JP2024508766A - アミラーゼバリアント - Google Patents

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Abstract

本発明では、新規のアミラーゼ酵素が提供される。より具体的には、遺伝子操作されたアミラーゼ酵素、酵素を含む組成物並びに酵素又は酵素を含む組成物を作製及び使用する方法が提供される。【選択図】 なし

Description

本発明では、新規のアミラーゼ酵素が提供される。より具体的には、遺伝子操作されたアミラーゼ酵素、酵素を含む組成物並びに酵素又は酵素を含む組成物を作製及び使用する方法が提供される。
酵素は、石油化学に対する持続可能な代替物として様々な応用で一層使用されている。酵素は、生分解性であり、低温で既に触媒的に活性であり得、エネルギー消費の減少をもたらす。特に、洗剤産業において、酵素は、クリーニング効率を改善し、洗浄工程におけるエネルギー消費を減少させるために洗浄配合物において実装されている。
アミラーゼは、デンプンを加水分解することができる酵素である。したがって、アミラーゼは、デンプンのしみの除去で利用されており、この目的のためにクリーニング組成物に加えられている。これらの洗剤への応用では、アミラーゼは、高温において且つ/又は洗剤の変性条件及び洗浄アルコール内で安定であるものとする。したがって、改善された特性、特に改善された安定性及び改善された性能を有する新規のアミラーゼ酵素の必要性が存在している。
本発明は、親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、好ましくは置換を含み、
(ii)前記バリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80%であるが、100%未満の配列同一性を有し、及び
(iii)前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
さらに、本発明は、前記アルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクター並びにポリヌクレオチド、核酸コンストラクト又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
さらに、本発明は、アルファ-アミラーゼバリアント及び少なくとも1種の追加の構成成分を含む組成物であって、好ましくは洗剤組成物(例えば、洗濯洗剤組成物又は自動食器洗浄(ADW)洗剤組成物)並びにそのような組成物におけるアルファ-アミラーゼバリアントの使用に関する。
本発明は、アルファ-アミラーゼバリアントを生成する方法であって、前記アルファ-アミラーゼバリアントの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養すること;及び前記アルファ-アミラーゼバリアントを回収することを含む方法にも関する。
本発明は、本発明の実施形態及び本明細書に含まれる実施例の以下のより詳細な説明に対する参照によってより容易に理解され得る。
本発明は、特定の実施形態に関して記載されることになるが、この記載は、限定的な意味で解釈されるべきではない。
定義
特に注記がない限り、本明細書で使用される用語は、当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。
本発明の例示的な実施形態を詳細に説明する前に、本発明を理解するために重要な定義を示す。別段の記載がない限り又は定義の性質から明らかな場合を除いて、定義は、本明細書に記載される全ての化合物、方法及び使用に適用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、文脈上明確に指示されない限り、それぞれの複数形も包含する。
本発明に関連して、「約」及び「およそ」という用語は、対象とする特徴の技術的効果が依然として確保されると当業者が理解することになる精度の幅を指す。この用語は、通常、示された数値から±20%、好ましくは±15%、より好ましくは±10%、さらにより好ましくは±5%のずれを示す。
さらに、本明細書及び特許請求の範囲における「第1の」、「第2の」、「第3の」又は「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」などの用語は、類似の構成要素を区別するために使用されるものであり、必ずしも連続した順番又は時系列順を説明するものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、及び本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載又は図示する順序以外の順序で実施することが可能であることが理解されるべきである。「第1」、「第2」、「第3」又は「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」、「i」、「ii」などの用語が方法若しくは使用又はアッセイの工程に関する場合、本出願で別段の指定がない限り、本明細書で前述又は後述するように、この工程間に時間を置かないか又は時間間隔の一貫性がなく、すなわち、この工程は、同時に実施され得るか、又はこのような工程間に数秒間、数分間、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間若しくはさらに数年間の時間間隔があり得る。
本出願全体にわたって様々な論文が参照される。これらの論文及び全体がそれらの論文内で引用される参考文献の全ての開示は、本発明が関連する従来技術をより詳細に記載するために、参照により本出願に組み込まれる。
「含む」という用語は、非限定的であることが理解されるべきである。本発明の目的では、「からなる」という用語は、「含む」という用語の好ましい実施形態であるとみなされる。以下では、ある群が少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義される場合、好ましくは、これらの実施形態のみからなる群も包含することを意味する。
「親」配列(「親酵素」又は「親タンパク質」とも呼ばれる)は、親配列において「バリアント」をもたらす配列の変化の導入(例えば、1つ以上のアミノ酸置換を導入することによる)のための開始配列である。したがって、用語「酵素バリアント」、又は「配列バリアント」、又は「タンパク質バリアント」は、それぞれのバリアント酵素のための起源である親酵素に対する参照において使用される。したがって、親酵素は、野生型酵素及びさらなるバリアントの開発のために使用される野生型酵素のバリアントを含む。様々な酵素は、特定の程度までそれらのアミノ酸配列において親酵素と異なる。
本発明のバリアントを記載する際、承認されるIUPAC一文字又は三文字アミノ酸略称に従って使用される単一のアミノ酸に関する略称が使用される。
「アミノ酸改変」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸置換、欠失又は挿入を指す。
「置換」は、元のアミノ酸の後にアミノ酸配列内の位置の番号を与え、その後に置換されたアミノ酸を与えることによって記載される。例えば、120位でのヒスチジンのアラニンによる置換は、「His120Ala」又は「H120A」として指定される。置換は、この位置で親のアミノ酸を指定することなく、バリアントにおける得られるアミノ酸を単に命名することによっても記載され得、例えば「X120A」、又は「120A」、又は「Xaa120Ala」、又は「120Ala」である。
「欠失」は、元のアミノ酸の後にアミノ酸配列内の位置の番号を与え、その後に*を与えることによって記載される。したがって、150位でのグリシンの欠失は、「Gly150*」又は「G150*」と指定される。代わりに、欠失は、例えば、「D183及びG184の欠失」によって示される。
「挿入」は、元のアミノ酸の後にアミノ酸配列内の位置の番号を与え、その後に元のアミノ酸及び追加のアミノ酸を与えることによって記載される。例えば、グリシンの隣のリジンの180位での挿入は、「Gly180GlyLys」又は「G180GK」として指定される。例えば、Gly180の後にLys及びAlaなどの2個以上のアミノ酸が挿入されるとき、これは、Gly180GlyLysAla又はG195GKAとして示され得る。
置換及び挿入が同じ位置に存在する場合、これは、S99SD+S99A又は要約すればS99ADとして示され得る。既存のアミノ酸残基と同一なアミノ酸残基が挿入される場合、命名法において縮重が生じることは、明白である。例えば、グリシンが上の例においてグリシンの後に挿入される場合、これは、G180GGによって示されるであろう。複数の改変を含むバリアントは、「+」によって隔てられ、例えば、「Arg170Tyr+Gly195Glu」又は「R170Y+Gly195E」は、それぞれ170位及び195位のアルギニン及びグリシンのチロシン及びグルタミン酸による置換を表す。代わりに、複数の改変は、スペース又はコンマによって隔てられ得、例えばそれぞれR170Y G195E又はR170Y、G195Eである。異なる別の改変がある位置で導入され得る場合、異なる改変は、カンマによって隔てられ、例えば、それぞれ「Arg170Tyr,Glu」及びR170T,Eは、170位のアルギニンのチロシン又はグルタミン酸による置換を表す。特定の位置での別の置換は、X120A,G,H、120A,G,H、X120A/G/H又は120A/G/Hとしても示され得る。代わりに、異なる改変又は任意選択の置換は、角括弧において示され得、例えばArg170[Tyr,Gly]若しくはArg170{Tyr,Gly}又は要約すればR170[Y,G]若しくはR170{Y,G}である。
「合成」又は「人工」化合物は、インビトロでの化学的及び/又は酵素的合成によって生成される。用語「天然の」(又は天然に存在する又は野生型又は内在性の)細胞又は生物又はポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然に見出されるとおりの(すなわちいずれのヒトによる介入も伴わずに)細胞又は生物又はポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。本発明のために、細胞又は生物に関する「組み換え」(又はトランスジェニック)は、細胞又は生物が、遺伝子技術により人間によって導入される異種ポリヌクレオチドを含有し、ポリヌクレオチドに関して、遺伝子技術/組み換えDNA手法により人間によって生じさせられる全てのそれらのコンストラクトを含み、
(a)ポリヌクレオチド若しくはその一部の配列、又は
(b)それに対するプロモーターを含むが、これに限定されないポリヌクレオチドに作動可能に連結される1つ以上の遺伝子制御配列、又は
(c)a)及びb)の両方
は、それらの野生型遺伝子環境において配置されていないか又は人間によって改変されている。
用語「異種」(又は外因性、若しくは外来性、若しくは組み換え、若しくは非天然)ポリペプチドは、宿主細胞に対して天然ではないポリペプチド、構造的改変、例えば欠失、置換及び/又は挿入が、天然のポリペプチドを改変するために組み換えDNA手法によって作製されている宿主細胞に対して天然のポリペプチド又は発現が定量的に改変されるか若しくは発現が組み換えDNA手法、例えばより強力なプロモーターによって宿主細胞のDNAの操作の結果として天然の宿主細胞と異なるゲノム位置から指示される宿主細胞に対して天然のポリペプチドとして本明細書で定義される。同様に、用語「異種」(又は外因性、若しくは外来性、若しくは組み換え、若しくは非天然)ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して天然ではないポリヌクレオチド、構造的改変、例えば欠失、置換及び/又は挿入が、天然のヌクレオチドを改変するために組み換えDNA手法によって作製されている宿主細胞に対して天然のポリペプチド又は発現が組み換えDNA手法、例えばより強力なプロモーターによってポリヌクレオチドの調節エレメントの操作の結果として定量的に改変される宿主細胞に対して天然のポリヌクレオチド又は宿主細胞に対して天然であるが、組み換えDNA手法による遺伝子操作の結果としてその天然の遺伝子環境内に組み込まれないポリヌクレオチドを指す。2種以上のポリヌクレオチド配列又は2種以上のアミノ酸配列に関して、用語「異種」は、2種以上のポリヌクレオチド配列又は2種以上のアミノ酸配列が互いに特定の組み合わせにおいて天然に存在しないことを特徴付けるために使用される。
バリアントポリヌクレオチド及びバリアントポリペプチド配列は、親配列と比較したときのそれらの配列同一性によって定義され得る。配列同一性は、通常、「%配列同一性」又は「%同一性」として提供される。配列同一性の計算のために、第1の工程において、配列アラインメントが生成される。本発明によれば、ペアワイズグローバルアラインメントが生成され、これは、2つの配列が、それらの完全長にわたってアラインメントされ、通常、アラインメントアルゴリズムと呼ばれる数理的手法を使用することによって生成されることを意味する。
本発明によれば、アラインメントは、Needleman及びWunschのアルゴリズムを使用することによって生成される(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)。好ましくは、プログラム「NEEDLE」(European Molecular Biologyオープンソフトウェアスウィート(EMBOSS))が本発明のために使用され、プログラムデフォルトパラメーター(ポリヌクレオチド:ギャップオープン=10.0、ギャップ伸長=0.5及びマトリックス=EDNAFULL;ポリペプチド:ギャップオープン=10.0、ギャップ伸長=0.5及びマトリックス=EBLOSUM62)を使用する。2つの配列をアラインメントした後、第2の工程において、同一性値は、生成されるアラインメントから決定される。この目的のために、%-同一性は、同一の残基の数を、その完全長にわたって本発明のそれぞれの配列を示すアラインメント領域の長さで割り、100を掛けることによって計算される:%-同一性=(同一の残基/その完全長にわたって本発明のそれぞれの配列を示すアラインメント領域の長さ)*100。
2つの核酸配列の同一性パーセントを計算するために、同じことが、いくつかの基準値とともに2つのアミノ酸配列の同一性パーセントの計算の場合のように適用される。タンパク質をコードする核酸配列のために、ペアワイズアラインメントが、イントロンを除く開始コドンから停止コドンまで本発明の配列のコード領域の完全長にわたってなされるものとする。本発明の配列が比較される他の配列中に存在するイントロンもペアワイズアラインメントのために除去され得る。次に、同一性パーセントは、%-同一性=(同一の残基/それらの完全長にわたってイントロンを除く開始コドンから停止コドンまでの本発明の配列を示すアラインメント領域の長さ)*100によって計算される。2つの配列をアラインメントした後、第2の工程において、同一性値は、生成されるアラインメントから決定される。
さらに、Needleman及びWunschアルゴリズムを実装する核酸配列のための好ましいアラインメントプログラム(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)は、プログラムデフォルトパラメーター(ギャップオープン=10.0、ギャップ伸長=0.5及びマトリックス=EDNAFULL)を伴う「NEEDLE」(European Molecular Biologyオープンソフトウェアスウィート(EMBOSS))である。
本発明の配列と同一の又は類似した領域を有し、%同一性を決定するために本発明の配列と比較されるものとする配列は、例えば、公的に利用可能なコンピューターの方法及び例えばNCBIで利用可能なBLAST、BLAST-2などのプログラムを使用して、当技術分野における技術内にある様々な方法によって容易に同定され得る。
様々なポリペプチドが、親配列と比較したときのそれらの配列類似性によって定義され得る。配列類似性は、通常、「%配列類似性」又は「%-類似性」として提供される。%配列類似性は、定義されたアミノ酸のセットが、例えば、それらの大きさ、疎水性、電荷又は他の特徴によって類似した特性を共有していることを考慮する。本明細書では、あるアミノ酸の類似したアミノ酸との交換は、「保存的変異」と呼ばれ得る。本発明による類似したアミノ酸は、以下のとおりに定義され、本発明による%-類似性の決定のためにも適用されるものとし、またデータベース探索及び配列アラインメントのために最も使用されるアミノ酸類似性マトリックスの1つである、例えばプログラム「NEEDLE」によって使用されるとおりのBLOSUM62マトリックスに従う:
アミノ酸Aは、アミノ酸Sと類似し、
アミノ酸Dは、アミノ酸E;Nと類似し、
アミノ酸Eは、アミノ酸D;K;Qと類似し、
アミノ酸Fは、アミノ酸W;Yと類似し、
アミノ酸Hは、アミノ酸N;Yと類似し、
アミノ酸Iは、アミノ酸L;M;Vと類似し、
アミノ酸Kは、アミノ酸E;Q;Rと類似し、
アミノ酸Lは、アミノ酸I;M;Vと類似し、
アミノ酸Mは、アミノ酸I;L;Vと類似し、
アミノ酸Nは、アミノ酸D;H;Sと類似し、
アミノ酸Qは、アミノ酸E;K;Rと類似し、
アミノ酸Rは、アミノ酸K;Qと類似し、
アミノ酸Sは、アミノ酸A;N;Tと類似し、
アミノ酸Tは、アミノ酸Sと類似し、
アミノ酸Vは、アミノ酸I;L;Mと類似し、
アミノ酸Wは、アミノ酸F;Yと類似し、
アミノ酸Yは、アミノ酸F;H;Wと類似する。
保存的アミノ酸置換は、酵素などの機能性タンパク質のポリペプチド配列の配列の完全長にわたって存在し得る。一実施形態では、そのような変異は、酵素の機能性ドメインに関係しない。一実施形態では、保存的変異は、酵素の触媒中心に関係しない。配列類似性の計算のために、第1の工程において、配列アラインメントは、上記のとおりに生成される。2つの配列をアラインメントした後、第2の工程において、類似性値は、生成されるアラインメントから決定される。この目的のために、%-類似性は、同一の残基に足した類似した残基の数を、その完全長にわたって本発明の配列を示すアラインメント領域の長さで割り、100を掛けることによって計算される:%-類似性=[(同一の残基+類似した残基)/その完全長にわたって本発明の配列を示すアラインメント領域の長さ]*100。
核酸に関して、類似した配列は、それぞれのストリンジェンシー条件を使用するハイブリダイゼーションによっても決定され得る。用語「高いストリンジェンシー条件」は、少なくとも100ヌクレオチド長のプローブについて、12~24時間の標準的なサザンブロッティング手順に従う、5×SSPE、0.3%SDS、200マイクログラム/ml剪断変性サケ精子DNA及び50%ホルムアミド中42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は、最終的に、2×SSC、0.2%SDSを使用して65℃でそれぞれ15分間3回洗浄される。用語「非常に高いストリンジェンシー条件」は、少なくとも100ヌクレオチド長のプローブについて、12~24時間の標準的なサザンブロッティング手順に従う、5×SSPE、0.3%SDS、200マイクログラム/ml剪断変性サケ精子DNA及び50%ホルムアミド中42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は、最終的に、2×SSC、0.2%SDSを使用して70℃でそれぞれ15分間3回洗浄される。
アミラーゼの「A及びBドメイン」という用語は、本明細書で使用する場合、これらの2つのドメインが1つの単位としてとらえられたものを意味する一方、Cドメインは、アルファ-アミラーゼの別の単位である。したがって、「A及びBドメイン」のアミノ酸配列は、「A及びBドメイン」及び他の追加のドメイン(Cドメインなど)を含むアルファ-アミラーゼの配列の1つの連続した配列又は一部として理解される。
「断片」又は「部分配列」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の一部である。用語「機能性断片」は、それぞれ完全長アミノ酸配列のほんの一部を含むが、依然として同じ若しくは類似した活性及び/又は機能を有する任意の核酸又はアミノ酸配列を指す。好ましくは、機能性断片は、元の完全長アミノ酸配列と少なくとも75%同一、少なくとも76%同一、少なくとも77%同一、少なくとも78%同一、少なくとも79%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%又は少なくとも99.5%同一である。機能性断片は、それぞれ元の核酸又は元のアミノ酸配列と比較して連続した核酸又はアミノ酸を含む。
「遺伝子コンストラクト」又は「発現カセット」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されるとおりの1つ以上の制御配列(少なくとも1つのプロモーター)に作動可能に連結された、発現されることになる目的の少なくとも1つの配列で構成される核酸分子である。
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、別の細胞への移行のため又は所与の細胞内での安定な若しくは一過的な発現のための外来ポリヌクレオチド配列を運ぶのに好適な任意の種類のコンストラクトを含む。用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、プラスミド、ファージミド、ウイルス性ベクター(例えば、ファージ)、バクテリオファージ、バキュロウイルス、コスミド、フォスミド、人工染色体又は目的の特定の宿主に特異的な任意の他のベクターなどであるが、これらに限定されない任意の種類のクローニング媒体を包含する。外来ポリヌクレオチド配列は、通常、「目的の遺伝子」として本明細書で参照され得るコード配列を含む。目的の遺伝子は、宿主細胞の起源又は送り先の種類に応じて、イントロン及びエクソンを含み得る。
用語「導入」又は「形質転換」は、本明細書で参照される場合、移行のために使用される方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への移行を包含する。すなわち、用語「形質転換」は、本明細書で使用する場合、ベクター、シャトルシステム又は宿主細胞に依存せず、それは、当技術分野で知られるとおりの形質転換のポリヌクレオチド移行方法に関するだけでなく(例えば、Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYを参照されたい)、それは形質導入又は形質移入などであるが、これらに限定されない任意のさらなる種類のポリヌクレオチド移行方法を包含する。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、「発現され」得る。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特定の遺伝子又は特定の遺伝子(複数)又は特定の核酸コンストラクトの転写を意味する。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、遺伝子又は遺伝子(複数)又は遺伝子コンストラクトの構造RNA(例えば、rRNA、tRNA)又はmRNAへの転写を意味し、後者のその後のタンパク質への翻訳の有無は問わない。このプロセスは、DNAの転写及び得られるmRNA産物のプロセシングを含む。
組み換え細胞は、それぞれの野生型細胞と比較した場合、発現の「増加」又は「減少」を示す場合がある。用語「発現の増加」、「発現の増強」又は「過剰発現」は、本明細書で使用する場合、元の野生型発現レベルに対して追加的な発現のいずれかの形態を意味する(発現の欠如又は測定不能な発現でもあり得る)。本明細書での「発現の増加」、「発現の増強」又は「過剰発現」に対する参照は、対照生物に対する、遺伝子発現における増加並びに/又はポリペプチドを参照する限り、ポリペプチドレベルの増大及び/若しくはポリペプチド活性の増大を意味するように解釈される。発現における増加は、対照生物のものと比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%若しくは100%又はそれを超える優先順位での増加であり得る。
用語「精製」又は「精製すること」は、少なくとも1種の構成成分、例えば目的のタンパク質が、少なくとももう1つの構成成分、例えば発酵ブロスの粒子状物質から分離され、異なる区画又は相に移されるプロセスを指し、異なる区画又は相が物理的障壁によって分離されることは、必ずしも必要ではない。そのような異なる区画の例は、濾過膜又は布によって分離される2つの区画、すなわち濾液及び保持液であり;そのような異なる相の例は、それぞれペレット及び上清又はケーク及び濾液である。発酵ブロスから目的のタンパク質を精製した後に得られる溶液は、本明細書では「精製された酵素溶液」と呼ばれる。
「タンパク質配合物」は、少数の成分を含む任意の複雑ではない配合物を意味し、成分は、タンパク質配合物に含まれるタンパク質を安定化する目的及び/又はタンパク質配合物自体の安定化を果たす。
「酵素特性」としては、触媒活性、基質/補因子特異性、生成物特異性、経時的な安定性、熱安定性、pH安定性及び化学的安定性が挙げられるが、これらに限定されない。「酵素活性」又は「触媒活性」は、酵素によって発揮される触媒効果を意味し、酵素の1ミリグラム当たりのユニット(比活性)又は酵素の1分子当たりの1分当たりで転換される基質の分子(分子活性)として表される。酵素活性は、酵素の実際の機能によって指定され得、例えばペプチド結合の加水切断を触媒することによってタンパク質分解活性を発揮するプロテアーゼ、エステル結合の加水切断によって脂肪分解活性を発揮するリパーゼ、多糖におけるグリコシド結合の加水分解に関与するアミラーゼ活性などである。
本発明による「酵素安定性」という用語は、保管又は操作中の時間に応じた酵素活性の保持に関する。保管中の時間に応じた酵素活性の保持は、「保管安定性」と呼ばれ、本発明に関連して好ましい。
経時的な特定の条件下で保管されるか又は使用される酵素の触媒活性における変化を決定し、定量化するために、「初期の酵素活性」は、ゼロ時(100%)及び後の特定の時点(x%)で既定の条件下において測定される。測定された値の比較により、酵素活性の潜在的な減少がその程度において決定され得る。酵素活性の減少の程度は、酵素の安定性又は不安定性を決定する。「酵素活性の半減期」は、その初期値の2分の1(50%)まで低下する酵素活性の減衰に必要となる時間の尺度である。「酵素活性の半減期」は、調査中の課題因子、例えば酵素熱安定性に関して表され得、T50は、50%の残存酵素活性が、熱処理を受けていない参照試料と比較した場合、特定の時間の熱不活性化後に依然として存在する温度を示し得る。
「pH安定性」又は「pH依存活性」は、特定のpH値への暴露後に酵素活性を発揮する酵素の能力を指す。
用語「熱的安定性」、「熱安定性」又は「熱依存活性」は、好ましくは洗剤組成物中(好ましくはES1-C洗剤中)において高温、好ましくは40℃の温度で14日間又は92℃で少なくとも10分間暴露した後に触媒活性又は洗浄性能を発揮する酵素の能力を指す。
用語「洗剤安定性」又は「洗剤組成物中における保管下での安定性」は、洗剤組成物、好ましくは洗剤組成物中(好ましくはES1-C洗剤中)において40℃又は50℃の温度で14日間の保管後に触媒活性又は洗浄性能を発揮する酵素の能力を指す。
「改善度」(IF)は、特定の特性におけるそれぞれの親酵素に対する酵素バリアントの改善の程度である。それぞれの親酵素に対する酵素バリアントの改善は、>1.0の改善度(IF)によって特徴付けられる。代わりに、改善度は、パーセンテージにおいて表され得、例えば、1.1のIFは、110%に等しい。
本明細書で使用する場合、酵素の「洗浄性能」(本明細書では「クリーニング性能」とも呼ばれる)は、洗剤組成物のクリーニング性能に対する酵素の寄与、すなわち酵素の性能によって洗剤組成物に追加されたクリーニング性能を指す。用語「洗浄性能」は、本明細書では洗濯及び硬質表面クリーニングのために同様に使用される。洗浄性能は、適切な洗浄条件下で比較される。用語「適切な洗浄条件」は、条件、特に洗剤市場区分において家庭で実際に使用される洗浄温度、時間、洗浄力学、泡濃度、洗剤の種類及び水の硬度を示すために本明細書で使用される。用語「改善された洗浄性能」は、よりよい最終結果が適切な洗浄条件下でしみ除去において得られるか、又は重量に対してより少ない酵素が、対応する対照条件に対して同じ最終結果を得るのに必要とされることを示すために使用される。
本明細書で使用する場合、用語「特異的性能」は、活性酵素の1ユニット当たりの特定のしみ又は汚れのクリーニング及び除去を指す。いくつかの実施形態では、特異的性能は、卵、卵黄、牛乳、草、ミンチ肉の血液、チョコレートソース、離乳食、皮脂などのしみ又は帆を使用して決定される。
「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」又は「クリーニング配合物」又は「洗剤溶液」は、汚れた材料をクリーニングするために設計された組成物を意味する。本発明による洗剤組成物及び/又は洗剤溶液は、洗濯及び硬質表面クリーニングなどの様々な適用のための洗剤組成物及び/又は洗剤溶液を含む。用語「洗剤構成成分」は、洗剤組成物及び/又は洗剤溶液において使用され得る化学物質の種類を意味するように本明細書で定義される。
本発明の洗剤配合物は、1種以上の界面活性剤を含み得る。「界面活性剤」(本明細書で「界面活性薬剤」と同義的に使用される)は、液体に加えられるとき、その液体の界面での特性を変える有機化学物質を意味する。そのイオン電荷に応じて、界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性又は両性と呼ばれる。
用語「有効量の洗剤構成成分」は、効果的なしみ除去及び効果的なクリーニング条件(例えばpH、泡の量)をもたらす特定の構成成分の量、光学的な利益(例えば、蛍光増白、移染防止)を効果的にもたらす特定の構成成分の量及び処理を効果的に促進する(処理、保管及び使用中に物理的特徴を維持する;例えば、レオロジー改質剤、ヒドロトロープ、乾燥剤)特定の構成成分の量を含む。
用語「洗濯」又は「洗濯すること」は、家庭での洗濯及び工業的洗濯の両方に関し、本発明の洗剤組成物を含有する溶液により織物及び/又は布地を処理するプロセスを意味する。洗濯プロセスは、家庭用洗濯機又は工業用洗濯機などの技術的デバイスを使用することによって実行され得る。代わりに、洗濯プロセスは、手動でなされ得る。
用語「織物」は、紡績糸(編むこと又は織ることのために使用される天然又は合成繊維で作られる糸)、紡績糸の中間製品、繊維、不織材料、天然材料、合成材料並びに衣服、布及び他の物品などのこれらの材料で作られる布地を含む任意の織物材料を意味する。用語「布地」(繊維を織ること、編むこと又はフェルト化することによって作製される織物)又は「衣服」(織物で作られる衣類の任意の物品)は、本明細書で使用する場合、より広い用語である織物も含むものとする。
用語「硬質表面クリーニング」は、硬質表面のクリーニングとして本明細書で定義され、硬質表面は、床、家具、壁、衛生的なセラミックス、ガラス、食卓用金物又は食器を含む金属表面などの家庭における任意の硬質表面を含み得る。硬質表面クリーニングの特定の形態は、食器洗浄、特に自動食器洗浄(ADW)である。
用語「食器洗浄」は、例えば、手動又は自動食器洗浄によって食器を洗浄する全ての形態を指す。食器類を洗浄することは、プレート、カップ、ガラス、ボウルなどの陶器の全ての形態、スプーン、ナイフ、フォーク及び配膳用具などの食卓用金物類の全ての形態並びにセラミックス、メラミンなどのプラスチック、金属、陶磁器類、ガラス及びアクリル樹脂のクリーニングを含むが、これらに限定されない。
クリーニング性能は、適切なクリーニング条件下で評価される。本明細書の用語「適切なクリーニング条件」は、洗濯機、自動食器洗浄機又は手動でのクリーニングプロセスにおいて実際に使用される条件、特にクリーニング温度、時間、クリーニング装置、泡濃度、洗剤の種類及び水の硬度を指す。
本発明の技術分野において、通常、用語「しみ」は、洗濯、例えば織物、布地又は繊維のためのクリーニングに関して使用される一方、用語「汚れ」は、通常、硬質表面クリーニング、例えば食器及び食卓用金物のクリーニングに関して使用される。しかしながら、本明細書では、用語「しみ」及び「汚れ」は、互換的に使用されるものとする。
「金属イオン捕捉ビルダー」は、本明細書で使用する場合、ビルダーが、最初に中性pHにおいて7°dH硬度(ドイツ硬度)で水溶液中のカルシウムイオンの全てと化合するのに十分な量で使用されるとき、それほど多くない量の沈殿が形成される点で沈殿ビルダーと異なる。「強力なビルダー」は、4を超える、特に5を超えるか、6を超えるか又は7を超えるカチオン/キレート剤錯体の対数の安定度定数(Log KCa)を有して強力にCa2+などの二価カチオンに結合できる高効率のキレート剤として分類される。安定度定数は、0.1Mのイオン強度及び25℃の温度で決定される。「強力な金属イオン捕捉ビルダー」は、上記の特性の両方を兼ね備える。
詳細な説明
本発明において、新規のアミラーゼ酵素が提供される。より具体的には、親アルファ-アミラーゼのバリアント、バリアントアルファ-アミラーゼを作製する方法、アルファ-アミラーゼバリアントを含む組成物及びバリアントアルファ-アミラーゼ又はバリアントアルファ-アミラーゼを含む組成物を使用する方法が提供される。
アルファ-アミラーゼバリアント
本発明は、親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、好ましくは置換を含み、
(ii)前記バリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも60%であるが、100%未満の配列同一性を有し、及び
(iii)前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、天然に存在しないアミラーゼである。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、単離された、合成的な及び/又は組み換えアルファ-アミラーゼバリアントである。
本発明によるアミラーゼは、「アミロース分解活性」又は「アミラーゼ活性」を有する。「アミロース分解活性」又は「アミラーゼ活性」は、多糖におけるグルコシド結合の加水分解のための能力を説明する。アルファ-アミラーゼ活性は、当業者に知られるアルファ-アミラーゼ活性の測定のためのアッセイによって決定され得る。アルファ-アミラーゼ活性を測定するアッセイに関する例は、Phadebasアッセイ又はEPSアッセイ(「Infinity試薬」)である。Phadebasアッセイにおいて、アルファ-アミラーゼ活性は、基質としてPhadebas錠剤を利用することによって決定される(Phadebasアミラーゼ試験、Magle Life Scienceによって提供される)。デンプンは、アルファ-アミラーゼによって加水分解されて、可溶性の青色断片をもたらす。620nmで分光光度的に測定される結果として生じる青色溶液の吸光度は、アルファ-アミラーの関数である。測定される吸光度は、条件の所与の設定下で対象のアルファ-アミラーゼの比活性(活性/純粋なアルファ-アミラーゼタンパク質のmg)に正比例する。
代わりに、アルファ-アミラーゼ活性は、エチリデン-4-ニトロフェニル-アルファ-D-マルトヘプタシド(EPS)を利用する方法によっても決定され得る。D-マルトヘプタシドは、エンド-アミラーゼによって切断され得るブロックオリゴ糖である。切断後、キットに含まれるアルファ-グルコシダーゼが基質を消化して、黄色を有する遊離PNP分子を遊離し、それにより405nmでの可視分光光度法によって測定され得る。EPS基質及びアルファ-グルコシダーゼを含有するキットは、例えば、Roche Costum Biotech(cat.No.10880078103)によって製造される。時間依存的な吸収曲線の勾配は、条件の所与の設定下で対象のアルファ-アミラーゼの比活性(酵素1mg当たりの活性)に正比例する。
一実施形態では、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、親アミラーゼのアミロース分解活性の少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも110%、少なくとも120%、少なくとも130%、少なくとも140%、少なくとも150%、少なくとも160%、少なくとも170%、少なくとも180%、少なくとも190%又は少なくとも200%を示す。一実施形態では、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、親アミラーゼと比較して同じアミロース分解活性又は増大したアミロース分解活性を示す。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、親アミラーゼと比較して増大したアミロース分解活性を示す。
好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3によるアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである。
本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、最も好ましくは置換を含む。
