BR122020009747B1 - Polipeptídeo e alfa-amilase variantes, composição detergente, e, utilização de uma alfa- amilase variante - Google Patents

Abstract

a presente invenção diz respeito a variantes de uma alfa-amilase genitora. a presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos codificando as variantes; construções de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos para usar as variantes.

Description

Referência a uma listagem de sequências

[0001] Essa aplicação contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é aqui incorporada por referência.

Antecedentes da InvençãoCampo da Invenção

[0002] A presente invenção diz respeito a métodos para rastrear alfa- amilases com elevado desempenho a baixa temperatura, em particular elevado desempenho a baixas temperaturas em detergentes. A invenção diz ainda respeito a composições de detergentes compreendendo tais amilases.

Descrição da Técnica Relacionada

[0003] Alfa-amilases (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolases, E.C. 3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas que catalisa a hidrólise de amido e outros 1,4-glucosidic-, oligo- e polissacarídeos lineares e ramificados.

[0004] Há uma longa história de utilização industrial de alfa-amilases em várias aplicações conhecidas como detergente, cozedura, fabrico de cerveja, liquefação e sacarificação de amido, por exemplo na preparação de xaropes com elevado teor de frutose ou como parte da produção de etanol do amido. Essas e outras aplicações de alfa-amilases são conhecidas e utilizam alfa-amilases derivadas de microorganismos, em particular alfa-amilases bacterianas.

[0005] Entre as primeiras alfa-amilases bacterianas a serem usadas esteve uma alfa-amilase de B.licheniformis, também conhecida como Termamyl, que foi extensivamente caracterizada e cuja estrutura de cristal foi determinada para essa enzima. Amilases alcalinas, como SP707, formam um grupo particular de alfa-amilases que foram usadas em detergentes. Muitas dessas amilases bacterianas foram modificadas para melhorar a sua funcionalidade em uma aplicação particular.

[0006] Métodos de aumentar a termoestabilidade de alfa-amilases foram bem estudados. Suzuki et al. (1989) revela alfa-amilases quiméricas, em que regiões especificadas de uma alfa-amilase B. amyloliquefaciens foram substituídas pelas regiões correspondentes de uma alfa-amilase B. licheniformis. As alfa-amilases quiméricas foram construídas com o propósito de identificar regiões responsáveis pela termoestabilidade. Descobriu-se que tais regiões incluem resíduos aminoácidos 177-186 e resíduos aminoácidos 255-270 da alfa-amilase B. amyloliquefaciens. Igarashi et al. 1998 mostra que a termoestabilidade de amilases de tipo AmyS pode ser aumentada pela eliminação de dois resíduos aminoácidos, R179-G180, (numeração AmyS) de um ciclo (F 178 a A184). Contudo, Shiau et al. (2003) mostra que uma enzima AmyS com eliminação no mesmo ciclo tem uma atividade específica inferior para a hidrólise de amido de milho a alta temperatura à da enzima genitora, negando uma das principais vantagens das amilases AmyS.

[0007] Por razões ambientais, tem sido cada vez mais importante baixar a temperatura em processos de lavagem de roupa, lavagem de louça e/ou limpeza. Contudo, a maior parte das enzimas incluindo amilases têm uma temperatura ótima que está acima da temperatura normalmente usada na lavagem a baixa temperatura. A alfa-amilase é uma enzima chave para utilização em composições detergentes e a sua utilização tornou-se cada vez mais importante para remoção de manchas de amido durante a lavagem de roupa ou de louça. Como tal, é importante encontrar variantes de alfa-amilase, que retêm o seu desempenho de lavagem, o efeito e/ou atividade de remoção de manchas quando a temperatura é reduzida. Contudo, apesar da eficiência das atuais composições de enzimas de detergentes, há muitas manchas que são difíceis de remover completamente. Esses problemas são compostos pela maior utilização de baixas temperaturas de lavagem (por exemplo, água fria) e ciclos de lavagem mais curtos. Assim, é desejável ter enzimas amilolíticas que podem funcionar a baixa temperatura e ao mesmo tempo preservar ou aumentar outras propriedades desejáveis como atividade específica (atividade amilolítica), estabilidade e/ou desempenho de lavagem.

[0008] Assim, é objeto da presente invenção providenciar métodos melhorados de rastrear alfa-amilases e variantes com elevado desempenho, em particular desempenho de lavagem elevado, a baixas temperaturas.

Sumário da Invenção

[0009] Em um primeiro aspeto, a presente invenção diz respeito a um método de rastrear alfa-amilases com elevado desempenho, em particular elevado desempenho de lavagem, a baixas temperaturas, compreendendo as etapas dea) Determinar a ligação das enzimas com substrato sólido ou imobilizado para a alfa-amilase, como amido,b) Selecionar alfa-amilases com baixa afinidade com o substrato, em particular tendo um rácio baixo entre a ligação ao substrato e atividade.

[00010] Em um outro aspeto, a invenção diz respeito a um método de selecionar variantes de uma alfa-amilase genitora compreendendo as etapas dea) Gerar variantes substituindo, eliminando ou inserindo um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou mais aminoácidos localizados na superfície da alfa-amilase genitora;b) Testar as variantes para a ligação ao substrato sólido ou imobilizado para a alfa-amilase, como amido;c) Selecionar variantes com uma ligação mais baixa ao substrato do que a alfa-amilase genitora.

[00011] Em um outro aspeto, a invenção diz respeito a variantes que podem ser selecionadas com base no método reivindicado e composições detergentes compreendendo uma alfa-amilase selecionada usando o método da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00012] A invenção baseia-se na observação que existe uma correlação inversa entre a ligação de uma amilase a amido bruto e o desempenho a baixa temperatura, em particular ao desempenho de lavagem a baixas temperaturas. Por exemplo, usando dados para um número de amilase de detergente experimental mostra uma clara correlação entre a ligação a amido de arroz e o desempenho de lavagem em testes AMSA. Assim, descobriu-se surpreendentemente que as alfa-amilases com uma baixa ligação a um substrato sólido têm um elevado desempenho a baixa temperatura, em particular um elevado desempenho em detergentes a baixas temperaturas.

Definições

[00013] Atividade da alfa-amilase: O termo “atividade de alfa-amilase” significa a atividade de alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolases, E.C. 3.2.1.1, que constituem um grupo de enzimas que catalisa a hidrólise de amido e outros 1,4-glucosidic-, oligo- e polissacarídeos lineares e ramificados.

[00014] Ligação ao substrato: O termo “ligação ao substrato” ou “ligação a um substrato sólido” ou termos gramaticamente equivalentes significam a propriedade de uma alfa-amilase se ligar a um substrato sólido incluindo um substrato imobilizado a um material sólido. O termo é um termo relativo e é em geral expresso como uma ligação relativa em comparação com uma alfa-amilase de referência. Para variantes, a ligação ao substrato é em geral medida relativamente à alfa-amilase genitora que serviu de ponto de partida para as variantes. A ligação ao substrato pode ser medida pela incubação de uma solução da alfa-amilase com o substrato sólido, removendo o substrato e determinando a fração da quantidade inicial da alfa-amilase que continua ligada ao substrato sólido. Os métodos preferenciais para determinar a ligação do substrato a um substrato sólido é revelada de seguida na seção de Materiais e Métodos.

[00015] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo com atividade de alfa-amilase compreendendo uma alteração, ou seja, uma substituição, inserção e/ou eliminação em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma substituição de um aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente; uma eliminação significa a remoção de um aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adicionar 1-3 aminoácidos adjacentes a um aminoácido ocupando uma posição.

[00016] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[00017] Enzima de tipo selvagem: O termo alfa-amilase de “tipo selvagem” significa uma alfa-amilase expressa por um microorganismo ocorrendo naturalmente, como um fungo bacteriano, de fermento ou filamentoso encontrado na natureza.

[00018] Genitor ou alfa-amilase genitora: O termo “genitor” ou “alfa- amilase genitora” significa uma alfa-amilase à qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O genitor pode ser um polipeptídeo (tipo selvagem) ocorrendo naturalmente ou uma sua variante. Em relação a variantes, o polipeptídeo genitor é o polipeptídeo com exatamente a mesma sequência da variante exceto pelos resíduos especificamente alterados na variante.

[00019] Variante isolada: O termo “variante isolada” significa uma variante que é modificada pela mão do homem. Em um aspeto, a variante é pelo menos 1% pura, por exemplo, pelo menos 5% pura, pelo menos 10% pura, pelo menos 20% pura, pelo menos 40% pura, pelo menos 60% pura, pelo menos 80% pura e pelo menos 90% pura, como determinado por SDS- PAGE.

[00020] Variante substancialmente pura: O termo “variante substancialmente pura” significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% de peso de outro material polipeptídeo com o qual é associado nativamente ou recombinantemente. De preferência, a variante é pelo menos 92% pura, por exemplo, pelo menos 94% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 96% pura, pelo menos 97% pura, pelo menos 98% pura, pelo menos 99% pura, pelo menos 99,5% pura e 100% pura de peso do material polipeptídeo total presente na preparação. As variantes da presente invenção são de preferência em uma forma substancialmente pura. Isso pode ser alcançado, por exemplo, preparando a variante por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

[00021] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo na sua forma final a seguir à translação e quaisquer modificações pós-translacionais, como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[00022] Sequência de codificação de polipeptídeo maduro: O termo “sequência de codificação de polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade alfa- amilase.

[00023] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências aminoácidas ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[00024] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências aminoácidas é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência a versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de “identidade mais longa” de etiqueta Needle (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado da seguinte forma:(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Intervalos em Alinhamento)

[00025] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de deoxiribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), de preferência a versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de “identidade mais longa” de etiqueta Needle (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado da seguinte forma:(Deoxiribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Intervalos em Alinhamento)

[00026] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo com um ou mais (vários) aminoácidos eliminados do terminal amina e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade alfa- amilase.

[00027] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo com um ou mais (vários) nucleotídeos eliminados da extremidade 5' e/ou 3' sequência de codificação de um polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento com atividade alfa-amilase.

[00028] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo local cromossomático. A variação alélica ocorre naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências aminoácidas alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[00029] Polinucleotídeo isolado: O termo “polinucleotídeo isolado” significa um polinucleotídeo que é modificado pela mão do homem. Em um aspeto, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 1% puro, por exemplo, pelo menos 5% puro, pelo menos 10% puro, pelo menos 20% puro, pelo menos 40% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro e pelo menos 95% puro, como determinado por eletroforese de agarose. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética ou sintética ou quaisquer suas combinações.

[00030] Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo “polinucleotídeo substancialmente puro” significa uma preparação polinucleotídica sem outros polinucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para utilização dentro de sistemas de produção de polipeptídeos geneticamente modificados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% de peso de outro material polinucleotídeo com o qual está associado nativamente ou recombinantemente. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, contudo, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas, como promotores e terminadores. É preferencial que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, por exemplo, pelo menos 92% puro, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro e pelo menos 99,5% puro em termos de peso. Os polinucleotídeos da presente invenção são de preferência em uma forma substancialmente pura.

[00031] Sequência de codificação: O termo “sequência de codificação” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência aminoácida do seu produto polipeptídeo. As fronteiras da sequência de codificação são geralmente determinadas por uma matriz de leitura aberta que geralmente começa com o codão de início ATG ou codões de início alternativos como GTG e TTG e termina com um codão de fim como TAA, TAG e TGA. A sequência de codificação pode ser um polinucleotídeo DNA, cDNA, sintético ou recombinante.

[00032] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula mRNA madura unida obtida de uma célula eucariótica. O cDNA não tem sequências íntron que podem estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito RNA primário inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro unido.

[00033] Construção do Ácido Nucléico: O termo “construção do ácido nucléico” significa uma molécula de ácido nucléico, quer monocatenária quer bicatenária, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucléicos de forma que não existiriam de outra maneira na natureza ou que é sintética. O termo construção de ácido nucléico é sinônimo do termo “cassete de expressão” quando a construção de ácido nucléico contém as sequências de controle necessárias para expressão de uma sequência de codificação da presente invenção.

[00034] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativo ou estranho um ao outro. Tais sequências de controle incluem, mas não se limitam a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência propeptídea, promotor, sequência de peptídeo de sinal e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de paragem transcricionais e translacionais. As sequências de controle podem ser providenciadas com ligantes com o fim de introduzir locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região de codificação do polinucleotídeo codificando uma variante.

[00035] Ligado operacionalmente: O termo “ligado operacionalmente” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada relativamente à sequência de codificação de um polinucleotídeo de forma a que a sequência de controle dirija a expressão da sequência de codificação.

[00036] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção da variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, translação, modificação pós-translacional e secreção.

[00037] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e que está operacionalmente ligado a nucleotídeos adicionais que asseguram a sua expressão.

[00038] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfeção, transdução e semelhantes com uma construção de ácido nucléico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[00039] Processo de remoção de amido: A expressão “processo de remoção de amido” diz respeito a qualquer tipo de processo pelo qual é removido (ou convertido) amido, como em processos de lavagem em que o amido é removido de tecidos, por exemplo, limpeza de tecidos como lavagem de roupa. Um processo de remoção de amido pode também ser limpeza de superfícies duras como lavagem de louça ou podem ser processos de limpeza em geral como em limpeza industrial ou institucional. A expressão também compreende outros processos de remoção de amido ou conversão de amido, produção de etanol, liquefação de amido, desengomagem têxtil, produção de papel e polpa, fabrico de cerveja e detergentes em geral.

[00040] Propriedade melhorada: O termo “propriedade melhorada” significa uma característica associada com uma variante que é melhorada em comparação com o genitor. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não se limitam a, atividade térmica, termoestabilidade, atividade pH, estabilidade pH, especificidade de substrato/cofator, propriedades de superfície melhoradas, especificidade de produto, maior estabilidade ou solubilidade na presença de biomassa pré-tratada, estabilidade melhorada sob condições de armazenamento e estabilidade química.

[00041] Desempenho de lavagem: No presente contexto, o termo “desempenho de lavagem” é usado como a capacidade de uma enzima de remover amido ou manchas contendo amido presentes no objeto a ser limpo durante, por exemplo, lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras, como lavagem de louça. O desempenho de lavagem pode ser quantificado pelo cálculo do chamado valor de intensidade (Int) definido na descrição de AMSA ou no teste de desempenho de lavagem da proveta na seção de Métodos abaixo.

