 사용하여, 효소의 형태로 발현할 수 있다.

본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 운반하는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 과정에 편리하게 사용될 수 있는 모든 벡터이고, 벡터의 선택은 그것이 도입될 숙주세포에 대개 의존하게된다. 따라서, 벡터는 스스로 복제하는 벡터, 즉 벡터는 염색체의 독립체로서 존재하며, 벡터의 복제는 염색체 복제와는 독립적이다, 예컨데 플라스미드, 박테리오파지 또는 역색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체이다. 대안으로는, 벡터가 숙주세포에 도입되었을 때, 숙주세포의 게놈에 삽입되고 그것이 삽입된 염색체와 함께 복제를 하는 것일 수 있다.

벡터에서는, DNA 서열이 적절한 프로모터 서열과 작동하게 연결되어야 한다. 프로모터는 선택된 숙주세포 내에서 전사 활성을 보이는 DNA 서열이고, 숙주세포에 대해 상동 또는 이종인 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래된 것이다. 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열의 전사를 하도록 하는 적절한 프로모터의 예는, 특히 박테리아 숙주에서, E. coli의 lac 오페론의 프로모터, Streptomyces coelicolor 아가라제 유전자 dagA 프로모터, Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자 (amyL)의 프로모터, Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM)의 프로모터, Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제 (amyQ)의 프로모터, Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 등이다. 균류 숙주에서의 전사에 대해서, 유용한 프로모터의 예는 A. oryzae TAKA 아밀라제를 암호화하는 유전자, Rhizomucor miehei 아스파틱 프로티나제, A. niger 자연적 α-아밀라제, A. niger 산 안정성 α-아밀라제, A. niger 글루코아밀라제, Rhizomucor miehei 리파아제, A. oryzae 알칼리 프로테아제, A. oryzae 트리오스 인산 이성질화효소 또는 A. nidulans 아세트아미다제로부터 유래한 것들이다.

본 발명의 발현벡터는 적절한 전사 종결 및, 진핵세포에서는, 폴리아데닐화 서열이 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열에 작동하도록 연결된 것을 또한 포함한다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터로서 동일한 근원에서 적절하게 유래된다.

벡터는 문제의 숙주세포 내에서 벡터가 복제되도록하는 DNA 서열을 더 포함한다. 그러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제원점이다.

벡터는 선택적 마커, 예컨데 B. subtilis 또는 B. licheniformis의 dal 유전자와 같은, 산물의 보체가 숙주세포 내에서 결함있는 유전자, 또는 앰피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라싸이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 유전자를 또한 포함한다. 게다가, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 sC와 같은 Aspergillus 선별 마커, 히그로마이신 내성을 발생시키는 마커, 또는 예컨데 WO 91/17243에 기술된 바와 같은 동시-형질전환에 의해 수행되는 선별을 포함한다.

예컨데 특정 박테리아를 숙주세포로 사용할 때, 세포내 발현이 어떤 측면에서는 유리하나, 발현이 세포외인 것이 통상 선호된다. 일반적으로, 여기서 언급된 Bacillus α-아밀라제는 발현된 프로테아제를 배양 배지로 분비하도록 하는 전(前)지역을 포함한다. 만약 바람직하다면, 이 전지역은, 각 전지역을 암호화하는 DNA 서열의 치환에 의해 편리하게 수행하여, 다른 전지역 또는 신호 서열로 교체된다.

α-아밀라제 변이체, 프로모터, 종결인자 및 다른 요소를 각각 암호화하는 본 발명의 DNA 구조체를 접착, 및 복제에 필요한 정보를 가지는 적절한 벡터에 그들을 삽입하는 과정은 본 분야에 숙련된 자에게 공지이다 (비교, 예를들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold spring Harbor, 1989).

본 발명의 세포는, DNA 구조체이든 상기에서 정의한 본 발명의 발현 벡터를 포함하든, 본 발명의 α-아밀라제 변이체의 재조합 산물에 있어서 숙주세포로 사용되는 것이 유리하다. 세포는, 편리하게 숙주 염색체내에 DNA 구조체 (한 개 이상의 카피로)를 삽입시킴으로서, 변이체를 암호화하는 본 발명의 DNA 구조체로 형질전환된다. DNA 서열이 세포내에서 보다 안정하게 유지되기 때문에 이러한 삽입이 통상적으로 유리하다고 생각된다. 숙주 염색체내로의 DNA 구조체 삽입은 통상적 방법, 예컨데 동형 또는 이형 재조합, 에 따라서 수행된다. 대안으로는, 세포는 다른 종류의 숙주세포와 관련있는 상기에서 기술한 발현벡터로 형질전환할 수 있다.

본 발명의 세포는 포유류 또는 곤충과 같은 고등 생물의 세포일 수 있으나, 바람직하게는 미생물 세포, 예컨데 박테리아 또는 균류 (효모 포함) 세포, 이다.

적절한 박테리아의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는 Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus와 같은 그람 양성 박테리아, 또는 E. coli와 같은 그람 음성 박테리아이다. 박테리아의 형질전환은, 예컨데, 원래 알려진 방식으로 원형질체 형질전환 또는 수용능력있는 세포를 사용하여 처리된다.

효모 유기체는 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces의 종, 예컨데 Saccharomyces cerevisiae, 으로부터 선호적으로 선택된다. 사상 균류는 유리하게 Aspergillus의 종, 예컨데 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger,에 속한다. 균류 세포는 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환 후 원래 알려진 방식으로 세포벽 재생을 포함하는 과정에 의해 형질전환된다. Aspergillus 숙주세포의 형질전환에 대한 적절한 과정은 EP 238 023에 기술되어 있다.

더 나아간 측면에서, 본 발명은, 변이체의 생산을 유도하는 환경하에서 상기에서 기술한 숙주세포의 배양 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 변이체의 회복을 포함하는 방법인, 본 발병의 α-아밀라제 변이체를 생산하는 방법에 관련된 것이다.