好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1、3、4によるか若しくは配列番号15~41のいずれかにおける、好ましくは配列番号1におけるアミラーゼ又は配列番号1、3、4と若しくは配列番号15~41のいずれかにおいて、好ましくは配列番号1において少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼである。より好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3によるアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである。
好ましい実施形態では、アミノ酸置換の結果として生じるアミノ酸残基は、対応する位置で配列番号3又は5におけるアミノ酸残基と同一ではない。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、7、25、37、70、100、118、135、160、176、193、210、251、281、258、323、361、363、368、405、434、441、459、460、451及び482からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸位置で親アルファ-アミラーゼと比較して、アミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせを含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。さらに特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う25、100、135、176、193及び460からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸位置で親アルファ-アミラーゼと比較して、アミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせを含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
好ましくは、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、100、135、135、135、135、160、176、193、251、258、276、299、323、363、363、382、405、460及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、最も好ましくは置換を含む。
好ましくは、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含む。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、7、25、37、70、100、118、135、160、176、193、210、251、281、258、323、361、363、368、405、434、441、459、460、451及び482からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸位置で親アルファ-アミラーゼと比較して、アミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。さらに特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う25、100、135、176、193及び460からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸位置で親アルファ-アミラーゼと比較して、アミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
好ましくは、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、100、135、135、135、135、160、176、193、251、258、276、299、323、363、363、382、405、460及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含む。
好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、429及び459からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、116、176、225、251、320、400、405、408、410、418、429、446、449、458、459、460、471及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、176、251、405及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、6、10、12、13、14、15、17、20、21、22、23、24、27、28、32、34、36、38、39、42、45、47、51、70、75、76、83、89、92、95、96、99、100、108、115、154、156、164、191、192、213、215、221、222、223、226、233、234、236、237、240、245、249、268、271、277、282、285、288、289、290、297、301、308、309、312、326、327、333、336、338、341、343、348、351、352、353、355、356、358、366、367、370、376、379、381、389、392、399、413、424、426、429、432、436、440、442、443、448、451、453、456、459、463、468及び480からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、429及び459からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、10、12、13、14、15、17、20、21、23、24、27、34、36、38、39、42、45、47、51、89、92、99、100、108、115、164、191、192、213、221、222、223、233、234、236、237、240、245、249、268、271、282、288、289、290、297、301、308、309、312、326、327、333、336、338、341、343、348、351、352、353、355、356、358、366、367、370、376、379、381、389、392、413、424、426、429、432、440、442、443、448、451、453、456、468及び480からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4及び429からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う25及び176からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う25、176及び186からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、176、186、251、405、439及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、176、251、405、439及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、176、186、251、405及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、176、251、405及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う位置4及び25又は25及び176又は176及び186又は186及び251又は251及び405又は405及び482、好ましくは位置4及び25及び176、又は25及び176及び186、又は176及び186及び251、又は186及び251及び405、又は251及び405及び482でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う116、181、225及び320からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う位置116及び181又は181及び225又は225及び320、好ましくは位置116及び181及び225又は181及び225及び320でのアミノ酸置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
代替的な実施形態では、本発明は、親配列と比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX9D、X9F、X9K、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T、X9Y、X179G、X181D、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186R、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206M、X206Y、X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N、X244V、X402T、X419C、X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L、X420Q、X422C、X422N、X422H、X423F、X423M、X423Q、X423S、X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W、X428Y、X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T、X430V、X435K、X435P、X435S、X435A、X435D、X437L、X437T、X437W、X441C、X441K、X441L、X441M、X441S、X444H、X444M、X444N、X444R、X444T、X450C、X450D、X450E、X450H、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R、X450T、X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N、X452T、X454A、X454E、X454K、X454L、X454P、X454S、X454T、X466E、X466W、X469F、X469L、X469Y、X475A、X475K、X475E、X475L、X479I、X479K、X479M、X483F、X483L、X483Q及びX483Rからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含むアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3によるアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである。
好ましくは、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、下記のアミノ酸位置(配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う)の1つ以上でのアミノ酸置換を含む。好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3によるアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである。好ましくは、挙げられる位置(すなわちX)での親アルファ-アミラーゼのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
一実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置9(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X9D、X9F、X9K、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T又はX9Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置179(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X179Gを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置181(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X181D、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W又はX181Y、好ましくはX181Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置186(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X186A、X186C、X186D、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186R、X186V、X186W又はX186Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置190(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X190Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置195(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X195H、X195K、X195L、X195W又はX195Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置206(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X206C、X206H、X206M又はX206Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置244(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N又はX244Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置402(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X402Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置419(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X419Cを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置420(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L又はX420Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置422(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X422C、X422N又はX422Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置423(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X423F、X423M、X423Q又はX423Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置428(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W又はX428Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置430(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T又はX430Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置435(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X435K、X435P、X435S、X435A又はX435Dを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置437(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X437L、X437T又はX437Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置441(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X441C、X441K、X441L、X441M又はX441Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置444(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X444H、X444M、X444N、X444R又はX444Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置450(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X450C、X450D、X450E、X450H、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R又はX450Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置452(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N又はX452Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置454(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X454A、X454E、X454K、X454L、X454P、X454S又はX454Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置466(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X466E又はX466Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置469(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X469F、X469L又はX469Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置475(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X475A、X475K、X475E又はX475Lを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置479(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X479I、X479K又はX479Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置483(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X483F、X483L、X483Q又はX483Rを含む。
好ましくは、この代替的な実施形態では、上で挙げられる位置(すなわちX)での親アルファ-アミラーゼにおけるアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。好ましくは、本発明は、親配列と比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX181D、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186R、X186V、X186W、X186Y、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206M、X206Y、X441C、X441K、X441L、X441M及びX441Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含むアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3によるアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましくは、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う4、25、100、135、135、135、135、160、176、193、251、258、276、299、323、363、363、382、405、460及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含む。
好ましくは、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うH1、H2、N3、G4、T5、N6、G7、T8、M10、Y12、F13、E14、W15、Y16、L17、P18、N19、D20、G21、N22、H23、W24、N25、R26、L27、R28、S29、D30、A31、S32、N33、L34、K35、D36、K37、G38、I39、T40、A41、V42、P45、A47、W48、A51、G59、A60、L63、N70、Q71、K72、G73、V75、R76、T81、R82、N83、Q86、V89、T90、A91、L92、K93、S94、N95、G96、I97、Q98、V99、Y100、V103、N106、K108、G109、A113、T114、E115、W116、V117、A119、S125、N126、N128、Q129、V131、S132、G133、D134、Y135、T136、A139、T141、K142、F143、D144、F145、P146、G147、G149、N150、T151、N154、F155、K156、Y160、H161、F162、G164、V165、Q169、S170、Q172、L173、Q174、N175、R176、G184、D188、V191、Y203、H210、P211、E212、V213、V214、N215、E216、R218、N219、G221、V222、W223、Y224、T225、N226、T227、L230、D231、F233、R234、I235、D236、A237、V238、H240、K242、Y243、F245、W249、L250、T251、H252、V253、N255、T256、T257、K259、M261、F262、A263、V264、A265、W268、N270、I272、G273、A274、E276、L279、S280、W284、N285、H286、S287、V288、F289、D290、V291、P292、L293、H294、Y295、N296、L297、N299、S301、R302、S303、G304、N306、Y307、D308、M309、R310、Q311、I312、F313、N314、G315、V318、Q319、R320、H321、T323、H324、V326、T327、D333、P336、E337、E338、E341、S342、F343、V344、E345、E346、F348、P350、L351、A352、Y353、A354、L355、L357、T358、R359、D360、G362、Y363、P364、V366、F367、Y368、D370、Y372、P375、T376、G378、V379、A381、M382、K383、S384、K385、D387、P388、I389、L390、E391、A392、R393、Q394、K395、Y396、A397、Y398、G399、T400、Q401、D403、L405、D406、H407、P408、V410、W413、T414、R415、E416、D418、H421、S424、L426、A427、L429、S431、G436、K438、W439、M440、V442、G443、N445、N446、A447、G448、E449、W451、D453、T455、G456、N457、Q458、T459、N460、T461、V462、T463、N465、D467、G468、G470、V474、S478、S480、Y482、A119、D163、D271、F180、G182、G258、I177、I275、K185、K269、K281、N224、N260、N277、P322、P434、R118、S365、T193、T282、T356、V120、V317、W187、W189、Y178及びY298からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含む。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4、N25、K37、N70、Y100、R118、Y135、Y160、R176、T193、H210、T251、K281、G258、T323、Q361、Y363、Y368、L405、P434、E441、T459、N460、T451及びY482からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸位置で親アルファ-アミラーゼと比較して、アミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うN25、Y100、Y135、R176、T193及びN460からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸位置で親アルファ-アミラーゼと比較して、アミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
特に好ましくは、本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4、N25、Y100、Y135、Y160、R176、T193、T251、G258、E276、N299、T323、Y363、Y363、M382、L405、N460及びY482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX100D、X100F、X100K、X100L、X103A、X106D、X108A、X109A、X10A、X10C、X10E、X10F、X10L、X10W、X10Y、X113F、X113H、X113M、X113R、X113V、X113W、X113Y、X114A、X114C、X114D、X114E、X114F、X114G、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114N、X114Q、X114R、X114S、X114V、X114W、X114Y、X115C、X115D、X115K、X115M、X115N、X115Q、X115R、X115S、X115T、X115V、X116I、X116K、X116L、X116M、X116R、X116T、X117A、X117C、X117D、X117F、X117I、X117N、X117P、X117R、X117W、X117Y、X118A、X118D、X118E、X119H、X119P、X119R、X119S、X119Y、X120E、X120G、X120M、X120S、X120W、X120Y、X123D、X123S、X125A、X125D、X125E、X125F、X125G、X125H、X125K、X125L、X125M、X125N、X125Q、X125R、X125T、X125V、X125W、X125Y、X126D、X128C、X128E、X128L、X128M、X128W、X128Y、X129E、X12N、X12S、X131C、X131I、X131L、X131Q、X131W、X132T、X133A、X133C、X133D、X133E、X133H、X133K、X133N、X133P、X133Q、X133S、X134C、X134E、X134F、X134I、X134L、X134M、X134P、X134T、X134V、X134W、X134Y、X135D、X135E、X135G、X135M、X135N、X135P、X135S、X135T、X135W、X136A、X136C、X136D、X136E、X136F、X136H、X136L、X136M、X136N、X136P、X136W、X139C、X139S、X13A、X13Y、X141V、X142C、X142E、X142F、X142L、X142M、X142Q、X142R、X142W、X142Y、X143F、X144C、X144E、X144G、X144K、X144N、X144Q、X144R、X144S、X144T、X144V、X144Y、X145A、X146C、X146D、X146E、X146F、X146G、X146H、X146K、X146L、X146S、X146T、X146W、X147M、X149E、X14N、X150C、X150E、X150Q、X151C、X151E、X154A、X154Y、X155Y、X156E、X156V、X158H、X158N、X158Y、X15R、X160D、X160E、X160W、X161T、X162V、X163A、X163Q、X163T、X164V、X165S、X165T、X165W、X169A、X169D、X169E、X169S、X169V、X16F、X16R、X170C、X170F、X172A、X172C、X172D、X172K、X172N、X173I、X173Y、X174D、X174E、X174G、X174H、X174M、X174N、X174P、X174S、X174T、X175A、X175G、X175H、X175Q、X176K、X176S、X176T、X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S、X177W、X178F、X17K、X17V、X180M、X180N、X180T、X180W、X182D、X182E、X182N、X182Q、X182S、X185E、X185M、X185N、X187A、X187D、X187M、X187V、X188H、X188T、X188V、X189I、X18F、X18I、X18K、X18M、X18R、X18T、X191F、X191H、X191K、X191M、X191W、X191Y、X192A、X192T、X193D、X193E、X193G、X193V、X19A、X19C、X19D、X19F、X19G、X19H、X19I、X19K、X19L、X19M、X19P、X19Q、X19S、X19T、X19Y、
X1R、X1V、X203E、X203R、X208F、X208I、X208Y、X20A、X20C、X20D、X20E、X20F、X20G、X20H、X20K、X20L、X20M、X20N、X20P、X20Q、X20S、X20T、X20V、X20W、X20Y、X210A、X210C、X210D、X210E、X210F、X210M、X210N、X210Q、X210S、X210Y、X211A、X211C、X211D、X211E、X211G、X211H、X211L、X211N、X211Q、X211S、X211T、X211V、X212C、X212D、X212I、X212L、X212W、X213A、X213C、X213M、X213R、X213S、X214E、X214P、X215A、X215D、X215E、X215H、X215W、X216G、X216H、X218A、X218C、X218D、X218E、X218F、X218G、X218H、X218I、X218K、X218L、X218N、X218Q、X218S、X218T、X218V、X218W、X218Y、X219A、X219C、X219D、X219E、X219F、X219G、X219H、X219K、X219M、X219Q、X219R、X219S、X219T、X219W、X219Y、X21E、X21S、X221F、X221N、X222D、X222K、X222S、X222T、X223C、X223L、X223V、X223Y、X224F、X224V、X225A、X225C、X225E、X225F、X225H、X225I、X225N、X225R、X225S、X225Y、X226A、X226C、X226D、X226E、X226G、X226H、X226I、X226L、X226M、X226Q、X226R、X226S、X226T、X226V、X226W、X226Y、X227C、X227F、X227G、X227H、X227I、X227K、X227L、X227M、X227R、X227T、X227V、X227W、X227Y、X22A、X22D、X22E、X22F、X22G、X22K、X22L、X22M、X22Q、X22R、X22T、X22W、X22Y、X230A、X230F、X231C、X231D、X231N、X233C、X233H、X233I、X233M、X233T、X233W、X233Y、X234C、X235L、X235M、X235V、X236Y、X237C、X237I、X238A、X238F、X238T、X23N、X23Q、X23W、X240M、X242M、X242N、X243D、X243F、X245E、X245H、X245M、X249D、X249I、X24G、X250V、X251A、X251E、X251F、X251L、X251M、X251S、X251T、X252C、X252I、X252S、X253C、X253G、X253Y、X255D、X255F、X255I、X255T、X255V、X256C、X257L、X257V、X257Y、X258F、X258Q、X258R、X259L、X25A、X25C、X25D、X25F、X25G、X25H、X25K、X25L、X25M、X25Q、X25S、X25W、X25Y、X260H、X261R、X262C、X262D、X262E、X262H、X262P、X262Y、X263I、X264H、X264T、X264W、X265S、X268F、X268G、X269M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26L、X26M、X26P、X26S、X26V、X26Y、X270A、X270Q、X270Y、X271S、X272F、X272G、X272L、X272S、X273A、X273C、X273D、X273E、X273F、X273H、X273I、X273L、X273M、X273P、X273Q、X273R、X273V、X273W、X273Y、X274F、X274S、X275V、X276D、X276K、X276L、X276N、X276R、X276Y、X277D、X277E、X277T、X279A、X279P、X27A、X27D、X27F、X27G、X27H、X27I、X27Q、X27R、X27T、X27V、X280D、X280F、X280G、X280H、X280I、X280K、X280N、X280R、X280V、X280Y、X281A、X281D、X281E、X281H、X284A、X284F、X284H、X284L、X284M、X284N、X284Y、X285G、X285L、X285N、X285P、X286Q、X287A、X287D、X287E、X287H、X287T、X288A、X288K、X288P、X288Y、X289F、X289G、X289R、X289T、
