JP4745503B2 - アルカリα−アミラーゼ活性を有するポリペプチド及びそれらをコードする核酸 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景：
発明の分野：
本発明は、α−アミラーゼ活性を有する単離されたポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。さらに、本発明は、本発明のα−アミラーゼの変異体に関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、及び前記ポリペプチドの生成及び使用方法にも関する。さらに、本発明はまた、洗濯、皿洗い及び/又は硬質表面洗浄のための組成物にも関する。
関連技術の説明：
【０００２】
長年の間、α−アミラーゼ酵素は種々の異なった目的のために使用されており、それらの中で最も重要なことは、澱粉液化、織物糊抜き、紙及びパルプ産業における及び醸造及びベーキングのための澱粉改質である。ますます重要になっているα−アミラーゼのさらなる使用は、アルカリ性pHでの洗剤による洗浄の間、澱粉ステインの除去である。
市販のα−アミラーゼ製品の例は、Termamyl（商標）, Duramyl（商標）, Natalase（商標）, BAN（商標）及びFungamyl（商標）(すべては、Novo Nordisk A/S, Denmarkから入手できる)である。他の市販源からのそれらの及び類似する製品は、酸性〜中性pH最良性、典型的には、pH５〜pH7.5の範囲での最適性を有し、そしてそれらはアルカリpHでの洗剤溶液において最適性を示さない。
【０００３】
WO95/26397号は、バチルス株からのα−アミラーゼを開示する。WO96/23873号は、洗浄条件下で改良された性能を有するバチルスアミラーゼの変異体を記載する。
アメリカ特許第5,147,796号は、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼを記載する。上記資料の図2bは、pH8-8.5での最適なアミラーゼ活性を示す。
【０００４】
M. Takagiなど., J. ferment. Bioeng., Vol. 81, No.6, 557-559 (1996) は、バチルスsp. からの親アルカリ性α−アミラーゼ−プルラナーゼを記載する。前記酵素はpH９で最適なアミラーゼ活性を有するが、しかしその活性はそれよりも高いpHで急速に低下し、そしてpH10での活性は、pH７での活性よりも低い。
WO97/00324号（KAO）は、洗剤のために適切な寄託番号FERM BP-3048のバチルスsp. 株KSM−AP1378に由来するアルカリ液化α−アミラーゼをコードする遺伝子を開示する。
【０００５】
Tsukamoto など., (1988), Biochem. Biophys. Res Commun. 151, p.25-33は、バチルス sp. #707からのアルカリα−アミラーゼを開示する。
アルカリ溶液において、特に、約９〜11のpHでのアルカリ洗剤溶液において、変更された性能、特に改良された性能を有する新規α−アミラーゼを供給することが、本発明の目的である。
【０００６】
発明の要約：
本発明は、α−アミラーゼ活性を有し、且つ
（ａ）配列番号２又は４のアミノ酸１〜485と少なくとも96％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１又は３の核酸配列、（ii）配列番号１又は３のcDNA配列、（iii）少なくとも100個のヌクレオチドの（ｉ）又は（ii）の副配列、又は（iV）前記(ｉ)、（ii）又は（iii）の相補的鎖と、中位の緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド；
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；
（ｄ）α−アミラーゼ活性を有する、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフラグメント；
（ｅ）約８〜９のpHの範囲でPhadebas方法（37℃）を用いて決定されるpH最適性を有するポリペプチド；
（ｆ）55〜65℃の範囲でPhadebas方法（pH9.0）を用いて決定される温度最適性を有するポリペプチド；
（ｇ）等電点電気泳動（Pharmacia, Ampholine, pH3.5-9.3）により決定される７−８のpIを有するポリペプチド；及び
（ｉ）９〜11のpHで改良された洗浄及び/又は皿洗い性能を有するポリペプチドから成る群から選択された１又は複数の特徴又は性質を有する単離されたポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明のα−アミラーゼが、１又は複数の上記特徴を有することが、理解されるべきである。
さらに、本発明は、本発明のα−アミラーゼの変異体にも関する。本発明また、ポリペプチドをコードする単離された核酸配列、及び前記核酸配列を含んでなる核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチドの生成及び使用方法にも関する。
【０００８】
発明の特定の記載：
微生物源：
本発明のアルカリα−アミラーゼは、バチルスの株から誘導され得る。好ましい株は、バチルスsp. DSM126４９ (AA560 α−アミラーゼ)又はDSM12648（AA349 α−アミラーゼ）のものである。それらの株は、Deutshe Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE での特許手続きのために、微生物の寄託の国際認識に基づいてブダペスト条件下で本発明者により1999年１月25日に寄託された。
【０００９】
それぞれ、プラスミドpLiH1274及びpTVB299においてα−アミラーゼ遺伝子を含む、NNO49467及びNN049470と称する２種のE.コリ株はまた、Deutshe Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DEでのブダペスト条件下で、1999年４月７日に寄託され、そしてそれぞれ、受託番号DSM12761及びDSM12764を付与された。
α−アミラーゼ活性を有するポリペプチド：
【００１０】
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、EC 3. 2.1.1）は、澱粉及び他の線状及び枝分かれ鎖の１，４―グルコシドオリゴ−及び多糖類の加水分解を触媒する酵素グループを構成する。本発明のために、α−アミラーゼ活性は、下記“材料及び方法”セクションに記載されるPhadebasアッセイ又はpNPG7アッセイを用いて決定される。
酵素の相同性：
【００１１】
第１の態様においては、本発明は、α−アミラーゼ活性を有する、配列番号２又は４（すなわち、成熟ポリペプチド）のアミノ酸１〜485に対して、少なくとも約96％、好ましくは少なくとも約97％、より好ましくは少なくとも約98％、さらにより好ましくは少なくとも約99％の程度の相同性を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（この後、“相同ポリペプチド”と称する）に関する。
【００１２】
好ましい態様においては、相同ポリペプチドは、配列番号２又は４のアミノ酸１〜485とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましくは１つのアミノ酸で異なるアミノ酸配列を有する。配列番号２又は４は同一であることが注目されるべきである。しかしながら、DNA配列、すなわち配列番号２又は４に示される本発明のα−アミラーゼをコードする、それぞれ配列番号１及び３は、同一ではない。
【００１３】
アミノ酸配列相同性は、第２の配列からの第１の配列の誘導を示す２種の配列間の相同性の程度として決定され得る。相同性は、適切には、当業界において知られているコンピュータープログラムにより決定され得る。従って、GCGバージョン８（Needleman, S.B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecula Biology, 48, 443-453）に提供されるギャップは、配列の対様一列整列を、及び誤った設定を用いての同一性の程度又は相同性の程度の計算のために使用され得る。ギャップ設定は、次のパラメーターであり得る：5.0のギャップ創造ペナルティー及び0.3のギャップ拡張ペナルティー。
【００１４】
既知のバチルスsp.α−アミラーゼに対する相同性：
既知配列の相同性調査は、上記のようにして決定されたアミノ酸に対して65〜95％の範囲で多くのバチルスアミラーゼと、本発明の配列に関して相同性を示した。
【００１５】
特に、見出されるほとんどの相同α−アミラーゼは、SP690（約87％相同であるアメリカ特許第5,856,164号の配列番号１）、SP722（約87％相同であるアメリカ特許第5,856,164号の配列番号２）、本発明の配列に対して約87％相同であるWO97/00324号の配列番号２として開示されるバチルスsp. KSM-AP1378から得られるα−アミラーゼの成熟部分（アミノ酸31-516）、及び上記のようにして決定された配列番号２及び４に対して約95％相同であるα−アミラーゼ（Tsukamoto など., (1988), Biochem. Biophys. Res Commun. 151, p.25-33に開示される）（図１における一列整列において配列“707amy”として示される）である。
【００１６】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２又は４のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；又はα−アミラーゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成る。配列番号２又は４は、本発明のアルカリα−アミラーゼ成熟部分を示す。
配列番号２又は４のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び/又はカルボキシル末端から欠失される１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００１７】
対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の二者択一の形のいずれかを示す。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然で生じ、そして集団内で多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレントであり得（コードされたポリペプチドにおける変化は存在しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
【００１８】
相同ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失、及び/又は異なったアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換により、配列番号２又は４のアミノ酸配列と異なることができる。好ましくは、アミノ酸変化は、マイナーな性質のもの、すなわちタンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシ−末端−延長、たとえばアミノ−末端のメチオニン残基の延長；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長；又は実効電荷又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変更することにより精製を促進する小さな延長のものである。
【００１９】
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、比活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New York により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly並びにそれらの逆。
【００２０】
第２の態様においては、本発明は、中位の緊縮条件、より好ましくは中−高程度の緊縮条件、さらにより好ましくは高い緊縮条件及び最も好ましくは非常に高い緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１又は３の核酸配列、（ii）配列番号１又は３のcDNA配列、（iii）少なくとも100個のヌクレオチドの（ｉ）又は（ii）の副配列、又は（iV）前記(ｉ)、（ii）又は（iii）の相補的鎖と、同じ条件下でハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする核酸配列によりコードされるα―アミラーゼを有する単離されるポリペプチドに関する（J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniaztus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Znd edition, Cold Spring Harbor, New York）。
【００２１】
配列番号１の副配列は、少なくとも100個のヌクレオチド、又は好ましくは少なくとも200個のヌクレオチドであり得る。さらに、副配列は、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードすることができる。前記ポリペプチドはまた、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体又はそのフラグメントでもあり得る。
配列番号１又は３の核酸配列又はその副配列、及び配列番号２又は４のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界において良く知られている方法に従って、異なった属又は種の株からのα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定し、そしてクローン化するための核酸プローブを企画するために使用され得る。
【００２２】
特に、そのようなプローブは、そこにおける対応する遺伝子を同定し、そして単離するために、標準のサザンブロット方法に従って、興味ある属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短いが、しかし少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、及びより好ましくは少なくとも35個の長さのヌクレオチドであるべきである。より長いプローブもまた使用され得る。DNA及びRNAの両プローブが使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するためにラベルされる（たとえば、³²P, ³H, ³⁵S, ビオチン、又はアビジンにより）。そのようなプローブは、本発明により包含される。
【００２３】
従って、そのような他の生物から調製されたゲノムDNA又はcDNAライブラリーは、上記に記載されるプローブとハイブリダイズし、そしてα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーンされ得る。そのような生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDNA又は分離されたDNAが、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料に移行され、そしてその上に固定され得る。配列番号１又は３と相同であるクローン又はDNA、又はその副配列を同定するためには、キャリヤー材料がサザンブロットに使用される。