세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주세포가 자라고 본 발명의 α-아밀라제 변이체의 발현을 획득하는데 적절한 모든 통상적 배지이다. 적절한 배지는 시중 공급자로부터 획득하거나 공표된 제법에 따라 제조된다 (예컨데, American Type Culture Collection의 카탈로그에 기술된 바와 같이).

숙주세포로부터 분비된 α-아밀라제 변이체는, 원심분리 또는 여과에 의한 배지로부터 세포의 분리, 및 황산 암모늄과 같은 염에 의해서 배지의 단백질성 성분의 침전, 이어서 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 방법의 사용을 포함하는 잘 알려진 과정에 의해서 배양 배지로부터 편리하게 회수할 수 있다.

산업적 적용

본 발명의 α-아밀라제 변이체는 다양한 산업적 응용이 허용되는 유용한 특성을 지녔다. 특히, 본 발명의 효소 변이체는 세탁, 식기세척 및 거친표면 세척제 조성물의 구성성분으로 응용된다. 다양한 변이체는 감미료의 생산 및 녹말에서 에탄올 생산 및/또는 섬유의 풀빼기에 특히 유용하다. 녹말 액화 및/또는 당화 공정을 포함하는, 통상의 녹말 전환 공정에 대한 환경은, 예컨데 US 3,912,590 및 EP 특허 출원번호 252 730 및 63 909에 기술되어 있다.

녹말로부터 감미료 생산

녹말에서 과당 시럽의 전환에 대한 "전통적" 공정은 세번의 연속적인 효소공정, 즉 액화공정 후에 당화공정 및 이성화공정으로 통상 구성된다. 액화공정 동안, 녹말은 5.5 내지 6.2 사이의 pH값과 95-160℃의 온도에서 약 2시간동안 α-아밀라제 (예컨데 Termamyl™)의 처리로 덱스트린으로 분해된다. 이러한 환경하에서 최적 효소 안정성을 보장하기 위해서, 1mM의 칼슘이 첨가된다 (40 ppm 유리 칼슘 이온).

액화공정 후 덱스트린은 글루코아밀라제 (예컨데 AMG™) 및 이소아밀라제 또는 풀루란나제 (예컨데 Promozyme™)와 같은 가지제거 효소의 첨가에 의해서 덱스트로스로 전환한다. 이 단계 전에 pH는 4.5 이하의 값으로 낮추어야 하고, 높은 온도 (95℃ 이상)를 유지하며, 액화 α-아밀라제 활성이 변성되어야 한다. 온도는 60℃로 낮추고, 글루코아밀라제 및 가지제거 효소를 첨가한다. 당화공정은 24-72 시간동안 진행된다.

당화공정 이후에 pH는 6-8 범위의 값, 바람직하게는 pH 7.5로 상승시키고, 칼슘은 이온교환에 의해 제거한다. 덱스트로스 시럽은 그 후, 예컨데 고정화 포도당이성질화효소 (Sweetzyme™과 같은)를 사용하여 고과당 시럽으로 전환된다.

이 공정의 적어도 1 효소적 개선을 꾀할 수 있다. 액화 α-아밀라제의 칼슘 의존성의 감소. 유리 칼슘의 첨가는 적절하게 α-아밀라제의 높은 안정성을 보장하는데 필요하나, 유리 칼슘은 포도당이성질화효소의 활성을 강하게 저해하며, 값 비싼 단위 조작을 통해서, 3-5 ppm 이하의 유리 칼슘의 레벨로 낮아질 정도로 제거할 것이 요구된다. 만약 그러한 조작을 회피할 수 있고, 액화공정이 유리 칼슘 이온의 첨가없이 수행될 수 있다면 비용 절약을 할 수 있다.

이를 달성하기 위해, 낮은 농도의 유리 칼슘 (< 40 ppm)에서 안정하고 높은 활성인 저칼슘 의존성 Termamyl 유사 α-아밀라제가 요구된다. 그러한 Termamyl 유사 α-아밀라제는 4.5-6.5 범위, 바람직하게는 4.5-5.5 범위의 pH에서 최적 pH를 가져야 한다.

세제 조성물

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 변이체는 세제 조성물에 적절하게 혼합될 수 있다. 낮은 칼슘 농도, 즉 알칼리성 지역, 에서 증가된 열안정성은 세제에서 아밀라제 성능에 매우 유리하다. 세제 조성물 (세탁 또는 식기세척 세제와 같은)의 관련된 성분, 그러한 세제 조성물에서 변이체의 적절한 제조방법 및 관련된 형태의 세제 조성물의 예에 관한 더욱 자세한 사항으로, 예를들면 WO 96/23874 및 WO 97/07202가 참고로 작성됐다.

본 발명의 변이체를 포함하는 세제 조성물은, 리파아제, 큐티나제, 프로테아제, 셀룰라아제, 퍼록시다제 또는 락카제 및/또는 다른 α-아밀라제와 같은 하나 이상의 다른 효소를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 α-아밀라제 변이체는 통상 사용되는 농도에서 세제에 혼합될 수 있다. 본 발명의 변이체는 통상적 투여량 수준의 세제를 사용하여 세탁/식기세척 용액 리터당 0.00001-1 mg (순수한, 활성 효소 단백질로 계산)의 α-아밀라제에 대응하는 양으로 혼합될 수 있다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 (부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로서) B. stearothermophilus α-아밀라제로부터 유래한 본 발명의 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO: 4 에 나타낸 서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제로부터 유래한 Termamyl 유사 α-아밀라제의 혼합물을 포함하는 조성물에 관련된 것이다.

