BR112019015943A2

BR112019015943A2 - variantes de alfa-amilase

Info

Publication number: BR112019015943A2
Application number: BR112019015943A
Authority: BR
Inventors: Andersen Carsten; Ghadiyaram Chakshusmathi; Damager Iben; Venkatachalam Iyer Padma; Kulothungan SAINATHAN Rajendra
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2020-04-07
Also published as: MX2019008967A; JP2020506698A; WO2018141707A2; EP4276179A3; CN110382694B; JP2023071943A; US12071643B2; WO2018141707A3; DK3577219T3; DK3577219T5; CN110382694A; EP4276179A2; MX2023008937A; ES2963486T3; ZA201905673B; JP7242535B2; US20190345470A1; EP3577219A2; CA3046670A1; EP3577219B1

Abstract

a presente invenção refere-se a variantes de uma alfa-amilase genitora que têm um desempenho de lavagem melhorado em comparação à alfa-amilase genitora. a presente invenção também se refere a polinucleotídeos que codificam as variantes, construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, e um método de produção das variantes da presente invenção.

Description

“VARIANTES DE ALFA-AMILASE”

Referência a uma Listagem de Sequências [0001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada ao presente documento a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Área da Invenção [0002] Apresente invenção refere-se a variantes de uma alfaamilase, polinucleotídeos que codificam as variantes e métodos de produção das variantes.

Descrição da Técnica Relacionada [0003] As alfa-amilases (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolases, E.C. 3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas que catalisa a hidrólise de amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glucosídicos lineares e ramificados.

[0004] Há uma longa história de utilização industrial de alfaamilases em várias aplicações conhecidas como detergente, cozedura, fabricação de cerveja, liquefação e sacarificação de amido, por exemplo, na preparação de xaropes com elevado teor de frutose ou como parte da produção de etanol do amido. Essas e outras aplicações de alfa-amilases são conhecidas e utilizam alfa-amilases derivadas de microorganismos, em particular alfa-amilases bacterianas.

[0005] Entre as primeiras alfa-amilases bacterianas a serem usadas havia uma alfa-amilase de B. licheniformis, também conhecida como Termamyl, que foi extensivamente caracterizada e cuja estrutura de cristal foi determinada para essa enzima. Amilases alcalinas, tais como AA560, formam um grupo particular de alfa-amilases que têm sido usadas em

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2/121 detergentes. Muitas dessas amilases bacterianas conhecidas foram modificadas para melhorar a sua funcionalidade em uma aplicação particular.

[0006] Amilases de Bacillus, tais como Termamyl, AA560 (WO 2000/060060) e SP707 (descrita por Tsukamoto et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 151: 25-31) formam um grupo particular de alfaamilases que têm sido usadas em detergentes. Essas amilases foram modificadas para melhorar a estabilidade em detergentes. WO 96/23873, por exemplo, revela a deleção dos aminoácidos 181+182 ou dos aminoácidos 183+184 de SP707 (SEQ ID NO: 7 de WO 96/23873) para melhorar a estabilidade desta amilase. WO 96/23873 revela adicionalmente a modificação da amilase SP707 pela substituição de M202 com, por exemplo, uma leucina para estabilizar a molécula em relação a oxidação. Portanto, é conhecida a modificação de amilases para melhorar determinadas propriedades.

[0007] Por razões ambientais, tem sido cada vez mais importante baixar a temperatura em processos de lavagem de roupa, lavagem de louça e/ou limpeza. Contudo, a maior parte das enzimas incluindo amilases têm uma temperatura ótima que está acima da temperatura normalmente usada na lavagem a baixa temperatura. A alfaamilase é uma enzima chave para utilização em composições detergentes e a sua utilização tornou-se cada vez mais importante para a remoção de manchas de amido durante a lavagem de roupa ou de louça. Como tal, é importante encontrar variantes de alfa-amilase, que retêm o seu desempenho de lavagem, o efeito e/ou atividade de remoção de manchas quando a temperatura é reduzida. Contudo, apesar da eficácia das atuais composições de enzimas de detergentes, há muitas manchas que são difíceis de remover completamente. Esses problemas são intensificados pela

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3/121 maior utilização de baixas temperaturas de lavagem (por exemplo, água fria) e ciclos de lavagem mais curtos. Assim, é desejável ter enzimas amilolíticas que podem funcionar a baixa temperatura e ao mesmo tempo preservar ou aumentar outras propriedades desejáveis tais como atividade específica (atividade amilolítica), estabilidade e/ou desempenho de lavagem.

[0008] Portanto, é um objeto da presente invenção proporcionar variantes de alfa-amilase que poderíam ser usadas em processos de lavagem de roupa, lavagem de louça e/ou limpeza a uma baixa temperatura, tal como temperaturas de 5 a 40 °C. É um objeto adicional da presente invenção proporcionar variantes de alfa-amilase que têm um desempenho de lavagem melhorado a uma baixa temperatura em comparação à alfa-amilase genitora ou em comparação à alfa-amilase de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

Sumário da Invenção [0009] A presente invenção refere-se a uma variante de uma alfa-amilase genitora, em que a variante compreende (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondendo a 109, 1,7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem pelo menos 80, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a variante tem atividade de alfa-amilase.

[00010] A presente invenção também se refere a um polinucleotideo que codifica uma variante de acordo com a invenção, uma

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4/121 construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo que codifica a variante de acordo com a invenção, um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo que codifica a variante de acordo com a invenção e uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo que codifica a variante de acordo com a invenção.

[00011] A presente invenção também se refere a um método de produção de uma variante de alfa-amilase, compreendendo (a) cultivar a célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a expressão da variante, e (b) recuperação da variante.

[00012] A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de obtenção de uma variante de alfa-amilase, compreendendo introduzir em uma alfa-amilase genitora uma modificação em uma ou mais posições correspondendo a 109, 7, 1,391,280,284, 320 e 323 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, em que cada modificação é independentemente uma substituição ou deleção, e a variante tem atividade de alfa-amilase; e recuperar a variante. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00013] Apresente invenção refere-se a variantes de uma alfaamilase genitora, em que a variante compreende (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondendo a 109, 7, 1,391,280, 284, 320 e 323 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem pelo menos 80, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo

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5/121 menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a variante tem atividade de alfa-amilase.

[00014] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma variante de uma alfa-amilase genitora, em que a variante compreende (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondendo a posições selecionadas do grupo que consiste em 109, 1,7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo a posições selecionadas do grupo que consiste em 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem pelo menos 80, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a variante tem atividade de alfaamilase.

Definições [00015] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo em populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou pode codificar os polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[00016] O termo “alfa-amilase” (alfa-1 ,4-glucan-4-glucanohidrolase, E.C. 3.2.1.1) constitui um grupo de enzimas que catalisa a hidrólise

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6/121 de amido e outros oligo- e polissacarideos 1,4-glucosidicos lineares e ramificados. Para propósitos da presente invenção, a atividade de alfaamilase é determinada de acordo com o procedimento descrito na seção de Exemplos. Em um aspecto, as variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[00017] O termo “aminoácido”, como usado no presente documento, inclui os vinte aminoácidos geneticamente codificados padrão e seus estereoisômeros correspondentes na forma “d” (em comparação à forma natural “I”), aminoácidos ômega, outros aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos não convencionais (por exemplo, aminoácidos a, adissubstituídos, N-alquilaminoácidos, etc.) e aminoácidos quimicamente derivatizados. Derivados químicos de um ou mais aminoácidos podem ser obtidos por reação com um grupo lateral funcional. Tais moléculas derivatizadas incluem, por exemplo, as moléculas nas quais os grupos de amino livre foram derivatizados para formar cloridratos de amina, grupos ptoluenossulfonila, grupos carboxibenzoxi, grupos t-butiloxicarbonila, grupos cloroacetila ou grupos formila. Grupos de carboxila livre podem ser derivatizados para formar sais, ésteres metílicos e etílicos ou outros tipos de ésteres e hidrazidas. Grupos de hidroxila livre podem ser derivatizados para formar derivados de O-acila ou O-alquila. Também incluídos como derivados químicos são aqueles peptídeos que contêm derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo: 4hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina;

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7/121 homosserina pode ser substituída por serina e ornitina por lisina. Derivados também incluem peptídeos contendo uma ou mais adições ou deleções contanto que a atividade necessária seja mantida. Outras modificações incluídas sãoamidação, acilação de terminal amino (por exemplo, acetilação ou amidação de ácido tioglicólico), amidação de carboxila terminal (por exemplo, com amônia ou metilamina) e as modificações de terminais similares.

[00018] Quando um aminoácido está sendo especificamente indicado, tal como “alanina” ou “Ala” ou “A”, o termo se refere tanto a l-alanina como d-alanina salvo explicitamente mencionado de outro modo. Outros aminoácidos não convencionais podem ser também componentes apropriados para polipeptideos da presente invenção, contanto que a propriedade funcional desejada seja retida pelo polipeptídeo. Para os peptídeos mostrados, cada resíduo de aminoácido codificado, quando apropriado, é representado por uma designação de letra única, correspondendo ao nome trivial do aminoácido convencional. Em uma modalidade, os polipeptideos da invenção compreendem ou consistem em Iaminoácidos.

[00019] O termo “cDNA” designa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de RNAm madura, que sofre splicing, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não possui as sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor do RNAm que é processado através de uma série de etapas, incluindo splicing, antes de aparecer como RNAm que sofreu splicing maduro.

[00020] O termo “sequência codificante” significa um polinucleotideo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de

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8/121 uma variante. Os limites da sequência codificante são geralmente determinados por uma fase de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação, tal como ATG, GTG ou TTG, e termina com um códon de terminação, tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma combinação dos mesmos.

[00021] O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para a expressão de um polinucleotideo que codifica uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha (isto é, de um gene diferente) em relação ao polinucleotideo que codifica a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de propeptide o, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes para o propósito de introdução de sítios de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotideo que codifica uma variante.

[00022] Os termos “desempenho de lavagem aprimorado” ou “desempenho de lavagem melhorado” significam que a capacidade do polipeptídeo da invenção de fornecer um efeito de limpeza (por exemplo, remoção de manchas) em um processo de lavagem, tal como lavagem de roupa ou de louça, é melhorada em comparação àquela da alfa-amilase genitora de SEQ ID NO:1. O desempenho de lavagem pode ser determinado usando métodos bem conhecidos na técnica, tais como usando um ensaio de estresse mecânico automático (AMSA, do inglês “automatic mechanical stress assay”). Será reconhecido por especialistas na técnica que o

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9/121 desempenho de lavagem aprimorado pode ser alcançado sob apenas algumas ou talvez todas as condições de lavagem, por exemplo, a temperaturas de lavagem de 20 ^QC ou mais altas (tais como a 40 ^QC).

[00023] O termo “benefício de detergência de enzima” usado no presente documento, refere-se ao efeito vantajoso que uma enzima pode acrescentar a um detergente em comparação ao mesmo detergente sem a enzima. Benefícios de detergência importantes que podem ser proporcionados por enzimas são remoção de manchas com nenhuma ou muito pouca sujidade visível após lavagem e/ou limpeza, prevenção ou redução da redeposição de sujidades liberadas no processo de lavagem (um efeito que é também denominado antirredeposição), restauração total ou parcial da brancura de têxteis que originalmente eram brancos mas, após uso e lavagem repetidos, obtiveram uma aparência acinzentada ou amarelada (um efeito que é também denominado branqueamento). Benefícios de cuidados de têxteis, que não estão diretamente relacionados com a remoção catalítica de manchas ou prevenção da redeposição de sujidades, são também importantes para os benefícios de detergência de enzima. Exemplos de tais benefícios de cuidados de têxteis são prevenção ou redução da transferência de corante de um tecido para outro tecido ou outra parte do mesmo tecido (um efeito que é também denominado inibição de transferência de corante ou antirredeposição de corante), remoção de fibras salientes ou quebradas da superfície de um tecido para diminuir a tendência de formação de borbotos ou remover os borbotos ou felpo já existentes (um efeito que é também denominado antiformação de borbotos), melhoria da suavidade do tecido, clarificação da cor do tecido e remoção de sujidades particuladas que estão presas nas fibras do tecido ou peças de vestuário. O branqueamento enzimático é um benefício de detergência de

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10/121 enzima adicional onde a atividade catalítica é geralmente usada para catalisar a formação de componente de branqueamento tal como peroxide de hidrogênio ou outros peroxides.

[00024] O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional, e secreção.

[00025] O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[00026] O termo “fragmento” significa um polipeptideo que tem um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila do polipeptideo de SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8; em que o fragmento tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos de SEQ ID NOs: 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8, por exemplo, pelo menos 300 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pelo menos 350 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pelo menos 400 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pelo menos 450 resíduos de aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[00027] O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similar com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

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11/121 [00028] O termo “valor de intensidade”, como usado no presente documento, refere-se à medição do desempenho de lavagem. É medido como o brilho expresso como a intensidade da luz refletida a partir da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem, onde um valor de intensidade mais alto se correlaciona com maior desempenho de lavagem. As medições de cor são feitas com um digitalizador de mesa profissional (Kodak iQsmart, Kodak) usado para capturar uma imagem do têxtil lavado. Para extrair um valor para a intensidade da luz a partir das imagens digitalizadas, os valores de pixel de 24 bits da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado por adição dos valores RGB como vetores e depois consideração do comprimento do vetor resultante:

Int =^r² + g²+b² [00029] Os termos “Delta intensidade” ou “valor de Delta intensidade” são definidos no presente documento como o resultado de uma medição de intensidade de um material deteste, por exemplo, uma amostra de tecido CS-28 (Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos) ou uma superfície dura. A amostra de tecido é medida com uma porção da amostra de tecido, lavada sob condições idênticas, como fundo. A delta intensidade é o valor de intensidade do material de teste lavado com amilase subtraindo o valor de intensidade do material de teste lavado sem amilase.

[00030] O termo “propriedade melhorada”, como usado no presente documento, refere-se a uma característica associada a uma variante que é melhorada em comparação ao genitor. Tais propriedades

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12/121 melhoradas incluem, mas não são limitadas a, desempenho de lavagem, atividade térmica, termoestabilidade e estabilidade sob condições de armazenamento e estabilidade química. A propriedade melhorada pode ser qualquer uma das definidas e descritas no presente documento, tal como estabilidade.