[00042] Desempenho de lavagem melhorado: O termo “desempenho de lavagem melhorado” é aqui definido como uma enzima variante apresentando uma alteração do desempenho de lavagem de uma variante de amilase relativa ao desempenho de lavagem da amilase genitora ou relativa à alfa-amilase com a sequência aminoácida idêntica da referida variante, mas não tendo a eliminação em uma ou mais das posições especificadas ou relativas à atividade de uma alfa-amilase com a sequência aminoácida mostrada em SEQ ID NO 4, por exemplo por remoção de manchas aumentada. O termo “desempenho de lavagem” inclui limpeza em geral, por exemplo limpeza de superfícies duras como a lavagem de louça, mas também o desempenho de lavagem de tecidos como lavagem de roupa e também limpeza industrial e institucional.

[00043] Baixa temperatura: “Baixa temperatura” é uma temperatura de 5-35°C, de preferência 5-30°C, mais preferencialmente 5-25°C, mais preferencialmente 5-20°C, mais preferencialmente 5-15°C, e em particular 510°C. Em uma forma de realização preferencial, “Baixa temperatura” é uma temperatura de 10-35°C, de preferência 10-30°C, mais preferencialmente 1025°C, mais preferencialmente 10-20°C, e em particular 10-15°C.

[00044] Em um primeiro aspeto, a presente invenção diz respeito a um método de rastrear alfa-amilases com elevado desempenho a baixa temperatura, em particular com elevado desempenho de lavagem a baixas temperaturas, compreendendo as etapas dea) Determinar a ligação das enzimas a substrato sólido ou imobilizado para a alfa-amilase, tal como amido,b) Selecionar alfa-amilases com baixa ligação ao substrato, em particular alfa-amilases tendo um rácio de ligação ao substrato e atividade baixos.

[00045] Esse aspeto da invenção diz respeito ao rastreamento de alfa- amilases com elevado desempenho a baixas temperaturas, em particular para rastrear alfa-amilases de detergente com elevado desempenho de lavagem a baixa temperatura. O método é adequado para rastrear novas alfa-amilases por forma a encontrar enzimas que têm bom desempenho a baixa temperatura. O método pode ainda de forma vantajosa ser automatizado e adaptado a um procedimento de rastreamento de elevado rendimento.

[00046] Em uma forma de realização, o método é adequado para encontrar novas alfa-amilases. Uma forma conveniente é testar um número de alfa-amilases candidatas e incluir uma alfa-amilase detergente conhecida como padrão e depois selecionar novas alfa-amilases candidatas com uma ligação menor ao substrato do que a alfa-amilase detergente padrão. As alfa- amilases selecionadas serão as candidatas com elevado desempenho de lavagem e podem ainda ser testadas por outras propriedades importantes para enzimas detergentes, tais como estabilidade, atividade específica, etc.

[00047] São conhecidas na literatura várias amilases detergentes, incluindo amilases de tipo selvagem como as alfa-amilases com SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 11 e 12: variantes de qualquer uma destas como as variantes reveladas em WO2001066712 e WO2006002643, e qualquer uma destas amilases detergentes pode ser de forma adequada incluída no método como uma alfa-amilase detergente padrão.

[00048] As alfa-amilases nessa forma de realização são selecionadas para ter menor ligação ao substrato do que a amilase detergente padrão selecionada como tendo menos de 95% da ligação da alfa-amilase detergente padrão, tal como menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação, mais preferencialmente menos de 10% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 5% da ligação.

[00049] Em alternativa usando SP722, a alfa-amilase com SEQ ID NO: 1 como a alfa-amilase detergente padrão, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que SP722 preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00050] Em alternativa usando SP707, a alfa-amilase com SEQ ID NO: 2 como a alfa-amilase detergente padrão, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que SP707, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00051] Em alternativa usando AA560, a alfa-amilase com SEQ ID NO: 3 como a alfa-amilase detergente padrão, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que AA560, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00052] Em alternativa usando SP690, a alfa-amilase com SEQ ID NO: 4 como a alfa-amilase detergente padrão, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que SP690, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00053] Em alternativa usando KSM-AP1378, a alfa-amilase com SEQ ID NO: 5 como a alfa-amilase detergente padrão, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que KSM-AP1378, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00054] Em alternativa usando SP7-7, a alfa-amilase com SEQ ID NO: 6 como a alfa-amilase detergente padrão, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que SP7-7, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00055] Método da invenção pode também ser usado com outras alfa- amilases genitoras como a alfa-amilase Bacillus licheniformis (BLA), a alfa- amilase com SEQ ID NO: 13 para selecionar alfa-amilases com desempenho melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que BLA, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00056] Em alternativa usando a alfa-amilase Bacillus amyloliquefaciens (BAN), a alfa-amilase com SEQ ID NO: 14 como a alfa-amilase genitora, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que BAN, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00057] Em alternativa usando a alfa-amilase Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) (BSG), a alfa-amilase com SEQ ID NO: 15 como a alfa-amilase genitora, o método pode ser usado para selecionar alfa-amilases com desempenho melhorado a baixa temperatura selecionando alfa-amilases com menor ligação ao substrato do que BSG, preferencialmente menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00058] Em um outro aspeto, a invenção diz respeito a um método de selecionar variantes de uma alfa-amilase genitora compreendendo as etapas dea) Gerar variantes substituindo, eliminando ou inserindo um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou mais aminoácidos localizados na superfície da alfa-amilase genitora;b) Testar as variantes para a ligação ao substrato sólido ou imobilizado para a alfa-amilase, como amido;c) Selecionar variantes com uma ligação mais baixa ao substrato do que a alfa-amilase genitora.

[00059] Método pode em princípio ser usado em qualquer alfa-amilase conhecida para o que é desejável selecionar variantes com desempenho melhorado a baixa temperatura, contudo, em uma forma de realização preferencial, o método da invenção é usado para gerar variantes com desempenho de lavagem melhorado a baixa temperatura.

[00060] Em outras formas de realização, o método da invenção é usado para encontrar amilases para selecionar variantes de uma alfa-amilase genitora com desempenho melhorado a baixa temperatura em aplicações na área de limpeza, em aplicações como a sacarificação ou liquefação do amido para degradar o amido em açúcares que podem ser fermentados para providenciar etanol para consumo ou para combustível, ou em aplicações na produção têxtil. Todas essas aplicações são conhecidas na técnica e os técnicos saberão como as alfa-amilases selecionadas de acordo com o método da invenção podem ser aplicadas em essas aplicações.

[00061] Em essa forma de realização preferencial, a alfa-amilase genitora pode ser uma alfa-amilase detergente, ou seja, uma alfa-amilase com atividade sob condições normalmente aplicadas em limpeza e lavagem de roupa, como atividade na presença de surfactantes, quelantes e outros componentes habitualmente usados em detergentes e atividade a um pH alcalino como no intervalo 8-11, tal como 9-10.

[00062] As variantes podem ser preparadas substituindo, eliminando ou inserindo um ou mais resíduos aminoácidos em um ou mais aminoácidos localizados na superfície da alfa-amilase genitora.

[00063] Os técnicos saberão como identificar resíduos a serem modificados pela identificação de resíduos localizados na superfície da molécula genitora. Em essa conexão, resíduos localizados na superfície da molécula entendem-se por resíduos onde pelo menos parte do resíduo está em contacto direto com o meio envolvente em uma forma natural da molécula. Os técnicos saberão extrair esse tipo de informação de estruturas 3-D da molécula genitora caso uma estrutura 3-D da molécula genitora esteja disponível ou caso uma estrutura 3-D da genitora não esteja disponível por alinhamento da alfa-amilase genitora com uma alfa-amilase para a qual a estrutura 3-D esteja disponível e identificando resíduos localizados na superfície da molécula como resíduos da alfa-amilase genitora que no alinhamento correspondem a resíduos localizados na superfície da alfa- amilase. Como é conhecida na técnica mais de uma estrutura 3-D de alfa- amilases, a identificação de resíduos localizados na superfície de uma determinada alfa-amilase genitora deve ser baseada no alinhamento da alfa- amilase genitora com a estrutura 3D para a alfa-amilase com a identidade de sequência mais elevada em relação à alfa-amilase genitora.

[00064] As variantes são geradas substituindo, eliminando ou inserindo um ou mais resíduos aminoácidos em um ou mais aminoácidos localizados na superfície da alfa-amilase genitora de um ou mais resíduos de aminoácidos em posições localizadas na superfície da alfa-amilase genitora, como substituindo, eliminando ou inserindo pelo menos um resíduos localizado na superfície, como pelo menos dois resíduos, por exemplo três resíduos, por exemplo quatro resíduos, por exemplo cinco resíduos, por exemplo seis resíduos, por exemplo sete resíduos, por exemplo oito resíduos,por exemplo nove resíduos, por exemplo dez resíduos, como até quinze resíduos, por exemplo até vinte resíduos ou até trinta resíduos localizados na superfície da alfa-amilase genitora.

[00065] As variantes podem adicionalmente conter outras substituições, eliminações ou inserções em um ou mais resíduos aminoácidos não localizados na superfície da molécula. Muitas dessas substituições, eliminações ou inserções foram reveladas na técnica anterior e podem também ser usadas de acordo com a presente invenção. Como exemplos de tal substituição, inserção ou eliminação adicional preferencial pode ser mencionada a eliminação de resíduos D183 e G184 na alfa-amilase genitora, como revelado na WO96/23873.

[00066] De preferência são geradas variantes com pelo menos 90% de identidade de sequência com a sua alfa-amilase genitora, de preferência pelo menos 95% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 97% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência e mais preferencialmente ainda pelo menos 99% de identidade de sequência.

[00067] As variantes são selecionadas para ter menor ligação ao substrato do que a alfa-amilase genitora como as tendo menos de 95% da ligação da alfa-amilase genitora, como menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00068] Em uma forma de realização preferencial a invenção diz respeito a um método para selecionar variantes de uma alfa-amilase genitora selecionada entre alfa-amilases com SEQ ID NO: 1-15 e alfa-amilases com pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a um desses, de preferência pelo menos 85% de identidade, de preferência 90% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 97% de identidade, compreendendo as etapas dea) Gerar variantes substituindo, eliminando ou inserindo um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou mais aminoácidos localizados na superfície da alfa-amilase genitora, onde as variantes têm pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à sua alfa-amilase genitora, de preferência pelo menos 95% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 97% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência e mais preferencialmente ainda pelo menos 99% de identidade de sequência.b) Testar as variantes para a ligação ao substrato sólido ou imobilizado para a alfa-amilase, como amido; ec) Selecionar variantes com menor ligação ao substrato do que a alfa-amilase genitora, onde as variantes têm menos de 95% da ligação da alfa-amilase genitora, como menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00069] Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a variantes de uma alfa-amilase genitora selecionada entre alfa-amilases com SEQ ID NO: 1-15 e alfa-amilases com pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a um desses, de preferência pelo menos 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 87% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência e mais preferencialmente pelo menos 97% de identidade de sequência, em que:i) a variante tem pelo menos 80% de identidade de sequência em relação à alfa-amilase genitora, de preferência pelo menos 85%, de preferência pelo menos 87% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, eii) a variante tem menor ligação ao substrato sólido em comparação com a alfa-amilase genitora como menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70%, de preferência menos de 60%, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[00070] Tais variantes podem ser providenciadas usando o método da invenção.

[00071] As variantes da invenção também incluem variantes em que um ou mais resíduos localizados na superfície das alfa-amilases genitoras e sendo parte de um local de ligação do substrato foram substituídos ou eliminados. Tais locais de ligação do substrato presentes na superfície das alfa-amilases genitora têm sido revelados na literatura para algumas alfa-amilases e os técnicos saberão reconhecer que tais locais de ligação do substrato podem ser identificados em outras alfa-amilases genitoras alinhando uma alfa-amilase genitora com outra sequência de alfa-amilase para a qual tais locais de ligação do substrato foram identificados.

[00072] Como exemplos de resíduos que fazem parte de um local de ligação de substrato podem ser mencionados:a) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 e G477 em SEQ ID NO: 2b) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 e G477 em SEQ ID NO: 5c) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 e G477 em SEQ ID NO: 4d) W138, W157, W165, E167, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, K315, W342, R437, W467 e G475 em SEQ ID NO: 13,e) W136, W155, W163, E165, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, R315, W342, R437, W467 e G475 em SEQ ID NO: 14f) W139, W158, W166, E168, W187, E192, F260, F287, G302, G303, W345, W437, W467, G474 e G475 em SEQ ID NO: 15

[00073] As variantes da invenção também incluem variantes incluindo uma ou mais modificações que introduzem um ou mais resíduos aminoácidos volumosos em uma posição perto de um resíduo sendo parte de um local de ligação do substrato, tal como os resíduos mencionados em a)-h) acima. Em essa conexão, um resíduo de aminoácido volumoso pode ser selecionado entre aminoácidos com uma cadeia lateral longa, tal como Tyr, Trp, Phe, His e Ile, sendo os preferenciais Tyr e Trp. Perto de um resíduo parte de um local de ligação do substrato pretende significar que o resíduo modificado está localizado a menos de 10 Â do resíduo parte de um local de ligação do substrato, de preferência menos de 6 Â e mais preferencialmente menos de 3 Â em relação a esses resíduos. Os técnicos têm a capacidade de identificar tais resíduos com base na informação de estrutura disponível.

[00074] Outras variantes preferenciais incluem variantes tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2, de preferência pelo menos 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 87% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% deidentidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 97% deidentidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 98% deidentidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 99% deidentidade de sequência, mas menos de 100% de identidade de sequência e compreendendo as seguintes substituições:

[00075] H183*+G184*+W140F;

[00076] H183*+G184*+Q169N;

[00077] H183*+G184*+Q169A;

[00078] H183*+G184*+W189Y+E190P;

[00079] H183*+G184*+N260D;

[00080] H183*+G184*+G477E;

[00081] H183*+G184*+G477Q;

[00082] H183*+G184*+G477K;

[00083] H183*+G184*+W189E+E190P;

[00084] H183*+G184*+A51I+W140Y;

[00085] H183*+G184*+W140Y+W189E;

[00086] H183*+G184*+W140Y+N260P;

[00087] H183*+G184*+W140Y+W284D;

[00088] H183*+G184*+W140Y+G476R;

[00089] H183*+G184*+W140Y+G477E;

[00090] H183*+G184*+W189E+W439R;

[00091] H183*+G184*+W284D+G477E;

[00092] H183*+G184*+W439R+G476R;

[00093] H183*+G184*+W439R+G477E;

[00094] H183*+G184*+E194D;

[00095] H183*+G184*+W439R+D467K;

[00096] H183*+G184*+R320M+W439R;

[00097] H183*+G184*+W439R+K485R;

[00098] H183*+G184*+Y160S;

[00099] H183*+G184*+W189F+E190P;

[000100] H183*+G184*+F262A;

[000101] H183*+G184*+Y363H;

[000102] H183*+G184*+G476E;

[000103] H183*+G184*+N260P+W439R;

[000104] H183*+G184*+N260P+G477E;

[000105] H183*+G184*+W439R+G476R;

[000106] H183*+G184*+K72S+W140Y;

[000107] H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G;

[000108] H183*+G184*+E194S;

[000109] H183*+G184*+E345D+G477R;

[000110] H183*+G184*+K302N+W439R;

[000111] H183*+G184*+R320K+W439R

[000112] H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q;

[000113] H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q;

[000114] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;

[000115] H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E;

[000116] H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q;

[000117] H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R;

[000118] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;

[000119] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;

[000120] H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E;

[000121] H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R;

[000122] H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R;

[000123] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y;

[000124] H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q;

[000125] H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q;

[000126] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K;

[000127] H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R;

[000128] H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K;

[000129] H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K;

[000130] H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y;

[000131] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;

[000132] H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K;

[000133] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q;

[000134] H183*+G184*+W159Y+W 167F+N260P+F262P+W439Y+G47 6K+G477Q;

[000135] H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q;

[000136] H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y;

[000137] H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q;

[000138] H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.