게다가, 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 (부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로서) B. stearothermophilus α-아밀라제로부터 유래한 본 발명에 따른 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO: 5에 나타낸 B. amyloliquefaciens α-아밀라제의 부분 및 SEQ ID NO: 4에 나타낸 B. licheniformis α-아밀라제의 부분을 포함하는 잡종 α-아밀라제의 혼합을 포함하는 조성물에 관련된 것이다. 후자에 언급한 잡종 Termamyl 유사 α-아밀라제는 SEQ ID NO: 4에 나타낸 B. licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기와 SEQ ID NO: 5에 나타낸 B. amyloliquefaciens로부터 유래한 α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 후자에 언급된 잡종 α-아밀라제는 적절하게 다음의 돌연변이를 포함한다: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEQ ID NO: 4의 번호를 사용). 하기의 실시예에서 상기 잡종 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제는, 본 발명의 조성물에 사용되는 본 발명의 변이체와 조합으로 사용된다.

본 발명의 구체예에서 조성물은 TVB146 및 LE174, 예컨데 1:1과 같은 2:1 내지 1:2의 비율로, 의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 α-아밀라제 변이체 또는 본 발명의 조성물은 본 발명의 한 측면으로서 세탁 및/또는 식기세척; 섬유 풀빼기 또는 녹말 액화에 사용된다.

재료 및 방법

효소:

BSG α-아밀라제: SEQ ID NO: 3에 기술된 B. stearothermophilus α-아밀라제.

TVB146 α-아밀라제 변이체: 다음의 돌연변이를 지닌 SEQ ID NO: 3에 기술된 B. stearothermophilus α-아밀라제 변이체: I181-G182 + N193F 위치에 결실.

LE174 잡종 α-아밀라제 변이체:

LE174는 Termamyl 서열과 동일한 잡종 Termamyl 유사 α-아밀라제이다. 즉 (성숙된 단백질의) N-말단 35 아미노산 잔기가 (성숙된 단백질) BAN의 N-말단 33 잔기로 치환된 것을 제외한, SEQ ID NO: 4에 나타낸 Bacillus licheniformis α-아밀라제, 즉 다음과 같은 돌연변이를 더 가지는 SEQ ID NO: 5에 나타낸 Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제: H156T+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEQ ID NO: 4의 번호를 이용). LE174는 SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351)에 의해 만들어진다.

α-아밀라제 변이체의 발효 및 정제

관련된 발현 플라스미드를 가지는 B. subtilis 세균주는 -80℃ 균주로부터 10㎍/mL 카나마이신이 있는 LB-한천 평판에 스트릭킹 (streaking)하고, 37℃에서 하룻밤동안 배양한다.

콜로니를 500ml 진탕 플라스크에 담긴 10 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 100ml BPX 배지에 옮긴다.

BPX 배지의 조성:

감자 녹말 100 g/l

보리 가루 50 g/l

BAN 5000 SKB 0.1 g/l

나트륨 카세인네이트 10 g/l

콩 가루 20 g/l

Na₂HPO₄, 12 H₂O 9 g/l

Pluronic™ 0.1 g/l

배양은 37℃에서 270 rpm으로 5일간 진탕한다.

세포 및 세포 파편은 20-25분간 4500 rpm 원심분리에 의하여 발효액으로부터 제거한다. 그 후 부유물은 완전히 깨끗한 용액을 얻기위해 여과한다. 여과액을 농축하고 UF-필터 (10000 차단 막)에서 세척하고 완충액은 20mM 아세테이트 pH 5.5로 바꾼다. UF-여과액은 S-세파로스 F.F.를 사용하여 용출은 동일한 완충액에서 0.2M NaCl과 함께 단계 용출에 의해서 수행된다. 용출액은 Q-세파로스 F.F.를 사용하여 10mM Tris, pH 9.0에 대해 투석하고 6 컬럼 부피가 넘는 0-0.3M NaCl의 선형 구배에서 용출한다. (Phadebas 분석으로 측정된) 활성이 있는 분획은 괴이게하고, pH는 pH 7.5로 조정하며 남은 색은 5분간 0.5% W/vol. 활성탄의 처리로 제거한다.

활성 결정 - (KNU)

1 킬로 α-아밀라제 유니트 (1 KNU)는 다음과 같은 조건에서 α-아밀라제의 결정을 위한 Novo Nordisk의 표준방법으로 시간당 5.26 g 녹말 (Merck, Amylum Solubile, Erg. B 6, Batch 9947275)을 분해하는 효소의 양이다:

기질 수용성 녹말

용매의 칼슘 함유량 0.0043 M

반응시간 7-20 분

온도 37℃

pH 5.6

Novo Nordisk의 분석방법 (AF 9)의 상세한 설명은 의뢰하여 획득가능하다.

BS-아밀라제 활성 결정 - KNU (S)

1. 적용영역

이 방법은 발효 및 회복 샘플 및 조제되고 입자화된 제품에서 α-아밀라제 활성을 결정하는데 사용된다.

2. 원리

BS-아밀라제는 기질 (4,6-에틸리덴(G₇)-p-니트로페닐(G₁)-α,D-말토헵타오시드 (에틸리덴-G₇-PNP로 쓰여진))을, 다른물질 가운데, G₂-PNP 및 G₃-PNP로 분해한다. 여기서 G는 포도당 및 PNP는 p-니트로페놀을 의미한다.

G2-PNP 및 G3-PNP는 과다하게 첨가되는 α-글루코시다제에 의하여 포도당 및 노란색의 p-니트로페놀로 분해된다.

발색 반응은 시험관 내에서 모니터되고 시간에 따른 흡광도의 변화는 반응속도의 발현으로서 계산되며 따라서 효소의 활성이다. 보다 자세한 사항은 Boehringer Mannheim 1442 309 지침서를 참고.

