JP4955546B2

JP4955546B2 - 変更された性質を有するα−アミラーゼ変異体

Info

Publication number: JP4955546B2
Application number: JP2007518456A
Authority: JP
Inventors: アンデルセン，カルステン; エストダル，ヘンリク; スカゲルリンド，ペテル
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 2004-07-05
Filing date: 2005-07-05
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2025-07-05
Also published as: BRPI0512776A; AU2005259686B2; CN113549606A; EP3000887B1; CA2854912A1; EP4269684A3; DK1781790T3; JP2008504811A; EP3000887A3; US20160053244A1; US10563186B2; CN101010429A; CN107151662A; CA2571864A1; AU2005259686A1; WO2006002643A2; EP1781790B1; US9096837B2; CA2571864C; EP4269684A2

Description

発明の分野：
本発明は、α−アミラーゼ活性を有し、そして親テルマミル−様α−アミラーゼに対して少なくとも１つの次の性質において変更を示す、前記親α−アミラーゼの変異体に関する：基質特異性、基質結合、基質分解パターン、熱安定性、pH活性プロフィール、pH安定性プロフィール、酸化に対する安定性、Ca²⁺依存性、低められた及び高められたpI及び改良された洗浄能力、比活性、例えば高温及び/又は低/高pH条件下での、特に低カルシウム濃度での安定性、及び洗剤の存在下での安定性、例えば洗剤における貯蔵安定性。本発明の変異体は、澱粉転換、エタノール生成、洗濯洗浄、皿洗い、硬質表面清浄、織物糊抜き及び/又は甘味剤の生成のために適切である。

発明の背景：
α−アミラーゼ（α−1,4−グルカン−4−グルカノヒドラーゼ、EC3,2,1,1）は、澱粉、及び他の線状及び枝分かれ鎖の1,4−グルコシドオリゴ−及び多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
本発明の目的は、特に、洗剤使用のために適切な改良されたα−アミラーゼを供給することである。

発明の要約：
本発明の目的は、対応する親α−アミラーゼ、すなわち突然変異誘発されていないα−アミラーゼに比較して、α−アミラーゼ活性を有し、そして前記親α−アミラーゼに対して少なくとも１つの上記性質における変更を示す、テルマミル−様α−アミラーゼ変異体を提供することである。

命名法：
本発明の記載においては、アミノ酸残基についての従来の一文字及び多文字コードが使用される。参照の容易さのために、本発明のα−アミラーゼ変異体は、次の命名法の使用により記載される：
元のアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸。
この命名法によれば、位置30におけるアスパラギンによるアラニンの置換は、次のように示され：
Ala30Asn又はA30N
同じ位置におけるアラニンの欠失は、次のように示され：
Ala30^*又はA30^*
そして追加のアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は次のように示される：
Ala30AlaLys又はA30AK。

連続した一連のアミノ酸残基、例えばアミノ酸残基30−33の欠失は、（30−30）^*又はΔ（A30−N33）として示される。
特定のα−アミラーゼが、他のα−アミラーゼに比較して“欠失”を含み、そして挿入がそのような位置において生ぜしめられる場合、これは、位置36におけるアスパラギン酸の挿入について、次のように示される：
^*36Asp又は^*36D。

複数の突然変異は、次のように、＋の印により分けられ、すなわちそれぞれ、アスパラギン及びセリンによりアラニン及びグルタミン酸を置換する、位置30及び34における突然変異は次のように表される：
Ala30Asn＋Glu34Ser又はA30N＋E34S。
１又は複数のアミノ酸残基が所定の位置に挿入される場合、それは次のように示される：
A30N, E, A30N又はA30E。

さらに、修飾のために適切な位置が、いずれの特定の修飾も示されないで、本明細書において同定される場合、いずれかのアミノ酸残基がその位置に存在するアミノ酸残基により置換され得ることが理解されるべきである。従って、例えば、位置30におけるアラニンの修飾が言及される場合、アラニンは、欠失されるか、又はいずれか他のアミノ酸、すなわちR,N,D,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,Vのいずれか１つのアミノ酸により置換され得ることが理解されるべきである。さらに、“A30X”とは、次の置換のいずれか１つを意味する：A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y, 又は A30V；又は要するに、A3OR,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V。

親酵素（番号付けのために使用される）がその位置における置換のために示される問題のアミノ酸残基をすでに有する場合、次の命名法が使用される：
N又はVの１つが野生型で存在する場合、“X30N”又は“X30N, V”。
従って、他の対応する親酵素が位置30における“Asn”又は“Val”に置換されることを意味する。

アミノ酸残基の特徴化：
荷電されたアミノ酸：Asp, GIu, Arg, Lys, His
負に荷電されたアミノ酸（最も負の残基を最初に示す）：Asp, Glu
正に荷電されたアミノ酸（最も正の残基を最初に示す）：Arg, Lys, His
中性アミノ酸：Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro
疎水性アミノ酸残基（最も疎水性の残基を最後に示す）：Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Tyr, Phe, Trp
親水性アミノ酸（最も親水性の残基を最後に示す）：Thr, Ser, Cys, Gln, Asn

発明の特定の記載：
本発明の目的は、親ポリペプチドに対して少なくとも１つの次の性質の変更を有する、ポリペプチド、例えば酵素、特にα−アミラーゼを供給することである：特に、洗剤及び皿洗い適用における、基質特異性、基質結合、基質分解パターン、熱安定性、pH/活性プロフィール、酸化に対する安定性、Ca²⁺依存性、及び比活性。前記性質は下記のように、さらに定義されるであろう。

ポリペプチド：
本発明のポリペプチドは、生物学的活性、抗菌活性及び酵素活性を有するタンパク質を包含する。
企画される酵素活性は、プロテアーゼ、CGTアーゼ、マンナナーゼ、マルトゲン性アミラーゼ、グルコアミラーゼ、カルボヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼを包含する。

１つの好ましい態様においては、酵素は、α−アミラーゼ、特にバチルス又はアスペルギラスα−アミラーゼである。好ましい態様においては、バチルスα−アミラーゼは、テルマミル−様アミラーゼである。
生物学的活性を有するポリペプチドは、EPO, TPO, 成長因子、調節ペプチド、血液凝集因子、抗体、等を包含する。

SP722の三次構造及びもう１つのテルマミル−様α−アミラーゼの三次構造の設計：
本発明のα−アミラーゼの変異体は、WO01/66712号の付録に示されるSP722の三次構造に基づかれていることが見出されている。他のポリペプチドの変異体は、他の三次構造に基づかれることが見出され得る。

もう１つのアルカリ性テルマミル−様アミラーゼのモデルAA560は、WO01/66712号の付録に開示されるAP722三次構造に基づいて構築されている。AA560α−アミラーゼは、鋳型アミラーゼ（SP722）に対して約87％同一であり、そしてその一連整列は、挿入も又は欠失も含まない。

本発明の発見は、配列番号12で示されるテルマミル−様α−アミラーゼに対して、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは80％、さらにより好ましくは85％、さらにより好ましくは90％、より好ましくは95％、より好ましくは97％、さらにより好ましくは99％同一であるテルマミル−様アミラーゼに適用され得る。好ましくは、前記発見は、アルカリ性テルマミル−様α−アミラーゼ、特にSP722（図１における一列整列において番号７として示される配列番号４）に比較して、一列整列された一次構造における追加のアミノ残基又はギャップを伴わないで、同じ長さのアルカリ性α−アミラーゼに基づいて使用され得る。

特に、前記発見は、次のアルカリ性テルマミル−様α−アミラーゼに基づいて使用され得る：SP690（配列番号２）、SP722（配列番号４）、AA560（配列番号12）、＃707α−アミラーゼ（配列番号13）、WO97/00324号に開示されるKSM AP1378, WO02/10356号に開示される＃AP7-7α−アミラーゼ、又はそのフラグメント又は切断された形。後者の言及されるアルカリ性α−アミラーゼは、上記相互作用領域近くに、非常に類似する三次結晶構造を有し、そして485個の長さのアミノ酸の同じ一次構造を有する。

それとは対照的に、テルマミル（図１における一列整列において配列番号１として示される）は、２個のアミノ酸残基（位置１及び２）を欠いており；位置174及び181−132にギャップを有し；そしてSP722と一列整列される場合、位置378−381に３個の追加のアミノ酸残基を有する。
BAN（図１における一列整列において配列番号４として示される）は、５個のアミノ酸残基（位置１−４及び488）を欠いており；位置174及び181−182にギャップを有し；そしてSP722と一列整列される場合、位置378−381に３個の追加のアミノ酸残基を有する。

BSG（図１における一列整列において配列番号３として示される）は、１つのアミノ酸残基（位置）を欠いており；そしてSP722と一列整される場合、位置489−519に31個の追加のアミノ酸残基を有する。
KSM−K36及びKSM−K38（EP1,022,334-A）は、５個のアミノ酸残基（位置１及び２）を欠いており、そしてSP722と一列整列される場合、位置174及び181−182にギャップを有する。

AA180, AA20及びAmrk385（デンマーク特許出願PA2000/00347号又はPCT/DK01/00133号）は、SP722と一列整列される場合、位置261に１つの追加のアミノ酸を有する。
下記に、もう１つのα−アミラーゼからテルマミル−様α−アミラーゼを、いかにして構成するかが記載されている。この方法は、上記に言及されるように、他のポリペプチドに対して表され得る。

テルマミル−様α−アミラーゼの構成：
WO96/23874号は、B. アミロリケファシエンスα−アミラーゼの300個のN−末端アミノ酸残基（BAN^TM）及びB. リケニホルミスα−アミラーゼのC−末端のアミン酸301−483（配列番号８）から成る、テルマミル−様α−アミラーゼについての三次構造（3D構造）のX−線結晶構造データを提供する。WO96/23874号はさらに、親に対して変更された性質を示す親テルマミル−様α−アミラーゼの変異体を、親テルマミル−様α−アミラーゼの構造の分析に基づいて、企画（構成）するためにの方法を記載する。

他のテルマミル−様構造は、引用により本明細書に組み込まれるWO96/23874号に従って構成され得る。
本発明の変異体を入手することに関しては、AA560三次構造が、例１に記載のように、SP722の三次構造（付録１に開示される）に基づいて企画された（構成された）。他のテルマミル−様α−アミラーゼ（例えば、本明細書に開示されるそれら）の構造は、同様にして構築され得る。

テルマミル−様α−アミラーゼ：
バチルスssp. により生成される多くのα−アミラーゼは、アミノ酸レベルに基づいては、高い相同性（同一）である。
多くのバチルスα−アミラーゼの同一性は、下記表１（Clustalw）に見出され得る：

例えば、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んで成るB.リケニホルミスα−アミラーゼ（Termamyl^TM として市販されている）は、配列番号10に示されるアミノ酸を含んで成るB.アミロリクエファシエンスと約81％相同であり、そして配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んで成るB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼと約65％相同であることが見出された。さらに、相同α−アミラーゼは、WO 95/26397号に開示されるSP690及び SP722を包含し、そしてそれぞれ配列番号２及び４で示される。他のアミラーゼは、バチルスsp. 由来の及び配列番号12で示されるAA560α−アミラーゼ、及びTsukamoto など., Biochemical and Biophysical Research Communications. 151 (1988), pp. 25-31により記載される、バチルスsp. 由来の＃707α−アミラーゼである。

KSM AP1878α−アミラーゼは、WO 97/00324号 (KAO Corporationからの)に開示される。また、EP1,022,334号に開示されるK38及びK38α−アミラーゼが、本発明に従って企画される。
他のα−アミラーゼは、配列番号13, 14, 15, 16, 17及び18で示される。

さらに、相同α−アミラーゼは、EP 0252666号に記載されるB.リケニホルミス（ATCC 27811）により生成されるα−アミラーゼ、及びWO91/00353及びWO94/18314に同定されるα−アミラーゼを包含する。他の市販のテルマミル−様α−アミラーゼは、次の商標で市販されている製品に含まれる：Optitherm^TM 及びTakatherm^TM (Solvay から入手できる)、Maxamyl^TM (Gist-brocades/Genencor から入手できる)、Spezym AA^TM 及びSpezyme Delta AA^TM (Genencor から入手できる）、及びkeistase^TM (Daiwa から入手できる)、Purastar^TM ST 5000E, PURASTRA^TM HPAM L (Genencor Int. から入手できる)。