[00031] O termo “desempenho de lavagem melhorado” é definido no presente documento como a exibição de uma alteração do desempenho de lavagem de uma amilase da presente invenção em relação ao desempenho de lavagem da amilase de SEQ ID NO: 2 ou 1. A alteração pode, por exemplo, ser vista como maior remoção de manchas. O desempenho de lavagem melhorado é determinado de acordo com o Exemplo 1. O desempenho de lavagem foi melhorado se o Fator de Melhoramento (FM) for superior a 1,0, preferencialmente superior a 1,05 em uma ou mais das condições mencionadas no Exemplo 1 no detergente modelo A a 20 °C em que a concentração da variante de alfa-amilase é 0,2 mg/L, ou no detergente modelo A a 40 °C em que a concentração da variante de alfa-amilase é 0,05 mg/L, ou no detergente modelo J a 20 °C em que a concentração da variante de alfa-amilase é 0,2 mg/L, ou no detergente modelo J a 30 °C em que a concentração da variante de alfa-amilase é 0,05 mg/L ou no Detergente K a 20 °C em que a concentração da variante de alfaamilase é 0,2 mg/L. As condições de lavagem são descritas na seção de Exemplos.

[00032] O termo “desempenho de lavagem” inclui limpeza em geral, por exemplo, limpeza de superfícies duras como na lavagem de louça, mas também o desempenho de lavagem de tecidos como na lavagem de roupa e também limpeza industrial e institucional. O desempenho de lavagem melhorado pode ser medido por comparação das delta intensidades como

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13/121 descrito na definição no presente documento.

[00033] O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não seja de ocorrência natural, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptideo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação. Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma variante de uma alfa-amilase isolada.

[00034] Polinucleotídeo isolado: O termo polinucleotídeo isolado significa um polinucleotídeo que é modificado pela mão do homem. Em um aspecto, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 1% puro, por exemplo, pelo menos 5% puro, pelo menos 10% puro, pelo menos 20% puro, pelo menos 40% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro e pelo menos 95% puro, como determinado por eletroforese de agarose. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética, sintética, ou quaisquer combinações das mesmas.

[00035] Variante isolada: O termo “variante isolada” significa uma variante que é modificada pela mão do homem. Em um aspecto, a

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14/121 variante é pelo menos 1% pura, por exemplo, pelo menos 5% pura, pelo menos 10% pura, pelo menos 20% pura, pelo menos 40% pura, pelo menos 60% pura, pelo menos 80% pura e pelo menos 90% pura, como determinado porSDS-PAGE.

[00036] Baixa temperatura: “Baixa temperatura” é uma temperatura de 5 a 40 °C, preferencialmente 5 a 35 °C, preferencialmente 5 a 30 °C, mais preferencialmente 5 a 25 °C, mais preferencialmente 5 a 20 °C, de máxima preferência 5 a 15 °C, e em particular 5 a 10 °C. Em uma modalidade preferencial, “Baixa temperatura” é uma temperatura de 10 a 35 °C, preferencialmente 10 a 30 °C, ou 10 a 25 °C, ou 10 a 20 °C, ou 10 a 15 °C.

[00037] O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações póstranslacionais, tais como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[00038] O termo “sequência codificante de polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade de alfa-amilase.

[00039] O termo “mutante” significa um polinucleotídeo que codifica uma variante.

[00040] O termo “mutação”, no contexto dos polipeptídeos da invenção, significa que um ou mais aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos de referência (isto é SEQ ID NO:1) são alterados por substituição com um aminoácido diferente ou por deleção. Além disso, a

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15/121 mutação pode corresponder a uma inserção de um ou mais aminoácidos adicionais na sequência de aminoácidos de referência.

[00041] O termo “construção de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, seja de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiría, de outro modo, na natureza ou que é sintética, compreendendo uma ou mais sequências de controle. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo do termo “cassete de expressão” quando a construção de ácido nucleico contém as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência codificante da presente invenção.

[00042] O termo ‘Operacionalmente ligada” designa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de tal forma que a sequência de controle direciona a expressão da sequência codificante.

[00043] O termo “genitor” ou “alfa-amilase genitora” significa uma alfa-amilase à qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O genitor pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural (do tipo selvagem) ou uma variante do mesmo. Por exemplo, o genitor pode ser a alfa-amilase de SEQ ID NO:1 (conhecida como SP722). Alternativamente, pode também significar a alfa-amilase de SEQ ID NO: 2. A alfa-amilase genitora pode ser qualquer alfa-amilase apropriada, tal como as mencionadas no presente documento como SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7 e 8.

[00044] A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas é descrita pelo parâmetro “identidade

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16/121 de sequência”.

[00045] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados podem ser penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade para extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue:

[00046] (Resíduos Idênticos x 100)/(Compri mento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento) [00047] Alternativamente, os parâmetros usados podem ser penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade para extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção-nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue:

[00048] (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x

100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento) [00049] Processo de remoção de amido: A expressão “processo de remoção de amido” refere-se a qualquer tipo de processo pelo qual é removido (ou convertido) amido, como em processos de lavagem em

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17/121 que o amido é removido de tecidos, por exemplo, limpeza de tecidos como lavagem de roupa. Um processo de remoção de amido podería também ser limpeza de superfícies duras como lavagem de louça ou podería ser processos de limpeza em geral como em limpeza industrial ou institucional. A expressão também compreende outros processos de remoção de amido ou conversão de amido, produção de etanol, liquefação de amido, desengomagem têxtil, produção de papel e polpa, fabricação de cerveja e detergentes em geral.

[00050] Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo “polinucleotídeo substancialmente puro” significa uma preparação polinucleotídica isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para uso dentro de sistemas de produção de polipeptideos geneticamente manipulados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1%, e no máximo 0,5% em peso de outro material polinucleotídico com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas de ocorrência natural, tais como promotores eterminadores. É preferencial que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, por exemplo, pelo menos 92% puro, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, e pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura.

[00051] Variante substancialmente pura: O termo “variante substancialmente pura” significa uma preparação que contém no máximo

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10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1%, e no máximo 0,5% em peso de outro material polipeptidico com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Preferencialmente, a variante é pelo menos 92% pura, por exemplo, pelo menos 94% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 96% pura, pelo menos 97% pura, pelo menos 98% pura, pelo menos 99% pura, pelo menos 99,5% pura, e 100% pura em peso do material polipeptidico total presente na preparação. As variantes da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isso pode ser alcançado, por exemplo, por preparação da variante por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

[00052] O termo “subsequência” significa um polinucleotideo que tem um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante de polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento que tem atividade de alfaamilase.

[00053] Têxtil: A amostra têxtil CS-28 (amido de arroz em algodão) é obtida do Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos.

[00054] O termo “benefícios de cuidados de têxteis”, como usado no presente documento, é definido como não estando diretamente relacionado com remoção catalítica de manchas ou prevenção da redeposição de sujidades, são também importantes para benefícios de detergência de enzima. Exemplos de tais benefícios de cuidados de têxteis são prevenção ou redução da transferência de corante de um têxtil para outro têxtil ou outra parte do mesmo têxtil (um efeito que é também denominado

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19/121 inibição de transferência de corante ou antirredeposição de corante), remoção de fibras salientes ou quebradas da superfície de um têxtil para diminuir a tendência de formação de borbotos ou remover os borbotos ou felpo já existentes (um efeito que é também denominado antiformação de borbotos), melhoria da suavidade do têxtil, clarificação da cor do têxtil e remoção de sujidades particuladas que estão presas nas fibras do têxtil. O branqueamento enzimático é um benefício de detergência de enzima adicional onde a atividade catalítica é geralmente usada para catalisar a formação de componente de branqueamento tal como peroxide de hidrogênio ou outros peroxides ou outras espécies de branqueamento.

[00055] O termo “variante” significa um polipeptídeo que tem atividade de alfa-amilase compreendendo uma mutação, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições em relação à alfa-amilase “genitora” de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Uma substituição significa substituição do aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa a adição de um aminoácido adjacente a e imediatamente após o aminoácido que ocupa uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de alfa-amilase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[00056] O termo alfa-amilase de “tipo selvagem” significa uma alfa-amilase expressa por um microorganismo de ocorrência natural, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza.

[00057] Convenções para a Designação de Variantes

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20/121 [00058] Os polipeptídeos da invenção que têm atividade de alfa-amilase correspondem a variantes de uma alfa-amilase derivada de Bacillus, como mostrado em SEQ ID NOs: 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

SEQ ID NO: 1 [00059] HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDASN LRNRGITAIWIPPAWKGTSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRS QLESAIHALKNNGVQVYGDVVMNHKGGADATENVLAVEVNPNNRNQEIS GDYTIEAWTKFDFPGRGNTYSDFKWRWYHFDGVDWDQSRQFQNRIYKF RGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMDHPEVVNELRRWGEWYTNT LNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWLTHVRNATGKEMFAVAEFWKNDLGALEN YLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNASNSGGNYDMAKLLNGTVVQKHPMHAV TFVDNHDSQPGESLESFVQEWFKPLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPT HSVPAMKAKIDPILEARQNFAYGTQHDYFDHHNIIGWTREGNTTHPNSGLA TIMSDGPGGEKWMYVGQNKAGQVWHDITGNKPGTVTINADGWANFSVN GGSVSIWVKR [00060] Para propósitos da presente invenção, o polipeptideo revelado em SEQ ID NO: 1 é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outro polipeptideo de alfa-amilase. No entanto, o especialista na técnica reconhecería que a sequência de SEQ ID NO: 2 pode ser também usada para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outro polipeptideo de alfa-amilase. A sequência de aminoácidos de outra alfa-amilase é alinhada com o polipeptideo maduro revelado em SEQ ID NO: 1 e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptideo maduro revelado em SEQ ID NO: 1 é determinado usando o algoritmo de NeedlemanWunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The

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European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade para extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[00061] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra alfa-amilase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências polipeptídicas usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 18991900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.

[00062] Quando a outra alfa-amilase divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, tal que a comparação tradicional à base de sequências falhe em detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), outros algoritmos de comparação de sequências em pares podem ser usados. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias (perfis) de polipeptídeos para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterative de pesquisa de bases de dados e é

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22/121 capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas, tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881), utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê o enovelamento estrutural para uma sequência de consulta. De forma similar, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Esses alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[00063] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas proteicas podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos, como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11:739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm e Park,

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2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[00064] Ao descrever as variantes de alfa-amilase da presente invenção, a nomenclatura descrita a seguir é adaptada para facilidade de referência. É empregue a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras aceite pela IUPAC.

[00065] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos, é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido que substitui. Consequentemente, a substituição, por exemplo, detreonina na posição 226 por alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411 Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[00066] Deleções. Para uma deleção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, Consequentemente, a deleção de glicina na posição 181 é designada como “Ser181*” ou “S181*”. Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Ser181* + Thr182*” ou “S181* + T182*”.

[00067] Inserções. Para uma inserção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Consequentemente, a inserção de lisina após, por exemplo, glicina na posição 195 é designada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido no 1, aminoácido inserido no 2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[00068] Em tais casos, o resíduo (ou resíduos) de aminoácido

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24/121 inserido é numerado pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o resíduo (ou resíduos) de aminoácido inserido. No exemplo acima, a sequência seria, então:

Genitor:	Variante:
195	195 195a 195b
G	G - K - A

[00069] Múltiplas modificações. Variantes compreendendo múltiplas modificações são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 portirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[00070] Modificações diferentes. Quando alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes:

[00071] Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala, Tyr167Ala+Arg170Gly, e Tyr167Ala+Arg170Ala.

[00072] Alfa-amilases genitoras [00073] A alfa-amilase genitora pode ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 1.

[00074] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo

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25/121 menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptideo de SEQ ID NO: 1.

[00075] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptideo de SEQ ID NO: 1.

[00076] A alfa-amilase genitora pode ser também um polipeptideo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo apresentado em SEQ ID NO: 2.

[00077] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptideo de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptideo de SEQ ID NO: 2.

[00078] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptideo de SEQ ID NO: 2.

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26/121 [00079] A alfa-amilase genitora pode ser também um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 3.

[00080] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00081] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3.

[00082] A alfa-amilase genitora pode ser também um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 4.

[00083] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez

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27/121 aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[00084] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[00085] A alfa-amilase genitora pode ser também um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 5.

[00086] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 5 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

[00087] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

[00088] A alfa-amilase genitora pode ser também um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 6.

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28/121 [00089] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 6 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

[00090] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 6.

[00091] A alfa-amilase genitora pode ser também um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 7.

[00092] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7.

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29/121 [00093] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptideo de SEQ ID NO: 7.

[00094] A alfa-amilase genitora pode ser também um polipeptideo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptideo apresentado em SEQ ID NO: 8.

[00095] Em um aspecto, a alfa-amilase genitora tem uma identidade de sequência em relação ao polipeptideo de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem atividade de alfa-amilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptideo de SEQ ID NO: 8.

[00096] A alfa-amilase genitora compreende ou consiste preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, a alfa-amilase genitora é uma variante alélica do polipeptideo de SEQ ID NO: 8.

[00097] A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou um fragmento das mesmas, pode ser usada para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar eclonar DNA que codifica um genitor a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem

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30/121 ser usadas para hibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos de Southern blot padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. De preferência, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00098] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outros organismos pode ser rastreada em busca de DNA que hibridiza com as sondas acima descritas e codifica um genitor. O DNA genômico ou outro DNA de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado podem ser transferidos para e imobilizados em nitrocelulose ou outro material portador adequado, que é usado em um Southern blot.

[00099] Para propósitos da presente invenção, hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda nucleotídica marcada correspondendo a um polinucleotídeo que codifica SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou uma subsequência das mesmas, sob condições de

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31/121 estringência baixa a muito elevada. As moléculas com as quais a sonda hibridiza podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[000100] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou um fragmento das mesmas.

[000101] Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência muito baixa a muito elevada são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42 °C em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 25% para estringências muito baixas e baixas, formamida a 35% para estringências médias a médias-elevadas, ou formamida a 50% para estringências elevadas a muito elevadas, seguindo procedimentos de Southern blot padrão durante 12 a 24 horas idealmente. O material portador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 45 °C (estringência muito baixa), 50 °C (estringência baixa), 55 °C (estringência média), 60 °C (estringência média-elevada), 65 °C (estringência elevada), ou 70 °C (estringência muito elevada).

[000102] Para sondas curtas que têm cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização e hibridização a cerca de 5 °C a 10 °C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390) em NaCI 0,9 M, Tris-HCI 0,09 M pH 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 a 0,5%, solução de Denhardt 1X, pirofosfato de sódio 1 mM, fosfato de sódio monobásico 1 mM, ATP 0,1 mM e 0,2 mg de

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RNA de levedura por mL seguindo procedimentos de Southern blot padrão por 12 a 24 horas idealmente. O material portador é finalmente lavado uma vez em SCC 6X mais SDS a 0,1% durante 15 minutos e duas vezes, cada uma durante 15 minutos, usando SSC 6X a 5 °C a 10 °C abaixo do Tm calculado.

[000103] O genitor pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido(a) de”, como usado no presente documento em conexão com uma determinada fonte, significará que o genitor codificado por um polinucleotideo é produzido pela fonte ou por uma célula na qual o polinucleotideo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o genitor é secretado extracelularmente.