【００２４】
本発明のためには、ハイブリダイゼーションは、核酸配列が、中位〜非常に高い緊縮条件下で、配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列、その相補的鎖、又はその副配列に対応するラベルにされた核酸プローブにハイブリダイズすることを示す。核酸プローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出される。
【００２５】
もう1つの好ましい態様においては、核酸プローブは、それぞれ、E.コリDSM12761又はE.コリDSM12764に含まれる、それぞれプラスミドpLiH1274（AA349） 又はpTVB299（AA560）に含まれる核酸配列であり、又はここで前記核酸配列は、本発明のα−アミラーゼを有し、そしてそれぞれ、配列番号２又は４で示されるポリペプチドをコードする。
【００２６】
少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長さの長いプローブに関して、中位〜非常に高い緊縮条件は、標準のサザンブロット方法に従っての、５×SSPE、 0.3%SDS、 200μg/ml の剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び35％ホルムアミド（中位及び中−高緊縮に関して）、又は50％ホルムアミド（高い及び非常に高い緊縮に関して）における42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。
【００２７】
少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長いプローブに関しては、キャリヤー材料は最終的に、２×SSC、 0.2%SDS溶液を用いて、好ましくは少なくとも55℃（中位の緊縮）、好ましくは少なくとも60℃（中位の高い緊縮）、より好ましくは少なくとも65℃（高い緊縮）、及び最も好ましくは少なくとも70℃（非常に高い緊縮）で、それぞれ15分間、３度洗浄される。
【００２８】
約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、緊縮条件は、0.9MのNaCl、0.09Mのトリス−HCl, pH7.6、 ６mM のEDTA、 0.5のNP-40, 1×Denhardt’s溶液、１mMのピロリン酸ナトリウム、１mMの一塩基性リン酸ナトリウム、0.1mMのATP及び0.2mgの酵母RNA（ml当たり）における、Bolton and McCarthy（1962、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390）に従って計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度での標準のサザンブロット方法に従ってのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び後−ハイブリダイゼーション洗浄として定義される。
【００２９】
約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、キャリヤー材料は、６×SSC及び0.1％SDSにより15分間、1度、及び６×SSCを用いて、計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度でそれぞれ15分間、２度、洗浄される。
第３の態様においては、本発明は、単離されたポリペプチド、すなわち次の生理学的性質を有する、配列番号２又は４で示されるポリペプチオドに関する：
Phadebas方法（37℃）を用いて決定されるpH最適性（図２を参照のこと）は、８〜９の範囲のpH、より正確には約8.5のpHであることが見出された。
【００３０】
Phadebas方法（pH9.0）を用いて決定される温度最適性（図３を参照のこと）は、55〜65℃、より正確には、約60℃であることが見出された。
７〜８のpI（例６の表１を参照のこと）は、等電点電気泳動（Pharmacia, Ampholine, pH3.5-9.3）により決定された。
35,000NU/mgの比活性（例６の表１を参照のこと）は、Phadebas方法を用いて、そして６,000NU/mgの比活性は、pNPG7方法を用いて決定された。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、配列番号２又は４の成熟ポリペプチドのα−アミラーゼ活性の少なくとも20％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも60％、さらにより好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、及び最も好ましくは少なくとも100％を有する。
本発明のポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書において使用される場合、核酸配列によりコードされるポリペプチドが前記源により、又はその源からの核酸配列が挿入されている細胞により生成されることを意味する。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、細菌ポリペプチドであり得る。例えば、前記ポリペプチドは、グラム陽性細胞ポリペプチド、例えば、バチルス（bacillus）ポリペプチド、例えばバチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、
【００３３】
バチルス・メガテリウス（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）又はバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）ポリペプチド；又はストレプトミセス（Streptomyces）ポリペプチド、例えばストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）ポリペプチド；又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えばE.コリ（E. coli）又はプソイドモナスsp. (Pseudomonas sp.) ポリペプチドであり得る。
【００３４】
もう1つの好ましい態様においては、ポリペプチドは、バチルスsp. のポリペプチドであり、さらに好ましい態様においては、ポリペプチドは、バチルスsp. DSM12650及びバチルスsp. DSM12651のポリペプチド、例えば、それぞれ配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
前述の種に関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、包含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解するであろう。
【００３５】
それらの種の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcaltures (CBS), 及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)。
【００３６】
さらに、そのようなポリペプチドは、他の源、例えば天然源（例えば、土壌、培養土、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて同定され、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良く知られている。次に、核酸配列は、もう1つの微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。ポリペプチドをコードする核酸配列がプローブにより検出されると、配列は当業者に知られている技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zd Edition, Cold Spring Harbor, New York を参照のこと）。
【００３７】
本明細書において定義される場合、“単離された”ポリペプチドは、SDS−PAGEにより決定される場合、他の非−α―アミラーゼポリペプチドを実質的に有さないポリペプチド、たとえば少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも40％の純度、より好ましくは約60％の純度、さらに好ましくは約80％の純度、最も好ましくは約90％の純度及びさらに最も好ましくは約95％の純度のポリペプチドである。
【００３８】
本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドはまた、もう１つのポリペプチドが前記ポリペプチド又はフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されている、融合された又は切断可能な融合ポリペプチドも包含することができる。融合されたポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、本発明の核酸配列（又はその一部）に融合することによって生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、そしてポリペプチドをコードするコード配列を、それらが整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるよう、連結することを包含する。
【００３９】
用語“改良された洗浄機能”とは、本発明においては、親α−アミラーゼ、例えば突然変異誘発されていない、例えば置換されていないα−アミラーゼ主鎖に比較して、洗浄のために使用される他のα―アミラーゼ、例えばSP690, SP722及びTermamyl（商標）よりも高い、例９に記載される洗浄条件下で決定される性能を意味する。
【００４０】
変異体α−アミラーゼ：
AA560 の変異体の変更された性質：
次に、本発明のAA560又はA349α−アミラーゼに導入され得る突然変異、特に置換及び欠失、及び親α−アミラーゼの性質に関しての所望する性質の変更が論じられる。
【００４１】
発明はまた、配列番号２又は配列番号４に示されるα−アミラーゼの変異体（すなわちα−アミラーゼ変異体）にも関する。本発明の変異体α−アミラーゼは、メチオニンアミノ酸残基の１又は複数の残基が、Cys及びMetを除くいずれかのアミノ酸残基により置換される事実により特徴づけられる。従って、本発明によれば、メチオニンアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は次のものである：Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr及びVal。
【００４２】
本発明の変異体α−アミラーゼの好ましい態様は、メチオニンアミノ酸残基の１又は複数の残基が、Leu, Thr, Ala, Gly, Ser, Ile又はValアミノ酸残基、好ましくはLeu, Thr, Ala又はGlyアミノ酸残基により置換される事実により特徴づけられる。この態様においては、酸化剤の存在下で非常に満足する活性レベル及び安定性が得られる。特に、これは、次の位置での１又は複数のメチオニンが当業界において知られているいずれかの適切な技法、例えば特に、特定部位の突然変異誘発及び遺伝子シャフリングを用いて、置換され、又は欠失され得ることを意味する。配列番号２における企画された位置は次の通りであり：9, 10, 105, 116, 202, 208, 261, 309, 323, 382, 430, 440。
【００４３】
好ましい態様においては、本発明の変異体α−アミラーゼは、位置202でのメチオニンアミノ酸残基が、Cys及びMetを除くアミノ酸残基のいずれか、好ましくはLeu, Thr, Ala, Gly, Ser, Ile又はAspにより置換される事実により特徴づけられる。
他の企画された好ましい突然変異は、アミノ酸R181, G182, D183又はG184, K185, G186の１，２又はそれ以上の残基欠失、又は１又は複数のそれらの残基の置換を包含する。好ましい突然変異は、D183−G184の欠失である。好ましくは適切な突然変異は、Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr及びValによるG186の置換である。特に好ましい置換は、G186Rである。
【００４４】
Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr及びValによるN195の置換がまた企画される。特に興味ある置換は、N195Fである。
上記突然変異の次の組み合わせが包含される：（D183−G184）＋N195Fの欠失、（D183−G184）＋G186Rの欠失、（D183−G184）＋G186R＋N195F及びG186R＋N195Fの欠失。
【００４５】
高められた熱安定性：
特に酸性pH及び/又は低いCa²⁺濃度で高められた熱安定性を有する本発明の変異体をもたらす突然変異は、次の位置での突然変異を包含する（AA560α−アミラーゼ番号付け、すなわち配列番号２を用いての）：R158, N174, G186, N195, N197, H210, E212, V214, V215, E216, K269, N270。
【００４６】
本発明においては、用語“酸性pH”とは、7.0以下のpH、特に産業的な澱粉液化工程が通常行われるpH5.5〜6.2のpH範囲以下を意味する。
本発明においては、用語“低いカルシウム濃度”とは、産業的な澱粉液化に使用される通常レベル以下の濃度を意味する。通常の濃度は、トウモロコシにおける遊離Ca²⁺の濃度に依存して変化する。通常、1mM（40ppm）に対応する用量が添加され、これがトウモロコシにおけるレベルと共に、40〜60ppmの遊離Ca²⁺を付与する。
【００４７】
本発明においては、用語“高い温度”とは、95℃〜160℃の温度、特に産業的な澱粉液化工程が通常行われる、95℃〜105℃の範囲を意味する。
本発明者は、酸性pH及び/又は低いCa²⁺濃度での熱安定性が上記突然変異及び/又はI206を包含する他の突然変異をお互い組合すことによって、さらに高められ得ることを見出した。
前記“他の”突然変異は、次の通りである（AA560α−アミラーゼに関して、配列番号２）：N195, E212, E216, K269及びI206。
前記突然変異はさらに、WO96/23873号に記載されるように、１、好ましくは２又は３、又はそれ以上の位置（すなわち、本明細書における配列番号２の位置R181, G182, D183, G184）において欠失と組合され得る。
【００４８】
本発明によれば、親AA560α−アミラーゼの変異体は、上記の位置の1, 2, 3, 4, 5, 6, 7又はそれ以上の位置における突然変異を包含することができる。
言及されたAA560α−アミラーゼが企画されるのみならず、また下記に定義されるような程度の相同性（同一性）を有するα−アミラーゼも、本発明の範囲内であるよう企画されることが強調されるべきである。
配列番号２における、それぞれN195, I206, E212及びE216に対応する位置でのそれぞれのアミノ酸残基が、多くのTermamyl−様α−アミラーゼ、すなわちTermamyl（商標）(B. リケニホルミスα−アミラーゼ)に保存されるアミノ酸残基を構成することが、本明細書において言及され得る。従って、例えば、AA560及びTermamylにおける残基のその対応する位置が、図１、及び下記第１表及び第２表に整列して見出され得る。
【００４９】
【表４】