それらのα−アミラーゼ間に見出される実質的な相同性のために、それらは同じ種類のα−アミラーゼ、すなわち“テルマミル−様α−アミラーゼ”の種類に属すると思われる。
従って、本発明においては、用語“テルマミル−様α−アミラーゼ”とは、アミノ酸レベルで、Termamyl^TM, すなわち本明細書において配列番号８で示されるアミノ酸を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼとの実質的な相同性を示す。

換言すれば、本明細書において、配列番号2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17及び18に示されるアミノ酸配列を有するすべてのその次のα−アミラーゼが、“テルマミル−様α−アミラーゼ”であると見なされる。他のテルマミル−様α−アミラーゼは、i)配列番号2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17及び13で示される前記アミノ酸配列の少なくとも１つの配列に対して、少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも75％、又は少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％の相同性を示し、そして/又はii)本明細書の配列番号1, 3, 5, 7, 9, 11（このコード配列は、それぞれ、本明細書における配列番号2, 4, 6, 8, 10及び12で示されるアミノ酸配列をコードする）から明らかである上記特定されるα−アミラーゼをコードするDNA配列に対してハイブリダイズするDNA配列によりコードされる、α−アミラーゼである。

また、１）テルマミルに対して高い相同性を有する触媒ドメイン、及び２）炭水化物結合ドメイン（CBM）から成るテルマミルアミラーゼは、本明細書に包含されるものとして理解されるべきである。結合ドメインは、触媒ドメインの配列に対するN−末端、又は触媒ドメインに対するC−末端のいずれかに位置し、１つよりも多くのCBMがN−又はC−末端のいずれか、又は両端に位置する。CBMを有するアミラーゼは、天然源からであるか、又はアミラーゼをコードする遺伝子と、CBMをコードする遺伝子とを融合する遺伝子工学の結果であり得る。

相同性（同一性）：
相同性は、第２配列からの第１配列の派生を示す２種の配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当業界において知られているコンピュータープログラム、例えばGCGプログラムパッケージに提供されるGAPにより適切に決定され得る（上記に記載される）。従って、Gap GCGv8は、同一性のためのデフォールト評点マトリックス及び次のデフォールトパラメーターを用いて使用され得る:核酸配列比較のために、それぞれ5.0のGAP創造ペナルティー及び0.3のGAP延長ペナルティー、及びタンパク質配列比較のために、それぞれ3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティー。GAPは、一列整列を製造し、そして同一性を計算するために、Needleman and Wunsch, (1970), J. MoI. Biol. 48, p.443-453の方法を使用する。

テルマミル（配列番号８）と例えばもう1つのα−アミラーゼとの間の構造的整列は、他のテルマミル−様α−アミラーゼにおける同等/対応する位置を同定するために使用され得る。前記構造的整列を得るための1つの方法は、ギャップペラルティのデフォルト値、すなわち3.0のギャップ創造ペナルティ及び0.1のギャップ延長ペナルティを用いて、GCGパッケージからのPile Upプログラムを使用することである。他の構造的整列方法は、疎水性クラスター分析（Gaboriaud など., (1987), FEB5 LETTERS 224, pp. 149-155）及びreverse threading (Huber, T; Torda, AE, Protein Science Vol. 7, No.1, pp. 142-149 (1998) を包含する。

ハイブリダイゼーション：
上記性質ii) のポリペプチド、例えばテルマミル−様α−アミラーゼの特徴化に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは適切には、問題のα−アミラーゼの十分な又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて調製され得る。

ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、5×SSCにおけるプレソーキング、及び20％ホルムアミド、5×Denhardt’s 溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8、及び50mgの音波処理された変性ウシ胸腺DNAの溶液における約40℃で１時間のプレハイブリダイゼーション、続いて、100mMのATPにより補充された同じ溶液における約40℃で18時間のハイブリダイゼーション、続いて、2×SSC、0.2％のSDSの溶液において40℃（低緊縮性）、好ましくは50℃（中位の緊縮性）、より好ましくは65℃（高緊縮性）、さらにより好ましくは約75℃（非常に高い緊縮性）での30分のフィルターの3度の洗浄を包含する。ハイブリダイゼーション方法についての一層の詳細は、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 に見出され得る。

本発明において、“〜に由来する”とは、問題の生物の株により生成されるか又は生成できるα−アミラーゼのみならず、またそのような株から単離されたDNAによりコードされ、そして前記DNA配列により形質転換された宿主生物において生成されるα−アミラーゼもまた示すことを意図される。最後に前記用語は、合成及び／又はcDNA起原のDNA配列によりコードされ、そして問題のα−アミラーゼの同一特徴を有するα−アミラーゼを示すことを意図される。前記用語はまた、親α−アミラーゼが天然に存在するα−アミラーゼの変異体、すなわち天然に存在するα−アミラーゼの1又は複数のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であり得ることを示す。

親テルマミル−様α−アミラーゼ：
本発明によれば、上記に定義されるようなすべてのテルマミル−様α−アミラーゼは、親（すなわち、主鎖）α−アミラーゼとして使用され得る。本発明の好ましい態様においては、親α−アミラーゼは、B. リケニホルミス、例えば上記に言及されるそれらの１つ、例えば配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するB. リケニホルミスα−アミラーゼに由来する。

好ましい態様においては、親テルマミル−様α−アミラーゼは、SP722又はBSG、又はAA560、例えばSP722+R181*+G182*； SP722+D183*+G184*; SP722+D183*+G184*+N195F; SP722+D183*+G184*+M202L; SP722+D183*+G184*+N195F+M202L; SP722+D183*+G184*+R181 Q; SP722+D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K; BSG+1181*+G182*; BSG+I181*+G182*+N193F; BSG+I181*+G182*+M2OOL; BSG+1181 *+G182*+N193F+M200L; AA560+D183*+G184*; AA560+D183*+G184*+N195F; AA560+D183*+G184*+M202L; AA560+D183*+G184*+N195F+M202L; AA560+D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458Kのいずれかである。"BSG+1181 *+G182*+N193F"とは、B. ステアロサーモフィラスα−アミラーゼが次の通りに突然変異誘発されたことを意味する:位置I181 及び G182 での欠失、及び位置193におけるASn（N）からPhe(F)への置換。

親ハイブリッドテルマミル−様α−アミラーゼ：
親α−アミラーゼ（すなわち、主鎖α−アミラーゼ）は、ハイブリッドα−アミラーゼ、すなわち少なくとも2種のα−アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合わせを含んで成るα−アミラーゼであり得る。

親ハイブリッドα−アミラーゼは、アミノ酸相同性（同一性）及び/又は免疫学的交差反応性及び/又はDNAハイブリダイゼーション（上記で定義されるような）に基づいて、テルマミル−様α−アミラーゼに属することを決定され得るα−アミラーゼであり得る。この場合、ハイブリッドα−アミラーゼは典型的には、テルマミル−様α−アミラーゼの少なくとも1つの部分、及び微生物（細菌又は菌類）及び/又は哺乳類起源のテルマミル−様α−アミラーゼ又は非−テルマミル−様α−アミラーゼから選択された1又は複数の他のα−アミラーゼの部分から構成される。

従って、親ハイブリッドα−アミラーゼは、少なくとも2つのテルマミル−様α−アミラーゼ、もしくは少なくとも1つのテルマミル−様及び少なくとも1つの非テルマミル−様細菌α−アミラーゼ、又は少なくとも1つのテルマミル−様及び少なくとも1つの菌類α−アミラーゼに由来する一部のアミノ酸配列の組み合わせを含んで成る。部分アミノ酸配列が由来するテルマミル−様α−アミラーゼは、本明細書に言及されるそれらの特定のテルマミル−様α−アミラーゼのいずれかであり得る。

例えば、親α−アミラーゼは、B.リケニホルミスの株に由来するα−アミラーゼのC−末端部分、及びB.アミロリクエファシエンスの株又はB.ステアロサーモフィラスの株に由来するα−アミラーゼのN−末端部分を含んで成る。

例えば、親α−アミラーゼは、B.リケニホルミスα−アミラーゼのC−末端部分の少なくとも430個のアミノ酸残基を含んで成り、そして例えば、ａ）配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するB．アミロリクエファシエンスα−アミラーゼの37個のN−末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼの445個のC−末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント、又はテルマミル配列、すなわち配列番号８で示されるバチルス・リケニホルミスα−アミラーゼと同一であるハイブリッドテルマミル−様α−アミラーゼ（但し、N−末端の35個のアミノ酸残基（成熟タンパク質の）が、BAN（成熟タンパク質）、すなわち配列番号10で示されるバチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼのN−末端の33個の残基により置換されている）；あるいは

ｂ）配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼの68個のN−末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するB.リケニホルミスα−アミラーゼの415個のC−末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントを含むことができる。

もう１つの適切な親ハイブリッドα−アミラーゼは、BANのN−末端、バチルス・アミロリクエファシエンスα−アミラーゼ（成熟タンパク質のアミノ酸１〜300）、及びテルマミルからC−末端（成熟タンパク質のアミノ酸301〜483）から成る、WO96/23874号（Novo Nordisk）に記載されているものである。
さらにもう１つの適切な親ハイブリッドα−アミラーゼは、配列番号2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 又は 18の配列、及び配列番号13（AMY1048）の最後の99個のアミノ酸から成る。

本発明の好ましい態様においては、親テルマミル−様α−アミラーゼは、配列番号８及び10のハイブリドα−アミラーゼである。特に、親ハイブリッドテルマミル−様α−アミラーゼは、配列番号８で示されるB. リケニルホルミスα−アミラーゼの445個のC−末端アミノ酸残基、及び次の突然変異：H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (配列番号８における番号付けを用いる)を、さらに、適切に有することができる、配列番号10で示されるB. アミロリクエファシエンスに由来するα−アミラーゼの33個のN−末端アミノ酸残基を含んで成るハイブリッドα−アミラーゼであり得る。

他の特に企画される親α−アミラーゼは、少数の突然変異を有するLE174、すなわち次の突然変異を有する上記に言及されたハイブリッドを含む：A181T+N190F+A209V+Q264S; N190F+A209V+Q264S; A209V+Q264S; Q264S; H156Y+N190F+A209V+Q264S; H156Y+A209V+Q264S; H156Y+Q264S; H156Y+A181T+A209V+Q264S; H156Y+A181T+Q264S; H156Y+Q264S; H156Y+A181T+N190F+Q264S; H156Y+A181T+N190F; H156Y+A181T+N190F+A209V。それらのハイブリッドはまた、本発明の一部でもあると思われる。

好ましい態様においては、親テルマミル−様α−アミラーゼは、LE174+G48A+T49I+G107A+I201 F; LE174+M197L; 又は LE174+G48A+T49I+G107A+M197L+I201 Fのいずれかを含むLE174である。
企画される他の親α−アミラーゼは、I201Fにおける追加の置換を有するLE174であるLE429を含む。本発明によれば、LE335は、LE429に比較して、T49I＋G107Aに追加の置換を有するα−アミラーゼであり；LE399は、LE335＋G48A、すなわちG48A+T49I+G107A+I201 Fを有するLE174である。

本発明の変異体の構成：
興味ある変異体の構成は、変異体を生成の助けとなる条件下で変異体をコードするDNA配列を含んで成る微生物を培養することによって達成され得る。次に、続いて変異体が得られる培養ブイヨンから回収され得る。これは下記に詳細に記載される。

変更された性質
次のことが、本発明の変異体に存在することができる突然変異と、それに起因する性質の所望する変更（それに比較して、親テルマミル−様α−アミラーゼ）との間の関係を議論する。
上記に言及されるように、本発明は、特に高温及び/又は低pHで、特に低カルシウム濃度で変更された性質を有するテルマミル−様α−アミラーゼに関する。

本発明においては、“高温”とは、70〜120℃、好ましくは80〜100℃、特に85〜95℃の温度を意味する。
本発明においては、用語“低pH”とは、４〜６、好ましくは4.2〜5.5、特に4.5〜5の範囲のpHを意味する。
本発明においては、用語“高pH”とは、８〜11、特に8.5〜10.6の範囲のpHを意味する。