2.1 반응 조건

반응:

온도 : 37℃

pH : 7.1

전배양 시간 : 2 분

검출:

파장 : 405 nm

측정 시간 : 3분

3. 유니트의 정의

Bacillus stearothermophilus α-아밀라제 (BS-아밀라제) 활성은 선언된 활성의 표준 및 킬로 Novo 유니트 (Stearothermophilus) 또는 KNU(S)에 기술된 것과 관련하여 결정된다.

4. 특이성 및 민감성

결정의 한계: 대략 0.4 KNU(s)/g

5. 장치

Cobas Fara 분석기

Diluted (예컨데 Hamilton Microlab 1000)

분석 밸런스 (예컨데 Mettler AE 100)

교반기 판

6. 반응제/기질

기성품 키트가 이 분석에서 α-아밀라제 활성을 결정하기 위해 사용된다. 기질과 α-글루코시다제의 특이적 반응제는 Boehringer Mannheim 지침서에 기술된 대로 사용되지 않는 것을 주목하라. 그러나, "완충액", "유리1", 유리 1a" 및 유리 2"의 지시는 그 지침서에서 인용된 것이다.

6.1 기질

4,6-에틸리덴(G₇)-p-니트로페닐(G₁)-α,D-말토헵타오시드 (에틸리덴-G₇-PNP에 기술된 대로) 예컨데 Boehringer Mannheim 1442 309

6.2 α-글루코시다제 도움 반응제

α-글루코시다제, 예컨데 Boehringer Mannheim 1442 309

6.3 BRIJ 35 용액

BRIJ 35 (30% W/V Sigma 430 AG-6) 1000 mL

탈광물수 2,000 mL까지

6.4 안정화제

Brij 35 용액 33 mL

CaCl₂ ^*2H₂O (Merck 2382) 882 g

탈광물수 2,000 mL까지

7. 샘플 및 표준

7.1 표준 곡선

예 : BS-아밀라제 표준곡선의 준비

적절한 표준이 다음과 같이 0.60 KNU(s)로 희석된다. 표준의 계산된 양은 무게를 재고 탈광물수로 2/3 표시 주위까지 채워진 200mL 부피의 플라스크에 첨가된다. 플라스크 부피의 1%에 해당하는 안정제가 첨가되고 플라스크는 탈광물수로 표시된 곳까지 채운다.

Hamilton Microlab 1000은 하기에 나타낸 희석액을 생산하는데 사용된다. 1% 안정제가 있는 탈광물수는 희석제로 사용된다.

희석 번호	효소주 용액	1% 안정제	KNU(s)/mL
1	20㎕	580㎕	0.02
2	30㎕	570㎕	0.03
3	40㎕	560㎕	0.04
4	50㎕	550㎕	0.05
5	60㎕	540㎕	0.06

7.2 레벨 대조군

Novo Nordisk A/S BS 아밀라제 레벨 대조군은 Cobas Fara를 이용하여 수행되는 모든것을 포함한다. 대조군은 마지막 희석이 표준곡선의 범위 내에 있게 하기 위해서 1% 안정제로 희석된다. 모든 무게 및 희석액은 작업목록에 기록한다.

7.3 샘플 용액

단일 결정

생산물로부터 (마지막 샘플이 아닌) 발효 샘플, 파이롯트 플랜트로부터 모든 발효 샘플 및 저장 안정 샘플은 무게를 재고 단지 한번 분석한다.

1 회분 후 이중 결정:

공정 샘플, 생산물로부터 마지막 발효 샘플, GLP 연구로부터의 샘플 및 R&D 샘플은 무게를 재고 두번 분석한다.

2 회분 후 이중 결정:

완결된 생산물 샘플의 무게를 재고 두번의 독립된 공정 후 두번 분석한다.

분말 형태의 샘플의 최대 농도: 5%

실험 샘플은 1% 안정제가 있는 탈광물수로 그들의 예상되는 활성의 기초하에 대략 0.037 KNU(S)/mL까지 희석한다. 마지막 희석은 샘플 컵에 직접 행한다.

8. 과정

8.1 Cobas Menu 프로그램

Cobas Menu 프로그램은 샘플의 무게/희석 및 사용될 레벨 대조군을 제시하기 위해 사용된다.

샘플은 특유 인식 코드를 가지고 프로그램에 들어가며 작업목록은 출력된다.

샘플과 대조군은 무게를 재고 수(手)-작성 무게 자료가 있는 작업목록에 기술된 대로 희석된 것이 BS-아밀라제 분석 일지에 삽입된다.

결과는 아이템 9에서 기술된 Cabas Fara에 의해서 자동으로 컴퓨터 처리되고 표준곡선과 함께 출력된다.

작업목록과 결과 출력물은 BS-아밀라제 분석 일지에 삽입된다.

8.2 Cobas Fara 배치

샘플은 샘플 선반에 위치시킨다.

다섯개의 표준은 위치 1에서 5 (위치 5에 가장 센 표준)의 조정 선반에 위치시키고, 대조군은 위치 10의 동일 선반에 위치시킨다.

기질은 30 mL 반응제 용기에 옮기고 위치 2 (용기 1)에 반응제 선반에 위치시킨다.

α-글루코시다제 도움 반응제는 50mL 반응제 용기에 옮겨지고 위치 2 (용기 C)에 반응제 선반에 위치시킨다.

8.3 Cobas Fare 분석

분석의 중요 원리는 다음과 같다:

20㎕ 샘플 및 10㎕ 세척수는 250㎕ α-글루코시다제 도움 반응제가 있는 큐벳에 피펫으로 주입된다. 큐벳은 10초간 회전시키고 반응제는 수평 큐벳 속으로 버려진다. 25㎕ 기질 및 20㎕ 세척수는 피펫으로 제거된다. 37℃의 온도가 보장되도록 1초 기다린 후, 큐벳을 다시 회전시키고 기질은 수평 큐벳에서 혼합된다. 흡광도는 120초 후에 최초 측정한 후 매 5초마다 측정한다. 흡광도는 각 샘플마다 총 37회 측정한다.