[000104] O genitor pode ser uma alfa-amilase bacteriana. Por exemplo, o genitor pode ser um polipeptideo de uma bactéria gram-positiva, tal como uma alfa-amilase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus ou Streptomyces, ou um polipeptideo de uma bactéria gramnegativa, tal como uma alfa-amilase de Campylobacter, E. coll, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella ou Ureaplasma.

[000105] Em um aspecto, o genitor é uma alfa-amilase de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.

[000106] Em outro aspecto, o genitor é uma alfa-amilase de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

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33/121 [000107] Em outro aspecto, o genitor é uma alfa-amilase de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans.

[000108] Em outro aspecto, o genitor é uma alfa-amilase de Bacillus sp., por exemplo a alfa-amilase de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[000109] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os especialistas na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[000110] As estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em várias coleções de culturas, como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[000111] O genitor pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para o isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo que codifica um genitor pode então ser derivado rastreando similarmente uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro

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34/121 microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez que um polinucleotideo que codifica um genitor tenha sido detectado com uma sonda (ou sondas), o polinucleotideo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são conhecidas pelas pessoas de habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Sambrook etal., 1989, supra).

[000112] O genitor pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma porção de um polipeptídeo é fundida no terminal N ou terminal C de uma porção de outro polipeptídeo.

[000113] O genitor pode ser também um polipeptídeo fundido ou polipeptídeo de fusão clivável no qual um polipeptídeo é fundido no terminal N ou terminal C de outro polipeptídeo. Um polipeptídeo fundido é produzido por fusão de um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo com um polinucleotideo que codifica outro polipeptídeo. São conhecidas na técnica técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão e que incluem a ligação das sequências codificantes que codificam os polipeptídeos de modo que fiquem na mesma fase de leitura e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob controle do mesmo promotor (ou promotores) e terminador. As proteínas de fusão podem ser também construídas usando tecnologia de inteína na qual são criadas fusões pós-tradução (Cooper etal., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson etal., 1994, Science 266: 776-779).

[000114] Um polipeptídeo de fusão pode compreender, adicionalmente, um sítio de divagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de divagem incluem os, mas não estão limitados aos, sítios revelados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493;

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Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Preparação de Variantes [000115] A presente invenção refere-se a métodos para a obtenção de uma variante que tem atividade de alfa-amilase, compreendendo (a) introduzir em uma alfa-amilase genitora uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, em que cada modificação é i nd e pendente mente uma substituição ou deleção, e a referida variante tem atividade de alfa-amilase; e (b) recuperar a referida variante.

[000116] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para a obtenção de uma variante que tem atividade de alfa-amilase, compreendendo (a) introduzir em uma alfa-amilase genitora uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que cada modificação é i nd e pendente mente uma substituição ou deleção, e a referida

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36/121 variante tem atividade de alfa-amilase; e (b) recuperar a referida variante.

[000117] Em uma modalidade, a modificação é uma substituição. Em uma modalidade, a modificação é uma deleção.

[000118] Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método para a obtenção de uma variante que tem atividade de alfa-amilase, compreendendo (a) introduzir em uma alfa-amilase genitora uma substituição em uma ou mais posições, em que a substituição é selecionada de H1 A, G7A, G109A, N280S, W284H, K320A, M323N e E391A do polipeptideo de SEQ ID NOs: 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e (b) recuperar a variante.

[000119] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente introduzir na alfa-amilase genitora uma deleção em uma ou mais posições, em que a deleção é selecionada de: ΗΓ, R181*, G182*, D183* e G184* do polipeptideo de SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e recuperar a variante.

[000120] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente introduzir na alfa-amilase genitora uma substituição em uma ou mais posições, em que a substituição é selecionada de: W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, G304R e G476K do polipeptideo de SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e recuperar a variante.

[000121] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção gênica sintética, construção gênica semissintética, mutagênese aleatória, rearranjo, etc.

[000122] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (várias) mutações são criadas em um ou mais sítios definidos em um polinucleotídeo que codifica o genitor.

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37/121 [000123] A mutagênese sítio-dirígida pode ser alcançada in vitro por PCR, envolvendo o uso de iniciadores oligonucleotídicos que contêm a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirígida também pode ser realizada in vitro por mutagênese de cassete que envolve a divagem por uma enzima de restrição em um sítio no plasmídeo que compreende um polinucleotídeo que codifica o genitor e a subsequente ligação de um oligonucleotídeo que contém a mutação no polinucleotídeo. Normalmente a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo a ligação entre as extremidades coesivas do plasmídeo e inserto. Ver, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton etal., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[000124] A mutagênese sítio-dirigida também pode ser alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. N.^Q 2004/0171154; Storici etal., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[000125] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio-dirigida na presente invenção. Existem vários estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[000126] A construção gênica sintética implica síntese in vitro de uma molécula polinucleotídica concebida para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de genes pode ser realizada utilizando várias técnicas, tais como a tecnologia à base de microchip de multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[000127] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções

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38/121 e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou rearranjo, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tais como aqueles revelados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, apresentação emfagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente dos E.U.A. N.^Q 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese região-dirigida (Derbyshire etal., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA7-. 127).

[000128] Métodos de mutagênese/rearranjo podem ser combinados com métodos de varredura automatizados, de elevada produtividade para detectar atividade de polipeptídeos submetidos a mutagênese eclonados expressos por células hospedeiras (Ness etal., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA submetidas a mutagênese que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[000129] A construção gênica semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção gênica sintética, e/ou mutagênese sítio-dirigida, e/ou mutagênese aleatória, e/ou rearranjo. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos polinucleotídicos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítioespecíficos, enquanto ainda outras regiões podem estar sujeitas à

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39/121 amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. As subsequências polinucleotídicas podem ser depois rearranjadas.

Variantes [000130] Apresente invenção também proporciona variantes de uma alfa-amilase genitora, compreendendo (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a variante tem atividade de alfa-amilase. Por meio do presente documento, são proporcionadas variantes que têm desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura, em comparação à alfa-amilase genitora ou em comparação à alfa-amilase de SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[000131] Em uma modalidade, a variante tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora.

[000132] Em outra modalidade, a invenção refere-se a variantes isoladas de uma alfa-amilase genitora, compreendendo (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições

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140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, (ii) a variante tem pelo menos 80, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a variante tem atividade de alfa-amilase.

[000133] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[000134] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[000135] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[000136] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[000137] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%,

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41/121 tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 5.

[000138] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 6.

[000139] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 7.

[000140] Em outra modalidade, a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, e pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência com o polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 8.

[000141] Em uma modalidade, o número de modificações nas variantes da presente invenção é 1 a 20, por exemplo, 1 a 10 e 1 a 5, tal como 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 modificações.

[000142] Em uma modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que

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42/121 a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000143] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em duas ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000144] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em três ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000145] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em quatro ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000146] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em cinco ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000147] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em seis ou mais posições

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 53/319

43/121 correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000148] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em sete ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000149] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em oito posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e opcionalmente uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000150] Em uma modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000151] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em duas ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 54/319

44/121 acordo com SEQ ID NO: 1.

[000152] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em três ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000153] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em quatro ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000154] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em cinco ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000155] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em seis ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000156] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em sete ou mais posições

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 55/319

45/121 correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182, 183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000157] Em outra modalidade, a variante compreende uma modificação, tal como uma substituição, em oito posições correspondendo às posições 109, 1,7, 280, 284, 320, 323 e 391, e uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182,183, 184, 195, 203, 243, 260, 304 e 476, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000158] Em uma modalidade preferencial, a variante compreende uma modificação em uma, duas, três, quatro ou cinco posições selecionadas do grupo que consiste em 1,7, 109, 280 e 391.

[000159] Em uma modalidade, a variante compreende pelo menos uma deleção e pelo menos uma substituição em duas, três, quatro ou cinco posições selecionadas do grupo que consiste em 1,7, 109, 280 e 391.

[000160] Em uma modalidade, a variante compreende uma substituição em uma, duas, três ou quatro posições selecionadas de 7, 109, 280 e391.

[000161] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições selecionadas do grupo de posições que consiste em: X1+X7; X1+X109; X1+X280; X1+X284; X1+X320; X1+X323; X1+X391; X109+X280; X109+X284; X109+X320; X109+X323; X109+X391; X7+X109; X7+X280; X7+X284; X7+X320; X7+X323; X7+X391; X280+X284; X280+X320; X280+X323; X280+X391; X284+X320; X284+X323;

X284+X391; X320+X323; X320+X391; e X323+X391, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 56/319

46/121 [000162] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições selecionadas do grupo de posições que consiste em: X109+X7+X1; X109+X7+X391; X109+X7+X280; X109+X7+X284; X109+X7+X320; X109+X7+X323; X109+X1+X391; X109+X1+X280;

X109+X1+X284; X109+X1+X320; X109+X1+X323; X109+X391+X280; X109+X391+X284; X109+X391+X320; X109+X391+X323;

X109+X280+X284; X109+X280+X320; X109+X280+X323;

X109+X284+X320; X109+X284+X323; X109+X320+X323; X7+X1+X391; X7+X1+X280; X7+X1+X284; X7+X1+X320; X7+X1+X323; X7+X391+X280; X7+X391+X284; X7+X391+X320; X7+X391+X323; X7+X280+X284;

X7+X280+X320; X7+X280+X323; X7+X284+X320; X7+X284+X323;

X7+X320+X323; X1+X391+X280; X1+X391+X284; X1+X391+X320;

X1+X391+X323; X1+X280+X284; X1+X280+X320; X1+X280+X323;

X1+X284+X320; X1+X284+X323; X1+X320+X323; X391+X280+X284; X391+X280+X320; X391+X280+X323; X391+X284+X320;

X391+X284+X323; X391+X320+X323; X280+X284+X320;

X280+X284+X323; X280+X320+X323; e X284+X320+X323, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000163] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições selecionadas do grupo de posições que consiste em: X109+X7+X1+X391; X109+X7+X1+X280; X109+X7+X1+X284;

X109+X7+X1+X320; X109+X7+X1+X323; X109+X7+X391+X280;

X109+X7+X391+X284; X109+X7+X391+X320; X109+X7+X391+X323;

X109+X7+X280+X284; X109+X7+X280+X320; X109+X7+X280+X323;

X109+X7+X284+X320; X109+X7+X284+X323; X109+X7+X320+X323;

X109+X1+X391+X280; X109+X1+X391+X284; X109+X1+X391+X320;

X109+X1+X391+X323; X109+X1+X280+X284; X109+X1+X280+X320;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 57/319

47/121

X109+X1+X280+X323; X109+X1+X284+X320; X109+X1+X284+X323;

X109+X1+X320+X323; X109+X391+X280+X284; X109+X391+X280+X320; X109+X391+X280+X323; X109+X391+X284+X320;

X109+X391+X284+X323; X109+X391+X320+X323;

X109+X280+X284+X320; X109+X280+X284+X323;

X109+X280+X320+X323; X109+X284+X320+X323; X7+X1+X391+X280; X7+X1+X391+X284; X7+X1+X391+X320; X7+X1+X391+X323;

X7+X1+X280+X284; X7+X1+X280+X320; X7+X1+X280+X323;

X7+X1+X284+X320; X7+X1+X284+X323; X7+X1+X320+X323;

X7+X391+X280+X284; X7+X391+X280+X320; X7+X391+X280+X323;

X7+X391+X284+X320; X7+X391+X284+X323; X7+X391+X320+X323;

X7+X280+X284+X320; X7+X280+X284+X323; X7+X280+X320+X323;

X7+X284+X320+X323; X1+X391+X280+X284; X1+X391+X280+X320;

X1+X391+X280+X323; X1+X391+X284+X320; X1+X391+X284+X323;

X1+X391+X320+X323; X1+X280+X284+X320; X1+X280+X284+X323;

X1+X280+X320+X323; X1+X284+X320+X323; X391+X280+X284+X320; X391+X280+X284+X323; X391+X280+X320+X323;

X391+X284+X320+X323; e X280+X284+X320+X323, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000164] Em uma modalidade, a variante compreende uma ou mais modificações selecionadas do grupo que consiste em ΧΓ, X1A, X7A, X7K, X7E, X7N. X7Q, X7L, X7D, X109A, X109S, X140Y, Χ18Γ, X182*, X183*, X184*, X195F, X206Y, X243F, X260G, X280S, X284H, X284R, X284F, X304R, X320A, X320M, X320T, X320V, X320S, X323N, X323R, X323S, X323K, X391A, X391V, e X476K, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000165] Em uma modalidade particular, a variante compreende

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 58/319

48/121 as modificações selecionadas do grupo que consiste em: ΧΓ+Χ1Α; ΧΓ+Χ7Α ΧΓ+Χ109Α; X1*+X280S; ΧΓ+Χ284Η; ΧΓ+Χ320Α; ΧΓ+Χ323Ν; ΧΓ+Χ391Α X1A+X7A; X1A+X109A; X1A+X280S; X1A+X284H; X1A+X320A;

X1A+X323N; X1A+X391A; X7A+X109A; X7A+X280S; X7A+X284H; X7A+X320A; X7A+X323N; X7A+X391A; X109A+X280S; X109A+X284H; X109A+X320A; X109A+X323N; X109A+X391A; X280S+X284H;

X280S+X320A; X280S+X323N; X280S+X391A; X284H+X320A;

X284H+X323N; X284H+X391A; X320A+X323N; X320A+X391A; e

X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

[000166] Em uma modalidade, a variante compreende as modificações selecionadas do grupo que consiste em: ΧΓ+Χ7Α+Χ109Α; X1*+X7A+X280S: ΧΓ+Χ7Α+Χ284Η: ΧΓ+Χ7Α+Χ320Α: ΧΓ+Χ7Α+Χ323Ν:

ΧΓ+Χ7Α+Χ391Α;

ΧΓ+Χ109Α+Χ320Α;

X1*+X280S+X284H;

X1*+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ284Η+Χ391Α;

ΧΓ+Χ323Ν+Χ391Α;

X1A+X7A+X284H;

X1A+X7A+X391A;

X1A+X109A+X320A;

X1A+X280S+X284H;

X1A+X280S+X391A;

X1A+X284H+X391A;

X1A+X323N+X391A;

X7A+X109A+X320A;

X7A+X280S+X284H;

XV+X109A+X280S;

ΧΓ+Χ109Α+Χ323Ν;

XV+X280S+X320A;

ΧΓ+Χ284Η+Χ320Α;

ΧΓ+Χ320Α+Χ323Ν;

X1A+X7A+X109A;

X1A+X7A+X320A;

X1A+X109A+X280S;

X1A+X109A+X323N;

X1A+X280S+X320A;

X1A+X284H+X320A;

X1A+X320A+X323N;

X7A+X109A+X280S;

X7A+X109A+X323N;

X7A+X280S+X320A;

ΧΓ+Χ109Α+Χ284Η;

ΧΓ+Χ109Α+Χ391Α;

XV+X280S+X323N;

ΧΓ+Χ284Η+Χ323Ν;

ΧΓ+Χ320Α+Χ391Α;

X1A+X7A+X280S;

X1A+X7A+X323N;

X1A+X109A+X284H;

X1A+X109A+X391A;

X1A+X280S+X323N;

X1A+X284H+X323N;

X1A+X320A+X391A;

X7A+X109A+X284H;

X7A+X109A+X391 A;

X7A+X280S+X323N;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 59/319

49/121

X7A+X284H+X320A;

X7A+X320A+X323N;

X109A+X280S+X284H;

X109A+X280S+X391 A;

X109A+X284H+X391 A;

X109A+X323N+X391A;

X280S+X284H+X391A;

X280S+X323N+X391A;

X284H+X323N+X391A; e

X7A+X284H+X323N;

X7A+X320A+X391A;

X109A+X280S+X320A;

X109A+X284H+X320A;

X109A+X320A+X323N;

X280S+X284H+X320A;

X280S+X320A+X323N;

X284H+X320A+X323N;

X320A+X323N+X391A,

1.