本発明においては、用語“低カルシウム濃度”とは、60ppm、好ましくは40ppm、より好ましくは25ppm、特に５ppmよりも低い遊離カルシウムレベルを意味する。
特別に企画された、変更された性質を受け入れることに関して、特別に企画された親テルマミル−様α−アミラーゼは、上記に言及される親テルマミル−様α−アミラーゼ及び親ハイブリッドテルマミル−様α−アミラーゼである。SP722α−アミラーゼが出発点として使用されるが、しかし例えばテルマミル、BSG, BAN, AA560, SP690, AA180, KSM AP1378, SP7-7 及び #707, K38, 及び K36における対応する位置がまた、開示されるように理解されるべきである。

改良された酸化安定性アミラーゼ変異体の企画：
配列番号８におけるM197、又は配列番号12における同等のM202は、洗剤において、過硼酸塩のような漂白剤の存在下で安定性を高めることが示されている。また、配列番号８におけるM15の突然変異は、いくらかの効果を示しているが、しかし配列番号2, 4, 6, 10及び12、及びM15に等しい位置での対応するメチオニンを有さない他のアミラーゼに関しては、他の残基、特に他のメチオニンが、M202について観察される以上に安定性を高めることが見出された。

それらは、配列番号17及び18におけるM9, M10, M105, M116 (SP690, SP722, AMRK385には存在しない), M202, M208, M261 , M309, M323 (only in AA560, SP722においてのみ), M382, M410 (SP.7-7), M430, M440を包含するが、但しそれらだけには限定されず、そして配列番号16（AAI−10）においては、最も興味ある位置は、M10, M105, M202, M208, M246, M286, M309, M430, M440, M454であり、そして配列番号14（Amrk385）においては、最も興味ある位置は、M9, M10, M105, M202, M208, M262, M310, M383, M431 , M441であり、そして配列番号15（K38）においては、最も興味ある位置は、M7, M8, M103, M107, M277, M281 , M304, M318, M380, M425, M435である。最も好ましい置換は、M9L,I, M10L, M105L,I,F, M116N,D,L,I,F,W,R,K, M202L,I,T,V, M208F,Y,L,I, M261L,I, M309L,I, M323L,I,S,T,A,Q,E,N,D, M382L,I,Y,F,K, M410L,I.V, M430L,I, M440L,l,F,Yである。

上記に言及されるように、M202は、漂白剤の存在下で安定性について重要であることが示されている。しかしながら、安定性のために好ましい置換へのM202の突然変異誘発は、アミラーゼの活性を低める。アミラーゼを再活性化するためには、推定上の基質結合分割と共に置換が、活性のために有益であることが示されている。それらは、中でも、T193, K269, N270, L272, Y295, N296, N299, S303, Y304, Q311 , N314, G315, Q319, 及び A339を包含する。好ましい突然変異は、T193S,N,D,E,Q, K269S,Q, N270F,Y,D, L272I,V,A, Y295F,N,D,Q,E, N296K,Q,E, N299F,Y,Q,T, S303Q,K, Y304F,R,K, Q311N,Q,K,R,T,S,Y,F, NSMD,S,T,Q, G315N,S,T, Q319E,K,S,T, A339S,Tである。

洗浄用途のための最適な酵素は、最適に作用するためにいくつかの基準を満たすべきである。使用の前、洗剤マトリックスにおいて安定すべきであり、洗浄の間、安定すべきであり、そして洗浄の間、非常に活性的であるべきである。それらの個々の基準を最適化するために報告されるいくつかの例が存在するが、しかし酸化につれて、安定性アミラーゼは低い活性になり、そして活性化されたアミラーゼは低い安定性になるので、すべての３種の要求を満たす置換の最適な組合せを同定することが本発明の範囲である。好ましい組合せは、次の通りである：

M9L+M202I
M9L+M202I+M323T
M9L+M202I+M323T+M382Y
M202I+Y295F
M202I+A339S
M9L+M202I+Y295F+A339S
M9L+M202I+Y295F
M9L+M202I+A339S
M9L+M202I+Y295F+A339S
M9L+M202I+Y295F+A339S+E345R

M9L+G149A+M202I+Y295F+A339S+E345R
M9L+M202L
M9L+M202L+M323T
M9L+M202L+M323T+M382Y
M202L+Y295F
M202L+A339S
M9L+M202L+Y295F+A339S
M9L+M202L+Y295F
M9L+M202L+A339S
M9L+M202L+Y295F+A339S
M9L+M202L+Y295F+A339S+E345R
M9L+G149A+M202L+Y295F+A339S+E345R

M9L+M202T
M9L+M202T+M323T
M9L+M202T+M323T+M382Y
M202T+Y295F
M202T+A339S
M9L+M202T+Y295F+A339S
M9L+M202T+Y295F
M9L+M202T+A339S
M9L+M202T+Y295F+A339S
M9L+M202T+Y295F+A339S+E345R

M9L+G149A+M202T+Y295F+A339S+E345R
M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R
M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y
M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339S
M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R
M9L+G149A+M202L+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R
M9L+G149A+M202I+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y
M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339S
M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R
M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R+N471E

M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y+N471E
M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339S+N471E
M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T2571+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R+N471E。

第１の観点においては、
6, 30, 33, 82, 37, 106, 118, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231 , 256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303, 304, 305, 311 , 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361 , 378, 383, 419, 421 , 437, 441 , 444, 445, 446, 447, 450, 461 , 471 , 482, 484から成る群から選択された１又は複数の位置で変更を含んで成る、親テルマミル−様α−アミラーゼの変異体に関し、ここで

（ａ）前記変更が、独立して、
（ｉ）前記位置を占めるアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、又は
（iii）前記位置を占めるアミノ酸の異なったアミノ酸による置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、そして
（ｃ）個々の位置が、配列番号12で示されるAA560のアミノ酸配列を有する親テルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応することを特徴とする。

好ましい態様においては、本発明の変異体（番号付けのために配列番号12を用いる）は、１又は複数の次の突然変異/置換を有する：
R26S, D30N, N33D, R82H, K37T, N106D, K118Q, N128Y, G133E,A, G149A.N, N150H,Q, Y160F, Y178F, G182T, G186A, T193S,N,D,E,Q, Y203L, V214I.T, D231N, G256K, T257I, G258D, K269S.Q, N270F,Y,D, L272I,V,A, N283D, Y295F.N, D1Q1E, N296K,Q,E, Y298F.H, N299F,Y,Q,T, S303Q.K, Y304F.R.K, G305D, Q311N,Q,K,R,T,S,Y,F, N314D,S,T,Q, G315N,S,T, V318L, Q319E1K1S1T, A339S.T, E345N,R, Q361 E, G378K, K383R, T419N, H421Y, N437H, F441 L, R444E.Y, N445Q, K446R, A447Y, V450T, T461 P, N471 E, W482Y, N484Q。

好ましい二重、三重及び多−突然変異誘発（番号付けのために配列番号12を用いる）は、下記を包含する：
M9L+M202I,
M9L+M202I+M323T,
M9L+M202I+323T+M382Y,
M9L+M202I+Y295F+A339S,
M9L+M202I+Y295F,
M9L+M202I+A339S,
M9L+M202I+Y295F+A339S,
M9L+M202I+Y295F+A339S+E345R,
M9L+G149A+M202I+Y295F+A339S+E345R,
M9L+M202L,

M9L+M202L+M323T,
M9L+M202L+M232T+M382Y,
M9L+M202L+Y295F+A339S,
M9L+M202L+Y295F,
M9L+M202L+A339S,
M9L+M202L+Y295F+A339S,
M9L+M202L+Y295F+A339S, E345R,
M9L+G149A+M202L+Y295F+A339S+E345R,
M9L+M202T,
M9L+M202T+M323T,

M9L+M202T+M323T+M382Y,
M9L+M202T+Y295F+A339S,
M9L+M202T+Y295F,
M9L+M202T+A339S,
M9L+M202T+Y295F+A339S,
M9L+M202T+Y295F+A339S+E345R,
M9L+G149A+M202T+Y295F+A339S+E345R,
M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R,
M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y,
M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339S,

M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R,
M9L+G149A+M202L+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R,
M9L+G149A+M202I+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y,
M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339S,
M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R,
M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R+N471E,
M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y+N471E,
M9L+G149A+G182T+G186A+M2021+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339S+N471E,
M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R+N471E,
M202L+M105F+M208F,

G133E+M202L+Q361E,
G133E+M202L+R444E,
M202L+Y295F,
M202L+A339S,
M202L+M323T,
M202L+M323T+M309L,
M202L+M323T+M430I,
M202L+V214T+R444Y,
M202L+N283D+Q361E,
M202L+M382Y+K383R,

M202L+K446R+N484Q,
M202I+Y295F,
M202I+A339S,
M202I+M105F+M208F,
G133E+M202I+Q361E,
G133E+M202I+R444E,
M202I+M202I+M323T,
M202I+M202I+M323T+M309L,
M202I+M323T+M430I,
M202I+V214T+R444Y,

M202I+N283D+Q361E,
M202I+M382Y+K383R,
M202I+K446R+N484Q,
M202V+M105F+M208F,
G133E+M202V+Q361E,
G133E+M202V+R444E,
M202V+M323T,
M202V+M323T+M309L,
M202V+M323T+M430I,
M202V+M323T+M9L,

M202V+V214T+R444Y,
M202V+N283D+Q361E,
M202V+M382Y+K383R,
M202V+K446R+N484Q,
M202T+M105F+M208F,
G133E+M202T+Q361E,
G133E+M202T+R444E,
M202T+Y295F,
M202T+A339S,
M202T+M323T,

M202T+M323T+M309L,
M202T+M323T+M430I,
M202T+M323T+M9L,
M202T+V214T+R444Y,
M202T+N283D+Q361E,
M202T+A339S,
M202T+Y295F ,
M202T+N299F,Y,
M202T+M382Y+K383R,
M202T+K446R+N484Q。

安定性：
本発明においては、60ppm以下の遊離（すなわち、溶液において未結合）カルシウム濃度で、特に高温（すなわち、70〜120℃）及び/又は極端なpH（すなわち、低いか又は高いpH、すなわちそれぞれpH４〜６又はpH８〜11）で、変更された安定性、特に改良された安定性（すなわち、高いか又は低い）の達成に関して、重要な突然変異（アミノ酸置換及び欠失を包含する）は、“変更された性質”のセクションに列挙される突然変異のいずれかを包含する。安定性は、下記“材料及び方法”のセクションに記載のようにして決定され得る。

Ca ²⁺ 安定性：
変更されたCa²⁺安定性とは、Ca²⁺消耗下で酵素の安定性が改良された、すなわち高いか又は低い安定性であることを意味する。本発明においては、特に高いpH（すなわち、pH８〜10.5）で、変更されたCa²⁺安定性、特に改良されたCa²⁺安定性、すなわち高いか又は低い安定性の達成に関しての重要な突然変異（アミノ酸置換及び欠失を包含する）は、“変更された性質”のセクションに列挙される突然変異のいずれかを包含する。

比活性：
本発明のさらなる観点においては、特に10〜60℃、好ましくは20〜50℃、特に30〜40℃で、変更された比活性、特に高められた又は低められた比活性を示す変異体の入手に関しての重要な突然変異（アミノ酸置換及び欠失を包含する）は、“変更された性質”のセクションに列挙される突然変異のいずれかを包含する。比活性は、下記“材料及び方法”のセクションに記載のようにして決定され得る。

酸化安定性：
本発明の変異体は、親α−アミラーゼに比較して、変更された酸化安定性、特に高い酸化安定性を有することができる。高められた酸化安定性は、例えば洗剤組成物において好都合であり、そして低められた酸化安定性は澱粉液化のために組成物において好都合である。酸化安定性は、下記“材料及び方法”のセクションに記載のようにして決定され得る。

変更されたpHプロフィール：
特に高pH（すなわち、pH８〜10.5）又は低pH（すなわち、pH４〜６）で、変更されたpHプロフィール、特に改良された活性の入手に関しての重要な位置及び突然変異は、活性部位残基に接近して位置するアミノ酸残基の突然変異を包含する。好ましい特定の突然変異/置換は、問題の位置についてのセクション“変更された性質”に列挙されるそれらである。適切なアッセイは、下記“材料及び方法”のセクションに記載される。