【００５０】
【表５】

【００５１】
それらの保存されたアミノ酸残基の突然変異は、性質の変更に関して、非常に重要である。
番号付けのために配列番号２を用いる場合、２，３，４，５，６又は７個の突然変異が本発明に従って性質を変えるために、特に酸性pH及び/又は低いCa²⁺
濃度で熱安定性を高めるために次の位置で行われ得る（本明細書における配列番号２又は４に関して）：
【００５２】
【表６】

【００５３】
３，４，５，６又は７個の突然変異の組み合わせが、本発明に従って企画される。
特定の二重突然変異が本発明に従って行われる（番号付けのために配列番号２又は４を用いての）：
【００５４】
【表７】

【００５５】
【表８】

【００５６】
好ましい態様においては、変異体は、次の突然変異を含んで成る：配列番号２における、又は本明細書に定義されるような96 ％相同のα−アミラーゼにおける対応する位置でのN195F/K264S。もう１つの態様においては、本発明の変異体は、次の突然変異を含んで成る：配列番号２における、又はもう１つの相同α−アミラーゼにおける対応する位置でのR181^★/G182^★/N192F。前記変異体はさらに、位置E216Qでの置換を含んで成る。
【００５７】
pH ８〜 10.5 での AA560 変異体の改良された Ca ²⁺ 安定性：
改良されたCa²⁺安定性は、Ca²⁺消耗下での酵素の安定が改良されていることを意味する。本発明においては、高いpHでの改良されたCa²⁺安定性達成に関しての重要な突然変異（アミノ酸置換及び欠失を包含する）は、上記の“高められた熱安定性”セクションにおいて開示される突然変異及び/又は欠失を包含する。
【００５８】
発明の一般的な突然変異誘発：
本発明の変異体は、上記に概略されるそれらの修飾の他に、１又は複数の修飾を包含することが好ましい。従って、修飾されるα−アミラーゼ変異体の部分に存在する１又は複数のプロリン残基が、天然に存在する可能性ある非プロリン残基のいずれかであり、そして好ましくは、アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、バリン又は、ロイシンである非プロリン残基により置換されることは、好都合である。
【００５９】
同様に、親α−アミラーゼが修飾されているアミノ酸残基間に存在する１又は複数のシステインが、非システイン残基、例えばセリン、アラニン、トレオニン、グリシン、バリン又はロイシンにより置換されることが好ましい。
さらに、本発明の変異体は、唯一の修飾として、又は上記に概略された修飾のいずれかと組合して、修飾され得、その結果、配列番号２のアミノ酸フラグメント190−214に対応するアミノ酸フラグメントに存在する１又は複数のAsp及び/又はGluが、それぞれAsn及び/又はGlnにより置換される。配列番号２のアミノ酸フラグメント190−214に対応するアミノ酸フラグメントに存在する１又は複数のLys残基の、Argによる置換がまた、α−アミラーゼにおいて、興味の対象である。
【００６０】
本発明は、複数の上記概略された修飾を組み込む変異体を包含することが理解されるであろう。
さらに、本明細書に記載あれる変異体のいずれかに点突然変異を導入することが、好都合である。
本発明の突然変異は適切には、次の位置での突然変異を包含することができる：Y135, L17, M202, V214。
【００６１】
α−アミラーゼをコードする DNA 配列のクローニング：
上記で定義されるような親α−アミラーゼをコードするDNA配列は、当業界において良く知られている種々の方法を用いて、問題のα−アミラーゼを生成するいずれかの細胞又は微生物から単離され得る。最初に、ゲノムDNA及び/又はcDNAライブラリーが、研究されるα−アミラーゼを生成する生物から、染色体DNA又はmRNAを用いて構成されるべきである。
【００６２】
次に、α−アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、ラベルされた相同オリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして問題の生物から調製されるゲノムライブラリーからα−アミラーゼコードのクローンを同定するために使用され得る。他方では、既知α−アミラーゼ遺伝子に相同の配列を含む、ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブは、低い緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、α−アミラーゼコードのクローンを同定するためにプローブとして使用され得る。
【００６３】
α−アミラーゼコードのクローンを同定するためのさらにもう1つの方法は、発現ベクター、例えばプラスミド中にゲノムDNAのフラグメントを導入し、得られるゲノムDNAによりα−アミラーゼ陰性細胞を形質転換し、そして次に、α−アミラーゼのための基質を含む寒天上に前記形質転換された細菌にプレートし、それにより、α−アミラーゼを発現するクローンの同定を可能にすることを包含する。
【００６４】
他方では、酵素をコードするDNA配列は、確立された標準の方法、例えばS.L.Beaucage and M.H. Caruthers (1981) により記載されるホスホロアミジット方法、又はMatthesなど. (1984) により記載される方法により、合成的に調製され得る。ホスホロアミジット方法においては、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターによりクローン化される。
【００６５】
最後に、DNA配列は、標準の技法に従って、合成、ゲノム又はcDNA起源のフラグメント（適切には、完全なDNA配列の種々の部分に対応するフラグメント）を連結することによって調製される、混合されたゲノム及び合成起源、混合された合成及びcDNA起源、又は混合されたゲノム及びcDNA起源のものであり得る。DNA配列はまた、例えばアメリカ特許第4,683,202号又はR. K. Saiki など. (1988) に記載されるように、特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により調製され得る。
【００６６】
特定部位の突然変異誘発：
α−アミラーゼをコードするDNA配列が単離され、そして突然変異のための所望する部位が同定されると、突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。それらのオリゴヌクレオチドは、所望する突然変異部位を端に有するヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成の間に挿入される。特定の方法においては、DNAの一本鎖ギャップ、すなわちα−アミラーゼ−コード配列がα−アミラーゼ遺伝子を担持するベクターにより創造される。
【００６７】
次に、所望する突然変異を担持する合成ヌクレオチドが、一本鎖DNAの相同部分に対してアニーリングされる。次に残りのギャップがDNAポリメラーゼI（クレノウフラグメント）によりフィルインされ、そしてその構造体がT４リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例は、Morinagaなど., (1984)に記載されている。アメリカ特許第4,760,025号は、カセットのマイナーな変更を行うことによって、複数の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種々の長さの多くのオリゴヌクレオチドが導入され得るので、さらに多くの種類の突然変異がMorinagaの方法により一度に導入され得る。
【００６８】
α−アミラーゼをコードするDNA配列中に突然変異を導入するためのもう１つの方法は、Nelson and Long (1989)に記載されている。それは、PCR反応におけるプライマーの1つとして化学的に合成されたRNAを用いることによって導入される所望の突然変異を含むPCRフラグメントの３−段階生成を包含する。PCR−生成されたフラグメントから、突然変異を担持するDNAフラグメントが、制限エンドヌクレアーゼによる分解により単離され、そして発現プラスミド中に再挿入され得る。
【００６９】
ランダム突然変異誘発：
ランダム突然変異誘発は、問題の示されるアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも３つの部分において、又は完全な遺伝子内で、局在化された又は領域−特異的ランダム突然変異誘発として適切に行われる。
親α−アミラーゼをコードするDNA配列のランダム突然変異誘発は便利には、当業界において知られているいずれかの方法の使用により行われ得る。
【００７０】
上記に関連して、本発明のさらなる観点は、親に関して変更され、又は高められたされた熱安定性を示す、親α−アミラーゼの変異体を生成するための方法に関し、ここで前記方法は、
（ａ）親α−アミラーゼをコードするDNA配列をランダム突然変異誘発にゆだね、
（ｂ）段階（ａ）において得られた、突然変異誘発されたDNA配列を宿主細胞において発現し、そして
（ｃ）親α−アミラーゼに関して変更された性質（例えば、熱安定性）を有するα−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスクリーンすることを含んで成る。
【００７１】
上記本発明の方法の段階（ａ）は好ましくは、ドーピングされたプライマーを用いて行われる。
例えば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はPCR生成される突然変異誘発にDNA配列をゆだねることによって行われ得る。さらに、ランダム突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により行われ得る。突然変異誘発剤は、例えば、トランジッション、トランスバージョン、逆位、スクランブリング、欠失及び/又は挿入を誘発する剤であり得る。
【００７２】
本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発が生じるための適切な条件下で、選択の突然変異誘発剤の存在下で、突然変異誘発される親酵素をコードするDNA配列をインキュベートし、そして所望する性質を有する突然変異誘発されたDNAをスクリーニングすることによって行われる。
【００７３】
突然変異誘発オリゴヌクレオチドの使用により行われる場合、オリゴヌクレオチドは、変更される位置で、オリゴヌクレオチドの合成の間、３種の非親ヌクレオチドによりドーピングされるか、又はスパイキングされる。そのドーピング又はスパイキングは、所望しないアミノ酸のためのコドンが回避されるように行われ得る。そのドーピングされ又はスパイキングされたオリゴヌクレオチドは、例えばPCR、LCR又は適切であると思われるいずれかのDNAポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、いずれかの公開された技法によりα−アミラーゼ酵素をコードするDNA中に組み込まれ得る。
【００７４】
好ましくは、ドーピングは、個々の位置における野生型及び突然変異の百分率があらかじめ定められている“一定のランダムドーピング”を用いて行われる。さらに、ドーピングは、一定のヌクレオチドの導入のための選択に向けられ、そしてそれにより、１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入のための選択に向けられる。ドーピングは、例えば個々の位置における90％野生型及び10％突然変異の導入を可能にするために行われ得る。ドーピングスキームの選択におけるさらなる考慮は、遺伝子及びタンパク質−構造強制に基づかれる。ドーピングスキームは、中でも、停止コドンの導入が回避されることを確保するDOPEプログラム（“Material and Methods”セクションを参照のこと）を用いて行われ得る。
【００７５】
PCR−生成される突然変異誘発が使用される場合、親α−アミラーゼをコードする、化学的に処理されているか又は処理されていない遺伝子が、ヌクレオチドの誤った組み込みを高める条件下でPCRにゆだねられる（Deshler 1992; Leung など., Technique, Vol. 1, 1989, pp.11-15）。
E.コリのミューテーター株（Fowlerなど., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp.179-191）、S. セレビシアエ又はいずれかの他の微生物が、例えば親グリコシダーゼを含むプラスミドを用いて、ミューテーター株を形質転換し、前記プラスミドを有するミューテーター株を増殖し、そしてそのミューテーター株から突然変異誘発されたプラスミドを単離することによって、前記α−アミラーゼをコードするDNAのランダム突然変異誘発のために使用され得る。突然変異誘発されたプラスミドは、続いて、発現生物を形質転換するために使用され得る。
【００７６】
突然変異誘発されるDNA配列は便利には、親α−アミラーゼを発現する生物から調製されるゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。他方では、DNA配列は、突然変異誘発剤と共にインキュベートされるか又は他方では、その剤に暴露され得る適切なベクター、例えばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在することができる。突然変異誘発されるDNAはまた、前記細胞のゲノム中に組み込まれることによって、又は細胞に含まれるベクター上に存在することによって、宿主細胞にも存在することができる。最終的に、突然変異誘発されるDNAは、単離された形で存在することができる。ランダム突然変異にゆだねられるDNA配列は好ましくは、cDNA又はゲノムDNA配列であることが理解されるであろう。
【００７７】
いくつかの場合、発現段階ｂ）又はスクリーニング段階c）を行う前、突然変異誘発されたDNA配列を増幅することが便利である。そのような増幅は、当業界において知られる方法に従って行われ得、現在好まし方法は、親酵素のDNA又はアミノ酸配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのPCR−生成される増幅である。
【００７８】
突然変異誘発剤とのインキュベーション又はその剤への暴露に続いて、突然変異誘発されたDNAは、発現の発生を可能にする条件下で、DNA配列を担持する適切な宿主細胞を培養することによって発現される。このために使用される宿主細胞は、任意にはベクター上に存在する、突然変異誘発されたDNA配列により形質転換されている細胞、又は突然変異誘発処理の間、親酵素をコードするDNA配列を担持された細胞であり得る。
【００７９】
適切な宿主細胞の例は、次のものである：グラム陽性細菌、例えばバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus lichemiformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、
【００８０】
バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）、ストレプトミセス・リビタンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）；及びグラム陰性細菌、例えばE.コリ。
さらに、突然変異誘発されたDNA配列は、突然変異誘発されたDNA配列の発現を可能にする機能をコードするDNA配列を含んで成ることができる。
【００８１】
局在化されたランダム突然変異誘発：
ランダム突然変異誘発は、問題の親α−アミラーゼの部分に都合良く局在化され得る。これは、例えば、酵素の一定領域が酵素の所定の性質のために特に重要なものであることが同定されている場合、及び修飾が改良された性質を有する変異体をもたらすことが予測される場合、好都合であり得る。そのような領域は通常、親酵素の三次構造が解明され、そして酵素の機能と関連ずけられている場合に同定され得る。
【００８２】
局在化された又は領域特異的なランダム突然変異誘発は便利には、上記に論じられるようなPCR生成された突然変異誘発技法、又は当業界において知られている他のいずれかの適切な技法の使用により行われる。他方では、修飾されるDNA配列の一部分をコードするDNA配列が、例えば適切なベクター中への挿入により単離され、そして前記一部分は続いて、上記に論じられるいずれかの突然変異誘発方法の使用により突然変異誘発にゆだねられ得る。
【００８３】
α−アミラーゼ変異体を提供するための他の方法：
本発明の変異体を提供するための他の方法は、たとえばWO95/22625（Affymax Technologies N.V. からの）及びWO96/00343（Novo Nordisk A/S からの）に記載される方法を包含する、当業界において知られている遺伝子シャフリング方法（gene shuffling method）を包含する。
【００８４】
α−アミラーゼ変異体の発現：
本発明によれば、上記方法、又は当業界において知られているいずれか他の方法により生成される変異体をコードするDNA配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を含む。
【００８５】
本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列を担持する組換え発現ベクターは、便利には、組換えDNA方法にゆだねられ得るいずれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわち複製が染色体複製に無関係である染色体外存在物として存在するベクター、たとえばプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外要素、ミニクロモソーム又は人口染色体であり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【００８６】
ベクターにおいては、DNA配列は適切なプロモーター配列に操作可能的に結合されるべきである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいずれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は非相同であるタンパク質コードの遺伝子に由来することができる。本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列の転写を、特に細菌宿主において方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリのlac オペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子dagA プロモーター、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラス マルトジェン性アミラーゼ遺伝子のプロモーター（amyM）、バチルス・アミロリクエファシエンスα−アミラーゼのプロモーター（amyQ）、バチルス・スブチリスxylA 及びxylB 遺伝子のプロモータ、等である。
【００８７】
菌類宿主における転写に関して、有用なプロモーターの例は、A.オリザエTAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニガー中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸性安定性α−アミラーゼ、A.ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A.オリザエアルカリプロテアーゼ、A.オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、又はA.ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。
【００８８】
本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、及び真核生物においては、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列に操作可能的に連結されるポリアデニル化配列を含んで成ることができる。終結及びポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ源に適切には由来することができる。
ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成ることができる。そのような配列の例は、プラスミドpUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, 及びpIJ702 の複製の起点である。
【００８９】
ベクター又は、選択マーカー、たとえば1つの遺伝子（ここでその生物が宿主細胞における欠陥を補充する）、たとえばB.スブチリス又はB.リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテロラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含んで成ることができる。さらに、ベクターは、アスペルギラス選択マーカー、たとえばamdS, argB, niaD及びsC、ヒグロマイシン耐性を生ぜしめるマーカーを含んで成ることができ、又はその選択はたとえばWO91/17243に記載のようにして同時−形質転換により達成され得る。
【００９０】
細胞内発現は、いくつかの観点においては、たとえば宿主細胞として一定の細菌を用いる場合、好都合であるが、一般的に発現は細胞外であることが好ましい。一般的に、本明細書において言及されるバチルスα−アミラーゼは、培養物培地中への発現されたプロテアーゼの分泌を可能にするプレ領域を含んで成る。所望する場合、このプレ領域は、異なったプレ領域又はシグナル配列により置換され得、便利には、それぞれのプレ領域をコードするDNA配列の置換により達成される。
【００９１】
それぞれ、α−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素をコードする本発明のDNA構造体を連結し、そしてそれらを、複製のために必要な情報を含む適切なベクター中に挿入するため使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrook など., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 を参照のこと）。
【００９２】
上記で定義されたような本発明のDNA構造体又は発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は、好都合には、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え生成において宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主染色体にDNA構造体（１または複数のコピーにおける）を組み込むことによって、変異体をコードする本発明のDNA構造体により形質置換され得る。この組み込みは一般的には、DNA配列が細胞において安定して維持されるので、好都合であると思われる。宿主染色体中へのDNA構造体の組み込むは、従来の方法、たとえば相同又は非相同組換えにより行われ得る。他方では、細胞は、異なった型の宿主細胞に関して上記に記載されるようにして、発現ベクターにより形質転換され得る。
【００９３】
本発明の細胞は、高等生物、たとえば哺乳類又は昆虫の細胞であり得るが、しかし好ましくは、微生物細胞、たとえば細菌又は菌類（酵母を包含する）細胞である。
適切な細胞の例は、グラム陽性細菌、たとえばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・プレビス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラクタス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンギエンシス、ストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナス;及びグラム陰性細胞、たとえばE.コリである。細菌の形質転換は、原形質形質転換により、又はそれ自体知られている態様でコンピテント細胞を用いることによってもたらされ得る。