X7A+X280S+X391A;

X7A+X284H+X391A;

X7A+X323N+X391A;

X109A+X280S+X323N;

X109A+X284H+X323N;

X109A+X320A+X391 A;

X280S+X284H+X323N;

X280S+X320A+X391A;

X284H+X320A+X391A;

em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO:

[000167] Em uma modalidade preferencial, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições selecionadas do grupo que consiste em:

[000168] X1*+X109A+X280S+X391 A;

X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A;

X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A;

X1 *+X109A+X280S+X320M+X391A;

X1 *+X109A+X280S+X320V+X391A;

X1 *+X109A+X280S+X320S+X391A;

X1 *+X109A+X284R+X391A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A;

X1 *+X7L+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320T+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323R+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X391V;

ΧΓ+Χ109A+X284F+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X284F+X391 A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323N+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323K+X391 A; X1 *+X109S+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X284H+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391 A;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 60/319

50/121

X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A; X7A+X320A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X284H+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

X1 *+X7A+X109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das amilases apresentadas em SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[000169] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, selecionadas do grupo que consiste em:

[000170] X1*+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A; X1 *+X7L+X109A+X280S+X391 A; X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320M+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X320T+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320V+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323R+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320S+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X391V; X1 *+X109A+X284R+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X284F+X391 A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 61/319

51/121

ΧΓ+Χ109A+X280S+X284F+X391Α; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323N+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323K+X391 A; X1 *+X109S+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X284H+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391 A;

X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A; X7A+X320A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X284H+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 1.

[000171] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, selecionadas do grupo que consiste em:

[000172] X1*+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A;

XT+X7L+X109A+X280S+X391 A;

X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A

X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A

X1 *+X7D+X109A+X280S+X391A

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

X1 *+X109A+X280S+X320M+X391A;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 62/319

52/121

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320T+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320V+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323R+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320S+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X391V; X1 *+X109A+X284R+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X284F+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X284F+X391 A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323N+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323K+X391 A; X1 *+X109S+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 2.

[000173] Em uma modalidade preferencial, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, selecionadas do grupo que consiste em:

[000174] HV+G109A+N280S+E391 A;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 63/319

53/121

H1 *+G7K+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G7E+G109A+N280S+E391A;

H1 *+G7N+G109A+N280S +E391 A; H1 *+G7Q+G109A+N280S+E391A;

H1 *+G7L+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G7D+G109A+N280S+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+E391 A; H1 *+G109A+N280S+K320M+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320T+E391A; H1 *+G109A+N280S+K320V+E391A;

H1 *+G109A+N280S+M323R+E391 A; H1 *+G109A+N280S+K320S+E391A;

H1 *+G109A+N280S+E391V; H1 *+G109A+W284R+E391A;

H1 *+G109A+W284F+E391 A; H1 *+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A;

H1 *+G109A+N280S+W284F+E391 A; H1 *+G109A+N280S+M323N+E391A;

H1 *+G109A+N280S+M323K+E391 A; H1 *+G109S+N280S+E391A;

H1 *+G109A+W284H+E391 A; H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

H1 *+G7A+G109A+N280S+E391 A;H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+K32 0A+M323N+E391A; G7A+W284H+K320A+M323N; G7A+K320A+M323N;

K320A; G7A+K320A; Hr+G7A+G109A+N280S+E391 A;

H1 *+G109A+N280S+W284H+E391 A; H1 *+G109A+N280S+M323S+E391A;

H1 *+G7A+G109A+N280S+K320A+E391 A;

H1 *+G7A+G109A+N280S+M323S+E391 A;

H1 *+G7A+G109A+N280S+M323 N+E391 A;

H1 *+G7A+G109A+N280S+W284F+E391 A;

H1 *+G7A+G109A+N280S+W284R+E391 A;

H1 *+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391 A;

HV+G7A+G109A+W284R+E391 A; e

H1 *+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A.

[000175] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3, selecionadas do grupo que consiste em:

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 64/319

54/121 [000176] X1*+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A;

X1 *+X7L+X109A+X280S+X391 A; X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391 A; X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A; X7A+X320A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X284H+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 3.

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 65/319

55/121 [000177] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4, selecionadas do grupo que consiste em:

[000178] XV+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A;

X1 *+X7L+X109A+X280S+X391 A; X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320M+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X320T+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320V+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323R+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320S+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X391V; X1 *+X109A+X284R+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X284F+X391 A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X284F+X391 A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323N+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323K+X391 A; X1 *+X109S+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391 A;

X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A; X7A+X320A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X284H+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 66/319

56/121

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 4.

[000179] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 5, selecionadas do grupo que consiste em:

[000180] X1*+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A;

XT+X7L+X109A+X280S+X391 A; X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320M+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320T+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320V+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323R+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320S+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X391V; X1 *+X109A+X284R+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X284F+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X284F+X391 A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323N+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323K+X391 A; X1 *+X109S+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391 A;

X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A; X7A+X320A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X284H+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 67/319

57/121

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 5.

[000181] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6, selecionadas do grupo que consiste em:

[000182] X1*+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A; XT+X7L+X109A+X280S+X391 A; X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X284H+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A;X1 *+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A +X323N+X391 A; X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A;

X7A+X320A;

X1 *+X7A+X109A+X280S+X391A;

Petição 870190073831, de 01/08/2019, pág. 68/319

58/121

ΧΓ+Χ109A+X280S+X284H+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X323S+X391A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 6.

[000183] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7, selecionadas do grupo que consiste em:

[000184] X1*+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A; ΧΓ+Χ7Ο+Χ109A+X280S+X391A;

X1 *+X7L+X109A+X280S+X391 A; X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X284H+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A;

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59/121

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A;X1 *+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A +X323N+X391A; X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A; X7A+X320A; X1 *+X7A+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

XV+X7A+X109A+X284R+X391A; e

XV+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 7.

[000185] Em uma modalidade, a variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8, selecionadas do grupo que consiste em:

[000186] XV+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Κ+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7E+X109A+X280S+X391A;

ΧΓ+Χ7Ν+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X7Q+X109A+X280S+X391A;

X1 *+X7L+X109A+X280S+X391 A; X1 *+X7D+X109A+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320A+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320M+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X320T+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320V+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X323R+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320S+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X280S+X391V; X1 *+X109A+X284R+X391A;

ΧΓ+Χ109A+X284F+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A;

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ΧΓ+Χ109A+X280S+X284F+X391 Α; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323N+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323K+X391 A; X1 *+X109S+X280S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391 A; X7A+X284H+X320A+X323N; X7A+X320A+X323N; X320A; X7A+X320A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X391 A; X1 *+X109A+X280S+X284H+X391A; ΧΓ+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323S+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X323N+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284F+X391 A;

ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X284R+X391 A; ΧΓ+Χ7Α+Χ109A+X280S+X320A+X323S+X391 A;

X1*+X7A+X109A+X284R+X391 A; e

X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1 e a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação às amilases apresentadas em SEQ ID NO: 8.

[000187] É preferencial que a variante de acordo com a invenção compreenda uma modificação em uma, duas, três, quatro ou cinco posições selecionada do grupo de X1*, X1A, X7A, X109A, X280S e X391A. Em uma modalidade mais preferencial, as modificações em uma, duas, três, quatro ou cinco posições são selecionadas de ΧΓ, X7A, X109A, X280S e X391A.

[000188] Em um aspecto, a invenção refere-se a variantes compreendendo modificações nas posições correspondendo a [000189] X1*+X109A+X280S+X391 A,

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61/121

ΧΓ+Χ109A+X284H+X391 A, X1 *+X109A+X280S+X320A+X323N+X391 A, X1*+X7A+X109A+X280S+X391 A, e

X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X323N+X391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[000190] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 1 compreendendo modificações nas posições correspondendo a H1*+G109A+N280S+E391 A;

H1 *+G109A+W284H+E391 A; H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A; HV+G7A+G109A+N280S+E391A; e

H1 *+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, [000191] em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO:1.

[000192] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 2 compreendendo correspondendo a H1 *+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G109A+W284H+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A;

HV+G7A+G109A+N280S+E391A; e

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 2.

[000193] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 3 compreendendo correspondendo a H1 *+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G109A+W284H+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A;

HV+G7A+G109A+N280S+E391A; e

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62/121

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 3.

[000194] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 4 compreendendo correspondendo a H1 *+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G109A+W284H+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A;

HV+G7A+G109A+N280S+E391A; e

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 4.

[000195] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 5 compreendendo correspondendo a H1 *+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G109A+W284H+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A;

HV+G7A+G109A+N280S+E391A; e

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 5.

[000196] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 6 compreendendo correspondendo a H1 *+G109A+N280S+E391 A; H1*+G109A+W284H+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A;

HV+G7A+G109A+N280S+E391A; e

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 6.

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63/121 [000197] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 7 compreendendo correspondendo a H1 *+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G109A+W284H+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A;

H1*+G7A+G109A+N280S+E391A; e

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 7.

[000198] Em uma modalidade, a invenção refere-se a variantes de SEQ ID NO: 8 compreendendo correspondendo a H1 *+G109A+N280S+E391 A; H1 *+G109A+W284H+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391 A;

H1*+G7A+G109A+N280S+E391A; e

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391 A, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, e em que a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 8.

[000199] Em uma modalidade, a variante da invenção compreende adicionalmente uma modificação em uma ou mais posições selecionadas do grupo de 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476. Em uma modalidade particular, a variante da invenção compreende uma ou mais modificações adicionais selecionadas do grupo de W140Y/F, R181*, G182*, D183*, G184*, N195F/Y, I206Y/F, Y243F,

E260A/D/C/Q/L/M/F/P/S/W/V/G/H/I/K/N/R/T/Y, G304R/K/E/Q e

G476E/Q/R/K. Em uma modalidade preferencial, a variante de acordo com a invenção compreende adicionalmente substituições em duas, três ou quatro posições selecionadas do grupo que consiste em G304R, W140YF, E260GHIKNPRTY e G476EQRK. Em uma modalidade mais preferencial, as

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64/121 substituições nas duas, três ou quatro posições são selecionadas do grupo que consiste em G304R, W140Y, E260G e G476K.

[000200] Em uma modalidade, a variante da invenção compreende as modificações correspondendo a [000201 ] H1 *+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+ Y243F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K, [000202] H1 *+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+ Y243F+E260G+W284H+G304 R+E391A+G476K, [000203] H1 *+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+ Y243F+E260G+N280S+G304R+K320A+M323N+E391A+G476K, [000204] H1 *+G7A+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I2 06Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K, e [000205] H1 *+G7A+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I2 06Y+Y243F+E260G+N280S+W284H+G304R+M323N+E391A+G476K, [000206] em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1, a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e é uma variante de SEQ ID NO: 1 [000207] Aminoácidos essenciais em um genitor podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Nesta última técnica, mutações únicas de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de alfaamilase para se identificarem resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton etal., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da alfa-amilase ou outra interação biológica pode também ser determinado por análise física da estrutura, como determinado

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65/121 por técnicas tais como a ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos do sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos etal., 1992, Science 255: 306-312; Smith etal., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptideos relacionados com o genitor.

Polinucleotídeos [000208] A presente invenção também se refere a polinucleotídeos isolados que codificam qualquer uma das variantes da presente invenção. Assim, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos isolados que codificam uma variante compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições: 109,1,7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, em que a variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e em que a variante tem atividade de alfa-amilase.

Construções de Ácido Nucleico [000209] A presente invenção também se refere a construções de ácido nucleico compreendendo um polinucleotideo que codifica uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais (várias) sequências de controle que direcionam a expressão da sequência

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66/121 codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. Assim, a presente invenção refere-se a construções de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições: 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[000210] Um polinucleotídeo pode ser manipulado de várias formas para providenciar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando os métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[000211] A sequência de controle pode ser uma sequência de promotor reconhecida por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. A sequência de promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que mostre atividade transcricional na célula hospedeira, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[000212] Exemplos de promotores adequados para

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67/121 direcionamento da transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillusamyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacilluslicheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansacarase (sacB) de Bacillussubtilis, genes xylA e xyIBóe Bacillussubtilis, operon lac de E. coll, gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor e gene da beta-lactamase procariótica (VillaKamaroff etal., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA75:3727-3731), assim como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

[000213] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfaamilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, betaglucosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de

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Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado que inclui um gene que codifica uma alfa-amilase neutra em Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados que incluem o gene que codifica alfa-amilase neutra em Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene que codifica triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados, e híbridos dos mesmos.

[000214] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[000215] A sequência de controle também pode ser uma sequência de terminador de transcrição adequada, que é reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo que codifica a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja

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69/121 funcional na célula hospedeira.

[000216] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease semelhante àtripsina de Fusarium oxysporum.

[000217] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos etal., 1992, supra.

[000218] A sequência de controle pode também ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um RNAm que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo que codifica a variante. Pode ser usada qualquer sequência líder que seja funcional na célula hospedeira.

[000219] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[000220] Os líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[000221] A sequência de controle pode também ser uma

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70/121 sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência codificante da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[000222] As sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillusniger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum.

[000223] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. CellularBiol. 15: 5983-5990.

[000224] A sequência de controle pode ser também uma região codificante de peptideo sinal que codifica um peptideo sinal ligado ao terminal N de uma variante e direciona a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotideo pode inerentemente conter uma região codificante de peptideo sinal naturalmente ligada, na mesma fase de leitura de tradução, ao segmento da região codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma região codificante de peptideo sinal que é estranha à sequência codificante. A região codificante de peptideo sinal estranha pode ser necessária quando a sequência codificante não contiver naturalmente uma região codificante de peptideo sinal. Alternativamente, a região codificante de peptideo sinal estranha pode simplesmente substituir a região codificante de peptideo sinal natural de forma a melhorar a secreção da variante. Contudo, pode ser usada qualquer

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71/121 região codificante de peptídeo sinal que direciona a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.