[000139] Outras variantes preferenciais incluem variantes consistindo de SEQ ID NO: 2 com uma das substituições acima mencionadas.

[000140] Outra variante preferencial da invenção é uma variante com pelo menos 80% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 90% deidentidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% deidentidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 97% deidentidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 98% deidentidade com SEQ ID NO: 13 e compreendendo uma substituição em uma posição correspondendo a K315 e/ou W467 em SEQ ID NO: 13, de preferência K315ANCQEGHILMFPSTWYVM, particularmente preferencial K315M e/ou W467AF. Em uma forma de realização preferencial, a substituição na posição K315 é combinada com outras substituições, preferencialmente selecionadas entre G48A, T51IL, G107A, H156Y; A181T, N190F, I201F, A209V e Q264S.

[000141] Em um outro aspeto, a invenção diz respeito a uma composição detergente compreendendo uma alfa-amilase selecionada usando o método da invenção.

[000142] Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma composição detergente compreendendo uma alfa-amilase variante caracterizada por:i) ter pelo menos 80% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência, maispreferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência, maispreferencialmente pelo menos 97% de identidade de sequência, maispreferencialmente pelo menos 98% de identidade com uma de SEQ ID NO: 112 ii) tendo uma ligação a um substrato sólido ou imobilizado que é menos de 95% da ligação da alfa-amilase genitora, como menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, de preferência menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[000143] Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma composição detergente compreendendo uma alfa-amilase variante caracterizada por:i) ter pelo menos 80% de identidade de sequência em relação a um desses, de preferência pelo menos 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 97% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade com uma de SEQ ID NO: 1-12ii) tendo uma ligação a um substrato sólido ou imobilizado que é menos de 95% da ligação da alfa-amilase tendo SEQ ID NO: 8, como menos de 90% da ligação; de preferência menos de 80% da ligação, de preferência menos de 70% da ligação, de preferência menos de 60% da ligação, de preferência menos de 50% da ligação, de preferência menos de 40% da ligação, de preferência menos de 30% da ligação, mais preferencialmente menos de 20% da ligação e mais preferencialmente ainda menos de 10% da ligação.

[000144] A invenção também diz respeito a uma composição detergente compreendendo uma alfa-amilase onde a ligação da alfa-amilase ao amido de arroz é inferior à ligação da alfa-amilase com SEQ ID NO: 8 ao amido de arroz, de preferência menos de 80%, mais preferencialmente menos de 70%, mais preferencialmente menos de 60%, mais preferencialmente menos de 50%, mais preferencialmente menos de 40%, mais preferencialmente menos de 30%, mais preferencialmente menos de 20% e mais preferencialmente ainda menos de 10%.

Determinar a ligação de alfa-amilases ao substrato sólido

[000145] Para o propósito da presente invenção, a ligação de alfa-amilases a um substrato sólido ou imobilizado pode em princípio ser determinada usando um qualquer método da técnica de determinação da ligação de um substrato. Em geral, tal método envolve contactar uma alfa-amilase com um substrato sólido ou imobilizado e determinar a fração de alfa-amilases ligadas aos substratos.

[000146] Substrato sólido ou imobilizado pode ser qualquer substrato para alfa-amilases que é insolúvel em termos de substrato sob as condições de teste. O substrato sólido pode ser um amido como amido de trigo, amido de milho ou amido de arroz, sendo o preferido o amido de arroz. Em alternativa, a determinação pode ser feita usando substrato imobilizado que inclui quaisquer substratos solúveis ou insolúveis para alfa-amilases imobilizadas em uma matriz sólida. De acordo com a invenção, a ligação de uma alfa- amilase ao seu substrato é determinada como a fração de amilase ligada medida a 20°C na presença de amido com pH 8. A ligação de uma alfa- amilase ao seu substrato pode ser determinada pela incubação de uma solução aquosa da alfa-amilase com o amido e determinando a fração de amilase ligada usando o método revelado abaixo.

Convenções para Designação de Variantes

[000147] Para os propósitos da presente invenção, o polipeptídeo maduro revelado em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15 é usado para determinar o resíduo aminoácido correspondente em outra alfa-amilase. A sequência aminoácida de outra alfa- amilase é alinhada com o polipeptídeo maduro revelado em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15 e com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo aminoácido no polipeptídeo maduro revelado em SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência a versão 3.0.0 ou superior.

[000148] A identificação do resíduo aminoácido correspondente em outra alfa-amilase pode ser confirmada por um alinhamento de sequências polipeptídicas múltiplas usando “ClustalW” (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948).

[000149] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15 de forma a que a comparação tradicional baseada na sequência não consegue detetar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequência par a par. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa com base em sequência usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detetar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, predição de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prediz o desdobramento estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Esses alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para os polipeptídeos, e tais modelos podem ser avaliados em termos de precisão usando várias ferramentas desenvolvidas para o propósito.

[000150] Para proteínas de estrutura conhecida, encontram-se várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas e esses alinhamentos são acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando vários algoritmos como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatorial (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e podem ser utilizadas adicionalmente implementações desses algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse por forma a descobrir possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[000151] Ao descrever as variantes de alfa-amilase da presente invenção, a nomenclatura descrita de seguida é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura aminoácida IUPAC aceite de letra única ou três letras.

[000152] Substituições. Para uma substituição aminoácida, é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Em conformidade, a substituição de treonina por alanina na posição 226 é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 da glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respetivamente.

[000153] Eliminações. Para uma eliminação aminoácida, é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição*. Em conformidade, a eliminação de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. Eliminações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[000154] Inserções. Para uma inserção aminoácida, é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Em conformidade, a inserção de lisina na posição 195 é designada como “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após a glicina na posição 195 é designada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[000155] Em tais casos, o ou os resíduos aminoácidos inseridos são numerados pela adição de minúsculas ao número de posição do resíduo aminoácido precedendo o ou os resíduos aminoácidos inseridos. No exemplo acima, a sequência seria então:

[000156] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo alterações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma substituições de tirosina e ácido glutâmico por arginina e glicina nas posições 170 e 195, respetivamente.

[000157] Substituições diferentes. Onde substituições diferentes puderem ser introduzidas em uma posição, as substituições diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina por tirosina ou ácido glutâmico na posição 170. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes:

[000158] “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”,“Tyr167Ala+Arg170Gly”, e “Tyr167Ala+Arg170Ala”.

Alfa-amilases genitoras

[000159] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, SP722.

[000160] Em um aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa- amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[000161] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 1. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[000162] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[000163] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, SP707 revelado em Tsukamoto et al. 1988, Biochem. Biophys.Res Comm. 151, 25-31.

[000164] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[000165] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 2. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[000166] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[000167] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, AA560.

[000168] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[000169] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 3. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[000170] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[000171] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SP690 revelado em WO9526397.

[000172] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[000173] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 4. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[000174] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4.

[000175] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, KSM-AP1378 revelado em EP 670367.

[000176] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[000177] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 5. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[000178] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5.

[000179] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, sp 7-7.

[000180] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[000181] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 6. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[000182] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6.

[000183] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, SP722+T183*+G184*.

[000184] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7.

[000185] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 7. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7.

[000186] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7.

[000187] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, SP 707+G182*+H183*.

[000188] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8.

[000189] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 8. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8.

[000190] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8.

[000191] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9, AA560+T183*+G184*.

[000192] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9.

[000193] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 9. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9.

[000194] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9.

[000195] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10, SP690+T183*+G184*.

[000196] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10.

[000197] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 10. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10.

[000198] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10.

[000199] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11, KSM-AP1378+D183*+G184*.

[000200] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11.

[000201] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 11. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11.

[000202] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11.

[000203] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 12, SP-7-7+G182*+H183*.

[000204] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 12 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 12.

[000205] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 12. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 12.

[000206] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 12.

[000207] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 13, derivado de Bacillus licheniformis.

[000208] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 13 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 13.

[000209] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 13. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 13.

[000210] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 13.

[000211] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14, derivado de Bacillus amyloliquefaciens.

[000212] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14.

[000213] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 14. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14.

[000214] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 14.

[000215] A alfa-amilase genitora pode também ser um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15, derivado de Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus).

[000216] Em outro aspeto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15 de pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade alfa-amilase. Em um aspeto, a sequência aminoácida do genitor difere em não mais de dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15.

[000217] O genitor compreende ou consiste de preferência na sequência aminoácida de SEQ ID NO: 15. Em outro aspeto, o genitor compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15.

[000218] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 15.

[000219] A sequência aminoácida de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento, pode ser usado para conceber sondas de ácido nucléico para identificar e clonar DNA codificando um genitor de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos de transferência Southern padrão, por forma a identificar e isolar aí o correspondente gene. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. De preferência, a sonda de ácido nucléico tem pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, por exemplo pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Podem ser usadas sondas DNA e RNA. As sondas são tipicamente etiquetadas para detetar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

[000220] Uma biblioteca DNA ou cDNA genômica preparada a partir de tais organismos pode ser rastreada em busca de DNA que hibridiza com as sondas acima descritas e codifica um genitor. DNA genômico ou outro de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese de agarose ou de gel poliacrilamida ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado podem ser transferidos para e imobilizados em nitrocelulose ou outro material portador adequado, que é usado em uma transferência Southern.

[000221] Para propósitos da presente invenção, hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda nucleotídica etiquetada correspondendo a um polinucleotídeo codificando SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 ou uma sua subsequência, sob condições de estringência baixas a muito elevadas. As moléculas em que a sonda hibridiza podem ser detetadas usando, por exemplo, película de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[000222] Em um aspeto, a sonda de ácido nucléico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento.

[000223] Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, são definidas condições de estringência baixas a muito elevadas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado e desnaturado e 25% de formamida para estringências baixas e muito baixas, 35% de formamida para estringências médias e médias-altas ou 50% de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo procedimentos de transferências Southern padrão durante 12 a 24 horas, de modo ótimo. O material portador é finalmente lavado três vezes, cada uma com a duração de 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% SDS a 45°C (estringência muito baixa), 50°C (baixa estringência), 55°C (estringência média), 60°C (estringência média-alta), 65°C (estringência elevada), ou 70°C (estringência muito elevada).

[000224] Para sondas curtas que têm entre 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização e hibridização a cerca de 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390) em 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1X solução de Denhardt, 1 mM pirofosfato de sódio, 1 mM fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM ATP, e 0,2 mg de RNA de fermento por ml seguindo procedimentos de transferência Southern padrão por 12 a 24 horas, de modo ótimo. O material portador é finalmente lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1% SDS por 15 minutos e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X SSC entre 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado.

[000225] O genitor pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtida de” como aqui usado em ligação com uma determinada fonte significará que o genitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma célula na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspeto, o genitor é secretado extracelularmente.

[000226] genitor pode ser uma alfa-amilase bacteriana. Por exemplo, o genitor pode ser um polipeptídeo bacteriano grampositivo como uma alfa- amilase Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces, ou um polipeptídeo bacteriano gram-negativo como uma alfa- amilase Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.

[000227] Em um aspeto, o genitor é uma alfa-amilase Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[000228] Em outro aspeto, o genitor é uma alfa-amilase Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000229] Em outro aspeto, o genitor é uma alfa-amilase Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

[000230] O genitor pode ser uma alfa-amilase fúngica. Por exemplo, o genitor pode ser uma alfa-amilase de fermento como alfa-amilase Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia. Por exemplo, o genitor pode ser uma alfa-amilase fúngica filamentosa como alfa-amilase Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor,Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xylaria.

[000231] Em outro aspeto, o genitor é uma alfa-amilase Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

[000232] Em outro aspeto, o genitor é uma alfa-amilase Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[000233] Em outro aspeto, o genitor é uma alfa-amilase Bacillus sp., por exemplo a alfa-amilase de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.

[000234] Será entendido que para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção abrange tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual são conhecidos. Os técnicos da área saberão reconhecer a identidade dos equivalentes apropriados.

[000235] Estirpes dessas espécies encontram-se facilmente acessíveis ao público em várias coleções de culturas como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e a Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[000236] O genitor pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima referidas. As técnicas para isolar microorganismos e DNA diretamente de habitats são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo codificando um genitor pode então ser derivado rastreando similarmente uma biblioteca genômica ou de cDNA de outro microorganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detetado com uma ou mais sondas um polinucleotídeo codificando um genitor, o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas conhecidas dos especialistas da área (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[000237] O genitor pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma porção de um polipeptídeo é fundida no terminal N ou terminal C de uma porção de outro polipeptídeo.

[000238] O genitor também pode ser um polipeptídeo fundido ou polipeptídeo de fusão clivável no qual um polipeptídeo é fundido no terminal N ou terminal C de outro polipeptídeo. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo em um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligar as sequências de codificação codificando os polipeptídeos de forma a ficarem na estrutura e que a expressão do polipeptídeo fundido fique sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. As proteínas de fusão também podem ser construídas usando tecnologia de inteína na qual são criadas fusões pós- translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[000239] Um polipeptídeo de fusão pode ainda compreender um local de clivagem entre dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem, mas não se limitam a, os locais revelados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 34883493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Preparação de variantes

[000240] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, como mutagênese direcionada para o local, construção de gene sintética, construção de gene semissintética, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[000241] A mutagênese direcionada para o local é uma técnica na qual uma ou mais (várias) mutações são criadas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando o genitor.