9. 측정

샘플의 활성은 Novo Nordisk A/S 표준과 관련하여 계산된다.

표준곡선은 분석기에 의하여 도화된다. 곡선은 완만히 휘고, 표준 번호 5에 대한 0.25 주위의 흡광도에 대해서 천천히 증가한다.

KNU(S)/mL의 샘플의 활성은 분석기에 의하여 표준곡선이 판독된다.

무게/희석에 대한 마지막 계산을 하기 위해 다음의 공식을 사용한다:

KNU(S)/g 의 활성 = S x V X F/W

S= 판독한 분석 결과 KNU(S)/mL

V= mL 사용한 용적플라스크의 부피

F= 이차 희석에 대한 희석 인자

W= 효소 샘플의 무게 g

9.2 평균값의 계산

결과는 3자리 유효숫자로 나타냈다. 그러나, 샘플 활성 < 10 KNU(S)/g에 대해서는, 단지 2자리 유효숫자가 주어졌다.

평균값의 계산에는 다음의 규칙을 적용하였다:

1. 평균값으로부터 2 표준편차 이상 벗어나는 수치는 계산에 포함하지 않았다.

2. 1회분 후 단독 또는 이중 결정:

평균값은 표준곡선의 활성 영역 내에 있는 결과의 기초하에서 계산된다.

3. 2회분 후 이중 결정: 모든 값은 평균값에 포함된다. 특이한 값은 생략했다.

10. 정확도 및 정밀도

변동의 계수는 완료된 제품의 수 및 레벨 대조군에 대한 분석 결과의 회고적 확인에 기초하여 2.9%이다.

α-아밀라제 활성에 대한 분석

α-아밀라제 활성은 기질로서 Phadebas정제를 사용한 방법에 의하여 결정된다. Phadebas 정제 (Pharmacia Diagnostic사에 의하여 지원된 Phadebas아밀라제 시험)는, 우혈청 알부민 및 완충 물질과 혼합되고 정제화되는 교차결합된 불용성 청색 녹말 중합체를 포함한다.

모든 단일 측정에 대해서 한개의 정제는 5 mL 50 mM Britton-Robinson 완충액 (50 mM 아세트산, 50 mM 인산, 50 mM 붕산, 0.1 mM CaCl₂, NaOH로 원하는 값으로 조정된 pH)을 포함하는 튜브에 현탁한다. 시험은 원하는 온도의 수조에서 수행된다. 시험될 α-아밀라제는 50 mM Britton-Robinson 완충액의 x ml에서 희석한다. 이 α-아밀라제 용액 1 ml를 5 ml 50 mM Britton-Robinson 완충액에 첨가한다. 녹말은 용해성 청색 단편을 만드는 α-아밀라제에 의하여 가수분해된다. 620 nm로 분광광도계에서 측정되는, 결과된 청색 용액의 흡광도는 α-아밀라제 활성의 함수이다.

10 또는 15분의 배양 (시험 시간) 후 측정된 620 nm 흡광도는 620 nm에서 0.2 에서 2.0 흡광도 단위 범위에 있다는 것이 중요하다. 이 흡광도 범위 내에서 활성과 흡광도 사이의 선형성이 있다 (Lambert-Beer 법칙). 따라서 효소의 희석은 이 표준에 적합하도록 조정되어야 한다. 특정된 세트의 조건 (온도, pH, 반응시간, 완충 조건) 하에서 주어진 α-아밀라제 1 mg은 일정량의 기질을 가수분해하여 청색이 나타나게 한다. 색의 강도는 620 nm에서 측정한다. 측정된 흡광도는 주어진 세트의 조건하에서 문제의 α-아밀라제의 특이 활성 (순수한 α-아밀라제 단백질의 활성/mg)에 대해 정비례한다.

실시예 1

BSG α-아밀라제의 변이체의 제조 (SEQ ID NO: 3)

BSG, amyS를 암호화하는 유전자는 플라스미드 pPL1117에 위치한다. 이 플라스미드는 또한, 플라스미드 pUB110 (Gryczan, T.J. et al (1978) J.Bact 134:318-329)로부터 모두 획득한, 카나마이신 내성을 부여하는 유전자 및 복제원점을 가지고 있다.

amyS의 성숙한 부분의 DNA 서열은 SEQ ID NO: 11에 나타나 있고 성숙 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3에 나타나 있다.

성숙 단백질에서 아미노산 I181-G182에 대응하는 6 뉴클레오티드의 결실을 포함하는, BSG 변이체 TVB145는 다음과 같이 제조된다:

중합효소 연쇄반응 (PCR)은 DNA 프라이머 BSG1 (SEQ ID NO: 15) 및 BSGM2 (SEQ ID NO: 18) 사이에 존재하는, (플라스미드 pPL1117의) amyS 유전자의 부분을 증폭하는데 사용된다. BSG1은 amyS 유전자의 부분과 동일한 반면 BSGM2는 6bp 뉴클레오티드 결실을 가지고 있다. 표준 PCR 반응을: 제조업자인 Boehringer Mannheim Gmbh이 권장하는 조건하에서 Pwo 중합효소를 사용하여, 94℃로 5 분간, 25 싸이클의 (94℃에서 45 초, 50℃에서 45 초, 72℃에서 90 초), 72℃에서 7 분으로 수행한다.

결과된 대략 550 bp 증폭된 밴드는 대략 1080 bp의 DNA 단편의 결과가 되는 주형인 pPL1117이 있는 제2 PCR에서 프라이머 BSG3과 더불어 메가프라이머 (Barik, S 및 Galinski, MS (1991): Biotechniques 10: 489-490)로 사용된다.