[000225] Sequências codificantes de peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes de peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillusstearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[000226] Sequências codificantes de peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes de peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicolainsolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[000227] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes de peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos etal., 1992, supra.

[000228] A sequência de controle pode também ser uma região codificante de propeptídeo que codifica um propeptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pro poli peptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por divagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo do

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72/121 propolipeptídeo. A região codificante de propeptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillussubtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (\NO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[000229] Quando estiverem presentes no terminal N de uma variante tanto regiões de peptídeo sinal e propeptídeo, a região de propeptídeo fica posicionada junto ao terminal N da variante e a região de peptídeo sinal fica posicionada junto ao terminal N da região de propeptídeo.

[000230] Pode também ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas dos operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor da glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor da TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae e o promotor da glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação gênica. Em sistemas eucarióticos, essas sequências reguladoras incluem o gene da di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nesses casos, o polinucleotideo que codifica a variante estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

Vetores de Expressão [000231] A presente invenção também se refere a vetores de

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73/121 expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de terminação da transcrição e tradução. Assim, a presente invenção refere-se a vetores recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As várias sequências nucleotídicas e de controle podem ser ligadas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica a variante em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante é localizada no vetor de forma que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para a expressão.

[000232] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser co nveni ente mente submetido a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar na expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[000233] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma,

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74/121 isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente dareplicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado junto com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Adicionalmente, pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[000234] O vetor com preende preferencialmente um ou mais (vários) marcadores de seleção que permitem a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos e similares.

[000235] Exemplos de marcadores bacterianos de seleção são os genes dal de Bacilluslicheniformis ou Bacillussubtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3.

[000236] O vetor compreende preferencialmente um elemento (ou elementos) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[000237] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo que codifica a variante

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75/121 ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode compreender sequências nucleotídicas adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local (ou locais) específico no cromossomo. Para aumentar a probabilidade de integração em um local específico, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares base, 400 a 10.000 pares base e 800 a 10.000 pares base, que têm um elevado grau de identidade com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser sequências nucleotídicas codificantes ou não codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[000238] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediador da replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa uma sequência nucleotídica que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[000239] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção na célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou por inclusão de

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76/121 um gene marcador de seleção amplificável com o polinucleotideo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador de seleção, e, deste modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente de seleção apropriado.

[000240] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra) para obter variantes substancialmente puras.

Células Hospedeiras [000241] A presente invenção também se refere a células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais (várias) sequências de controle que direcionam a produção de uma variante da presente invenção. Assim, a presente invenção refere-se a células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção de uma variante compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições

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140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1. Uma construção ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que a construção ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica a variante e sua fonte.

[000242] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

[000243] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coii, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[000244] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[000245] A célula hospedeira bacteriana pode ser também

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78/121 qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000246] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[000247] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168:111-115), por uso de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coll pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Fies. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada, por exemplo, por transformação de protoplastos e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode, por exemplo, ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi etal., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl.

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Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser efetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para a introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[000248] A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, de inseto, vegetal ou fúngica.

[000249] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474. Os métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182 a 187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção [000250] A presente invenção também se refere a métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula

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80/121 hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para a expressão da variante; e(b) recuperar a variante. Assim, apresente invenção refere-se a métodos de produção de uma variante, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão ou um polinucleotideo que codifica uma variante compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, sob condições adequadas para a expressão da variante; e (b) recuperar a variante.

[000251] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de obtenção de uma variante de alfa-amilase, compreendendo introduzir em uma alfa-amilase genitora uma modificação em uma ou mais posições correspondendo a posições selecionadas do grupo que consiste em 109, 7, 1, 391,280, 284, 320 e 323 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo a posições selecionadas do grupo que consiste em 140,181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, em que cada modificação é independentemente uma substituição ou deleção, e a variante tem atividade de alfa-amilase; e recuperar a variante.

[000252] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo

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81/121 fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizado em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo se realiza em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada de lisados celulares.

[000253] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Esses métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade da variante.

[000254] A variante pode ser recuperada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

[000255] A variante pode ser purificada através de vários procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e de exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por

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82/121 exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puras.

[000256] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés disso uma célula hospedeira da presente invenção expressando uma variante é usada como uma fonte da variante.

Composições [000257] Apresente invenção se refere também a composições compreendendo uma variante da presente invenção. Assim, a presente invenção refere-se a composições compreendendo uma variante compreendendo uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em uma tal variante. O termo “enriquecidas” significa que a atividade de alfa-amilase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de 1,1.

[000258] A composição pode compreender uma variante como o maior componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, betaglucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase,

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83/121 enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. A enzima (ou enzimas) adicional pode ser produzida, por exemplo, por um microrganismo que pertence ao gênero Bacillus, por exemplo, Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis, ou o gênero Aspergillus, por exemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus avamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, por exemplo., Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookv^ellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum; Humicola, por exemplo., Humicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma, por exemplo., Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride ou qualquer outra célula hospedeira descrita no presente documento.

[000259] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. A variante pode ser estabilizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[000260] De acordo com a invenção, as variantes de alfaamilase acima podem ser tipicamente um componente em uma composição de limpeza, tal como uma composição detergente, por exemplo, uma composição detergente para lavagem de roupa ou uma composição detergente para lavagem de louça. É particularmente preferencial uma

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84/121 composição detergente líquida para lavagem de roupa.

[000261] Tais composições de limpeza compreendem um adjunto detergente/de limpeza, preferencialmente uma mistura de componentes. Tipicamente, o adjunto de limpeza estará presente na composição em uma quantidade de 0,001 a 99,9% em peso, mais tipicamente de 0,01 a 80% em peso do adjunto de limpeza.

[000262] Em outro aspecto preferencial, a composição compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos, incluindo semipolares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwiteriônicos e/ou anfolíticos e/ou semipolares não iônicos e/ou misturas dos mesmos. Os tensoativos estão tipicamente presentes a um nível de 0,1% a 60% em peso ou de 0,5 a 50% em peso ou 1 a 40% em peso da composição.

Usos [000263] A presente invenção também se dirige a métodos de uso das variantes de alfa-amilase.

[000264] As variantes de alfa-amilase da invenção são úteis em composições detergentes, lavagem de roupa, lavagem de louça e/ou processos de limpeza a uma baixa temperatura.

[000265] Métodos de Uso [000266] A presente invenção também se refere a um método para limpar e/ou tratar no local uma superfície ou tecido, entre outros. Em um aspecto, tal método compreende as etapas de opcionalmente lavar e/ou enxaguar a referida superfície ou tecido, colocar a referida superfície ou tecido em contato com qualquer produto de consumo revelado na presente patente, depois é revelado opcionalmente lavar e/ou enxaguar a referida superfície ou tecido.

[000267] Tal como usada no presente documento, a lavagem

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85/121 inclui, mas não está limitada a, esfregar e agitação mecânica. A secagem de tais superfícies ou tecidos pode ser realizada por qualquer um dos meios comuns empregues, quer em ambientes domésticos ou industriais. Tais meios incluem, mas não estão limitados a, secagem com ar forçado ou ar parado à temperatura ambiente ou temperaturas elevadas a pressões entre 5 e 0,01 atmosferas na presença ou ausência de radiação eletromagnética, incluindo luz solar, infra-vermelho, ultra-violeta e irradiação por micro-ondas. Em um aspecto, a referida secagem pode ser efetuada atemperaturas acima da temperatura ambiente por utilização de um ferro de passar, em que, por exemplo, o referido tecido pode estar em contato direto com o referido ferro de passar durante períodos de tempo relativamente curtos ou até mesmo prolongados e em que pode ser exercida pressão superior àquela caso contrário normalmente presente devido a força gravitacional. Em outro aspecto, a referida secagem pode ser efetuada a temperaturas acima da temperatura ambiente por uso de um secador. Um aparelho para a secagem de tecido é bem conhecido e é frequentemente chamado de uma secadora de roupa. Além de roupa, tais aparelhos são usados para secar vários outros itens incluindo toalhas, lençóis, fronhas, fraldas e assim por diante, e tal equipamento foi aceito como uma comodidade padrão em várias nações do mundo substancialmente substituindo o uso de varais para a secagem de tecido. A maioria das secadoras em uso hoje em dia usam ar aquecido que é passado por cima e através do tecido enquanto é movimentado na secadora. O ar pode ser aquecido, por exemplo, deforma eletrônica, através de chama de gás, ou até mesmo com radiação de micro-ondas. Tal ar pode ser aquecido de cerca de 15 °C a cerca de 400 °C, de cerca de 25°C a cerca de 200 °C, de cerca de 35 °C a cerca de 100 °C, ou até mesmo de cerca de 40 °C a cerca de 85 °C e usado na secadora para secar uma superfície e/ou

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86/121 tecido. Como será constatado por um especialista na técnica, as composições de limpeza da presente invenção são idealmente apropriadas para uso em aplicações de lavagem de roupa. Assim, a presente invenção inclui um método para lavagem de um tecido. O método compreende as etapas de colocar um tecido a ser lavado em contato com a referida solução de limpeza de roupa compreendendo pelo menos uma modalidade da composição de limpeza, aditivo de limpeza ou mistura dos mesmos dos depositantes. O tecido pode compreender praticamente qualquer tecido capaz de ser lavado sob condições normais de uso do consumidor ou institucional. A solução tem preferencialmente um pH de cerca de 8 a cerca de 10,5. As composições podem ser empregues a concentrações de cerca de 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. As temperaturas da água variam tipicamente de cerca de 5 ^QC a cerca de 90 ^QC. A razão entre a água e o tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

A seguir são exemplificadas composições detergentes.

[000268] Tabela 1: Exemplos de composições detergentes granulares de lavagem de roupa concebidas para lavagem à mão ou em máquinas de lavar com abertura superior. Cada composição detergente granular de lavagem de roupa é numerada de 1 a 6 de modo a diferenciar uma composição das outras.

	1 (% em peso)	2 (% em peso)	3 (% em peso)	4 (% em peso)	5 (% em peso)	6 (% em peso)
Alquilbenzenossulfonato linear	20	22	20	15	20	20
Cloreto de C12-14 d I metil-	0,7	0,2	1	0,6	0,0	0

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hidroxietilamônio
AE3S	0,9	1	0,9	0,0	0,5	0,9
AE7	0,0	0,0	0,0	1	0,0	3
Tripolifosfato de sódio	5	0,0	4	9	2	0,0
Zeólito A	0,0	1	0,0	1	4	1
Silicato 1,6R (SiO2:Na2O uma razão de 1,6:1)	7	5	2	3	3	5
Carbonato de sódio	25	20	25	17	18	19
Poliacrilato PM 4500	1	0,6	1	1	1,5	1
Copolímero de enxerto aleatórios¹	0,1	0,2	0,0	0,0	0,0	0,0
Carboximetilcelulose	1	0,3	1	1	1	1
Protease (Savinase(Ê 32,89 mg ativa/g)	0,1	0,1	0,1	0,1		0,1
Lipase - Lipex® (18 m ativa/g)	0,03	0,07	0,3	0,1	0,07	0,4
*Amilase da present invenção (mg ativa)	0,63	1,0	2,0	0,44	0,88	0,3
Branqueador fluorescent 1	0,06	0,0	0,06	0,18	0,06	0,06
Branqueador fluorescent 2	0,1	0,06	0,1	0,0	0,1	0,1
DTPA	0,6	0,8	0,6	0,25	0,6	0,6
MgSO4	1	1	1	0,5	1	1
Percarbonato de sódio	0,0	5,2	0,1	0,0	0,0	0,0
Perborato de sódio	4,4	0,0	3,85	2,09	0,78	3,63

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mono-hidratado
NOBS	1,9	0,0	1,66	0,0	0,33	0,75
TAED	0,58	1,2	0,51	0,0	0,015	0,28
Ftalocianina de zinco sulfonada	0,0030	0,0	0,0012	0,0030	0,0021	0,0
S-ACMC	0,1	0,0	0,0	0,0	0,06	0,0
Violeta direto 9	0,0	0,0	0,0003	0,0005	0,0003	0,0
Azul ácido 29	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0003
Sulfato/umidade	Saldo

[000269] *A amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

[000270] Tabela 2: Outros exemplos (numerados 7 a 12 abaixo na tabela 2) de composições detergentes granulares de lavagem de roupa concebidas para máquinas de lavar automáticas com abertura frontal.

	7 (% por peso)	8 (% por peso)	9 (% por peso)	10 (% por peso)	11 (% por peso)	12 (% por peso)
Alquilbenzenossulfonato linear	8	7,1	7	6,5	7,5	7,5
AE3S	0	4,8	0	5,2	4	4
Sulfato de alquila C12-14	1	0	1	0	0	0
AE7	2,2	0	3,2	0	0	0
Cloreto de C10-12 dimetilhidroxietilamônio	0,75	0,94	0,98	0,98	0	0
Silicate cristalino em camadas (ô-Na2SÍ20s)	4,1	0	4,8	0	0	0

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Zeólito A	5	0	5	0	2	2
Ácido cítrico	3	5	3	4	2,5	3
Carbonato de sódio	15	20	14	20	23	23
Silicato 2R (SiO2:Na2O a uma razão de 2:1)	0,08	0	0,11	0	0	0
Agente de liberação de sujidade	0,75	0,72	0,71	0,72	0	0
Copolímero de ácido acrílico/ácido maleico	1,1	3,7	1,0	3,7	2,6	3,8
Carboximetilcelulose	0,15	1,4	0,2	1,4	1	0,5
Protease - Purafect® (84 mg ativa/g)	0,2	0,2	0,3	0,15	0,12	0,13
Lipase - Lipex® (18,00 mg ativa/g)	0,05	0,15	0,1	0	0	0
Celulase - Celluclean™ (15,6 mg ativa/g)	0	0	0	0	0,1	0,1
*Amilase da presente invenção (mg ativa)	4,0	2,0	1,0	0,7	6,0	3,0
Amilase⁴	0,15	0,04	0,03	-	0,01	0,16
TAED	3,6	4,0	3,6	4,0	2,2	1,4
Percarbonato	13	13,2	13	13,2	16	14
Sal de Na do ácido etilenodiamina-N,N'dissuccínico, isômero (S,S) (EDDS)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Hidroxietano difosfonato (HEDP)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2

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MgSOí	0,42	0,42	0,42	0,42	0,4	0,4
Perfume	0,5	0,6	0,5	0,6	0,6	0,6
Aglomerado supressor de espuma	0,05	0,1	0,05	0,1	0,06	0,05
Sabão	0,45	0,45	0,45	0,45	0	0
Ftalocianina de zinco sulfonada (ativa)	0,000 7	0,001 2	0,000 7	0	0	0
S-ACMC	0,01	0,01	0	0,01	0	0
Violeta direto 9 (ativo)	0	0	0,000 1	0,000 1	0	0
Sulfato/água e diversos	Saldo