【００９４】
酵母生物は、好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces）又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）の種、たとえばサッカロミセス・セレビシアエから選択される。糸状菌は好都合には、アスペルギラスの種、たとえばアスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーに属することができる。菌類細胞は、プロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、続いて、それ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238,023号に記載されている。
【００９５】
さらにもう1つの観点においては、本発明は本発明のα−アミラーゼ変異体を生成するための方法に関し、ここで前記方法は、上記のような宿主細胞を、変異体の生成の助けとなる条件下で培養し、そして細胞及び/又は培養培地から変異体を回収することを含んでなる。
細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖し、そして本発明のα−アミラーゼ変異体の発現を得るために適切ないずれかの従来の培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開されたレセピーに従って調製され得る（たとえば、American Type Culture Collection のカタログに記載のようにして）。
【００９６】
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は便利には、良く知られている方法、たとえば遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、そして培地中のタンパク質成分を、塩、たとえば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、続いてクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものを使用することによる方法により、培養物培地から回収され得る。
【００９７】
核酸配列：
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列にも関する。好ましい態様においては、核酸配列は、配列番号１又は３で示される。もう1つの好ましい態様においては、核酸配列は、それぞれE.コリ DSM12761及びE.コリ DSM12764に含まれるプラスミドpLiH1274又はプラスミドpTVB299に含まれる配列である。もう１つの好ましい態様においては、核酸配列は、配列番号１又は３の成熟ポリペプチドコード領域である。本発明はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号１又は３とは異なる、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。本発明はまた、α−アミラーゼ活性を有する、それぞれ配列番号２又は４のフラグメントをコードする配列番号１又は３の副配列にも関する。
【００９８】
配列番号１又は３の副配列は、配列番号１又は３により包含される核酸配列であるが、但し5’及び/又は3’側末端からの１又は複数のヌクレオチドが欠失されている。
本発明はまた、配列番号１又は３の成熟ポリペプチドコード配列に少なくとも1つの突然変異を含んで成る変異体核酸配列にも関し、ここで前記変異体核酸配列は配列番号２又は４のアミノ酸１〜485から成るポリペプチドをコードする。
【００９９】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反応（PCR）、又は共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることによってもたらされ得る。例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application; Academic Press, New York を参照のこと。他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ鎖反応（LCR）、連結された活性化転写（LAT）及び核酸配列に基づく増幅（NASBA）が使用され得る。核酸配列は、フサリウム株、又は他の又は関連する生物からクローン化され得、そして従って、核酸配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝子又は種変異体であり得る。
【０１００】
用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、アガロース電気泳動により決定される場合、他の核酸配列を実質的に有さず、たとえば少なくとも約20％純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは少なくとも約60％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約80％の純度、及び最も好ましくは少なくとも約90％の純度である核酸配列を言及する。
【０１０１】
たとえば、単離された核酸配列は、それが再生されるであろう異なった部位にその天然の位置から核酸配列を再配置するために遺伝子工学に使用される標準のクローニング方法により得られる。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望する核酸フラグメントの切除及び単離、ベクター分子中へのフラグメントの挿入、及び核酸配列の複数コピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への組換えベクターの組み込みを包含する。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成、合成起源、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【０１０２】
酵素をコードするDNA配列の相同性：
本発明はまた、活性ポリペプチドをコードする、配列番号１（すなわち、ヌクレオチド１〜1458）又は配列番号３（すなわち、ヌクレオチド１〜1458）の成熟ポリペプチドコード配列に対して、DNAレベルに基づいて、少なくとも約96％、好ましくは約97％、好ましくは少なくとも約98％、より好ましくは少なくとも約99％の相同生の程度を有する核酸配列にも関する。
【０１０３】
DNA配列相同性は、第２の配列からの第１の配列の誘導を示す２種の配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、適切には、当業界において知られているコンピュータープログラム、例えばGCGプログラムパッケージ（上記）に提供されるギャップ（GAP）により決定され得る。従って、GCG GCGv８は、次のデフォールトパラメーターと共に使用される：5.0のギャップ創造ペナルティー、及び0.3のギャップ拡張ペナルティー、デフォールト評点マトリックス。ギャップは、一列整列を創造するために、Needleman/Wunsch/Sellersの方法を使用する。
【０１０４】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、そのポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。用語、ポリペプチドに“実質的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を言及する。それらのポリペプチドは、その天然源から単離されたポリペプチドとは、いくつかの構築された態様で異なり、たとえば非活性、熱安定性、pH最適性又は同様のものにおいて異なる変異体であり得る。
【０１０５】
変異体配列は、配列番号１又は３のポリペプチドコード部分として提供される核酸配列、たとえばその副配列に基づいて、及び/又は核酸配列によりコードされるポリペプチドのもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的記載のためには、Fordなど., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107を参照のこと。
【０１０６】
そのような置換は、分子の機能に対して決定的である領域外で行われ、そしてさらに活性ポリペプチドをもたらすことは、当業者に明らかであろう。本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、そして従って、好ましくは置換を受けやすくないアミノ酸残基は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（たとえば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照のこと）。
【０１０７】
後者の技法においては、突然変異は分子における正に荷電された残基ごとに導入され、そしてその得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するためにα−アミラーゼ活性について試験される。基質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、クリスタログラフィー又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、立体構造体の分析により決定され得る（たとえば、de Vos など., 1992, Science 255: 306-312; Smith など., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver など., 1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照のこと）。
【０１０８】
本発明はまた、配列番号１又は３の核酸配列又はその相補的鎖；又はその対立遺伝子及び副配列と同じ条件下でハイブリダイズする核酸プローブと、中位の緊縮条件、好ましくは中位の高い緊縮条件、より好ましくは高い緊縮条件、及び最も好ましくは非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズする本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列にも関する。（Sambrook など., 1989, 前記）。
【０１０９】
本発明はまた、（a）中位の、中位の高い、高い又は非常に高い緊縮条件下で、配列番号１又は３の配列、又はそれらの相補的鎖、又はその副配列によりDNAをハイブリダイズせしめ；そして（b）核酸配列を単離することによって生成される、単離された核酸配列にも関する。副配列は好ましくは、少なくとも100個のヌクレオチドの配列、たとえばα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列である。
【０１１０】
変異体核酸配列を生成するための方法：
本発明はさらに、配列番号１又は３の成熟ポリペプチドコード配列又はその副配列中に少なくとも1つの突然変異を導入することを含んで成る。変異体核酸配列を生成するための方法に関し、ここで前記変異体核酸配列は、α−アミラーゼ活性を有する、配列番号２又は４のアミノ酸１−485又はそのフラグメントから成るポリペプチドをコードする。
【０１１１】
１つのヌクレオチドをもう1つのヌクレオチドにより交換するためへの核酸配列中への突然変異の導入は、当業界において知られているいずれかの方法を用いて、特定部位の突然変異誘発により達成され得る。興味ある挿入体を有する、超らせん二本鎖DNAベクター及び所望する突然変異を含む２種の合成プライマーを用いる方法が特に有用である。ベクターの反対鎖に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Pfu DNAポリメラーゼによる温度サイクリングの間、延長する。
【０１１２】
プライマーの組み込みに基づいて、付着されたニッケルを含む突然変異誘発されたプラスミドが生成される。温度サイクリングに続いて、生成物は、親DNA鋳型を消化し、そして突然変異−含有の合成されたDNAについて選択するために、メチル化され、そしてヘミメチル化されたDNAに対して特異的であるDpnIにより処理される。当業界において知られている他の方法もまた使用され得る。それらの他の方法は、たとえばWO95/22625（Affymax Technologies N.V. からの）及びWO96/00343（Novo Nordisk A/S からの）に記載されるように、遺伝子シャフリング方法を包含する。
【０１１３】
核酸構造体：
本発明はまた、適切な宿主細胞においてコード配列の発現を方向づける１又は複数の制御配列に操作可能的に連結される本発明の核酸配列を、制御配列と適合できる条件下で含んで成る核酸構造体にも関する。発現は、ポリペプチドの生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌（但し、それらだけには限定されない）を、包含することが理解される方法。
【０１１４】
“核酸構造体”とは、本明細書においては、天然に存在する遺伝子から単離され、又は他方では、天然に存在しない態様で組み合わされ、そして並置される、核酸のセグメントを含むように修飾されている、一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義される。用語“核酸構造体”とは、核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味である。
【０１１５】
用語“コード配列”とは、本明細書において定義される場合、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に特定する核酸配列として定義される。そのコード配列の境界は、一般的に、リボソーム結合部位(原核生物)により、又はmRNAの5’末端で読み取り枠のすぐ上流に位置するATG開始コドン、及びmRNAの3’末端で読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、DNA、cDNA 及び組み合わせ核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１６】
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中へのその挿入の前、核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要とされる。組換えDNA方法を用いて核酸配列を修飾するための技法は、当業界において良く知られている。
【０１１７】
用語“制御配列”とは、本発明のポリペプチドの発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来であっても又は外来性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１８】
最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。用語“操作可能的に連結される”とは、本明細書においては、制御配列が、それがポリペプチドの生成を方向づけるよう、DNA配列のコード配列に対する位置に適切に配置される形状として定義される。
【０１１９】
プロモーター配列：
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列、たとえば変異体の、切断された、及びハイブリッドのプロモーターであり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【０１２０】
特に細胞宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリlacオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）Lバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、Bチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（amyM）、
【０１２１】
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliguefaciens） α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バチルス・サブチリスxylA及びzylB遺伝子及び原生動物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（Villa−Kamaroffなど., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731）、及びtac プロモーター（De Boer など., 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 21-25）である。さらなるプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242: 74-94; 及びSambrookなど., 1989, 前記に記載される。
【０１２２】
ターミネーター配列：
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’側末端に操作可能的に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが本発明において使用され得る。
【０１２３】
シグナル配列：
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そしてそのコードされたポリペプチドを細胞の分泌路中に方向づけるシグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’側末端は、本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。他方では、コード配列の5’側末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。
【０１２４】
そのコード配列が天然において、シグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。しかしながら、分泌路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。
【０１２５】
細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、バチルスNCIB11837マルトゲン性アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ、バチルス・リケニホルミススブチリシン、バチルス・リケニホルミスβ−ラクタマーゼ、バチルス・アステロサーモフィラス中性プロテアーゼ（nprT, nprS, nprM）、及びバチルス・スブチリスprsAについての遺伝子から得られるシグナルペプチド領域である。追加のシグナルペプチドは、Sinomen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137 により記載される。
【０１２６】
調節システム：
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすそれらのシステムである。原核生物系における調節システムは、lac, tac及びtrpオペレーターシステムお包含する。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが使用され得る。
【０１２７】
糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギラス・オリザエグルコアミラーゼプロモーターが、調節配列として使用さえ得る。調節配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にするそれらの配列である。真核システムにおいては、それらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列が、調節配列により操作可能的に連結される。
【０１２８】
発現ベクター：
本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配列は、１又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核酸配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により操作可能的に連結される。
【０１２９】
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そして核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（たとえば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。
【０１３０】
ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。ベクターは自己複製を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲノム中に導入される全DNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドが使用され得る。
【０１３１】
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。細菌選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス又はバチルス・リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3である。
【０１３２】
糸状菌宿主細胞に使用するための選択マーカーは、次の群から選択されるが、但しそれらだけには限定されない；amdS (アセトアミダーゼ)、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD (硝酸レダクターゼ)、pyrG (オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ) 及びtrpC (アントラニル酸シンターゼ)、並びにそれらの同等物。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子が、アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。
【０１３３】
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリペプチド、又はいずれか他の要素をコードする核酸配列に依存する。他方では、ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。
【０１３４】
正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最も好ましくは800〜1,500個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０１３５】