[000242] A mutagênese direcionada para o local podem ser conseguida in vitro por PCR envolvendo a utilização de iniciadores oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese direcionada para o local pode também ser realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando o genitor e a subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Normalmente a enzima de restrição que digere no plasmídeo e oligonucleotídeo é a mesma, permitindo a inserção de extremidades viscosas no plasmídeo para os ligar um ao outro. Ver, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[000243] A mutagênese direcionada para o local também pode ser conseguida in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[000244] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese direcionada para o local na presente invenção. Há muitos kits comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[000245] A construção de gene sintética implica síntese in vitro de uma molécula polinucleotídica concebida para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese genética pode ser realizada utilizando várias técnicas, tal como a tecnologia de base microchip em multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que são sintetizados oligonucleotídeos e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[000246] Substituições aminoácidas simples ou múltiplas, eliminações, e/ou inserções podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguido de um procedimento de rastreamento relevante, como as reveladas por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR exposto a erros, expressão em fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. No. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[000247] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com elevado rendimento, métodos de rastreamento automatizados para detetar a atividade de polipeptídeos clonados mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão conhecidos na técnica. Esses métodos permitem a determinação rápida da importância dos resíduos aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[000248] A construção de gene semissintética é conseguida combinando aspetos da construção de gene sintético, e/ou mutagênese direcionada para o local, e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos específicos de local, enquanto outras regiões podem estar sujeitas a amplificação PCR predisposta a erros ou amplificação de PCR não predisposta a erros. Podem então ser embaralhadas subsequências polinucleotídicas.

Variantes

[000249] Aminoácidos essenciais podem ser identificados em um genitor de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, como a mutagênese direcionada para local ou mutagênese de escaneio de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica anterior, as mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas em busca de atividade alfa- amilase para identificar resíduos aminoácidos críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da alfa-amilase ou outra interação biológica pode também ser determinado por análise física da estrutura, como determinado por técnicas como a ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de eletrões ou etiquetagem de fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contacto putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos relacionados com o genitor.

Polinucleotídeos

[000250] A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam qualquer uma das variantes da presente invenção.

Construções de Ácido Nucléico

[000251] A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[000252] Um polinucleotídeo pode ser manipulado de várias formas para providenciar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[000253] A sequência de controle pode ser uma sequência de promotor reconhecida por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. A sequência de promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucléico que mostre atividade transcricional na célula hospedeira, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[000254] Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição de construções de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene alfa-amilase Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene alfa-amilase Bacillus licheniformis (amyL), gene penicilinase Bacillus licheniformis (penP), gene da amilase maltogênica Bacillus stearothermophilus (amyM), gene da levansucrase Bacillus subtilis (sacB), genes Bacillus subtilis xylA e xylB, operão E. coli lac, gene da agarase Streptomyces coelicolor (dagA), e gene procariótico da beta-lactamase (Villa- Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). São descritos mais promotores em “Useful proteins from recombinant bacteria” de Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

[000255] Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição de construções de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável Aspergillus niger, glucoamilase Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), amilase TAKA Aspergillus oryzae, protease alcalina Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase Rhizomucor miehei, proteinase aspártica Rhizomucor miehei, beta-glucosidase Trichoderma reesei, celobiohidrolase I Trichoderma reesei, celobiohidrolase II Trichoderma reesei, endoglucanase I Trichoderma reesei, endoglucanase II Trichoderma reesei, endoglucanase III Trichoderma reesei, endoglucanase IV Trichoderma reesei, endoglucanase V Trichoderma reesei, xilanase I Trichoderma reesei, xilanase II Trichoderma reesei, beta-xilosidase Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado incluindo um gene codificando uma alfa-amilase neutra em Aspergilli em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene codificando triose fosfato isomerase em Aspergilli; exemplos não limitativos incluem promotores modificados incluindo o gene codificando a alfa-amilase neutra em Aspergillus niger no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene codificando a triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados e híbridos.

[000256] Em um hospedeiro de fermento, promotores úteis são obtidos a partir dos genes para enolase Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinase Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína Saccharomyces cerevisiae (CUP1), e 3- fosfoglicerato quinase Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de fermento são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[000257] A sequência de controle pode também ser uma sequência de terminador de transcrição adequada que é reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está ligada operacionalmente ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[000258] Terminadores preferidos para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes para antranilato sintase Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase Aspergillus niger, glucoamilase Aspergillus niger, TAKA amilase Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina Fusarium oxysporum.

[000259] Terminadores preferidos para células hospedeiras são obtidos a partir dos genes para enolase Saccharomyces cerevisiae, citocroma C Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de fermento são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[000260] A sequência de controle pode também ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está ligada operacionalmente ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usada qualquer sequência líder que seja funcional na célula hospedeira.

[000261] Líderes preferidos para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes para TAKA amilase Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase Aspergillus nidulans.

[000262] Líderes adequados para células hospedeiras de fermento são obtidos a partir dos genes para enolase Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3- fosfoglicerato quinase Saccharomyces cerevisiae, fator alfa Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase Saccharomyces cerevisiae/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH2/GAP).

[000263] A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência ligada operacionalmente ao terminal 3' da sequência de codificação da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[000264] Sequências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para antranilato sintase Aspergillus nidulans, glucoamilase Aspergillus niger, alfa-glucosidase Aspergillus niger, TAKA amilase Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina Fusarium oxysporum.

[000265] São descritas sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de fermento por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[000266] A sequência de controle pode também ser uma região de codificação de peptídeo de sinal que codifica um peptídeo de sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretória da célula. A extremidade 5' da sequência de codificação do polinucleotídeo pode inerentemente conter uma região de codificação de peptídeo de sinal naturalmente ligada em matriz de leitura de tradução ao segmento da região de codificação que codifica a variante. Em alternativa, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo de sinal que é estranha à sequência de codificação. A região de codificação de peptídeo de sinal estranha pode ser necessária quando a sequência de codificação não contiver naturalmente uma região de codificação de peptídeo de sinal. Em alternativa, a região de codificação de peptídeo de sinal estranha pode simplesmente substituir a região de codificação de peptídeo de sinal natural de forma a melhorar a secreção da variante. Contudo, pode ser usada qualquer região de codificação de peptídeo de sinal que dirija a variante expressa para a via secretória de uma célula hospedeira.

[000267] Sequências de codificação de peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para amilase maltogênica Bacillus NCIB 11837, subtilisina Bacillus licheniformis, beta-lactamase Bacillus licheniformis, alfa- amilase Bacillus stearothermophilus, proteases neutras Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e Bacillus subtilis prsA. São descritos outros peptídeos de sinal por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[000268] Sequências de codificação de peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para amilase neutra Aspergillus niger, glucoamilase Aspergillus niger, TAKA amilase Aspergillus oryzae, celulase Humicola insolens, endoglucanase V Humicola insolens, lipase Humicola lanuginosa e proteinase aspártica Rhizomucor miehei.

[000269] Peptídeos de sinal úteis para células hospedeiras de fermento são obtidos a partir de genes para fator alfa Saccharomyces cerevisiae e invertase Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de codificação de peptídeo de sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[000270] A sequência de controle pode também ser uma região de codificação de propeptídeos que codifica um propeptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como proenzima ou propolipeptídeo (ou um zimogênio, em alguns casos). Um propolipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo do propolipeptídeo. A região de codificação de propeptídeo pode ser obtida dos genes para protease alcalina Bacillus subtilis (aprE), protease neutra Bacillus subtilis (nprT), lacase Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica Rhizomucor miehei e fator alfa Saccharomyces cerevisiae.

[000271] Quando estiverem presentes no terminal N de uma variante tanto regiões de peptídeo de sinal e de propeptídeos, a região propeptídea fica posicionada junto ao terminal N da variante e a região de peptídeo de sinal fica posicionada junto ao terminal N da região propeptídea.

[000272] Pode também ser desejável adicionar sequências regulatórias que permitam a regulação da expressão da variante relativa ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. No fermento, podem ser usados o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos, podem ser usados o promotor de glucomilase Aspergillus niger, o promotor de TAKA alfa-amilase Aspergillus oryzae e o promotor de glucoamilase Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem amplificação de gene. Em sistemas eucarióticos, essas sequências regulatórias incluem o gene de dihidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em esses casos, o polinucleotídeo codificando a variante estaria ligado de forma operacional à sequência regulatória.

Vetores de expressão

[000273] A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de paragem transcricionais e translacionais. As várias sequências nucleotídicas e de controle podem ser juntas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais (vários) locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante de tais locais. Em alternativa, o polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência de codificação fica localizada no vetor de forma a que a sequência de codificação fique ligada operacionalmente às sequências de controle apropriadas para expressão.

[000274] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e possam suscitar a expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo circular linear ou fechado.

[000275] vetor pode ser um vetor replicante autonomamente, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossomal, cuja replicação é independente da replicação cromossomal, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossomal, um minicromossoma ou um cromossoma artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar auto-replicação. Em alternativa, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado juntamente com o(s) cromossoma(s) nos quais tenha sido integrado. Além disso, pode ser usado um vetor simples ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[000276] vetor contém de preferência um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem selecionar facilmente células transformadas, transfetadas, transduzidas ou semelhantes. Um marcador selecionável é um gene cujo produto providencia resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos e semelhantes.

[000277] Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que confiram resistência antibiótica como resistência ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de fermento são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Marcadores selecionáveis para utilização em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não se limitam a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. De uso preferencial em uma célula Aspergillus são os genes de amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[000278] vetor contém de preferência um ou mais elementos que permitem a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação do vetor na célula independente do genoma.

[000279] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a sequência de polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Em alternativa, o vetor pode conter sequências de nucleotídeo adicionais para dirigir integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma ou mais localizações precisas no(s) cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos integracionais devem conter um número suficiente de ácidos nucléicos, tal como 100 a 10000 pares base, 400 a 10000 pares base e 800 a 10000 pares base, que têm um elevado grau de identidade com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser sequências nucleotídicas codificantes ou não codificantes. Por outro lado, o vetor pode estar integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[000280] Para replicação autónoma, o vetor pode ainda compreender uma origem de replicação permitindo ao vetor replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador plasmídeo mediando a replicação autónoma que funcione em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador plasmídeo” significa uma sequência nucleotídica que permite a um plasmídeo ou vetor replicar in vivo.

[000281] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.

[000282] Exemplos de origens de replicação para utilização em uma célula hospedeira de fermento são os dois mícrons de origem de replicação ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[000283] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser conseguidos de acordo com os métodos revelados em WO 00/24883.

[000284] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção na célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópia do polinucleotídeo pode ser alcançado por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável no polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e como tal cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas através de cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[000285] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos dos técnicos da área (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra) para obter variantes substancialmente puras.

Células hospedeiras

[000286] A presente invenção também diz respeito a células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção ligado operacionalmente a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Uma construção ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de forma a que a construção ou vetor seja mantido como integrante cromossomal ou como um vetor extracromossomal autoreplicante como acima descrito. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá, em grande medida, do gene codificando a variante e da sua fonte.

[000287] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo um procariota ou um eucariota.

[000288] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria gram-positiva ou gram-negativa. Bactérias gram-positivas incluem, mas não se limitam a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. Bactérias gram-negativas incluem, mas não se limitam, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.

[000289] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula Bacillus, incluindo, mas não se limitando a, células Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

[000290] A célula hospedeira bacteriana pode também ser qualquer célula Streptococcus, incluindo, mas não se limitando a, células Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000291] A célula hospedeira bacteriana pode também ser qualquer célula Streptomyces, incluindo, mas não se limitando a, células Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

[000292] A introdução de DNA em uma célula Bacillus pode, por exemplo, ser feita por transformação protoplasta (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula E. coli pode, por exemplo, ser feita por transformação protoplasta (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula Streptomyces pode, por exemplo, ser feita por transformação protoplasta e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou por transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula Pseudomonas pode, por exemplo, ser feita por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula Streptococcus pode, por exemplo, ser feita por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformação protoplasta (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070), por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409436). Contudo, pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira.

[000293] A célula hospedeira pode também ser um eucariota, como uma célula de mamífero, insecto, planta ou fungo.

[000294] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como aqui usado inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a ediçao, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

[000295] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fermento. “Fermento” como aqui usado inclui fermento ascosporógeno (Endomycetales), fermento basidiosporógeno, e fermento pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de fermento pode variar no futuro, para os propósitos dessa invenção, o fermento será definido como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[000296] A célula hospedeira de fermento poderá ser uma célula Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia como uma célula Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolytica.

[000297] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo acontece por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por fermentos como Saccharomyces cerevisiae acontece por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[000298] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

[000299] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[000300] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação protoplasta, transformações dos protoplastas e regeneração da parede da célula de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras Aspergillus e Trichoderma são descritas na EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Métodos adequados para transformar espécies Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. O fermento pode ser transformado usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, In Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de produção

[000301] A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir uma variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas à expressão da variante; e (b) recuperar a variante.

[000302] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lote, batelada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Estão disponíveis meios adequados de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada, pode ser recuperada de lisados de células.

[000303] A variante pode ser detetada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Esses métodos de detecção podem incluir a utilização de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzimas. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade da variante.

[000304] A variante pode ser recuperada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente através de procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, recolha, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

[000305] A variante pode ser purificada através de vários procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e de exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puras.

[000306] Em um aspeto alternativo, a variante não é recuperada, mas é sim usada como fonte da variante uma célula hospedeira da presente invenção expressando uma variante.

Composições

[000307] A presente invenção também diz respeito a composições compreendendo uma variante da presente invenção. De preferência, as composições são enriquecidas em uma tal variante. O termo “enriquecidas” significa que a atividade alfa-amilase da composição foi aumentada, por exemplo com um fator de enriquecimento de 1,1.

[000308] A composição pode compreender uma variante como o maior componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente. Em alternativa, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase. A ou as enzimas adicionais podem ser produzidas, por exemplo, por um microorganismo pertencendo ao gênero Aspergillus, por exemplo Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae; Fusarium, por exemplo Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides ou Fusarium venenatum; Humicola, por exemplo Humicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma, por exemplo Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

[000309] As composições podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem ser em forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode ser em forma de um granulado ou um microgranulado. A variante pode ser estabilizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Composições detergentes

[000310] Em uma forma de realização, a invenção dirige-se a composições detergentes compreendendo uma enzima da presente invenção em combinação com um ou mais componentes adicionais da composição de limpeza.