[000271] *A amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

[000272] Tabela 3: Exemplos de composições detergentes líquidas de lavagem pesada (numeradas 13 a 18)

	13 (% por peso)	14 (% por peso)	15 (7o por peso)	16 (7o por peso)	17 (7o por peso)	18 (7o por peso)
Alquil(Ci2-i5 )etoxi(1,8)sulfato	14,7	11,6		16,31		17,29
Sulfonate de alquil(Ci 1,8 )benzeno	4,3	11,6	8,3	7,73	117	7,73
Sulfato de alquila ramificada C16-17	17	1,29		3,09		3,3
Alquila C12-14 com 9 etoxilatos	0,9	1,07		1,31		1,31
Óxido de dimetilamina C12	0,6	0,64		1,03		1,03

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Ácido cítrico	3,5	0,65	3	0,66	2,27	0,67
Ácido graxo C12-18	1,5	2,32	3,6	1,52	0,82	1,52
Borato de sódio (Borax)	2,5	2,46	1,2	2,53		2,53
Alquil(Ci2-i4)etoxi 3 sulfato de sódio			2,9		3,9
Alquila C14-15 com 7 etoxilatos			4,2		1,9
Alquila C12-14 com 7 etoxilatos			1,7		0,5
Cloreto de Ca di-hidratado					0,045
Formato de Ca	0,09	0,09		0,09		0,09
Um composto: bis((C2H₅O)(C2H4O)n)(CH3)- N⁺-CxH2x-N⁺-(CH3)bis((C2H₅O)(C2H4O)n); n é 20 a 30; x é 3 a 8, opcionalmente sulfatado ou sulfonado			1,2		0,66
Copolímero com enxertos aleatórios¹		1,46	0,5		0,83
Polietilenimina etoxilada²	1,5	1,29		1,44		1,44
Ácido dietileno triamina penta-acético	0,34	0,64		0,34		0,34
Dietileno triamina penta (ácido metileno fosfônico)			0,3		0,3
Ácido 1 -hidroxietilideno-1,1difosfônico					0,18
Hidrato do sal dissódico do ácido di-hidroxibenzeno-3,5-						0,19

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dissulfônico
Ti nopal AMS-GX		0,06				0,29
Tinopal CBS-X	0,2	0,17		0,29
Ti nopal TAS-X B36					0,091
Polímero alcoxilado anfifílico de limpeza de gordura³	1,28	1	0,4	1,93		1,93
CHEC			0,2
Etanol	2	1,58	1,6	5,4	1,2	3,57
Propilenoglicol	3,9	3,59	1,3	4,3		3,8
Dietilenoglicol	1,05	1,54		1,15		1,15
Polietilenoglicol	0,06	0,04		0,1		0,1
*Amilase da presente invenção (mg ativa)	15,0	10,0	5,0	8,0	4,25	11,7
Amilase⁴	0,01	0,1	0,15	0,12	-	0,05
Monoetanolamina	3,05	2,41	0,4	1,26	0,31	1,13
NaOH	2,44	1,8		3,01	3,84	0,24
Cumeno sulfonato de sódio			1		0,95
Formato de sódio		0,11		0,09	0,2	0,12
Água, componentes de estética (corantes, perfumes) e componentes minoritários (enzimas incluindo lipase, protease, amilase adicional, cada uma a 0,2% de proteína ativa, solventes, estruturantes)	saldo

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93/121 [000273] ¹Copolímero com enxertos aleatórios é um copolímero de óxido de polietileno com enxertos de acetato de polivinila que tem uma cadeia principal de óxido de polietileno e várias cadeias laterais de acetato de polivinila. O peso molecular da cadeia principal de óxido de polietileno é de cerca de 6000 e a razão em peso entre o óxido de polietileno e o acetato de polivinila é cerca de 40 a 60 e não mais do que 1 ponto de enxertia por 50 unidades de óxido de etileno.

[000274] 2 Polietilenimina (PM = 600) com 20 grupos etoxilato por -NH.

[000275] 3 Polímero alcoxilado anfifílico de limpeza de gordura é uma polietilenimina (PM = 600) com 24 grupos etoxilato por -NH e 16 grupos propoxilato por-NH [000276] *A amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

[000277] Tabela 4: Exemplos de composições detergentes líquidas de lavagem pesada (numeradas 19 a 21)

	19 (% por peso)	20 (% por peso)	21 (% por peso)
Alquilbenzeno sulfonato de sódio	21,0	10,2	3,53
Alquila C124-18 com 1,5 a 9 etoxilatos	18,0	6,32	0,88
Sulfato de alquila ramificada			2,44
Alquiletoxi 1-3 sulfato de sódio		1,17	14,81
Ácido cítrico		3,14	2,05
Óxido de dimetilamina C12			0,56
Ácido graxo C12-18	15,0	2,59	1,48
Protease (Purafect Prime®, 40,6 mg	1,5	0,52	1,64

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ativa/g)
Mananase (Mannaway®, 11 mg ativa/g)	0,1	0,06
Xiloglucanase (Whitezyme®, 20 mg ativa/g)	0,2	0,06
Lipase (ILipex)	0,1	0,2	0,05
*Amilase da presente invenção (mg ativa)	5,9	2,3	12,8
bis((C2H₅O)(C2H4O)n)(CH3)-N⁺-CxH2xN⁺-(CH3)-bis((C2H₅O)(C2H4O)n), em que n = de 20 a 30; e x = de 3 a 8, opcionalmente sulfatado ou sulfonado	2,0	0,63
Copolímero com enxertos aleatórios¹		1,07
Polietilenimina etoxilada²	0,8		1,51
Polímero alcoxilado anfifílico³
Amilase⁴
Quelante fosfonado	0,8	0,41	0,53
Hidrótropo		0,93
Branqueador	0,2	0,09	0,19
Corante tonalizante de tiofeno etoxilado	0,004
Componentes minoritários: corantes, perfume, microcápsulas de perfume, enzimas, estabilizadores de enzimas, solventes, estruturantes, agentes modificadores do pH	Saldo	Saldo	Saldo

[000278] *A amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

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95/121 [000279] **Com base no peso total da composição de limpeza e/ou tratamento, um total de no máximo 7% de água.

Matérias-primas e Observações para os Exemplos de Composições 1 a 21 [000280] Alquilbenzenossulfonato linear que tern um comprimento médio de cadeia de carbonos alifática de C11-C18 [000281] Cloreto de C12-18 dimetil-hidroxietilamônio [000282] AE3S é alquil(C12-15)etoxi (3) sulfato [000283] AE7 é álcool C12-15 etoxilado, com um grau médio de etoxilação de 7 [000284] AE9 é álcool C12-16 etoxilado, com um grau médio de etoxilação de 9 [000285] HSAS é um sulfato de alquila primária ramificada intermediária com comprimento da cadeia de carbonos de cerca de 16 a 17 como revelado em US 6.020.303 e US 6.060.443 [000286] O poliacrilato PM 4500 é fornecido pela BASF [000287] A carboximetiIcelulose é Finnfix® V fornecida pela CP Kelco, Arnhem, Países Baixos [000288] CHEC é um polímero de hidroxietilcelulose modificado de forma catiônica.

[000289] Os quelantes fosfonados são, por exemplo, ácido dietilenotetra-amina penta-acético (DTPA) Hidroxietano difosfonato (HEDP) [000290] Savinase®, Natalase®, Stainzyme®, Lipex®, CellucleanTM, Mannaway® e Whitezyme® são todos produtos da Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca.

[000291] Purafect®, Purafect Prime® são produtos da Genencor International, Paio Alto, Califórnia, E.U.A.

[000292] O branqueador fluorescente 1 é Tinopal® AMS, o

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96/121 branqueador fluorescente 2 é Tinopal® CBS-X, Violeta direto 9 é Pergasol® Violet BN-Z NOBS é nonanoiloxibenzenossulfonato de sódio [000293] TAED é tetra-acetiletilenodiamina [000294] S-ACMC é carboximetilcelulose conjugada com C.l. azul reativo 19 nome do produto AZO-CM-CELLULOSE [000295] O agente de liberação de sujidade é Repel-o-tex® PF [000296] O copolímero de ácido acrílico/ácido maleico tem peso molecular de 70.000 e razão de acrilato:maleato de 70:30 [000297] EDDS é um sal de sódio do ácido etilenodiamina-N,N'dissuccínico, isômero (S,S) O aglomerado supressor de espuma é fornecido pela Dow Corning, Midland, Michigan, E.U.A.

[000298] HSAS é um sulfato de alquila ramificada intermediária [000299] Liquitint® Violet CT é fornecido pela Milliken, Spartanburg, Carolina do Sul, E.U.A.

[000300] 1 Copolímero com enxertos aleatórios é um copolímero de óxido de polietileno com enxertos de acetato de polivinila que tem uma cadeia principal de óxido de polietileno e várias cadeias laterais de acetato de polivinila. O peso molecular da cadeia principal de óxido de polietileno é de cerca de 6000 e a razão em peso entre o óxido de polietileno e o acetato de polivinila é cerca de 40 a 60 e não mais do que 1 ponto de enxertia per 50 unidades de óxido de etileno.

[000301] 2 Polietilenoimina (PM = 600) com 20 grupos etoxilato por -NH.

[000302] 3 O polímero alcoxilado anfifílico é uma polietilenimina (PM 600), preparado a partir de um polímero que é derivatizado para conter 24 grupos etoxilato por -NH e 16 grupos propoxilato por -NH.

[000303] Amilase⁴ é qualquer uma de a) a k) no presente

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97/121 documento (mg de proteína ativa).

[000304] Tabela 5: Exemplos de composições detergentes de dose unitária de lavagem de roupa (numeradas 22 a 26). Cada formulação de dose unitária pode compreender um ou vários compartimentos.

	22 (% por peso)	23 (% por peso)	24 (% por peso)	25 (% por peso)	26 (% por peso)
Ácido alquilbenzenossulfônico	14,5	14,5	14,5	14,5	14,5
Alquil(Ci2-is)etoxi 3 sulfato	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5
Alquila C12-18 com 7 etoxilatos	13,0	13,0	13,0	13,0	13,0
Ácido cítrico	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
Ácido graxo	14,8	14,8	14,8	14,8	14,8
*Amilase da presente invenção (mg ativa)	6	12	8	2	10
Polietilenimina etoxilada¹	4,0	4,0	4,0	4,0	4,0
Protease (Purafect Prime®, 40,6 mg ativa/g)	1,4	2,0	0,9	1,2	0
Celulase (Celluclean, proteína ativa)	0,1	0,2			0,1
Amilase⁴ (proteína ativa) a) a k) no presente documento	0,1	0,05	0,1	0,2	0,1
Ácido hidroxietano difosfônico	1,2	1,2	1,2	1,2	1,2
Branqueador	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3
P-diol	15,8	13,8	13,8	13,8	13,8
Glicerol	6,1	6,1	6,1	6,1	6,1

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MEA	8,0	8,0	8,0	8,0	8,0
TIPA	-	-	2,0	-	-
TEA	-	2,0	-	-	-
Cume no sulfonate	-	-	-	-	2,0
Ciclo-hexil dimetanol	-	-	-	2,0	-
Água	10	10	10	10	10
Estruturante	0,14	0,14	0,14	0,14	0,14
Perfume	1,9	1,9	1,9	1,9	1,9
Tampões (monoetanolamina)	Até pH 8,0
Solventes (1,2 propanediol, etanol)	Até 100%

[000305] *A amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

[000306] 1 Polietilenimina (PM = 600) com 20 grupos etoxilato por -NH.

[000307] Tabela 6: Exemplo de composição de dose unitária de vários compartimentos (numerada 27). Formulações detergentes de dose unitária de vários compartimentos de lavagem de roupa da presente invenção são fornecidas abaixo. Nesses exemplos, a dose unitária tem três compartimentos, mas composições similares podem ser preparadas com dois, quatro ou cinco compartimentos. O filme usado para encapsular os compartimentos é álcool polivinílico.

Composição de base 1	27 (% por peso)
Glicerol (mín. 99)	5,3

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99/121

1,2-propanodiol	10,0
Ácido cítrico	0,5
Monoetanolamina	10,0
Soda cáustica	-
Dequest 2010	1,1
Sulfito de potássio	0,2
*Amilase da presente invenção (mg ativa)	8,0
Marlipal não iônico C24EO7	20,1
HLAS	24,6
Branqueador óptico FWA49	0,2
Ácido graxo C12-15	16,4
Polímero Lutensit Z96	2,9
Polietilenoimina etoxilada PEI600 E20	1,1
MgCI2	0,2
Solventes (1,2 propanediol, etanol)	A 100%

[000308] Tabela 7: Formulações de vários compartimentos (numeradas como composição 1 ou 2 e com uma designação de compartimento [A, B ou C]).

Composição	1		2
Compartimento	A	B	C	A	B	C
Volume de cada compartimento	40 ml	5 ml	5 ml	40 ml	5 ml	5 ml
Material ativo em % em peso

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100/121

Perfume	1,6	1,6	1,6	1,6	1,6	1,6
Corantes	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
TiO2	0,1	-	-	-	0,1	-
Sulfito de sódio	0,4	0,4	0,4	0,3	0,3	0,3
Acusol 305	1,2			2	-	-
Óleo de rícino hidrogenado	0,14	0,14	0,14	0,14	0,14	0,14
Composição de base 1	Adicionar até 100%	Adicionar até 100%	Adicionar até 100%	Adicionar até 100%	Adicionar até 100%	Adicionar até 100%

[000309] *A amilase da presente invenção é mostrada como mgs de enzima ativa por 100 g de detergente.

[000310] As dimensões e valores revelados no presente documento não devem ser entendidos como sendo estritamente limitados aos valores numéricos exatos mencionados. Em vez disso, salvo especificado de outro modo, cada uma de tais dimensões pretende significar tanto o valor mencionado como uma faixa funcionalmente equivalente entorno deste valor. Por exemplo, uma dimensão revelada como “40 mm” pretende significar “cerca de 40 mm”.

EXEMPLOS

Ensaio de pNP-G7 para a determinação da atividade de alfa-amilase [000311] A atividade de alfa-amilase pode ser determinada por um método empregando o substrato G7-pNP. G7-pNP que éuma abreviação para 4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(Gi)-a,D-malto-heptaosídeo, um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase, tal como uma alfa-amilase. Após a divagem, a alfa-glucosidase incluída no kit digere o substrato hidrolisado ainda mais para liberar uma molécula de PNP livre que tem uma cor amarela e, assim, pode ser medida por

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101/121 espectrofotometria visível em λ=405 nm (400 a 420 nm.). Os kits que contêm o substrato G7-pNP e alfa-glucosidase são fabricados pela Roche/Hitachi (N.^Q de cat. 11876473).

[000312] REAGENTES:

[000313] O substrato G7-pNP desse kit contém 4,6-etilidenoG7-pNP 22 mM e HEPES 52,4 mM (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1 -piperaziniI]etanossulfônico), pH 7,0).