自律複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてのベクターの自律的な複製を可能にする複製の起点を含んで成る。複製の細菌起点の例は、E.コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322, pUC19, pACYC177及びpACYC184, 及びバチルスにおける複製を可能にするpUB110, pE194, pTA1060及びpAMβ１の複製の起点である。酵母宿主細胞への使用のための複製の起点の例は、複製の２ミクロン起点、すなわちARS1, ARS4, ARS1及びCEN3の組み合わせ、及びARS4及びCEN6の組み合わせである。複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する起点である（例えば、Ehrlich, 1978, Procedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433を参照のこと）。
【０１３６】
本発明の核酸配列の１以上のコピーが、遺伝子生成物の生成を高めるために宿主細胞中に挿入され得る。核酸配列のコピー数の上昇は、宿主細胞ゲノム中に配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、又は核酸配列と共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ、ここで細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、そしてそれにより、核酸配列の追加のコピーが、適切な選択剤の存在下で前記細胞を培養することによって選択され得る。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと）。
【０１３７】
宿主細胞：
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主にも関する。本発明の核酸配列を含んでなるベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
【０１３８】
有用な単細胞は、細菌細胞、たとえば次のグラム陽性細菌バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウシ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシス、又はストレプトミセス細胞、たとえばストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナス、又は次のグラム陰性細菌：E.コリ及びプソイドモナスsp.（但し、それらだけには限定されない）である。好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・サブチリス細胞である。もう１つの好ましい態様においては、バチルス細胞は、好アルカリ性バチルスである。
【０１３９】
細菌宿主細胞中へのベクターの導入はたとえば、コンピテント細胞（たとえば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 を参照のこと）を用いてプロトプラスト形質転換（たとえば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115）、エレクトロポレーション（たとえば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のこと）又は接合（たとえば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照のこと）によりもたらされ得る。
【０１４０】
生成方法：
本発明はまた、（a）ポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために、その野生型において、ポリペプチドを生成できる菌株を培養し；そして（b）ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。好ましくは、前記菌株は、バチルス sp.属である。
本発明はまた、（a）ポリペプチドの生成を助ける条件下で宿主細胞を培養し；そして（b）ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０１４１】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で宿主細胞を培養し、ここで前記宿主細胞は配列番号１又は３の成熟ポリペプチドコード領域に少なくとも１つの突然変異を有する変異体核酸配列を含んで成り、そして前記変異体核酸配列は配列番号２又は４のアミノ酸１〜485から成るポリペプチドをコードし；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドの生成方法にも関する。
【０１４２】
組成物：
さらなる観点においては、本発明は、本発明のα−アミラーゼ又はその変異体を含んで成る組成物に関する。好ましくは、組成物は、本発明のα−アミラーゼ又はその変異体において富化される。本発明において、用語“富化された”とは、組成物中のα−アミラーゼ活性が、例えば1.1の富化因子により高められたことを示す。
【０１４３】
前記組成物は、主用酵素成分、たとえば一成分組成として、本発明のポリペプチドを含んで成る。他方では、組成物は、複数の酵素活性、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リバーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼペクチン分解酵素、
【０１４４】
ペプチドブルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを含むことができる。追加の酵素は、アスペルギラス属、好ましくは、アスペルギラス・アキュレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はトリコダーマ、ヒューミコラ、好ましくはヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、又はフサリウム、好ましくは、フサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、
【０１４５】
フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearium）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusariumu roseum）、
【０１４６】
フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium torulosaum）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）又はフサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）に属する微生物により生成できる。
【０１４７】
ポリペプチド組成物は、当業界において知られている方法に従って調製され、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、粒質又は微小粒質の形で存在することができる。組成物に含まれるポリペプチドは、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
本発明のポリペプチド組成物の好ましい用途の例が、下記に付与される。本発明のポリペプチド組成物の用量及び前記組成物が使用される他の条件は、当業界において知られている方法に基づいて決定され得る。
【０１４８】
産業上の用途：
アルカリpH値でのそれらの活性のために、本発明のα−アミラーゼは、種々の産業工程への使用のために適切であり、特に前記酵素は、洗剤、例えば洗濯、皿洗い及び硬質表面清浄洗剤組成物における成分としての可能性ある用途を有すると共に、それはまた、織物、布及び衣料品の糊抜き、ビール製造又は醸造、パルプ及び紙製造、及びさらに、澱粉又は完全な穀物からの、甘味剤及びエタノール、例えば燃料、飲料及び産業用エタノール製造のために有用である。
【０１４９】
澱粉転換：
従来の澱粉転換工程、例えば液化及び糖化工程は、例えばアメリカ特許第3,912,590号及びヨーロッパ特許公開第252,730号及び第63,909号（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１５０】
パルプ及び紙製造：
本発明のアルカリα−アミラーゼはまた、澱粉教化された故紙及び厚紙からのリグノセルロース材料、例えばパルプ、紙及び厚紙の製造にも使用され、特にここで再パルプ化が７以上のpHで生じ、そしてアミラーゼが前記強化澱粉の分解を通して廃棄材料の砕解を促進することができる。本発明のα−アミラーゼは、澱粉−被覆された印刷紙から紙製造パルプを製造する工程において特に有用である。
【０１５１】
それらの工程は、次の段階：
ａ）パルプを製造するために紙を砕解し、
ｂ）段階ａ）の前、その間又はその後、澱粉−分解酵素により処理し、そして
ｃ）段階ａ）及びｂ）の後、パルプからインキ粒子を分解することを含んで成る、WO95/14807号に記載のようにして行われ得る。
【０１５２】
本発明のα−アミラーゼはまた、澱粉の変性において非常に有用であり、ここで酵素的に変性された澱粉が、アルカリ充填剤、例えば炭酸カルシウム、カオリン及びクレーと共に、紙製造に使用される。本発明ののアルカリα−アミラーゼにより、前記充填剤の存在下で澱粉を変性することが可能になり、従って、より単純な統合された工程を可能にする。
【０１５３】
織物、布及び衣料品の糊抜き：
本発明のα−アミラーゼはまた、織物、布又は衣類の糊抜きにおいて非常に有用である。織物加工産業においては、α−アミラーゼは、製織の間、よこ糸上で保護被膜として作用する澱粉−含有糊剤の除去を促進するための糊抜き工程においても助剤として従来使用されて来た。製織の後、糊剤被膜の完全な除去は、布が精練され、漂白され、そして染色される続く工程において最適な結果を確保するのに重要である。酵素による澱粉の分解は、それが、繊維材料に対していずれの有害な効果も包含しないので好ましい。
【０１５４】
加工費用を減じ、そしてミル処理を高めるために、糊抜き加工は時々、精練及漂白段階と組合される。そのような場合、非酵素助剤、例えばアルカリ又は酸化剤が、従来のα−アミラーゼは高いpHレベル及び漂白剤とほとんど適合できないので、スターチを分解するために、典型的には使用される。澱粉糊剤の非酵素分解は、かなりの攻撃的な科学物質が使用されるので、いくらかの繊維損傷を導く。従って、本発明のα−アミラーゼはアルカリ溶液において改良された性能を有するので、それらを使用することが所望される。α−アミラーゼは、セルロース含有布又は織物を糊抜きする場合、単独でセルロースと組合して使用され得る。
【０１５５】
糊抜き及び漂白工程は、当業界において良く知られている。例えば、そのような工程は、WO95/21247号、アメリカ特許第4,643,736号、ヨーロッパ特許第119,920号（それらは引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
糊抜きのための市販の製品は、Novo Hordisk A/SからのAquazyme（商標）及びAquazyme（商標）Ultraを包含する。
ビール醸造：
本発明のα−アミラーゼはまた、ビール醸造工程において非常に有用であり；前記α−アミラーゼは典型的には、マッシュ工程の間に添加されるであろう。
【０１５６】
洗剤組成物：
本発明の酵素は洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
【０１５７】
特定の観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る洗剤添加剤を提供する。前記洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カーボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ及び/又はポロキシダーゼを含んで成ることができる。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり（すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性）、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
【０１５８】
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に修飾された、又はタンパク質構築された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO89/06279号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270号及びWO94/25583号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。
【０１５９】
有用なプロテアーゼの例は、WO92/19729号、WO98/20115号、WO98/20116号及びWO98/34946号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：27, 35, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235及び274。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Alcalase^TM, Savinase^TM, Primase^TM, Duralase^TM, Esperase^TM及びKannase^TM (Novo Nordisk A/S), Maxatase^TM, Maxacal^TM, Maxapem^TM, Properase^TM, Purafect^TM, Purafect OxP^TM, FN2^TM及びFN3^TM (Genencor International Inc.) を包含する。
【０１６０】
リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ（別名、サーモミセス）、例えばヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載のようなヒューミコラ・ラウギノサ（T.ラウギノサ）、又はWO96/13580号に記載のようなヒューミコラ・インソレンス、P.アルカリゲネス又はP.プソイドアルカリゲネス（ヨーロッパ特許第218272号）、P.セパシア（ヨーロッパ特許第331376号）、P.スツゼリ（P.stutzeri）(イギリス特許第1,372,034号)、P.フルオレセンス、プソイドモナスsp. SD705株（WO75/06720号及びWO96/27002号）、P.ウイスコンシネンシス（WO96/12012号）からのリパーゼ、バチルスリーパーゼ、例えばB.スブチリス（Dartoisなど. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、B. ステアロサーモフィラス（日本特許64/744992）又はB.プミラス（WO91/16422号）からのリーパーゼを包含する。
【０１６１】
他の例は、リパーゼ変異体、例えばWO92/05249号、WO94/01541号、ヨーロッパ特許第407225号、ヨーロッパ特許第206105号、WO95/35381号、WO96/00292号、WO95/30744号、WO94/25576号、WO95/14783号、WO95/22615号、WO97/04079号及びWO97/0720号に記載されるものを包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、Lipolase^TM 及びLipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
【０１６２】
アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α−及び/又はβ）は、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。アミラーゼは、バチルス、例えばイギリス特許第1,296,839号により詳細に記載される、B.リケニルホルミスの特許株から得られるα−アミラーゼを包含する。有用なアミラーゼの例は、WO94/02597号、WO94/18314号、WO96/23873号及びWO/43424号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408及び444。
市販のアミラーゼは、Duramyl^TM, Termamayl^TM, Fungamyl^TM 及びBAM^TM (Novo Nordisk A/S), Rapidase^TM 及びPurastar^TM (Genencor International Inc.)である。
【０１６３】
セルラーゼ：適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、バチルス、ヒューミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属からのセルラーゼ、例えばアメリカ特許第4,435,307号、アメリカ特許第5,648,263号、アメリカ特許第5,691,178号、アメリカ特許第5,776,757号及びWO89/09259号に開示されるヒューミコラ・インソレンス、マイセリオプソラ・サーモフィラ/オキシスポラムから生成される菌類セルラーゼを包含する。
【０１６４】
特に適切なセルラーゼは、色彩保護有益性を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許第0495257号、ヨーロッパ特許第0531372号、WO96/11262号、WO96/29397号、WO98/08940号に記載されるセルラーゼである。例の例は、WO94/07998号、ヨーロッパ特許第0531315号、アメリカ特許第5,457,046号、アメリカ特許第5,685,593号、アメリカ特許第5,763,254号、WO95/24471号、WO98/12307号及びPCT/DK98/0299号に記載されるそれらのものである。
市販のセルラーゼは、Celluzyme^TM 及びCarezyme^TM (Novo Nordisk A/S), Clazinase^TM 及びPuradex HA^TM (Genencor International Inc.) 及びKAC−500 (B)^TM (Kao Corporation) を包含する。
【０１６５】
ペルオキシダーゼ / オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリナス、例えばコプリナス・シネレウス、及びWO93/24618 号、WO95/10602号及びWO98/15257号に記載されるそれらのようなそれらの変異体からのペルオキシダーゼを包含する。
【０１６６】
市販のペルオキシダーゼは、Guardzyme^TM (Novo Nordisk A/S) を包含する。洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加剤を添加することにより、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤又は組合された添加剤が、例えば粒質物、液体、スラリー、等として配合され得る。好ましくは洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非−ダスチング粒質物、液体、特に安定された液体又はスラリーである。
【０１６７】
非−ダスチング粒質物は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号に開示のようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。蝋被覆材料の例は、1000〜20,000の平均モル重量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50の酸化エチレン単位を有する、エトキシル化されたノニルフェノール；12〜20個の炭素原子を有するアルコールを有し、そして15〜80の酸化エチレン単位を有する、エトキシ化された脂肪アルコール；脂肪アルコール、脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。
【０１６８】
流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。例えば、液体酵素調製物は、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、硫酸又は硼酸を添加することによって、安定化される。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示される方法に従って調製され得る。
【０１６９】
本発明の洗剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体の形で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る１又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜6.0重量％のレベルで存在する。
【０１７０】
そこに含まれる場合、洗剤は通常、約１％〜約40％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪酸スルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
【０１７１】
そこに含まれる場合、界面活性剤は通常、約0.2％〜約40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体（“グルコサミド”）を含むであろう。
【０１７２】
洗剤は、０〜65％の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート（例えばHoechstからのSKS−６）を含むことができる。
【０１７３】
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−N−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。
【０１７４】
洗剤は、H₂O₂源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。
【０１７５】
洗剤はまた、他の従来の洗剤組成物、例えば布コンディショナー、例えばクレー、泡増強剤、石鹸泡抑制剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、抗−土壌再沈着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇りインヒビター、又は香料を含むことができる。
【０１７６】
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体１L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体１L当たり0.05−5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体１L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
本発明の酵素はさらに、WO97/07202号（引例として本明細書組み込まれる）に開示される洗剤配合物に導入され得る。
【０１７７】
皿洗い洗剤組成物：
本発明の酵素はまた、次のものを包含する皿洗い洗剤組成物にも使用され得る：
【０１７８】
【表９】