[000311] A escolha de componentes adicionais é da competência do profissional e inclui ingredientes convencionais, incluindo os componentes não limitativos exemplares abaixo indicados. A escolha de componentes pode incluir, para tratamento dos tecidos, a consideração do tipo de tecido a ser limpo, o tipo e/ou grau de sujidade, a temperatura a que deverá ocorrer a limpeza e a formulação do produto detergente. Apesar dos componentes abaixo mencionados serem categorizados por cabeçalho geral de acordo com uma funcionalidade particular, não deve ser entendido como uma limitação, já que um componente pode compreender funcionalidades adicionais, como será do conhecimento do profissional.

Enzima da presente invenção

[000312] Em uma forma de realização da presente invenção, o polipeptídeo da presente invenção pode ser adicionado a uma composição detergente em uma quantidade correspondendo a 0,001-100 mg de proteína, como 0,01-100 mg de proteína, de preferência 0,005-50 mg de proteína, mais preferencialmente 0,01-25 mg de proteína, ainda mais preferencialmente 0,05-10 mg de proteína, mais preferencialmente 0,05-5 mg de proteína, e ainda mais preferencialmente 0,01-1 mg de proteína por litro de licor de lavagem.

[000313] A(s) enzima(s) da composição detergente da invenção podem ser estabilizadas usando agentes de estabilização convencionais, por exemplo um poliol como o propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, por exemplo um éster de borato aromático ou um derivado de ácido fenil borônico como o ácido 4-formilfenil borônico e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO92/19709 e WO92/19708.

[000314] Um polipeptídeo da presente invenção pode também ser incorporado nas formulações de detergente reveladas na WO97/07202 que é aqui incorporada por referência.

Surfactantes

[000315] A composição detergente pode compreender um ou mais surfactantes, que podem ser aniônicos e/ou catiônicos e/ou não iônicos e/ou semipolares e/ou zwitteriônicos ou uma sua mistura. Em uma forma de realização particular, a composição detergente inclui uma mistura de um ou mais surfactantes não iônicos e um ou mais surfactantes aniônicos. O(s) surfactante(s) estão tipicamente presentes em um nível entre 0,1% a 60% de peso, tal como cerca de 1% a 40%, ou cerca de 3% a 20%, ou cerca de 3% a 10%. O(s) surfactante(s) são escolhidos mediante a aplicação de limpeza desejada, e incluem qualquer ou quaisquer surfactantes convencionais conhecidos na técnica. Pode ser usado qualquer surfactante conhecido na técnica para utilização em detergentes de lavagem de roupa.

[000316] Quando aí incluído o detergente deverá normalmente conter entre cerca de 1% a cerca de 40% de peso, tal como entre cerca de 5% a cerca de 30%, incluindo entre cerca de 5% a cerca de 15%, ou entre cerca de 20% a cerca de 25% de um surfactante aniônico. Exemplos não limitativos de surfactantes aniônicos incluem sulfatos e sulfonatos, em particular, alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), isômeros de LAS, alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa- olefinossulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alceno, alcano- 2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanossulfonatos e dissulfonatos, sulfatos de alquila (AS) como dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfatos de álcool graxo (FAS), sulfatos de álcool primário (PAS), etersulfatos de álcool (AES ou AEOS ou FES, também conhecidos como etoxissulfatos de álcool ou éter sulfatos de álcool graxo), alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), éster sulfonatos, glicerol ésteres de ácido graxo sulfonados, metil ésteres de ácido graxo alfa-sulfo (alfa-SFMe ou SES) incluindo éster sulfonato de metila (MES), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ácido succínico dodecenil/tetradecenil (DTSA), derivados de ácido graxo de aminoácidos, diésteres e monoésteres de ácido sulfo-succínico ou sabão e suas combinações.

[000317] Quando aqui incluído, o detergente conterá normalmente entre cerca de 0% a cerca de 40% de peso de um surfactante catiônico. Exemplos não limitativos de surfactantes catiônicos incluem alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), cetiltrimetilamônio brometo (CTAB), dimetildistearilamônio cloreto (DSDMAC) e alquilbenzildimetilamônio e suas combinações, compostos alquila de amônio quaternário, amônio quaternário alcoxilado (AQA).

[000318] Quando aí incluído, o detergente conterá normalmente entre cerca de 0,2% a cerca de 40% de peso de um surfactante não iônico, por exemplo entre cerca de 0,5% a cerca de 30%, em particular entre cerca de 1% a cerca de 20%, entre cerca de 3% a cerca de 10%, tal como entre cerca de 3% a cerca de 5%, ou de cerca de 8% a cerca de 12%. Exemplos não limitativos de surfactantes não iônicos incluem etoxilatos de álcool (AE ou AEO), propoxilatos de álcool, alcoóis graxos propoxilados (PFA), alquil ésteres de ácido graxo alcoxilado, tal como alquil ésteres de ácido graxo etoxilados e/ou propoxilados, etoxilados de alquilfenol (APE), etoxilados de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicosídeos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graxo (FAM), dietanolamidas de ácido graxo (FADA), monoetanolamidas de ácido graxo etoxiladas (EFAM), monoetanolamida de ácido graxo propoxilada (PFAM), amidas polihidroxi alquila de ácido graxo, ou derivados de glucosamina N-acila N-alquila (glucamidas, GA, ou glucamida de ácido graxo, FAGA), bem como produtos disponíveis com o nome comercial SPAN e TWEEN, e suas combinações.

[000319] Quando aqui incluído, o detergente conterá normalmente entre cerca de 0 % a cerca de 40 % de peso de um surfactante semipolar. Exemplos não limitativos de surfactantes semipolares incluem óxidos de amina (AO) como óxido de alquildimetilamina, óxido N-(coco alquila)-N,N-dimetilamina e óxido de amina N-(sebo-alquila)-N,N-bis(2-hidroxietila), alcanolamidas de ácido graxo e alcanolamidas de ácido graxo etoxiladas e suas combinações.

[000320] Quando aqui incluído, o detergente conterá normalmente entre cerca de 0 % a cerca de 40 % de peso de um surfactante zwitteriônico. Exemplos não limitativos de surfactantes zwitteriônicos incluem a betaína, alquildimetilbetaína e sulfobetaína e suas combinações.

Hidrótopos

[000321] Um hidrótopo é um composto que solubiliza compostos hidrofóbicos em soluções aquosas (ou de forma oposta, substâncias polares em um ambiente não polar). Tipicamente, os hidrótopos têm caráter hidrofílico e hidrofóbico (chamadas propriedades anfifílicas como conhecidas dos surfactantes); contudo, a estrutura molecular dos hidrótopos geralmente não favorece a auto-agregação espontânea, ver, por exemplo, a revisão de Hodgdon e Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Os hidrótopos não apresentam uma concentração crítica acima da qual a auto-agregação ocorre como descoberto em surfactantes e lípidos formando meso-fases micelares, lamelares e outras bem conhecidas. Em vez disso, muitos hidrótopos apresentam um processo de agregação do tipo contínuo em que o tamanho dos agregados aumenta à medida que aumenta a concentração. Contudo, muitos hidrótopos alteram o comportamento de fase, a estabilidade e as propriedades coloidais dos sistemas contendo substâncias de caráter polar e não polar, incluindo misturas de água, óleo, surfactantes e polímeros. Os hidrótopos são usados de forma clássica em várias indústrias, desde a indústria farmacêutica, de higiene pessoal, alimentar, até aplicações técnicas. A utilização de hidrótopos em composições detergentes permite por exemplo formulações de surfactantes mais concentradas (como no processo de compactar detergentes líquidos através de remoção de água) sem induzir fenômenos indesejados como a separação de fase ou elevada viscosidade.

[000322] O detergente pode conter 0-5% de peso, tal como entre cerca de 0,5 a cerca de 5%, ou cerca de 3% a cerca de 5% de um hidrótopo. Pode ser usado qualquer hidrótopo conhecido na técnica para utilização em detergentes de lavagem de roupa. Exemplos não limitativos de hidrótopos incluem benzeno sulfonato de sódio, p-tolueno sulfonatos de sódio (STS), xileno sulfonatos de sódio (SXS), cumeno sulfonatos de sódio (SCS), cimeno sulfonato de sódio, óxidos de amina, alcoóis e poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sódio, hidroxinaftaleno sulfonato de sódio, etilhexil sulfato de sódio e suas combinações.

Adjuvantes e co-adjuvantes

[000323] A composição detergente pode conter cerca de 0-65% de peso, tal como cerca de 10% a cerca de 40% de um adjuvante ou co-adjuvante de detergente ou uma sua mistura. Em um detergente de lavagem de louça, o nível de adjuvante é tipicamente 40-65%, em particular 50-65%. O adjuvante e/ou co-adjuvante pode particularmente ser um agente quelante que forma complexos solúveis em água com Ca e Mg. Pode ser usado qualquer adjuvante e/ou co-adjuvante conhecido na técnica para utilização em detergentes de lavagem de roupa ou de louça ou detergentes usados em limpeza industrial ou institucional. Exemplos não limitativos de adjuvantes incluem zeólitos, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos como trifosfato de sódio (STP ou STPP), carbonatos como carbonato de sódio, silicatos solúveis como metassilicato de sódio, silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst), etanolaminas como 2-aminoetan-1-ol (MEA), iminodietanol (DEA) e 2,2’,2”-nitrilotrietanol (TEA) e carboximetilinulina (CMI), e suas combinações.

[000324] A composição detergente pode também conter 0-50% de peso, tal como cerca de 10% a cerca de 40% de um co-adjuvante de detergente ou uma sua mistura. A composição detergente pode incluir um co-adjuvante isolado ou em combinação com um adjuvante, por exemplo um adjuvante zeólito. Exemplos não limitativos de co-adjuvantes incluem homopolímeros de poliacrilatos ou seus copolímeros, como poli(ácido acrílico) (PAA) ou copoli(ácido acrílico/ácido maléico) (PAA/PMA). Outros exemplo não limitativos incluem citrato, quelantes como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos e fosfonatos, e ácido alquil- ou alquenilsuccínico. Exemplos específicos adicionais incluem ácido 2,2’,2”-nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ácido iminodisuccínico (IDS), ácido etilenodiamina-N,N’-disuccínico (EDDS), ácido metilglicinodiacético (MGDA), ácido glutâmico ácido-N,N-diacético (GLDA), 1-hidroxietano-1,1- diilbis(ácido fosfônico) (HEDP), etilenodiaminotetraquis(metileno) tetraquis(ácido fosfônico) (EDTMPA), dietilenotriaminepentaquis(metileno) pentaquis(ácido fosfônico) (DTPMPA), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico ácido-N-monoacético (ASMA), ácido aspártico ácido- N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico ácido-N- monopropiônico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N- (2-sulfometil) aspártico (SMAS), ácido N- (2-sulfoetil) aspártico (SEAS), ácido N- (2- sulfometil) glutâmico (SMGL), ácido N- (2- sulfoetil) glutâmico (SEGL), ácido N- metiliminodiacético (MIDA), ácido α- alanina-N,N-diacético (α -ALDA) , ácido serina-N,N-diacético (SEDA), ácido isoserina-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico ácido- N ,N - diacético (ANDA), ácido sulfanílico ácid-N, N-diacético (SLDA) , ácido taurina-N, N-diacético (TUDA) e ácido sulfometil-N,N-diacético (SMDA), N-(hidroxietila)-etilidenodiaminotriacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), Dietilenotriamina Penta (ácido metilenofosfônico) (DTPMP), aminotris(ácido metilenofosfônico) (ATMP), e suas combinações e seus sais. São descritos outros adjuvantes e/ou co-adjuvantes em, por exemplo, WO 09/102854, US 5977053.

[000325] Inibidores de incrustação como fosfonatos.

Sistemas de branqueamento

[000326] O detergente pode conter 0-20% de peso, tal como cerca de 0% a cerca de 10%, de um sistema de branqueamento. Pode ser usado qualquer sistema de branqueamento conhecido na técnica para utilização em detergentes de lavagem de roupa + louça + I&I. Componentes adequados de sistema de branqueamento incluem catalisadores de branqueamento, ativadores de branqueamento, fontes de peróxido de hidrogênio como percarbonato de sódio e perboratos de sódio, perácidos pré-formados e suas misturas. Perácidos pré-formados adequados incluem, mas não se limitam a, ácidos e sais peroxicarboxílicos, ácidos e sais percarbónicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos, por exemplo, Oxona (R), e suas misturas. Exemplos não limitativos de sistemas de branqueamento incluem sistemas de branqueamento de base peróxida, que podem compreender, por exemplo, um sal inorgânico, incluindo sais de metal alcalino como sais de sódio de perborato (normalmente mono- ou terahidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais de persilicato, em combinação com um ativador de branqueamento formando perácido. Por ativador de branqueamento entende-se aqui um composto que reage com lixívia de peroxigênio como peróxido de hidrogênio para formar um perácido. O perácido assim formado constitui a lixívia ativada. Ativadores de branqueamento adequados para serem aqui usados incluem os pertencentes à classe das ésteres amidas, imidas ou anidridas, exemplos adequados são tetracetil atileno diamina (TAED), sulfonato de sódio 3,5,5 trimetil hexanoiloxibenzeno, ácido dodecanóico diperoxi, 4-(dodecanoiloxi) benzenossulfonato (LOBS), 4-(decanoiloxi)benzenossulfonato, 4- (decanoiloxi)benzoato (DOBS), 4-(3,5,5-trimetilhexanoiloxi) benzenossulfonato (ISONOBS), tetraacetiletilenodiamina (TAED) e 4- (nonanoiloxi)benzenossulfonato (NOBS), e/ou o revelados na WO98/17767. Foi revelado na EP624154 uma família particular de ativadores de branqueamento de interesse e particularmente preferencial nessa família é o citrato de acetil-tributila (ATC). ATC ou um triglicérido de cadeia curta como a Triacina tem a vantagem de ser amigo do ambiente, uma vez que acaba por se degradar em ácido cítrico e álcool. Além disso, o citrato de acetil-tributila e a triacetina têm uma boa estabilidade hidrolítica no produto durante armazenamento e são ativadores de branqueamento eficientes. Por fim, ATC providencia uma boa capacidade adjuvante para o aditivo de lavagem de roupa. Em alternativa, o sistema de branqueamento pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona. O sistema de branqueamento pode também compreender perácidos como o ácido 6- (ftaloílamino)percaprónico (PAP). O sistema de branqueamento pode também incluir um catalisador de branqueamento. Em algumas formas de realização, o componente de branqueamento pode ser um catalisador orgânico selecionado do grupo consistindo de catalisadores orgânicos com as seguintes fórmulas:

[000327] e suas misturas; em que cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificada contendo de 9 a 24 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 24 carbonos, de preferência cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificada contendo de 9 a 18 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 18 carbonos, mais preferencialmente cada R1 é independentemente selecionado do grupo consistindo de 2-propilheptil, 2- butiloctil, 2-pentilnonil, 2-hexildecil, n- dodecil, n-tetradecil, n-hexadecil, n- octadecil, iso-nonil, iso-decil, iso-tridecil e iso-pentadecil. Outros sistemas de branqueamento exemplares são descritos, por exemplo, em WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259, WO2007/087242. Fotobranqueamentos adequados podem ser por exemplo ftalocianina de zinco sulfonatada.

