BR112021005412A2 - preparação de enzima, processo para fabricar uma preparação de enzima estável, métodos para reduzir a perda da atividade proteolítica, para preparação de uma formulação detergente, para remover manchas e para aumentar a estabilidade na armazenagem de uma formulação detergente líquida, usos de um composto e da preparação de enzima, e, formulação detergente - Google Patents

Abstract

Preparação de enzima compreendendo o componente (a): pelo menos um composto conforme a fórmula geral (I) em que as variáveis da fórmula (i) são como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e arila alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1-C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H; componente (b): pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das hidrolases (EC 3), preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo de proteases, mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62); e opcionalmente o componente (c): pelo menos um composto selecionado dentre solventes, estabilizantes de enzima diferentes do componente (a) e compostos estabilizando a preparação de enzima líquida como tal.

Description

1 / 96 PREPARAÇÃO DE ENZIMA, PROCESSO PARA FABRICAR UMA PREPARAÇÃO DE ENZIMA ESTÁVEL, MÉTODOS PARA REDUZIR A PERDA DA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA, PARA PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO DETERGENTE, PARA REMOVER MANCHAS E

PARA AUMENTAR A ESTABILIDADE NA ARMAZENAGEM DE UMA FORMULAÇÃO DETERGENTE LÍQUIDA, USOS DE UM COMPOSTO E DA PREPARAÇÃO DE ENZIMA, E, FORMULAÇÃO DETERGENTE Descrição

[001] A presente invenção está direcionada para uma preparação de enzima, preferivelmente uma preparação de enzima líquida, compreendendo componente (a): pelo menos um composto conforme a fórmula geral (I) (I) em que as variáveis na fórmula (I) são como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila, R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C5 linear e alquila C3-C10 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H; componente (b): pelo menos uma enzima selecionada a partir

2 / 96 do grupo das hidrolases (EC 3), preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases, mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC

3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62); e opcionalmente componente (c): pelo menos um composto selecionado dentre solventes, estabilizantes de enzima diferentes do componente (a) e compostos estabilizando a preparação de enzima líquida como tal.

[002] As enzimas são geralmente produzidas comercialmente como um concentrado líquido, frequentemente derivadas de um caldo de fermentação. A enzima tende a perder a atividade enzimática se a mesma permanece em um ambiente aquoso e assim é prática convencional convertê- la para uma forma anidra: os concentrados aquosos podem ser liofilizados ou secos por pulverização por exemplo, na presença de um material carreador para formar agregados. Usualmente, os produtos de enzima sólida precisam ser “dissolvidos” antes do uso. Para estabilizar as enzimas nos produtos líquido, inibidores de enzima são geralmente utilizados, preferivelmente inibidores de enzima reversíveis, para inibir a atividade da enzima temporariamente até que o inibidor de enzima seja liberado.

[003] O ácido bórico e ácidos borônicos são conhecidos inibir reversivelmente as enzimas proteolíticas. Um debate da inibição de uma serina protease, a subtilisina, pelo ácido borônico é provida em Molecular & Cellular Biochemistry 51, 1983, pp. 5-32. Para reativação, este inibidor precisa ser removido antes ou durante a aplicação, o que pode ser feito por exemplo pela diluição.

[004] Por causa de considerações ambientais existe uma demanda para pelo menos reduzir as quantidades de compostos contendo boro usados para a estabilização de enzima. Existe uma procura por alternativas para

3 / 96 serem usadas como estabilizantes de enzima na presença das enzimas.

[005] O problema a ser resolvido pela invenção atual se refere a prover um composto que ajude a reduzir a perda de atividade enzimática durante a armazenagem de produtos contendo enzima líquida. Foi um objeto adicional da presente invenção prover uma preparação de enzima que permitisse ser flexivelmente formulada em formulações detergentes líquidas ou formulações de limpeza com um tipo de enzimas ou misturas de enzimas.

[006] O problema foi resolvido provendo-se compostos conforme a fórmula geral (I): (I) em que as variáveis na fórmula (I) são como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila, R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C5 linear e alquila C3-C10 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H; e em que o dito composto sustenta a retenção da atividade enzimática de pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das hidrolases (EC 3), preferivelmente do grupo das proteases, mais preferivelmente das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente

4 / 96 do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62); durante a armazenagem das mesmas dentro de produtos líquidos.

[007] Os nomes das enzimas são conhecidos por aqueles versados na técnica com base nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Os nomes das enzimas incluem: um número EC (Enzyme Commission), nome recomendado, nomes alternativos (se algum), atividade catalítica e outros fatores; ver http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/ na última versão atualizada em 28 de junho de 2018.

[008] Em um aspecto, a invenção provê uma preparação de enzima contendo componente (a): pelo menos um estabilizante de enzima selecionado dentre os compostos conforme a fórmula geral (I) (I) em que as variáveis na fórmula (I) são como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila, R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C5 linear e alquila C3-C10 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H e

5 / 96 componente (b): pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das hidrolases (EC 3), preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases, mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC

3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62); e opcionalmente componente (c): pelo menos um composto selecionado dentre solventes, estabilizantes de enzima diferentes do componente (a) e compostos estabilizando a preparação de enzima líquida como tal.

[009] A preparação de enzima da invenção pode ser líquida a 20°C e 101,3 kPa. Os líquidos incluem soluções, emulsões e dispersões, géis etc. contanto que o líquido seja fluído e vertível. Em uma modalidade da presente invenção, composições detergentes líquidas de acordo com a presente invenção têm uma viscosidade dinâmica na faixa de cerca de 500 a cerca de

20.000 mPa*s, determinada a 25°C de acordo com Brookfield, por exemplo fuso 3 a 20 rpm com um viscosímetro de Brookfield LVT-II.

[0010] Em uma modalidade, líquido significa que a preparação de enzima não mostra formação de precipitado visível ou turbidez depois da armazenagem da preparação de enzima líquida, preferivelmente depois de pelo menos 20 dias de armazenagem a 37°C. Componente (a)

[0011] Mais especificamente, o componente (a) é um composto da fórmula geral (I) (I)

6 / 96 em que as variáveis na fórmula (I) são definidas como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila, R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H. Os exemplos de alquila C1-C8 linear são metila, etila, n-propila, n- butila, n-pentila, etc. Os exemplos de alquila C3-C8 ramificada são 2-propila, 2-butila, sec-butila, terc-butila, 2-pentila, 3-pentila, iso-pentila, etc. Os exemplos de arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila, são fenila, 1-naftila, 2-naftila, grupo do ácido ortofenilcarboxílico, grupo do ácido metafenilcarboxílico, grupo do ácido parafenilcarboxílico, orto-hidroxifenila, para-hidroxifenila, etc.

[0012] Em uma modalidade, R1 no composto conforme a fórmula (I) é selecionado dentre H, acetila e propionila. Em uma modalidade, R1 no composto conforme a fórmula (I) é H. Em uma modalidade, R1 no composto conforme a fórmula (I) é acetila. Em uma modalidade, R1 no composto conforme a fórmula (I) é propionila.

[0013] Em uma modalidade, R2 no composto conforme a fórmula (I) é H e R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6- C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1-C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada.

[0014] Em uma modalidade, R2, R3, R4 no composto conforme a fórmula (I) são os mesmos, em que R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila

7 / 96 C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6- C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1-C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada.

[0015] Em uma modalidade, R1 no composto conforme a fórmula (I) é H e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear, fenilmetila e grupo do ácido ortofenilcarboxílico (salicila).

[0016] Em uma modalidade, R1, R2 e R3 no composto conforme a fórmula (I) são H e R4 é selecionado dentre alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2. Em uma modalidade, R1 e R2 no composto conforme a fórmula (I) são H e R3 e R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2.

[0017] Em uma modalidade, R1 no composto conforme a fórmula (I) é acetila e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2 e C4.

[0018] O componente (a) inclui sais do composto conforme a fórmula (I). Os sais incluem metal alcalino e sais de amônio por exemplo, aqueles de mono- e trietanolamina. Preferência é dada aos sais de potássio e sais de sódio.

[0019] Em uma modalidade da presente invenção, preparações de enzima, preferivelmente preparações de enzima líquida, compreende componente (a) em quantidades na faixa de 0,1% a 30% em peso, relativo ao peso total da preparação de enzima. A preparação de enzima pode compreender componente (a) em quantidades na faixa de 0,1% a 15% em peso, 0,25% a 10% em peso, 0,5% a 10% em peso, 0,5% a 6% em peso, ou 1% a 3% em peso, todas em relação ao peso total da preparação de enzima.

[0020] Em uma modalidade da presente invenção, o composto (a) compreende pelo menos um derivado pelo menos parcialmente hidrolisado do composto (a) como impureza. Em uma modalidade da presente invenção, o

8 / 96 componente (a) compreende como uma impureza de um composto totalmente hidrolisado (a’) que é como segue: (II) em que as variáveis R1, R2, R3 e R4 são as mesmas como descritas para o componente (a) acima.

[0021] Tal impureza pode equivaler até 50% em mol, preferivelmente 0,1 a 20% em mol, ainda mais preferivelmente 1 a 10% em mol do componente (a). Embora as impurezas possam originar a partir da síntese do componente (a) e possam ser removidas pelos métodos de purificação não é preferido remove-las. Componente (b)

[0022] Em um aspecto da invenção, pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) é parte de um concentrado de enzima líquida. “Concentrado de enzima líquida” aqui significa qualquer produto compreendendo a enzima líquida compreendendo pelo menos uma enzima. “Líquido” no contexto de concentrado de enzima está relacionado com a aparência física a 20°C e 101,3 kPa.

[0023] O concentrado de enzima líquida pode resultar da dissolução da enzima sólida no solvente. O solvente pode ser selecionado dentre água e um solvente orgânico. Um concentrado de enzima líquida resultando da dissolução da enzima sólida no solvente pode compreender quantidades de enzima até a concentração de saturação.

[0024] A dissolução aqui significa, que os compostos sólidos são liquefeitos pelo contato com pelo menos um solvente. A dissolução significa

9 / 96 dissolução completa de um composto sólido até que a concentração de saturação seja obtida em um solvente especificado, em que nenhuma separação de fase ocorre.

[0025] Em um aspecto da invenção, o componente (b) do concentrado de enzima resultante pode ser livre de água, significa que nenhuma quantidade significante de água está presente. Quantidades de água não significantes aqui significa, que a preparação de enzima compreende menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 7%, menos do que 5%, menos do que 4%, menos do que 3%, menos do que 2% em peso de água, todas em relação ao peso total do concentrado de enzima, ou nenhuma água. Em uma modalidade, o concentrado de enzima livre de água livre de água significa que o concentrado de enzima não compreende quantidades significantes de água, mas compreende solventes orgânicos em quantidades de 30 a 80% em peso, relativo ao peso total do concentrado de enzima.

[0026] Os concentrados de enzima líquida compreendendo água podem ser chamados de “concentrados de enzima aquosa”. Os concentrados de enzima aquosa podem se soluções compreendendo enzima, em que o produto de enzima sólida foi dissolvido em água. Em uma modalidade “concentrado de enzima aquosa” significa produtos compreendendo enzimas resultantes da produção de enzima pela fermentação.

[0027] Fermentação significa o processo de cultivar células recombinantes que expressam a enzima desejada em um meio nutriente adequado permitindo que as células hospedeiras recombinantes cresçam (este processo pode ser chamado de fermentação) e expressem a proteína desejada. No final da fermentação, o caldo de fermentação geralmente é coletado e adicionalmente processado, em que o caldo de fermentação compreende uma fração líquida e uma fração sólida. Dependendo se a enzima foi secretada dentro da fração líquida ou não, a proteína ou enzima desejadas podem ser

10 / 96 recuperadas a partir da fração líquida do caldo de fermentação ou a partir dos lisados de célula. A recuperação da enzima desejada usa métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os métodos adequados para a recuperação de proteínas ou enzimas a partir do caldo de fermentação incluem, mas não são limitados a coleta, centrifugação, filtração, extração e precipitação.

[0028] Os concentrados de enzima líquida, podem compreender quantidades de enzima na faixa de 0,1% a 40% em peso, ou 0,5% a 30% em peso, ou 1% a 25% em peso, ou 3% a 25% em peso, ou 5% a 25% em peso, todas em relação ao peso total do concentrado de enzima. Em uma modalidade, os concentrados de enzima líquida são resultantes da fermentação e são aquosos.

[0029] Os concentrados de enzima aquosos resultantes da fermentação podem compreender água em quantidades de mais do que cerca de 50% em peso, mais do que cerca de 60% em peso, mais do que cerca de 70% em peso, ou mais do que cerca de 80% em peso, todas em relação ao peso total do concentrado de enzima. Os concentrados de enzima aquosos que resultam da fermentação, podem compreender componentes residuais tais como provenientes do meio de fermentação, fragmentos de célula provenientes da produção de células hospedeiras, metabólitos produzidos pela produção de células hospedeiras durante a fermentação. Em uma modalidade, os componentes residuais podem estar compreendidos no concentrado de enzima líquida em quantidades menores do que 30% em peso, menores do que 20% em peso, menores do que 10% em peso ou menores do que 5% em peso, todas em relação ao peso total do concentrado de enzima aquosa.

[0030] Pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) é selecionada dentre hidrolases (EC 3), a seguir também aludidas como enzima (componente (b)). As enzimas (componente (b)) preferidas são selecionadas a partir do grupo das enzimas atuando na ligação de éster (E.C. 3.1), das glicosilases (E.C. 3.2) e peptidases (E.C. 3.4). As enzimas atuando na ligação

11 / 96 de éster (E.C. 3.1), são a seguir também aludidas como lipases (componente (b)), respectivamente. As glicosilases (E.C. 3.2) são a seguir também aludidas como amilases (componente (b)) e celulases (componente (b)). As peptidases são a seguir também aludidas como proteases (componente (b)).

[0031] As hidrolases (componente (b)) no contexto da presente invenção são identificadas pelas sequências de polipeptídeo (aqui também chamadas de sequências de aminoácido). A sequência de polipeptídeo especifica a estrutura tridimensional incluindo o “sítio ativo” de uma enzima que por sua vez determina a atividade catalítica da mesma. As sequências de polipeptídeo podem ser identificadas por uma SEQ ID NO. De acordo com o World Intellectual Property Office (WIPO) Standard ST.25 (1998) os aminoácidos aqui são representados usando o código de três letras com a primeira letra como uma maiúscula ou a letra correspondente.

[0032] A enzima (componente (b)) de acordo com a invenção se refere às enzimas precursoras e/ou enzimas variantes, ambas tendo atividade enzimática. As enzimas tendo atividade enzimática são enzimaticamente ativas ou exercem conversão enzimática, significando que as enzimas atuam sobre os substratos e convertem os mesmos em produtos. O termo “enzima” aqui exclui variantes inativas de uma enzima.

[0033] Uma sequência “precursora” (de uma proteína ou enzima precursora, também chamada de “enzima precursora”) é a sequência de partida para a introdução de mudanças (por exemplo, pela introdução de uma ou mais substituições, inserções, deleções de aminoácidos ou uma combinação das mesmas) para a sequência, resultando em “variantes” das sequências precursoras. O termo enzima precursora (ou sequência precursora) inclui enzimas do tipo selvagem (sequências) e sequências sinteticamente geradas (enzimas) que são usadas como sequências de partida para a introdução de mudanças (adicionais).

[0034] Os termos “variante de enzima” ou “variante de sequência” ou

12 / 96 “enzima variante” se referem a uma enzima que difere da sua enzima precursora na sua sequência de aminoácido até um certo grau. Se não de outro modo indicado, enzima variante “tendo atividade enzimática” significa que esta enzima variante tem o mesmo tipo de atividade enzimática como a respectiva enzima precursora.

[0035] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita como segue é usada: as substituições de aminoácido são descritas provendo-se o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácido, seguido pelo aminoácido substituído.

[0036] As deleções de aminoácido são descritas provendo-se o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácido, seguido por *.

[0037] As inserções de aminoácido são descritas provendo-se o aminoácido original da enzima precursora seguido pelo número da posição dentro da sequência de aminoácido, seguido pelo aminoácido original e pelo aminoácido adicional. Por exemplo, uma inserção na posição 180 da lisina ao lado da glicina é designada como “Gly180GlyLys” ou “G180GK”.

[0038] Nos casos onde uma substituição e uma inserção ocorrem na mesma posição, isto pode ser indicado como S99SD+S99A ou resumindo S99AD. Nos casos onde um resíduo de aminoácido idêntico ao resíduo de aminoácido existente é inserido, é óbvio que a degenerescência na nomenclatura surge. Se por exemplo uma glicina é inserida depois da glicina no exemplo acima isto seria indicado por G180GG.

[0039] Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr, Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 com tirosina ou ácido glutâmico. Alternativamente alterações diferentes ou substituições opcionais podem ser indicadas em colchetes por exemplo,

13 / 96 Arg170[Tyr, Gly] ou Arg170{Tyr, Gly}; ou resumindo R170 [Y,G] ou R170 {Y, G}; ou por extenso R170Y, R170G.

[0040] As variantes de enzima podem ser definidas pela sua identidade de sequência quando comparadas a uma enzima precursora. A identidade de sequência geralmente é provida como “% da identidade de sequência” ou “% da identidade”. Para os cálculos das identidades de sequência, em uma primeira etapa um alinhamento de sequência tem que ser produzido. De acordo com esta invenção, um alinhamento global aos pares tem que ser produzido, significando que duas sequências têm que ser alinhadas em relação ao seu comprimento completo, que é geralmente produzido usando-se uma abordagem matemática, chamada de algoritmo de alinhamento.

[0041] De acordo com a invenção, o alinhamento é gerado usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453). Preferivelmente, o programa “NEEDLE” (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) é usado para os propósitos da atual invenção, usando os programas de parâmetro de default (abertura de interstício = 10,0, extensão de interstício = 0,5 e matriz = EBLOSUM62).

[0042] De acordo com esta invenção, o seguinte cálculo de % de identidade se aplica:% de identidade = (resíduos idênticos / comprimento da região de alinhamento que está mostrando a respectiva sequência desta invenção em relação ao seu comprimento completo) * 100.