洗浄性能：
特に中位〜高いpH、すなわちpH６〜11、好ましくはpH8.5〜11で改良された洗浄性能を有する変異体の入手に関しての重要な位置及び突然変異は、問題の位置についてのセクション“変更された性質”に列挙される特定の突然変異/置換を包含する。洗浄性能は、下記“材料及び方法”のセクションに記載のようにして試験され得る。

本発明のα−アミラーゼ変異体の調製方法：
遺伝子中に突然変異を導入するためのいくつかの方法は、当業界において知られている。α−アミラーゼをコードするDNA配列のクローニングの簡単な論議の後、前記α−アミラーゼをコードする配列内の特定部位で突然変異を生成するための方法が論じられるであろう。

α−アミラーゼをコードするDNA配列のクローニング
親α−アミラーゼをコードするDNA配列は、当業界において良く知られている種々の方法を用いて、問題のα−アミラーゼを生成するいずれかの細胞又は微生物から単離され得る。最初に、ゲノムDNA及び/又はcDNAライブラリーが、研究されるべきα−アミラーゼを生成する生物からの染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構成されるべきである。次に、α−アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、相同のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして問題の生物から調製されるゲノムライブラリーからα−アミラーゼをコードするクローンを同定するために使用され得る。他方では、既知のα−アミラーゼ遺伝子に対して相同の配列を含むラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーション及び低緊縮性の洗浄条件を用いて、α−アミラーゼをコードするクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。

α−アミラーゼをコードするクローンを同定するためのされにもう1つの方法は、発現ベクター、例えばプラスミド中にゲノムDNAのフラグメントを挿入し、その得られるゲノムDNAライブラリーによりα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、その形質転換された細菌を、α−アミラーゼのための、基質を含む寒天上にプレートし、それにより、α−アミロースを発現するクローンの同定を可能にすることを包含する。

他方では、酸素をコードするDNA配列は、確立された標準の方法、例えばS. L. Beaucage and M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869により記載されるホスホロアミジット方法、又はMatthes など., The EMBO J. 3, 1984, pp. 801-805により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホロアミジット方法においては、オリゴヌクレオチドが、例えば自動DNA合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切のベクターにおいてクローン化される。

最終的に、DNA配列は、標準技法に従って、合成ゲノム又はcDNA起源のフラグメント（適切な場合、完全なDNA配列の種々の部分に対応するフラグメント）を連結することによって調製される、混合されたゲノム及び合成起源のもの、混合された合成及びcDNA起源のもの又は混合されたゲノム及びcDNA起源のものであり得る。DNA配列はまた、例えばアメリカ特許第4,683,202号又はR.K. Saiki など., Science 239, 1988, pp. 487-491 に記載されるように、特定のプライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応（PCR）により調製され得る。

特定部位の突然変異誘発
α−アミラーゼをコードするDNA配列が単離され、そして突然変異のための所望する部位が同定されるとすぐに、突然変異が合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。それらのオリゴヌクレオチドは、所望する突然変異部位を端に有するヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成の間、挿入される。特定の方法においては、α−アミラーゼをコードする配列を架橋するDNAの一本鎖ギャップが、α−アミラーゼ遺伝子を担持するベクターにおいて創造される。

次に、所望する突然変異を担持する合成ヌクレオチドが、一本鎖DNAの相同部分にアニーリングされる。次に、残るキャップがDNAポリメラーゼI(クレノウフラグメント)により満たされ、そしてその構造体がT4リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例が、Morinaga など.,(1984)に記載される。アメリカ特許第4,760,025号は、カセットの少々の変更を実施することによって、複数の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るので、さらに多くの種類の突然変異がMorinaga の方法によりいずれかの時点で一度に導入され得る。

α−アミラーゼをコードするDNA配列中に突然変異を導入するためのもう1つの方法が、Nelson and Long (1989) に記載されている。それは、PCR反応におけるプライマーの1つとして化学的に合成されたDNA鎖を用いることによって導入される所望する突然変異を含むPCRフラグメントの3−段階生成を包含する。PCR−生成されたフラグメントから、突然変異を担持するDNAフラグメントが、制限エンドヌクレアーゼによる分解により単離され、そして発現プラスミド中に再挿入され得る。

本発明の変異体を調製するための他の方法は、例えばWO 95/22625 号(Affymax Technologies N.V.からの) 又はWO 96/00343 号(Novo Nordisk A/Sからの)に記載のような遺伝子シャフリング、又は問題の突然変異、例えば置換及び/又は欠失を含んで成るハイブリッド酸素をもたらす他の対応する技法を包含する。

ランダム突然変異誘発：
ランダム突然変異は、問題の示される、又は完全な遺伝子内に示されるアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも3種の部分における局在化された又は領域−特異的ランダム突然変異誘発として適切に実施される。
親α−アミラーゼをコードするDNA配列のランダム突然変異誘発は、便利には、当業界において知られているいずれかの方法の使用により実施され得る。

上記に関して、本発明のさらなる観点は、枝分れ点近くでのオリゴ糖を分解する、低められた能力を示し、そしてさらに、親に比較して、改良された基質特異性及び/又は改良された比活性を示す、親α−アミラーゼの変異体を生成するための方法に関し、ここで前記方法は、
（ａ）前記親α−アミラーゼをコードするDNA配列をランダムに突然変異誘発にゆだね、
（ｂ）段階（ａ）で得られた突然変異誘発されたDNA配列を宿主細胞において発現し、そして
（ｃ）親α−アミラーゼに比較して、変更された性質（すなわち、熱安定性）を有するα−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスクリーンすることを含んで成る。

本発明の上記の方法の段階（ａ）は好ましくは、刺激されたプライマーを用いて実施される。例えば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることにより実施され得る。さらに、ランダム突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により実施され得る。突然変異誘発剤は、例えばトランジション、トランスバージョン、逆位、スクランブリング、欠失、及び/又は挿入を誘発するものであり得る。

本発明のための適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）光、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸、及びヌクレオチド類似体を包含する。そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発される親酵素をコードするDNA配列を、生ぜしめる突然変異誘発のための適切の条件下で、選択の突然変異誘発剤の存在下でインキュベートし、そして所望する性質を有する突然変異誘発されたDNAを選択することによって実施される。

突然変異誘発がオリゴヌクレオチドの使用により実施される場合、オリゴヌクレオチドは、変更される予定である位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、3種の非−親ヌクレオチドにより刺激され又はスパイクされ得る。刺激又はスパイキングは、所望しないアミノ酸のためのコドンが回避されるように行われ得る。刺激された又はスパイクされたオリゴヌクレオチドは、適切であると思われるようなPCR、LCR又はいずれかのDNAポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、いずれかの公開された技法により、α−アミラーゼ酵素をコードするDNA中に組み込まれ得る。好ましくは、刺激は、個々の位置における野生型及び突然変異の百分率が予備定義されている“一定のランダム刺激”を用いて実施される。

さらに、刺激は、一定のヌクレオチドの導入のための選択、及びそれにより、１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入のための選択に対して向けられ得る。刺激は、例えば個々の位置における90％の野生型及び10％の突然変異の導入を可能にするために行われ得る。刺激スキームの選択における追加の考えは、遺伝子の及びタンパク質構造の抑制に基づかれている。刺激スキームは、中でも、停止コドンの導入が回避されることを確保するDOPEプログラムを用いることによって行われ得る。PCR−生成された突然変異誘発が使用される場合、親α−アミラーゼをコードする、化学的に処理された又は処理されていない遺伝子のいずれかが、ヌクレオチドの誤った導入を高める条件下でPCRにゆだねられる（Deshler 1992; Leung など., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15）。

E．コリのミューテーター株（Fowler など., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191）、S.セレビシアエ又はいずれかの他の微生物が、例えば親グリコシラーゼを含むプラスミドを用いてミューテーター株を形質転換し、前記プラスミドと共にミューテーター株を増殖せしめ、そしてミューテーター株から突然変異誘発されたプラスミドを単離することによって、α−アミラーゼをコードするDNAのランダム突然変異誘発のために使用さえ得る。続いて、突然変異誘発されたプラスミドを用いて、発現生物を形質転換することができる。突然変異誘発されるべきDNA配列は便利には、親α−アミラーゼを発現する生物から調製されるゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。

他方では、DNA配列は、突然変異誘発剤と共にそれ自体インキュベートされるが、又は他方では、その剤に暴露され得る適切なベクター、例えばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在することができる。突然変異誘発されるべきDNAはまた、宿主細胞のゲノムに組み込まれることによって、又は宿主細胞に含まれるベクター上に存在することによって、その宿主細胞にも存在することができる。最終的に、突然変異誘発されるべきDNAは、単離された形で存在することができる。ランダム突然変異誘発にゆだねられるべきDNA配列は好ましくは、cDNA又はゲノムDNA配列であることが理解されるであろう。

多くの場合、発現段階ｂ）又はスクリーニング段階ｃ）を実施する前、突然変異誘発されたDNA配列を増幅することは便利である。そのような増幅は、当業界において知られている方法に従って実施され得、ここで現在好ましい方法は親酵素のDNA又はアミノ酸配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのPCR−生成される増幅法である。突然変異誘発剤とのインキュベーション又はその剤への暴露に続いて、突然変異誘発されたDNAは、DNA配列を担持する適切な宿主細胞を、発現を生ぜしめる条件下で培養することによって発現される。この目的のために使用される宿主細胞は、任意にベクター上に存在する突然変異誘発されたDNA配列により形質転換されている細胞、又は突然変異誘発処理の間、親酵素をコードするDNA配列を担持する細胞であり得る。

適切な宿主細胞の例は、次のものである：グラム陽性細菌、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・プレビス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラクタス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンギエンシス、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）;及びグラム陰性細胞、例えばE.コリ。突然変異誘発されたDNA配列はさらに、突然変異誘発されたDNA配列の発現を可能にする機能をコードするDNA配列を含んで成る。

局在化されたランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発は、好都合には、問題の親α−アミラーゼの一部に局在化され得る。これは、例えば酵素の一定の領域が酵素の所定の性質のために特に重要であることが同定されている場合、及び修飾が改良された性質を有する変異体をもたらすことが予測される場合、好都合であり得る。そのような領域は、親酵素の三次構造が誘発され、そして酵素の機能に関連している場合に通常同定され得る。

局在化された又は領域−特異的ランダム突然変異誘発は、上記のようなPCR生成される突然変異誘発技法、又は当業界において知られているいずれか他の適切な技法の使用により便利には実施される。他方では、修飾されるべきDNA配列の部分をコードするDNA配列は、例えば適切なベクター中への挿入により単離され得、そして続いて、前記部分が上記で論じられた突然変異誘発方法のいずれかの使用により突然変異誘発にゆだねられる。

α−アミラーゼ変異体を提供するための他の方法
本発明の変異体を提供するための他の方法は、例えばWO95/22625（Affymax Technologies N.V. からの）及びWO96/00343（Novo Nordisk A/S からの）に記載される方法を包含する、当業界において知られている遺伝子シャフリング方法（gene shuffling method）を包含する。

アミラーゼ変異体の発現：
本発明によれば、上記方法、又は当業界において知られているいずれか他の方法により生成される変異体をコードするDNA配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を含む。

本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列を担持する組換え発現ベクターは、便利には、組換えDNA方法にゆだねられ得るいずれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわち複製が染色体複製に無関係である染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外要素、ミニクロモソーム又は人口染色体であり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。

ベクターにおいて、DNA配列は適切なプロモーター配列に操作可能的に結合されるべきである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいずれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は非相同であるタンパク質コードの遺伝子に由来することができる。本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列の転写を、特に細菌宿主において方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリのlac オペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子dagA プロモーター、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラスマルトゲン性アミラーゼ遺伝子のプロモーター（amyM）、バチルス・アミロリクエファシエンスα−アミラーゼのプロモーター（amyQ）、バチルス・スブチリスxylA 及びxylB 遺伝子のプロモータ、等である。

菌類宿主における転写に関して、有用なプロモーターの例は、A.オリザエTAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニガー中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸性安定性α−アミラーゼ、A.ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A.オリザエアルカリプロテアーゼ、A.オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、又はA.ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。

本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、及び真核生物においては、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列に操作可能的に連結されるポリアデニル化配列を含んで成ることができる。終結及びポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ源に適切には由来することができる。
ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成ることができる。そのような配列の例は、プラスミドpUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, 及びpIJ702 の複製の起点である。