【０１７９】
【表１０】

【０１８０】
【表１１】

【０１８１】
【表１２】

【０１８２】
【表１３】

【０１８３】
【表１４】

【０１８４】
【表１５】

【０１８５】
【表１６】

【０１８６】
【表１７】

【０１８７】
【表１８】

【０１８８】
【表１９】

【０１８９】
１１）1), 2), 3), 4), 6) 及び10) に記載されるような自動皿洗い組成物であるが、過硼酸塩が過酸酸塩により置換されている。
１２）マンガン触媒をさらに含む１）−６）に記載されるような自動皿洗い組成物。前記マンガン触媒は、例えば“Efficient manganese catalysts for low-temporature bleaching”、Nature 369, 1994, pp.637-639に記載される化合物の１つであり得る。
【０１９０】
使用：
本発明はまた、洗剤組成物、特に洗濯洗剤組成物及び皿洗い洗剤組成物、硬質表面清浄組成物、及び織物、布又は衣類の糊抜き、パルプ及び紙、ビール醸造、及び上記のような澱粉転換工程のための組成物へのα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドの使用方法にも向けられる。
本発明はさらに例により記載されるが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１９１】
材料および方法
緩衝剤および基質として使用した化学物質は少なくとも試薬用の商品である。材料
酵素：
SP690：米国特許第5,856,164号の配列番号1に開示されているアルファ−アミラーゼ。
SP722：米国特許第5,856,164号の配列番号2に開示されているアルファ−アミラーゼ。
【０１９２】
Termamyl^R：米国特許第5,830,837号の配列番号1に開示されているバシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）からのアルファ−アミラーゼ。
AA560：配列番号2に示すin vivoアルファ−アミラーゼ。
BAN：バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）に由来し、ノボ・ノルディスク社（Novo Nordisk A／S）から入手可能であるアルファ−アミラーゼ。
BSG：バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）に由来し、ノボ・ノルディスク社から入手可能であるアルファ−アミラーゼ。
【０１９３】
モデル洗浄剤：
A／P（アジア／パシフィック）モデル洗浄剤は下記の組成を有する：20％のSTPP（トリポリリン酸ナトリウム）、25％のNa₂SO₄、15％のNa₂CO₃、20％のLAS（線状アルキルベンゼンスルホン酸塩、Nansa 80S）、5％のC₁₂−C₁₅アルコールエトキシレート（Dobanol 25−7）、5％のNa₂Si₂O₅、0.3％のNaCl。
オモ・マルチ″アカオ（Omo Multi Acao）（ブラジル）、
オモ濃厚粉末（EU）（Unilever）、
アリエル・ヒューツア（Ariel Futur）液（Procter and Gamble）。
【０１９４】
生物材料の寄託
下記の生物学的材料は、ブダベスト条約の規定に従いドイチェ・サムムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ゼルクルツレン（Deutshe Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen）GmbH（DSMZ）（Mascheroder Weg 1b、D−38124 Braunschweig DE）に寄託され、下記の受け入れ番号を与えられた：
寄託 受け入れ番号 寄託年月日
NN017557 DSM 12648 1999年1月25日
NN017560 DSM 12649 1999年1月25日
NN049467 DSM 12761 1999年4月7日
NN049470 DSM 12764 1999年4月7日
【０１９５】
菌株は特許出願の継続の間に37 C.F.R. §1.14および35 U.S.C. §122下に特許および商標の長官により資格を与えられたものに入手可能である。寄託は寄託された菌株の実質的に純粋な培養物を表す。寄託はこの出願の対応出願が出願されている国における外国の特許法により要求されるとき入手可能である。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の活動により許可された特許権の適用制約において主題の発明を実施するための実施許諾を構成しない。
【０１９６】
宿主生物
枯草菌（Bacillus subtilis）SHA273株はWO 95／10603に開示されている。
大腸菌（E. coli）SJ2株（Diderichsen他（1990））、J. Bacteriol.、Vol. 172、pp. 4315−4321。
【０１９７】
プラスミド：
遺伝子バンクベクターpSJ1678は、さらにWO 94／19454（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されている。
pTVB110は、pUB110（Gryczan、T.J.（1978）J. Bact. 134：318−329）からの複製起点の使用により枯草菌（Bacillus subtilis）において複製する植物である。さらに、このプラスミドは、プラスミドpC194から得られたクロラムフェニコールに対する耐性を与えるcat遺伝子をコードする（Horinouchi、S.およびWeisblum、B.（1982）J. Bact. 150：815−825）。このプラスミドは、amyLプロモーター、シグナル配列および転写ターミネーターが存在するように、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）アルファ−アミラーゼ遺伝子amyLのトランケートバージョンを収容するが、amy−プラス表現型（澱粉を含有する寒天上でハローを形成する）を提供しない。
pTVB299：実施例10における構築を参照。
【０１９８】
方法
一般的分子生物学的方法：
特記しない限り、DNA操作および形質転換は分子生物学の標準的方法を使用して実施された（Sambrook他（1989）；Ausubel他（1995）；HarwoodおよびCutting（1990）。
【０１９９】
アルファ−アミラーゼおよび変異型の発酵
この分野においてよく知られている方法または次のようにして、発酵を実行することができる。
−80℃のストックからの10μg／mlのカナマイシンを含むLB寒天上に、関係する発現プラスミドを収容する枯草菌（B. subtilis）をストリークし、37℃において一夜成長させる。500mlの震盪フラスコ中で10μg／mlのカナマイシンを補充した100mlの培地に、コロニーを移す。
【０２００】
BPX培地の組成：
ジャガイモ澱粉 100g／l
オオムギ粉 50g／l
BAN 5000 SKB 0.1g／l
ナトリウムカゼイネート 10g／l
大豆荒粉 20g／l
Na₂HPO₄・12H₂O 9g／l
Pluronic^TM 0.1g／l
培養物を37℃、270rpmにおいて5日間震盪する。
【０２０１】
4500rpmにおいて20〜25分間遠心することによって、発酵ブロスから細胞および細胞デブリを除去する。その後、上清を濾過して完全に透明な溶液を得る。濾液を濃縮し、UFフィルター（10000カットオフ膜）上で洗浄し、緩衝液を20mMの酢酸塩pH5.5に変化させる。UF濾液をS−セファロースF.F.上に適用し、同一緩衝液中の0.2MのNaClを使用する段階溶離により、溶離を実施する。溶出液を10mMのTris、pH9.0に対して透析し、Q−セファロースF.F.上に適用し、6カラム体積にわたって0〜0.3MのNaClの線形勾配で溶離する。活性（ファデバス（Phadebas）アッセイにより測定する）を含有する画分をプールし、pHをpH7.5に調節し、0.5％w／vの活性炭で5分間処理することによって、残留する色を除去した。
【０２０２】
アルファ−アミラーゼ活性についてのアッセイ
1. ファデバス（Phadebas）アッセイ
基質としてファデバス（Phadebas^R）タブレットを使用する方法により、アルファ−アミラーゼ活性を測定する。ファデバスタブレット（Phadebas^R Amylase Test、Pharmacia Diagnosticにより供給される）は、ウシ血清アルブミンおよび緩衝化物質を混合され、タブレット化された、架橋した不溶性青色澱粉ポリマーを含有する。
【０２０３】
単一測定毎に、5mlのブリットン・ロビンソン（Britton−Robinson）緩衝液（50mMの酢酸、50mMのリン酸、50mMのホウ酸、0.1mMのCaCl₂、NaOHで問題の値に調節されたpH）を含有する管の中に、1つのタブレットを懸濁させる。この試験は問題の温度において水浴中で実施する。試験すべきアルファ−アミラーゼをxmlのブリットン・ロビンソン緩衝液中に希釈する。1mlのこのアルファ−アミラーゼ溶液を5mlの50mMのブリットン・ロビンソン緩衝液に添加する。澱粉はアルファ−アミラーゼにより加水分解されて、可溶性青色フラグメントを生成する。620nmにおいて測定した、生ずる青色溶液の吸収は、アルファ−アミラーゼ活性の関数である。
【０２０４】
インキュベーション（試験時間）の10または15分後に測定された620nmの吸収は、620nmにおいて0.2〜2.0吸収単位の範囲であることが重要である。この吸収範囲において、活性と吸収との間に線形性が存在する（ランバート-ベールの法則）。したがって、酵素の希釈はこの基準に適合するように調節しなくてはならない。特定した組の条件（温度、pH、反応時間、緩衝条件）下に、1mgの所定のアルファ−アミラーゼはある量の基質を加水分解し、そして青色が生成されるであろう。色強度を620nmにおいて測定する。測定した吸収は、所定の組の条件下に問題のアルファ−アミラーゼの比活性（活性／mgの純粋なアルファ−アミラーゼタンパク質）に直接比例する。
【０２０５】
2. 別法（PNP−G7アッセイ）
PNP−G7基質を使用する方法により、アルファ−アミラーゼ活性を測定する。PNP−G7は、p−ニトロフェニル−アルファ，D−マルトヘプタオシドの略号であり、ブロックされたオリゴ糖である。このオリゴ糖はエンド−アミラーゼにより切断することができる。切断後、キットに含まれているアルファ−グルコシダーゼは基質を消化して遊離PNP分子を遊離させる。このPNP分子は黄色を有し、こうしてλ＝405nm（400〜420nm）において可視分光測定により測定することができる。PNP−G7基質およびアルファ−グルコシダーゼを含有するキットは、ベーリンガー・マンヘイム（Boehringer Mannheim）により製造されている（カタログNo. 1054635）。
【０２０６】
基質を調製するために、1びんの基質（BM1442309）を5mlの緩衝液（BM1442309）に添加する。α−グルコシダーゼを調製するために、1びんのα−グルコシダーゼ（BM1442309）を45mlの緩衝液（BM1442309）に添加する。5mlのα−グルコシダーゼ溶液を0.5mlの基質と混合することによって、使用溶液を調製する。
20μlの酵素溶液を96ウェルのマイクロタイタープレートに移し、25℃においてインキュベートすることによって、アッセイを実行する。200μlの使用溶液を25℃において添加する。溶液を混合し、1分間前インキュベートし、OD405nmにおいて3分かけて15秒毎に吸収を測定する。
時間依存的吸収−曲線の勾配は、所定の組の条件下に問題のアルファ−アミラーゼの比活性（活性／mgの酵素）に直接比例する。
【０２０７】
カルシウムおよび pH 依存的安定性
液化pHとしてpH6.0〜6.2を使用しかつ40ppmの遊離カルシウムを添加して95℃〜105℃における安定性を改良することによって、通常の工業的液化を実施する。ここにおいて提案されている置換のいくつかを行って、
1. pH6.2より低いpHにおいて、および／または
2. 40ppmの遊離カルシウムより低いカルシウムレベルにおいて、
安定性を改良した。
AA560アルファ−アミラーゼにおいて異なる置換により得られた安定性を変更を測定するために、2つの異なる方法を使用することができる。
【０２０８】
方法 1 遊離カルシウムの存在下に、低いpH、pH5.0における安定性を測定する1つのアッセイ。10μgの変異型を下記の条件下にインキュベートする：5ppmのカルシウムおよび5％w/wの普通のコーンスターチ（カルシウムを含まない）を含有する、pHをpH5.0に調節した、0.1Mの酢酸塩溶液。95℃の水浴中で30分間インキュベートを実施する。
方法 2 遊離カルシウムの非存在下に安定性を測定し、pHをpH6.0に維持する1つのアッセイ。このアッセイはカルシウムの感受性の低下を測定する：10μgの変異型を下記の条件下にインキュベートする：5ppmのカルシウムおよび5％w/wの普通のコーンスターチ（カルシウムを含まない）を含有する、pHをpH6.0に調節した、0.1Mの酢酸塩溶液。95℃の水浴中で30分間インキュベートを実施する。
【０２０９】
安定性の決定
すべての安定性の実験は同一構成を使用して実施する。この方法は次の通りである：
酵素を関係する条件下にインキュベートする（1〜4）。試料を0、5、10、15および30分において採り、アッセイ緩衝液（0.1Mの50mMのブリットン緩衝液pH7.3）中の25倍（すべての採取した試料について同一希釈）に希釈し、標準的条件下にpH7.3、37℃においてファデバス（Pharmacia）を使用して活性を測定する。
インキュベーションの前（0分）に測定した活性を参照（100％）として使用する。百分率の傾斜をインキュベーション時間の関数として計算する。
【０２１０】
比活性の決定
ファデバスアッセイ（Pharmacia）を使用して、比活性を活性／mg酵素として測定する。
【０２１１】
AA560 および変異型を使用するジェット・クッキング（ jet cooking ）および液化
ミニ−ジェット・システム中で、50NU／gのDSの投与量を使用し、p.5.5において5ppmのCa⁺⁺を添加して液化実験を実施して、配合したアルファ−アミラーゼ変異型の性能を親アルファ−アミラーゼの性能と比較した。時間の関数としてDE増加を測定する（ネオクプロイン（Neocuproine）方法）ことによって、反応をモニターする。
【０２１２】
約11.8kgのセレスターC＊ファーム（Cerestar C＊Pharm）GL 03406（89％の澱粉）を脱イオン水の中に懸濁させ、30kgに構成することによって、コーンスターチのスラリーを調製する。0.55gのCaCl₂・2H₂Oを添加した後、周囲温度においてpHを5.5に調節する。
50NU／gのDSに対応する量の酵素を添加し、NaClで導電性を300mSに調節する。標準的条件は次の通りである：

【０２１３】
ジェッティング後、液化した澱粉を収集し、密閉した熱フラスコをパイロットプラントから実験室に移し、ここで二次液化を95℃において続ける。
10mlの試料を15〜90分において15分の間隔で採る。2滴の1N HClを添加して酵素を不活性化する。これらの試料から、0.3〜0.1g（期待するDEに従う）を秤量し、100mlに希釈する。次いでネオクプロイン法（改良された精度における還元性糖の測定、Dygert、Li、FloridaおよびThomas（1965）、Anal. Biochem. 13、368）に従い還元性糖を測定し、DE値を測定する。時間の関数としてDEの発生を比較する。
【０２１４】