[000314] O reagente de alfa-glucosidase contém HEPES 52,4 mM, NaCI 87 mM, MgCI2 12,6 mM, CaCI2 0,075 mM, > 4 kU/L de alfaglucosidase.

[000315] A solução de trabalho do substrato é feita por mistura de 1 mL do reagente de alfa-glucosidase com 0,2 mL do substrato G7-pNP. Essa solução de trabalho do substrato é feita imediatamente antes de ser utilizada.

[000316] Tampão de diluição: MOPS 50 mM, 0,05% (p/v) de Triton X100 (éter p-(1,1,3,3-tetrametiIbutil)-fenílico de polietilenoglicol (Ci4H22O(C2H4O)n (η = 9 a 10))), CaCl2 1 mM, pH 8,0.

[000317] PROCEDIMENTO:

[000318] A amostra de amilase a ser analisada foi diluída em tampão de diluição para assegurar que o pH da amostra diluída é 7. O ensaio foi realizado transferindo-se 20 pLde amostras de enzima diluídas para placa de microtitulação de 96 poços e adicionando-se 80 pL de solução de trabalho de substrato. A solução foi misturada e pré-incubada 1 minuto à temperatura ambiente e a absorção é medida a cada 20 segundos durante 5 minutos em DO 405 nm.

[000319] O coeficiente angular (absorbância por minuto) da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à

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102/121 atividade específica (atividade por mg de enzima) da alfa-amilase em questão sob determinado conjunto de condições. A amostra de amilase deve ser diluída para um nível em que o coeficiente angular fique abaixo de 0,4 unidade de absorbância por minuto.

Ensaio de tensão mecânica automática (AMSA) para lavagem de roupa [000320] A fim de avaliar o desempenho de lavagem em roupa são realizados experimentos de lavagem, usando o ensaio de tensão mecânica automática (AMSA, do inglês Automatic Mechanical Stress Assay). Com o AMSA, o desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções detergentes de enzima de volume pequeno pode ser examinado. A placa de AMSA tem vários compartimentos para soluções de teste e uma tampa que aperta firmemente a amostra de roupa, o têxtil a ser lavado, contra todas as aberturas dos compartimentos. Durante o tempo de lavagem, a placa, soluções de teste, têxtil e tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicar tensão mecânica de um modo regular, periodicamente oscilante. Para descrição adicional ver WO 02/42740, especialmente o parágrafo “Special method embodiments” nas páginas 23 a 24.

Descrição geral do desempenho de lavagem [000321] É preparada uma solução de teste compreendendo água (10 °dH), detergente, por exemplo, 5,1 g/L de detergente líquido europeu como descrito abaixo, e a enzima da invenção, por exemplo, a uma concentração de 0, 0,8 e/ou 1,2 mg de proteína enzimática/L. Tecidos manchados com amido (por exemplo CS-28 do Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Baixos) são adicionados e lavados durante 20 minutes a 20 °C. Após enxágue abundante com água da

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103/121 torneira corrente e secagem na escuridão, a intensidade da luz ou valores de refletância dos tecidos manchados são subsequentemente medidos como uma medida de desempenho de lavagem. O teste com 0 mg de proteína enzimática/L é usado como branco para obter um valor de remissão delta. Preferencialmente é aplicada ação mecânica durante a etapa de lavagem, por exemplo, na forma de sacudidela, rotação ou agitação da solução de lavagem com os tecidos.

[000322] Os experimentos de desempenho de lavagem AMSA foram realizados sobas condições experimentais abaixo especificadas:

[000323] Tabela 8: Condições experimentais de AMSA

Dosagem de detergente líquido de lavagem de roupa	5,7 g/L de detergente líquido europeu (EU) (cf. Exemplo 1A) ou 0,8 g/L de detergente líquido da América do Norte (E.U.A.) (cf. Exemplo 1B)
Volume de solução de teste	160 micro L
pH	como é
Tempo de lavagem	5 a 20 minutos, de preferência 20 minutos
Temperatura	15 a 40 °C, de preferência 20 °C
Dureza da água	10 °dH, Ca²⁺:Mg²⁺: HCO3- = 3:1:6
Concentração de enzima na solução de teste	0,8 e 1,2 mg/L
Material de teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

[000324] Tampão de diluição de amilase: A amilase foi diluída em água ultrapura (água MilliQ) com uma concentração pequena de cálcio (0,1 mM) para estabilizar a amilase durante armazenamento e 0,01% de Triton X-100 para reduzir o risco de adsorção da proteína enzimática a recipientes e pipetas.

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104/121 [000325] A dureza da água foi ajustada para 10 °dH por adição de CaCl2, MgCl2 e NaHCOs (Ca²⁺:Mg²⁺:HCO3- = 3:1:4,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram enxaguados em água da torneira e secos.

[000326] O desempenho de lavagem é medido como o brilho da cor do têxtil lavado. O brilho também pode ser expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

[000327] As medições de cor são feitas com um digitalizador de mesa profissional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Brondby, Dinamarca), que é usado para capturar uma imagem do têxtil lavado.

[000328] Para extrair um valor para a intensidade da luz a partir das imagens digitalizadas, os valores de pixel de 24 bits da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado por adição dos valores RGB como vetores e depois consideração do comprimento do vetor resultante:

Int =^r² + g² + b² [000329] Os resultados do teste AMSA de lavagem de roupa de diferentes variantes são mostrados nas Tabelas 1 e 2. No resultado o índice é 100. O resultado de desempenho da alfa-amilase genitora é atribuído o valor de 100 e os resultados das variantes são comparados com esse valor. Desempenho de lavagem de TOM [000330] A dureza da água foi ajustada para a força descrita abaixo por adição de CaCl2, MgCl2 e NaHCOs. Soluções de lavagem foram preparadas com a quantidade de detergente, temperatura e dureza da água

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105/121 desejadas em um balde como descrito abaixo. O detergente foi dissolvido durante agitação magnética por 10 minutos (a solução de lavagem foi usada dentro de 30 a 60 minutos após preparação).

[000331] A temperatura e rotação (rpm) no banho de água no tergotômetro foram ajustadas de acordo com as configurações abaixo na tabela 2. Tendo ajustado a temperatura de acordo com as configurações (tolerância é +/- 0,5 °C), a solução de lavagem foi adicionada a um béquer de TOM de acordo com a quantidade descrita abaixo.

[000332] A agitação no béquer foi realizada a 200 rpm. 2 amostras de tecido com amido de arroz preparadas à mão (HM CS-28), 2 amostras de tecido com amido de tapioca preparadas à mão (HM CS-29) e lastro foram adicionados a cada um dos béqueres e a lavagem foi realizada de acordo com o tempo mencionado abaixo. As amostras de tecido foram enxaguadas em água de torneira fria durante 5 minutos e colocadas em um saco para lavar roupa e enxaguadas em uma máquina de lavar (AEG ÕKO LAVAMAT 86820) com o programa “STIVN”. As amostras de tecido foram separadas e deixadas secar entre papel de filtro em um armário de secagem sem calor ao longo da noite.

[000333] As amostras têxteis HM CS-28 (amido de arroz em algodão, 5x5 cm, amido aplicado em um círculo de 2,5 cm de diâmetro) e HM CS-29 (amido de tapioca em algodão, 5x5 cm, amido aplicado em um círculo de 2,5 cm de diâmetro) foram obtidas do Center for Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos.

[000334] Algodão branco tricotado foi usado como lastro e foi obtido da Warwick Equest Ltd, Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham, DH8 6BN Reino Unido.

[000335] Tabela 9: Condições experimentais

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106/121

	Condições europeias usando WE SUD	Condições europeias usando WE HDL
Dosagem de detergente	1,87 g/L	5,30 g/L
Concentração de enzima na solução de lavagem	0,065 mg de proteína enzimática/L	0,2 mg de proteína enzimática/L
Dureza da água	20,6 °dH (Ca2+:Mg2+:HCO3- = 4:1:7,5)
Volume de solução de teste	1000 mL
Tempo de lavagem	5 a 15 minutos, de preferência 15 minutos
Rotação	200 rpm
pH	como é
Temperatura	15 a 40 °C, de preferência a 15 °C

[000336] Os detergentes e materiais de teste foram os seguintes:

Detergente líquido de lavagem de roupa	Condições europeias (WE): WE SUD como descrito no Exemplo 2A abaixo e WE HDL como descrito no Exemplo 2B abaixo (Detergente K).
Material de teste	HM CS-28 (amido de arroz em algodão, amostra de tecido de 5x5 cm com amido aplicado em um círculo de 2,5 cm de diâmetro), HM CS-29 (amido de tapioca em algodão, amostra de tecido de 5x5 cm com

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107/121

	amido aplicado em um círculo de 2,5 cm de diâmetro).
Lastro	Algodão branco tricotado em tamanho de 5x5 cm adicionado a um peso total de 40 g (40 g incluindo todas as amostras de tecido, isto é, lastro e material de teste).

[000337] O desempenho de lavagem foi medido como o brilho da cor do têxtil lavado expresso em valores de remissão (REM). As medições de remissão foram feitas com o uso de um espectrofotômetro Macbeth ColorEye 7000. Cada uma das amostras de tecido secas foi medida. Como há um risco de interferência devido ao fundo, as amostras de tecido foram colocadas em cima de 2 camadas de tecido durante a medição da remissão. A remissão foi medida a 460 nm. O filtro de UV não foi incluído. Um resultado médio foi calculado para a remissão das amostras de tecido.

[000338] O desempenho de lavagem de diferentes variantes é mostrado na tabela 5 como Fator de Melhoramento (FM) e é calculado como mostrado abaixo:

FM = REMvariante — REMBranco REMEnzima de referência—REMBranco

Exemplo 1

Desempenho de lavagem de alfa-amilases usando o ensaio de tensão mecânica automática [000339] De forma a avaliar o desempenho de lavagem das alfa-amilases em uma composição de base de detergente, podem ser realizados experimentos de lavagem usando o ensaio de tensão mecânica automática (AMSA, do inglês “Automatic Mechanical Stress Assay”). Com o

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108/121 teste AMSA, o desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções detergentes de enzima de volume pequeno pode ser examinado. A placa de AMSA tem vários compartimentos para soluções de teste e uma tampa que aperta firmemente a amostra têxtil a ser lavada contra todas as aberturas dos compartimentos. Durante o tempo de lavagem, a placa, soluções de teste, têxtil e tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicar tensão mecânica de um modo regular, periodicamente oscilante. Para descrição adicional ver WO 02/42740, especialmente o parágrafo “Special method embodiments” nas páginas 23 a 24.

Descrição geral do desempenho de lavagem [000340] É preparada uma solução de teste compreendendo água (6 °dH ou 15 °dH), 0,79 g/L de detergente, por exemplo, detergente modelo J como descrito abaixo, e a enzima da invenção a uma concentração de 0 ou 0,2 mg de proteína enzimática/L. Tecidos manchados com amido (CS-28do Center For Test materials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Baixos) são adicionados e lavados durante 10 minutos a 20 °C e 40 °C, ou alternativamente 10 minutos a 20 °C e 30 °C como especificado nos exemplos. Após enxágue abundante sob água da torneira corrente e secagem na escuridão, os valores de intensidade da luz dos tecidos manchados são subsequentemente medidos como uma medida do desempenho de lavagem. O teste com 0 mg de proteína enzimática/L é usado como branco e correspondeu à contribuição do detergente. De preferência, a ação mecânica é aplicada durante a etapa de lavagem, por exemplo sob a forma de sacudidela, rotação ou agitação da solução de lavagem com o tecido. Os experimentos de desempenho de lavagem de AMSA podem ser conduzidos sob as condições experimentais especificadas

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109/121 abaixo:

[000341] Tabela A: Condição experimental

Detergente	Detergente líquido modelo J (ver a tabela B)
Dosagem de detergente	0,79 g/L
Volume de solução de teste	160 micro L
pH	Como é
Tempo de lavagem	10 minutos
Temperatura	20 °C ou 30 °C
Dureza da água	6 °dH
Concentração de enzima no teste	0,2 mg de proteína enzimática/L e 0,05 mg de proteína enzimática/L
Material de teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

[000342] Tabela B: Detergente modelo J

Composto	Teor do composto (% p/p)	% de componente ativo (% p/p)
LAS	5,15	5,00
AS	5,00	4,50
AEOS	14,18	10,00
Ácido graxo de coco	1,00	1,00
AEO	5,00	5,00
MEA	0,30	0,30
MPG	3,00	3,00

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110/121

Etanol	1,50	1,35
DTPA (como sal de Nas)	0,25	0,10
Citrato de sódio	4,00	4,00
Formato de sódio	1,00	1,00
Hidróxido de sódio	0,66	0,66
H2O, com troca iônica	58,95	58,95

[000343] A dureza da água foi ajustada para 6 °dH por adição de CaCl2, MgCl2 e NaHCOs (Ca²⁺:Mg²⁺:HCO³’ = 2:1:4,5) ao sistema de teste.

Após lavagem, os têxteis foram enxaguados em água de torneira e secos.

[000344] Tabela C: Condição experimental

Detergente	Detergente líquido modelo A (ver a tabela D)
Dosagem de detergente	3,33 g/L
Volume de solução de teste	160 micro L
pH	Como é
Tempo de lavagem	10 minutos
Temperatura	20 °C ou 40 °C
Dureza da água	15 °dH
Concentração de enzima no teste	0,2 mg de proteína enzimática/L, 0,05 mg de proteína enzimática/L
Material de teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

[000345] Tabela D: Detergente modelo A

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111/121

Composto	Teor do composto (% p/p)	% de componente ativo (% p/p)
LAS	12,00	11,60
AEOS, SLES	17,63	4,90
Ácido graxo de soja	2,75	2,48
Ácido graxo de coco	2,75	2,80
AEO	11,00	11,00
Hidróxido de sódio	1,75	1,80
Etanol / Propan-2ol	3,00	2,70/0,30
MPG	6,00	6,00
Glicerol	1,71	1,70
TEA	3,33	3,30
Formato de sódio	1,00	1,00
Citrato de sódio	2,00	2,00
DTMPA	0,48	0,20
PCA	0,46	0,18
Fenoxietanol	0,50	0,50
H2O, com troca iônica	33,64	33,64

[000346] A dureza da água foi ajustada para 15 °dH por adição de CaCl2, MgCl2 e NaHCOs (Ca²⁺:Mg²⁺:HCO³’ = 4:1:7,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram enxaguados em água de torneira e secos.