X28C、X28D、X28E、X28F、X28G、X28I、X28K、X28N、X28Q、X28S、X28T、X28V、X290D、X290M、X290N、X290Q、X290W、X291D、X291K、X291T、X291Y、X292C、X292D、X292F、X292I、X292L、X292T、X292W、X292Y、X293D、X293E、X293F、X293K、X293R、X294G、X294T、X295F、X296A、X296C、X296L、X296Y、X297E、X297F、X297H、X297K、X297M、X297S、X297V、X299G、X299I、X299K、X299L、X299S、X299Y、X29D、X29E、X29F、X29G、X29H、X29I、X29K、X29L、X29N、X29P、X29Q、X29V、X29W、X29Y、X2I、X2S、X301F、X302H、X302I、X302Q、X302V、X302Y、X303E、X303H、X303I、X303K、X303L、X303M、X303N、X303P、X303R、X303T、X304A、X304D、X304E、X304H、X304K、X304M、X304N、X304P、X304R、X304T、X304W、X304Y、X306A、X306D、X306E、X306G、X306H、X306I、X306M、X306Q、X306R、X306S、X306T、X306V、X306W、X306Y、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X30A、X30E、X30F、X30G、X30H、X30I、X30K、X30L、X30M、X30Q、X30T、X30W、X30Y、X310A、X310Q、X311A、X311E、X311G、X311H、X311K、X311N、X311R、X311T、X311Y、X312L、X312M、X313V、X314C、X314E、X314K、X314Q、X315A、X315C、X315E、X315H、X315K、X315T、X318I、X318S、X318T、X319A、X319D、X319H、X319I、X319K、X319M、X319N、X319P、X319S、X319T、X319W、X31N、X31Q、X31S、X31T、X31V、X31W、X320A、X320C、X320D、X320E、X320G、X320H、X320K、X320L、X320N、X320Q、X320S、X320Y、X321A、X321E、X321K、X321N、X321T、X321V、X321W、X323A、X323G、X323K、X323L、X323V、X324K、X324L、X324M、X324W、X324Y、X326G、X326N、X326S、X326Y、X327C、X327L、X327M、X32A、X32D、X32E、X32F、X32H、X32I、X32L、X32M、X32N、X32P、X32Q、X32T、X32W、X333I、X334T、X336K、X337A、X337C、X337F、X337G、X337I、X337K、X337L、X337M、X337N、X337Q、X337R、X337S、X337T、X337V、X337Y、X338G、X338S、X338T、X33D、X33E、X33H、X33K、X33M、X33Q、X33R、X33Y、X341V、X342P、X343L、X343T、X343W、X343Y、X344I、X344Q、X344V、X345D、X345G、X345M、X345N、X345Q、X345S、X345T、X346A、X346C、X346D、X346G、X346H、X346N、X346Q、X348T、X34H、X34I、X34V、X350H、X350K、X350P、X351A、X351M、X352S、X353H、X354I、X354N、X354T、X354Y、X355I、X355M、X356I、X356V、X357A、X358I、X358L、X358N、X358P、X358V、X359E、X35A、X35C、X35D、X35G、X35H、X35I、X35L、X35M、X35N、X35P、X35Q、X35R、X35S、X35T、X35V、X35Y、X360A、X360F、X360G、X360I、X360L、X360N、X360Q、X360R、X360S、X360T、X360V、X360Y、X362F、X362K、X362M、X362N、X362T、X362V、X362Y、X363A、X363C、X363D、X363E、X363G、X363H、X363K、X363L、X363M、X363P、X363Q、X363R、X363S、X363T、X363V、X363W、X363Y、X364A、X364C、X364G、X364K、X364L、X364N、X364S、X364T、X364V、X366I、X366L、X366T、X367E、X367S、X368A、X368F、X368L、X368N、
X36A、X36E、X36G、X36I、X36K、X36M、X36N、X36P、X36Q、X36R、X36S、X36T、X36V、X370E、X370I、X372A、X372C、X372E、X372F、X372H、X372M、X372N、X372Q、X375A、X375D、X375E、X375I、X375K、X375Q、X375R、X375T、X375W、X375Y、X376G、X376I、X376K、X376L、X376M、X376Q、X376R、X376S、X376V、X377Q、X378C、X378D、X378E、X378R、X379A、X379L、X379S、X37A、X37G、X37M、X37P、X37T、X37V、X37W、X381E、X381V、X382A、X382H、X382K、X382L、X382N、X382Q、X382S、X383C、X383D、X383E、X383H、X383I、X383M、X383N、X383Q、X383R、X383S、X383V、X383Y、X384A、X384C、X384D、X384E、X384F、X384I、X384L、X384M、X384N、X384Q、X384R、X384T、X384V、X384W、X384Y、X385A、X385C、X385D、X385E、X385F、X385G、X385H、X385I、X385L、X385M、X385N、X385P、X385Q、X385R、X385S、X385T、X385V、X385W、X385Y、X387C、X387E、X387N、X388E、X388F、X388H、X388I、X388M、X388R、X388V、X389G、X389H、X389K、X38N、X390D、X390F、X390M、X390N、X390P、X390R、X391A、X391F、X391G、X391K、X391M、X391N、X391Q、X391S、X391T、X391Y、X392C、X392V、X393E、X393H、X393P、X393S、X393V、X394A、X394C、X394E、X394H、X394I、X394L、X394M、X394N、X394R、X394S、X395A、X395H、X395M、X395V、X396H、X396P、X397D、X397H、X397P、X397S、X398M、X399P、X39E、X39K、X3A、X3F、X3G、X3I、X3K、X3L、X3Q、X3V、X400A、X400D、X400E、X400G、X400H、X400I、X400K、X400L、X400M、X400N、X400P、X400Q、X400R、X400S、X400V、X400W、X401I、X401K、X401M、X401T、X403N、X405C、X405H、X405M、X405T、X405V、X406P、X407D、X407R、X407S、X408E、X408I、X408Q、X40I、X40S、X410H、X410I、X410K、X410L、X410P、X410R、X410Y、X413S、X414C、X414E、X414S、X415E、X415I、X416S、X418C、X418N、X418P、X41C、X41D、X41E、X41G、X41Q、X41S、X41T、X421N、X421P、X424A、X426D、X426W、X427C、X427F、X427G、X427K、X427Q、X427R、X427S、X427T、X427V、X429A、X429D、X429E、X429F、X429G、X429I、X429M、X429N、X429P、X429Q、X429S、X429T、X429V、X429W、X42C、X42I、X42Q、X42V、X431I、X434S、X436E、X438F、X438P、X438Y、X439K、X439C、X439P、X440V、X442Q、X443H、X443T、X445A、X445C、X445D、X445F、X445G、X445H、X445K、X445M、X445Q、X445R、X445S、X445T、X445V、X446F、X446I、X446L、X446P、X446Q、X446R、X446V、X446W、X447V、X448D、X448E、X448H、X448N、X449A、X449F、X449G、X449K、X449L、X449M、X449N、X449P、X449Q、X449R、X449S、X449V、X449W、X449Y、X451L、X453G、X453I、X453N、X453P、X453Y、X455L、X456L、X456M、X456R、X456S、X456V、X456W、X456Y、X457A、X457C、X457E、X457F、X457G、X457K、X457L、X457M、X457R、X457S、X457T、X457V、X457W、X458I、X458K、X458V、X458W、X459C、X459D、X459E、X459I、X459K、X459N、X459Q、X459R、X459V、X459Y、
X45G、X45N、X460A、X460D、X460E、X460G、X460Q、X460R、X460S、X460T、X460V、X461A、X461E、X461F、X461K、X461L、X461M、X461N、X461Q、X461R、X461S、X461V、X462K、X463L、X465H、X465P、X465R、X465V、X467A、X467E、X467H、X468D、X468H、X470A、X470Q、X470T、X471E、X474F、X474H、X474P、X478A、X478E、X47S、X480D、X480E、X480M、X480R、X480Y、X482C、X482T、X482W、X48F、X48I、X48M、X48Y、X4A、X4C、X4K、X4M、X4Q、X4R、X4S、X51Q、X51T、X51V、X54D、X54G、X54Q、X59T、X5A、X5C、X5D、X5E、X5F、X5H、X5I、X5K、X5L、X5M、X5N、X5P、X5Q、X5R、X5V、X5Y、X60T、X63C、X63V、X6A、X6C、X6E、X6F、X6G、X6H、X6K、X6L、X6M、X6P、X6Q、X6S、X6T、X6V、X6W、X6Y、X70F、X70H、X70L、X70M、X70N、X70Y、X71D、X72C、X72D、X72E、X72N、X72T、X73L、X73N、X73Q、X75A、X75G、X75I、X75L、X75P、X75T、X75W、X76C、X76E、X76G、X76L、X76T、X76V、X7C、X7E、X7F、X7H、X7K、X7N、X7P、X7Q、X7R、X7S、X7V、X7W、X7Y、X81H、X81L、X82K、X82M、X83A、X83D、X83E、X83G、X83R、X83S、X86K、X87D、X87R、X89A、X89C、X89F、X89G、X89L、X89M、X89R、X89S、X8A、X8C、X8F、X8I、X8M、X8P、X8S、X8V、X8W、X8Y、X90A、X90D、X90E、X90F、X90G、X90I、X90M、X90N、X90Q、X90R、X90S、X90V、X90Y、X91C、X91D、X91E、X91F、X91G、X91H、X91I、X91K、X91L、X91M、X91N、X91Q、X91S、X91T、X91V、X91W、X91Y、X92D、X92M、X92V、X93K、X93Q、X94A、X94D、X94E、X94K、X94M、X94V、X94Y、X95E、X95I、X95L、X95V、X96K、X96N、X96Q、X97V、X98E、X98G、X98N、X99H、X99K、X99N、X100W及びX1Gからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
好ましくは、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、下記のアミノ酸位置(配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う)の1つ以上でのアミノ酸置換を含む。好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3によるアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである。好ましくは、挙げられる位置(すなわちX)での親アルファ-アミラーゼのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
一実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置100(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X100D、X100F、X100K、X100L又はX100Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置103(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X103Aを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置106(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X106Dを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置108(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X108Aを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置109(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X109Aを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置10(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X10A、X10C、X10E、X10F、X10L、X10W又はX10Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置113(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X113F、X113H、X113M、X113R、X113V、X113W又はX113Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置114(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X114A、X114C、X114D、X114E、X114F、X114G、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114N、X114Q、X114R、X114S、X114V、X114W又はX114Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置115(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X115C、X115D、X115K、X115M、X115N、X115Q、X115R、X115S、X115T又はX115Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置116(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X116I、X116K、X116L、X116M、X116R又はX116T、好ましくはX116Kを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置117(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X117A、X117C、X117D、X117F、X117I、X117N、X117P、X117R、X117W又はX117Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置118(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X118A、X118D又はX118Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置119(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X119H、X119P、X119R、X119S又はX119Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置120(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X120E、X120G、X120M、X120S、X120W又はX120Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置123(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X123D又はX123Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置125(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X125A、X125D、X125E、X125F、X125G、X125H、X125K、X125L、X125M、X125N、X125Q、X125R、X125T、X125V、X125W又はX125Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置126(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X126Dを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置128(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X128C、X128E、X128L、X128M、X128W又はX128Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置129(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X129Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置12(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X12N又はX12Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置131(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X131C、X131I、X131L、X131Q又はX131Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置132(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X132Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置133(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X133A、X133C、X133D、X133E、X133H、X133K、X133N、X133P、X133Q又はX133Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置134(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X134C、X134E、X134F、X134I、X134L、X134M、X134P、X134T、X134V、X134W又はX134Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置135(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X135D、X135E、X135G、X135M、X135N、X135P、X135S、X135T又はX135Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置136(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X136A、X136C、X136D、X136E、X136F、X136H、X136L、X136M、X136N、X136P又はX136Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置139(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X139C又はX139Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置13(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X13A又はX13Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置141(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X141Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置142(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X142C、X142E、X142F、X142L、X142M、X142Q、X142R、X142W又はX142Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置143(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X143Fを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置144(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X144C、X144E、X144G、X144K、X144N、X144Q、X144R、X144S、X144T、X144V又はX144Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置145(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X145Aを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置146(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X146C、X146D、X146E、X146F、X146G、X146H、X146K、X146L、X146S、X146T又はX146Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置147(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X147Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置149(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X149Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置14(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X14Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置150(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X150C、X150E又はX150Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置151(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X151C、X151E、X154A又はX154Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置155(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X155Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置156(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X156E又はX156Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置158(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X158H、X158N又はX158Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置15(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X15Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置160(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X160D、X160E又はX160Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置161(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X161Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置162(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X162Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置163(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X163A、X163Q又はX163Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置164(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X164Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置165(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X165S、X165T又はX165Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置169(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X169A、X169D、X169E、X169S又はX169Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置16(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X16F又はX16Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置170(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X170C又はX170Fを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置172(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X172A、X172C、X172D、X172K又はX172Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置173(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X173I又はX173Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置174(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X174D、X174E、X174G、X174H、X174M、X174N、X174P、X174S又はX174Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置175(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X175A、X175G、X175H又はX175Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置176(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X176K、X176S又はX176T、好ましくはX176Kを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置177(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S又はX177Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置178(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X178Fを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置17(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X17K又はX17Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置180(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X180M、X180N、X180T又はX180Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置182(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X182D、X182E、X182N、X182Q又はX182Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置185(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X185E、X185M又はX185Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置187(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X187A、X187D、X187M又はX187Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置188(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X188H、X188T又はX188Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置189(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X189Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置18(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X18F、X18I、X18K、X18M、X18R又はX18Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置191(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X191F、X191H、X191K、X191M、X191W又はX191Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置192(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X192A又はX192Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置193(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X193D、X193E、X193G又はX193Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置19(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X19A、X19C、X19D、X19F、X19G、X19H、X19I、X19K、X19L、X19M、X19P、X19Q、X19S、X19T又はX19Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置1(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X1R、X1V又はX1Gを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置203(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X203E又はX203Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置208(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X208F、X208I又はX208Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置20(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X20A、X20C、X20D、X20E、X20F、X20G、X20H、X20K、X20L、X20M、X20N、X20P、X20Q、X20S、X20T、X20V、X20W又はX20Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置210(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X210A、X210C、X210D、X210E、X210F、X210M、X210N、X210Q、X210S又はX210Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置211(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X211A、X211C、X211D、X211E、X211G、X211H、X211L、X211N、X211Q、X211S、X211T又はX211Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置212(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X212C、X212D、X212I、X212L又はX212Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置213(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X213A、X213C、X213M、X213R又はX213Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置214(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X214E又はX214Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置215(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X215A、X215D、X215E、X215H又はX215Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置216(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X216G又はX216Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置218(