Polímeros

[000328] detergente pode conter 0-10% de peso, tal como 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% ou 0,2-1% de um polímero. Pode ser usado qualquer polímero conhecido na técnica para utilização em detergentes de lavagem de roupa, louça e I&I. O polímero pode funcionar como um co-adjuvante, como acima mencionado, ou pode providenciar propriedades ati-redeposição, de proteção das fibras, liberação de sujidade, inibição de transferência de cores e/ou limpeza de gorduras. Polímeros de anti-redeposição exemplares incluem (carboximetil)celulose (CMC), poli(vinil álcool) (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) ou poli(óxido de etileno) (PEG), poli(etilenoimina) etoxilada e policarboxilatos como PAA, PAA/PMA, e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico. Polímeros de proteção de fibras exemplares incluem CMC hidrofobicamente modificado (HM-CMC) e silicones. Polímeros de liberação de sujidade exemplares incluem copolímeros de ácido tereftálico e glicois oligoméricos. Polímeros de transferência de cores exemplares incluem PVP, poli(vinilimidazol) (PVI) e poli(vinilpiridin-N-óxido) (PVPO ou PVPNO). Outros polímeros exemplares são revelados, por exemplo, na WO 2006/130575.Agentes de coloração de tecido

[000329] As composições detergentes da presente invenção podem também incluir agentes de coloração de tecido como corantes ou pigmentos que quando formulados em composições detergentes podem depositar-se em um tecido quando o referido tecido é posto em contacto com um licor de lavagem compreendendo as referidas composições detergentes, alterando assim a tonalidade do referido tecido através de absorção/reflexão da luz visível. Agentes de clareamento fluorescentes emitem pelo menos alguma luz visível. Em contraste, os agentes de coloração do tecido alteram a tonalidade de uma superfície, pois absorvem pelo menos uma porção do espectro de luz visível. Agentes de coloração de tecido adequados incluem corantes e conjugados de corante-argila e podem também incluir pigmentos. Corantes adequados incluem corantes de molécula pequena e corantes poliméricos. Corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados do grupo consistindo de corantes que se enquadram em classificações do Índice de Cor (C.I.) de Azul Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou suas misturas, por exemplo como descrito em WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 e EP1876226 (aqui incorporadas por referência). A composição detergente compreende preferencialmente entre cerca de 0,00003% de peso a cerca de 0,2% de peso, de cerca de 0,00008 % de peso a cerca de 0,05 % de peso, ou mesmo de cerca de 0,0001% de peso a cerca de 0,04 % de peso de agente de coloração de tecido. A composição pode compreender de 0,0001% de peso a 0,2% de peso de agente de coloração de tecido, isso sendo especialmente preferencial quando a composição está em forma de uma bolsa de dose unitária. Agentes de coloração adequados são também revelados por exemplo em WO 2007/087257, WO2007/087243.

Enzimas (adicionais)

[000330] aditivo do detergente bem como a composição detergente podem compreender uma ou mais enzimas [adicionais] como a protease, lipase, cutinase, uma amilase, carbohidrase, celulase, pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo, uma lacase, e/ou peroxidase.

[000331] Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionadas devem ser compatíveis com o detergente selecionado, (ou seja, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.) e a(s) enzima(s) devem estar presentes em quantidades eficazes.

[000332] Celulases: Celulases adequadas incluem as de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com proteína manipulada. Celulases adequadas incluem as celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo as celulases fúngicas produzidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum reveladas em US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO 89/09259.

[000333] Celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras com benefícios de cuidados da cor. Exemplos de tais celulases são as celulases descritas em EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulases como as descritas em WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

[000334] Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme™, e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, e Puradax HA™ (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

[000335] Proteases: Proteases adequadas incluem as de origem animal, vegetal ou microbiana. São preferenciais as de origem microbiana. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com proteína manipulada. A protease pode ser uma protease serina ou uma metaloprotease, de preferência uma protease microbiana alcalina ou uma protease tipo tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são as subtilisinas, especialmente as derivadas de Bacillus, por exemplo subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descritas na WO 89/06279). Exemplos de proteases tipo tripsina são a tripsina (por exemplo de origem suína ou bivina) e a protease Fusarium descrita em WO 89/06270 e WO 94/25583.

[000336] Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas em WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, e 274.

[000337] Enzimas de protease preferenciais disponíveis comercialmente incluem Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™ e Kannase™ (Novozymes A/S), Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purg10afect™, Purafect OxP™, FN2™ e FN3™ (Genencor International Inc.).

[000338] Lipases: Lipases adequadas incluem as de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com proteína manipulada. Exemplos de lipases úteis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como descritas em EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. insolens como descritas em WO 96/13580, uma lipase Pseudomonas, por exemplo de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, estirpe Pseudomonas sp. SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase Bacillus, por exemplo de B. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).

[000339] Outros exemplos são variantes de lipase como as descritas em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

[000340] Enzimas de lipase preferenciais disponíveis comercialmente incluem LipolaseTM, Lipolase UltraTM, e Lipex™ (Novozymes A/S).

[000341] Amilases: Amilases adequadas (α e/ou β) incluem as de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com proteína manipulada. Amilases incluem, por exemplo, α-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo uma estirpe especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhe em GB 1,296,839.

[000342] Exemplos de amilases úteis são as variantes descritas em WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 e 444.

[000343] Amilases comercialmente disponíveis são a StainzymeTM, StainzymeTM Plus, NatalaseTM, DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM e BANTM (Novozymes A/S), RapidaseTM, PoweraseTM e PurastarTM (da Genencor International Inc.).

[000344] Peroxidases/Oxidases: Peroxidases/oxidases adequadas incluem as de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com proteína manipulada. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo de C. cinereus, e suas variantes como as descritas em WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257.

[000345] Peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme™ (Novozymes A/S).

[000346] A(s) enzima(s) do detergente podem ser incluídas em uma composição detergente adicionando aditivos separados contendo uma ou mais enzimas ou adicionando um aditivo combinado compreendendo todas essas enzimas. Um aditivo de detergente da invenção, ou seja, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta, etc. Formulações de aditivo de detergente preferenciais são granulados, em particular granulados sem formação de poeiras, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas.

[000347] Podem ser produzidos granulados sem formação de poeiras por exemplo como revelado em US 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios entre 1000 e 20000; nonolfenóis etoxilados com entre 16 e 50 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados em que o álcool contém entre 12 e 20 átomos de carbono e em que há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de película adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados na GB 1483591. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Podem ser preparadas enzimas protegidas de acordo com o método revelado na EP 238,216.

Materiais adjuntos

[000348] Podem também ser usados quaisquer componentes de detergente conhecidos na técnica para utilização em detergentes de lavagem de roupa, louça e I&I. Outros componentes de detergente opcionais incluem agentes anti-corrosão, agentes anti-encolhimento, agentes contra a redeposição de sujidades, agentes anti-pregueamento, bactericidas, ligantes, inibidores de corrosão, agentes desintegrantes de desintegração, corantes, estabilizadores de enzimas (incluindo ácido bórico, boratos, CMC, e/ou polióis como o propileno glicol), condicionadores de tecido incluindo argilas, agentes de enchimento/ ajudantes de processamento, agentes de clareamento fluorescentes/branqueadores óticos, propulsor de espuma, reguladores de espuma (solução saponífera), perfumes, agentes de suspensão de sujidade, amaciadores, supressores de solução saponífera, inibidores de embaciamento e agentes de migração, sozinhos ou em combinação. Pode ser usado qualquer ingrediente conhecido na técnica para utilização em detergentes de lavagem de roupa, louça ou I&I. A escolha de tais ingredientes é do conhecimento dos profissionais.

[000349] Dispersantes - As composições detergentes da presente invenção também podem conter dispersantes. Em particular, detergentes em pó podem compreender dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homo- ou copoliméricos ou os seus sais, em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono. Dispersantes adequados são por exemplo descritos em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

[000350] Agentes de Inibição de Transferência de Corantes - As composições detergentes da presente invenção podem também incluir um ou mais agentes de inibição de transferência de corantes. Agentes de inibição de transferência de corantes adequados incluem, mas não se limitam a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de poliamina N-óxidos, copolímeros de N- vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou suas misturas. Quando presentes em uma composição sujeito, os agentes de inibição de transferência de corantes podem estar presentes em níveis entre cerca de 0,0001% a cerca de 10%, entre cerca de 0,01% a cerca de 5% ou mesmo entre cerca de 0,1% a cerca de 3% de peso da composição.

[000351] Agente de clareamento fluorescente - As composições detergentes da presente invenção conterão também de preferência componentes adicionais que poderão tingir os artigos a serem lavados, tais como agente de clareamento fluorescente ou branqueadores óticos. Onde presente, o branqueador está de preferência a um nível de cerca de 0,01% a cerca de 0,5%. Qualquer agente de clareamento fluorescente para utilização em uma composição de detergente de roupa pode ser usado na composição da presente invenção. Os agentes de clareamento fluorescentes mais comummente usados são os pertencentes às classes de derivados de ácido diaminostilbeno-sulfônico, derivados de diarilpirazolina e derivados de bisfenil-distirila. Exemplos do tipo de derivado de ácido diaminostilbeno- sulfônico de agentes de clareamento fluorescente fluorescentes incluem os sais de sódio de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N-metil-N-2-hidroxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil- 2,1,3-triazol-2-il)stilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1-metil-2- hidroxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2,2'-dissulfonato e 2-(stilbil- 4”-nafto-1,2':4,5)-1,2,3-trizol-2”-sulfonato. Agentes de clareamento fluorescentes preferenciais são Tinopal DMS e Tinopal CBS, comercializados por Ciba-Geigy AG, Basileia, Suíça. Tinopal DMS é o sal dissódico de 4,4'- bis-dissulfonato estilbeno (2-morfolino-4 anilino-s-triazin-6-ilamino). Tinopal CBS é o sal dissódico de dissulfonato 2,2'-bis-(fenil-estirilo). Também preferenciais são os agentes de clareamento fluorescentes disponibilizados comercialmente por Parawhite KX, fornecidos por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Índia. Outros fluorescentes adequados para utilização na invenção incluem pirazolinas 1-3-diarila e 7-alquilaminocoumarinas. Níveis de branqueador fluorescente adequados incluem níveis inferiores de entre cerca de 0,01 a 0,05, entre cerca de 0,1 ou mesmo de cerca de 0,2% de peso a níveis superiores de 0,5 ou mesmo 0,75% de peso.

[000352] Polímeros de liberação de sujidade - As composições detergentes da presente invenção podem também incluir um ou mais polímeros de liberação de sujidade que ajudam à remoção de sujidades dos tecidos como tecidos de base algodão e poliéster, em particular na remoção de sujidade hidrofóbica de tecidos de base poliéster. Os polímeros de liberação de sujidade podem, por exemplo, ser polímeros de base tereftalto não iônicos ou aniônicos, caprolactama polivinílica e copolímeros relacionados, copolímeros de enxerto de vinil, poliamidas de poliéster, ver, por exemplo, o capítulo 7 de Powdered Detergents, Surfactant science series, volume 71, Marcel Dekker, Inc. Outro tipo de polímeros de liberação de sujidade são polímeros de limpeza de gordura alcoxilados anfifílicos compreendendo uma estrutura nuclear e vários grupos alcoxilados ligados a essa estrutura nuclear. A estrutura nuclear pode compreender uma estrutura polialquilenimina ou uma estrutura polialcanolamina como descrita em detalhe na WO 2009/087523 (aqui incorporada por referência). Além disso, copolímeros de enxerto aleatórios são polímeros de liberação de sujidade adequados. Copolímeros de enxerto adequados são descritos em mais detalhe em WO 2007/138054, WO 2006/108856 e WO 2006/113314 (aqui incorporados por referência). Outros polímeros de liberação de sujidade são estruturas de polissacarídeos substituídos especialmente estruturas celulósicas substituídas tal como derivados celulósicos como os descritos em EP 1867808 ou WO 2003/040279 (ambos aqui incorporados por referência). Polímeros celulósicos adequados incluem celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose modificada anionicamente, celulose modificada não anionicamente, celulose modificada cationicamente, celulose modificada zwitterionicamente e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose de metila, celulose de metila carboxi, celulose de etila, celulose de etila hidroxila, celulose de metila propila hidroxila, celulose de metila carboxi éster e suas misturas.

[000353] Agentes anti-redeposição - As composições detergentes da presente invenção podem também incluir um ou mais agentes anti- redeposição como carboximetilcelulose (CMC), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno e/ou polietilenoglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico e ácido maléico e polietilenoiminas etoxiladas. Os polímeros de base celulose descritos acima como polímeros de liberação de sujidade também podem funcionar como agentes anti-redeposição.

[000354] Outros materiais adjuntos adequados incluem, mas não se limitam a, agentes anti-encolhimento, bactericidas, ligantes, portadores, corantes, estabilizadores enzimáticos, amaciadores de tecido, agentes de enchimento, reguladores de espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supressores de solução saponífera, solventes, estruturantes para detergentes líquidos e/ou agentes de elastização da estrutura.Formulação dos produtos detergentes

[000355] A composição detergente da invenção pode apresentar-se em qualquer forma conveniente, por exemplo uma barra, um pedaço de sabão homogêneo, um pedaço de sabão com duas ou mais camadas, um pó normal ou compacto, um granulado, uma pasta, um gel ou um líquido normal, compacto ou concentrado.

[000356] Formas de formulação do detergente: Camadas (fases iguais ou diferentes), bolsas, contra formas para unidade de dosagem por máquina.