[0043] De acordo com esta invenção, as variantes de enzima podem ser descritas como uma sequência de aminoácido que seja pelo menos n% idêntica à sequência de aminoácido da enzima precursora respectiva com “n” sendo um número inteiro entre 10 e 100. Em uma modalidade, enzimas variantes são pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%,

14 / 96 pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas sequência de aminoácido de comprimento completo da enzima precursora, em que a variante de enzima tem atividade enzimática.

[0044] As variantes de enzima podem ser definidas pela sua similaridade de sequência quando comparadas a uma enzima precursora. A similaridade de sequência geralmente é provida como “% de similaridade de sequência” ou “% de similaridade”.% de similaridade de sequência leva em consideração que conjuntos definidos de aminoácidos compartilham propriedades similares, por exemplo, pelo seu tamanho, pela sua hidrofobicidade, pela sua carga ou pelas outras características. Aqui, a troca de um aminoácido com um aminoácido similar pode ser chamado “mutação conservativa”.

[0045] Para a determinação de % de similaridade de acordo com esta invenção o seguinte se aplica: aminoácido A é similar aos aminoácidos S; aminoácido D é similar aos aminoácidos E e N; aminoácido E é similar aos aminoácidos D e K e Q; aminoácido F é similar aos aminoácidos W e Y; aminoácido H é similar aos aminoácidos N e Y; aminoácido I é similar aos aminoácidos L e M e V; aminoácido K é similar aos aminoácidos E e Q e R; aminoácido L é similar aos aminoácidos I e M e V; aminoácido M é similar aos aminoácidos I e L e V; aminoácido N é similar aos aminoácidos D e H e S; aminoácido Q é similar aos aminoácidos E e K e R; aminoácido R é similar aos aminoácidos K e Q; aminoácido S é similar aos aminoácidos A e N e T; aminoácido T é similar aos aminoácidos S; aminoácido V é similar aos aminoácidos I e L e M; aminoácido W é similar aos aminoácidos F e Y; aminoácido Y é similar aos aminoácidos F e H e W.

[0046] As substituições de aminoácido conservativas podem ocorrer em relação ao comprimento completo da sequência de uma sequência de

15 / 96 polipeptídeo de uma proteína funcional tal como uma enzima. Em uma modalidade, tais mutações não são pertencentes aos domínios funcionais de uma enzima. Em uma modalidade, as mutações conservativas não são pertencentes aos centros catalíticos de uma enzima.

[0047] Para levar as mutações conservativas em conta, um valor para a similaridade de sequência de duas sequências de aminoácido pode ser calculado a partir do mesmo alinhamento, que é usado para calcular a % de identidade.

[0048] De acordo com esta invenção, o seguinte cálculo de % de similaridade aplica: a % de similaridade = [(resíduos idênticos + resíduos similares) / comprimento da região de alinhamento que está mostrando a(s) sequência(s) respectiva(s) desta invenção em relação ao seu comprimento completo] *100.

[0049] De acordo com esta invenção, as variantes de enzima podem ser descritas como uma sequência de aminoácido que seja pelo menos m % similar à sequência precursoras respectiva com “m” sendo um número inteiro entre 10 e 100. Em uma modalidade, enzimas variantes são pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo da enzima precursora, em que a enzima variante tem atividade enzimática.

[0050] “Atividade enzimática” significa o efeito catalítico exercido por uma enzima, que geralmente é expresso como unidades por miligrama de enzima (atividade específica) que se refere às moléculas de substrato transformadas por minuto por molécula de enzima (atividade molecular).

[0051] As enzimas variantes podem ter atividade enzimática de acordo com a presente invenção quando as ditas variantes de enzima exibem

16 / 96 pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% da atividade enzimática da enzima precursora respectiva. Protease

[0052] Em um aspecto da invenção, pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) é selecionada a partir do grupo das hidrolases (EC 3), preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases, mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo da serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62).

[0053] As proteases são membros da classe EC 3.4. As proteases (componente (b)) incluem aminopeptidases (EC 3.4.11), dipeptidases (EC

3.4.13), dipeptidil-peptidases e tripeptidil-peptidases (EC 3.4.14), peptidil- dipeptidases (EC 3.4.15), carboxipeptidases tipo serina (EC 3.4.16), metalocarboxipeptidases (EC 3.4.17), carboxipeptidases topo cisteína (EC

3.4.18), ômega peptidases (EC 3.4.19), serina endopeptidases (EC 3.4.21), cisteína endopeptidases (EC 3.4.22), endopeptidases aspártica (EC 3.4.23), metaloendopeptidases (EC 3.4.24), treonina endopeptidases (EC 3.4.25) ou endopeptidases de mecanismo catalítico desconhecido (EC 3.4,99).

[0054] Em uma modalidade, pelo menos uma protease (componente (b)) é selecionada dentre serina proteases (EC 3.4.21). A serina proteases ou serina peptidases são distinguidas por terem uma serina no sítio cataliticamente ativo, que forma um aduto covalente com o substrato durante a reação catalítica. Uma serina protease (componente (b)) no contexto da presente invenção é selecionada a partir do grupo consistindo em quimotripsina, por exemplo, EC 3.4.21.1), elastase por exemplo, EC

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3.4.21.36), elastase, por exemplo, EC 3.4.21.37 ou EC 3.4.21.71), granzima por exemplo, EC 3.4.21.78 ou EC 3.4.21.79), calecreína por exemplo, EC

3.4.21.34, EC 3.4.21.35, EC 3.4.21.118 ou EC 3.4.21.119), plasmina por exemplo, EC 3.4.21.7), tripsina por exemplo, EC 3.4.21.4), trombina por exemplo, EC 3.4.21.5) e subtilisina. A subtilisina é também conhecida como subtilopeptidase, por exemplo, EC 3.4.21.62, a última a seguir também sendo aludida como “subtilisina”.

[0055] Um subgrupo das serina proteases tentativamente designado como subtilases foi proposto por Siezen et al. (1991), Protein Eng. 4:719-737 e Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523. As subtilases incluem a família da subtilisina, família da termitase, a família da proteinase K, a família da peptidase lantibiótica, a família da quexina e a família da pirolisina.

[0056] Um subgrupo das subtilases são as subtilisinas que são serina proteases da família S8 como definido pela base de dados MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk). A família da peptidase S8 compreende a serina endopeptidase subtilisina e seus homólogos. Na família S8A, os resíduos do sítio ativo frequentemente ocorrem nos motivos Asp-Thr/Ser-Gly (que é similar para a motivo de sequência nas famílias das endopeptidases aspártica no clã AA), His-Gly-Thr-His e Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro.

[0057] A classe relacionada com a subtilisina das serina proteases (componente (b)) compartilha uma sequência do aminoácido comum definindo uma tríade catalítica que as distinguem da classe relacionada com a quimotripsina da serina proteases. As subtilisinas e quimotripsina relacionadas com a serina proteases ambas possuem uma tríade catalítica compreendendo aspartato, histidina e serina.

[0058] Os exemplos incluem as subtilisinas como descrito na WO 89/06276 e EP 0283075, WO 89/06279, WO 89/09830, WO 89/09819, WO 91/06637 e WO 91/02792.

[0059] As proteases são proteínas ativas exercendo “atividade de

18 / 96 protease” ou “atividade proteolítica”. A atividade proteolítica está relacionada com a taxa de degradação de proteína por uma protease ou enzima proteolítica em um curso definido de tempo.

[0060] Os métodos para analisar a atividade proteolítica são bem conhecidos na literatura (ver por exemplo, Gupta et al. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 381-395). A atividade proteolítica pode ser determinada usando-se Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida (Suc-AAPF- pNA, AAPF curto AAPF; ver por exemplo, DelMar et al. (1979), Analytical Biochem 99, 316-320) como substrato. pNA é clivado da molécula de substrato pela clivagem proteolítica, resultando na liberação de cor amarela de pNA livre que pode ser quantificado pela medição OD405.

[0061] A atividade proteolítica pode ser provida em unidades por grama de enzima. Por exemplo, 1 U de protease pode corresponder à quantidade de protease que libera 1 μmol de aminoácidos positivos em folina e peptídeos (como tirosina) por minuto até o pH 8,0 e 37°C (caseína como substrato).

[0062] As proteases (componente (b)) do tipo de subtilisina (EC

3.4.21.62) podem ser proteases bacterianas provenientes de um microrganismo selecionadas dentre protease de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphilococcus, Streptococcus ou Streptomyces ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo tal como um Campilobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[0063] Em um aspecto da invenção, pelo menos uma protease (componente (b)) é selecionada dentre protease de Bacillus alcalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus gibsonii, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus

19 / 96 pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

[0064] Em uma modalidade da presente invenção, pelo menos uma protease (componente (b)) é selecionada das seguintes: subtilisina da Bacillus amiloliquefaciens BPN’ (descrita por Vasantha et al. (1984) J. Bacteriol. Volume 159, p. 811-819 e JA Wells et al. (1983) em Nucleic Acids Research, Volume 11, p. 7911-7925); subtilisina da Bacillus licheniformis (subtilisina Carlsberg; descrita em EL Smith et al. (1968) em J. Biol Chem, Volume 243, pp. 2184-2191 e Jacobs et al. (1985) em Nucl. Ácidos Res, Vol 13, p. 8913- 8926); subtilisina PB92 (sequência original da protease alcalina PB92 é descrita na EP 283075 A2); subtilisina 147 e/ou 309 (Esperase®, Savinase®, respectivamente) como descrita na WO 89/06279; subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792, tal como da Bacillus lentus DSM 5483 ou das variantes da Bacillus lentus DSM 5483 como descrita na WO 95/23221; subtilisina da Bacillus alcalophilus (DSM 11233) descrita em DE 10064983; subtilisina da Bacillus gibsonii (DSM 14391) como descrita na WO 2003/054184; subtilisina da Bacillus sp. (DSM 14390) descrita na WO 2003/056017; subtilisina da Bacillus sp. (DSM 14392) descrita na WO 2003/055974; subtilisina da Bacillus gibsonii (DSM 14393) descrita na WO 2003/054184; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 4 como descrita na WO 2005/063974; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 4 como descrita na WO 2005/103244; subtilisina tendo a SEQ ID NO: 7 como descrita na WO 2005/103244; e subtilisina tendo a SEQ ID NO: 2 como descrita no pedido DE 102005028295.4.

[0065] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos a subtilisina 309 (que pode ser aqui chamada de Savinase) como descrito como sequência a) na Tabela I da WO 89/06279 ou uma variante da mesma que seja pelo menos 80% idêntica a mesma e tem atividade proteolítica.

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[0066] Os exemplos de proteases (componente (b)) úteis de acordo com a presente invenção compreendem as variantes descritas nas: WO 92/19729, WO 95/23221, WO 96/34946, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 99/11768, WO 01/44452, WO 02/088340, WO 03/006602, WO 2004/03186, WO 2004/041979, WO 2007/006305, WO 2011/036263, WO 2011/036264 e WO 2011/072099. Os exemplos adequados compreendem especialmente variantes da subtilisina protease derivada de SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 (que é a sequência da protease alcalina madura da Bacillus lentus DSM 5483) com as substituições de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e 274 (de acordo com a numeração da BPN’), que tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, uma tal protease não é mutada nas posições Asp32, His64 e Ser221 (de acordo com a numeração da BPN’).

[0067] As proteases (componente (b)) adequadas incluem variantes da protease tendo atividade proteolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo da enzima precursora como descrito acima.

[0068] As proteases (componente (b)) adequadas incluem variantes da protease tendo atividade proteolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos

21 / 96 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo da enzima precursora.

[0069] Em uma modalidade, pelo menos uma protease (componente (b)) tem SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 ou uma protease que seja pelo menos 80% idêntica à mesma e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a dita protease é distinguida por ter aminoácido de ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) ou asparagina (N) ou glutamina (Q) ou alanina (a) ou glicina (G) ou serina (S) na posição 101 (de acordo com a numeração da BPN’) e tem atividade proteolítica. Em uma modalidade, a dita protease compreende um ou mais substituições adicionais: (a) treonina na posição 3 (3T), (b) isoleucina na posição 4 (4I), (c) alanina, treonina ou arginina na posição 63 (63A, 63T ou 63R), (d) ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 156 (156D ou 156E), (e) prolina na posição 194 (194P), (f) metionina na posição 199 (199M), (g) isoleucina na posição 205 (205I), (h) ácido aspártico, ácido glutâmico ou glicina na posição 217 (217D, 217E ou 217G), (i) combinações de dois ou mais aminoácidos de acordo com (a) a (h). Pelo menos uma protease (componente (b)) pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 e é distinguida por compreender um aminoácido (de acordo com (a)-(h)) ou combinações de acordo com (i) junto com o aminoácido 101E, 101D, 101N, 101Q, 101A, 101G ou 101S (de acordo com a numeração da BPN’) e tendo atividade proteolítica. Em uma modalidade, a dita protease é distinguida por compreender a mutação (de acordo com a numeração da BPN’) R101E ou S3T + V4I + V205I ou R101E e S3T, V4I e V205I ou S3T + V4I + V199M + V205I + L217D e tendo atividade proteolítica.

[0070] Em uma modalidade, a protease de acordo com SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 é distinguida por compreender a mutação (de acordo com a numeração da BPN’) S3T + V4I + S9R + A15T + V68A +

22 / 96 D99S + R101S + A103S + I104V + N218D e tendo atividade proteolítica.

[0071] Em uma modalidade, pelo menos uma protease é selecionada dentre enzimas de protease comercialmente disponíveis que incluem mas não são limitadas a produtos vendidos sob os nomes comerciais de Alcalase®, Blaze®, Duralase®, Durazym®, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® e Esperase® (Novozymes A/S), aqueles vendidos sob a marca de Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect® Prime, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Ultimase®, Opticlean®, Effectenz®, Preferenz® e Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem® (Gist-Brocases N.V.), Bacillus lentus Protease Alcalina (BLAP; sequência mostrada na Figura 29 da US 5.352.604) e variantes da mesma e KAP (subtilisina da Bacillus alkalophilus) da Kao Corp.

[0072] De acordo com a presente invenção, o componente (b) pode compreender uma combinação de pelo menos duas proteases, preferivelmente selecionadas a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente selecionadas a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) – tudo como descrito acima.

[0073] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre proteases de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, como descrito acima.

[0074] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada da subtilisina 309 como descrito na Tabela I a) da WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, como descrito acima.

[0075] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada a partir

23 / 96 do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e pelo menos uma lipase. Lipase

[0076] As “Lipases”, “enzima lipolítica”, “esterase lipídica”, todas se referem a uma enzima da classe EC 3.1.1 (“éster carboxílico hidrolase”). A lipase significa proteína ativa tendo atividade de lipase (ou atividade lipolítica; triacilglicerol lipase, EC 3.1.1.3), atividade de cutinase (EC

3.1.1.74; as enzimas tendo atividade de cutinase podem ser aqui chamadas de cutinase), atividade de esterol esterase (EC 3.1.1.13) e/ou atividade de cera- éster hidrolase (EC 3.1.1.50).

[0077] Os métodos para determinar a atividade lipolítica são bem conhecidos na literatura (ver por exemplo, Gupta et al. (2003), Biotechnol. Appl. Biochem. 37, p. 63-71). Por exemplo, a atividade de lipase pode ser medida pela hidrólise da ligação de éster no substrato de palmitato de para- nitrofenila (pNP-Palmitato, C:16) e liberam pNP que é amarelo e pode ser detectado a 405 nm.

[0078] “Atividade lipolítica” significa que o efeito catalítico exercido por uma lipase, que pode ser provida em unidades lipolíticas (LU). Por exemplo, 1LU pode corresponder à quantidade de lipase que produz 1 μmol de ácido graxo titulável por minuto em um pH stat. sob as seguintes condições: temperatura 30°C.; pH = 9,0; o substrato pode ser uma emulsão 3,3% em peso de óleo de oliva e 3,3% goma arábica, na presença de 13 mmol/l Ca2+ e 20 mmol/l NaCl em 5 mmol/l Tris-tampão.

[0079] As lipases (componente (b)) incluem aqueles de origem bacteriana ou fúngica. Em um aspecto da invenção, uma lipase (componente (b)) adequada é selecionada das seguintes: lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como descrito nas EP 258068, EP 305216, WO 92/05249 e WO 2009/109500 ou de

24 / 96 H. insolens como descrito na WO 96/13580; lipases derivadas de Rhizomucor miehei como descrito na WO 92/05249; lipase das cepas de Pseudomonas (algumas destas agora renomeadas para Burkholderia), por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218272, WO 94/25578, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 96/00292), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1372034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), Pseudomonas mendocina (WO 95/14783), P. glumae (WO 95/35381, WO 96/00292); lipase de Streptomyces griseus (WO 2011/150157) e S. pristinaespiralis (WO 2012/137147), lipases de Streptomyces tipo GDSL (WO 2010/065455); lipase de Thermobifida fusca como descrito na WO 2011/084412; lipase de Geobacillus stearothermophilus como descrito na WO 2011/084417; lipases Bacillus, por exemplo, como descrito na WO 00/60063, lipases de B. subtilis como descrito em Dartois et al. (1992), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360 ou WO 2011/084599, B. stearothermophilus (JP S64-074992) ou B. pumilus (WO 91/16422); lipase de Candida antarctica como descrito na WO 94/01541; cutinase de Pseudomonas mendocina (US 5389536, WO 88/09367); cutinase de Magnaporthe grisea (WO 2010/107560); cutinase de Fusarum solani pisi como descrito nas WO 90/09446, WO 00/34450 e WO 01/92502; e cutinase de Humicola lanuginosa como descrito nas WO 00/34450 e WO 01/92502.

[0080] As lipases (componente (b)) adequadas também incluem aqueles aludidos como aciltransferases ou per-hidrolases, por exemplo, aciltransferases com homologia a lipase A de Candida antarctica (WO 2010/111143), aciltransferase de Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), per-hidrolases da família CE7 (WO 2009/67279) e variantes da per-hidrolase de M. smegmatis em particular a variante S54V (WO 2010/100028).

[0081] As lipases (componente (b)) adequadas incluem também

25 / 96 aquelas que são variantes das lipases descritas acima que têm atividade lipolítica. Tais variantes de lipase (componente (b)) adequadas são por exemplo, aquelas que são desenvolvidas pelos métodos como descritos na WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/60063, WO 2007/087508, EP 407225 e EP 260105.