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X218A、X218C、X218D、X218E、X218F、X218G、X218H、X218I、X218K、X218L、X218N、X218Q、X218S、X218T、X218V、X218W又はX218Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置219(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X219A、X219C、X219D、X219E、X219F、X219G、X219H、X219K、X219M、X219Q、X219R、X219S、X219T、X219W又はX219Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置21(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X21E又はX21Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置221(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X221F又はX221Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置222(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X222D、X222K、X222S又はX222Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置223(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X223C、X223L、X223V又はX223Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置224(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X224F又はX224Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置225(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X225A、X225C、X225E、X225F、X225H、X225I、X225N、X225R、X225S又はX225Y、好ましくはX225Aを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置226(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X226A、X226C、X226D、X226E、X226G、X226H、X226I、X226L、X226M、X226Q、X226R、X226S、X226T、X226V、X226W又はX226Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置227(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X227C、X227F、X227G、X227H、X227I、X227K、X227L、X227M、X227R、X227T、X227V、X227W又はX227Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置22(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X22A、X22D、X22E、X22F、X22G、X22K、X22L、X22M、X22Q、X22R、X22T、X22W又はX22Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置230(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X230A又はX230Fを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置231(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X231C、X231D又はX231Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置233(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X233C、X233H、X233I、X233M、X233T、X233W又はX233Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置234(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X234Cを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置235(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X235L、X235M又はX235Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置236(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X236Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置237(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X237C又はX237Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置238(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X238A、X238F又はX238Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置23(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X23N、X23Q又はX23Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置240(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X240Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置242(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X242M又はX242Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置243(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X243D又はX243Fを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置245(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X245E、X245H又はX245Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置249(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X249D又はX249Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置24(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X24Gを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置250(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X250Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置251(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X251A、X251E、X251F、X251L、X251M、X251S又はX251T、好ましくはX251Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置252(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X252C、X252I又はX252Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置253(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X253C、X253G又はX253Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置255(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X255D、X255F、X255I、X255T又はX255Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置256(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X256Cを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置257(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X257L、X257V又はX257Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置258(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X258F、X258Q又はX258Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置259(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X259Lを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置25(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X25A、X25C、X25D、X25F、X25G、X25H、X25K、X25L、X25M、X25Q、X25S、X25W又はX25Y、好ましくはX25Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置260(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X260Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置261(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X261Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置262(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X262C、X262D、X262E、X262H、X262P又はX262Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置263(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X263Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置264(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X264H、X264T又はX264Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置265(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X265Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置268(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X268F又はX268Gを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置269(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X269Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置26(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X26A、X26D、X26E、X26F、X26L、X26M、X26P、X26S、X26V又はX26Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置270(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X270A、X270Q又はX270Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置271(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X271Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置272(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X272F、X272G、X272L又はX272Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置273(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X273A、X273C、X273D、X273E、X273F、X273H、X273I、X273L、X273M、X273P、X273Q、X273R、X273V、X273W又はX273Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置274(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X274F又はX274Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置275(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X275Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置276(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X276D、X276K、X276L、X276N、X276R又はX276Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置277(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X277D、X277E又はX277Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置279(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X279A又はX279Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置27(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X27A、X27D、X27F、X27G、X27H、X27I、X27Q、X27R、X27T又はX27Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置280(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X280D、X280F、X280G、X280H、X280I、X280K、X280N、X280R、X280V又はX280Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置281(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X281A、X281D、X281E又はX281Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置284(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X284A、X284F、X284H、X284L、X284M、X284N又はX284Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置285(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X285G、X285L、X285N又はX285Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置286(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X286Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置287(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X287A、X287D、X287E、X287H又はX287Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置288(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X288A、X288K、X288P又はX288Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置289(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X289F、X289G、X289R又はX289Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置28(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X28C、X28D、X28E、X28F、X28G、X28I、X28K、X28N、X28Q、X28S、X28T又はX28Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置290(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X290D、X290M、X290N、X290Q又はX290Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置291(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X291D、X291K、X291T又はX291Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置292(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X292C、X292D、X292F、X292I、X292L、X292T、X292W又はX292Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置293(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X293D、X293E、X293F、X293K又はX293Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置294(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X294G又はX294Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置295(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X295Fを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置296(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X296A、X296C、X296L又はX296Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置297(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X297E、X297F、X297H、X297K、X297M、X297S又はX297Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置299(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X299G、X299I、X299K、X299L、X299S又はX299Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置29(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X29D、X29E、X29F、X29G、X29H、X29I、X29K、X29L、X29N、X29P、X29Q、X29V、X29W又はX29Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置2(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X2I又はX2Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置301(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X301Fを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置302(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X302H、X302I、X302Q、X302V又はX302Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置303(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X303E、X303H、X303I、X303K、X303L、X303M、X303N、X303P、X303R又はX303Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置304(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X304A、X304D、X304E、X304H、X304K、X304M、X304N、X304P、X304R、X304T、X304W又はX304Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置306(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X306A、X306D、X306E、X306G、X306H、X306I、X306M、X306Q、X306R、X306S、X306T、X306V、X306W又はX306Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置307(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X307F又はX307Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置308(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X308Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置309(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X309H、X309L又はX309Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置30(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X30A、X30E、X30F、X30G、X30H、X30I、X30K、X30L、X30M、X30Q、X30T、X30W又はX30Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置310(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X310A又はX310Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置311(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X311A、X311E、X311G、X311H、X311K、X311N、X311R、X311T又はX311Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置312(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X312L又はX312Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置313(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X313Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置314(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X314C、X314E、X314K又はX314Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置315(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X315A、X315C、X315E、X315H、X315K又はX315Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置318(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X318I、X318S又はX318Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置319(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X319A、X319D、X319H、X319I、X319K、X319M、X319N、X319P、X319S、X319T又はX319Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置31(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X31N、X31Q、X31S、X31T、X31V又はX31Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置320(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X320A、X320C、X320D、X320E、X320G、X320H、X320K、X320L、X320N、X320Q、X320S又はX320Y、好ましくはX320Kを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置321(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X321A、X321E、X321K、X321N、X321T、X321V又はX321Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置323(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X323A、X323G、X323K、X323L又はX323Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置324(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X324K、X324L、X324M、X324W又はX324Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置326(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X326G、X326N、X326S又はX326Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置327(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X327C、X327L又はX327Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置32(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X32A、X32D、X32E、X32F、X32H、X32I、X32L、X32M、X32N、X32P、X32Q、X32T又はX32Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置333(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X333Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置334(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X334Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置336(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X336Kを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置337(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X337A、X337C、X337F、X337G、X337I、X337K、X337L、X337M、X337N、X337Q、X337R、X337S、X337T、X337V又はX337Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置338(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X338G、X338S又はX338Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置33(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X33D、X33E、X33H、X33K、X33M、X33Q、X33R又はX33Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置341(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X341Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置342(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X342Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置343(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X343L、X343T、X343W又はX343Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置344(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X344I、X344Q又はX344Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置345(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X345D、X345G、X345M、X345N、X345Q、X345S又はX345Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置346(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X346A、X346C、X346D、X346G、X346H、X346N又はX346Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置348(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X348Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置34(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X34H、X34I又はX34Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置350(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X350H、X350K又はX350Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置351(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X351A又はX351Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置352(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X352Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置353(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X353Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置354(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X354I、X354N、X354T又はX354Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置355(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X355I又はX355Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置356(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X356I又はX356Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置357(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