[000357] As bolsas podem ser configuradas como compartimentos simples ou múltiplos. Podem apresentar qualquer forma, formato e material adequados para conter a composição, por exemplo sem permitir a liberação da composição da bolsa antes do contacto com a água. A bolsa é feita de uma película solúvel em água que encerra um volume interior. O referido volume interior pode ser dividido em compartimentos da bolsa. As películas preferenciais são materiais poliméricos de preferência polímeros formados em uma película ou folha. Polímeros, copolímeros ou seus derivados preferidos são selecionados de poliacrilatos, e copolímeros de acrilato solúveis em água, metilcelulose, carboximetilcelulose, dextrina de sódio, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, maltodextrina, polimetacrilatos, mais preferencialmente copolímeros de álcool polivinílico e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). De preferência, o nível de polímeros na película, por exemplo PVA, é pelo menos cerca de 60%. O peso molecular médio preferencial será tipicamente entre cerca de 20000 a cerca de 150000. As películas também podem ser de composições misturadas compreendendo misturas de polímeros degradáveis hidroliticamente e solúveis em água tal como poliactida e álcool polivinílico (conhecido pelo referência comercial M8630 como vendido por Chris Craft In. Prod. Of Gary, Ind., US) mais plastificantes como glicerol, etileno glicerol, propileno glicol, sorbitol e suas misturas. As bolsas podem compreender uma composição sólida de lavagem de roupa ou componentes parciais e/ou uma composição líquida de lavagem ou componentes parciais separados por película solúvel em água. O compartimento para componentes líquidos pode ser diferente na composição em relação aos compartimentos que contêm sólidos. Ref: (US2009/0011970 A1)

[000358] Ingredientes de detergentes podem ser separados fisicamente uns dos outros por compartimentos em bolsas dissolvíveis em água ou em camada de pedaços de sabão diferentes. Dessa forma podem ser evitada uma interação de armazenamento negativa entre os componentes. Diferentes perfis de dissolução de cada um dos compartimentos podem também dar azo à dissolução retardada de componentes selecionados na solução de lavagem.

Formulações de detergente granular

[000359] Um detergente granular pode ser formulado como descrito em WO09/092699, EP1705241, EP1382668, WO07/001262, US6472364, WO04/074419 ou WO09/102854. Outras formulações de detergente úteis são descritas em WO09/124162, WO09/124163, WO09/117340, WO09/117341,WO09/117342, WO09/072069, WO09/063355, WO09/132870,WO09/121757, WO09/112296, WO09/112298, WO09/103822,WO09/087033, WO09/050026, WO09/047125, WO09/047126,WO09/047127, WO09/047128, WO09/021784, WO09/010375,WO09/000605, WO09/122125, WO09/095645, WO09/040544,WO09/040545, WO09/024780, WO09/004295, WO09/004294,WO09/121725, WO09/115391, WO09/115392, WO09/074398,WO09/074403, WO09/068501, WO09/065770, WO09/021813,WO09/030632 e WO09/015951.

[000360] WO2011025615, WO2011016958, WO2011005803, WO2011005623, WO2011005730, WO2011005844, WO2011005904,WO2011005630, WO2011005830, WO2011005912, WO2011005905,WO2011005910, WO2011005813, WO2010135238, WO2010120863,WO2010108002, WO2010111365, WO2010108000, WO2010107635,WO2010090915, WO2010033976, WO2010033746, WO2010033747,WO2010033897, WO2010033979, WO2010030540, WO2010030541,WO2010030539, WO2010024467, WO2010024469, WO2010024470,WO2010025161, WO2010014395, WO2010044905,

[000361] WO2010145887, WO2010142503, WO2010122051,WO2010102861, WO2010099997, WO2010084039, WO2010076292,WO2010069742, WO2010069718, WO2010069957, WO2010057784,WO2010054986, WO2010018043, WO2010003783, WO2010003792,

[000362] WO2011023716, WO2010142539, WO2010118959,WO2010115813, WO2010105942, WO2010105961, WO2010105962,WO2010094356, WO2010084203, WO2010078979, WO2010072456,WO2010069905, WO2010076165, WO2010072603, WO2010066486,WO2010066631, WO2010066632, WO2010063689, WO2010060821,WO2010049187, WO2010031607, WO2010000636.Usos

[000363] A presente invenção também se dirige a métodos para utilização das composições em causa.

[000364] Lavagem de roupa/têxtil/tecido (lavagem de roupa doméstica, lavagem de roupa industrial)

[000365] Limpeza de superfícies duras (ADW, lavagem automóvel, superfícies industriais)

[000366] Utilização em detergentes. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser adicionados a, e assim tornarem-se parte de, um componente de uma composição detergente.

[000367] A composição detergente da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição detergente para lavagem de roupa manual ou à máquina, incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição de amaciador de tecidos adicionada para enxaguamento, ou ser formulada como uma composição detergente para utilização em operações domésticas gerais de limpeza de superfícies duras ou ser formulada para operações de lavagem de louça manual ou à máquina.

[000368] A composição detergente pode ainda ser formulada em forma de dosagem unitária ou em forma de barra de sabão ou barra de sabão para lavagem de roupa.

[000369] Em um aspeto específico, a presente invenção providencia um aditivo de detergente compreendendo um polipeptídeo da presente invenção como aqui descrito. Em outro aspeto, a presente invenção providencia um detergente adequado para limpeza a temperaturas iguais ou inferiores a 35°C. MétodosDesempenho de lavagem de alfa-amilase usando AMSA

[000370] De forma a avaliar o desempenho de lavagem das variantes alfa- amilase em uma composição base de detergente, podem ser realizadas experiências de lavagem. As enzimas são testadas usando o Ensaio de Tensão Mecânica Automático (AMSA). Com o teste AMSA, pode ser examinado o desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções de detergente com pequeno volume de enzimas. A placa AMSA tem várias ranhuras para soluções de teste e uma tampa firmemente apertando a amostra têxtil a ser lavada contra todas as aberturas de ranhura. Durante o tempo de lavagem, a placa, soluções de teste, o têxtil e tampa são vigorosamente agitados para pôr a solução de teste em contacto com o têxtil e aplicar tensão mecânica de forma regular e periodicamente oscilante. Para uma descrição mais detalhada, consultar a WO 02/42740, especialmente o parágrafo “Special method embodiments” na página 23-24.

[000371] Descrição do desempenho geral de lavagem

[000372] É preparada uma solução de teste compreendendo água (15 °dH), 0,8 g/L de detergente, por exemplo detergente modelo A como abaixo descrito, ou 50 mM HCO3-, e a enzima da invenção, por exemplo em uma concentração de 0,1 0,2, 0,3, 0,4, 0,8 e/ou 1,2 mg de proteína enzima/L. É adicionado tecido manchado com amido (por exemplo CS-28 do Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Holanda) e lavado durante 30 minutos a 20°C, ou em alternativa 20 minutos a 15°C, ou em alternativa 45 minutos a 15°C ou em alternativa 20 minutos a 15°C ou 40°C como especificado nos exemplos. Após enxaguamento abundante com água da torneira corrente e secagem na escuridão, a intensidade da luz ou valores de refletância dos tecidos manchados são de seguida medidos como uma medida de desempenho de lavagem. O teste com 0 mg de proteína enzima/L é usado como branco para obter um valor de remissão delta (ΔREM). Em alternativa, o desempenho de lavagem é comparado ao da alfa-amilase genitora, sendo atribuído o valor de 100 ao resultado do desempenho da alfa- amilase e os resultados das variantes a serem comparadas a esse valor. De preferência, a ação mecânica é aplicada durante a etapa de lavagem, por exemplo sob a forma de sacudir, rodar ou agitar a solução de lavagem com o tecido.

[000373] As experiências de desempenho de lavagem AMSA foram realizadas sob as condições experimentais abaixo especificadas:

[000374] A dureza da água foi ajustada para 15°dH por adição de CaCl2, MgCl2 e NaHCO3 (Ca2+:Mg2+:HCO3- = 4:1:7,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram passados por água da torneira e secos.

*O modelo X é misturado sem AEO. AEO é adicionado à lavagem separadamente.pH aproximado da lavagem em água de 12 °dH (Ca: Mg: HCO3 =2:1:4,5)

[000375] A dureza da água foi ajustada para 12 °dH por adição de CaCl2,MgCl2 e NaHCO3 (Ca: Mg: HCO3 =2:1:4,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram passados por água da torneira e secos.

[000376] desempenho de lavagem foi medido como o brilho da cor do têxtil lavado. O brilho também pode ser expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é menor do que a da amostra limpa. Como tal, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

[000377] As medições de cor são feitas com um scanner de mesa (Kodak iQsmart, Kodak) que é usado para capturar uma imagem do têxtil lavado.

[000378] Para extrair um valor para a intensidade da luz das imagens digitalizadas, os valores de pixel de 24 bits da imagem são convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado adicionando os valores RGB juntamente como vetores e depois considerando o comprimento do vetor resultante:

Têxteis:

[000379] A amostra têxtil CS-28 (amido de arroz em algodão) é obtida do Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Holanda.Teste de desempenho de lavagem usando provetas

[000380] Esse ensaio é um modelo de pequena escala de uma máquina de lavar a roupa de carregamento vertical e usado para avaliar o desempenho de lavagem de amilases.

[000381] teste de desempenho de lavagem de proveta, usando provetas de 250 mL e um agitador de palheta providenciando movimento rotativo oscilante, 180° em cada direção, com uma frequência de 80 por minuto, compreende as seguintes etapas: providenciar 100 mL de solução de lavagem (6°C, 15 °dH, pH 8,0) contendo 50 mM NaHCO3 e 0,4 mg/L de enzimas; adicionar duas amostras de CS-28 (5x5 cm) e duas amostras de EMPA 162 (5x5 cm) à solução de lavagem para começar a lavagem; ajustar a velocidade de rotação para 80 rpm; parar a agitação após 60 minutos, enxaguar as amostras com água fria corrente da torneira; secar as amostras enxaguadas no escuro durante a noite; e avaliar o desempenho de lavagem medindo a remissão da luz incidente a 460 nm usando Color Eye como abaixo descrito. Equipamento e material

[000382] Banho de água (5°C) com circulação; provetas de vidro (250 mL); um braço rotativo por proveta com capacidade de 100 mL de solução de lavagem; amostras de teste: CS-28 (amido de arroz em algodão) do Center for Testmaterials BV, Vlaardingen, Holanda e EMPA 162 (amido de arroz em algodão/poliéster) de EMPA Testmaterials AG, St. Gallen, Suíça, as amostras são cortadas em 5 x 5 cm.

[000383] Solução de lavagem: Tampão de 50 mM NaHCO3, pH 8,0, dureza da água: 15 °dH, rácio Cálcio:Magnésio 4:1.

[000384] Solução de estoque de amilase: 1 mg de proteína enzima por mL. - Uma solução de 0,1 % (p/v) Triton X-100 e 0,1 mM CaCl2 em água ultrapura (água MilliQ) é usada para diluição da amilase (tampão de diluição da amilase).

Medição Color Eye

[000385] desempenho de lavagem é expresso como valor de remissão delta (ΔRem). As avaliações de refletância de luz das amostras foram feitas usando um espectrofotômetro de refletância Macbeth Color Eye 7000 com abertura oval muito pequena, ou seja 0,7 cm2 (~0,7 x 1,0 cm). As medições foram feitas sem UV na luz incidente e foi extraída remissão a 460 nm. A amostra a ser medida foi colocada em cima de outra amostra do mesmo tipo antes de ser medida para reduzir a reflexão do pistão empurrando a amostra contra a abertura de medição. Os valores de remissão delta para amostra individuais foram calculados por subtração do valor de remissão da amostra lavada sem amilase adicionada (controle) ao valor de remissão da amostra lavada com amilase.

Desempenho de lavagem de alfa-amilases usando robô mini-lavagem:

[000386] O robô mini-lavagem é um modelo de pequena escala de uma máquina de lavar a roupa e usado para avaliar o desempenho de lavagem de amilases.

[000387] A provetas de 100 mL foram adicionados 60 mL de solução de lavagem, aquecida a 15°C ou 40°C. Depois é adicionada enzima (Concentrações: 0,00; 0,015; 0,05; 0,25; 0,50; 1,00 mg proteína enzima/L). Têxtil (CS-28; amido de arroz em algodão) em estrutura é submergido na solução de lavagem contendo uma determinada concentração de enzimas e lavado durante 20 minutos. Após lavagem, o têxtil em estrutura é seco em armários de secagem sem calor. A remissão do têxtil é medida a 460 nm usando um Espectrofotômetro ZEISS MCS 521 VIS. Os valores de remissão delta para o têxtil individual foram calculados por subtração do valor de remissão do têxtil lavado sem amilase adicionada (controle) ao valor de remissão do têxtil lavado com amilase.

Ensaio pNP-G7 para determinação da atividade da alfa-amilase

[000388] A atividade da alfa-amilase pode ser determinada por um método empregando o substrato G7-pNP. G7-pNP é uma abreviatura de 4,6- etilideno(G7)-p-nitrofenil(Gi)-α,D-maltoheptaosideo, um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase, como uma alfa- amilase. A seguir à clivagem, a alfa-glucosidase incluída no kit digere ainda mais o substrato hidrolisado para liberar uma molécula livre de p-nitrofenol (pNP) de cor amarela e pode assim ser medida por espectrofotometria visível a X = 405 nm (400-420 nm). Os kits contendo substrato G7-pNP e alfa- glucosidase são fabricados pela Roche/Hitachi (cat. N° 11876473).

REAGENTES:

[000389] O substrato G7-pNP desse kit contém 22 mM 4,6-etilideno- G7- pNP e 52,4 mM HEPES (2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-ácido etanossulfônico), pH 7,0).

[000390] O reagente alfa-glucosidase contém 52,4 mM HEPES, 87 mM NaCl, 12,6 mM MgCh, 0,075 mM CaCh, > 4 kU/L alfa-glucosidase.

[000391] A solução de trabalho do substrato é feita por mistura de 1 mL do reagente de alfa-glucosidase com 0,2 mL do substrato G7-pNP. Essa solução de trabalho do substrato é feita imediatamente antes de ser utilizada.

[000392] Tampão de diluição: 50 mM MOPS, 0,05% (p/v) Triton X100 (polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil éter (C14H22O(C2H4O)n (n = 9-10))), 1 mM CaCl2, pH 8,0.

PROCEDIMENTO:

[000393] A amostra de amilase a ser analisada foi diluída em um tampão de diluição para assegurar que o pH da amostra diluída é 7. O ensaio foi realizado transferindo 20 μl de amostras de enzimas diluídas para placa de microtitulação de 96 poços e adicionando 80 μl de solução de trabalho do substrato. A solução foi misturada e pré-incubada 1 minuto à temperatura ambiente e a absorção foi medida de 20 em 20 segundos ao longo de 5 minutos a OD 405 nm.