[0082] As lipases (componente (b)) adequadas incluem variantes de lipase tendo atividade lipolítica que seja pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo da enzima precursora como descrito acima.

[0083] As lipases (componente (b)) adequadas incluem variantes de lipase tendo atividade lipolítica que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo da enzima precursora.

[0084] Em uma modalidade, pelo menos uma lipase (componente (b)) é selecionada dentre triacilglicerol lipase fúngica (classe EC 3.1.1.3). A triacilglicerol lipase (componente (b)) fúngica pode ser selecionada dentre lipase de Thermomyces lanuginose. Em uma modalidade, a lipase (componente (b)) de Thermomyces lanuginosa é selecionada dentre triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e variantes das mesmas tendo atividade lipolítica. A triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2

26 / 96 da US 5869438 pode ser aqui chamada de Lipolase.

[0085] A lipase (componente (b)) de Thermomyces lanuginosa pode ser selecionada dentre variantes tendo atividade lipolítica que seja pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438.

[0086] A lipase (componente (b)) de Thermomyces lanuginosa pode ser selecionada dentre variantes tendo atividade lipolítica compreendendo apenas as mutações conservativas, que entretanto não pertencem do domínio funcional dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO:2 da US 5869438. As variantes de lipase desta modalidade tendo atividade lipolítica podem ser pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: v2 da US 5869438.

[0087] A lipase (componente (b)) Thermomyces lanuginosa pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 2 da US 5869438 distinguidas por terem aminoácido T231R e N233R. A dita lipase de Thermomyces lanuginosa pode adicionalmente compreender uma ou mais das seguintes trocas de aminoácidos: Q4V, V60S, A150G, L227G, P256K.

[0088] Em uma modalidade, pelo menos uma lipase é selecionada dentre lipases comercialmente disponíveis que incluem, mas não são limitadas a produtos vendidos sob os nomes comerciais de Lipolase®, Lipex®, Lipolex® e Lipoclean® (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (Gist-Brocades/ agora DSM).

[0089] De acordo com a presente invenção, o componente (b) pode compreender uma combinação de pelo menos duas lipases, preferivelmente

27 / 96 selecionadas dentre triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 e variantes das mesmas tendo atividade lipolítica como descrito acima.

[0090] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), preferivelmente selecionadas a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima.

[0091] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada das proteases de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica – todas como descrito acima.

[0092] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre subtilisina 309 como descrito na Tabela I a) da WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica – todas como descrito acima.

[0093] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente selecionadas a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e pelo menos uma amilase. Amilase

[0094] Em uma modalidade, as preparações de enzima inventivas compreendem pelo menos uma amilase (componente (b)). As “Amilases”

28 / 96 (componente (b)) de acordo com a invenção (alfa e/ou beta) incluem aqueles de origem bacteriana ou fúngica (EC 3.2.1.1 e 3.2.1.2, respectivamente). Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados a partir de proteína são incluídos.

[0095] As amilases (componente (b)) de acordo com a invenção têm “atividade amiolítica” ou “atividade de amilase” envolvendo (endo)hidrólise de ligações glicosídicas em polissacarídeos. A atividade de α-amilase pode ser determinada pelos ensaios para medição da atividade de α-amilase que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os exemplos para ensaiar a medição das atividades de α-amilase são: a atividade de α-amilase pode ser determinada por um método utilizando tabletes Phadebas como substrato (Phadebas Amylase Test, fornecido pela Magle Life Science). O amido é hidrolisado pela α-amilase dando fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azul resultante, espectrofotometricamente medida a 620 nm, é uma função da atividade da α- amilase. A absorbância medida está diretamente proporcional à atividade específica (atividade/mg de proteína de α-amilase pura) da α-amilase em questão sob o conjunto dado de condições.

[0096] A atividade de α-amilase também pode ser determinada por um método utilizando a Etiliden-4-nitrofenil-α-D-malto-heptaosídeo (EPS). O D-malto-heptaosídeo é um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase. Seguindo a clivagem, a α-glicosidase incluída no kit para digerir o substrato para liberar uma molécula de PNP livre que tem uma cor amarela e assim pode ser medida pela espectrometria visível a 405 nm. Os kits contendo substrato de EPS e α-glicosidase é fabricada pela Roche Costum Biotech (cat. No. 10880078103). A inclinação da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade específica (atividade por mg de enzima) da α-amilase em questão sob o dado conjunto de condições.

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[0097] A atividade amilolítica pode ser provida em unidades por grama de enzima. Por exemplo, 1 unidade de α-amilase pode liberar 1,0 mg de maltose de amido em 3 min no pH 6,9 a 20°C.

[0098] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ser selecionada a partir das seguintes: amilases da Bacillus licheniformis tendo a SEQ ID NO: 2 como descrito na WO 95/10603; amilases da B. stearothermophilus tendo a SEQ ID NO: 6 como descrito na WO 02/10355; amilases da Bacillus sp. 707 tendo a SEQ ID NO: 6 como descrito na WO 99/19467; amilases da Bacillus halmapalus tendo a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 como descrito na WO 96/23872, também descrito como SP-722; amilases da Bacillus sp. DSM 12649 tendo a SEQ ID NO: 4 como descrito na WO 00/22103; amilases da cepa TS-23 de Bacillus tendo a SEQ ID NO: 2 como descrito na WO 2009/061380; amilases da Cytophaga sp. tendo a SEQ ID NO: 1 como descrito na WO 2013/184577; amilases da Bacillus megaterium DSM 90 tendo a SEQ ID NO: 1 como descrito na WO 2010/104675; amilases da Bacillus sp. compreendendo os aminoácidos 1 a 485 da SEQ ID NO: 2 como descrito na WO 00/60060.

[0099] As amilases (componente (b)) adequadas incluem variantes de amilase tendo atividade de amilase que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo da enzima precursora como descrito acima.

[00100] As amilases (componente (b)) adequadas incluem variantes de amilase tendo atividade de amilase que são pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%,

30 / 96 pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% similares quando comparadas com a sequência de polipeptídeo de comprimento completo da enzima precursora.

[00101] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 12 como descrito na WO 2006/002643 ou é pelo menos 80% idêntica à mesma e tem atividade amiolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 12 e compreende as substituições as posições Y295F e M202LITV.

[00102] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 6 como descrito na WO 2011/098531 ou é pelo menos 80% idêntica à mesma e tem atividade amiolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 6 e compreende uma substituição em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em 193 [G,A,S,T ou M], 195 [F,W,Y,L,I ou V], 197 [F,W,Y,L,I ou V], 198 [Q ou N], 200 [F,W,Y,L,I ou V], 203 [F,W,Y,L,I ou V], 206 [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D ou E], 210 [F,W,Y,L,I ou V], 212 [F,W,Y,L,I ou V], 213 [G,UM,S,T ou M] e 243 [F,W,Y,L,I ou V].

[00103] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 1 como descrito na WO 2013/001078 ou é pelo menos 85% idêntica à mesma e tem atividade amiolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 1 e compreende uma alteração em duas ou mais (diversas) posições correspondendo as posições G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 e G477.

[00104] Pelo menos uma amilase (componente (b)) pode ter a SEQ ID NO: 2 como descrita na WO 2013/001087 ou é pelo menos 85% idêntico à mesma e tem atividade amiolítica. Pelo menos uma amilase pode ser pelo menos 85% idêntico à SEQ ID NO:2 e compreende uma deleção de posições

31 / 96 181+182 ou 182+183 ou 183+184 e tem atividade amiolítica. Em uma modalidade, a dita amilase pode compreender uma ou duas ou mais adicionalmente modificações em qualquer uma das posições correspondendo às W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 e G477.

[00105] Em uma modalidade, pelo menos uma amilase é selecionada dentre amilases comercialmente disponíveis que incluem, mas não são limitadas aos produtos vendidos sob os nomes comerciais de Duramil®, Termamil®, Fungamil®, Stainzyme®, Stainzyme Plus®, Natalase®, Liquozyme X e BAN® (da Novozymes A/S) e Rapidase®, Purastar®, Powerase®, Effectenz® (M100 da DuPont), Preferenz® (S1000, S110 e F1000; da DuPont), PrimaGreen® (Todos; DuPont), Optisize® (DuPont).

[00106] De acordo com a presente invenção, o componente (b) pode compreender uma combinação de pelo menos duas amilases.

[00107] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease e pelo menos uma amilase.

[00108] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease e pelo menos uma lipase e pelo menos uma amilase. Celulase

[00109] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e pelo menos uma celulase.

[00110] A preparação de enzima da invenção pode compreender pelo menos uma celulase (componente (b)). Os três tipos principais de celulases são conhecidos, a saber celobio-hidrolase (1,4-P-D-glucan celobio-hidrolase, EC 3.2.1.91), endo-ss-1,4-glucanase (endo-1,4-P-D-glucan 4-glucano--

32 / 96 hidrolase, EC 3.2.1.4) e ss-glicosidase (EC 3.2.1.21).

[00111] As “Celulases”, “enzimas celulase” ou “enzimas celulolíticas” (componente (b)) são as enzimas envolvidas na hidrólise da celulose. Os ensaios para medição da “atividade de celulase” ou “atividade celulolítica” são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a atividade celulolítica pode ser determinada em virtude do fato de que a celulase hidrolisa carboximetil celulose para reduzir carboidratos, a capacidade redutora da qual é determinada colorimetricamente por meio da reação do ferricianeto, de acordo com Hoffman, W. S., J. Biol. Chem. 120, 51 (1937).

[00112] A atividade celulolítica pode ser provida em unidades por grama de enzima. Por exemplo, 1 unidade pode liberar 1,0 μmol de glicose a partir da celulose em uma hora no pH 5,0 a 37°C (tempo de incubação de 2 horas).

[00113] As celulases de acordo com a invenção incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Em uma modalidade, pelo menos uma celulase é selecionada dentre celulases compreendendo um domínio de ligação da celulose. Em uma modalidade, pelo menos uma celulase é selecionada dentre celulases compreendendo apenas um domínio catalítico, significa que a celulase carece do domínio de ligação da celulose.

[00114] Em uma modalidade, pelo menos uma celulase (componente (b)) é selecionada dentre as celulases comercialmente disponíveis que incluem mas não são limitadas a Celluzyme®, Endolase®, Carezyme®, Cellusoft®, Renozyme®, Celluclean® (da Novozymes A/S), Ecostone®, Biotouch®, Econase®, Ecopulp® (da AB Enzymes Finlândia), Clazinase® e Puradax HA®, celulase detergente L da Genencor, IndiAge® Neutra (da Genencor International Inc./DuPont), Revitalenz® (2000 da DuPont), Primafast® (DuPont) e KAC-500® (da Kao Corporation).

[00115] De acordo com a presente invenção, o componente (b) pode compreender uma combinação de pelo menos duas celulases.

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[00116] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease e pelo menos uma celulase.

[00117] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease e pelo menos uma lipase e pelo menos uma celulase.

[00118] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease e pelo menos uma amilase e pelo menos uma celulase.

[00119] Em uma modalidade, o componente (b) compreende uma combinação de pelo menos uma protease e pelo menos uma lipase e pelo menos uma amilase e pelo menos uma celulase. Componente (c)

[00120] Em uma modalidade, a preparação de enzima líquida da invenção compreende o componente (c) que compreende pelo menos um composto selecionado dentre solventes, estabilizantes de enzima diferentes do componente (a) e compostos estabilizando a preparação de enzima líquida como tal. Estabilizantes de enzima diferentes do componente (a):

[00121] A preparação da enzima líquida da invenção pode compreender pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a). O dito estabilizante de enzima (componente (c)) pode ser selecionado dentre os compostos contendo boro, polióis, aldeídos de peptídeo, outros estabilizantes e misturas dos mesmos. Compostos contendo boro:

[00122] Os compostos contendo boro (componente (c)) podem ser selecionados dentre ácido bórico ou seus derivados e dentre ácido borônico ou seus derivados tais como ácidos aril borônicos ou seus derivados, dentre sais dos mesmos e dentre misturas dos mesmos. O ácido bórico aqui pode ser chamado ácido ortobórico.

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[00123] Em uma modalidade, o composto contendo boro (componente (c)) é selecionado a partir do grupo consistindo em ácidos aril borônicos e seus derivados. Em uma modalidade, o composto contendo boro é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido benzeno borônico (BBA) que também é chamado de ácido fenil borônico (PBA), derivados dos mesmos e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, os derivados do ácido fenil borônico são selecionados a partir do grupo consistindo nos derivados da fórmula (IIIa) e fórmula (IIIb): (IIIa) (IIIb) em que R1 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, hidróxi, alquila C1-C6 não substituída ou substituída e alquenila C1-C6 não substituída ou substituída; em uma modalidade preferida, R é selecionado a partir do grupo consistindo em hidróxi e alquila C1 não substituída; R2 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, hidróxi, alquila C1-C6 não substituída ou substituída e alquenila C1-C6 não substituída ou substituída; em uma modalidade preferida, R é selecionado a partir do grupo consistindo em H, hidróxi e alquila C1 substituída.

[00124] Em uma modalidade os derivados do ácido fenil-borônico (componente (c)) são selecionados a partir do grupo consistindo em ácido fenil borônico 4-formila (4-FPBA), ácido fenil borônico 4-carbóxi (4-CPBA), ácido fenil borônico 4-(hidroximetila) (4-HMPBA), ácido e p-tolilborônico (p-TBA).

[00125] Outros derivados adequados (componente (c)) incluem: ácido 2-tienil borônico, ácido 3-tienil borônico, ácido (2-acetamidofenil) borônico, ácido (2-benzofuranil) borônico, ácido 1-naftil borônico, ácido 2-naftil borônico, 2-FPBA, 3-FBPA, ácido 1-tiantrenil borônico, ácido 4-dibenzo-

35 / 96 furano borônico, ácido 5-metil-2-tienil borônico, ácido 1-benzotiofeno-2 borônico, ácido 2-furanil borônico, ácido 3-furanil borônico, ácido 4,4- bifenil-diborônico, ácido 6-hidróxi-2-naftalenoborônico, ácido 4- (metiltio)fenil borônico, ácido 4-(trimetilsilil)fenil borônico, ácido 3- bromotiofeno borônico, ácido 4-metiltiofeno borônico, ácido 2-naftil borônico, ácido 5-bromotiofeno borônico, ácido 5-clorotiofeno borônico, ácido dimetiltiofeno borônico, ácido 2-bromofenil borônico, ácido 3- clorofenil borônico, ácido 3-metóxi-2-tiofeno borônico, ácido p-metil-feniletil borônico, ácido 2-tiantrenil borônico, ácido dibenzotiofeno borônico, ácido 9- antraceno borônico, ácido 3,5 diclorofenil borônico, anidrido do ácido difenil borônico e, ácido o-clorofenil borônico, p- ácido clorofenil borônico, ácido m-bromofenil borônico, ácido p-bromofenil borônico, ácido p-fluorofenil borônico, ácido octil borônico, ácido 1,3,5 trimetilfenil borônico, ácido 3- cloro-4-fluorofenil borônico, ácido 3-aminofenil borônico, ácido 3,5-bis- (trifluorometil) fenil borônico, ácido 2,4 diclorofenil borônico, ácido 4- metoxifenil borônico e misturas dos mesmos. Polióis:

[00126] Os polióis (componente (c)) podem ser selecionados dentre polióis contendo de 2 a 6 grupos hidroxila. Os exemplos adequados incluem glicol, propileno glicol, 1,2-propano diol, 1,2-butano diol, etileno glicol, hexileno glicol, glicerol, sorbitol, manitol, eritriol, glicose, frutose, lactose e eritritano. Aldeídos peptídicos:

[00127] Os aldeídos peptídicos (componente (c)) podem ser selecionados dentre os aldeídos de di-, tri- ou tetra-peptídeo e análogos de aldeído (cada uma das formas B1-BO-R em que, R é H, CH3, CX3, CHX2 ou CH2X (X=halogênio), BO é um resíduo de aminoácido único (em uma modalidade com uma cadeia lateral alifática ou aromática opcionalmente substituída); e B1 consiste em um ou mais resíduos de aminoácidos (em uma

36 / 96 modalidade um, dois ou três), opcionalmente compreendendo um grupo de proteção de terminal N ou como descrito na WO 09/118375 e WO 98/13459 ou um inibidor de protease do tipo proteína tal como RASI, BASI, WASI (inibidores de alfa-amilase/subtilisina bifuncionais de arroz, cevada e trigo) ou CI2 ou SSI. Outros estabilizantes:

[00128] Outros estabilizantes (componente (c)) podem ser selecionados dentre sais como NaCl ou KCl e sais alcalinos do ácido láctico e ácido fórmico.

[00129] Outros estabilizantes (componente (c)) podem ser selecionados a partir de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que proveem tais íons para as enzimas, bem como outros íons metálicos por exemplo, bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), estanho (II), cobalto (II), cobre (II), Níquel (II) e oxovanádio (IV)). Compostos estabilizando a preparação de enzima líquida como tal

[00130] Os compostos estabilizando a preparação de enzima líquida como tal significam qualquer composto exceto os estabilizantes de enzima necessários para estabelecer a estabilidade na armazenagem de uma preparação líquida em quantidades eficazes para garantir a estabilidade na armazenagem.

[00131] A estabilidade na armazenagem no contexto de preparações líquidas para aqueles versados na técnica geralmente inclui aspectos de aparência do produto e uniformidade de dosagem.

[00132] A aparência do produto é influenciada pelo pH do produto e pela presença de compostos tais como conservantes, antioxidantes, modificadores de viscosidade, emulsificadores, etc.

[00133] A uniformidade de dosagem está geralmente relacionada com a homogeneidade de um produto.

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[00134] As preparações da enzima inventiva podem ser alcalinas ou exibem um valor do pH neutro ou levemente ácido, por exemplo 6 a 14, 6,5 a 13, 8 a 10,5 ou 8,5 a 9,0.

[00135] A preparação de enzima líquida da invenção pode compreender pelo menos um conservante. Os conservantes são adicionados em quantidades eficazes na prevenção da contaminação microbiana da preparação de enzima líquida, preferivelmente da preparação de enzima aquosa.