X357Aを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置358(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X358I、X358L、X358N、X358P又はX358Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置359(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X359Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置35(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X35A、X35C、X35D、X35G、X35H、X35I、X35L、X35M、X35N、X35P、X35Q、X35R、X35S、X35T、X35V又はX35Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置360(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X360A、X360F、X360G、X360I、X360L、X360N、X360Q、X360R、X360S、X360T、X360V又はX360Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置362(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X362F、X362K、X362M、X362N、X362T、X362V又はX362Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置363(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X363A、X363C、X363D、X363E、X363G、X363H、X363K、X363L、X363M、X363P、X363Q、X363R、X363S、X363T、X363V、X363W又はX363Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置364(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X364A、X364C、X364G、X364K、X364L、X364N、X364S、X364T又はX364Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置366(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X366I、X366L又はX366Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置367(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X367E又はX367Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置368(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X368A、X368F、X368L又はX368Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置36(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X36A、X36E、X36G、X36I、X36K、X36M、X36N、X36P、X36Q、X36R、X36S、X36T又はX36Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置370(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X370E又はX370Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置372(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X372A、X372C、X372E、X372F、X372H、X372M、X372N又はX372Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置375(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X375A、X375D、X375E、X375I、X375K、X375Q、X375R、X375T、X375W又はX375Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置376(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X376G、X376I、X376K、X376L、X376M、X376Q、X376R、X376S又はX376Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置377(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X377Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置378(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X378C、X378D、X378E又はX378Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置379(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X379A、X379L又はX379Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置37(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X37A、X37G、X37M、X37P、X37T、X37V又はX37Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置381(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X381E又はX381Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置382(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X382A、X382H、X382K、X382L、X382N、X382Q又はX382Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置383(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X383C、X383D、X383E、X383H、X383I、X383M、X383N、X383Q、X383R、X383S、X383V又はX383Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置384(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X384A、X384C、X384D、X384E、X384F、X384I、X384L、X384M、X384N、X384Q、X384R、X384T、X384V、X384W又はX384Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置385(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X385A、X385C、X385D、X385E、X385F、X385G、X385H、X385I、X385L、X385M、X385N、X385P、X385Q、X385R、X385S、X385T、X385V、X385W又はX385Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置387(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X387C、X387E又はX387Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置388(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X388E、X388F、X388H、X388I、X388M、X388R又はX388Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置389(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X389G、X389H、X389K又はX38Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置390(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X390D、X390F、X390M、X390N、X390P又はX390Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置391(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X391A、X391F、X391G、X391K、X391M、X391N、X391Q、X391S、X391T又はX391Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置392(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X392C又はX392Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置393(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X393E、X393H、X393P、X393S又はX393Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置394(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X394A、X394C、X394E、X394H、X394I、X394L、X394M、X394N、X394R又はX394Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置395(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X395A、X395H、X395M又はX395Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置396(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X396H又はX396Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置397(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X397D、X397H、X397P又はX397Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置398(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X398Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置399(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X399Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置39(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X39E又はX39Kを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置3(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X3A、X3F、X3G、X3I、X3K、X3L、X3Q又はX3Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置400(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X400A、X400D、X400E、X400G、X400H、X400I、X400K、X400L、X400M、X400N、X400P、X400Q、X400R、X400S、X400V又はX400Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置401(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X401I、X401K、X401M又はX401Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置403(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X403Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置405(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X405C、X405H、X405M、X405T又はX405V、好ましくはX405Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置406(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X406Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置407(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X407D、X407R又はX407Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置408(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X408E、X408I又はX408Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置40(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X40I又はX40Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置410(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X410H、X410I、X410K、X410L、X410P、X410R又はX410Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置413(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X413Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置414(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X414C、X414E又はX414Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置415(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X415E又はX415Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置416(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X416Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置418(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X418C、X418N又はX418Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置41(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X41C、X41D、X41E、X41G、X41Q、X41S又はX41Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置421(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X421N又はX421Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置424(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X424Aを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置426(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X426D又はX426Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置427(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X427C、X427F、X427G、X427K、X427Q、X427R、X427S、X427T又はX427Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置429(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X429A、X429D、X429E、X429F、X429G、X429I、X429M、X429N、X429P、X429Q、X429S、X429T、X429V又はX429Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置42(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X42C、X42I、X42Q又はX42Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置431(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X431Iを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置434(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X434Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置436(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X436Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置438(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X438F、X438P又はX438Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置439(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X439K、X439C又はX439Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置440(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X440Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置442(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X442Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置443(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X443H又はX443Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置445(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X445A、X445C、X445D、X445F、X445G、X445H、X445K、X445M、X445Q、X445R、X445S、X445T又はX445Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置446(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X446F、X446I、X446L、X446P、X446Q、X446R、X446V又はX446Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置447(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X447Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置448(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X448D、X448E、X448H又はX448Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置449(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X449A、X449F、X449G、X449K、X449L、X449M、X449N、X449P、X449Q、X449R、X449S、X449V、X449W又はX449Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置451(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X451Lを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置453(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X453G、X453I、X453N、X453P又はX453Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置455(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X455Lを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置456(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X456L、X456M、X456R、X456S、X456V、X456W又はX456Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置457(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X457A、X457C、X457E、X457F、X457G、X457K、X457L、X457M、X457R、X457S、X457T、X457V又はX457Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置458(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X458I、X458K、X458V又はX458Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置459(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X459C、X459D、X459E、X459I、X459K、X459N、X459Q、X459R、X459V又はX459Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置45(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X45G又はX45Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置460(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X460A、X460D、X460E、X460G、X460Q、X460R、X460S、X460T又はX460Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置461(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X461A、X461E、X461F、X461K、X461L、X461M、X461N、X461Q、X461R、X461S又はX461Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置462(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X462Kを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置463(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X463Lを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置465(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X465H、X465P、X465R又はX465Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置467(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X467A、X467E又はX467Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置468(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X468D又はX468Hを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置470(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X470A、X470Q又はX470Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置471(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X471Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置474(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X474F、X474H又はX474Pを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置478(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X478A又はX478Eを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置47(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X47Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置480(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X480D、X480E、X480M、X480R又はX480Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置482(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X482C、X482T又はX482W、好ましくはX482Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置48(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X48F、X48I、X48M又はX48Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置4(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X4A、X4C、X4K、X4M、X4Q、X4R又はX4S、好ましくはX4Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置51(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X51Q、X51T又はX51Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置54(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X54D、X54G又はX54Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置59(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X59Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置5(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X5A、X5C、X5D、X5E、X5F、X5H、X5I、X5K、X5L、X5M、X5N、X5P、X5Q、X5R、X5V又はX5Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置60(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X60Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置63(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X63C又はX63Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置6(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X6A、X6C、X6E、X6F、X6G、X6H、X6K、X6L、X6M、X6P、X6Q、X6S、X6T、X6V、X6W又はX6Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置70(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X70F、X70H、X70L、X70M、X70N又はX70Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置71(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X71Dを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置72(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X72C、X72D、X72E、X72N又はX72Tを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置73(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X73L、X73N又はX73Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置75(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X75A、X75G、X75I、X75L、X75P、X75T又はX75Wを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置76(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X76C、X76E、X76G、X76L、X76T又はX76Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置7(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X7C、X7E、X7F、X7H、X7K、X7N、X7P、X7Q、X7R、X7S、X7V、X7W又はX7Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置81(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X81H又はX81Lを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置82(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X82K又はX82Mを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置83(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X83A、X83D、X83E、X83G、X83R又はX83Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置86(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X86Kを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置87(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X87D又はX87Rを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置89(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X89A、X89C、X89F、X89G、X89L、X89M、X89R又はX89Sを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置8(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X8A、X8C、X8F、X8I、X8M、X8P、X8S、X8V、X8W又はX8Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置90(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X90A、X90D、X90E、X90F、X90G、X90I、X90M、X90N、X90Q、X90R、X90S、X90V又はX90Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置91(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X91C、X91D、X91E、X91F、X91G、X91H、X91I、X91K、X91L、X91M、X91N、X91Q、X91S、X91T、X91V、X91W又はX91Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置92(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X92D、X92M又はX92Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置93(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X93K又はX93Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置94(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X94A、X94D、X94E、X94K、X94M、X94V又はX94Yを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置95(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X95E、X95I、X95L又はX95Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置96(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X96K、X96N又はX96Qを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置97(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X97Vを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置98(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X98E、X98G又はX98Nを含む。