【０２１５】
DOPE プログラムを使用する一般的ランダム突然変異誘発法
下記の工程により、ランダム突然変異誘発を実施することができる：
1. 親酵素における修飾のために問題の領域を選択する、
2. 選択した領域における突然変異部位および非突然変異部位を決定する、
3. 例えば、所望の安定性および／または構築すべき変異型の性能に関して、どんな突然変異を実施するかを決定する、
4. 構造的に合理的な突然変異を選択する、
5. 工程4に関して工程3により選択した残基を調節する、
【０２１６】
6. 適当なドープアルゴリズムを使用して、ヌクレオチド分布を分析する、
7. 例えば、停止コドンの導入を回避するために、例えば、遺伝暗号から生ずる拘束を考慮して、必要に応じて、遺伝暗号の現実に対して必要な残基を調節する、
8. プライマーを作る、
9. プライマーを使用してランダム突然変異誘発を実行する、
10. 所望の改良された性質についてスクリーニングすることによって、生ずるグルコアミラーゼ変異型を選択する。
【０２１７】
ドープアルゴリズム
工程6において使用するために適当なドープアルゴリズムは、この分野においてよく知られている。1つのこのようなアルゴリズムは下記の文献に記載されている：Tomandl、D.他、1997、Journal of Computer−Aided Molecular Design 11：29−38。他のアルゴリズムはDOPEである（Jensen、LJ、Andersen、KV、Svendsen、A、およびKretzschmar、T（1998）Nucleic Acids Research 26：697−702）。
【０２１８】
フィルタースクリーニングアッセイ
親酵素に比較して高いpHにおいて改良された安定性を有するAA560変異型をスクリーニングし、そしてスクリーニング温度の設定に依存して親酵素に比較して高いpHおよび培地温度において改良された安定性を有するAA560アルファ−アミラーゼ変異型をスクリーニングするために、このアッセイを使用することができる。
【０２１９】
高い pH におけるフィルターアッセイ
10μg／mlのカナマイシンを含むTY寒天平板上のセルロースアセテート（OE 67、Schleicher & Schuell、ドイツ国ダッセル）およびニトロセルロースフィルター（Protran−Ba 85、Schleicher & Schuell、ドイツ国ダッセル）のサンドイッチ上で37℃において少なくとも21時間、バシラス（Bacillus）ライブラリーをプレートする。セルロースアセテート層をTY寒天平板上に配置する。
【０２２０】
プレート後に、しかしインキュベーション前に、各フィルターサンドイッチを針で特別にマークして、フィルター上の陽性変異型を捜し出し、そしてグリシン−NaOH緩衝液、pH8.6〜10.6を含む容器に変異型が結合したニトロセルロースフィルターを移し、室温（10℃〜60℃において変更することができる）において15分間インキュベートする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターを、使用するまで、室温においてTYプレート上で貯蔵する。インキュベーション後、グリシン−NaOH、pH8.6〜10.6中に1％のアガロース、0.2％の澱粉を含有するプレート上で残留活性を検出する。
【０２２１】
ニトロセルロースフィルターを有するアッセイプレートをフィルターサンドイッチと同一方法でマークし、室温において2時間インキュベートする。濾液を除去した後、アッセイプレートを10％のルゴール（Lugol）溶液で染色する。澱粉分解性変異型を暗青色バックグラウンド上の白色スポットとして検出し、次いで貯蔵プレート上で同定する。陽性変異型を第1スクリーンと同一条件下に2回再スクリーニングする。
【０２２２】
低カルシウムフィルターアッセイ
関係する抗生物質、例えば、カナマイシンまたはクロラムフェニコールを含むTY寒天平板上のセルロースアセテート（OE 67、Schleicher & Schuell、ドイツ国ダッセル）およびニトロセルロースフィルター（Protran−Ba 85、Schleicher & Schuell、ドイツ国ダッセル）のサンドイッチ上で37℃において少なくとも21時間、バシラス（Bacillus）ライブラリーをプレートする。セルロースアセテート層をTY寒天平板上に配置する。
【０２２３】
プレート後に、しかしインキュベーション前に、各フィルターサンドイッチを針で特別にマークして、フィルター上の陽性変異型を捜し出し、そして炭酸塩／重炭酸塩緩衝液pH8.5〜10および異なるEDTA濃度（0.001mM〜100mM）を含む容器に変異型が結合したニトロセルロースフィルターを移す。フィルターを室温において1時間インキュベートする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターを、使用するまで、室温においてTYプレート上で貯蔵する。
【０２２４】
インキュベーション後、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液pH8.5〜10中に1％のアガロース、0.2％の澱粉を含有するプレート上で残留活性を検出する。ニトロセルロースフィルターを有するアッセイプレートをフィルターサンドイッチと同一方法でマークし、室温において2時間インキュベートする。濾液を除去した後、アッセイプレートを10％のルゴール溶液で染色する。澱粉分解性変異型を暗青色バックグラウンド上の白色スポットとして検出し、次いで貯蔵プレート上で同定する。陽性変異型を第1スクリーンと同一条件下に2回再スクリーニングする。
【０２２５】
実施例
実施例 1．DSM 12648 および DSM 12649 からゲノム DNA の単離
バシラス（Bacillus）種DSM 12649株（AA560アルファ−アミラーゼ）およびバシラス（Bacillus）種DSM 12648株（AA349アルファ−アミラーゼ）を、液体TY培地中で増殖させる（Ausubel他（1995）に記載されているように））。37℃および300rpmにおいて16時間インキュベートした後、細胞を収集し、ゲノムDNAをPitcher他（1989）が記載する方法により単離した。
【０２２６】
ゲノムライブラリーの構築：
DSM 12649株のゲノムDNAを制限酵素Sau3Aで部分的に消化し、0.7％のアガロースゲル上の電気泳動によりサイズで分画した。サイズが2〜10kbのフラグメントをDEAE−セルロース紙上への電気泳動により単離する（Dretzen他（1981））。単離されたDNAフラグメントをBamHI消化pSJ1678プラスミドDNAに結合し、結合混合物を使用して大腸菌（E. coli）SJ2を形質転換した。
【０２２７】
形質転換：
大腸菌（E. coli）SJ2宿主を調製し、供給業者が記載するように、BIO−RADからの遺伝子PULSER^TMエレクトロポレーション装置を使用するエレクトロポレーションにより形質転換させた。
【０２２８】
陽性形質転換体の同定：
大腸菌（E. coli）SJ2中でDNAライブラリーを前述したように構築し、0.5％のAZCL−アミラーゼ（Megazyme）および10μg／mlのクロラムフェニコールを含有するLB寒天平板（Ausubel他（1995）に記載されている）上でスクリーニングし、37℃において一夜インキュベートした。アミラーゼ活性を発現するクローンは青色拡散ハローとともに出現した。1つのこのようなクローンをLiH1274と命名した。さらに、クローニングしたSau3A DNAフラグメントの一部分を配列決定することによって、DNAを特性決定した。
【０２２９】
実施例 2．DSM 12648 株（ AA349 ）からのアルファ−アミラーゼをコードする遺伝子の DNA 配列の決定
既知のバシラス（Bacillus）アルファ−アミラーゼの中に保存された領域に対して向けられたデジェネレイトプライマーを使用して、アルファ−アミラーゼをコードする遺伝子の内部のDNAフラグメントを特異的にPCR増幅するために、プラスミドpSJ1678、pLiH1274の中に挿入されたデンプン分解活性をコードする遺伝子を含有する、大きい染色体フラグメントを構築するクローンを鋳型として使用した。デジェネレイトプライマーは下記の領域／アミノ酸配列に対して向けられていた：
【０２３０】
For36：GITA（L／V／I）W（I／L）（配列番号5）
For97：VY（G／A）D（V／F／L）V（M／L／I／F）NH（配列番号6）
For227：DG（F／I）R（F／L／I）DA（A／V）KH（配列番号7）
Rev235：DG（F／I）R（F／L／I）DA（A／V）KH（配列番号8）
Rev328：VTFV（D／E）NHD（配列番号9）
Rev410：GWTREG（配列番号10）
【０２３１】
前方向（Fro）および逆方向（Rev）プライマーの種々の組合わせをPCRにおいて使用し、内部DNAフラグメントを増幅することができた。
DNAフラグメントをQIAquickスピンカラム（QUIGEN）により精製し、同一デジェネレイトプライマーを使用して配列決定した。
配列から、成熟AA349アルファ−アミラーゼ（配列番号2）をコードする完全なコーディング領域のDNA配列を標準的プライマーウォーキングアプローチにより決定した。
【０２３２】
実施例 3．DSM 12649 株（ AA560 ）からのアルファ−アミラーゼをコードする遺伝子の DNA 配列の決定
DSM 12649株（実施例1）からの染色体DNAの調製物を実施例2に前述した実験と同様な実験において鋳型として使用して、AA560アルファ−アミラーゼ（配列番号4）のDNA配列を決定した。
【０２３３】
実施例 4．pTVB110 の中への AA349 アルファ−アミラーゼのサブクローニング
pTVB110は、pUB110からの複製起点の使用により枯草菌（Bacillus subtilis）において複製するプラスミドである（Gryczan、T.J.（1978）J. Bact. 134：318−329）。さらに、このプラスミドは、プラスミドpC194から得られるクロラムフェニコールに対する耐性を与えるcat遺伝子をコードする（Horinouchi、S.およびWeisblum、B.（1982）J. Bact. 150：815−825）。このプラスミドはバシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）アルファ−アミラーゼ遺伝子amyLのトランケートバージョンを収容し、こうしてamyLプロモーター、シグナル配列および転写ターミネーターが存在するようにするが、プラスミドはamy−プラス表現型（澱粉を含有する寒天上でハローを形成する）を提供しない。
【０２３４】
多い量のAA349アルファ−アミラーゼを発現させるために、転写がamyLプロモーターにより開始されかつ転位がamyLシグナル配列により指令されるように、成熟遺伝子をamyLシグナル配列に正確に融合した。
成熟AA349アルファ−アミラーゼ内にPstI部位が見出される。pTVB110の中への遺伝子のクローニングはpTVB110中のPstI部位を利用するので、AA349アルファ−アミラーゼ内に位置するPstI部位はクローニングの間に破壊された（アミノ酸アラニン88のサイレント突然変異の導入により（GCA→GCG））。
【０２３５】
製造会社（Boehringer Mannheim）が推奨する条件下にPwoポリメラーゼを使用するプラスミドpLiH1274上のPCRにより、ほぼ280bpのフラグメントを増幅するために、プライマー188クローニングNおよび188（Pst−）を使用した。このフラグメントをアガロースゲルから精製し、プライマー188クローニングCと一緒にメガプライマー（G. SarkarおよびS.S. Sommer（1990））として使用して、第2PCRにおいて成熟アミラーゼをコードする全長の遺伝子を増幅した。
【０２３６】
生ずるほぼ1480bpのフラグメントを制限エンドヌクレアーゼPstIおよびSfiIで消化し、同一酵素で消化したプラスミドpTVB110と結合した。
プロテアーゼおよびアミラーゼ欠失枯草菌（Bacillus subtilis）株SHa273（WO 95／10603に記載されている）を結合混合物で形質転換し、amy−プラス形質転換体のDNA配列を確認した。このプラスミドをpTVB231と表示する。
【０２３７】
オリゴヌクレオチド：
188（Pst−）：
5' GGC GTT AAC CGC AGC TTG TAA C （配列番号11）
188クローニングC：
5' CCG AGC TCG GCC GGC TGG GCC GTC GAC TTA TTT GTT TAC CCA AAT AGA AAC （配列番号12）
188クローニングN：
5' CAT TCT GCA GCA GCG GCG CAC CAC AAT GGT ACG AAC G
（配列番号13）
【０２３８】
実施例 5．pTVB110 の中への AA560 アルファ−アミラーゼのサブクローニング
DNA配列決定は、DSM 12648（AA349）株およびDSM 12649（AA560）株からのアルファ−アミラーゼ間のDNAの高い同一性を明らかにした。結局、同一オリゴヌクレオチドおよび戦略を利用して、AA560アルファ−アミラーゼを発現ベクターpTVB110の中にクローニングし、pTVB232を生成し、次いでこれを標準的技術に従い発酵させた。
【０２３９】
実施例 6．親 AA560 アルファ−アミラーゼの精製
0.01mlの50％（w/w）CaCl₂・2H₂O、0.0125mlの12％（w/w）アルミン酸ナトリウム、0.025mlの10％C521および0.075mlの0.1％A130／mlの培養ブロスを添加することによって、培養ブロスを凝集させた。酵素溶液に硫酸アンモニウムを1.2Mの最終濃度に添加し、1.2Mの硫酸アンモニウム、10mMのTris HCl、pH7.0中で前もって平衡化したブチルトーヨーパール（Butyl Toyo Pearl）カラム（100ml）上に適用した。
【０２４０】
5mMのTris HCl、pH7.0を使用してアミラーゼを溶離し、溶離したプールを5mMのTris HClに対して一夜透析した。次いで20mMのTris−HCl、pH9.0中で前もって平衡化したQ−セファロースカラム（200ml）を使用するイオン交換クロマトグラフィーに画分をかけた。非結合物質を平衡化緩衝液で洗浄し、アミラーゼを線形勾配0〜1MのNaCl、20mMのTris HCl、pH9.0で溶離した。アミラーゼ調製物の純度はSDS−PAGEにより95％以上と判定された。
【０２４１】
実施例 7．親 AA560 アルファ−アミラーゼの特性決定
前述のファデバスアッセイ（37℃、pH7.3）および別のpNPG7（25℃、pH7.1）の両方を使用して、アルファ−アミラーゼ活性を測定した。選択したpH値および温度値において、pHおよび温度のプロファイルを作った。pHプロファイルを37℃において測定し、そして温度プロファイルをpH9.0において測定した。
等電点電気泳動を使用して、等電点を測定した（Pharmacia、Ampholine、pH3.5〜9.3）。
【０２４２】
【表２０】