[00136] Os exemplos não limitativos de conservantes adequados incluem compostos de amônio (quaternário), isotiazolinonas, ácidos orgânicos e agentes de liberação de formaldeído. Os exemplos não limitativos dos compostos de amônio (quaternário) adequados incluem cloretos de benzalcônio, poli-hexametileno biguanida (PHMB), cloreto de Didecildimetilamônio (DDAC) e N-(3-aminopropil)-N-dodecilpropano-1,3- diamina (Diamina). Os exemplos não limitativos de isotiazolinonas adequadas incluem 1,2-benzisotiazolin-3-ona (BIT), 2-metil-2H-isotiazol-3-ona (MIT), 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona (CIT), 2-octil-2H-isotiazol-3-ona (OIT) e 2-butil-benzo[d]isotiazol-3-ona (BBIT). Os exemplos não limitativos dos ácidos orgânicos adequados incluem ácido benzóico, ácido sórbico, ácido L- (+)-láctico, ácido fórmico e ácido salicílico. Os exemplos não limitativos de agente de liberação de formaldeído adequados incluem N,N’- metilenobismorfolina (MBM), 2,2’,2”-(hexa-hidro-1,3,5-triazino-1,3,5- triil)trietanol (HHT), (etileno-dióxi)dimetanol, .alfa.,.alfa.’,.alfa.’’-trimetil- 1,3,5-triazino-1,3,5(2H,4H,6H)-trietanol (HPT), 3,3’-metilenobis[5- metiloxazolidino] (MBO) e cloreto de cis-1-(3-cloroalil)-3,5,7-triaza-1- azonia-adamantana (CTAC).

[00137] Os conservantes úteis adicionais incluem butilcarbamato de iodopropinila (IPBC), composto de liberação de halogênio tal como dicloro- dimetil-hidantoína (DCDMH), bromo-cloro-dimetil-hidantoína (BCDMH) e

38 / 96 dibromo-dimetil-hidantoína (DBDMH); os compostos de bromo-nitro tais como Bronopol (2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol), 2,2-dibromo-2-ciano- acetamida (DBNPA); aldeídos tais como glutaraldeido; fenoxietanol; Bifenil- 2-ol; e zinco ou sódio piritiona. Solventes

[00138] Em uma modalidade, a preparação da enzima inventiva é aquosa de 5% a 30% em peso, na faixa de 5% a 25% em peso ou na faixa de 20% a 70% em peso, todas em relação ao peso total da preparação de enzima.

[00139] Em uma modalidade, a preparação de enzima da invenção compreende pelo menos um solvente orgânico selecionado a partir do etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol, etileno glicol, propileno glicol, 1,3-propano diol, butano diol, glicerol, diglicol, propil diglicol, butil diglicol, hexileno glicol, éter metílico do etileno glicol, éter etílico de etileno glicol, éter propílico do etileno glicol e fenoxietanol, são preferidos etanol, isopropanol ou propileno glicol. Adicionalmente, a preparação de enzima da invenção pode compreender pelo menos um solvente orgânico selecionado dentre os compostos tais como 2-butoxietanol, álcool isopropílico e d-limoneno.

[00140] A dita preparação de enzima pode compreender solventes orgânicos em quantidades na faixa de 0% a 20% em peso relativo ao peso total da preparação de enzima. Em uma modalidade, a preparação de enzima compreende água em quantidades na faixa de 5% a 15% em peso e nenhuma quantidade significante de solvente orgânico, por exemplo 1% em peso ou menos, todas em relação ao peso total da preparação de enzima.

[00141] Em uma modalidade, a preparação de enzima da invenção compreende pelo menos componente (a): pelo menos um estabilizante de enzima selecionado dentre os compostos conforme a fórmula geral (I)

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(I) em que as variáveis na fórmula (I) são como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila, R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C5 linear e alquila C3-C10 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H e componente (b): pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases, mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62); e opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo de lipases e amilases; e componente (c): pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a), preferivelmente selecionado dentre os compostos contendo boro como descrito acima, mais preferivelmente selecionado dentre o ácido fenil borônico (PBA) ou seus derivados como descrito acima, mais preferivelmente sendo ácido fenil borônico 4-formila (4- FPBA).

40 / 96 Preparação de preparação de enzima

[00142] A invenção se refere a um processo para fabricar uma preparação de enzima, o dito processo compreendendo a etapa de misturar pelo menos componente (a) como descrito acima e componente (b) como descrito acima.

[00143] Em uma modalidade a invenção se refere a um processo para fabricar uma preparação de enzima, o dito processo compreendendo a etapa de misturar componentes (a), (b) e (c) como descrito acima, em que componente (b) preferivelmente compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62); e opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo de lipases e amilases. Em uma modalidade componente (c) compreende pelo menos um solvente como descrito acima. Em uma modalidade, o componente (c) compreende pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a), preferivelmente selecionado dentre os compostos contendo boro como descrito acima, mais preferivelmente selecionado dentre ácido fenil borônico (PBA) ou seus derivados como descrito acima, mais preferivelmente sendo ácido fenil borônico 4-formila (4-FPBA) – todos como descrito acima.

[00144] O componente (b) pode ser sólido. O componente (b) sólido pode ser adicionado ao componente (a) sólido antes do contato de ambos com pelo menos um solvente (componente (c)). Pelo menos um solvente é como descrito acima. O contato com pelo menos um solvente (componente (c)) pode resultar na solubilização de pelo menos uma molécula do componente (a) e pelo menos uma molécula do componente (b), resultando na estabilização de pelo menos uma molécula do componente (b). Em uma modalidade, os componentes (a) e (b) sólidos são completamente dissolvidos em pelo menos um solvente (componente (c)) sem separação de fase.

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[00145] O componente (a) sólido pode ser dissolvido em pelo menos um solvente (componente (c)) antes de misturar com o componente (b) sólido ou líquido. Em uma modalidade, o componente (a) é completamente dissolvido em pelo menos um solvente (componente (c)) antes de misturar com componente (b). Pelo menos um solvente é como descrito acima.

[00146] O componente (b) pode ser líquido, em que pelo menos uma enzima pode estar compreendida em um concentrado de enzima líquida como descrito acima. O componente (b) pode ser suplementado com o componente (a) sólido, em que o componente (a) sólido dissolve no componente (b) líquido. Em uma modalidade, o componente (b) líquido é aquoso, preferivelmente resultando da fermentação. Em uma modalidade, quando o componente (a) sólido dissolve no componente (b) líquido, no líquido solvente adicional pode ser adicionado.

[00147] Em uma modalidade, o componente (c) como descrito acima é misturado com os componentes (a) e (b), em que a mistura é distinguida em ser feita em uma ou mais etapas. Estabilização de enzima

[00148] A invenção se refere a um método de estabilizantes de componente (b) pela etapa de adicionar o componente (a), em que os componentes (a) e (b) são aqueles descritos acima. Em uma modalidade, o componente (b) é líquido. Em uma modalidade, a invenção se refere a um método de estabilizantes do componente (b) pela etapa de adicionar o componente (a), em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease e opcionalmente uma enzima selecionada dentre lipase e amilase.

[00149] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método de estabilizantes de componente (b) pela etapa de adicionar o componente (a) e pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) como descrito acima. Pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) é preferivelmente selecionado dentre os compostos contendo

42 / 96 boro como descrito acima, mais preferivelmente selecionado dentre ácido fenil borônico (PBA) ou seus derivados como descrito acima, mais preferivelmente sendo ácido fenil borônico 4-formila (4-FPBA).

[00150] A invenção adicionalmente se refere a um método de estabilizantes de pelo menos uma hidrolase em formulações líquidas compreendendo a mistura na ordem especificada em uma ou mais etapas pelo menos componentes (a) e (b) e opcionalmente pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) – todos como descrito acima – com um ou mais componentes de formulação. Pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) é preferivelmente selecionado dentre os compostos contendo boro como descrito acima, mais preferivelmente selecionado dentre ácido fenil borônico (PBA) ou seus derivados como descrito acima, mais preferivelmente sendo ácido fenil borônico 4-formila (4- FPBA).

[00151] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método de estabilizantes do componente (b) na presença de pelo menos um tensoativo pela etapa de adicionar o componente (a) e opcionalmente pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a), em que os componentes (a) e (b) são aqueles descritos acima e pelo menos um tensoativo é selecionado dentre tensoativos não iônicos, tensoativos anfotéricos, tensoativos aniônicos e tensoativos catiônicos, todos como descrito abaixo. Em uma modalidade, as formulações líquidas são formulações detergente. Pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) é preferivelmente selecionado dentre os compostos contendo boro como descrito acima, mais preferivelmente selecionado dentre ácido fenil borônico (PBA) ou seus derivados como descrito acima, mais preferivelmente sendo ácido fenil borônico 4-formila (4-FPBA).

[00152] A invenção se refere ao uso do componente (a) como aditivo para o componente (b). Em uma modalidade, os componentes (a) e (b) são

43 / 96 sólidos e o componente (b) é estabilizado quando colocando em contato a mistura dos componentes (a) e (b) sólidos com pelo menos um solvente (componente (c) como descrito acima). O contato com pelo menos um solvente (componente (c)) pode resultar na solubilização de pelo menos uma molécula do componente (a) e pelo menos uma molécula do componente (b), resultando na estabilização de pelo menos uma molécula do componente (b). Em uma modalidade, os componentes (a) e (b) sólidos são completamente dissolvidos em pelo menos um solvente (componente (c)) sem separação de fase.

[00153] Em uma modalidade, a invenção se refere ao uso de um composto conforme a fórmula (I): (I) em que as variáveis na fórmula (I) são definidas como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H como aditivo para pelo menos uma hidrolase (componente (b)), em que o composto conforme a fórmula (I) e a hidrolase são sólidos e em

44 / 96 que atividade enzimática da hidrolase é estabilizada quando o composto conforme a fórmula (I) e a hidrolase são colocados em contatos com pelo menos um solvente [componente (c)].

[00154] Em uma modalidade da presente invenção, o componente (a) é adicionado em quantidades na faixa de 0,1% a 30% em peso, relativo ao peso total da preparação de enzima. A preparação de enzima pode compreender componente (a) em quantidades na faixa de 0,1% a 15% em peso, 0,25% a 10% em peso, 0,5% a 10% em peso, 0,5% a 6% em peso ou 1% a 3% em peso, todas em relação ao peso total da preparação de enzima.

[00155] Em uma modalidade, pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) é adicionado em quantidades eficazes para inibir reversivelmente a atividade proteolítica de pelo menos uma protease compreendida no componente (b).

[00156] Em uma modalidade, o dito composto conforme a fórmula (I) é usado como um aditivo para o componente (b), em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62), em que o composto conforme a fórmula (I) e a protease são sólidos e em que atividade proteolítica da protease é estabilizada quando o composto conforme a fórmula (I) e a protease são colocadas em contato com pelo menos um solvente [componente (c)].

[00157] Em uma modalidade, o dito composto conforme a fórmula (I) é usado junto com pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a), preferivelmente pelo menos um boro contendo composto, como aditivo para o componente (b), em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62), em

45 / 96 que o composto conforme a fórmula (I) e a protease são sólidos e em que atividade proteolítica da protease é estabilizada quando o composto conforme a fórmula (I) e a protease são colocadas em contato com pelo menos um solvente [componente (c)].

[00158] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), preferivelmente selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima, em que o composto conforme a fórmula (I) a protease e a lipase são sólidos e em que atividade proteolítica da protease e/ou atividade lipolítica da lipase são estabilizada quando o composto conforme a fórmula (I), a protease e a lipase são colocadas em contato com pelo menos um solvente [componente (c)].

[00159] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre proteases de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica como descrito acima e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima, em que o composto conforme a fórmula (I), a protease e a lipase são sólidos e em que atividade proteolítica da protease e/ou atividade lipolítica da lipase são estabilizadas quando o composto conforme a fórmula (I) a protease e a lipase são colocadas em contato com pelo menos um solvente [componente (c)].

[00160] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre subtilisina 309 como descrito na Tabela I a) da WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica como descrito acima e pelo menos uma triacilglicerol lipase de

46 / 96 acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima, em que o composto conforme a fórmula (I), a protease e a lipase são sólidos e em que atividade proteolítica da protease e/ou atividade lipolítica da lipase são estabilizadas quando o composto conforme a fórmula (I), a protease e a lipase são colocadas em contato com pelo menos um solvente [componente (c)].

[00161] A estabilização de uma enzima pode se referir a estabilidade no curso de tempo (por exemplo, a estabilidade na armazenagem), estabilidade térmica, estabilidade do pH e estabilidade química. O termo “estabilidade de enzima” aqui preferivelmente se refere à retenção da atividade enzimática como uma função de tempo por exemplo, durante a armazenagem ou operação. O termo “armazenagem” aqui significa indicar o fato de produtos ou composições serem armazenados a partir do momento que são fabricados até o ponto no tempo de serem usados na aplicação final. A retenção da atividade enzimática como uma função do tempo durante a armazenagem é chamada de “estabilidade na armazenagem”. Em uma modalidade, a armazenagem significa armazenagem durante pelo menos 20 dias a 37°C. A armazenagem pode significar armazenagem durante 21, 28 ou 35 dias a 37°C.

[00162] Para determinar mudanças na atividade enzimática com o tempo, a “atividade enzimática inicial” de uma enzima pode ser medida sob condições definidas no tempo zero, isto é, antes da armazenagem) e a “atividade enzimática depois da armazenagem” pode ser medida em um certo ponto no tempo mais tarde, isto é, depois da armazenagem).

[00163] A atividade enzimática depois da armazenagem dividida pela atividade enzimática inicial multiplicada por 100 dá a “atividade enzimática residual” (a %).

[00164] Uma enzima é estável de acordo com a invenção, quando a sua atividade enzimática residual é pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo

47 / 96 menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou 100% quando comparada à atividade enzimática inicial antes da armazenagem.

[00165] Subtrair a % de 100% dá a “perda da atividade enzimática durante a armazenagem” quando comparada à atividade enzimática inicial antes da armazenagem. Em uma modalidade, uma enzima é estável de acordo com a invenção quando essencialmente nenhuma perda da atividade enzimática ocorre durante a armazenagem, isto é, perda na atividade enzimática igual a 0% quando comparada à atividade enzimática inicial antes da armazenagem. Essencialmente nenhuma perda da atividade enzimática dentro desta invenção pode significar que a perda da atividade enzimática é menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 9%, menos do que 8%, menos do que 7%, menos do que 6%, menos do que 5%, menos do que 4%, menos do que 3%, menos do que 2% ou menos do que 1% quando comparada à atividade enzimática inicial antes da armazenagem.

[00166] Em um aspecto da invenção o componente (a) é usado para reduzir a perda da atividade enzimática durante a armazenagem do componente (b). O cálculo da % de perda da atividade enzimática reduzida é feito como segue: (% de perda da atividade enzimática da enzima estabilizada) – (% de perda da atividade enzimática da enzima não estabilizada). O valor para perda reduzida indica a perda reduzida da atividade enzimática de pelo menos uma enzima compreendida no componente (b) na presença do componente (a) quando comparada à perda da atividade enzimática da(s) mesma(s) enzima(s) na ausência do componente (a) em um certo ponto no tempo.

[00167] A perda reduzida da atividade enzimática dentro desta

48 / 96 invenção pode significar que a perda da atividade enzimática é reduzida na presença do componente (a) em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 40%, em pelo menos 50%, em pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%, quando comparada à perda da atividade enzimática na ausência do componente (a).

[00168] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para reduzir a perda da atividade proteolítica de pelo menos uma protease (componente (b)) compreendida em um líquido durante a armazenagem pela etapa de adicionar um composto conforme a fórmula (I): (I) em que as variáveis na fórmula (I) são definidas como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H.

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[00169] Em uma modalidade, o método para reduzir a perda da atividade proteolítica de pelo menos uma protease (componente (b)) compreendida em um líquido durante a armazenagem compreende a etapa de adicionar um composto conforme a fórmula (I) e a etapa de adicionar pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a), preferivelmente um boro contendo composto.

[00170] Em uma modalidade, a protease (componente (b)) é compreendida em uma preparação de enzima líquida ou a protease é compreendida em uma composição líquida compreendendo pelo menos um tensoativo tal como uma formulação detergente líquida.

[00171] Em uma modalidade, o método para reduzir a perda da atividade proteolítica de pelo menos uma protease, é distinguida no componente (b) compreendendo pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62).

[00172] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), preferivelmente selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima.

[00173] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre proteases de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica como descrito acima e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima.

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[00174] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre subtilisina 309 como descrito na Tabela I a) da WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica como descrito acima e pelo menos uma triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica como descrito acima.

[00175] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), preferivelmente selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e pelo menos uma amilase, preferivelmente selecionada dentre SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 da WO 2013/001078 e variantes das mesmas tendo atividade amiolítica.

[00176] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre proteases de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica como descrito acima e pelo menos uma amilase, preferivelmente selecionada dentre SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 da WO 2013/001078 e variantes das mesmas tendo atividade amiolítica.

[00177] Em uma modalidade, o componente (b) compreende pelo menos uma protease selecionada dentre subtilisina 309 como descrito na Tabela I a) da WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica como descrito acima e pelo menos uma amilase, preferivelmente pelo menos uma amilase é selecionada dentre amilases de Bacillus sp. 707 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica e amilases de Bacillus halmapalus ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica, preferivelmente selecionada dentre amilases de acordo com a SEQ ID NO: 1 e 2 da WO 2013/001078 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica – todas como descritas acima.

[00178] Em um aspecto da invenção, o componente (a) estabiliza pelo

51 / 96 menos uma protease compreendida no componente (b). Pelo menos uma protease compreendida no componente (b) é preferivelmente selecionada dentre subtilisina 147 e/ou 309 como descrito na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrito na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como descritas acima. Em uma modalidade, o componente (a) é usado para estabilizar a protease [componente (b)] dentro de uma preparação de enzima líquida. Em uma modalidade, o componente (a) é usado para estabilizar protease [componente (b)] dentro de uma composição líquida compreendendo pelo menos um tensoativo, preferivelmente dentro de uma composição detergente líquida. A estabilização neste contexto pode significar estabilização durante a armazenagem a 37°C para 21, 28 e/ou 35 dias.