別の実施形態では、バリアントアルファ-アミラーゼは、親アルファ-アミラーゼと比較して、位置99(配列番号3の付番に従う)でのアミノ酸置換、好ましくは置換X99H、X99K又はX99Nを含む。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX4Q、X7H、X7W、X25H、X25Y、X37M、X70H、X100W、X118D、X135T、X160W、X176K、X193E、X210C、X251E、X281N、X258Q、X323G、X361R、X363E、X363H、X363N、X368F、X405M、X434R、X441Q、X459N、X460G、X451L及びX482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX25H、X25Y、X100W、X135T、X176K、X193E及びX460Gからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX4Q、X25H、X100W、X135E、X135T、X135W、X135D、X160W、X176K、X193E、X251E、X258Q、X276R、X299S、X323G、X363E、X363H、X382Q、X405M、X460G及びX482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX4Q、X25H、X176K、X186E、X251E、X405M及びX482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX4Q、X25H、X176K、X251E、X405M及びX482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX116K、X181T、X225A及びX320Kからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うH1G、H1V、H1R、H2S、H2I、N3Q、N3K、N3F、N3G、N3L、G4Q、G4R、G4S、G4K、G4M、G4A、G4C、T5F、T5E、T5M、T5Y、T5R、T5Q、T5K、T5L、T5A、T5V、T5C、T5N、T5H、T5D、T5P、T5I、N6T、N6E、N6A、N6K、N6Q、N6V、N6M、N6G、N6L、N6H、N6W、N6F、N6P、N6S、N6C、N6Y、G7Y、G7S、G7H、G7C、G7Q、G7F、G7P、G7W、G7R、G7K、G7E、G7V、G7N、T8C、T8V、T8F、T8Y、T8P、T8W、T8A、T8S、T8M、T8I、M10W、M10Y、M10L、M10C、M10E、M10F、M10A、Y12N、Y12S、F13A、F13Y、E14N、W15R、Y16F、Y16R、L17K、L17V、P18R、P18M、P18F、P18K、P18T、P18I、N19P、N19L、N19F、N19Y、N19T、N19I、N19Q、N19C、N19H、N19S、N19M、N19K、N19G、N19D、N19A、D20C、D20S、D20L、D20M、D20T、D20D、D20Q、D20F、D20P、D20G、D20V、D20W、D20A、D20Y、D20H、D20K、D20E、G21S、G21E、N22E、N22F、N22A、N22D、N22M、N22T、N22K、N22Y、N22G、N22R、N22Q、N22W、N22L、H23N、H23Q、H23W、W24G、N25H、N25Y、N25K、N25F、N25S、N25C、N25D、N25A、N25G、N25W、N25Q、N25M、N25L、R26S、R26V、R26M、R26A、R26D、R26E、R26F、R26P、R26Y、R26L、L27D、L27I、L27F、L27R、L27G、L27Q、L27V、L27T、L27A、L27H、R28N、R28S、R28F、R28C、R28E、R28T、R28G、R28K、R28D、R28V、R28I、R28Q、S29Y、S29L、S29P、S29W、S29K、S29F、S29N、S29H、S29D、S29V、S29G、S29Q、S29I、D30F、D30I、D30A、D30K、D30W、D30Y、D30M、D30L、D30H、D30Q、D30G、D30E、D30T、A31S、A31V、A31Q、A31T、A31N、A31W、S32T、S32H、S32W、S32F、S32Q、S32I、S32A、S32P、S32E、S32M、S32N、S32D、S32L、N33Y、N33D、N33M、N33Q、N33K、N33R、L34H、L34V、L34I、K35C、K35Y、K35P、K35T、K35M、K35H、K35A、K35V、K35I、K35G、K35Q、K35D、K35N、K35R、K35S、K35L、D36V、D36I、D36T、D36K、D36A、D36S、D36R、D36M、D36E、D36P、D36G、D36N、D36Q、K37P、K37V、K37W、K37A、K37G、G38N、I39E、I39K、T40I、T40S、A41G、A41Q、A41C、A41D、A41E、A41S、A41T、V42Q、V42V、V42I、V42C、P45N、P45G、A47S、W48F、W48I、W48M、A51T、G59T、A60T、L63V、L63C、N70N、N70L、N70M、N70F、N70Y、Q71D、K72T、K72E、K72D、K72N、K72C、G73Q、G73L、G73N、V75A、V75I、V75W、V75P、V75G、V75T、R76G、R76T、R76C、R76V、R76E、R76L、T81H、R82M、R82K、N83G、N83R、N83S、Q86K、V89F、V89A、V89C、V89L、V89G、V89M、V89S、V89R、T90Q、T90F、T90G、T90E、T90A、T90N、T90I、T90R、T90Y、T90V、T90S、T90M、T90D、A91S、A91Y、A91K、A91Q、A91F、A91H、A91T、A91I、A91W、A91N、A91V、A91L、A91C、A91G、A91D、A91E、A91M、L92V、L92M、L92D、K93K、K93Q、S94M、S94K、S94Y、S94D、S94A、S94V、N95V、N95I、N95E、N95L、G96N、G96K、I97V、Q98G、Q98E、Q98N、V99K、V99H、V99N、Y100D、Y100K、Y100L、Y100F、
V103A、N106D、K108A、G109A、A113Y、A113H、A113M、A113V、A113F、A113W、A113R、T114D、T114H、T114N、T114W、T114E、T114C、T114G、T114L、T114M、T114Q、T114F、T114A、T114V、T114K、T114S、T114Y、T114R、T114I、E115C、E115K、E115N、E115T、E115M、E115S、E115Q、E115R、E115D、E115V、W116I、W116K、W116M、W116R、X116T、W116L、V117D、V117Y、V117N、V117C、V117R、V117W、V117A、V117I、V117P、V117F、A119Y、A119R、A119P、A119H、S125A、S125K、S125L、S125T、S125R、S125F、S125W、S125Q、S125V、S125Y、S125H、S125N、S125E、S125G、S125M、N126D、N128C、N128L、N128Y、N128E、N128W、N128M、Q129E、V131I、V131C、S132T、G133E、G133P、G133C、G133D、G133Q、G133S、G133H、G133A、G133N、G133K、D134Y、D134W、D134F、D134P、D134E、D134V、D134L、D134M、D134T、D134C、D134I、Y135M、T136D、T136E、T136F、T136M、T136P、T136H、T136C、T136A、T136W、T136L、T136N、A139C、T141V、K142C、K142W、K142Y、K142L、K142M、K142Q、K142F、K142E、K142R、F143F、D144Q、D144C、D144V、D144K、D144T、D144Y、D144E、D144G、D144N、D144S、D144R、F145A、P146C、P146H、P146K、P146T、P146E、P146S、P146D、P146W、P146F、P146L、P146G、G147M、G149E、N150Q、N150E、N150C、T151C、T151E、N154Y、N154A、F155Y、K156V、Y160W、H161T、F162V、G164V、V165W、Q169E、Q169V、S170F、S170C、Q172C、Q172K、Q172A、L173I、L173Y、Q174P、Q174M、Q174E、Q174S、N175G、N175Q、N175H、R176K、R181D、R181F、R181H、R181I、R181N、R181Q、R181S、R181T、R181V、R181W、R181Y、D188V、D188H、V191K、V191H、V191F、V191W、V191Y、
Y203E、Y203R、H210D、H210C、H210E、H210N、H210F、H210Y、H210M、H210Q、H210S、H210A、P211N、P211C、P211T、P211E、P211G、P211V、P211Q、P211A、P211H、P211L、P211S、E212W、E212L、E212I、E212D、E212C、V213A、V213S、V213M、V213R、V213C、V214P、V214E、N215E、N215D、N215H、N215W、N215A、E216H、E216G、R218Q、R218E、R218C、R218N、R218F、R218S、R218G、R218K、R218I、R218T、R218D、R218Y、R218H、R218L、R218V、R218A、R218W、N219E、N219Q、N219K、N219T、N219M、N219D、N219F、N219S、N219R、N219A、N219Y、N219H、N219W、N219G、N219C、G221N、G221F、V222S、V222T、V222D、W223V、W223Y、W223L、W223C、Y224V、Y224F、T225A、T225R、T225N、T225E、T225H、T225F、T225C、T225Y、T225I、N226C、N226W、N226I、N226R、N226Y、N226D、N226L、N226M、N226G、N226T、N226Q、N226S、N226A、N226V、N226E、N226H、T227W、T227C、T227T、T227R、T227M、T227K、T227Y、T227V、T227F、T227I、T227H、T227L、T227G、L230A、L230F、D231N、D231C、F233T、F233W、F233H、F233C、F233I、F233Y、F233M、R234C、I235M、I235V、I235L、D236Y、A237C、A237I、V238T、H240M、K242M、Y243F、F245E、F245M、F245H、W249D、W249I、L250V、T251E、T251A、T251L、T251S、T251M、T251F、H252C、H252I、H252S、V253Y、V253G、N255T、N255V、N255D、N255F、N255I、T256C、T257Y、T257L、T257V、K259L、M261R、F262D、F262Y、F262C、F262P、F262E、F262H、A263I、V264T、V264W、V264H、A265S、W268G、N270A、N270Y、I272L、I272G、G273H、G273V、G273L、G273M、G273C、G273D、G273W、G273F、G273A、G273E、G273P、G273Y、G273R、G273I、A274S、E276Y、E276K、E276L、E276D、L279P、S280I、S280V、S280N、S280H、S280Y、S280K、S280R、W284Y、W284A、W284L、W284F、W284H、W284N、W284M、N285N、N285L、N285G、N285P、H286Q、S287E、S287H、S287A、S287D、S287T、V288K、V288P、V288Y、V288A、F289T、F289R、F289G、F289F、D290Q、D290N、D290M、D290D、D290W、V291D、V291Y、V291K、V291T、P292W、P292F、P292L、P292I、P292T、P292C、L293D、L293R、L293K、L293E、L293F、H294T、H294G、Y295F、N296Y、N296L、N296C、N296A、L297M、L297K、L297S、L297H、L297V、L297E、L297F、N299L、N299G、N299I、N299K、N299S、N299Y、
S301F、R302H、R302I、R302Q、R302Y、R302V、S303P、S303M、S303E、S303I、S303R、S303K、S303N、S303L、S303H、S303T、G304H、G304A、G304R、G304Y、G304D、G304N、G304M、G304E、G304P、G304W、G304K、G304T、N306M、N306E、N306A、N306G、N306W、N306V、N306S、N306I、N306H、N306T、N306D、N306Q、N306Y、N306R、Y307F、Y307M、D308S、M309H、M309L、M309Q、R310Q、R310A、Q311G、Q311E、Q311H、Q311A、Q311K、Q311T、Q311N、Q311R、Q311Y、I312M、I312L、F313V、N314C、N314Q、G315C、G315A、G315H、G315T、G315E、G315K、V318T、V318S、V318I、Q319K、Q319H、Q319P、Q319A、Q319I、Q319D、Q319M、Q319S、Q319N、Q319T、Q319W、R320G、R320Y、R320L、R320N、R320A、R320D、R320K、R320Q、R320E、R320H、R320C、R320S、H321E、H321W、H321T、H321A、H321N、H321V、H321K、T323K、T323G、H324W、H324K、H324Y、V326Y、V326N、V326G、V326S、T327M、T327C、T327L、D333I、P336K、E337N、E337K、E337M、E337T、E337V、E337Q、E337S、E337R、E337I、E337Y、E337G、E337F、E337A、E337L、E338G、E338T、E338S、E341V、S342P、F343W、F343Y、V344I、V344Q、V344V、E345N、E345T、E345M、E345G、E345S、E345D、E345Q、E346D、E346C、E346H、E346A、E346G、E346Q、E346N、F348T、P350P、P350H、P350K、L351M、L351A、A352S、Y353H、A354Y、A354N、A354T、A354I、L355I、L355M、L357A、T358P、R359E、D360N、D360R、D360S、D360Y、D360V、D360L、D360A、D360I、D360T、D360G、D360F、G362T、G362M、G362V、G362N、G362Y、G362F、G362K、Y363M、Y363G、Y363S、Y363V、Y363C、Y363T、Y363H、Y363P、Y363D、Y363L、Y363R、Y363Q、Y363E、Y363Y、Y363K、Y363W、Y363A、P364G、P364T、P364S、P364A、P364V、P364C、P364K、P364L、P364N、V366I、V366L、V366T、F367S、F367E、Y368N、Y368L、Y368A、D370E、D370I、Y372C、Y372H、Y372A、Y372F、Y372M、Y372Q、Y372N、Y372E、P375K、P375A、P375E、P375R、P375T、P375I、P375W、P375Q、T376S、T376R、T376M、T376I、T376V、T376Q、T376L、G378E、G378R、G378D、G378C、V379L、V379A、V379S、A381V、A381E、M382N、M382H、M382Q、M382K、M382A、M382S、K383R、K383I、K383D、K383V、K383M、K383E、K383N、K383S、K383Q、K383Y、K383C、K383H、S384W、S384Y、S384V、S384R、S384N、S384E、S384A、S384D、S384T、S384C、S384F、S384L、S384I、S384M、S384Q、K385G、K385V、K385T、K385Y、K385I、K385D、K385C、K385Q、K385A、K385W、K385L、K385H、K385M、K385N、K385S、K385F、K385E、K385R、K385P、D387N、D387C、D387E、P388R、P388F、P388H、P388V、P388E、P388I、I389G、I389K、I389H、L390P、L390N、L390R、L390F、L390M、L390D、E391T、E391F、E391S、E391A、E391G、E391M、E391N、E391Y、E391Q、E391K、A392C、A392V、R393V、R393E、R393H、R393S、R393P、Q394C、Q394L、Q394R、Q394S、Q394A、Q394E、Q394N、Q394M、Q394H、Q394I、K395V、K395M、K395A、K395H、Y396P、Y396H、A397P、A397D、A397S、A397H、Y398M、G399P、
T400L、T400P、T400I、T400S、T400A、T400R、T400Q、T400D、T400K、T400N、T400V、T400W、T400H、T400E、T400G、T400M、Q401M、Q401K、Q401T、Q401I、D403N、L405H、L405V、L405T、L405C、D406P、H407S、H407R、H407D、P408Q、P408E、P408I、V410R、V410K、V410I、V410L、V410H、W413S、T414E、T414C、T414S、R415I、R415E、E416S、D418C、D418P、D418N、H421P、H421N、S424A、L426D、L426W、A427Q、A427C、A427F、A427T、A427V、A427G、A427S、A427R、A427K、L429M、L429D、L429E、L429N、L429T、L429A、L429P、L429W、L429Q、L429S、L429F、L429G、L429I、L429V、S431I、G436E、K438P、K438F、K438Y、W439K、W439C、W439P、M440V、V442Q、G443T、G443H、N445M、N445T、N445A、N445G、N445S、N445F、N445R、N445Q、N445C、N445D、N445K、N445H、N445V、N446P、N446I、N446V、N446F、N446L、N446R、N446Q、N446W、A447V、G448E、G448H、G448N、G448D、E449V、E449Y、E449F、E449L、E449P、E449G、E449W、E449M、E449R、E449N、E449K、E449Q、E449S、E449A、W451L、D453G、D453I、D453P、D453Y、D453N、T455L、G456M、G456S、G456Y、G456V、G456L、G456W、G456R、N457K、N457C、N457L、N457S、N457R、N457F、N457T、N457A、N457V、N457W、N457E、N457M、N457G、Q458V、Q458W、Q458I、Q458K、T459Q、T459D、T459I、T459K、T459C、T459V、T459E、T459Y、N460E、N460Q、N460S、N460R、N460A、N460T、N460D、N460V、T461A、T461R、T461F、T461E、T461S、T461V、T461M、T461K、T461N、T461Q、V462K、T463L、N465P、N465V、N465H、N465R、D467A、D467E、D467H、G468H、G468D、G470Q、G470T、G470A、V474P、V474H、V474F、S478A、S478E、S480Y、S480M、S480E、S480D、S480R、Y482T、Y482C、A119S、A139S、A274F、D163A、D163Q、D163T、D188T、D20N、D231D、D271S、D370S、D36H、E276N、F180M、F180N、F180T、F180W、G182D、G182E、G182N、G182Q、G182S、G258F、G258Q、G258R、G273Q、G362C、G73C、G96Q、I177A、I177G、I177K、I177N、I177P、I177R、I177S、I177W、I272F、I272S、I275V、K156E、K185E、K185M、K185N、K242N、K269M、K281A、K281D、K281E、K281H、K281N、K281S、K37F、K37L、K37M、K37Y、K395C、L279A、L357C、L357F、N224F、N260H、N270Q、N277D、N277E、N277T、N314S、N33L、N83E、N95A、P322K、P434E、P434H、P434S、Q169D、Q169S、Q174G、Q174H、Q174N、Q311W、Q98A、Q98V、R118A、R118D、R118E、R176S、R176T、R359W、R82L、S280D、S280F、S280G、S365Y、S94E、T193D、T193E、T193G、T193V、T251T、T282V、T356C、T356L、T356V、T358M、T461L、T463A、T463V、V120E、V120G、V120M、V120S、V120W、V120Y、V131Q、V165S、V165T、V191M、V238A、V238F、V317M、V75H、W116I、W116M、W187A、W187D、W187M、W187V、W189I、W268F、Y100W、Y135D、Y135E、Y135G、Y135N、Y135P、Y135S、Y135T、Y135W、Y160D、Y160E、Y178F、Y243D、Y298V、Y363N、Y368F、Y372S、Y372T、Y396C、R393Q、P434R、V318L、T459N、H321Y、N460G、D387S、S365L、V253C、P388K、A352C、S365Q、Y396S、V379R、L405M、T81L及びR82Cからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4Q、G7H、G7W、N25H、N25Y、K37M、N70H、Y100W、R118D、Y135T、Y160W、R176K、T193E、H210C、T251E、K281N、G258Q、T323G、Q361R、Y363E,Y363H、Y363N、Y368F、L405M、P434R、E441Q、T459N、N460G、T451L及びY482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うN25H、Y100W、Y135T、R176K、T193E及びN460Gからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4Q、N25H、Y100W、Y135E、Y135T、Y135W、Y135D、Y160W、R176K、T193E、T251E、G258Q、E276R、N299S、T323G、Y363E、Y363H、M382Q、L405M、N460G及びY482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4Q、N25H、R176K、G186E、T251E、L405M、W439K及びY482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4Q、N25H、R176K、T251E、L405M、W439K及びY482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4Q、N25H、R176K、G186E、T251E、L405M及びY482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4Q、N25H、R176K、T251E、L405M及びY482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うG4Q、N25H、R176K、G186E、T251E、L405M及びY482Wからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
好ましくは、1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換は、アルファ-アミラーゼの表面上に配置されるアミノ酸位置にある。好ましくは、アルファ-アミラーゼの表面上に配置されるアミノ酸位置での1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換は、配列番号3の付番に従う5、7、16、18、20、22、26、28、29、32、35、36、54、70、73、75、83、86、87、90、93、94、95、96、98、113、116、125、126、128、129、131、133、135、136、146、147、149、150、151、154、158、160、169、170、172、174、175、184、191、192、208、210、224、242、249、253、256、257、268、279、297、302、303、304、306、308、309、311、312、313、318、320、321、336、337、338、345、358、370、375、376、378、379、382、383、397、398、401、405、406、416、418、421、434、442、443、446、448、455、457、458、459、461、463、465、467、471及び474からなる群から選択される。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼは、アルファ-アミラーゼの表面上に配置されるアミノ酸位置で1つ以上のアミノ酸置換を含み、アルファ-アミラーゼの表面上に配置されるアミノ酸位置での置換は、配列番号3の付番に従うX5F、X5E、X5M、X5Y、X5R、X5Q、X5K、X5L、X5A、X5V、X5C、X5N、X5H、X5D、X5P、X7Y、X7S、X7H、X7C、X7Q、X7F、X7P、X7W、X7R、X7K、X7E、X7V、X7N、X16F、X16R、X18R、X18M、X18F、X18K、X18T、X18I、X20C、X20S、X20L、X20M、X20T、X20D、X20Q、X20F、X20P、X20G、X20V、X20W、X20A、X20Y、X20H、X20K、X20E、X22E、X22F、X22A、X22D、X22M、X22T、X22K、X22Y、X22G、X22R、X22Q、X22W、X22L、X26S、X26V、X26M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26P、X26Y、X26L、X28N、X28S、X28F、X28C、X28E、X28T、X28G、X28K、X28D、X28V、X28I、X28Q、X29Y、X29L、X29P、X29W、X29K、X29F、X29N、X29H、X29E、X29D、X29V、X29G、X29Q、X29I、X32T、X32H、X32W、X32F、X32Q、X32I、X32A、X32P、X32E、X32M、X32N、X32D、X32L、X35C、X35Y、X35P、X35T、X35M、X35H、X35A、X35V、X35I、X35G、X35Q、X35D、X35N、X35R、X35S、X35L、X36V、X36I、X36T、X36K、X36A、X36S、X36R、X36M、X36E、X36P、X36G、X36N、X36Q、X54D、X54G、X54Q、X70N、X70L、X70H、X70M、X70F、X70Y、X73Q、X73L、X73N、X75A、X75I、X75W、X75P、X75G、X75L、X75T、X83G、X83R、X83E、X83D、X83A、X83S、X86K、X87D、X87R、X90Q、X90F、X90G、X90E、X90A、X90N、X90I、X90R、X90Y、X90V、X90S、X90M、X90D、X93K、X93Q、X94M、X94K、X94Y、X94D、X94A、X94E、X94V、X95V、X95I、X95E、X95L、X96N、X96Q、X96K、X98G、X98E、X98N、
X113Y、X113H、X113M、X113V、X113F、X113W、X113R、X116R、X116T、X116K、X116L、X125A、X125K、X125L、X125T、X125R、X125F、X125W、X125D、X125Q、X125V、X125Y、X125H、X125N、X125E、X125G、X125M、X126D、X128C、X128L、X128Y、X128E、X128W、X128M、X129E、X131I、X131L、X131W、X131C、X133E、X133P、X133C、X133D、X133Q、X133S、X133H、X133A、X133N、X133K、X135M、X135D、X135E、X135T、X135W、X136D、X136E、X136F、X136M、X136P、X136H、X136C、X136A、X136W、X136L、X136N、X146C、X146H、X146K、X146T、X146E、X146S、X146D、X146W、X146F、X146L、X146G、X147M、X149E、X150Q、X150E、X150C、X151C、X151E、X154Y、X154A、X158Y、X158N、X158H、X160W、X160D、X169E、X169A、X169V、X170F、X170C、X172C、X172K、X172D、X172N、X172A、X174P、X174M、X174E、X174D、X174T、X174S、X174H、X175G、X175Q、X175H、X175A、X191K、X191H、X191F、X191W、X191Y、X192A、X192T、X208I、X208Y、X208F、X210D、X210C、X210E、X210N、X210F、X210Y、X210M、X210Q、X210S、X210A、X224V、X224F、X242M、X249D、X249I、X253Y、X253G、X256C、X257Y、X257L、X257V、X268G、X279P、X297M、X297K、X297S、X297H、X297V、X297E、X297F、X302H、X302I、X302Q、X302Y、X302V、X303P、X303M、X303E、X303I、X303R、X303K、X303N、X303L、X303H、X303T、X304H、X304A、X304R、X304Y、X304D、X304N、X304M、X304E、X304P、X304W、X304K、X304T、X306M、X306E、X306A、X306G、X306W、X306V、X306S、X306I、X306H、X306T、X306D、X306Q、X306Y、X306R、X308S、X309H、X309L、X309Q、X311G、X311E、X311H、X311A、X311K、X311T、X311N、X311R、X311Y、X312M、X312L、X313V、X318T、X318S、X318I、X320G、X320Y、X320L、X320N、X320A、X320D、X320K、X320Q、X320E、X320H、X320C、X320S、X321E、X321W、X321T、X321A、X321N、X321V、X321K、X336K、X337N、X337K、X337M、X337T、X337V、X337Q、X337S、X337C、X337R、X337I、X337Y、X337G、X337F、X337A、X337L、X338G、X338T、X338S、X345N、X345T、X345M、X345G、X345S、X345D、X345Q、X358I、X358L、X358N、X358V、X358P、X370E、X370I、X375K、X375A、X375D、X375E、X375R、X375T、X375I、X375W、X375Y、X375Q、X376S、X376G、X376R、X376M、X376K、X376I、X376V、X376Q、X376L、X378E、X378R、X378D、X378C、X379L、X379A、X379S、X382N、X382H、X382Q、X382K、X382A、X382L、X382S、X383R、X383I、X383D、X383V、X383M、X383E、X383N、X383S、X383Q、X383Y、X383C、X383H、X397P、X397D、X397S、X397H、X398M、X401M、X401K、X401T、X401I、X405H、X405V、X405T、X405M、X405C、X406P、X416S、X418C、X418P、X418N、X421P、X421N、X434S、X442Q、X443T、X443H、X446P、X446I、X446V、X446F、X446L、X446R、X446Q、X446W、X448E、X448H、X448N、X448D、X455L、X457K、X457C、X457L、X457S、X457R、X457F、X457T、X457A、X457V、X457W、X457E、X457M、X457G、X458V、X458W、X458I、X458K、X459Q、X459D、X459I、X459K、X459C、X459V、X459E、X459R、X459N、X459Y、X461A、X461R、X461F、X461E、X461S、X461L、X461V、X461M、X461K、X461N、X461Q、X463L、X465P、X465V、X465H、X465R、X467A、X467E、X467H、X471E、X474P、X474H及びX474Fからなる群から選択される。