이 DNA 단편은 제한효소 Acc65I 및 SalI로 절단되고 결과된 대략 550 bp 단편은 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pPL1117에 접착하여 (WO92/11357 및 WO95/10603에 기술된) 프로테아제- 및 아밀라제-결실 Bacillus subtilis 균주 SHA273에 형질전환 시킨다.

카나마이신 내성 및 녹말 분해 형질전환체는 희망하는 돌연변이의 존재에 대해 분석한다 (유전자 내의 HindIII 위치의 도입을 확인하기 위해 제한 절단). Acc65I 및 SalI 제한위치 사이의 DNA 서열은 오직 희망하는 돌연변이의 존재를 보증하는 DNA 시퀀싱 (sequencing)에 의해 확인된다.

TVB145 및 페닐알라닌, N193F 대신 아스파라긴 193의 추가적 치환과 같이, 동일한 6 뉴클레오티드 결실을 가진 BSG 변이체 TVB146은 제1 PCR에서 프라이머 BSGM3 (SEQ ID NO: 19)를 사용한 TVB145와 유사한 방법으로 제조하였다.

I181-G182, N193F 및 L204F의 결실을 포함하는, BSG 변이체 TVB161은 PCR 반응의 주형이 플라스미드 pTVB146 (amyS 내에 TVB146 돌연변이를 포함하는 pPL1117 및 제1 PCR에 대한 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드는 BSGM3이다)라는 점을 제외하고는 이전의 두 변이체와 동일한 방법으로 제조하였다.

I181-G182, N193F 및 E210H의 결실을 포함하는, BSG 변이체 TVB162는 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드가 BSGM4 (SEQ ID NO: 20)이라는 점을 제외하고는 TVB161과 유사한 방법으로 제조하였다.

I181-G182, N193F 및 E214Q의 결실을 포함하는, BSG 변이체 TVB163은 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드가 BSGM5 (SEQ ID NO: 21)이라는 점을 제외하고는 TVB161과 유사한 방법으로 제조하였다.

상기 제조된 BSG 변이체는 그 후 상기의 "재료 및 방법" 편에서 기술한 대로 발효되고 정제하였다.

실시예 2

칼슘- 및 pH-의존 안정성의 측정

보통, 산업적 액화 공정은 액화 pH로서 pH 6.0-6.2의 사용 및 95℃-105℃에서 안정성을 증가하기 위한 40 ppm 유리 칼슘의 첨가로 진행된다. 여기에 제시된 일부 치환이

1. pH 6.2 보다 낮은 pH 및/또는

2. 40 ppm 유리 칼슘보다 낮은 유리 칼슘 레벨에서

안정성을 증가시키기 위해 사용되었다.

두가지 다른 방법이 B. stearothermophilus의 α-아밀라제에 다른 치환에 의해 얻은 안정성의 증가를 측정하기 위해 사용되었다:

방법 1. 5 ppm 유리 칼슘의 존재하에서, 감소된 pH, pH 5.0에서 안정성을 측정하는 분석. 변이체 10㎍을 다음의 환경하에서 배양하였다: 0.1M 아세테이트 용액, pH 는 pH 5.0으로 조정, 5ppm 칼슘 함유 및 5% w/w 보통 옥수수 녹말 (칼슘 없음). 배양은 95℃ 수조에서 30분간 하였다.

방법 2. pH를 pH 6.0으로 유지하고 유리 칼슘은 부존재 하에서 안정성을 측정하는 분석. 이 분석은 칼슘 민감도의 감소를 측정한다: 변이체 10㎍을 다음 환경하에서 배양하였다: 0.1M 아세테이트 용액, pH 는 pH 6.0으로 조정, 5% w/w 보통 옥수수 녹말 (칼슘 없음) 포함. 배양은 95℃ 수조에서 30분간 하였다.

안정성 결정

모든 안정성 시험 1, 2는 동일한 배치를 사용하였다. 방법은:

효소는 적절한 환경 (1-4)하에서 배양하였다. 샘플은 0, 5, 10, 15 및 30 분에 꺼냈고 분석 완충액 (0.1M 50mM Britton 완충액 pH 7.3)에서 25회 (취해진 모든 샘플에 대해 동일한 희석) 희석하고 활성은 pH 7.3, 37℃ 표준환경 하에서 Phadebas 분석 (Pharmacia)를 사용하여 측정하였다.

배양 전 (0 분)에 측정된 활성은 참조 (100%)로서 사용하였다. 퍼센트의 감소는 배양시간의 함수로서 계산되었다. 표는 30분 배양 후 잔류 활성을 보여준다.

안정성 방법 1. / 낮은 pH 안정성 증가

배양 시간 (분)	WT. SEQ ID NO: 3 아밀라제 (BSG)	위치 I181-G182 에서 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 변이체 (TVB145)	위치 I181-G182 + N193F에 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 변이체 (TVB146)	위치 I181-G182 + N193F + E214Q에 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 변이체 (TVB163)
0	100	100	100	100
5	29	71	83	77
10	9	62	77	70
15	3	50	72	67
30	1	33	62	60

안정성 방법 1. / 낮은 pH 안정성 증가

SEQ ID NO: 1 및 2에 대해 언급했던 아밀라제는 SEQ ID NO: 3에 대한 것보다 낮은 열안정성을 가지기 때문에 방법 1에 기술된 온도는 95℃에서 70℃로 감소하였다.