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112/121 [000347] Tabela E: Condição experimental

Detergente	[Composição detergente K]
Dosagem de detergente	5,3 g/L
Volume de solução de teste	160 micro L
pH	Como é
Tempo de lavagem	10 minutos
Temperatura	20 °C ou 40 °C
Dureza da água	15 °dH
Concentração de enzima no teste	0,2 mg de proteína enzimática/L, 0,05 mg de proteína enzimática/L
Material de teste	CS-28 (Amido de arroz em algodão)

[000348] Tabela F: Detergente K (como mencionado na tabela abaixo)

Composto	Teor do composto (% em peso ativo)
Alquilbenzeno sulfonate de sódio	8,7
Alquiletoxi 3 sulfato de sódio	1,0
Alquila C12-18 com 1,5 a 7 etoxi latos	5,3
Ácido cítrico	3,1
Branqueador óptico	0,05

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113/121

Polipropilenoglicol 1,1

Quelante fosfonado	0,5
Componentes minoritários (corantes, perfumes, enzimas, estabilizadores de enzimas, solventes, estruturantes, polímeros) e água	até 100%

[000349] A dureza da água foi ajustada para 15 °dH por adição de CaCI2, MgCI2 e NaHCO3 [000350] (Ca2+:Mg2+:HCO3- = 4:1:7,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram enxaguados em água de torneira e secos.

[000351] O desempenho de lavagem é medido como o brilho expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

[000352] As medições de cor são feitas com um digitalizador de mesa profissional (EPSON Expression 10000XL, EPSON) usado para capturar uma imagem do têxtil lavado.

[000353] Para extrair um valor para a intensidade da luz a partir das imagens digitalizadas, os valores de pixel de Cor com 48->24 Bits da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado por adição dos valores RGB como vetores e depois consideração do comprimento do vetor resultante:

Inl =f²+g² +b²

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114/121 [000354] Os desempenhos de lavagem das variantes de acordo com a invenção são mostrados nas tabelas abaixo. A tabela 3 mostra os resultados obtidos a partir do experimento de avaliação do desempenho de lavagem nos detergentes modelos A (tabela D) e J (tabela B) em diferentes concentrações (0,05 mg de enzima/L de detergente e 0,2 mg de enzima/L de detergente), e a diferentes temperaturas (20 °C e 40 °C). A tabela 4 mostra os resultados obtidos a partir do experimento de avaliação do desempenho de lavagem no detergente K (tabela F) em diferentes concentrações (0,05 mg de enzima/L de detergente e 0,2 mg de enzima/L de detergente) e a diferentes temperaturas (20 °C e 40 °C).

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115/121 [000355] Tabela 10: Resultados do desempenho de lavagem em detergentes modelo

Mutações	0,05 mg/L-A-20C	0,2 mg/L-A-20C	0,05 mg/L-A-40C	0,2 mg/L-A-40C	0,05 mg/L-J-20C	0,2 mg/L-J-20C	0,05 mg/L-J-30C	0,2 mg/L-J-30C
SEQ ID NO: 2 + H1 *+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391 A	4,7	1,5	2,3	1,1	2,7	1,1	3,5	1,5
SEQ ID NO: 2+ G7A+W284H+K320A+M323N	4,7	1,4	1,8	1,0	3,0	1,1	2,0	1,2
SEQ ID NO: 2+ G7A+K320A+M323N	4,3	1,6	2,0	1,0	2,0	1,1	2,0	1,2
SEQ ID NO: 2+ K320A	4,7	1,3	2,3	1,0	3,7	1,0	4,5	1,5
SEQ ID NO: 2+ G7A+K320A	4,3	1,4	2,3	1,1	3,3	1,1	2,5	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7A+G109A+N280S+E391 A	17	1,2	1,3	1,3	1,5	1,3	1,1	1,4
SEQ ID NO: 2+ Hr+G109A+N280S+W284H+E391A	2,3	17	2,8	1,4	5,0	2,0	5,5	1,8
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+E391 A	0,8	1,0	1,0	1,1	1,0	1,1	1,3	1,1
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+M323S+E391A	1,3	1,9	1,5	1,3	1,5	1,5	1,6	1,6

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SEQ ID NO: 2+ Hr+G7A+G109A+N280S+K320A+E391 A	1,5	1,2	1,3	1,2	1,2	1,1	1,7	1,1
SEQ ID NO: 2+Hr+G7A+G109A+N280S+M323S+E391 A	1,3	1,3	1,5	1,1	1,0	1,0	1,2	1,1
SEQ ID NO: 2+Hr+G7A+G109A+N280S+M323N+E391 A	1,4	1,3	1,3	1,2	1,0	1,2	1,6	1,1
SEQ ID NO: 2+Hr+G7A+G109A+N280S+W284F+E391 A	1,3	1,4	1,3	1,2	0,9	1,2	1,6	1,0
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7A+G109A+N280S+W284R+E391 A	1,1	1,3	1,0	1,0	0,7	1,2	1,4	0,9
SEQ ID NO: 2+ H1 *+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A	1,1	1,3	0,9	1,1	0,5	1,2	0,8	1,0
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7A+G109A+W284R+E391 A	1,0	1,2	0,9	1,1	0,6	1,1	1,1	1,0
SEQ ID NO: 2+ H1 *+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A	1,0	1,2	0,8	1,0	0,8	1,2	0,9	1,0

[000356] Tabela 11: Resultados do desempenho de lavagem no detergente K

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Mutações	0,05 mg/L- Det. KAriel-20C	0,2 mg/L- Det. K Ariel-20C	0,05 mg/L- Det. KAriel-40C	0,2 mg/L- Det. KAriel-40C
Referência - SEQ ID NO: 2	1,0	1,0	1,0	1,0
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+E391 A	1,1	1,0	2,0	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7K+G109A+N280S+E391 A	1,2	1,6	0,9	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7E+G109A+N280S+E391 A	1,2	1,6	0,6	1,0
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7N+G109A+N280S+E391 A	0,9	1,6	1,0	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7Q+G109A+N280S+E391 A	1,6	1,6	1,1	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7L+G109A+N280S+E391 A	1,6	1,6	1,4	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hr+G7D+G109A+N280S+E391 A	1,9	1,6	1,5	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hr+G109A+N280S+K320A+E391 A	0,4	0,9	1,0	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hr+G109A+N280S+K320M+E391A	1,5	1,1	1,8	1,3
SEQ ID NO: 2+ Hr+G109A+N280S+K320T+E391 A	1,3	1,1	1,5	1,1
SEQ ID NO: 2+ Hr+G109A+N280S+K320V+E391 A	1,0	0,9	1,7	1,1

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SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+M323R+E391 A	0,7	0,9	1,3	1,0
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+K320S+E391 A	1,8	1,3	1,8	1,3
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+E391 V	1,3	1,1	2,0	1,3
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+W284R+E391 A	1,2	1,3	1,2	1,2
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+W284F+E391 A	1,7	1,3	1,8	1,2
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391 A	2,0	1,4	1,4	1,2
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+W284F+E391 A	0,9	0,9	1,3	1,0
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+M323N+E391 A	2,0	1,6	2,0	1,3
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+N280S+M323K+E391A	2,3	1,6	2,0	1,6
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109S+N280S+E391 A	2,5	1,3	2,3	1,1
SEQ ID NO: 2+ H1*+G109A+W284H+E391 A	1,5	1,2	1,3	1,1
SEQ ID NO: 2+ HV+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A	1,6	1,1	1,2	1,1
SEQ ID NO: 2+ H1*+G7A+G109A+N280S+E391 A	1,5	1,4	1,2	1,2

[000357] Como pode ser visto na tabela 10 e tabela 11, todas as variantes testadas tiveram um desempenho de lavagem melhorado em comparação à referência (SEQ ID NO: 2) em pelo menos uma das condições testadas.

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Exemplo 2 - Desempenho de lavagem em TOM de alfa-amilases no detergente K líquido [000358] Os desempenhos de lavagem da variante testada e alfaamilase genitora correspondente (SEQ ID NO: 2) foram testados como descrito acima para lavagem em escala de TOM. O detergente usado foi o detergente K. Os resultados são fornecidos como (desempenho da variante menos o desempenho do branco) dividido pelo (desempenho do genitor menos o desempenho do branco).

[000359] Tabela 12: Desempenho de lavagem em escala de TOM

	Detergente K [WE HDL]
FM HMCS- 28	FM HMCS- 29
Referência/SEQ ID NO: 2)	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + Hr+G109A+W284H+E391 A	1,28	1,58
SEQ ID NO: 2 + H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A	1,13	1,61
SEQ ID NO: 2 + Hr+G7A+G109A+N280S+E391A	1,22	2,02

[000360] Tabela 13: Desempenho de lavagem em escala de TOM

1 L, lavagem de 5 min 0,13 mg de proteína enzimática/L	Det. K
FM	FM HM CS-26

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	HM CS- 29
Referência SEQ ID NO: 2	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + Hr+G109A+W284H+E391 A	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A	1,08	1,11
SEQ ID NO: 2 + Hr+G7A+G109A+N280S+E391A	1,10	1,13

[000361] Tabela 14: Desempenho de lavagem em teste em máquina de lavar em escala completa

Escala completa, 0,072 mg de proteína enzimática/L	Det. K
FM HM CS- 29	FM HM CS-26
Referência SEQ ID NO: 2	1,00	1,00
SEQ ID NO: 2 + Hr+G109A+W284H+E391 A	1,07	1,02
SEQ ID NO: 2 + H1 *+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A	1,22	1,32
SEQ ID NO: 2 + Hr+G7A+G109A+N280S+E391A	1,32	1,41

[000362] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não é para ser limitada em termos de escopo pelos aspectos específicos divulgados no presente documento, uma vez que esses aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo da presente

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121/121 invenção. De fato, diversas modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão evidentes aos especialistas na técnica a partir da descrição supracitada. Tais modificações também são destinadas a serem englobadas pelo escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, apresente divulgação incluindo definições prevalecerá.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 .Variante de uma alfa-amilase genitora, em que a referida variante compreende (i) uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109,1,7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181,182,183,184,195, 206, 243, 260, 304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, (ii) a referida variante tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOs: 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8, e (iii) a referida variante tem atividade de alfa-amilase.
2. Variante, de acordo com a reivindicação 1, em que a modificação é uma deleção ou uma substituição.
3. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que a referida variante compreende uma modificação em pelo menos uma posição correspondendo às posições 109, 1, 7, 280, 284, 320, 323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1.
4. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2 ou

3, em que a referida variante compreende uma modificação em pelo menos uma posição correspondendo às posições 109, 1, 7, 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 243, 260, 280, 284, 304, 320, 323, 391 e 476 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1.

õ.Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4, em que as referidas uma ou mais modificações são substituições.

6. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4 ou 5, em que pelo menos uma das referidas uma ou mais modificações é uma deleção.

7. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3,

4, 5 ou 6, em que a referida variante compreende uma modificação em pelo menos duas posições selecionadas do grupo que consiste em 1,109 e 391.

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8. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que a(s) referida(s) modificação(ões) é/são selecionada(s) do grupo que consiste em: X1*, X1A, X7A, X7K, X7E, X7N. X7Q, X7L, X7D, X109A, X109S, X140Y, X181 *, X182*, X183*, X184*, X195F, X206Y, X243F, X260G, X280S, X284H, X284R, X284F, X304R, X320A, X320M, X320T, X320V, X320S, X323N, X323R, X323S, X323K, X391A, X391V e X476K.

9. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3,4, 5, 6, 7 ou 8, em que a referida variante tem um desempenho melhorado, tal como um desempenho de lavagem melhorado.

10. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, em que a referida variante tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos da alfa-amilase genitora.

11. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em que o número de modificações é 1 a 30, por exemplo, 1 a 20, por exemplo, 1 a 10 e 1 a 5, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 modificações.

12. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, em que a referida variante compreende modificações nas posições selecionadas do grupo de posições que consiste em: X1+X7; X1+X109; X1+X280; X1+X284; X1+X320; X1+X323; X1+X391; X109+X280; X109+X284; X109+X320; X109+X323; X109+X391; X7+X109; X7+X280; X7+X284; X7+X320; X7+X323; X7+X391; X280+X284; X280+X320; X280+X323; X280+X391; X284+X320; X284+X323; X284+X391; X320+X323; X320+X391; e X323+X391, em que a numeração é de acordo com SEQ ID NO: 1.

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13.Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, em que a referida variante compreende modificações nas posições correspondendo às posições da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, selecionadas do grupo que consiste em:

H1*+G109A+N280S+E391A;

H1*+G7K+G109A+N280S+E391A;

HF+G7E+G109A+N280S+E391A;

HF+G7N+G109A+N280S+E391A;

H1*+G7Q+G109A+N280S+E391A;

HF+G7L+G109A+N280S+E391A; HF+G7D+G109A+N280S+E391A;

H1 *+G109A+N280S+K320A+E391 A;

H1 *+G109A+N280S+K320M+E391 A;

H1 *+G109A+N280S+K320T+E391 A;

H1 *+G109A+N280S+K320V+E391 A;

H1 *+G109A+N280S+M323R+E391 A;

H1 *+G109A+N280S+K320S+E391 A;

H1*+G109A+N280S+E391V;

H1 *+G 109 A+W284R+E391 A;

H1 *+G 109 A+W284F+E391 A;

HF+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A;

H1 *+G109A+N280S+W284F+E391 A;

H1*+G109A+N280S+M323N+E391A;

H1 *+G109A+N280S+M323K+E391 A;

HF+G109S+N280S+E391A;

H1 *+G109A+W284H+E391 A;

HF+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A;

HF+G7A+G109A+N280S+E391A;

H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391A;

G7A+W284H+K320A+M323N;

G7A+K320A+M323N;

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K320A;

G7A+K320A;

Η1 *+G7A+G 109A+N280S+E391 A;

Η1 *+G109A+N280S+W284H+E391 A;

H1 *+G109A+N280S+M323S+E391 A;

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A; H1*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A; H1*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A; H1*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A; H1*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A;

H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A;

H1*+G7A+G109A+W284R+E391A; e H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A.

14. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, em que a referida alfa-amilase genitora é selecionada das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, ou qualquer alfa-amilase que tem pelo menos 90%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 1 e 2.

15. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13 ou 14, em que a referida alfa-amilase genitora compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1 e 2.

16. Polinucleotídeo que codifica a referida variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14ou 15.

17. Construção de ácido nucleico compreendendo o referido polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 16.

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18. Vetor de expressão compreendendo o referido polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 16.

19. Célula hospedeira compreendendo o referido polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 16.

20. Método de produção de uma variante de alfa-amilase compreendendo:

a. cultivar a referida célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 19, sob condições adequadas para expressão da referida variante; e

b. recuperar a referida variante.

21. Método para a obtenção de uma variante de alfa-amilase, compreendendo introduzir em uma alfa-amilase genitora uma modificação em uma ou mais posições correspondendo às posições 109,1,7,280,284,320,323 e 391 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, e opcionalmente em uma ou mais posições correspondendo às posições 140,181, 182,183,184,195,206,243,260,304 e 476 da sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NO: 1, em que cada modificação é independentemente uma substituição ou deleção, e a referida variante tem atividade de alfa-amilase; e recuperar a referida variante.