[00179] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que a estabilização é distinguida pela (a) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 21 dias sendo > 70%, ≥ 75% ou ≥ 80% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 28 dias sendo > 65%, ≥ 70% ou ≥ 75% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (c) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 35 dias sendo > 60% ou ≥ 65% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00180] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é

52 / 96 H e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear e em que a estabilização é distinguida pela (a) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 21 dias sendo > 70%, ≥ 75%, ≥ 80% ou ≥ 83% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 28 dias sendo > 65%, ≥ 70%, ≥ 75% ou ≥ 79% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (c) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 35 dias sendo > 60% ou ≥ 65% ≥ 70% ou ≥ 72% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00181] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é acetila e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2 e C4 e em que a estabilização é distinguida pela (a) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 21 dias sendo > 70%, ≥ 75%, ≥80% ou ≥85% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 28 dias sendo > 65%, ≥ 70%, ≥ 75%, ≥ 80% ou ≥ 81% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (c) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 35 dias sendo > 60% ou ≥ 65% ≥ 70%, ≥ 75% ou ≥ 77% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00182] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 e R2 no composto conforme a fórmula (I) são H, R4 é selecionado a partir de alquila C2-C4 linear, preferivelmente

53 / 96 alquila C2 e R3 é igual a R1/R2 ou R4 e em que a estabilização é distinguida pela (a) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 21 dias sendo > 70%, ≥ 75%, ≥ 80% ou ≥ 81% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 28 dias sendo > 65%, ≥ 70%, ≥ 75% ou ≥ 76% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (c) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 35 dias sendo > 60%, ≥ 65% ou ≥ 69% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00183] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é H e R2, R3, R4 são selecionados dentre fenilmetila e salicila e em que a estabilização é distinguida pela (a) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 21 dias sendo > 70%, ≥ 75%, ≥80% ou ≥ 85% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 28 dias sendo > 65%, ≥ 70%, ≥ 75%, ≥ 80% ou ≥ 82% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (c) atividade proteolítica residual depois da armazenagem a 37°C por 35 dias sendo > 60%, ≥ 65%, ≥ 70% ou ≥ 75% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00184] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que a estabilização é distinguida pela (a) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a

54 / 96 37°C por 21 dias sendo < 25% ou ≤ 20% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo < 30% ou ≤ 25% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (c) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo < 40% ou ≤ 35% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00185] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é H e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo < 25%, ≤ 20% ou ≤ 17% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo < 30%, ≤ 25% ou ≤ 22% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem (c) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo < 40% ou ≤ 35%, ≤ 30% ou ≤ 28% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00186] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é acetila e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2 e C4 e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo < 25%, ≤ 20% ou ≤ 17% quando comparada à

55 / 96 atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo < 30%, ≤ 25% ou ≤ 21% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem (c) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo < 40%, ≤ 35%, ≤ 30% ou ≤ 25% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00187] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 e R2 no composto conforme a fórmula (I) são H, R4 é selecionado a partir de alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2 e R3 é igual a R1/R2 ou R4 e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo < 25%, ≤ 20% ou ≤ 19% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo < 30%, ≤ 25% ou ≤ 24% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem (c) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo < 40%, ≤ 35%, ≤ 30% ou ≤ 31% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00188] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é H e R2, R3, R4 são selecionados dentre fenilmetila e salicila e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo < 25%, ≤ 20% ou ≤ 15% quando comparada à

56 / 96 atividade proteolítica inicial antes da armazenagem e/ou (b) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo < 30%, ≤ 25%, ≤ 20% ou ≤ 17% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem. (c) perda da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo < 40%, ≤ 35%, ≤ 30%, ≤ 25% ou ≤ 23% quando comparada à atividade proteolítica inicial antes da armazenagem.

[00189] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que a estabilização é distinguida pela (a) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo ≥ 10% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (b) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo ≥ 10% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (c) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo ≥ 10% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a).

[00190] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é H e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo ≥ 10% ou ≥ 11% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (b) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo ≥ 10% ou ≥ 14% quando comparada à

57 / 96 perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (c) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo ≥ 10% ou ≥ 12% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a).

[00191] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é acetila e R2, R3, R4 são selecionados dentre alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2 e C4 e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo ≥ 10% ou ≥ 14% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (b) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo ≥ 10% ou ≥ 15% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (c) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo ≥ 10% ou 15% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a).

[00192] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 e R2 no composto conforme a fórmula (I) são H, R4 é selecionado a partir de alquila C2-C4 linear, preferivelmente alquila C2 e R3 é igual a R1/R2 ou R4 e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo ≥ 10% ou ≥ 12% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (b) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo ≥ 10% quando comparada à perda da

58 / 96 atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (c) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo ≥ 10% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a).

[00193] Em uma modalidade, a adição do componente (a) ao componente (b) estabiliza a protease durante a armazenagem, em que o componente (a) é distinguido pelo R1 no composto conforme a fórmula (I) é H e R2, R3, R4 são selecionados dentre fenilmetila e salicila e em que a estabilização é distinguida pela (a) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 21 dias sendo ≥ 10% ou ≥ 13% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (b) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 28 dias sendo ≥ 10%, ≥ 15% ou ≥ 16% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a) e/ou (c) perda reduzida da atividade proteolítica durante a armazenagem a 37°C por 35 dias sendo ≥ 10%, ≥ 15%, ≥ 20%, ≥ 25% ou ≥ 29% quando comparada à perda da atividade proteolítica na ausência do componente (a).

[00194] Em modalidades das modalidades acima, o componente (a) é usado para estabilizar protease [componente (b)] dentro de uma preparação de enzima líquida. Adicionalmente, em modalidades das modalidades acima a protease que é estabilizada pelo componente (a) é selecionado a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descrita na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como descritas

59 / 96 acima.

[00195] Em um aspecto da invenção, o componente (a) é usado para estabilizar o componente (b) compreendendo pelo menos uma protease e pelo menos uma lipase dentro de uma composição líquida compreendendo pelo menos um tensoativo, preferivelmente dentro de uma composição detergente líquida, em que pelo menos uma protease é preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descrito na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como descritas acima; pelo menos uma lipase é selecionada dentre Thermomyces lanuginosa lipase e variantes das mesmas, preferivelmente triacilglicerol lipase de acordo com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 2 da US 5869438 ou uma variante da mesma tendo atividade lipolítica – todas como descritas acima.

[00196] Em um aspecto da invenção, o componente (a) é usado para estabilizar o componente (b) compreendendo pelo menos uma protease e pelo menos uma amilase dentro de uma composição líquida compreendendo pelo menos um tensoativo, preferivelmente dentro de uma composição detergente líquida, em que pelo menos uma protease é preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descrito na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrito na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrito na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como descritas

60 / 96 acima; pelo menos uma amilase é selecionada dentre amilases da Bacillus sp. 707 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica e amilases da Bacillus halmapalus ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica, preferivelmente selecionada a partir de amilases de acordo com a SEQ ID NO: 1 e 2 da WO 2013/001078 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica – todas como descritas acima. Uso de preparação de enzima para os processos de formulação

[00197] A invenção em um aspecto se refere ao uso da preparação de enzima líquida da invenção para ser formulada em formulações detergentes tais como I&I e as formulações de cuidados domésticos para lavagem de roupa e limpeza de superfície dura, em que pelo menos os componentes (a) e (b) são misturados na ordem específica em uma ou mais etapas com um ou mais componentes detergentes. Em uma modalidade, pelo menos os componentes (a), (b) e (c) são misturados na ordem específica em uma ou mais etapas com um ou mais componentes detergentes, em que o componente (c) compreende pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a), preferivelmente um composto contendo boro.

[00198] Em um aspecto a invenção se refere a uma formulação detergente compreendendo a preparação de enzima líquida da invenção e um ou mais componentes detergentes.

[00199] Os componentes detergentes variam no tipo e/ou quantidade em uma formulação detergente dependendo da aplicação desejada tal como lavagem de têxteis brancos, têxteis coloridos e lã. O(s) componente(s) escolhido(s) adicionalmente dependem da forma física de uma formulação detergente (líquida, sólida, gel, provida em sacos ou como um tablete, etc.). O(s) componente(s) escolhido(s) por exemplo, para as formulações de lavagem de roupa adicionalmente dependem das convenções regional que por elas mesmas estão relacionadas aos aspectos como temperaturas de lavagem

61 / 96 usadas, mecanismos da máquina de lavar roupas (máquinas de eixo vertical vs. horizontal), consumo de água por ciclo de lavagem etc. e características geográficas como dureza média da água.

[00200] Os componentes detergentes individuais e uso nas formulações detergentes são conhecidos para aqueles versados na técnica. Componentes detergentes adequados compreendem, entre outros, tensoativos, construtores, polímeros, sistemas de branqueamento alcalinos, agentes branqueadores fluorescentes, supressores de espuma e estabilizantes, hidrótropos e inibidores de corrosão. Adicionalmente, os exemplos são descritos por exemplo, no “complete Technology Book on Detergents with Formulations (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)”, Engineers India Research Institute (EIRI), 6a edição (2015). Um outro livro de referência para aqueles versados na técnica pode ser “Detergent Formulations Encyclopedia”, Solverchem Publications, 2016.

[00201] É entendido que os componentes detergentes estão além dos componentes compreendidos na preparação de enzima da invenção. Se um componente compreendido na preparação de enzima da invenção também é um componente detergente, o mesmo estaria nas concentrações que precisam ser ajustadas nas quais o componente é eficaz para os propósitos desejados na formulação detergente.

[00202] Os componentes detergentes podem ter mais do que uma função na aplicação final de uma formulação detergente, portanto qualquer componente detergente mencionado no contexto de uma função específica aqui, também pode ter uma outra função na aplicação final de uma formulação detergente. A função de um componente detergente específico na aplicação final de uma formulação detergente geralmente depende da sua quantidade dentro da formulação detergente, isto é, a quantidade eficaz de um componente detergente.

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[00203] O termo “quantidade eficaz” inclui quantidades de componentes individuais para prover remoção de mancha eficaz e/ou condições de limpeza eficaz por exemplo, pH, quantidade de espumação), quantidades de certas componentes para eficazmente prover benefícios ópticos por exemplo. Abrilhantamento óptico, inibição da transferência de corante) e/ou quantidades de certos componentes para eficazmente ajudar no processamento (mantendo as características físicas durante o processamento, armazenagem e uso; por exemplo, modificadores de viscosidade, hidrótropos, dessecantes).

[00204] Em uma modalidade, uma formulação detergente é uma formulação de mais do que dois componentes detergentes, em que pelo menos um componente é eficaz na remoção de manchas, pelo menos um componente é eficaz em prover as condições de limpeza ideais e pelo menos um componente é eficaz em manter as características físicas do detergente.

[00205] As formulações detergentes da invenção podem compreender componente (a) e o componente (b) sendo dissolvidos no solvente. Dissolvido pode significar ser dissolvido na formulação detergente global. Dissolvido pode significar componente (a) e o componente (b) sendo parte da preparação de enzima líquida da invenção que pode ser encapsulada. A preparação da enzima líquida encapsulada pode ser parte de uma formulação detergente líquida ou parte de uma formulação detergente sólida.

[00206] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes, preferivelmente as formulações detergentes líquidas, compreendem o componente (a) em quantidades na faixa de 0,1% a 30% em peso, relativas ao peso total da formulação detergente. A preparação de enzima pode compreender componente (a) em quantidades na faixa de 0,1% a 15% em peso, 0,25% a 10% em peso, 0,5% a 10% em peso, 0,5% a 6% em peso ou 1% a 3% em peso, todos relativos ao peso total da formulação detergente.

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[00207] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes, preferivelmente formulações detergentes líquidas, compreendem 0,5 a 20% em peso, particularmente 1 a 10% em peso do componente (b) e 0,01% a 10% do componente (a), mais particularmente 0,05 a 5% em peso e mais particularmente 0,1% a 2% em peso do componente (a), todos relativos ao peso total da formulação detergente.

[00208] As formulações detergentes da invenção compreendem pelo menos um composto selecionado dentre os tensoativos, construtores, polímeros, fragrâncias e corantes.

[00209] A formulação detergente da invenção compreende pelo menos um tensoativo selecionado dentre tensoativos não iônicos, tensoativos anfotéricos, tensoativos aniônicos e tensoativos catiônicos.

[00210] A formulação detergente pode compreender 0,1 a 60% em peso relativo ao peso total da formulação detergente do tensoativo. A formulação detergente pode compreender pelo menos um composto selecionado dentre tensoativos aniônicos, tensoativos não iônicos, tensoativos anfotéricos e tensoativos de óxido de amina bem como combinações de pelo menos dois dos anteriores. Em uma modalidade, a formulação detergente da invenção compreende 5 a 30% em peso tensoativo aniônico e pelo menos um tensoativo não iônico, por exemplo na faixa de 3 a 20% em peso, todos relativos ao peso total da formulação detergente, em que a formulação detergente pode ser líquida.

[00211] Pelo menos um tensoativo não iônico podem ser selecionados dentre álcoois alcoxilados, di- e copolímeros de bloco múltiplo de óxido de etileno e óxido de propileno e produtos de reação de sorbitano com óxido de etileno ou óxido de propileno, alquil poliglicosídeos (APG), éteres mistos de hidroxialquila e óxidos de amina.

[00212] Os exemplos preferidos de álcoois alcoxilados e álcoois graxos alcoxilados são, por exemplo, compostos da fórmula geral (IV)

64 / 96 (IV) em que R3 é idêntico ou diferente e selecionado dentre hidrogênio e alquila C1-C10 linear, preferivelmente em cada caso idêntico e etila e particularmente preferíveis hidrogênio ou metila, R4 é selecionado dentre alquila C8-C22, ramificada ou linear, por exemplo n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C14H29, n-C16H33 ou n-C18H37, R5 é selecionado dentre alquila C1-C10, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, sec- pentila, neopentila, 1,2-dimetilpropila, isoamila, n-hexila, isohexila, sec- hexila, n-heptila, n-octila, 2-etilhexila, n-nonila, n-decila ou isodecila.

[00213] As variáveis m e n estão na faixa de zero a 300, onde a soma de n e m é pelo menos um, preferivelmente na faixa de 3 a 50. Preferivelmente, m está na faixa de 1 a 100 e n está na faixa de 0 a 30.

[00214] Em uma modalidade, os compostos da fórmula geral (IV) podem ser copolímeros de bloco ou copolímeros aleatórios, preferência sendo dada para copolímeros de blocos.

[00215] Outros exemplos preferidos de álcoois alcoxilados são, por exemplo, compostos da fórmula geral (V): (V) em que R6 é idêntico ou diferente e selecionado dentre hidrogênio e alquila C1-C10 linear, preferivelmente idêntico em cada caso e etila e

65 / 96 particularmente preferíveis hidrogênio ou metila, R7 é selecionado dentre alquila C6-C20, ramificada ou linear, em particular n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C13H27, n-C15H31, n-C14H29, n- C16H33, n-C18H37, a é um número na faixa de zero a 10, preferivelmente de 1 a 6, b é um número na faixa de 1 a 80, preferivelmente de 4 a 20, c é um número na faixa de zero a 50, preferivelmente 4 a 25.

[00216] A soma a + b + c está preferivelmente na faixa de 5 a 100, ainda mais preferivelmente na faixa de 9 a 50.

[00217] Em uma modalidade, um álcool alcoxilado é selecionado dentre aqueles conforme a fórmula (V), em que não há nenhum R6 e R7 é selecionado dentre n-C8H17, n-C10H21, n-C12H25, n-C13H27, n-C15H31, n-C14H29, n-C16H33, n-C18H37; a e c são zero, b está na faixa de 4 a 20, preferivelmente

9.

[00218] Os exemplos preferidos para éteres mistos de hidroxialquila são compostos da fórmula geral (VI) (VI) em que as variáveis são definidas como segue: R8 é idêntico ou diferente e selecionado dentre hidrogênio e alquila C1-C10 linear, preferivelmente em cada caso idêntico e etila e particularmente preferíveis hidrogênio ou metila, R9 é selecionado dentre alquila C8-C22 e alquenila C8-C22 lineares ou ramificadas; o exemplo inclui iso-C11H23, iso-C13H27, n-C8H17, n- C10H21, n-C12H25, n-C14H29, n-C16H33 ou n-C18H37, R10 é selecionado dentre alquila C1-C18 e alquenila C2-C18

66 / 96 lineares ou ramificadas; os exemplos incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, sec- pentila, neopentila, 1,2-dimetilpropila, isoamila, n-hexila, isohexila, sec- hexila, n-heptila, n-octila, 2-etilhexila, n-nonila, n-decila, isodecila, n- dodecila, n-tetradecila, n-hexadecila e n-octadecila.

[00219] As variáveis m e x estão na faixa de zero a 300, preferivelmente na faixa de zero a 100; a soma de m e x é pelo menos um, preferivelmente na faixa de 5 a 50.

[00220] Os compostos das fórmulas gerais (V) e (VI) podem ser copolímeros de bloco ou copolímeros aleatórios, preferência sendo dada para copolímeros de blocos.

[00221] Adicionalmente tensoativos não iônicos adequados são selecionados dentre di- e copolímeros de bloco múltiplo, composto de óxido de etileno e óxido de propileno. Adicionalmente tensoativos não iônicos adequados são selecionados dentre ésteres de sorbitano etoxilados ou propoxilados. Óxidos de amina ou alquil poliglicosídeos, especialmente alquila C4-C18 linear poliglcosídeos e alquila C8-C18 ramificada poliglicosídeos tais como compostos da fórmula média geral (VII) são igualmente adequados.

(VII) em que: R11 é alquila C1-C4, em particular etila, n-propila ou isopropila, R12 é -(CH2)2-R11, G1 é selecionado a partir de monossacarídeos com 4 a 6 átomos de carbono, especialmente dentre glicose e xilose, y na faixa de 1,1 a 4, y estando em um número médio.