배양 시간 (분)	WT. SEQ ID NO: 2 아밀라제	위치 D183-G184 에서 결실이 있는 SEQ ID NO: 2 변이체	SEQ ID NO: 1 아밀라제	위치 T183-G184 에서 결실이 있는 SEQ ID NO: 1 변이체
0	100	100	100	100
5	73	92	41	76
10	59	88	19	69
15	48	91	11	62
30	28	92	3	59

안정성 방법 2. / 낮은 칼슘 민감도

배양 시간 (분)	WT. SEQ ID NO: 3 아밀라제 (BSG)	위치 I181-G182 에서 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 변이체 (TVB145)	위치 I181-G182 + N193F에 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 변이체 (TVB146)	위치 I181-G182 + N193F + E214Q에 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 변이체 (TVB163)
0	100	100	100	100
5	60	82	81	82
10	42	76	80	83
15	31	77	81	79
30	15	67	78	79

특이적 활성 결정

특이적 활성은 활성/mg 효소 로서 Phadebas 분석 (Pharmacia)를 사용하여 결정했다. 활성은 여기의 재료 및 방법편에서 기술한 α-아밀라제 분석을 사용하여 결정했다.

부모 효소 및 단일 및 이중 돌연변이의 특이적 활성은:

BSG: SEQ ID NO: 3 (부모 효소) 20000 NU/mg

TVB145: I181-G182 위치에 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 :(단일 돌연변이)

34600 NU/mg

TVB146: I181-G182 + N193F 위치에 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 :(이중 돌연변이) 36600 NU/mg

TVB163: I181-G182+N193F+E214Q 위치에 결실이 있는 SEQ ID NO: 3 :(삼중 돌연변이) 36300 NU/mg

로 결정되었다.

실시예 3

α-아밀라제 변이체 TVB146에 의한 파이롯트 플랜트 분사 증자 및 액화

파이롯트 플랜트 액화 실험은, 부모 BSG α-아밀라제 (SEQ ID NO: 3)가 함께 있는 제조된 BSG α-아밀라제 변이체 TVB146 (I181-G182 + N193F 위치에 결실이 있는 SEQ ID NO:3)의 성능을 비교하기 위해, 5 ppm의 Ca²⁺이 첨가된 pH 5.5에서 50 NU (S)/g DS의 투여량을 사용하여 소형분사 시스템에서 수행하였다. 반응은 시간의 함수로서 DE 증가 (Neocuproine 방법)를 측정하여 모니터 하였다.

옥수수 녹말 현탁액은 탈이온수에 11.8 kg Cerestar C^*Pharm GL 03406 (89% 녹말)을 현탁시키고 30 kg으로 만들어서 준비하였다. pH는 0.55 g의 CaCl₂, 2H₂O를 첨가한 후에 주위온도에서 5.5로 조정하였다.

다음의 효소가 사용되었다.

TVB146 108 KNU(S)/g, 146 KNU(SM9)/g

BSG 아밀라제 101 KNU(S)/g, 98 KNU(SM9)/g

50 NU (SM9)/g DS에 해당하는 효소의 양을 첨가하고, 전도성은 NaCl을 사용하여 300mS로 조정하였다. 표준조건은 다음과 같다:

기질 농도 35 % w/w (최초)

31.6-31.9 % w/w (최종)

온도 105℃, 5 분 (제1 액화)

95℃, 90 분 (제2 액화)

pH (최초) 5.5

분사 후, 액화 녹말을 수집하고 밀봉된 열플라스크에 담아 파이롯트 플랜트에서, 95℃에서 제2 액화가 속행되는 실험실로 운반하였다.

10 ml 샘플을 15-90 분 사이에 15 분 간격으로 취했다. 1N HCl 2 방울을 효소를 불활성화하기 위해 첨가하였다. 이들 샘플로부터, 0.3-0.1 g (예상되는 DE에 따라)을 무게 재고 100 ml로 희석하였다. 환원당은 그 후 Neocuproine 방법 (향상된 정확성으로 환원당의 결정. Dygert, Li, Florida 및 Thomas (1965). Anal. Biochem 13, 368) 및 결정된 DE 값에 따라서 결정하였다. 시간의 함수로서 DE의 개발은 다음 표에 주어져 있다:

	TVB146	BSG
Time (분)	DE (neocuproine)
15	2.80	2.32
30	4.88	3.56
45	6.58	4.98
60	8.17	6.00
75	9.91	7.40
90	11.23	8.03

낮은 레벨의 칼슘에서 산업상 적절한 응용환경 하에서 α-아밀라제 변이체 TVB146은 부모 BSG α-아밀라제보다 상당히 우수한 성능을 보이는 것을 볼 수 있다.

실시예 4

α-아밀라제 변이체 (TVB146 및 LE174)의 조합에 의한 분사 증자 및 액화

α-아밀라제 변이체, TVB146 및 LE174 (비율 1:1)의 조합을 사용한 분사 증자 및 액화는 다음 조건에서 수행하였다:

기질 A.E. Staley food 등급 옥수수 녹말가루 (1001bs)

D.S. 35% 탈이온수 사용

유리 Ca²⁺pH 5.3 에서 2.7 ppm (비 첨가, 오직 녹말로부터)

초기 pH 5.3

각 효소 변이체에 대한 AF9 유니트 (AF9은 신청으로 획득가능) 투여량은 56 NU/g의 총 투여량에 대한 28 NU/g 녹말 db이다.

제1 액화에서 온도 105℃

제1 액화의 유지시간 5분

제2 액화에서 온도 95℃

제2 액화 개시 15분 후에 500cc 탈이온수 및 1ml의 1N HCl를 포함하는 1리터 부피 용기에 1.5 gms의 가수분해물을 첨가하고 첨가된 정확한 wt.는 기록되었다. 이것은 15분 간격으로 90분까지 그리고 추가적 시점인 127분까지 반복되었다. 이들은 1 리터까지 희석되었고 Dygert,Li, Florida 및 Thomas. 향상된 정확도의 환원당의 결정 (1965). Anal. Biochem 13, 368에 의하여 기술된 것과 같은 Neocuproine 방법을 통하여 덱스트로스 등가에 대해 결정하였다.