[000394] A inclinação (absorvância por minuto) da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade específica (atividade por mg de enzima) da alfa-amilase em questão sob o conjunto determinado de condições. A amostra de amilase deve ser diluída para um nível em que a inclinação fique abaixo das 0,4 unidades de absorvância por minuto.

Determinação da ligação ao amidoPrincípio do ensaio:

[000395] As variantes de amilase são incubadas na presença ou ausência de amido de arroz em bruto insolúvel a um valor de pH selecionado, no intervalo de pH 4,0 e 11,0, dependendo do valor de pH pretendido para a aplicação das alfa-amilases a serem selecionadas; por exemplo para aplicações de detergente, o pH é selecionado de forma adequada no intervalo alcalino tal como pH 8,0 ou pH 10,0; em um período de tempo selecionado, em geral entre 5 minutos e uma hora, de preferência no intervalo de 10 a 30 minutos tal como 10 minutos ou 30 minutos; e a uma temperatura selecionada, em geral no intervalo de 0°C a 30°C, de preferência a 4°C. Após centrifugação, a atividade da amilase é determinada nos sobrenadantes. A diferença na atividade nas amostras incubadas na presença e ausência de amido de arroz é uma medida da ligação da amilase ao amido insolúvel.

Materiais e Métodos:

[000396] Amido de arroz (Sigma Inc, Cat No. S7260), HEPES, cloreto de cálcio, Triton X-100, Glicina, EnzChek Ultra Amylase Assay Kit (Life Technologies, Cat No. E33651), placas de 96 micropoços para incubação e diluição (Nunc, Cat No. 269620) e placas pretas de semi-área de 96 poços para medições de fluorescência (Corning, Cat No. 3694).

[000397] tampão de ensaio continha 50 mM HEPES (pH 8,0), 0,1 mM CaCl2 e 0,01% Triton X-100. As soluções de proteína enzima foram diluídas em 0,15 mg/ml com o tampão de ensaio. Um tampão de ligação com pH elevado continha 50 mM Glicina-NaOH (pH 10,0) e 0,01% Triton X-100. Foi preparada uma solução de amido de arroz (2,5%) no tampão de ensaio para as variantes de SEQ ID NO: 14 e em tampão de ligação com pH elevado para as variantes de SEQ ID NO: 2. Foi preparada uma solução de substrato EnzCheck Ultra Amylase de acordo com as instruções do fabricante e diluída em 50 μg/ml no tampão de ensaio.a) Tampão com ou sem amido de arroz (2,5%), 100 μl foram adicionados a uma placa de microtitulação de 96 poços e pré-incubados a 4°C por 30 min.b) Soluções de enzimas, 20 μl foram adicionados aos poços acima e a placa foi colocada em um misturador e misturada a 900 rpm por 30 min a 4°C.c) A placa foi centrifugada a 2000 rpm por 5 minutos a 4°C para o amido assentar e o sobrenadante foi cuidadosamente removido e diluído para cerca de 1250 vezes no tampão de ensaio para que a concentração de proteína enzima seja cerca de 20 ng/ml.d) Amostras de enzimas diluídas, 25 μl foram adicionados a placas pretas com semi-área de 96 poços contendo 25 μl de solução de substrato EnzCheck Ultra Amylase e a placa foi imediatamente colocada em um leitor de placas para medições de fluorescência.e) A alteração na intensidade da fluorescência (ΔF.I.) foimedida a 25°C por 30 minutos a um comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 512 nm. As leituras de fluorescência entre os intervalos de tempo de 0,5 a 5 minutos foram apontadas para cálculo da atividade (ou seja) alteração na intensidade da fluorescência por minuto (ΔF.I./min).

EXEMPLOSExemplo 1: Determinação da ligação a amilose e desempenho de lavagem

[000398] Usando o método de medição da ligação a amido e o teste de desempenho de lavagem AMSA descrito na seção de métodos, foram analisadas várias amilases e suas variantes em relação à ligação à amilase e desempenho de lavagem.

[000399] A análise de ligação foi feita com um pH de 8,0, período de ligação de 10 minutos e a uma temperatura de 4°C. A ligação foi testada usando uma amilose 5 % (p/v) (Sigma A0512), e o teste de desempenho de lavagem foi realizado como descrito para o teste de desempenho de lavagem AMSA usando detergente modelo A e uma dosagem de enzimas de 0,4 mg de solução de lavagem de proteína enzima/L e uma temperatura de lavagem de 15°C. O tempo de lavagem foi 45 minutos.

[000400] Os resultados são apresentados na tabela 1 abaixo.

[000401] Desses resultados é claramente aparente uma correlação inversa entre a fração ligada ao amido e o desempenho de lavagem.

Exemplo 2: Determinação da ligação a amido de arroz em bruto e desempenho de lavagem

[000402] Princípio:

[000403] mesmo princípio descrito no Exemplo 1, mas com a utilização de uma suspensão de 5 % (p/v) de amido de arroz (Sigma S7260) em vez de amilose. A análise de ligação foi feita com um pH de 8,0, período de ligação de 10 minutos e a uma temperatura de 4°C.

Exemplo 3: Determinação da ligação à amilopectina

[000404] mesmo princípio como descrito no Exemplo 1, mas com a utilização de uma suspensão de 5 % (p/v) de amilopectina (da Fluka) de milho em vez de amilose.

Exemplo 4: Variantes da alfa-amilase Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 13).

[000405] Foram feitas variantes da alfa-amilase B. licheníformis com SEQ ID NO: 13. As variantes testadas tinham menor ligação ao amido e melhor desempenho de lavagem em comparação com a alfa-amilase genitora com SEQ ID NO: 13.

[000406] A análise de ligação foi feita com um pH de 8 com 5% (p/v) de amido de arroz insolúvel, período de ligação de 10 minutos e a uma temperatura de 5°C.

[000407] O desempenho de lavagem das variantes foi testado usando mini-lavagem com as condições descritas em “Desempenho de lavagem das alfa- amilases usando robô mini-lavagem” e mostrou que as variantes melhoraram o desempenho de lavagem usando 0,5 mg/L a 40°C em comparação com a alfa-amilase genitora de Bacillus licheniformis. Tempo de lavagem de 20 minutos.Desempenho de lavagem = Valor (Variante - Branco) / Valor(Termamyl-Branco) * 100

Exemplo 5: Variantes de alfa-amilase Bacillus sp 707 (SEQ ID NO: 2)

[000408] Foram geradas variantes adicionais da alfa-amilase com SEQ ID NO: 2 e as variantes foram testadas em relação à ligação de substrato, e desempenho de lavagem AMSA foi testado usando 0,3 mg proteína enzima/L a 15°C por 20 minutos em detergente modelo X.

[000409] A análise de ligação foi feita com um pH de 10,0 com 2,5% (p/v) de amido de arroz insolúvel, período de ligação de 10 minutos e a uma temperatura de 4°C.

[000410] O desempenho de lavagem é indicado em relação ao desempenhode lavagem da alfa-amilase genitora com SEQ ID NO: 2 com as modificações H183*+G184*

Exemplo 6: Variantes de alfa-amilase Bacillus sp 707 (SEQ ID NO: 2)

[000411] Foram geradas outras variantes da alfa-amilase com SEQ ID NO: 2 e as variantes foram testadas em relação a ligação de substrato e desempenho de lavagem a baixa temperatura, e variantes selecionadas tendo menor ligação de substrato do que a alfa-amilase genitora com SEQ ID NO: 2 com as modificações H183*+G184*. Os testes de lavagem AMSA foram realizados usando 0,3 mg proteína enzima/L a 15°C por 20 minutos em detergente modelo X.

[000412] desempenho de lavagem é indicado em relação ao desempenho de lavagem da alfa-amilase genitora com SEQ ID NO: 2 com as modificaçõesH183*+G184*.

Exemplo 7: Variantes de alfa-amilase Bacillus sp 707 (SEQ ID NO: 2)

[000413] Foram geradas outras variantes da alfa-amilase com SEQ ID NO: 2 e as variantes foram testadas em relação a ligação de substrato e desempenho de lavagem a baixa temperatura, e variantes selecionadas tendo menor ligação de substrato do que a alfa-amilase genitora com SEQ ID NO: 2 com as modificações H183*+G184*. Os testes de lavagem AMSA foram realizados usando 0,3 mg proteína enzima/L a 15°C por 20 minutos em detergente modelo X.

[000414] A análise de ligação foi feita com um pH de 8,0, período de ligação de 10 minutos e a uma temperatura de 4°C.

[000415] desempenho de lavagem é indicado em relação ao desempenho de lavagem da alfa-amilase genitora com SEQ ID NO: 2 com as modificaçõesH183*+G184*.

[000416] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada noseu escopo pelos aspetos específicos aqui revelados, uma vez que esses aspetos destinam-se a ilustrar vários aspetos da invenção. Quaisquer aspetos equivalentes pertencem ao escopo dessa invenção. De fato, várias modificações da invenção, para além das aqui apresentadas e descritas, serão claras para os profissionais a partir da descrição anterior. É pretendido que essas modificações também pertençam ao escopo das reivindicações adjuntas. Em caso de conflito, será a presente revelação incluindo definições a imperar.

Claims (6)

1. Polipeptídeo variante, caracterizado pelo fato de ser com atividade alfa-amilase, em que a variante é derivada de uma alfa-amilase genitora como mostrada na SEQ ID NO: 2, 4, 5 ou 15 e compreendea. uma deleção das posições 181 + 182 ou 182 + 183 ou 183 + 184 e ainda uma ou duas ou mais modificações em qualquer uma das posições correspondentes a W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289 , G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 e G477 na SEQ ID NO: 2;b. uma deleção das posições 181 + 182 ou 182 + 183 ou 183 + 184 e compreendendo ainda uma ou duas ou mais modificações em qualquer uma das posições correspondentes a W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 e G477 na SEQ ID NO: 5;c. uma deleção das posições 181 + 182 ou 182 + 183 ou 183 + 184 e compreendendo ainda uma ou duas ou mais modificações em qualquer uma das posições correspondentes a W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 e G477 na SEQ ID NO: 4; oud. uma deleção das posições 179 + 180 ou 180 + 181, ou 181 + 182 e compreendendo ainda uma ou duas ou mais modificações em qualquer uma das posições correspondentes a W139, W158, W166, E168, W187, E192, F260, F287, G302, G303 , W345, W437, W467, G474 e G475 na SEQ ID NO: 15,em que as modificações a-d são substituições e, em que a alfa- amilase variante tem uma menor ligação a amido sólido e maior desempenho de lavagem a 15°C, em comparação com a alfa-amilase genitora.

2. Alfa-amilase variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que foi modificado um resíduo de aminoácido em um ou mais locais de ligação do substrato na superfície da molécula.

3. Alfa-amilase variante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende as seguintes modificações na SEQ ID NO: 2:H183*+G184*+W140F;H183*+G184*+Q169N;H183*+G184*+Q169A;H183*+G184*+W189Y+E190P;H183*+G184*+N260D;H183*+G184*+G477E;H183*+G184*+G477Q;H183*+G184*+G477K;H183*+G184*+W189E+E190P;H183*+G184*+A51I+W140Y;H183*+G184*+W140Y+W189E;H183*+G184*+W140Y+N260P;H183*+G184*+W140Y+W284D;H183*+G184*+W140Y+G476R;H183*+G184*+W140Y+G477E;H183*+G184*+W189E+W439R;H183*+G184*+W284D+G477E;H183*+G184*+W439R+G476R;H183*+G184*+W439R+G477E;H183*+G184*+E194D;H183*+G184*+W439R+D467K;H183*+G184*+R320M+W439R;H183*+G184*+W439R+K485R;H183*+G184*+Y160S;H183*+G184*+W189F+E190P; H183*+G184*+F262A;H183*+G184*+Y363H;H183*+G184*+G476E;H183*+G184*+N260P+W439R;H183*+G184*+N260P+G477E;H183*+G184*+W439R+G476R;H183*+G184*+K72S+W140Y;H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G;H183*+G184*+E194S;H183*+G184*+E345D+G477R;H183*+G184*+K302N+W439R;H183*+G184*+R320K+W439RH183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+ G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+ G476K+G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+ G476E+G477K;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W 469Y+G476K+G477E;H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G 476K+G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E;H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G4 77R;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+ G476R;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+ G476Q+G477Q;H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+ G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G 476E+G477K;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W 469Y+G476R;H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K;H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G 476Q+G477K;H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+ G476E+G477K;H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+ G477K;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G 476K+G477Q;H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q;H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G 477Q; eH183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.

4. Alfa-amilase variante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que consiste de SEQ ID NO: 2 com uma modificação selecionada entre: H183*+G184*+W140F;H183*+G184*+Q169N;H183*+G184*+Q169A;H183*+G184*+W189Y+E190P;H183*+G184*+N260D;H183*+G184*+G477E;H183*+G184*+G477Q;H183*+G184*+G477K;H183*+G184*+W189E+E190P;H183*+G184*+A51I+W140Y;H183*+G184*+W140Y+W189E;H183*+G184*+W140Y+N260P;H183*+G184*+W140Y+W284D;H183*+G184*+W140Y+G476R;H183*+G184*+W140Y+G477E;H183*+G184*+W189E+W439R;H183*+G184*+W284D+G477E;H183*+G184*+W439R+G476R;H183*+G184*+W439R+G477E;H183*+G184*+E194D;H183*+G184*+W439R+D467K;H183*+G184*+R320M+W439R;H183*+G184*+W439R+K485R;H183*+G184*+Y160S;H183*+G184*+W189F+E190P;H183*+G184*+F262A;H183*+G184*+Y363H;H183*+G184*+G476E;H183*+G184*+N260P+W439R; H183*+G184*+N260P+G477E;H183*+G184*+W439R+G476R;H183*+G184*+K72S+W140Y;H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G;H183*+G184*+E194S;H183*+G184*+E345D+G477R;H183*+G184*+K302N+W439R;H183*+G184*+R320K+W439RH183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+ G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+ G476K+G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+ G476E+G477K;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W 469Y+G476K+G477E;H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G 476K+G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E;H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G4 77R;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+ G476Q+G477Q; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+ G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G 476E+G477K;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W 469Y+G476R;H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K;H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G 476Q+G477K;H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+ G476E+G477K;H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+ G477K;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q;H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G 476K+G477Q;H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q;H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y;H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G 477Q; eH183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.

5. Composição detergente, caracterizada pelo fato de compreender uma alfa-amilase variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um ou mais surfactantes.

6. Utilização de uma alfa-amilase variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser em um processo de limpeza.