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[00222] Adicionalmente os exemplos de tensoativos não iônicos são compostos das fórmulas gerais (VIIIa) e (VIIIb)

O (AO)w 13 14

R O R (VIIIa)

O 3 (AO)w1 (A O)w3 13 R O (EO)w2 14

R (VIIIb) em que AO é selecionado dentre óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno, EO é óxido de etileno, CH2CH2-O, R13 é alquila C1-C4, em particular etila, n-propila ou isopropila, R14 selecionado a partir de alquila C8-C18, ramificada ou linear A3O é selecionado dentre óxido de propileno e óxido de butileno, w é um número na faixa de 15 a 70, preferivelmente 30 a 50, w1 e w3 são números na faixa de 1 a 5, e w2 é um número na faixa de 13 a 35.

[00223] Uma vista geral de tensoativos não iônicos adicionalmente adequados podem ser verificados na EP-A 0 851 023 e na DE-A 198 19 187.

[00224] Em uma modalidade, a formulação detergente compreende misturas de dois ou mais tensoativos não iônicos diferentes.

[00225] Pelo menos um tensoativo anfotérico pode ser selecionado a partir de tensoativos que carregar um uma carga positiva e uma negativa na mesma molécula sob condições de uso. Os exemplos preferidos de tensoativos anfotéricos são os chamados tensoativos de betaína. Muitos exemplos de tensoativos de betaína carregam um átomo de nitrogênio

68 / 96 quaternizado e um grupo do ácido carboxílico por molécula. Um exemplo particularmente preferido de tensoativos anfotéricos é cocamidopropil betaína (lauramidopropil betaína).

[00226] Os exemplos de tensoativos de óxido de amina são compostos da fórmula geral (IX) R13R14R15N→O (IX) em que R13, R14 e R15 são selecionados independentemente um do outro dentre porções alifáticas, cicloalifáticas ou alquileno C2-C4 alquila C10-C20 amido. Preferivelmente, R12 é selecionado dentre alquila C8-C20 ou alquileno C2-C4 alquila C10-C20 amido e R13 e R14 são ambos metila.

[00227] Um exemplo particularmente preferido é lauril dimetil aminóxido, algumas vezes também chamado de óxido de lauramina. Um exemplo adicionalmente particularmente preferido é cocamidilpropil dimetilaminóxido, algumas vezes também chamado de cocamidopropilamina óxido.

[00228] Pelo menos um tensoativo aniônico pode ser selecionado dentre metal alcalino e sais de amônio de alquila C8-C18 sulfatos, de álcool graxo C8-C18 poliéter sulfatos, de hemi-ésteres do ácido sulfúrico de alquilfenóis C4-C12 etoxilados (etoxilação: 1 a 50 mol de óxido de etileno/mol), ésteres alquílicos de ácido sulfo graxo C12-C18, por exemplo de éstres metílicos de ácido sulfo fraxo C12-C18, adicionalmente de ácidos alquila C12-C18 sulfônicos e de ácidos alquila C10-C18 arilsulfônico. Preferência é dada aos sais de metal alcalino dos compostos anteriormente mencionados, particularmente preferíveis os sais de sódio.

[00229] Os exemplos específicos de tensoativos aniônicos são compostos conforme a fórmula geral (X) CsH2s+1-O(CH2CH2O)t-SO3M (X) em que s sendo um número na faixa de 10 a 18, preferivelmente 12 a

69 / 96 14 e ainda mais preferivelmente s = 12, t sendo um número na faixa de 1 a 5, preferivelmente 2 a 4 e ainda mais preferivelmente 3. M sendo selecionado dentre metais alcalinos, preferivelmente potássio e ainda mais preferivelmente sódio.

[00230] As variáveis s e t podem ser números médios e, portanto, eles não são necessariamente números inteiros, embora nas moléculas individuais conforme a fórmula (X), tanto s quanto t indiquem números inteiros.

[00231] Adicionalmente, os exemplos para tensoativos aniônicos adequados são sabões, por exemplo os sais de sódio ou potássio de ácido esteárico, ácido oléico, ácido palmítico, carboxilatos éter e alquiléter fosfatos.

[00232] As formulações detergentes inventivas podem compreender 1 a 40% em peso de pelo menos um construtor de detergência. Os exemplos para construtores de detergência incluem, mas não são limitados a zeólito, fosfato, fosfonato, citrato, construtores de polímero ou aminocarboxilatos tais como os sais de metal alcalino de iminodissuccinatos, por exemplo IDS-Na4, adicionalmente ácido nitrilotriacético (“NTA”), ácido metilglicina diacético (“MGDA”), ácido glutâmico ácido diacético (“GLDA”), ácido etileno diamina tetra-acético (“EDTA”) ou ácido dietilenotriamina penta-acético (“DTPA”). Os sais de metal alcalino preferidos são os sais de potássio e especialmente os sais de sódio.

[00233] Adicionalmente, os exemplos de construtores de detergência são polímeros com grupos complexantes tipo, por exemplo, polietilenimina na qual 20 a 90% em mol dos átomos N carregam pelo menos um grupo CH2COO- e os respectivos sais de metal alcalino dos sequestrantes acima, especialmente seus sais de sódio.

[00234] Adicionalmente os exemplos de polímeros adequados são polialquileniminas, por exemplo polietileniminas e polipropileno iminas. As polialquileniminas podem ser usadas como tais ou como derivados

70 / 96 polialcoxilados, por exemplos etoxilados ou propoxilados. As polialquileniminas compreendem pelo menos três unidades de alquilenimina por molécula.

[00235] Em uma modalidade da presente invenção, a dita unidade de alquilenimina é uma unidade de alquileno C2-C10 diamina, por exemplo um 1,2-propilendiamina, preferivelmente uma α,ω-alquileno C2-C10 diamina, por exemplo 1,2-etilendiamina, 1,3-propilendiamina, 1,4-butilendiamina, 1,5- pentilendiamina, 1,6-hexandiamina (também sendo aludida como 1,6- hexilendiamina), 1,8-diamina ou 1,10-decandiamina, ainda mais preferidas são 1,2-etilendiamina, 1,3-propilendiamina, 1,4-butilendiamina e 1,6- hexandiamina.

[00236] Em uma outra modalidade da presente invenção, a dita polialquilenimina é selecionada a partir da unidade de polialquilenimina, preferivelmente uma unidade de polietilenimina ou polipropilenimina.

[00237] O termo “polietilenimina” no contexto da presente invenção não apenas se refere aos homopolímeros de polietilenimina mas também às polialquileniminas compreendendo elementos estruturais de NH-CH2-CH2- NH junto com outros elementos estruturais de alquileno diamina, por exemplo elementos estruturais de NH-CH2-CH2-CH2-NH, elementos estruturais de NH-CH2-CH(CH3)-NH, elementos estruturais de NH-(CH2)4-NH, elementos estruturais de NH-(CH2)6-NH ou elementos estruturais de (NH-(CH2)8-NH mas os elementos estruturais de NH-CH2-CH2-NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar. As polietileniminas preferidas compreendem elementos estruturais de NH-CH2-CH2-NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar, por exemplo em um montante de 60% em mol ou mais, mais preferivelmente em u montante de pelo menos 70% em mol, referindo-se a todos os elementos estruturais de alquilenimina. Em uma modalidade especial, o termo polietilenimina se refere àquelas polialquileniminas que compartilham apenas um ou zero elemento estrutural

71 / 96 de alquilenimina por unidade de polietilenimina que seja diferente de NH- CH2-CH2-NH.

[00238] O termo “polipropilenimina” no contexto da presente invenção não apenas se refere aos homopolímeros de polipropilenimina mas também às polialquileniminas compreendendo elementos estruturais NH-CH2-CH(CH3)- NH juntos com outros elementos estruturais de alquileno diamina, por exemplo elementos estruturais de NH-CH2-CH2-CH2-NH, elementos estruturais de NH-CH2-CH2-NH, elementos estruturais de NH-(CH2)4-NH, elementos estruturais de NH-(CH2)6-NH ou elementos estruturais de (NH- (CH2)8-NH mas os elementos estruturais de NH-CH2-CH(CH3)-NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar. As polipropileniminas preferidas compreendem elementos estruturais de NH-CH2-CH(CH3)-NH sendo na maioria com respeito ao compartilhamento molar, por exemplo em um montante de 60% em mol ou mais, mais preferivelmente em um montante de pelo menos 70% em mol, referindo-se a todos elementos estruturais de alquilenimina. Em uma modalidade especial, o termo polipropilenimina se refere àquelas polialquileniminas que carregam apenas um ou zero elemento estrutural de alquilenimina por unidade de polipropilenimina que seja diferente de NH-CH2-CH(CH3)-NH.

[00239] As ramificações podem ser grupos alquilenamino tais como, mais não limitado aos grupos -CH2-CH2-NH2 ou grupos (CH2)3-NH2. Ramificações mais longas pode ser, por exemplo, grupos -(CH2)3- N(CH2CH2CH2NH2)2 ou -(CH2)2-N(CH2CH2NH2)2. Polietileniminas altamente ramificadas são, por exemplo, dendrímeros de polietilenimina ou moléculas relacionadas com um grau de ramificação na faixa de 0,25 a 0,95, preferivelmente na faixa de 0,30 a 0,80 e particularmente preferível pelo menos 0,5. O grau de ramificação pode ser determinado por exemplo pela 13 15 espectroscopia de C-RMN ou N-RMN, preferivelmente em D2O e é definido como segue:

72 / 96 DB = D+T/D+T+L com D (dendrítico) correspondendo à fração de grupos amino terciário, L (linear) correspondendo à fração de grupos amino secundário e T (terminal) correspondendo à fração de grupos amino primário.

[00240] Dentro do contexto da presente invenção, as unidades de polietilenimina ramificada são unidades de polietilenimina com DB na faixa de 0,25 a 0,95, particularmente preferíveis na faixa de 0,30 a 0,90% e muito particularmente preferível pelo menos 0,5. As unidades de polietilenimina preferidas são aquelas que exibem pouca ou nenhuma ramificação, assim predominantemente lineares ou unidades de polietilenimina linear.

[00241] No contexto da presente invenção, os grupos CH3 não estão sendo considerados como ramificações.

[00242] Em uma modalidade da presente invenção polialquilenimina pode ter um valor de amina primário na faixa de 1 a 1000 mg de KOH/g, preferivelmente de 10 a 500 mg de KOH/g, o mais preferido de 50 a 300 mg KOH/g. O valor da amina primária pode ser determinado de acordo com a ASTM D2074-07.

[00243] Em uma modalidade da presente invenção a polialquilenimina pode ter um valor de amina secundário na faixa de 10 a 1000 mg de KOH/g, preferivelmente de 50 a 500 mg de KOH/g, o mais preferido de 50 a 500 mg de KOH/g. O valor da amina secundária pode ser determinado de acordo com a ASTM D2074-07.

[00244] Em uma modalidade da presente invenção a polialquilenimina pode ter um valor de amina terciária na faixa de 1 a 300 mg de KOH/g, preferivelmente de 5 a 200 mg de KOH/g, o mais preferido de 10 a 100 mg de KOH/g. O valor de amina terciária pode ser determinado de acordo com a ASTM D2074-07.

[00245] Em uma modalidade da presente invenção, o compartilhamento molar de átomos N terciários é determinado pela

73 / 96 15 espectroscopia de N-RMN. Nos casos que o valor e resultado de amina terciária de acordo com a espectroscopia de 13C-RMN são inconsistentes, os resultados obtidos pela espectroscopia de 13C-RMN serão dados preferência.

[00246] Em uma modalidade da presente invenção, o peso molecular médio Mw da dita polialquilenimina está na faixa de 250 a 100.000 g/mol, preferivelmente até 50.000 g/mol e mais preferivelmente de 800 até 25.000 g/mol. O peso molecular médio Mw da polialquilenimina pode ser determinado pela cromatografia de permeação em gel (GPC) da respectiva polialquilenimina intermediária, com 1,5% em peso de ácido fórmico aquoso como eluente e metacrilato de poli-hidroxietila reticulado como fase estacionária.

[00247] A dita polialquilenimina pode ser livre ou alcoxilada, a dita alcoxilação sendo selecionada dentre etoxilação, propoxilação, butoxilação e combinações de pelo menos duas das anteriores. Preferência é dada ao óxido de etileno, óxido de 1,2-propileno e misturas de óxido de etileno e óxido de 1,2-propileno. Se misturas de pelo menos dois óxidos de alquileno são aplicados, eles podem ser reagidos em etapas ou simultaneamente.

[00248] Em uma modalidade da presente invenção, uma polialquilenimina alcoxilada carrega pelo menos 6 átomos de nitrogênio por unidade.

[00249] Em uma modalidade da presente invenção, a polialquilenimina é alcoxilada com 2 a 50 moles de óxido de alquileno por grupo NH, preferivelmente 5 a 30 moles de óxido de alquileno por grupo NH, ainda mais preferidas 5 a 25 moles de óxido de etileno ou óxido de 1,2-propileno ou combinações dos mesmos por grupo NH. No contexto da presente invenção, uma unidade de NH2 é contada como dois grupos NH. Preferivelmente, todos – ou quase todos – os grupos NH são alcoxilados e não há quantidades detectáveis de grupos NH deixados.

[00250] Dependendo da fabricação de tal polialquilenimina alcoxilada,

74 / 96 a distribuição do peso molecular pode ser estreita ou ampla. Por exemplo, a polidispersividade Q = Mw/Mn na faixa de 1 a 3, preferivelmente pelo menos 2 ou a mesma pode ser maior do que 3 e até 20, por exemplo 3,5 a 15 e ainda mais preferida na faixa de 4 a 5,5.

[00251] Em uma modalidade da presente invenção, a polidispersividade Q da polialquilenimina alcoxilada está na faixa de 2 a 10.

[00252] Em uma modalidade da presente invenção a polialquilenimina alcoxilada é selecionada dentre polietilenimina polietoxilada, polipropilenimina etoxilada, α,ω-hexandiaminas etoxiladas, polietilenimina etoxilada e propoxilada, polipropilenimina etoxilada e propoxilada e etoxilada e α,ω-hexandiaminas polipropoxilada.

[00253] Em uma modalidade da presente invenção o peso molecular médio Mn (média numérica) de polietilenimina alcoxilada está na faixa de

2.500 a 1.500.000 g/mol, determinada pela GPC, preferivelmente até 500.000 g/mol.

[00254] Em uma modalidade da presente invenção, a polialquilenimina alcoxilada média é selecionada dentre α,ω-hexanodiaminas etoxiladas e α,ω- hexanodiaminas etoxiladas e polipropoxiladas, cada uma com um peso molecular médio Mn (média numérica) na faixa de 800 a 500.000 g/mol, preferivelmente 1.000 a 30.000 g/mol.

[00255] As formulações detergentes líquidas da invenção podem compreender um ou mais inibidores de corrosão. Os exemplos não limitativos de inibidores de corrosão adequados incluem silicato de sódio, triazóis tais como benzotriazóis, bisbenzotriazóis, aminotriazóis, alquilaminotriazóis, derivados de fenol tais como hidroquinona, pirocatecol, hidróxi-hidroquinona, ácido gálico, floroglucinol e pirogalol, adicionalmente polietilenimina e sais de bismuto ou zinco. Os inibidores de corrosão podem ser formulados em formulações detergentes líquidas da invenção em quantidades de 0,1 a 1,5% p/p em relação ao peso global da composição detergente líquida.

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[00256] As formulações detergentes líquidas da invenção podem compreender pelo menos um copolímero de enxerto composto de (a) pelo menos um enxerto base selecionado dentre monossacarídeos não iônicos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos, e cadeias laterais obtidas pelo enxerto de (b) pelo menos um ácido mono- ou dicarboxílico etilenicamente insaturado e (c) pelo menos um composto da fórmula geral (XI), 1

R 2 + - O N(R )3 X 1

A

O (XI) em que as variáveis são definidas como segue: R1 é selecionado dentre metila e hidrogênio, A1 é selecionado dentre alquileno C2-C4, R2 são idênticos ou diferentes e selecionados dentre alquila C1- C4 , X- é selecionado dentre haleto, monoalquila C1-C4 sulfato e sulfato.

[00257] As formulações detergentes líquidas da invenção pode compreender um ou mais tampões tais como monoetanolamina e N,N,N- trietanolamina.

[00258] As formulações detergentes líquidas da invenção podem ser adaptadas em características de espumação para satisfazer vários propósitos. Os detergentes de lavagem de louça manual geralmente requerem espumas estáveis. Os detergentes de lavadora automática são geralmente requeridos ser de baixa espuma. Os detergentes de lavar roupas pode variar de alta espumação até uma faixa moderada ou intermediária a baixa. Os detergentes de lavagem de roupas de baixa espumação são geralmente recomendadas para

76 / 96 as lavadoras de carga frontal, tipo tambor e combinações de lavadora- secadora. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com o uso de estabilizantes de espumas ou supressores de espuma como componentes detergentes nas formulações detergentes que são adequados para aplicações específicas.

[00259] Os exemplos de estabilizantes de espuma incluem mas não são limitadas a alcanolamidas e óxidos de alquilamina. Os exemplos de supressores de espuma incluem mas não são limitados a fosfatos de alquila, silicones e sabões.

[00260] As formulações detergentes líquidas da invenção podem compreender uma ou mais fragrâncias tais como salicilato de benzila, 2-(4- terc-butilfenil) 2-metilpropional, comercialmente disponível como Lilial® e hexil cinamaldeído.

[00261] As formulações detergentes líquidas da invenção podem compreender um ou mais corantes tais como Azul Ácido 9, Amarelo Ácido 3, Amarelo Ácido 23, Amarelo Ácido 73, Pigmento Amarelo 101, Verde Ácido 1, Solvente Verde 7 e Verde Ácido 25.

[00262] As formulações detergentes líquidas podem compreender pelo menos um composto selecionado dentre solventes orgânicos, conservantes, modificadores de viscosidade e hidrótropos.

[00263] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes líquidas compreendem quantidades de solventes orgânicos são de 0,5 a 25% em peso, relativo ao peso total da formulação detergente líquida. Especialmente quando as formulações detergentes líquidas inventiva são providas em sacos ou os semelhantes, 8 a 25% em peso de solvente(s) orgânico(s) relativo ao peso total da formulação detergente líquida pode(m) ser compreendido(s). Os solventes orgânicos são aqueles descritos acima.