ベクター又は、選択マーカー、例えば1つの遺伝子（ここでその生物が宿主細胞における欠陥を補充する）、例えばB.スブチリス又はB.リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテロラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含んで成ることができる。さらに、ベクターは、アスペルギラス選択マーカー、例えばamdS, argB, niaD及びsC、ヒグロマイシン耐性を生ぜしめるマーカーを含んで成ることができ、又はその選択は例えばWO91/17243に記載のようにして同時−形質転換により達成され得る。

細胞内発現は、いくつかの観点においては、例えば宿主細胞として一定の細菌を用いる場合、好都合であるが、一般的に発現は細胞外であることが好ましい。一般的に、本明細書において言及されるバチルスα−アミラーゼは、培養物培地中への発現されたプロテアーゼの分泌を可能にするプレ領域を含んで成る。所望する場合、このプレ領域は、異なったプレ領域又はシグナル配列により置換され得、便利には、それぞれのプレ領域をコードするDNA配列の置換により達成される。

それぞれ、α−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素をコードする本発明のDNA構造体を連結し、そしてそれらを、複製のために必要な情報を含む適切なベクター中に挿入するため使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 を参照のこと）。

上記で定義されたような本発明のDNA構造体又は発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は、好都合には、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え生成において宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主染色体にDNA構造体（１または複数のコピーにおける）を組み込むことによって、変異体をコードする本発明のDNA構造体により形質置換され得る。この組み込みは一般的には、DNA配列が細胞において安定して維持されるので、好都合であると思われる。宿主染色体中へのDNA構造体の組み込むは、従来の方法、例えば相同又は非相同組換えにより行われ得る。他方では、細胞は、異なった型の宿主細胞に関して上記に記載されるようにして、発現ベクターにより形質転換され得る。

本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳類又は昆虫の細胞であり得るが、しかし好ましくは、微生物細胞、例えば細菌又は菌類（酵母を包含する）細胞である。
適切な細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・プレビス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラクタス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンギエンシス、ストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナス;及びグラム陰性細胞、例えばE.コリである。細菌の形質転換は、原形質形質転換により、又はそれ自体知られている態様でコンピテント細胞を用いることによってもたらされ得る。

酵母生物は、好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces）又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）の種、例えばサッカロミセス・セレビシアエから選択される。糸状菌は好都合には、アスペルギラスの種、例えばアスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーに属することができる。菌類細胞は、プロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、続いて、それ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238,023号に記載されている。

さらにもう1つの観点においては、本発明は本発明のα−アミラーゼ変異体を生成するための方法に関し、ここで前記方法は、上記のような宿主細胞を、変異体の生成の助けとなる条件下で培養し、そして細胞及び/又は培養培地から変異体を回収することを含んでなる。
細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖し、そして本発明のα−アミラーゼ変異体の発現を得るために適切ないずれかの従来の培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開されたレセピーに従って調製され得る（例えば、American Type Culture Collection のカタログに記載のようにして）。

宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は便利には、良く知られている方法、例えば遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、そして培地中のタンパク質成分を、塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、続いてクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものを使用することによる方法により、培養物培地から回収され得る。

産業上の用途
本発明のα−アミラーゼ変異体は、種々の産業上の用途を可能にする価値ある性質を有する。特に、本発明の酵素変異体は、洗濯、皿洗い及び硬質表面清浄洗剤組成物における成分として適用できる。

変更された性質を有する本発明の変異体は、澱粉加工、特に澱粉転換、特に澱粉の液化のために使用され得る（例えば、アメリカ特許第3,912,590号、ヨーロッパ特許出願第252730号及び第63909号、WO99/19467号及びWO96/28567号を参照のこと；すべての引例は引用により本明細書に組み込まれる）。本発明の変異体の他に、またグルコアミラーゼ、プルラナーゼ及び他のα−アミラーゼを含んで成る、澱粉転換目的のための組成物がまた、企画される。

さらに、本発明の変異体はまた、甘味剤及びエタノール（例えば、引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第5,231,017号を参照のこと）、例えば燃料、飲料用及び産業用エタノールの澱粉又は完全な穀物からの生成において、特に有用である。
本発明の変異体はまた織物、布及び衣料品の糊抜き（引用により本明細書に組み込まれる、WO95/21247号、アメリカ特許第4,643,736号、EP119,920号を参照のこと）、ビール製造又は醸造、パルプ及び紙の製造、及び飼料及び食品の製造のためにも有用である。

澱粉転換：
従来の澱粉転換工程、例えば液化及び糖化工程は、例えばアメリカ特許第3,912,590号及びヨーロッパ特許公開第252,730号及び第63,909号（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
１つの態様においては、澱粉を、低分子量炭水化物成分、例えば糖又は脂肪置換体に分解する澱粉転換方法は、枝切り段階を包含する。

澱粉の糖への転換：
澱粉を糖に転換する場合、澱粉は、解重合される。そのような解重合方法は、前処理段階、及び２又は３種の連続した処理段階、すなわち液化工程、糖化工程、及び所望する最終生成物に依存して、任意には異性化工程から成る。

天然澱粉の前処理：
天然澱粉は、室温で水に不溶性である微粒質物から成る。水性澱粉スラリーが加熱される場合、粒質物は膨潤し、そして最終的に破壊し、澱粉分子を溶液中に分散する。この“ゲル化”工程の間、粘度の劇的な上昇がある。固形レベルは典型的な産業工程において30〜40％であるので、澱粉は、取り扱われ得るよう、希薄化されるか、又は“液化”される。この粘度の低下は、今日ほとんど、酵素分解により得られる。

液化：
液化段階の間、長鎖澱粉は、枝分れされ、且つ線状の短鎖単離（マルトデキストリン）に、α−アミラーゼにより分解される。液化工程は、105〜110℃で５〜10分、続いて95℃で１〜２時間、行われる。pHは、5.5〜6.2である。それらの条件下で最適な酵素安定性を確保するために、1mMのカルシウムが添加される（40ppmの遊離カルシウムイオン）。この処理の後、液化された澱粉は、10〜15の“デキストロース当量”（DE）を有するであろう。

糖化：
液化工程の後、マルトデキストリンが、グルコアミラーゼ（例えば、AMG）及び枝切り酵素、例えばイソアミラーゼ（アメリカ特許第4,335,208号）又はプルラナーゼ（例えば、Promozyme^TM）（アメリカ特許第4,560,651号）の添加により、デキストロースに転換される。この段階の前、pHが、枝切り酵素により適切に加水分解され得ない、“パノース前駆体”と呼ばれる短いオリゴ糖の形成を低めるために、液化α−アミラーゼを不活性化するために、高温（95℃以上）を維持しながら、4.5以下の値に低められる。

温度が60℃に低められ、そしてグルコアミラーゼ及び枝切り酵素が添加される。糖化工程は、24〜72時間、進行する。
通常、液化段階の後、α−アミラーゼを変性する場合、約0.2〜0.5％の糖化生成物が、プルラナーゼにより分解され得ない枝分れ鎖の三糖6²＝α−グルコシルマルトース（パノース）である。液化段階からの活性アミラーゼが糖化の間、存在する（すなわち、変性がない）場合、このレベルは、１〜２％ほどの高さであり、これは、糖化の収率を有意に低めるので、所望されない。

異性化：
所望する最終糖生成物が例えば、高フルクトースシロップである場合、デキストロースシロップがフルクトースに転換され得る。糖化工程の後、pHが、６〜８の範囲、好ましくは7.5の値に高められ、そしてカルシウムがイオン交換体により除去される。次に、デキストロースシロップが、例えば固定されたグルコースイソメラーゼ（例えば、Sweetzyme^TM IT）を用いて、高フルクトースシロップに転換される。

エタノール生成：
一般的に、完全穀物からのアルコール生成（エタノール）は、次の４種の段階に分離され得る：
−微粉砕
−液化
−糖化
−発酵

微粉砕：
穀物が、構造体を開放するために微粉砕され、そしてさらなる加工を可能にされる。２種の工程、すなわち湿式又は乾式微粉砕が使用される。乾式微粉砕においては、完全穀粒が微粉砕され、そして工程の残る部分に使用される。湿式微粉砕は、胚及び粗びき粉（澱粉粒質物及びタンパク質）の非常に良好な分離を与え、そしてシロップの同時生成が存在する位置で適用される少数の例外が伴う。

液化：
液化工程においては、澱粉粒質物が、加水分解により、４よりも高いDPのマルトデキストリンに溶解される。加水分解は、酵素処理により、又はα−アミラーゼにより酵素的に実施され得る。酸加水分解は、制限される基礎に基づいて使用される。原料は、微粉砕された完全穀物か、又は澱粉加工からの副流であり得る。

酵素的液化は典型的には、３段階温スラリー工程として実施される。スラリーが60〜95℃、好ましくは80〜85℃に加熱され、そして酵素が添加される。次にスラリーが95〜140℃、好ましくは105〜125℃でジェット煮沸され、60〜95℃に冷却され、そして追加の酵素が添加され、最終加水分解が得られる。液化工程が、pH4.5〜6.5、典型的にはpH５〜６で実施される。微粉砕され、そして液化された穀物はまた、マッシュとしても知られている。

糖化：
酵母により代謝され得る低分子量糖DP_1-3を生成するために、液化からのマルトデキストリンがさらに加水分解されるべきである。加水分解は典型的には、グルコアミラーゼにより酵素的に行われ、他方では、α−グルコシダーゼ又は酸性α−アミラーゼが使用され得る。十分な糖化段階は72時間まで続くことができるが、しかしながら、典型的には40〜90分の予備−糖化、及び次に、発酵（SSF）の間、完全な糖化が通常行われる。糖化は典型的には、30〜65℃、典型的には約60℃、及びpH4.5で行われる。

発酵：
典型的には、サッカロミセスspp. からの酵母がマッシュに添加され、そして発酵が、24〜96時間、例えば、典型的には、35〜60時間、進行する。温度は、26〜34℃、典型的には約32℃であり、そしてpHは３〜６、好ましくは約４〜５である。
最も広く使用される方法は、糖化のための保持段階が存在しない、同時糖化及び発酵（SSF）方法であり、これは、酵母及び酵素が一緒に添加されることを意味することを注意すること。SSFを行う場合、発酵の直前、50℃以上の温度で予備−糖化段階を行うことが通常である。

蒸留：
発酵に続いて、マッシュが蒸留され、エタノールが抽出される。本発明の方法により得られるエタノールは、例えば燃料エタノール；飲料エタノール、すなわち飲料に適した中性スピリット；又は産業用エタノールとして使用され得る。

副生成物：
発酵からの残存物は、液体形又は乾燥形のいずれかで動物飼料のために典型的には使用される穀粒である。
液化、糖化、酵素、蒸留及びエタノールの回収をいかにして実施するかのさらなる詳細は、当業者に良く知られている。
本発明の方法によれば、糖化及び発酵は、同時に又は別々に行われ得る。

パルプ及び紙製造：
本発明のアルカリα−アミラーゼはまた、澱粉教化された故紙及び厚紙からのリグノセルロース材料、例えばパルプ、紙及び厚紙の製造にも使用され、特にここで再パルプ化が７以上のpHで生じ、そしてアミラーゼが前記強化澱粉の分解を通して廃棄材料の砕解を促進することができる。本発明のα−アミラーゼは、澱粉−被覆された印刷紙から紙製造パルプを製造する工程において特に有用である。それらの工程は、次の段階：
ａ）パルプを製造するために紙を砕解し、
ｂ）段階ａ）の前、その間又はその後、澱粉−分解酵素により処理し、そして
ｃ）段階ａ）及びｂ）の後、パルプからインキ粒子を分解することを含んで成る、WO95/14807号に記載のようにして行われ得る。

本発明のα−アミラーゼはまた、澱粉の変性において非常に有用であり、ここで酵素的に変性された澱粉が、アルカリ充填剤、例えば炭酸カルシウム、カオリン及びクレーと共に、紙製造に使用される。本発明のアルカリα−アミラーゼにより、前記充填剤の存在下で澱粉を変性することが可能になり、従って、より単純な統合された工程を可能にする。