E ＝ AA560、SP722およびSP690について3.0／cm／（g／l）
pH最適値の決定および温度最適値の決定の結果を、それぞれ、第2図および第3図に示す。
【０２４３】
実施例 8．親 AA560 アルファ−アミラーゼの洗濯試験
本発明のAA560アルファ−アミラーゼを含む洗剤溶液中で、結果25℃および40℃において15および30分間、汚れた被験スワッチを洗濯することによって、洗濯性能を評価した。
使用した洗剤を下記表2に記載する。A／Pモデル洗剤は前述の材料の節に記載されている。他の洗剤は商業的に入手可能である。アルファ−アミラーゼを含有する商業的洗剤を洗濯前にマイクロ波で不活性化した。
【０２４４】
実施例6の精製した組換えAA560アルファ−アミラーゼを下に示す濃度で洗剤溶液に添加した。被験スワッチをオレンジ色イネ澱粉で汚した（CS−28スワッチ、CFT、Center for Test Material、オランダ国、から入手可能である）。洗濯後、エルレフォ・レミッション（Elrepho Emission）分光光度計を使用して460nmにおいて規約反射率を測定することによって、スワッチを評価した。結果を次のように表す：△R＝アルファ−アミラーゼで洗濯したスワッチの規約反射率−アルファ−アミラーゼを使用しないで同一条件下に洗濯したスワッチ
【０２４５】
【表２１】

【０２４６】
結果を第4図〜第7図に示す。結果が証明するように、本発明のアルファ−アミラーゼは高度にアルカリ性pHにおいてすべての洗剤について有効であり、そしてAA560アルファ−アミラーゼは、それぞれSP690およびSP722に比較して、改良された洗濯性能を有することが示される。
【０２４７】
実施例 9．AA560 アルファ−アミラーゼを使用する糊抜き試験
TEGEWA方法（Verband TEGEWA、ドイツ国フランクフルトa.M.、カールストラッセ21、から入手可能である方法および標準的目盛り）に従い、布帛の糊抜きのために、親AA560アルファ−アミラーゼを使用した。条件は「材料および方法」の節に記載されている。
【０２４８】
30および55℃において実施した糊抜き試験において、AA560アルファ−アミラーゼを使用した。酵素を含浸溶液中で0.05〜2g／lで投与した。通常の熱いソーダ洗濯の代わりに、水中で布帛を洗濯することによって、洗濯後の手順を実施した。
紫色目盛り（TEGEWA）TEGEWA目盛り：1〜9を使用して効果を測定した。
等級1＝糊抜きなし、等級9＝完全な糊抜き。
【０２４９】
【表２２】

【０２５０】
実施例 10．寄託された材料 pTVB299 の構築
プラスミドpzero−2（Invitrogen、ニュージイランド国グロニンゲン）の中に、成熟遺伝子をサブクローニングした。AA560の完全な成熟領域を含有するほぼ1.5kbのPstI−SacIフラグメントをベクターpzero−2と結合させ、同一制限エンドヌクレアーゼで消化した。結合混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）細胞の中に形質転換した。形質転換体をPCRにより分析して、挿入されたフラグメントの存在を確認し、そして成熟アルファ−アミラーゼをコードするこのフラグメントの部分を配列決定した。生ずるプラスミドをpTVB299と表示し、DSMZにおいてDSM12764として寄託された。
【０２５１】
実施例 11．AA560 アルファ−アミラーゼの変異型の構築
配列番号2に示すAA560アルファ−アミラーゼをコードする遺伝子は、プラスミドpTVB223の中に位置する。アミラーゼは、枯草菌（Bacillus subtilis）においてこの構築物中のamyLプロモーターから発現される。
Sarkarおよびsommer（1990）、BioTechniques 8：404−407に記載されているメガ−プライマー法により、デルタ（D183−G184）突然変異を有する本発明の変異型を構築した。
【０２５２】
配列番号12に示すAA560をコードするpTVB223プラスミドからほぼ645bpのDNAフラグメントをPCRにより増幅するために、遺伝子特異的プライマーB1および突然変異原性プライマー101458を使用した。
645bpのフラグメントをアガロースゲルから精製し、そして同一鋳型上で実施した第2PCRにおいてプライマーY2と一緒にメガ−プライマーとして使用した。
【０２５３】
生ずるほぼ1080bpのフラグメントを制限酵素BstEIIおよびAflIIIで消化し、生ずるほぼ510bpのDNAフラグメントを精製し、同一酵素で消化したpTVB223プラスミドと結合させた。コンピテント枯草菌（Bacillus subtilis）SHA273（低アミラーゼおよびプロテアーゼ）細胞を結合およびクロラムフェニコール耐性形質転換体で形質転換し、DNA配列決定によりチェックしてプラスミド上の正しい突然変異の存在を確認した。
【０２５４】
プライマーB1：
5' CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG 3'（配列番号14）
プライマーY2：
5' CTT GTT CCC TTG TCA GAA CCA ATG 3'（配列番号15）
プライマー101458：
5' GT CAT AGT TGC CGA AAT CTG TAT CGA CTT C 3'（配列番号16）
デルタ（D183−G184）＋N195Fを有するAA560アルファ−アミラーゼをコードする生ずるプラスミドをpTVB232と命名した。
本発明の他の変異型の構築を同様な方法において実施することができる。
【０２５５】
実施例 12．AA560 変異型の洗濯性能の試験
本発明のAA560変異型の洗濯性能を実施例8に記載するように試験する。
実施例 13．AA560 変異型の比活性の試験
AA560変異型の比活性を実施例7に記載するように試験する。
【０２５６】
実施例 14．AA560 変異型のカルシウム安定性の試験
「材料および方法」の節に記載するアッセイを使用して、AA560変異型のカルシウム安定性を試験する。
本明細書において開示する特定の態様は本発明のいくつかの面の例示として意図されるので、本明細書に記載しかつ特許請求する発明の範囲はこれらの態様によりそ限定されない。任意の同等の態様は本発明の範囲内に入ることを意図する。事実、本発明の種々の変更は、ここにおいて示しかつ記載するものに加えて、以上の説明から当業者にとって明らかとなるであろう。このような変更は、また、本発明の範囲内に入ることを意図する。矛盾する場合において、定義を包含する本発明の開示がコントロールするであろう。
種々の参考文献は本明細書において引用され、その開示は引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２５７】
参考文献
Sambrook他、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、1989、Cold Spring Harbor Lab.、Cold Spring Harbor、NY。
Ausubel、F.M.他（編者）、Current Protocols in Molecular Biology、1995、John Wiley and Sons。
Harwood C.R.、およびCutting S.M.（編者）、Molecular Biological Methods for Bacillus、1990、John Wiley and Sons。
Diderichsen B.、Wedsted U.、Hedegaard L.、Jensen B.R.、Sjφholm C.、バシラス・ブレビス（Bacillus brebis）からのエキソ酵素である、アルファ−アセトラクテートデカルボキシラーゼをコードするaldBのクローニング、J. Bacteriol. 1990、Vol. 172、pp. 4315−4312。
Pitcher D.G.、Sunders N.A.、Owen R.J.、グアニジウムチオシアネートを使用する細菌のゲノムDNAの急速な抽出、Lett. Appl. Microbiol. 1989、Vol. 8、pp. 151−156。
Dretzen G.、Bellard M.、Sassone−Corsi P.、Chambon P.、アガロースおよびアクリルアミドゲルからDNAフラグメントを回収する信頼性ある方法、Anal. Biochem. 1981、Vol. 112、pp. 295−298。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、多くのバチルスα−アミラーゼの一列整列を示す。
【図２】 図２は、SP722及びSP690α−アミラーゼに比較してのAA560α−アミラーゼのpHプロフィールを示す。pHプロフィールは、37℃で測定される。その活性は、Abs650/mgとして絶対値で示される。
【図３】 図３は、対照のSP722及びSP690α−アミラーゼに比較してのpH9.0でのAA560α−アミラーゼの温度プロフィールを示す。
【図４】 図４は、SP722, SP690及びTermamyl（商標）に比較してのAPモデル洗剤97におけるAA560α−アミラーゼの洗浄性能を示す。
【図５】 図５は、それぞれ、SP722, SP690及びTermamyl（商標）に比較してのOmo Multi AcaoにおけるAA560α−アミラーゼの洗浄性能を示す。
【図６】 図６は、それぞれ、SP722, SP690及びTermamyl（商標）に比較してのOmo ConcentratedにおけるAA560α−アミラーゼの洗浄性能を示す。
【図７】 図７は、それぞれ、SP722, SP690及びTermamyl（商標）に比較してのAriel Futur 液体におけるAA560α−アミラーゼの洗浄性能を示す。
【配列表】

Claims (25)

1. α−アミラーゼ活性を有し、且つ配列番号２又は４のアミノ酸１〜485と少なくとも98％同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
2. α−アミラーゼ活性を有し、且つ配列番号２又は４のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
3. α−アミラーゼ活性を有し、且つ配列番号２又は４のアミノ酸配列から成るポリペプチド。
4. α−アミラーゼ活性を有し、且つ配列番号２又は４のアミノ酸１〜485と少なくとも99％同一性を有するポリペプチド。
5. それぞれ、E.コリDSM12761又はE.コリDSM12764に含まれるプラスミドpLiH1274又はpTVB299に含まれる核酸配列によりコードされる請求項１記載のポリペプチド。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸構造体。
7. 配列番号１又は３の成熟ポリペプチドコード配列に少なくとも１つの突然変異を有する核酸配列を含んで成る核酸構造体であって、ここで前記変異体核酸配列が配列番号２又は４のアミノ酸１〜485から成るポリペプチドをコードすることを特徴とする核酸構造体。
8. （ａ）核酸を、（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）配列番号１のcDNA配列、又は（iii）前記(ｉ)若しくは（ii）の相補的鎖と、非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズさせ；そして
   （ｂ）前記核酸を単離する；
   ことによって生成される請求項６又は７記載の核酸構造体。
9. 請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
10. 請求項９に記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
11. 変異体核酸を生成するための方法であって、
    （ａ）配列番号１又は３の成熟ポリペプチドコード配列中に少なくとも１つの変異を挿入し、ここで前記変異体核酸が配列番号２又は４のアミノ酸１〜485から成るポリペプチドをコードし；そして
    （ｂ）前記変異体核酸を回収する；
    ことを含んで成る方法。
12. 請求項11に記載の方法により生成される変異体核酸。
13. ポリペプチドの生成方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために、前記ポリペプチドをコードする請求項12に記載の変異体核酸を含んで成る株を培養し；そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
    ことを含んで成る方法。
14. 請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドを生成するための方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドを生産することができる微生物株を培養し；そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
    ことを含んで成る方法。
15. 請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドを生成するための方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体を含んで成る宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成のために適切な条件下で培養し：そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
    ことを含んで成る方法。
16. ポリペプチドの生成方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下で宿主細胞を培養し、ここで前記宿主細胞は、配列番号１又は３の成熟ポリペプチドコード配列に少なくとも１つの突然変異を有する、配列番号２又は４のアミノ酸配列１〜485から成るポリペプチドをコードする変異体核酸を含んで成り；そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
    ことを含んで成る方法。
17. １又は複数の下記変異（配列番号２に関する）：
    

    

    （^＊は欠失を意味する）を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドのα−アミラーゼ活性を有する変異体。
18. 下記変異の組合せ：
    

    

    

    を有する変異体の群から選択される請求項17に記載の変異体。
19. 位置E216Qでの置換をさらに含んで成る請求項17又は18に記載の変異体。
20. 洗剤組成物への請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項17〜19のいずれか１項記載の変異体の使用。
21. 糊抜き組成物への請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項17〜19のいずれか１項記載の変異体の使用。
22. 澱粉の液化のための請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項17〜19のいずれか１項記載の変異体の使用。
23. エタノール製造のための請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項17〜19のいずれか１項記載の変異体の使用。
24. 洗濯用洗剤組成物における請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項17〜19のいずれか１項記載の変異体の使用。
25. 皿洗い洗剤組成物における請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項17〜19のいずれか１項記載の変異体の使用。

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