[00264] As formulações detergentes líquidas inventivas podem compreender um ou mais conservantes selecionados dentre aqueles descritos

77 / 96 acima em quantidades eficazes para evitar a contaminação microbiana da formulação detergente líquida.

[00265] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes líquidas compreendem um ou mais modificadores de viscosidade. Os exemplos não limitativos de modificadores de viscosidade adequados incluem ágar-ágar, carragenina, tragacanto, goma arábica, goma xantana, alginatos, pectinas, hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, amido, gelatina, goma de alfarroba, poli(met)acrilatos reticulados, por exemplo ácido poliacrlílico reticulado com bis-(met)acrilamida, adicionalmente ácido silícico, argila tal como – mais não limitado a – montmorilonita, zeólito, dextrina e caseína. Os modificadores de viscosidade podem ser compreendidos em quantidades eficazes na provisão da viscosidade desejada.

[00266] Em uma modalidade da presente invenção, as formulações detergentes líquidas compreendem um ou mais hidrótropos que podem ser solventes orgânicos tais como etanol, isopropanol, etileno glicol, 1,2- propileno glicol e adicionalmente solventes orgânicos que são miscíveis em água sob condições normais sem limitação. Adicionalmente os exemplos de hidrótropos adequados são os sais de sódio do ácido toluenossulfônico, do ácido xilenossulfônico e de ácido cumenossulfônico. Os hidrótropos podem ser compreendidos em quantidades que facilitam ou possibilitam a dissolução de compostos que exibem solubilidade limitada em água.

[00267] Em uma modalidade da presente invenção, a formulação de acordo com a invenção é livre de fosfatos e polifosfatos, com hidrogeno fosfatos sendo incluído, por exemplo livre de fosfato de trissódio, tripolifosfato de pentassódio e metafosfato de hexassódio. Em conexão com fosfatos e polifosfatos, no contexto da presente invenção, “livre de” deve ser entendido como significando que o conteúdo de fosfato e polifosfato está no total na faixa de 10 ppm a 0,2% em peso, determinada pela gravimetria.

[00268] Em uma modalidade da presente invenção, a formulação de

78 / 96 acordo com a invenção é livre destes compostos de metal pesado que não atuam como catalisadores de branqueamento, em particular a partir de compostos de ferro. Em conexão com compostos de metal pesado no contexto da presente invenção, “livre de” deve ser entendido como significando que o conteúdo de compostos de metal pesado que não atuam como catalisadores de branqueamento está no total na faixa de 0 a 100 ppm, preferivelmente 1 a 30 ppm, determinada pelo método Leach. No contexto da presente invenção, “metais pesados” são todos os metais com uma densidade específica de pelo menos 6 g/cm3, com a exceção do zinco e bismuto. Em particular, os metais pesados são metais precisos e também ferro, cobre, chumbo, estanho, níquel, cádmio e cromo.

[00269] Em uma modalidade, as formulações detergentes líquidas da invenção são livres de branqueadores, por exemplo livres de compostos de peróxido inorgânico ou branqueadores de cloro tais como hipoclorito de sódio, significando que as formulações detergentes líquidas de acordo com a invenção compreendem no total 0,01% em peso ou menos de composto de peróxido inorgânico e branqueador de cloro, em relação em cada caso no peso total da formulação detergente líquida.

[00270] “Formulação detergente” ou “formulação limpadora” aqui significam formulações designadas para limpar material sujo. Limpar pode significar lavar roupas ou limpar superfície dura. O material sujo de acordo com a invenção inclui têxteis e/ou superfícies duras.

[00271] O termo “lavar roupas” se refere tanto à lavagem de roupas doméstica quanto à lavagem de roupas industrial e significa o processo de tratar têxteis com uma solução compreendendo uma formulação detergente da presente invenção. O processo de lavagem de roupas pode ser realizado usando-se dispositivos técnicos tais como uma máquina de lavagem doméstica ou uma industrial. Alternativamente, o processo de lavagem de roupas pode ser feito à mão.

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[00272] O termo “produto têxtil” significa qualquer material têxtil incluindo fios (linha feita de fibras naturais ou sintéticas usadas para tricotagem ou tecelagem), intermediários de fios, fibras, materiais não tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos, bem como tecidos (um produto têxtil fabricado por fibras de tecelagem, tricotagem ou feltragem) fabricados destes materiais tais como vestimentas (qualquer artigo de vestuário fabricado de produto têxtil), roupas e outros artigos.

[00273] O termo “fibras” inclui fibras naturais, fibras sintéticas e misturas dos mesmos. Os exemplos de fibras naturais são de origem vegetal (tal como linho, juta e algodão) ou animal, compreendendo proteínas tipo colágeno, queratina e fibroína por exemplo, seda, lã de ovelhas, angorá, mohair, caxemira). Os exemplos para fibras de origem sintética são fibras de poliuretano tais como Spandex® ou Lycra®, fibras de poliéster, poliolefinas tais como elastofina ou fibras de poliamida tais como náilon. As fibras podem ser fibras únicas ou partes de têxteis tais como malhas, tecidos ou não tecidos.

[00274] O termo “limpeza de superfície dura” é definido aqui como limpeza de superfícies duras em que as superfícies duras podem incluir quaisquer superfícies duras na unidade domiciliar, tais como pisos, móveis, paredes, cerâmicas sanitárias, vidro, superfícies metálicas incluindo talheres ou louças. O termo “limpeza de superfície dura” pode, portanto, significar “lavagem de louça” que se refere a todas as formas de lavar louças, por exemplo, à mão ou lava-louças automática (ADW). A lavagem de louça inclui, mas não é limitada à limpeza de todas as formas de utensílios de mesa tais como pratos, xícaras, copos, tigelas, todas as formas de utensílios de mesa tais como colheres, facas, garfos e utensílios de servir bem como cerâmicas, plásticos tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos.

[00275] Em um aspecto, a invenção se refere à provisão de uma formulação detergente líquida compreendendo pelo menos os componentes (a) e (b) e pelo menos um componente detergente, em que o componente (b)

80 / 96 compreende pelo menos uma protease e pelo menos uma lipase.

[00276] Em uma modalidade, a invenção provê uma formulação detergente líquida compreendendo pelo menos componentes (a) e (b) e pelo menos um componente detergente, em que o componente (b) compreende pelo menos uma lipase selecionada dentre Thermomyces lanuginosa lipase e variantes das mesmas como descrito acima e pelo menos uma protease preferivelmente selecionado a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descrita na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como descritas acima.

[00277] Em modalidades das modalidades acima, a formulação detergente líquida tem estabilidade na armazenagem aumentada quando comparada com uma formulação detergente líquida carecendo do componente (a). A estabilidade aumentada na armazenagem neste contexto pode significar que não há nenhuma perda significante no desempenho de lavagem depois da armazenagem do detergente na formulação a 37°C por 1 semana [7 dias], 2 semanas [14 dias], 4 semanas [28 dias], 6 semanas [42 dias] ou 8 semanas [56 dias].

[00278] Nenhuma perda significante no desempenho da lavagem depois da armazenagem pode significar que o detergente tem i. pelo menos 90% de desempenho de lavagem depois de 4 semanas de armazenagem a 37°C quando comparado com o desempenho de lavagem do mesmo detergente antes da armazenagem; e/ou ii. pelo menos 85% de desempenho de lavagem depois de 6 semanas de armazenagem a 37°C quando comparado com o desempenho de lavagem do mesmo detergente antes da armazenagem; e/ou iii. pelo menos 80% de desempenho de lavagem depois de 8

81 / 96 semanas de armazenagem a 37°C quando comparado com o desempenho de lavagem do mesmo detergente antes da armazenagem.

[00279] Em uma modalidade, a formulação detergente líquida compreendendo pelo menos os componentes (a) e (b) e pelo menos um componente detergente tem a estabilidade na armazenagem aumentada quando comparada com uma formulação detergente líquida carecendo do componente (a), em que o componente (b) compreende pelo menos uma lipase preferivelmente selecionada dentre a lipase de Thermomyces lanuginosa e variantes das mesmas como descritas acima e pelo menos uma protease como descrita acima, preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descritas na WO 89/06279; subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas como aqui descritas. A estabilidade na armazenagem aumentada em uma modalidade significa que o desempenho de lavagem de uma formulação detergente líquida depois de 4 a 8 semanas de armazenagem a 37°C é aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% ou pelo menos 10% quando comparado a uma formulação detergente líquida carecendo do componente (a) armazenada durante o mesmo tempo na mesma temperatura. A estabilidade na armazenagem aumentada pode significar que o desempenho de lavagem de uma formulação detergente líquida depois de 8 semanas de armazenagem a 37°C é aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% ou pelo menos 10% quando comparado a uma formulação detergente líquida carecendo do componente (a) armazenada durante o mesmo tempo na mesma temperatura.

[00280] Em um aspecto, a invenção se refere a prover uma formulação detergente líquida compreendendo pelo menos os componentes (a) e (b) e pelo menos um componente detergente, em que o componente (b)

82 / 96 compreende pelo menos uma protease e pelo menos uma amilase.

[00281] Em uma modalidade, a invenção provê uma formulação detergente líquida compreendendo pelo menos os componentes (a) e (b) e pelo menos um componente detergente, em que o componente (b) compreende pelo menos um preferivelmente selecionado a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descrito na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, a subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma amilase preferivelmente selecionada dentre as amilases da Bacillus sp. 707 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica e amilases da Bacillus halmapalus ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica, mais preferivelmente selecionadas dentre as amilases de acordo com as SEQ ID NOs: 1 e 2 da WO 2013/001078 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica – todas como descritas acima.

[00282] Em um aspecto, a invenção se refere ao uso do componente (a) para estabilizar o componente (b) dentro de uma formulação detergente líquida, em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease como descrita acima, preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descritas na WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como aqui descritas.

[00283] Em uma modalidade, a invenção se refere ao uso do componente (a) para estabilizar o componente (b) dentro de uma formulação detergente líquida, em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease como descrita acima, preferivelmente selecionada a partir da

83 / 96 subtilisina 147 e/ou 309 como descritas na WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma lipase preferivelmente selecionada dentre a lipase de Thermomyces lanuginosa e variantes das mesmas como descritas acima – todas as enzimas como aqui descritas.

[00284] Em uma modalidade, a invenção se refere ao uso do componente (a) para estabilizar o componente (b) dentro de uma formulação detergente líquida, em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease como descrita acima, preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descritas na WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma amilase preferivelmente selecionada dentre amilases da Bacillus sp. 707 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica e amilases da Bacillus halmapalus ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica, mais preferivelmente selecionadas dentre as amilases de acordo com a SEQ ID NO: 1 e 2 da WO 2013/001078 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica – todas as enzimas como aqui descritas.

[00285] Componente (b) estabilizado neste contexto significa que o desempenho de lavagem de uma formulação detergente líquida compreendendo o componente (b) depois de 4 a 8 semanas de armazenagem a 37°C é aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% ou pelo menos 10% quando comparada com uma formulação detergente líquida carecendo do componente (a) armazenada

84 / 96 durante o mesmo tempo na mesma temperatura. Componente (b) estabilizado pode significar que o desempenho de lavagem de uma formulação detergente líquida compreendendo o componente (b) depois de 8 semanas de armazenagem a 37°C é aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9% ou pelo menos 10% quando comparada com uma formulação detergente líquida carecendo do componente (a) armazenada durante o mesmo tempo na mesma temperatura.

[00286] Em um aspecto, a invenção se refere ao uso do componente (a) para reduzir a perda da atividade enzimática durante a armazenagem, preferivelmente a 37°C por 21, 28 e/ou 35 dias, do componente (b) dentro uma formulação detergente líquida, em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descrita na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma lipase preferivelmente selecionada dentre a lipase de Thermomyces lanuginosa e variantes das mesmas – todas as enzimas como descritas acima.

[00287] Em um aspecto, a invenção se refere ao uso do componente (a) para reduzir a perda da atividade enzimática durante a armazenagem, preferivelmente a 37°C por 21, 28 e/ou 35 dias, do componente (b) dentro de uma formulação detergente líquida, em que o componente (b) compreende pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descritas na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma amilase

85 / 96 preferivelmente selecionado dentre amilases a partir da Bacillus sp. 707 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica e amilases da Bacillus halmapalus ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica, mais preferivelmente selecionada dentre amilases de acordo com as SEQ ID NOs: 1 e 2 da WO 2013/001078 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica – todas as enzimas como descritas acima.

[00288] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para aumentar a estabilidade na armazenagem de uma formulação detergente líquida compreendendo pelo menos uma protease, pela adição de pelo menos um composto conforme a fórmula (I) à formulação detergente: 3

R O O

O O 2 4

R R O O

O 1

R (I) em que as variáveis da fórmula (I) são como segue: R1 é selecionado dentre H e alquila C1-C10 carbonila, em que alquila pode ser linear ou ramificada e pode carregar um ou mais grupos hidroxila; R2, R3, R4 são independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H.

[00289] Em uma modalidade, a estabilidade na armazenagem da dita formulação detergente líquida é aumentada durante a armazenagem a 37°C por 21, 28 e/ou 35 dias quando comparada a uma formulação detergente

86 / 96 líquida carecendo do composto conforme a fórmula (I) armazenada sob as mesmas condições. A estabilidade aumentada na armazenagem dentro desta invenção pode significar que o aumento na estabilidade de enzima na presença do componente (a) é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%, quando comparada com a atividade enzimática na ausência do componente (a).

[00290] Em uma modalidade, a dita formulação detergente líquida compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo de proteases tipo substilisina (EC 3.4.21.62) e em que a formulação detergente líquida opcionalmente compreende pelo menos uma lipase, preferivelmente selecionada da lipase de Thermomyces lanuginosa, em que (a) pelo menos uma protease é preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descritas na WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, a subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e a subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como aqui descritas, e (b) pelo menos uma lipase é preferivelmente selecionada da lipase de Thermomyces lanuginosa e variantes das mesmas como descrito acima.

[00291] Em uma modalidade, a dita formulação detergente líquida compreende pelo menos uma protease selecionada a partir do grupo de proteases tipo substilisina (EC 3.4.21.62) e em que a formulação detergente

87 / 96 líquida opcionalmente compreende pelo menos uma amilase, em que (a) pelo menos uma protease é preferivelmente selecionada a partir da subtilisina 147 e/ou 309 como descrita na WO 89/06279 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, a subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e a subtilisina de acordo com SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 ou variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como aqui descritas, e (b) pelo menos uma amilase é preferivelmente selecionada dentre as amilases da Bacillus sp. 707 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica e amilases da Bacillus halmapalus ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica, mais preferivelmente selecionada dentre as amilases de acordo com as SEQ ID NOs: 1 e 2 da WO 2013/001078 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica – como aqui descritas. Uso Adicional

[00292] A invenção se refere a um método para remover manchas compreendendo as etapas de colocar em contato uma mancha com uma formulação detergente da invenção compreendendo os componentes (a) e (b) e um ou mais componentes detergentes. Em uma modalidade, o método para remover manchas incluindo as etapas realizadas por um dispositivo automático tal como uma máquina de lavar roupas ou uma lava-louças automática.

[00293] Em uma modalidade, a formulação detergente compreende a preparação de enzima da invenção.

[00294] Em um aspecto, o método se refere à remoção de manchas compreendendo gordura. As gorduras podem ser subclassificadas como gordura, graxa ou óleo dependendo da temperatura de fusão. O óleo é geralmente líquido na temperatura ambiente. A graxa tem uma viscosidade mais alta do que o óleo na temperatura ambiente e pode ser chamado pastoso.

88 / 96 Em uma modalidade, a remoção de manchas compreendendo gordura pode ser feita nas temperaturas de limpeza ≤ 40°C, nas temperaturas de limpeza ≤ 30°C, nas temperaturas de limpeza ≤ 25°C ou nas temperaturas de limpeza ≤ 20°C.

[00295] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para remover manchas compreendendo compostos graxo tendo uma temperatura de fusão abaixo da temperatura de limpeza. Em uma modalidade, a mancha a ser removida de um produto têxtil compreende compostos graxos tendo uma temperatura de fusão de >30°C e a remoção é feita em uma temperatura de limpeza de temperatura ≤ 30°C.

[00296] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método para remover manchas compreendendo compostos gordurosos tendo uma temperatura de fusão >30°C em uma temperatura de limpeza de temperatura ≤ 30°C, em que o método compreende as etapas de colocar em contato a mancha com uma formulação detergente da invenção compreendendo os componentes (a) e (b) e um ou mais componentes detergentes. Os componentes (a) e (b) são aqueles como descritos acima. O componente (b), em uma modalidade compreende pelo menos uma lipase preferivelmente selecionada dentre lipase de Thermomyces lanuginosa e variantes das mesmas e pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada dentre a subtilisina 147 e/ou 309 como descrita na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica – todas como descritas acima.

[00297] Em um aspecto, o método se refere à remoção de manchas compreendendo amido. Em uma modalidade, a remoção de manchas compreendendo amido pode ser feita nas temperaturas de limpeza ≤ 40°C, nas temperaturas de limpeza ≤ 30°C, nas temperaturas de limpeza ≤ 25°C ou nas

89 / 96 temperaturas de limpeza ≤ 20°C.

[00298] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método para remover manchas compreendendo amido em uma temperatura de limpeza de temperatura ≤ 30°C, em que o método compreende as etapas de colocar em contato a mancha com uma formulação detergente da invenção compreendendo os componentes (a) e (b) e um ou mais componentes detergentes. Os componentes (a) e (b) são aqueles como descritos acima. O componente (b), em uma modalidade compreende pelo menos uma protease, preferivelmente selecionada dentre subtilisina 147 e/ou 309 como descritas na WO 89/06279 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica, subtilisina da Bacillus lentus como descrita na WO 91/02792 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e subtilisina de acordo com a SEQ ID NO: 22 como descrita na EP 1921147 e variantes das mesmas tendo atividade proteolítica e pelo menos uma amilase preferivelmente selecionada dentre as amilases de Bacillus sp. 707 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica e amilases de Bacillus halmapalus ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica, mais preferivelmente selecionadas dentre as amilases de acordo com as SEQ ID NOs: 1 e 2 da WO 2013/001078 ou variantes das mesmas tendo atividade amiolítica – todas as enzimas como descritas acima. Exemplos

[00299] A invenção será adicionalmente ilustrada pelos exemplos de trabalho.