결과는 다음과 같다:

시간 DE

15 3.2

30 4.8

45 6.3

60 7.8

75 9.4

90 10.4

127 13.1

인용된 문헌

Claims

아밀라제 활성이 있는 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 변이체로서, 다음의 지역/위치 중 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 지역/위치에서의 돌연변이 또는 다른 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 대응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 변이체.

(여기의 SEQ ID NO: 1과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 2과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 3과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 4과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 5과 관계있는):

(여기의 SEQ ID NO: 6과 관계있는):
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 4에서 N190F/Q264S 또는 다른 부모 α-아밀라제에서 대응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 3에서 I181^*/G182^*/N193F 또는 다른 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제에서 대응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 3 항에 있어서, SEQ ID NO: 3에서 E214Q 위치 또는 다른 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제에서 대응하는 위치에서의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 부모 α-아밀라제는 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5의 잡종 α-아밀라제인 것을 특징으로 하는 변이체.
제 5 항에 있어서, 부모 잡종 α-아밀라제는 SEQ ID NO: 4에 나타낸 B. licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO: 5에 나타낸 B. amyloliquefaciens로부터 유래한 α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기를 포함하는 잡종 α-아밀라제인 것을 특징으로 하는 변이체.
제 6 항에 있어서, 부모 잡종 Termamyl 유사 α-아밀라제는 다음의 돌연변이: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEQ ID NO: 4의 번호를 사용)를 더 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항에 있어서, 산성 pH 및/또는 낮은 Ca²⁺농도에서 상승된 안정성을 보이는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체.
제 9 항에 따른 DNA 구조체를 운반하는 재조합 발현 벡터.
제 9 항에 따른 DNA 구조체 또는 제 10 항에 따른 벡터로 형질전환된 세포.
제 11 항에 있어서, 미생물인 것을 특징으로 하는 세포.
제 12 항에 있어서, 박테리아 또는 균류인 것을 특징으로 하는 세포.
제 13 항에 있어서, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus 또는 Bacillus thuringiensis와 같은 그람 양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 세포.
선택적으로 비-먼지 입자, 안정화 액체 또는 보호된 효소의 형태인, 제 1 항 내지 제 8 항의 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 세제 첨가제.
제 15 항에 있어서, 첨가제의 0.02-200 mg 효소 단백질/g을 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 첨가제.
제 15 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼록시다제, 다른 아밀로분해 효소 및/또는 셀룰라제와 같은 다른 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 첨가제.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
제 18 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼록시다제, 다른 아밀로분해 효소 및/또는 셀룰라제와 같은 다른 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 수동 또는 자동 식기세척 세제 조성물.
제 20 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼록시다제, 다른 아밀로분해 효소 및/또는 셀룰라제와 같은 다른 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식기세척 세제 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체를 포함하는 수동 또는 자동 세탁물 세척 조성물.
제 22 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼록시다제, 다른 아밀로분해 효소 및/또는 셀룰라제와 같은 다른 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세탁물 세척 조성물.
(ⅰ) SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 B. stearothermophilus α-아밀라제로부터 유래한 (부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로서) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO: 4에 나타낸 서열을 가지는 B. licheniformis의 α-아밀라제의 혼합물; 또는

(ⅱ) 하나 이상의 다른 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로부터 유래한 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 B. stearothermophilus의 α-아밀라제의 혼합물; 또는

(ⅲ) 하나 이상의 다른 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로부터 유래한 본 발명에 따른 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 B. stearothermophilus α-아밀라제로부터 유래한 (부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로서) 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 변이체의 혼합물을 포함하는 조성물.
SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 B. stearothermophilus α-아밀라제로부터 유래한 (부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로서) 제 1 항 및 제 8 항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 변이체와 SEQ ID NO: 4에 나타낸 서열을 가지는 B. licheniformis α-아밀라제로부터 유래한 Termamyl 유사 α-아밀라제의 혼합물을 포함하는 조성물.
SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 B. stearothermophilus α-아밀라제로부터 유래한 (부모 Termamyl 유사 α-아밀라제로서) 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 변이체 및 SEQ ID NO: 5에 나타낸 B. amyloliquefaciens α-아밀라제의 부분과 SEQ ID NO: 4에 나타낸 B. licheniformis α-아밀라제의 부분을 포함하는 잡종 α-아밀라제의 혼합물을 포함하는 조성물.
제 26 항에 있어서, 잡종 α-아밀라제는 SEQ ID NO: 4에 나타낸 B. licheniformis α-아밀라제의 445 C-말단 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO: 5에 나타낸 B. amyloliquefaciens로부터 유래한 α-아밀라제의 37 N-말단 아미노산 잔기를 포함하는 잡종 α-아밀라제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27 항에 있어서, 잡종 α-아밀라제는 다음의 돌연변이 : H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEQ ID NO: 4의 번호를 사용)를 더 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 26 항에 있어서, TVB146 및 LE174의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체 또는 제 24 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 따른 조성물의 세탁 및/또는 식기세척을 위한 용도.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체 또는 제 24 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 따른 조성물의 섬유 풀빼기를 위한 용도.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 α-아밀라제 변이체 또는 제 24 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 따른 녹말 액화를 위한 용도.
(a) 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제를 암호화하는 DNA 서열을 무작위 돌연변이를 수행하는 단계,

(b) (a)단계에서 획득한 돌연변이된 DNA 서열을 숙주세포에서 발현시키는 단계, 및

(c) 부모 α-아밀라제에 관련하여 낮은 pH 및 낮은 칼슘 농도에서 증가된 안정성을 가지는 돌연변이된 α-아밀라제를 발현하는 숙주세포를 스크리닝하는 단계:

를 포함하는, 부모에 비하여 낮은 pH 및 낮은 칼슘 농도에서 증가된 안정성을 보이는 부모 Termamyl 유사 α-아밀라제의 변이체의 생산방법.