織物、布及び衣料品の糊抜き：
本発明のα−アミラーゼはまた、織物、布又は衣料品の糊抜きにおいて非常に有用である。織物加工産業においては、α−アミラーゼは、製織の間、よこ糸上で保護被膜として作用する澱粉−含有糊剤の除去を促進するための糊抜き工程においても助剤として従来使用されて来た。製織の後、糊剤被膜の完全な除去は、布が精練され、漂白され、そして染色される続く工程において最適な結果を確保するのに重要である。酵素による澱粉の分解は、それが、繊維材料に対していずれの有害な効果も包含しないので好ましい。

加工費用を減じ、そしてミル処理を高めるために、糊抜き加工は時々、精練及漂白段階と組合される。そのような場合、非酵素助剤、例えばアルカリ又は酸化剤が、従来のα−アミラーゼは高いpHレベル及び漂白剤とほとんど適合できないので、澱粉を分解するために、典型的には使用される。澱粉糊剤の非酵素分解は、かなりの攻撃的な科学物質が使用されるので、いくらかの繊維損傷を導く。従って、本発明のα−アミラーゼはアルカリ溶液において改良された性能を有するので、それらを使用することが所望される。α−アミラーゼは、セルロース含有布又は織物を糊抜きする場合、単独でセルロースと組合して使用され得る。

糊抜き及び漂白工程は、当業界において良く知られている。例えば、そのような工程は、WO95/21247号、アメリカ特許第4,643,736号、ヨーロッパ特許第119,920号（それらは引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
糊抜きのための市販の製品は、Novo Hordisk A/SからのAquazyme（商標）及びAquazyme（商標）Ultraを包含する。

ビール醸造：
本発明のα−アミラーゼはまた、ビール醸造工程において非常に有用であり；前記α−アミラーゼは典型的には、マッシュ工程の間に添加されるであろう。

洗剤組成物：
本発明の酵素は洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。

特定の観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る洗剤添加剤を提供する。前記洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、もう１つの澱粉分解性酵素、例えばα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトゲン性アミラーゼ、CGTアーゼ及び/又はセルラーゼ、マンナナーゼ（例えば、Novozymes, DenmarkからのMANNAWAY^TM）、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼ及び/又はラッカーゼを含んで成ることができる。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり（すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性）、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。

プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に修飾された、又はタンパク質構築された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO89/06279号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270号及びWO94/25583号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。

有用なプロテアーゼの例は、WO92/19729号、WO98/20115号、WO98/20116号及びWO98/34946号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：27, 35, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235及び274。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Alcalase^TM, Savinase^TM, Primase^TM, Duralase^TM, Esperase^TM及びKannase^TM (Novo Nordisk A/S), Maxatase^TM, Maxacal^TM, Maxapem^TM, Properase^TM, Purafect^TM, Purafect OxP^TM, FN2^TM及びFN3^TM (Genencor International Inc.) を包含する。

リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ（別名、サーモミセス）、例えばヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載のようなヒューミコラ・ラウギノサ（T.ラウギノサ）、又はWO96/13580号に記載のようなヒューミコラ・インソレンス、P.アルカリゲネス又はP.プソイドアルカリゲネス（ヨーロッパ特許第218272号）、P.セパシア（ヨーロッパ特許第331376号）、P.スツゼリ（P.stutzeri）(イギリス特許第1,372,034号)、P.フルオレセンス、プソイドモナスsp. SD705株（WO75/06720号及びWO96/27002号）、P.ウイスコンシネンシス（WO96/12012号）からのリパーゼ、バチルスリーパーゼ、例えばB.スブチリス（Dartoisなど. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、B. ステアロサーモフィラス（日本特許64/744992）又はB.プミラス（WO91/16422号）からのリーパーゼを包含する。

他の例は、リパーゼ変異体、例えばWO92/05249号、WO94/01541号、ヨーロッパ特許第407225号、ヨーロッパ特許第206105号、WO95/35381号、WO96/00292号、WO95/30744号、WO94/25576号、WO95/14783号、WO95/22615号、WO97/04079号及びWO97/0720号に記載されるものを包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、Lipolase^TM 及びLipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S) を包含する。

アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α−及び/又はβ）は、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。アミラーゼは、バチルス、例えばイギリス特許第1,296,839号により詳細に記載される、B.リケニルホルミスの特許株から得られるα−アミラーゼを包含する。有用なアミラーゼの例は、WO94/02597号、WO94/18314号、WO96/23873号及びWO/43424号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408及び444。

市販のアミラーゼは、DURAMYL^TM, LIQUEZYME^TM TERMAMYL^TM, NATALASE^TM, SUPRAMYL^TM, STAINZYME^TM, FUNGAMYL^TM and BAN^TM (Novozymes A/S), RAPIDASE^TM , PURASTAR^TM 及び PURASTAR OXAM^TM (Genencor International Inc.からの)である。

セルラーゼ：適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、バチルス、ヒューミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属からのセルラーゼ、例えばアメリカ特許第4,435,307号、アメリカ特許第5,648,263号、アメリカ特許第5,691,178号、アメリカ特許第5,776,757号及びWO89/09259号に開示されるヒューミコラ・インソレンス、マイセリオプソラ・サーモフィラ/オキシスポラムから生成される菌類セルラーゼを包含する。

特に適切なセルラーゼは、色彩保護有益性を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許第0495257号、ヨーロッパ特許第0531372号、WO96/11262号、WO96/29397号、WO98/08940号に記載されるセルラーゼである。例の例は、WO94/07998号、ヨーロッパ特許第0531315号、アメリカ特許第5,457,046号、アメリカ特許第5,685,593号、アメリカ特許第5,763,254号、WO95/24471号、WO98/12307号及びPCT/DK98/0299号に記載されるそれらのものである。
市販のセルラーゼは、Celluzyme^TM 及びCarezyme^TM (Novo Nordisk A/S), Clazinase^TM 及びPuradex HA^TM (Genencor International Inc.) 及びKAC−500 (B)^TM (Kao Corporation) を包含する。

ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリナス、例えばコプリナス・シネレウス、及びWO93/24618 号、WO95/10602号及びWO98/15257号に記載されるそれらのようなそれらの変異体からのペルオキシダーゼを包含する。
市販のペルオキシダーゼは、Guardzyme^TM (Novo Nordisk A/S) を包含する。

洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加剤を添加することにより、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤又は組合された添加剤が、例えば粒質物、液体、スラリー、等として配合され得る。好ましくは洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非−ダスチング粒質物、液体、特に安定された液体又はスラリーである。

非−ダスチング粒質物は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号に開示のようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。蝋被覆材料の例は、1000〜20,000の平均モル重量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50の酸化エチレン単位を有する、エトキシル化されたノニルフェノール；12〜20個の炭素原子を有するアルコールを有し、そして15〜80の酸化エチレン単位を有する、エトキシ化された脂肪アルコール；脂肪アルコール、脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。例えば、液体酵素調製物は、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、硫酸又は硼酸を添加することによって、安定化される。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示される方法に従って調製され得る。

本発明の洗剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体の形で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る１又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。

そこに含まれる場合、洗剤は通常、約１％〜約40％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪酸スルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。

そこに含まれる場合、界面活性剤は通常、約0.2％〜約40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体（“グルコサミド”）を含むであろう。

洗剤は、０〜65％の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート（例えばHoechstからのSKS−６）を含むことができる。

洗剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−N−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。

洗剤は、H₂O₂源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。

本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。

洗剤はまた、他の従来の洗剤組成物、例えば布コンディショナー、例えばクレー、泡増強剤、石鹸泡抑制剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、抗−土壌再沈着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇りインヒビター、又は香料を含むことができる。

洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体１L当たり0.001−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体１L当たり0.005−5mgの酵素タンパク質、より好ましくは洗浄液体１L当たり0.01−1mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体１L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
本発明の酵素はさらに、WO97/07202号（引例として本明細書組み込まれる）に開示される洗剤配合物に導入され得る。

皿洗い洗剤組成物：
本発明の酵素はまた、次のものを包含する皿洗い洗剤組成物にも使用され得る：

12）前記1), 2), 3), 4), 6) 及び10) に記載されるような自動皿洗い組成物であるが、過硼酸塩が過酸酸塩により置換されている。
13）マンガン触媒をさらに含む１）−６）に記載されるような自動皿洗い組成物。前記マンガン触媒は、例えば“Efficient manganese catalysts for low-temporature bleaching”、Nature 369, 1994, pp.637-639に記載される化合物の１つであり得る。

材料及び方法：
酵素：
SP722：配列番号４；Novozymesから入手でき、そしてWO95/26397号に開示される。
AA560：配列番号12；WO00/60060号に開示され、そしてNovozymes A/Sから入手できる；デンマーク特許出願第PA1999/00490号に開示される；DSMZに1999年１月25日に寄託され、そしてDSMZ12649を付与された。AA560は、Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig DEに、特許手続のために、微生物寄託の国際認識に基づいてブタベスト条約下で寄託された。
AX379：Novozymesから入手できる。
バチルス・サブチリスSHA273：WO95/10603号を参照のこと。

プラスミド：
pJE1は、SP722α−アミラーゼ（配列番号４）、すなわち成熟タンパク質におけるアミノ酸D183-G184に対応する６個のヌクレオチドの欠失の変異体をコードする遺伝子を含む。JE1遺伝子の転写は、amyLプロモーターから指図される。プラスミドはさらに、複製の起点、及びプラスミドpUB110（Gryczan, TJ など. (1978), J. Bact. 134:318-329）から得られた、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するCat−遺伝子を含む。

pDN1528は、テルマミルamyLをコードする完全遺伝子を含み、その発現は、それ自身のプロモーターにより指図される。さらに、プラスミドは、プラスミドpUB110からの複製の起点ori, 及びクロラムフェニコールに対する耐性を付与するプラスミドpC194からのcat遺伝子を含む。pDN1528は、WO96/23874の図９に示される。

方法：
一般的な分子生物学方法：
特にことわらない限り、DNA操作及び形質転換は、分子生物学の標準方法（Sambrook など. (1989); Ausubel など. (1995); Harwood and Cutting (1990)）を用いて、行われた。

モデル構築：
タンパク質構造データベース、例えば"The Protein Data Bank (PDB) (<http://www.pdb.bnl.gov/> )" 又は "The Brookhaven databank at Brookhaven National Laboratory, US"は、モデルが構築される、問題の分子に類似するタンパク質についての調査である。アミノ酸配列が、構造的に保存された領域を考慮しながら、一列整列され、そして座標が対象タンパク質に対して対照タンパク質からコピーされる。挿入及び欠失を有する領域の座標が、類似するアミノ酸配列を有する他のタンパク質から、又はほとんどの3Dソフトウェアパッケージ、例えばBiosym, MSIからのHomologyに見出されるランダム構造ジェネレーター機能を用いることにより、割り当てられる。

座標が対照タンパク質のすべてのアミノ酸に割り当てられ、そしてフラグメントがBiosym, MSIからのDiscoverプログラムにおけるコマンドEND REPAIR及びSPLICE REPAIRにより一緒に連結される場合、モデルは改良される。モデルのエネルギーは、まず分子を緩和することにより最少化され（DiscoverプログラムにおけるRELAXコマンド）、そして次に、分子力学により最少化される。
参照は、相同性構築ソフトフェア、例えばBiosym, MSIからのHomologyのマニュアルに見出され得る。

興味ある領域を得るための方法：
３種の既知の3D構造の細菌α−アミラーゼが存在する。２種のB. リケニルホルミスα−アミラーゼ、すなわちBrookhavenデータベースIBPL（Machius など. (1995), J. MoI. Biol. 246, p. 545-559）、及びIVJS（Song など. (1996), Enzymes for Carbohydrate 163 Engineering (Prog. Biotechnol. V 12)）が存在する。それらの２種の構造体は、２個のカルシウムイオン及び１つのナトリウムイオン結合部位近くの領域における、いわゆるB−ドメインからの構造体の重要部分を欠いている。

完全なB−ドメイン、及び従って、A及びBドメイン間に金属イオンを含む、公開されているBAN^TM（配列番号５）とB. リケニホルミスα−アミラーゼ（配列番号４）との間のハイブリッドである、α−アミラーゼBA2（WO96/23874号）の3D構造体がまた存在する。さらに、B. ステアロサーモフィラスからのα−アミラーゼの主要部分の構造体は、Suedにより公開されており、そしてアルカリα−アミラーゼSP722の構造体は、WO01/66712号に提供されている。