好ましくは、1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換は、アルファ-アミラーゼの触媒中心の近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼの触媒中心から20オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置にある。好ましくは、アルファ-アミラーゼの触媒中心の近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼの触媒中心から20オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置にある1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換は、配列番号3の付番に従う14、15、16、17、18、19、20、51、54、59、60、71、72、73、76、109、123、125、126、172、173、174、175、176、192、193、203、234、236、237、238、240、268、270、333、334、337、338、341及び342からなる群から選択される。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼは、アルファ-アミラーゼの触媒中心の近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼの触媒中心から20オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置で1つ以上のアミノ酸置換を含み、アルファ-アミラーゼの触媒中心の近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼの触媒中心から20オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置での置換は、配列番号3の付番に従うX14N、X15R、X16F、X16R、X17K、X17V、X18R、X18M、X18F、X18K、X18T、X18I、X19P、X19L、X19F、X19Y、X19T、X19I、X19Q、X19C、X19H、X19S、X19M、X19K、X19G、X19D、X19A、X20C、X20S、X20L、X20M、X20T、X20D、X20Q、X20F、X20P、X20G、X20V、X20W、X20A、X20Y、X20H、X20K、X20E、X51V、X51Q、X51T、X54D、X54G、X54Q、X59T、X60T、X71D、X72T、X72E、X72D、X72N、X72C、X73Q、X73L、X73N、X76G、X76T、X76C、X76V、X76E、X76L、X109A、X123D、X123S、X125A、X125K、X125L、X125T、X125R、X125F、X125W、X125D、X125Q、X125V、X125Y、X125H、X125N、X125E、X125G、X125M、X126D、X172C、X172K、X172D、X172N、X172A、X173I、X173Y、X174P、X174M、X174E、X174D、X174T、X174S、X174H、X175G、X175Q、X175H、X175A、X176K、X192A、X192T、X193E、X203E、X203R、X234C、X236Y、X237C、X237I、X238T、X240M、X268G、X270A、X270Y、X333I、X334T、X337N、X337K、X337M、X337T、X337V、X337Q、X337S、X337C、X337R、X337I、X337Y、X337G、X337F、X337A、X337L、X338G、X338T、X338S、X341V及びX342Pからなる群から選択される。
好ましくは、1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換は、アルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つの近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つから10オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置にある。好ましくは、アルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つの近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つから10オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置にある1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換は、配列番号3の付番に従う106、108、160、161、162、164、184、188、203、208、211、212、215、234、235、236、237、238、240、297、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、345、346、405、406、407、408、429、431及び474からなる群から選択される。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼは、アルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つの近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つから10オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置で1つ以上のアミノ酸置換を含み、アルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つの近傍に、好ましくはアルファ-アミラーゼのCa2+結合部位の1つから10オングストローム未満の距離に配置されたアミノ酸位置での置換は、配列番号3の付番に従うX106D、X108A、X160W、X160D、X161T、X162V、X164V、X188V、X188H、X203E、X203R、X208I、X208Y、X208F、X211D、X211N、X211C、X211T、X211E、X211G、X211V、X211Q、X211A、X211H、X211L、X211S、X212W、X212L、X212I、X212D、X212C、X215E、X215D、X215H、X215W、X215A、X234C、X235M、X235V、X235L、X236Y、X237C、X237I、X238T、X240M、X297M、X297K、X297S、X297H、X297V、X297E、X297F、X299L、X299G、X299I、X299K、X299S、X299Y、X301F、X302H、X302I、X302Q、X302Y、X302V、X303P、X303M、X303E、X303I、X303R、X303K、X303N、X303L、X303H、X303T、X304H、X304A、X304R、X304Y、X304D、X304N、X304M、X304E、X304P、X304W、X304K、X304T、X306M、X306E、X306A、X306G、X306W、X306V、X306S、X306I、X306H、X306T、X306D、X306Q、X306Y、X306R、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X310Q、X310A、X345N、X345T、X345M、X345G、X345S、X345D、X345Q、X346D、X346C、X346H、X346A、X346G、X346Q、X346N、X405H、X405V、X405T、X405M、X405C、X406P、X407S、X407R、X407D、X408Q、X408E、X408I、X429M、X429D、X429E、X429N、X429T、X429A、X429P、X429W、X429Q、X429S、X429F、X429G、X429I、X429V、X431I、X474P、X474H及びX474Fからなる群から選択される。
好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、上で挙げられるアミノ酸改変のいずれか、好ましくはアミノ酸置換の1~50個、好ましくは1~30個又は1~25個を含む。好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、上で挙げられる置換の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24又は少なくとも25個であるが、50個未満、好ましくは30個未満、好ましくは20個未満を含む。
より好ましくは、上で挙げられる置換の数が、1~30個、好ましくは1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5個、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25個の置換であるアルファ-アミラーゼバリアント。さらに好ましくは、上で挙げられる置換の数が、2~30個、好ましくは2~25個、2~20個、2~15個、2~10個、2~8個又は2~5個であるアルファ-アミラーゼバリアント。さらに好ましくは、上で挙げられる置換の数が、3~30個、好ましくは3~25個、3~20個、3~15個、3~10個、3~8個又は3~5個であるアルファ-アミラーゼバリアント。さらに好ましくは、上で挙げられる置換の数が、4~30個、好ましくは4~25個、4~20個、4~15個、4~10個又は4~8個であるアルファ-アミラーゼバリアント。好ましくは、アミノ酸改変、好ましくは置換の上で列挙される数に加えて、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる。
好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1、配列番号3若しくは配列番号4によるアミラーゼ又は配列番号1、配列番号3若しくは配列番号4と少なくとも60%の配列同一性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼであり、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである。
好ましい実施形態では、本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、
X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y+X482W、X25H+X186E+X206Y+X405M+X482W、X25H+X186E+X206Y+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X206Y+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X193E+X251E+X186E+X482W、X4Q+X193E+X206Y+X276R+X186E+X482W、X186E+X25H+X482W、X25H+X193E+X206Y+X251E+X276R+X405M+X186E+X482W、X25H+X251E+X186E+X482W、X25H+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X193E+X206Y+X405M+X186E+X482W、X3I+X356V、X3I+X356I、X83D+X94E、X94D+X125E、X131I+X377Q+X410H、X48F+X94D、X48Y+X116K+X218K、X5L+X218K+X225S、X83E+X116R+X158Y+X181E、X51V+X218K、X83E+X181E、X4Q+X7W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X37M+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25Y+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X118D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X182D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X258Q+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363H+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363N+X405M、X4Q+X176K+X181D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181F+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181N+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X136E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X100W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135T+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、
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X25H+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X363E+X123D、X25H+X176K+X186E+X206Y+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X363E+X135C、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X361R、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X281N+X363E+X175D、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X473R、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X363E、
X116K+X181T、
X116K+X181T+X225A、
X181T+X225A+X320K、及び
X116K+X181T+X225A+X320K
からなる群から選択される置換の組み合わせを含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましい実施形態では、本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、
X4Q+X25H、
X4Q+X25H+X176K、
X4Q+X25H+X176K+X186E、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K+X482W、
X25H+X176K、
X25H+X176K+X186E、
X176K+X186E、
X25H+X176K+X186E+X251E、
X25H+X176K+X186E+X251E+X405M、
X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、
X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K+X482W、
X25H+X176K+X251E+X405M、
X25H+X176K+X251E+X405M+X482W、
X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、
X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
X251E+X405M、
X251E+X405M+X439K、
X251E+X405M+X482W、
X251E+X405M+X439K+X482W、
X405M+X439K、
X405M+X482W、
X405M+X439K+X482W、
X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、及び
X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
好ましくは、X25H+X176K+X186E、X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W又はX4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K、X25H+X176K+X251E+X405M+X482W又はX4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X482W、最も好ましくは、X25H+X176K+X186E又はX4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W
からなる群から選択される置換の組み合わせを含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
さらに特に好ましい実施形態では、本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、
X116K+X181T、
X116K+X181T+X225A、
X116K+X181T+X225A+X320K、及び
X181T+X225A+X320K、好ましくはX116K+X181T+X225A+X320K
からなる群から選択される置換の組み合わせを含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましい実施形態では、本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、N25H+R176K+G186E+I206Y+R181Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+T193E、N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E+I206Y、N25H+G186E+I206Y+L405M、N25H+G186E+I206Y、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E、G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E+I206Y、G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M、G4Q+I206Y+N460G、G4Q+N25H+R176K+I206Y+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+T193E+T251E+G186E、G4Q+T193E+I206Y+E276R+G186E、G186E+N25H、N25H+T193E+I206Y+T251E+E276R+L405M+G186E、N25H+T251E+G186E、N25H+Y160W+R176K+G186E+T251E+L405M、T193E+I206Y+L405M+G186E、N25H+R176K+G186E+I206Y+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+R181Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Q359R、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+G258Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y135T+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+G258Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+Y482W、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+Y482W、
G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+L405M+Y482W、N25H+G186E+I206Y+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+N460G、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+N460G+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+N460G+Y482W、N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+Y482W、N25H+R176K+G186E+N195F+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+Y482W、G4Q+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+L405M+Y482W、N25H+G186E+N195F+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+N460G、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+N460G+Y482W及びG4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+N460G+Y482Wからなる群から選択される置換の組み合わせを含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
特に好ましい実施形態では、本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、
G4Q+N25H、
G4Q+N25H+R176K、
G4Q+N25H+R176K+G186E、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+W439K、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+W439K+Y482W、
G4Q+N25H+R176K+T251E、
G4Q+N25H+R176K+T251E+L405M+W439K、
G4Q+N25H+R176K+T251E+L405M+Y482W、
G4Q+N25H+R176K+T251E+L405M+W439K+Y482W、
N25H+R176K、
N25H+R176K+G186E、
R176K+G186E、
N25H+R176K+G186E+T251E、
N25H+R176K+G186E+T251E+L405M、
N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、
N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+W439K+Y482W、
N25H+R176K+T251E、
N25H+R176K+T251E+L405M、
N25H+R176K+T251E+L405M+Y482W、及び
N25H+R176K+T251E+L405M+W439K+Y482W、
好ましくは、N25H+R176K+G186E、N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、N25H+R176K、N25H+R176K+T251E+L405M+Y482W又はG4Q+N25H+R176K+T251E+L405M+Y482W、最も好ましくはN25H+R176K+G186E又はG4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W
からなる群から選択される置換の組み合わせを含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、本明細書で挙げられるアミノ酸改変の1~50個、好ましくは1~30、1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~8又は2~5個、好ましくは3~30、3~25、3~20、3~15、3~10、3~8又は3~5個、好ましくは4~30、4~25、4~20、4~15、4~10又は4~8個のアミノ酸改変、好ましくは置換を有する配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、本明細書で挙げられるアミノ酸置換の1~50個、好ましくは1~30、1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~8又は2~5個、好ましくは3~30、3~25、3~20、3~15、3~10、3~8又は3~5個、好ましくは4~30、4~25、4~20、4~15、4~10又は4~8個のアミノ酸改変、好ましくは置換を有する配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、さらに、1~50個、好ましくは1~30、1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5個、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~8又は2~5個、好ましくは3~30、3~25、3~20、3~15、3~10、3~8又は3~5個、好ましくは4~30、4~25、4~20、4~15、4~10又は4~8個の保存的アミノ酸交換を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、1~50個のアミノ酸改変、好ましくは1~30、1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5個、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~8又は2~5個、好ましくは3~30、3~25、3~20、3~15、3~10、3~8又は3~5個、好ましくは4~30、4~25、4~20、4~15、4~10又は4~8個のアミノ酸置換を有して、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、前記アミノ酸置換は、X100D、X100F、X100K、X100L、X103A、X106D、X108A、X109A、X10A、X10C、X10E、X10F、X10L、X10W、X10Y、X113F、X113H、X113M、X113R、X113V、X113W、X113Y、X114A、X114C、X114D、X114E、X114F、X114G、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114N、X114Q、X114R、X114S、X114V、X114W、X114Y、X115C、X115D、X115K、X115M、X115N、X115Q、X115R、X115S、X115T、X115V、X116I、X116K、X116L、X116M、X116R、X116T、X117A、X117C、X117D、X117F、X117I、X117N、X117P、X117R、X117W、X117Y、X118A、X118D、X118E、X119H、X119P、X119R、X119S、X119Y、X120E、X120G、X120M、X120S、X120W、X120Y、X123D、X123S、X125A、X125D、X125E、X125F、X125G、X125H、X125K、X125L、X125M、X125N、X125Q、X125R、X125T、X125V、X125W、X125Y、X126D、X128C、X128E、X128L、X128M、X128W、X128Y、X129E、X12N、X12S、X131C、X131I、X131L、X131Q、X131W、X132T、X133A、X133C、X133D、X133E、X133H、X133K、X133N、X133P、X133Q、X133S、X134C、X134E、X134F、X134I、X134L、X134M、X134P、X134T、X134V、X134W、X134Y、X135D、X135E、X135G、X135M、X135N、X135P、X135S、X135T、X135W、X136A、X136C、X136D、X136E、X136F、X136H、X136L、X136M、X136N、X136P、X136W、X139C、X139S、X13A、X13Y、X141V、X142C、X142E、X142F、X142L、X142M、X142Q、X142R、X142W、X142Y、X143F、X144C、X144E、X144G、X144K、X144N、X144Q、X144R、X144S、X144T、X144V、X144Y、X145A、X146C、X146D、X146E、X146F、X146G、X146H、X146K、X146L、X146S、X146T、X146W、X147M、X149E、X14N、X150C、X150E、X150Q、X151C、X151E、X154A、X154Y、X155Y、X156E、X156V、X158H、X158N、X158Y、X15R、X160D、X160E、X160W、X161T、X162V、X163A、X163Q、X163T、X164V、X165S、X165T、X165W、X169A、X169D、X169E、X169S、X169V、X16F、X16R、X170C、X170F、X172A、X172C、X172D、X172K、X172N、X173I、X173Y、X174D、X174E、X174G、X174H、X174M、X174N、X174P、X174S、X174T、X175A、X175G、X175H、X175Q、X176K、X176S、X176T、X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S、X177W、X178F、
X17K、X17V、X180M、X180N、X180T、X180W、X182D、X182E、X182N、X182Q、X182S、X185E、X185M、X185N、X187A、X187D、X187M、X187V、X188H、X188T、X188V、X189I、X18F、X18I、X18K、X18M、X18R、X18T、X191F、X191H、X191K、X191M、X191W、X191Y、X192A、X192T、X193D、X193E、X193G、X193V、X19A、X19C、X19D、X19F、X19G、X19H、X19I、X19K、X19L、X19M、X19P、X19Q、X19S、X19T、X19Y、X1R、X1V、X203E、X203R、X208F、X208I、X208Y、X20A、X20C、X20D、X20E、X20F、X20G、X20H、X20K、X20L、X20M、X20N、X20P、X20Q、X20S、X20T、X20V、X20W、X20Y、X210A、X210C、X210D、X210E、X210F、X210M、X210N、X210Q、X210S、X210Y、X211A、X211C、X211D、X211E、X211G、X211H、X211L、X211N、X211Q、X211S、X211T、X211V、X212C、X212D、X212I、X212L、X212W、X213A、X213C、X213M、X213R、X213S、X214E、X214P、X215A、X215D、X215E、X215H、X215W、X216G、X216H、X218A、X218C、X218D、X218E、X218F、X218G、X218H、X218I、X218K、X218L、X218N、X218Q、X218S、X218T、X218V、X218W、X218Y、X219A、X219C、X219D、X219E、X219F、X219G、X219H、X219K、X219M、X219Q、X219R、X219S、X219T、X219W、X219Y、X21E、X21S、X221F、X221N、X222D、X222K、X222S、X222T、X223C、X223L、X223V、X223Y、X224F、X224V、X225A、X225C、X225E、X225F、X225H、X225I、X225N、X225R、X225S、X225Y、X226A、X226C、X226D、X226E、X226G、X226H、X226I、X226L、X226M、X226Q、X226R、X226S、X226T、X226V、X226W、X226Y、X227C、X227F、X227G、X227H、X227I、X227K、X227L、X227M、X227R、X227T、X227V、X227W、X227Y、X22A、X22D、X22E、X22F、X22G、X22K、X22L、X22M、X22Q、X22R、X22T、X22W、X22Y、X230A、X230F、X231C、X231D、X231N、X233C、X233H、X233I、X233M、X233T、X233W、X233Y、X234C、X235L、X235M、X235V、X236Y、X237C、X237I、X238A、X238F、X238T、X23N、X23Q、X23W、X240M、X242M、X242N、X243D、X243F、X245E、X245H、X245M、X249D、X249I、X24G、X250V、X251A、X251E、X251F、X251L、X251M、X251S、X251T、X252C、X252I、X252S、X253C、X253G、X253Y、X255D、X255F、X255I、X255T、X255V、X256C、X257L、X257V、X257Y、X258F、X258Q、X258R、X259L、X25A、X25C、X25D、X25F、X25G、X25H、X25K、X25L、X25M、X25Q、X25S、X25W、X25Y、X260H、X261R、X262C、X262D、X262E、X262H、X262P、X262Y、X263I、X264H、X264T、X264W、X265S、X268F、X268G、X269M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26L、X26M、X26P、X26S、X26V、X26Y、X270A、X270Q、X270Y、X271S、X272F、X272G、X272L、X272S、X273A、X273C、X273D、X273E、X273F、X273H、X273I、X273L、X273M、X273P、X273Q、X273R、X273V、X273W、X273Y、X274F、X274S、X275V、X276D、X276K、X276L、X276N、X276R、X276Y、X277D、X277E、X277T、X279A、X279P、
X27A、X27D、X27F、X27G、X27H、X27I、X27Q、X27R、X27T、X27V、X280D、X280F、X280G、X280H、X280I、X280K、X280N、X280R、X280V、X280Y、X281A、X281D、X281E、X281H、X284A、X284F、X284H、X284L、X284M、X284N、X284Y、X285G、X285L、X285N、X285P、X286Q、X287A、X287D、X287E、X287H、X287T、X288A、X288K、X288P、X288Y、X289F、X289G、X289R、X289T、X28C、X28D、X28E、X28F、X28G、X28I、X28K、X28N、X28Q、X28S、X28T、X28V、X290D、X290M、X290N、X290Q、X290W、X291D、X291K、X291T、X291Y、X292C、X292D、X292F、X292I、X292L、X292T、X292W、X292Y、X293D、X293E、X293F、X293K、X293R、X294G、X294T、X295F、X296A、X296C、X296L、X296Y、X297E、X297F、X297H、X297K、X297M、X297S、X297V、X299G、X299I、X299K、X299L、X299S、X299Y、X29D、X29E、X29F、X29G、X29H、X29I、X29K、X29L、X29N、X29P、X29Q、X29V、X29W、X29Y、X2I、X2S、X301F、X302H、X302I、X302Q、X302V、X302Y、X303E、X303H、X303I、X303K、X303L、X303M、X303N、X303P、X303R、X303T、X304A、X304D、X304E、X304H、X304K、X304M、X304N、X304P、X304R、X304T、X304W、X304Y、X306A、X306D、X306E、X306G、X306H、X306I、X306M、X306Q、X306R、X306S、X306T、X306V、X306W、X306Y、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X30A、X30E、X30F、X30G、X30H、X30I、X30K、X30L、X30M、X30Q、X30T、X30W、X30Y、X310A、X310Q、X311A、X311E、X311G、X311H、X311K、X311N、X311R、X311T、X311Y、X312L、X312M、X313V、X314C、X314E、X314K、X314Q、X315A、X315C、X315E、X315H、X315K、X315T、X318I、X318S、X318T、X319A、X319D、X319H、X319I、X319K、X319M、X319N、X319P、X319S、X319T、X319W、X31N、X31Q、X31S、X31T、X31V、X31W、X320A、X320C、X320D、X320E、X320G、X320H、X320K、X320L、X320N、X320Q、X320S、X320Y、X321A、X321E、X321K、X321N、X321T、X321V、X321W、X323A、X323G、X323K、X323L、X323V、X324K、X324L、X324M、X324W、X324Y、X326G、X326N、X326S、X326Y、X327C、X327L、X327M、X32A、X32D、X32E、X32F、X32H、X32I、X32L、X32M、X32N、X32P、X32Q、X32T、X32W、X333I、X334T、X336K、X337A、X337C、X337F、X337G、X337I、X337K、X337L、X337M、X337N、X337Q、X337R、X337S、X337T、X337V、X337Y、X338G、X338S、X338T、