[00300] Observações gerais: as porcentagens são porcentagem em peso a menos que especificamente de outro modo mencionado. I. Compostos testado A) Compostos conforme a fórmula (I) - (componente (a)):

[00301] A.1 Trietilcitrato - adquirido da Sigma Aldrich A.2 Tripropilcitrato - adquirido da Sigma Aldrich A.3 Tributilcitrato - adquirido da Sigma Aldrich

90 / 96 A.4 Acetiltributilcitrato - adquirido da Sigma Aldrich A.5 Acetiltrietilcitrato - adquirido da Sigma Aldrich A.6 Monoetilcitrato - adquirido da Sigma Aldrich A.7 Dietilcitrato Síntese como descrita no: Journal of Chemical & Engineering Data 2018, DOI: 10.1021/acs.jced,7b01060, C. Berdugo, A. Suaza, M. Santaella, O. Sanchez A.8 Tribenzilcitrato Síntese como descrita na WO2007/14471 A1, 2007; Localização na patente: Página/Página coluna 19; 27-28 A.9 Trisalicilcitrato Síntese como descrita na WO2007/14471 A1, 2007; Localização na patente: Página/Página coluna 19; 27-28. B) Compostos comparativos:

[00302] B.1: ácido cítrico - adquirido da Sigma Aldrich B.2: Sal de trissódio do ácido cítrico - adquirido da Sigma Aldrich B.3: dietiloxalato - adquirido da Sigma Aldrich B.4: gliceroltriacetato (triacetina) - adquirido da Sigma Aldrich. II. Estabilidade da Protease

[00303] A estabilidade na armazenagem da protease foi avaliada a 37°C.

[00304] As formulações de teste base foram fabricadas tornando-se as formulações I a V básicas pela mistura dos componentes de acordo com a Tabela 1.

[00305] Protease usada: Savinase® 16.0L (CAS-No. 9014-01-1, EC- No. 232-752-2) foi adquirida da Sigma-Aldrich.

[00306] O respectivo componente (a) ou composto comparativo foi

91 / 96 adicionado, se aplicável, à respectiva formulação base em quantidades como indicadas na Tabela 1.

[00307] Protease (componente (b)) foi adicionada à respectiva formulação base em quantidades como indicadas na Tabela 1. A quantidade de protease como provida na Tabela 1 se refere à proteína ativa.

[00308] Água foi adicionada para realizar o equilíbrio para 100. Tabela 1: Formulações líquidas Ingredientes % em peso na formulação I. II. III. IV. V. Formulação base: (Comp. 1) 15 8 - 6 6 (Comp. 2) - 6 8 8 8 (Comp. 3) 6 4 - 4 4 (Comp. 4) 2 - - 2 - (Comp. 5) - 4 8 4 4 (Comp. 6) - 2,5 - - 2,5 Sorbitol 3 - - 2 - PEI-EO20 3 5 3 5 5 Propileno glicol - 4 - 2 4 Glicerol - - 6 - - Ca-formiato 1 - 1 - - Aditivos: Savinase 16,0L 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 componente (a)** 2,5 2,5 2,0 2,0 2,0 equilíbrio Água para 100 (Comp. 1): n-alquila C18-(OCH2CH2)25-OH (Comp. 2): combinação de alquila C10-C18 poliglicosídeo (Comp. 3): Alquila C10-C12 benzenossulfonato de sódio (Comp. 4): Cumenossulfonato de sódio (Comp. 5): lauretsulfato de sódio – n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na (Comp. 6): n-C12H25(CH3)2N→O ** para testes comparativos sem compostos inventivos estes foram substituídos com mesma quantidade de água.

[00309] A atividade de Savinase em certos pontos no tempo como indicados na Tabela 2 foi determinada utilizando-se Succinil-Ala-Ala-Pro- Phe-p-nitroanilida (Suc-AAPF-pNA, resumido AAPF) como substrato. A pNA é clivada da molécula de substrato pela clivagem proteolítica, resultando na liberação de cor amarela de pNA livre que foi determinada medindo-se a OD405. As medições foram feitas a 20°C.

[00310] A Tabela 2 exibe a atividade de protease medida em formulações líquidas depois da armazenagem por 1 a 30 dias a 37°C. Os valores da atividade proteolítica providos na Tabela 3 foram calculados

92 / 96 referindo-se ao valor 100% determinado na formulação de referência no tempo 0.

[00311] A nomenclatura das formulações é como segue: O algarismo romano antes do ponto final caracteriza a formulação base, o algarismo arábico o tipo de composto (A.# composto de acordo com invenção (componente (a)); (B.#) composto comparativo). Tabela 2: Atividade de protease no curso de tempo de armazenagem a 37°C Identificador de T0 3d 7d 14d 21d 28d 35d formulação Formulação Composto base I. 0 100 93 87 78 69 64 59 I. (A.1) 100 96 93 89 83 79 72 I. (A.2) 101 100 94 91 85 80 76 I. (A.4) 102 100 96 92 87 83 79 I. (A.5) 98 96 94 90 85 82 78 I. (A.7) 100 95 91 85 81 76 69 I. (B.1) 98 94 86 76 67 62 57 I. (B.2) 97 95 84 68 64 59 55 I. (B.3) 99 90 86 70 65 62 58 I. (B.4) 100 91 84 70 66 61 56 II. 0 98 93 89 74 69 64 59 II. (A.1) 100 100 96 93 89 83 78 II. (A.5) 102 101 100 94 90 85 81 II. (A.6) 101 102 100 95 92 87 83 II. (A.7) 98 98 96 94 90 87 83 II. (A.8) 100 94 91 88 85 83 77 II. (A.9) 98 96 92 87 84 80 76 II. (B.2) 98 95 82 75 66 63 60 II. (B.4) 97 87 80 73 58 57 54 III. 0 96 93 85 75 64 60 55 III. (A.1) 100 98 94 91 87 84 81 III. (A.2) 102 100 100 96 91 88 84 III. (A.5) 99 97 95 91 86 81 77 III. (A.6) 99 96 92 86 82 79 76 III. (A.7) 100 96 93 84 83 76 72 III. (A.9) 102 98 97 95 91 87 83 III. (B.1) 100 92 84 75 65 60 53 III. (B.2) 101 93 83 73 62 57 50 III. (B.3) 98 92 85 74 60 55 51 IV. 0 96 90 85 77 68 60 55 IV. (A.1) 98 96 93 88 82 79 74 IV. (A.3) 99 100 96 91 84 81 77 IV. (B.2) 98 91 86 70 64 58 52 V. 0 98 93 89 74 68 62 57

93 / 96 Identificador de T0 3d 7d 14d 21d 28d 35d formulação Formulação Composto base V. (A.1) 97 94 90 86 83 79 75 V. (A.3) 101 98 93 88 85 80 74 V. (A.8) 96 96 92 86 84 80 73 V. (B.1) 97 93 86 75 65 57 50 III. Testes de limpeza de têxteis

[00312] O desempenho detergente das formulações nos dois tipos de limpeza de tecidos de teste foi realizado. As amostras de pano de teste compreenderam uma sujeira complexa compreendendo componentes proteináceos e de gordura devido ao processo CFT assim como as amostras de pano de teste compreenderam um tipo graxo/particulado de sujeira.

[00313] O teste foi realizado como segue: um monitor de mancha múltipla compreendendo 8 pedaços de tecido sujo padronizado, cada um de 2,5 x 2,5 cm no tamanho e costurado nos dois lados a um carreador de poliéster forma lavados juntos em uma launder-O-meter com 2,5 g de pano de algodão e 5g/L do detergente de lavagem de roupas de teste líquido, Tabela 3.

[00314] As condições foram como segue: Equipamento: Launder-O- Meter da SDL Atlas, Rock Hill, USA. Líquido de lavagem: 250 ml, tempo de lavagem: 60 minutos, temperatura de lavagem: 30°C. Dureza da água: 2,5 mmol/L; Ca:Mg:HCO3 4:1:8

[00315] Razão de tecido para líquido 1:12 Depois do ciclo de lavagem, os monitores de mancha múltipla foram enxaguados em água, seguido por secagem na temperatura ambiente em um período de tempo de 14 horas.

[00316] Os seguintes tecidos pré-sujos foram usados: CFT C-S-10: manteiga sobre algodão CFT C-S-62: banha, colorida sobre algodão CFT C-S-68: sorvete de chocolate sobre algodão EMPA 112: cacau sobre algodão EMPA 141/1: batom sobre algodão EMPA 125: monitor para tensoativo

94 / 96 wfk20D: pigmento e gordura tipo sebo sobre tecido misto de poliéster/algodão CFT C-S-70: mousse de chocolate wfk = tecidos de teste wfk GmbH, Krefeld EMPA = Swiss Federal Institute of Materials Testing CFT = Center for Test Material B.V.

[00317] O nível total de limpeza foi avaliado usando medições de color. Os valores de reflectância das manchas sobre os monitores foram medidos usando um espectrômetro de reflectância de esfera (tipo SF 500 da Datacolor, USA, faixa de comprimento de onda 360 a 700 nm, geometria óptica d/8°) com um filtro de corte UV a 460 nm. Neste caso, com a ajuda da classificação espacial de cor CIE-Lab, o brilho L *, o valor a * no eixo de cor vermelho - verde e o valor b * no eixo de cor amarelo - azul, foram medidos antes e depois da lavagem e calculados em média para as 8 manchas do monitor. A mudança do valor de cor (Δ E), definido e calculado automaticamente pela avaliação das ferramentas de cor na seguinte equação: [brilho L*, valor de cor a* no eixo vermelho-verde, valor de cor b* no eixo azul-amarelo]

[00318] ΔE é uma medida do efeito de limpeza obtido. Todas as medições foram repetidas seis vezes para produzir um número médio. Observe que valores ΔE mais altos apresentam melhor limpeza. Uma diferença de 1 unidade pode ser detectada por uma pessoa versada. Um não perito pode detectar 2 unidades facilmente. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Rw = reflectância da sujeira lavada Ro = reflectância da não suja

[00319] A detergência foi calculada como: Um total de 6 réplicas de

95 / 96 cada pano foram conduzidas durante este estudo; um nível de confidência estatística de 90 a 95% foi calculado.

[00320] As formulações de teste foram fabricadas fazendo-se as formulações VI a X misturando-se os componentes de acordo com a Tabela 3.

[00321] O respectivo componente (a) ou composto comparativo foi adicionado, se aplicável, à respectiva formulação base em quantidades providas na Tabela 3.

[00322] Lipolase® 100L foi adicionada, se aplicável, à respectiva formulação base em quantidades providas na Tabela 3.

[00323] Savinase® 16,0L foi adicionada, se aplicável, à respectiva formulação base em quantidades providas na Tabela 3.

[00324] Água foi adicionada para realizar o equilíbrio para 100. Tabela 3: Formulações de lavagem de roupas líquidas Ingredientes % em peso na formulação VI. VII. VIII. IX. X. Formulação base: (Comp. 1) 8 8 8 8 8 (Comp. 2) 6 6 6 6 6 (Comp. 3) 4 4 4 4 4 (Comp. 4) 4 4 4 4 4 (Comp. 5) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 PEI-EO20 5 5 5 5 5 Propileno glicol 4 4 4 4 4 Aditivos: Savinase 16,0L - - - 0,7 0,7 Lipolase - - 0,2 0,2 0,2 componente (a)** - 2,5 2,5 - 2,5 equilíbrio Água para 100 (Comp. 1): n-C18-alquil-(OCH2CH2)25-OH (Comp. 2): combinação de alquila C10-C18 poliglicosídeo (Comp. 3): alquila C10-C12 benzenossulfonato de sódio (Comp. 4): lauretsulfato de sódio – n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na (Comp. 5): n-C12H25(CH3)2N→O ** para os testes comparativos sem compostos inventivos estes foram substituídos com mesma quantidade de água.

[00325] Os testes na launder-O-meter foram executados com formulações recém-preparadas e com as formulações armazenadas a 37°C durante uma armazenagem de 2 meses (1 semana [7 dias], 2 semanas [14 dias], 4 semanas [28 dias], 6 semanas [42 dias], 8 semanas [56 dias]). Como uma aproximação uma semana a 37°C é equivalente a 3½ semanas a 20°C.

96 / 96

Tabela 4: Resultados dos testes de launder-O-meter: soma de ΔE do monitor de manchas múltiplas mencionadas acima Identificador de formulação ΔE T0 ΔE 1 ΔE 2 ΔE 4 ΔE 6 ΔE 8 Formulação composto semana semanas semanas semanas semanas base VI. - 152 154 153 151 153 153 VII.

A.1 154 153 154 152 152 153 VII.

A.2 152 152 154 152 152 153 VII.

A.5 154 155 153 153 152 153 VII.

A.8 153 153 152 152 152 151 VIII. 0 183 184 181 179 179 175 VIII.

A.3 185 185 181 178 176 173 VIII.

A.4 185 185 183 181 182 181 VIII.

A.7 182 179 179 175 173 170 IX. - 187 183 176 172 165 159 X.

A.1 191 188 187 184 184 180 X.

A.2 189 187 184 182 182 177 X.

A.5 190 187 187 183 180 180 X.

A.8 191 189 185 186 182 176 X.

B.1 190 186 180 175 168 160 X.

B.3 190 187 182 177 169 162 X.

B.4 188 185 181 173 166 159

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que compreende componente (a): pelo menos um composto conforme a fórmula geral (I) 3

R

O O

O O 2 4

R R

O O

O 1

R (I) em que as variáveis na fórmula (I) são definidas como segue: R1 é selecionado a partir de H; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H; componente (b): pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases, preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62), e opcionalmente componente (c): composto selecionado dentre pelo menos um solvente, pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) e pelo menos um composto estabilizando a preparação de enzima líquida como tal.

2. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação 1,

caracterizada pelo fato de que a dita preparação de enzima compreende o componente (a) em quantidades na faixa de 0,1 a 30% em peso em relação ao peso total da preparação de enzima.

3. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma protease compreendida no componente (b) é estabilizada quando comparada com a preparação de enzima carecendo do componente (a).

4. Processo para fabricar uma preparação de enzima estável, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende as etapas de misturar pelo menos componente (a): pelo menos um composto conforme a fórmula geral (I) 3

R

O O

O O 2 4

R R

O O

O 1

R (I) em que as variáveis na fórmula (I) são definidas como segue: R1 é selecionado a partir de H; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H, componente (b): pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases, preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62), e opcionalmente componente (c): composto selecionado dentre pelo menos um solvente, pelo menos um estabilizante de enzima diferente do componente (a) e pelo menos um composto estabilizando a preparação de enzima líquida como tal.

5. Método para reduzir a perda da atividade proteolítica de pelo menos uma protease compreendida em uma preparação de enzima líquida, caracterizado pelo fato de ser durante a armazenagem pela etapa de adicionar o pelo menos um composto conforme a fórmula (I): 3

R

O O

O O 2 4

R R

O O

O 1

R (I) em que as variáveis na fórmula (I) são definidas como segue: R1 é selecionado a partir de H; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H.

6. Uso de um composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela fórmula (I):

R

O O

O O 2 4

R R

O O

O 1

R (I) em que as variáveis na fórmula (I) são definidas como segue: R1 é selecionado a partir de H; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H como aditivo para pelo menos uma protease, em que o composto conforme a fórmula (I) e a protease são sólidos e em que atividade proteolítica da protease é estabilizada quando o composto conforme a fórmula (I) e a hidrolase são colocados em contato com pelo menos um solvente [componente (c)].

7. Uso da preparação de enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser formulado em formulações detergentes, preferivelmente formulações detergentes líquidas, em que a preparação de enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 é misturada em uma ou mais etapas com um ou mais componentes detergentes.

8. Formulação detergente, caracterizada pelo fato de que compreende a preparação de enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e pelo menos um componente detergente.

9. Método para preparação de uma formulação detergente,

caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de misturar pelo menos componente (a): pelo menos um composto conforme a fórmula geral (I) 3

R

O O

O O 2 4

R R

O O

O 1

R (I) em que as variáveis da fórmula (i) são como segue: R1 é selecionado a partir de H; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H componente (b): pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases, preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das serina endopeptidases (EC 3.4.21), mais preferivelmente pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62), e pelo menos um componente detergente em quantidades eficazes.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de misturar a preparação de enzima como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e pelo menos um componente detergente em quantidades eficazes.

11. Método para remover manchas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de colocar em contato pelo menos uma mancha com uma formulação detergente como definida na reivindicação 8, em que o componente (b) da dita formulação detergente compreende pelo menos uma protease e opcionalmente adicionalmente compreende pelo menos uma lipase.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a mancha que deve ser removida de um têxtil compreende compostos graxos tendo uma temperatura de fusão de >30°C e a remoção é feita em uma temperatura de limpeza de temperatura ≤ 30°C.

13. Método para aumentar a estabilidade na armazenagem de uma formulação detergente líquida, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma protease, pela adição de pelo menos um composto conforme a fórmula (I) à formulação detergente: 3

R

O O

O O 2 4

R R

O O

O 1

R (I) em que as variáveis da fórmula (I) são como segue: R1 é selecionado a partir de H; R2, R3, R4 são, independentemente um do outro, selecionados dentre H, alquila C1-C8 linear e alquila C3-C8 ramificada, arila C6-C10, não substituídas ou substituídas com um ou mais grupos carboxilato ou hidroxila e aril-alquila C6-C10, em que a alquila da última é selecionada dentre alquila C1- C8 linear ou alquila C3-C8 ramificada, em que pelo menos um de R2, R3 e R4 não é H.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o detergente é armazenado a 37°C por pelo menos 20 dias.

15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14,

caracterizado pelo fato de que a protease é selecionada a partir do grupo das proteases tipo subtilisina (EC 3.4.21.62) e em que a formulação detergente líquida opcionalmente compreende pelo menos uma lipase, preferivelmente selecionada dentre a lipase de Thermomyces lanuginosa e variantes da mesma.