所定のα−アミラーゼの最良モデルを構築するために、接近した相同性の構造体が選択され、すなわちB. リケニホルミスα−アミラーゼの良好なモデルが、B. アミロリケファシエンスα−アミラーゼの良好なモデルである、BA2の構造に基づいて良好に構築され、そしてAA560、SP707, SP7-7及びKSM-AP1378のようなアルカリα−アミラーゼがSP722α−アミラーゼの構造に基づいて最良に構築される。

SP722三次構造からのAA560の相同構築：
SP722（配列番号４）に対するAA560α−アミラーゼ（配列番号12）の全体的な相同性は、上記に記載されるように約87％である。AA560及びSP722の配列の一列整列は、図１に見出され得る挿入又は欠失が存在しない位置を示す。
AA560α−アミラーゼの三次構造体は、“材料及び方法”のセクションに記載される方法“モデル構築”を用いて、付録１に開示される構造に基づいて構築されたモデルであった。

SP722の構造は、BIOSYM, MSIからのUNIX（登録商標）ワークステーション実施のInsight and Homologyソフトウェアに基づいて示されている。アミノ酸配列が一列整列され、そして整列されたSP722が、AA560アミノ酸に割り当てられた。SP722構造体に欠失する、AA560における最初の４個のアミノ酸の座標か、“END REPAIR”関数により割り当てられた。

AA560モデルが、“RELAX”コマンドを用いて、アミノ酸側鎖変化を、まず緩和し、そして次に、3Dモデルのエネルギーを最少にするために分子力学を実施することにより改良された。Insight95, MSIからのデフォールトパラメーターが、両緩和分子力学のために選択された。

α−アミラーゼ変異体の発酵及び精製：
発酵及び精製は、当業界において良く知られている方法により実施され得る。
α−アミラーゼ及び変異体の発酵：
発酵は、当業界において知られている方法により、又は次の通りに行われ得る。
適切なの発現プラスミドを有するB. スブチリス株を、適切な抗生物質を含むLB−寒天プレート上に画線培養し、そして37℃で一晩増殖せしめる。コロニーを、適切な抗生物質により補充された、500mlの振盪フラスコにおける100mlのBPX培地上に移す。

BPX培地の組成：
ジャガイモ澱粉 100g/l
大麦粉末 50g/l
BAN 5000 SKB 0.1g/l
カゼイン酸ナトリウム 10g/l
大豆ミール 20g/l
Na₂HPO₄・12H₂O 9g/l
Pluronic^TM 0.1g/l

培養物を37℃で、4〜5日間、270rpmで振盪する。
細胞及び細胞残骸を、4500rpmでの20〜25分間遠心分離により発酵ブイヨンから除去する。その後、上清液を濾過し、完全に透明な溶液を得た。濾液を濃縮し、そしてUF−フィルター（1000のカットオフ膜）上で洗浄し、そして緩衝液を20mMの酢酸塩（pH5.5）に変える。UF−濾液を、S−Sepharose F.F. 上に適用し、そして溶出を、同じ緩衝液中、0.2MのNaCl溶液による段階的溶出により実施する。溶出物を10mMのトリス（pH9.0）に対して透析し、そしてQ−Sepharose F.F. 上に適用し、そして6カラム体積にわたって0〜0.3MのNaClの線状グラジエントにより溶出する。活性（Phadebas アッセイにより測定される）を含む画分をプールし、pHを7.5に調節し、そして残存する色を、0.5％（w/v）の活性炭による5分間の処理により除去する。

安定性の決定：
アミラーゼ安定性を、次のような方法を用いて測定する：
酵素を適切な条件下でインキュベートした。サンプルを、0, 5, 10, 15及び30分で採取し、そしてアッセイ緩衝液（50mMのBritton 緩衝液、pH7.3）により25倍に希釈し（すべての採取されたサンプルに関しては同じ希釈度）、そして活性を、標準条件（pH7.3，37℃）下で、Phadebasアッセイ（Pharmacia）を用いて測定した。
インキュベーションの前に測定される活性（0分）を、対照（100％）として使用した。％低下を、インキュベーション時間の関数として計算した。表は、例えば30分のインキュベーションの後の残留活性を示す。

カルシウム−及びpH−依存安定性の測定：
通常、産業用液化工程は、95℃〜105℃での安定性を改良するために、液化pHとして6.0〜6.2のpHを用い、そして40ppmの遊離カルシウムの添加を伴って運転している。本明細書で提案された置換のいくつかは、
1．6.2よりも低いpHで、及び/又は
2．40ppmの遊離カルシウムよりも低い遊離カルシウムレベルで、安定性を改良するために行われてきた。
下記2種の異なった方法が、問題のα−アミラーゼにおける異なった置換により得られる安定性の変更を測定するための使用された：

方法1：5ppmの遊離カルシウムの存在下で、低められたpH、すなわちpH5.0での安定性を測定する1つのアッセイ。10μgの変異体を次の条件下でインキュベートした：5ppmのカルシウム及び5％（w/v）の通常のコーンスターチ（カルシウムを含まない）を含む、pH5.0に調節された0.1Mの酢酸塩溶液。インキュベーションを95℃で30分間、水浴において行った。

方法2：遊離カルシウムの不在下で安定性を測定し、そしてpHが6.0で維持されているアッセイ。このアッセイはカルシウム感受性の低下を測定する：10μgの変異体を次の条件下でインキュベートした：5％（w/v）通常のコーンスターチ（カルシウムを含まない）を含む、pHを6.0に調節された0.1Mの酢酸塩溶液。インキュベーションを95℃で30分間、水浴において行った。

α−アミラーゼ活性についてのアッセイ：
１．Phadebasアッセイ：
α−アミラーゼ活性を基質としてPhadebas（商標）錠剤を用いての方法により決定する。Phadebas 錠剤（Pharmacia Diagnostic から供給されるPhadebas（商標）Amylase Test）は、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と共に混合され、そして錠剤化された、架橋された不溶性の青色澱粉ポリマーを含む。

1回の測定ごとに、1つの錠剤を、5mLの50mMのBritton−Robinson 緩衝液（50mMの酢酸、50mMのリン酸、50mMの硼酸、0.1mMのCaCl₂；NaOHにより興味ある値に調節されているpH）を含む管において懸濁する。試験を、興味ある温度で、水浴において行う。試験されるα−アミラーゼを、5mlの50mMのBritton−Robinson 緩衝液により希釈する。このα−アミラーゼ溶液1mlを、5mlの50mMのBritton −Robinson 緩衝液に添加する。澱粉をα−アミラーゼにより加水分解し、可溶性の青色フラグメントを付与する。620nmで分光光学的に測定される前記の得られる青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活性の関数である。

10分又は15分のインキュベーション（試験時間）の後の測定された620nmでの吸光度は、620nm での0.2〜2.0の吸光度単位の範囲に存在することが重要である。この吸光度範囲においては、活性と吸光度との間に直線性が存在する（Lambert−Beer 法則）。従って、酵素の希釈は、この基準を満たすために調節されるべきである。特定された組の条件（温度、pH、反応時間、緩衝条件）下で、1mgの与えられたα−アミラーゼが一定の量の基質を加水分解し、そして青色が生成されるであろう。色の強度を620nm で測定する。測定された吸光度は、与えられた組の条件下で、問題のα−アミラーゼの比活性（純粋なα−アミラーゼタンパク質1mg当たりの活性）に直接的に比例する。

２．他の方法：
α−アミラーゼ活性を、PNP−G7基質を用いての方法により決定する。P-ニトロフェニル−α、D−マルトペプタオシドの略語であるPNP−G7は、エンド−アミラーゼにより分解され得る、ブロックされたオリゴ糖である。分解に続いて、キットに包含されるα−グルコシダーゼは、基質を消化し、黄色の色彩を有する遊離PNP分子を放し、そして従って、λ＝405nm（400−420nm）で可視分光側光により測定され得る。PNP−G7基質及びα−グルコシダーゼを含むキットは、Boehringer−Mannheimにより製造される（カタログ番号1054635）。

基質を調製するために、基質（BM1442309号）の１つのボトルを、5mlの緩衝液（BM1442309号）に添加する。α−グルコシダーゼを調製するために、α−グルコシダーゼ（BM第1462309号）の１つのボトルを、緩衝液（BM1442309号）45mlに添加する。使用溶液を、基質1mlと共にα−グルコシダーゼ溶液5mlを混合することによって製造する。
アッセイを、酵素溶液20μlを、96ウェルをマイクロタイターに移し、そして25℃でインキュベートすることによって行う。使用液200μlを、20℃で添加する。その溶液を混合し、そして１分間、プレインキュベートし、そして吸光度を15秒ごとに３分間、OD405nmで測定する。

時間依存性吸光度曲線の傾斜は、問題のα−アミラーゼの比活性（酵素当たりの活性）に、所定組の条件下で直接的に比例する。

比活性の決定：
比活性が、上記方法の１つを用いて、活性/mg酵素として決定される。製造指針は次の通りである（また下記、“α−アミラーゼ活性についてのアッセイ”を参照のこと）。

酸化安定性の決定：
本発明の種々の変異体を有する、濾過された原培養ブイヨンが、pH9.0での50mMのBrithon−Robinson緩衝液において、100KNU/mlのアミラーゼ活性（上記に定義される）に希釈され、そして40℃でインキュベートされる。続いて、H₂O₂が添加され、200mMの濃度が得られ、そしてpH値が9.0に再調節される。活性が、15秒後、及び5、15及び30分後、サンプルを採取し、そして氷冷却された水により５倍に希釈し、そしてそれらを氷上に貯蔵することにより測定される。従って、残る活性が、上記に記載されるPhadebas方法を用いて測定され、ここで620nmで分光学的に測定される、得られる青色溶液の吸光度が、α−アミラーゼ活性の関数である。5、15及び30分後の活性が、15秒後の活性に比較して、計算され、安定性が決定される。

洗浄性能：
洗浄性能が、問題のα−アミラーゼ変異体を有する洗剤に依存して、３〜５g/lの用量の種々の洗剤溶液（材料セクションを参照のこと）において、それぞれ、25℃及び40℃で15及び30分間；９〜10.5の範囲のpHで；６〜15°dHの範囲の硬度で；２：１〜４：１のCa：Mg比で汚された試験スワッチを洗浄することにより評価される。

組換えα−アミラーゼ変異体が、例えば0.01〜5mg/lの濃度で、洗剤溶液に添加される。試験スワッチが、オレンジ色の米澱粉により汚された（CS−28スワッチは、CFT, Center for Test Material, Hollandから入手できる）。
洗浄の後、スワッチが、Elrepho Remission Spectrophotometerを用いて、460nmでの規約反射率を測定することにより評価される。結果は、Δ＝α−アミラーゼにより洗浄されたスワッチの規約反射率−α−アミラーゼを伴わないで同じ条件下で洗浄されたスワッチの規約反射率として表される。

例１：AA560（配列番号12）の変異体の構成：
配列番号12で表されるAA560α−アミラーゼをコードする遺伝子は、プラスミドpTVB223に位置している。アミラーゼを、バチルス・サブチリスにおけるこの構造体におけるamyLプロモーターから発現する。
M202L突然変異を有する本発明の変異体を、Sarkar and Sommer, (1990), BioTechniques 8: 404-407に記載のようにして、メガ−プライマー方法により構成した。M202Lを有するAX379アミラーゼをコードする、得られるプラスミドを、pCA202−AX379と命名した。
本発明のほかの変異体の構成を、類似する態様で実施した。

例２：洗浄における活性の決定：
アミラーゼ変異体を、活性試験において、対照（表における最初の行）として使用される、それぞれアミラーゼAX379又はAX413において、従来の方法を用いて構成した。AX413変異体は、下記表に示されるように、突然変異を導入することにより、A379から誘導される。

活性を、40℃での類似するヨーロッパ洗浄における洗剤溶液において測定した。4g/lの洗剤溶液5ml当たりの１つのPhadebas錠剤の懸濁液を製造し、そしてエペンドーフ管中に、攪拌下で充填した。40℃での５分間の予備−加熱の後、アミラーゼ酵素を添加し、そしてその混合物を、激しく振盪しながら20分間インキュベートした。反応を、10％の1MのNaOHの添加により停止し、そして管を、10000×gで3分間、回転した。最終的に、650nmでの吸光度を、ブラインドとして非酵素サンプルを用いて、上清液について測定する。

例３：皿洗い間の安定性の決定：
アミラーゼ変異体を、活性試験において、対照（表における最初の行）として使用される、それぞれアミラーゼAX379又はAX413において、従来の方法を用いて構成した。AX413変異体は、下記表に示されるように、突然変異を導入することにより、A379から誘導される。

アミラーゼ安定性を、自動皿洗いの間、4g/lの洗剤中、約0.1mg/mlのアミラーゼを、40℃で18時間インキュベートすることにより測定した。インキュベーションを、９体積の冷（5℃以下）水の添加により、停止し、そして氷上で貯蔵した。１時間で、活性を、Phadebasアミラーゼキットを用いて測定し、そして洗剤サンプルにおける活性を、洗剤において同じ期間インキュベートされた（但し、氷上ではない）サンプルに比較した。

例４：
配列番号12のアミラーゼ変異体を、例１に記載のようにして構成し、そして富化培地を用いて、振盪フラスコにおいて発酵した。上清液から、アミラーゼ変異体タンパク質を、標準精製方法を用いて、90％以上の純度まで精製した。タンパク質濃度を、A280吸光度及び2.9ml/mg/cmの理論的延長係数から計算した。
G7-pNP活性アッセイを、アミラーゼサンプルの活性及び従って比活性（SA）を測定するために、“方法”下に記載のようにして使用し、すなわちmgアミラーゼタンパク質当たりのG7−pNP活性を計算し、そして相同対照アミラーゼに比較した。

例５：
洗浄試験を、40℃への一般的なヨーロッパ昇温プロフィールを20分間、適用する、ダウン−スケール洗濯機において、9g/l（Henkel）HDDの従来の洗剤、漂白剤及び0.2mgのアミラーゼタンパク質/Lを用いて行った。水の硬度は、Ca, Mg及びNaHCO₃により、16°dHに調節される。

洗浄性能を、アミラーゼを用いないで洗浄されたスワッチの白色度に対して、存在するアミラーゼを伴っての洗浄の後のスワッチの白色度を測定することにより、着色された米澱粉（CFTからのCS-28）を有する綿スワッチに対して評価した。白色度は、スワッチがライン上で一晩、乾燥された後、規約反射率分光計（Macbeth Color-Eye）を用いて測定される。

例６：
洗浄試験を、40℃への一般的なヨーロッパ昇温プロフィールを20分間、適用する、ダウン−スケール洗濯機において、6g/lのPersil Megaperls (Henkel)洗剤、及び0.2mgのアミラーゼタンパク質/Lを用いて行った。水の硬度は、Ca, Mg及びNaHCO₃により、16°dHに調節される。

図１−１は、13種の親テルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列の一列整列を表す。図１−２は、13種の親テルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列の一列整列を表す。図１−３は、13種の親テルマミル−様α−アミラーゼのアミノ酸配列の一列整列を表す。

Claims

親テルマミル−様α−アミラーゼの変異体であって、当該変異体が、下記の変異（１）〜（69）：
（１）K118Q+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K;
（２）K37T+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（３）H421Y+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（４）V450T+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（５）K383R+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（６）N445Q+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（７）Y178F+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（８）V318L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（９）W482Y+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（10）N283D+Q361E+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（11）M105F+M208F+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（12）M202L+M323T+M430I+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（13）K446R+N484Q+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（14）R444Y+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（15）N106D+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（16）Y203L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（17）G133E+Q361E+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（18）M323E+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（19）V214T+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（20）M202L+M323T+M309L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（21）M202L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（22）M202L+M323T＋D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（23）M202L+M323T+M9L+M382Y+K383R+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（24）M202L+M323T+M9L+M382Y+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（25）M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（26）T461P+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（27）Y298H+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（28）G133E+R444E+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（29）Y298F+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（30）M202T+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（31）M202I+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（32）M202V+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（33）Y295F+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（34）V214T+M323E+M382Y+K383R+N471E+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（35）Y178F+G258D+T419N+N437H+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（36）G149N+N150Q+M382Y+K383R+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（37）Y160F+V214T+M382Y+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（38）N128Y+G149A+V214T+D231N+M382Y+F441L+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（39）R82H+N128Y+G149A+V214T+M382Y+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（40）N150H+V214T+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（41）V214T+E345N+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（42）V214T+G305D+M382Y+R444E+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（43）V214T+M382Y+A447Y+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（44）M202I+V214T+M382Y+K383R+R444Y+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（45）V214T+G378K+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（46）V214T+A256K+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（47）R26S+D30N+N33D+V214T+M382Y+M202L+M323T+M9L+D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K；
（48）M202L+M9L+M323T；
（49）M202L+M9L+M323T+M382Y+K383R；
（50）M202L+M9L+S303Q+M323T+M382Y+K383R；
（51）M202L+M9L+V214T+M323T+M382Y；
（52）M202L+M9L+M323T+A339S+M382Y+K383R+N471E；
（53）M202L+M9L+V214T+M323T+A339S+N471E；
（54）M202L+V214T+G149H；
（55）M202L+V214T+E345R；
（56）M202L+V214T+G149A+M382Y；
（57）M202L+V214T+G149A+N299Y+T356I+M382Y；
（58）M202L+V214T+M382Y；
（59）M202L+V214T+G149A+K269S+N270Y+Y295F+A339S+E345R+N471E；
（60）M202L+V214T+A339S+N471E；
（61）M9L+M202I+M323T+V214T+Y295F+A339S+M382Y+K383R+N471E；
（62）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+G149A+A339S+E345R；
（63）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+G149A+V214I+A339S；
（64）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+N83S+G149A+A339S+E345R；
（65）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+G133K+G149A+A339S+E345R；
（66）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+I206F+A339S；
（67）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+G149A+A339S；
（68）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+G149A+V214V+K269S+N270Y+E345R+A339S；及び
（69）M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y+G149A+V214V+K269S+N270Y+A339S;
のいずれかを含み、ここで、各位置は、配列番号：12に示されるAA560のアミノ酸配列の位置に対応し、そして前記親α−アミラーゼは、配列番号：12に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有する、
ことを特徴とするα−アミラーゼの変異体。
前記変異体が、１又は複数の次の変異：
K118Q,
K37T,
H421Y,
V450T,
K383R,
N445Q,
Y178F,
V318L,
W482Y,
N283D+Q361E,
M105F+M208F,
M202L+M323T+M430I,
K446R+N484Q,
R444Y,
N106D,
Y203L,
G133E+Q361E,
M323E,
V214T,
M202L+M323T+M309L,
M202L,
M202L+M323T,
M202L+M323T+M9L+M382Y+K383R,
M202L+M323T+M9L+M382Y,
M202L+M323T+M9L
と組合せて、変異D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458Kを含んで成る、請求項１に記載の変異体。
前記変異体が、次の変異：
D183^*+G184^*+R118K+N195F+R320K+R458K+M202L+M323T+M9Lを含んで成る、請求項２に記載の変異体。
前記変異体がさらに、１又は複数の次の突然変異：
T461P,
Y298H,
G133E+R444E,
Y298F,
M202T,
M202I,
M202V,
V214T+M323E+M382Y+K383R+N471E,
Y178F+G258D+T419N+N437H,
G149N+N150Q+M382Y+K383R,
Y160F+V214T+M382Y,
N128Y+G149A+V214T+D231N+M382Y+F441L,
R82H+N128Y+G149A+V214T+M382Y,
N150H+V214T,
V214T+E345N,
V214T+G305D+M382Y+R444E,
V214T+M382Y+A447Y,
M202I+V214T+M382Y+K383R+R444Y,
V214T+G378K,
V214T+A256K,
R26S+D30N+N33D+V214T+M382Y
を含んで成る請求項３に記載の変異体。
前記親テルマミル−様α−アミラーゼが、配列番号：12に示されるアミノ酸配列のα−アミラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体。
前記親テルマミル−様α−アミラーゼが、少なくとも95％の配列番号12に対する同一性の程度を有するアミノ酸配列から成る請求項１〜５のいずれか１項記載の変異体。
配列番号12に対する同一性の程度が少なくとも97％である請求項６に記載の変異体。
配列番号12に対する同一性の程度が少なくとも99％である請求項７に記載の変異体。
前記親テルマミル−様α−アミラーゼが、高い緊縮条件下で、配列番号11の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされる請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体。
前記変異体が、前記親α−アミラーゼに対して、次の性質：洗剤の存在下での高い活性、洗剤の存在下での高い安定性、及び高い比活性、の少なくとも１つを有する請求項１〜９のいずれか１項記載の変異体。
前記洗剤の存在下での安定性が貯蔵安定性である、請求項10に記載の変異体。
請求項１〜11のいずれか１項記載のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体。
請求項12に記載のDNA構造体を担持する組換え発現ベクター。
請求項12に記載のDNA構造体又は請求項13に記載のベクターにより形成転換された細胞。
微生物である請求項14に記載の細胞。
前記微生物が細菌又は菌類である、請求項15に記載の細胞。
前記細菌がグラム陽性細菌である、請求項16に記載の細胞。
前記グラム陽性細菌が、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラクタス（Bacillus lautus）又はバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）である請求項17に記載の細胞。
請求項１〜11のいずれか１項記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る組成物。
請求項１〜11のいずれか1項記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る洗剤添加剤。
無粉塵性粒質物、安定化された溶液又は保護された酵素の形である、請求項20に記載の洗剤添加剤。
前記添加剤１ｇ当たり0.02〜200mgの酵素を含む請求項20又は21に記載の洗剤添加剤。
もう１つの酵素を含んで成る、請求項20〜22のいずれか１項に記載の洗剤添加剤。
前記もう１つの酵素が、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトゲン性アミラーゼ、CGTアーゼ、アミラーゼ又はもう１つのデンプン分解酵素、及び/又はセルラーゼである、請求項23に記載の洗剤添加剤。
前記デンプン分解酵素がグルコアミラーゼである、請求項24に記載の洗剤添加剤。
請求項１〜11のいずれか1項記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物。
もう1つの酵素を含んで成る、請求項26に記載の洗剤組成物。
前記もう１つの酵素が、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトゲン性アミラーゼ、CGTアーゼ、もう1つのデンプン分解酵素及び/又はセルラーゼである、請求項27に記載の洗剤組成物。
請求項１〜11のいずれか１項記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る手動又は自動皿洗い機用洗剤組成物。
もう1つの酵素を含んで成る、請求項29に記載の手動又は自動皿洗い機用洗剤組成物。
前記もう１つの酵素が、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトゲン性アミラーゼ、CGTアーゼ、アミラーゼ又はもう１つのデンプン分解酵素、及び/又はセルラーゼである、請求項30に記載の皿洗い機用洗剤組成物。
前記もう１つのデンプン分解酵素がグルコアミラーゼである、請求項31に記載の皿洗い機用洗剤組成物。
請求項１〜11のいずれか１項記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る手動又は自動洗濯用組成物。
もう1つの酵素を含んで成る、請求項33に記載の手動又は自動洗濯用組成物。
前記もう１つの酵素が、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトゲン性アミラーゼ、CGTアーゼ、アミラーゼ又はもう１つのデンプン分解酵素、及び/又はセルラーゼである、請求項34に記載の洗濯用組成物。
前記もう１つのデンプン分解酵素がグルコアミラーゼである、請求項35に記載の洗濯用組成物。
洗濯及び/又は皿洗いのためへの請求項１〜11のいずれか１項記載のα−アミラーゼ変異体又は請求項19〜36のいずれか1項に記載の組成物の使用。
織物糊抜きのためへの請求項１〜11のいずれか１項記載のα−アミラーゼ変異体又は請求項19〜36のいずれか１項に記載の組成物の使用。
澱粉液化のためへの請求項１〜11のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体又は請求項19〜36のいずれか１項に記載の組成物の使用。
請求項１〜11のいずれか１項記載の変異体の生成方法であって、請求項14〜18のいずれか１項に記載の細胞が、前記変異体の生成の助けとなる条件下で培養され、そして続いて、前記変異体が前記培養物から回収される方法。