X33D、X33E、X33H、X33K、X33M、X33Q、X33R、X33Y、X341V、X342P、X343L、X343T、X343W、X343Y、X344I、X344Q、X344V、X345D、X345G、X345M、X345N、X345Q、X345S、X345T、X346A、X346C、X346D、X346G、X346H、X346N、X346Q、X348T、X34H、X34I、X34V、X350H、X350K、X350P、X351A、X351M、X352S、X353H、X354I、X354N、X354T、X354Y、X355I、X355M、X356I、X356V、X357A、X358I、X358L、X358N、X358P、X358V、X359E、X35A、X35C、X35D、X35G、X35H、X35I、X35L、X35M、X35N、X35P、X35Q、X35R、X35S、X35T、X35V、X35Y、X360A、X360F、X360G、X360I、X360L、X360N、X360Q、X360R、X360S、X360T、X360V、X360Y、X362F、X362K、X362M、X362N、X362T、X362V、X362Y、X363A、X363C、X363D、X363E、X363G、X363H、X363K、X363L、X363M、X363P、X363Q、X363R、X363S、X363T、X363V、X363W、X363Y、X364A、X364C、X364G、X364K、X364L、X364N、X364S、X364T、X364V、X366I、X366L、X366T、X367E、X367S、X368A、X368F、X368L、X368N、X36A、X36E、X36G、X36I、X36K、X36M、X36N、X36P、X36Q、X36R、X36S、X36T、X36V、X370E、X370I、X372A、X372C、X372E、X372F、X372H、X372M、X372N、X372Q、X375A、X375D、X375E、X375I、X375K、X375Q、X375R、X375T、X375W、X375Y、X376G、X376I、X376K、X376L、X376M、X376Q、X376R、X376S、X376V、X377Q、X378C、X378D、X378E、X378R、X379A、X379L、X379S、X37A、X37G、X37M、X37P、X37T、X37V、X37W、X381E、X381V、X382A、X382H、X382K、X382L、X382N、X382Q、X382S、X383C、X383D、X383E、X383H、X383I、X383M、X383N、X383Q、X383R、X383S、X383V、X383Y、X384A、X384C、X384D、X384E、X384F、X384I、X384L、X384M、X384N、X384Q、X384R、X384T、X384V、X384W、X384Y、X385A、X385C、X385D、X385E、X385F、X385G、X385H、X385I、X385L、X385M、X385N、X385P、X385Q、X385R、X385S、X385T、X385V、X385W、X385Y、X387C、X387E、X387N、X388E、X388F、X388H、X388I、X388M、X388R、X388V、X389G、X389H、X389K、X38N、X390D、X390F、X390M、X390N、X390P、X390R、X391A、X391F、X391G、X391K、X391M、X391N、X391Q、X391S、X391T、X391Y、X392C、X392V、X393E、X393H、X393P、X393S、X393V、X394A、X394C、X394E、X394H、X394I、X394L、X394M、X394N、X394R、X394S、X395A、X395H、X395M、X395V、X396H、X396P、X397D、X397H、X397P、X397S、X398M、X399P、X39E、X39K、X3A、X3F、X3G、X3I、X3K、X3L、X3Q、X3V、
X400A、X400D、X400E、X400G、X400H、X400I、X400K、X400L、X400M、X400N、X400P、X400Q、X400R、X400S、X400V、X400W、X401I、X401K、X401M、X401T、X403N、X405C、X405H、X405M、X405T、X405V、X406P、X407D、X407R、X407S、X408E、X408I、X408Q、X40I、X40S、X410H、X410I、X410K、X410L、X410P、X410R、X410Y、X413S、X414C、X414E、X414S、X415E、X415I、X416S、X418C、X418N、X418P、X41C、X41D、X41E、X41G、X41Q、X41S、X41T、X421N、X421P、X424A、X426D、X426W、X427C、X427F、X427G、X427K、X427Q、X427R、X427S、X427T、X427V、X429A、X429D、X429E、X429F、X429G、X429I、X429M、X429N、X429P、X429Q、X429S、X429T、X429V、X429W、X42C、X42I、X42Q、X42V、X431I、X434S、X436E、X438F、X438P、X438Y、X439K、X439C、X439P、X440V、X442Q、X443H、X443T、X445A、X445C、X445D、X445F、X445G、X445H、X445K、X445M、X445Q、X445R、X445S、X445T、X445V、X446F、X446I、X446L、X446P、X446Q、X446R、X446V、X446W、X447V、X448D、X448E、X448H、X448N、X449A、X449F、X449G、X449K、X449L、X449M、X449N、X449P、X449Q、X449R、X449S、X449V、X449W、X449Y、X451L、X453G、X453I、X453N、X453P、X453Y、X455L、X456L、X456M、X456R、X456S、X456V、X456W、X456Y、X457A、X457C、X457E、X457F、X457G、X457K、X457L、X457M、X457R、X457S、X457T、X457V、X457W、X458I、X458K、X458V、X458W、X459C、X459D、X459E、X459I、X459K、X459N、X459Q、X459R、X459V、X459Y、X45G、X45N、X460A、X460D、X460E、X460G、X460Q、X460R、X460S、X460T、X460V、X461A、X461E、X461F、X461K、X461L、X461M、X461N、X461Q、X461R、X461S、X461V、X462K、X463L、X465H、X465P、X465R、X465V、X467A、X467E、X467H、X468D、X468H、X470A、X470Q、X470T、X471E、X474F、X474H、X474P、X478A、X478E、X47S、X480D、X480E、X480M、X480R、X480Y、X482C、X482T、X482W、X48F、X48I、X48M、X48Y、
X4A、X4C、X4K、X4M、X4Q、X4R、X4S、X51Q、X51T、X51V、X54D、X54G、X54Q、X59T、X5A、X5C、X5D、X5E、X5F、X5H、X5I、X5K、X5L、X5M、X5N、X5P、X5Q、X5R、X5V、X5Y、X60T、X63C、X63V、X6A、X6C、X6E、X6F、X6G、X6H、X6K、X6L、X6M、X6P、X6Q、X6S、X6T、X6V、X6W、X6Y、X70F、X70H、X70L、X70M、X70N、X70Y、X71D、X72C、X72D、X72E、X72N、X72T、X73L、X73N、X73Q、X75A、X75G、X75I、X75L、X75P、X75T、X75W、X76C、X76E、X76G、X76L、X76T、X76V、X7C、X7E、X7F、X7H、X7K、X7N、X7P、X7Q、X7R、X7S、X7V、X7W、X7Y、X81H、X81L、X82K、X82M、X83A、X83D、X83E、X83G、X83R、X83S、X86K、X87D、X87R、X89A、X89C、X89F、X89G、X89L、X89M、X89R、X89S、X8A、X8C、X8F、X8I、X8M、X8P、X8S、X8V、X8W、X8Y、X90A、X90D、X90E、X90F、X90G、X90I、X90M、X90N、X90Q、X90R、X90S、X90V、X90Y、X91C、X91D、X91E、X91F、X91G、X91H、X91I、X91K、X91L、X91M、X91N、X91Q、X91S、X91T、X91V、X91W、X91Y、X92D、X92M、X92V、X93K、X93Q、X94A、X94D、X94E、X94K、X94M、X94V、X94Y、X95E、X95I、X95L、X95V、X96K、X96N、X96Q、X97V、X98E、X98G、X98N、X99H、X99K、X99N、X100W及びX1Gからなる群から選択され、好ましくはX4Q、X25H、X100W、X135E、X135T、X135W、X135D、X160W、X176K、X193E、X251E、X258Q、X276R、X299S、X323G、X363E、X363H、X382Q、X405M、X460G及びX482Wからなる群から選択され、任意選択により、アルファ-アミラーゼバリアントは、1~50個、好ましくは1~30、1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5個、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~8又は2~5個、好ましくは3~30、3~25、3~20、3~15、3~10、3~8又は3~5個、好ましくは4~30、4~25、4~20、4~15、4~10又は4~8個の保存的アミノ酸交換をさらに含む。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、
X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y+X482W、X25H+X186E+X206Y+X405M+X482W、X25H+X186E+X206Y+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X206Y+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X193E+X251E+X186E+X482W、X4Q+X193E+X206Y+X276R+X186E+X482W、X186E+X25H+X482W、X25H+X193E+X206Y+X251E+X276R+X405M+X186E+X482W、X25H+X251E+X186E+X482W、X25H+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X193E+X206Y+X405M+X186E+X482W、X3I+X356V、X3I+X356I、X83D+X94E、X94D+X125E、X131I+X377Q+X410H、X48F+X94D、X48Y+X116K+X218K、X5L+X218K+X225S、X83E+X116R+X158Y+X181E、X51V+X218K、X83E+X181E、X4Q+X7W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X37M+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25Y+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X118D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X182D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X258Q+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363H+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363N+X405M、X4Q+X176K+X181D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181F+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181N+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X136E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X100W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135T+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、
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X25H+X176K+X251E、
X25H+X176K+X251E+X405M、
X25H+X176K+X251E+X405M+X482W、
X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
X116K+X181T、
X116K+X181T+X225A、
X181T+X225A+X320K、及び
X116K+X181T+X225A+X320K
からなる群から選択され、好ましくは、
N25H+R176K+G186E+I206Y+R181Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+T193E、N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E+I206Y、N25H+G186E+I206Y+L405M、N25H+G186E+I206Y、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E、G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E+I206Y、G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M、G4Q+I206Y+N460G、G4Q+N25H+R176K+I206Y+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+T193E+T251E+G186E、G4Q+T193E+I206Y+E276R+G186E、G186E+N25H、N25H+T193E+I206Y+T251E+E276R+L405M+G186E、N25H+T251E+G186E、N25H+Y160W+R176K+G186E+T251E+L405M、T193E+I206Y+L405M+G186E、N25H+R176K+G186E+I206Y+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+R181Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Q359R、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+G258Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y135T+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+G258Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+Y482W、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+Y482W、
G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+L405M+Y482W、N25H+G186E+I206Y+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+N460G、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+N460G+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+N460G+Y482W、N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+Y482W、N25H+R176K+G186E+N195F+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+Y482W、G4Q+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+L405M+Y482W、N25H+G186E+N195F+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+N460G、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+N460G+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+N460G+Y482W、
G4Q+N25H、
G4Q+N25H+R176K、
G4Q+N25H+R176K+G186E、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+W439K、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、
G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+W439K+Y482W、
G4Q+N25H+R176K+T251E、
G4Q+N25H+R176K+T251E+L405M+W439K、
G4Q+N25H+R176K+T251E+L405M+Y482W、
G4Q+N25H+R176K+T251E+L405M+W439K+Y482W、
N25H+R176K、
N25H+R176K+G186E、
R176K+G186E、
N25H+R176K+G186E+T251E、
N25H+R176K+G186E+T251E+L405M、
N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、
N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+W439K+Y482W、
N25H+R176K+T251E、
N25H+R176K+T251E+L405M、
N25H+R176K+T251E+L405M+Y482W、
N25H+R176K+T251E+L405M+W439K+Y482W、
X116K+X181T、
X116K+X181T+X225A、
X116K+X181T+X225A+X320K、及び
X181T+X225A+X320K、
より好ましくは、X116K+X181T+X225A、X181T+X225A+X320K、X116K+X181T+X225A+X320K、N25H+R176K+G186E、N25H+R176K+G186E、N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W又はG4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、最も好ましくはN25H+R176K+G186E、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W又はX116K+X181T+X225A+X320K
からなる群から選択されるアミノ酸置換の組み合わせの1つを有して、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
本明細書に記載されるとおりの1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換を有し且つアルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、親アミラーゼのアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
本明細書に記載されるとおりの1つ以上のアミノ酸置換を有し且つアルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、親アミラーゼのアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
一実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号4に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号15に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号16に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号18に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号19に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号20に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号21に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号22に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号24に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号25に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号26に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号27に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号28に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号29に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号30に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号31に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号32に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号33に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号34に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号35に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号36に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号37に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号38に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号39に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号40に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号41に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号4に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
より好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有し且つ本明細書に記載されるアミノ酸置換の1つ以上を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性又は配列類似性を含む。
アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、
(a)配列番号1と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を有するアミノ酸配列;
(b)配列番号2と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列、
(c)高いストリンジェンシー条件下において、
(i)配列番号1のコード配列;又は
(ii)配列番号2に示されるポリヌクレオチド
の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列;
(d)配列番号2と少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列(ポリヌクレオチドは、単に遺伝暗号の縮重によって配列番号2と異なる)、又は
(e)アミラーゼ活性を有する(a)、(b)又は(c)の断片
をさらに含む。
特に好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも少なくとも91.0%、少なくとも91.5%、少なくとも92.0%、少なくとも92.5%、少なくとも93.0%、少なくとも93.5%、94.0%、少なくとも94.5%、少なくとも95.0%、少なくとも95.5%、少なくとも96.0%、少なくとも96.5%、少なくとも97.0%、少なくとも97.5%、少なくとも98.0%、少なくとも98.5%、少なくとも99.0%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%であるが、100%未満の配列同一性又は配列類似性を含む。アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも少なくとも91.0%、少なくとも91.5%、少なくとも92.0%、少なくとも92.5%、少なくとも93.0%、少なくとも93.5%、94.0%、少なくとも94.5%、少なくとも95.0%、少なくとも95.5%、少なくとも96.0%、少なくとも96.5%、少なくとも97.0%、少なくとも97.5%、少なくとも98.0%、少なくとも98.5%、少なくとも99.0%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも95.0%、少なくとも95.5%、少なくとも96.0%、少なくとも96.5%、少なくとも97.0%、少なくとも97.5%、少なくとも98.0%、少なくとも98.5%、少なくとも99.0%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%であるが、100%未満の配列同一性又は配列類似性を含む。
アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも95.0%、少なくとも95.5%、少なくとも96.0%、少なくとも96.5%、少なくとも97.0%、少なくとも97.5%、少なくとも98.0%、少なくとも98.5%、少なくとも99.0%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも95.0%であるが、100%未満の配列同一性を含む。
アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含み、且つA及びBドメイン並びにCドメインを含み、A及びBドメインのアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも、96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満同一であり、Cドメインのアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも、96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満同一である。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上、好ましくは1~50個、好ましくは1~30個、好ましくは1~25個、好ましくは1~20個、好ましくは1~15個、好ましくは1~10個又は好ましくは1~5個を有する、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上、好ましくは1~50個、好ましくは1~30個、好ましくは1~25個、好ましくは1~20個、好ましくは1~15個、好ましくは1~10個又は好ましくは1~5個を有し、且つ1~50個、好ましくは1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸改変、好ましくはアミノ酸置換を有する、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態では、これらの1~50個の追加のアミノ酸置換は、好ましくは、親アルファ-アミラーゼのいずれかの機能性ドメインの外部での、好ましくは触媒活性ドメインの外部での保存的アミノ酸置換である。好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上を有し且つ1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸改変、好ましくはアミノ酸置換を有する、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態では、これらの1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸置換は、好ましくは、親アルファ-アミラーゼのいずれかの機能性ドメインの外部での、好ましくは触媒活性ドメインの外部での保存的アミノ酸置換である。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上を有し且つ触媒活性ドメインの外部で1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸置換を有する、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上を有し、且つ好ましくは触媒活性ドメインの外部で1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上、好ましくは1~50個、好ましくは1~30個、好ましくは1~25個、好ましくは1~20個、好ましくは1~15個、好ましくは1~10個又は好ましくは1~5個を有する、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上、好ましくは1~50個、好ましくは1~30個、好ましくは1~25個、好ましくは1~20個、好ましくは1~15個、好ましくは1~10個又は好ましくは1~5個を有し、且つ1~50個、好ましくは1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸改変、好ましくはアミノ酸置換を有する、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態では、これらの1~50個の追加のアミノ酸置換は、好ましくは、親アルファ-アミラーゼのいずれかの機能性ドメインの外部での、好ましくは触媒活性ドメインの外部での保存的アミノ酸置換である。好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上を有し且つ1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸改変、好ましくはアミノ酸置換を有する、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。一実施形態では、これらの1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸置換は、好ましくは、親アルファ-アミラーゼのいずれかの機能性ドメインの外部での、好ましくは触媒活性ドメインの外部での保存的アミノ酸置換である。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上を有し且つ触媒活性ドメインの外部で1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加のアミノ酸置換を有する、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、上記のアミノ酸置換の1個以上を有し、且つ好ましくは触媒活性ドメインの外部で1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
アルファ-アミラーゼの構造は、3つの別々のドメインA、B及びCを含み、例えばMachius et al.,1995,J.Mol.Bio/.246:545-559を参照されたい。本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントは、1つ以上の非触媒的CBM(炭水化物結合ドメイン又は特にアミラーゼに関して、デンプン結合ドメインとも呼ばれる炭水化物結合モジュール)をさらに含み得る。CBMは、酵素と基質の会合を向上させることができる。CBMは、C-ドメインに結合される。好ましくは、本発明のアミラーゼは、炭水化物結合ドメインを含まない。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、A、B及びCドメインである3つのドメインのみからなる。
本明細書で使用する場合、アルファ-アミラーゼの「A及びBドメイン」又は「ABドメイン」は、配列番号3のアミノ酸1~399と整列しているアミノ酸に対応する。本明細書で使用する場合、アルファ-アミラーゼの「Cドメイン」は、配列番号3のアミノ酸400~485と整列しているアミノ酸に対応する。
好ましくは、上記のとおりのアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、好ましくは置換の1つ以上を含むアルファ-アミラーゼバリアントは、異なる親アミラーゼ由来のそのドメイン、特にそのABドメイン及びそのCドメインを含むハイブリッドアミラーゼである。アルファ-アミラーゼバリアントは、アルファ-アミラーゼのCドメイン又はその一部を別のアルファ-アミラーゼのCドメイン又はその一部で置換することによって生成され得る。好ましくは、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントのA及びBドメインは、配列番号3のアルファ-アミラーゼのA及びBドメインと少なくとも75%の同一性、例えば少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有する。
好ましくは、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントのA及びBドメインは、配列番号6と少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有し、A及びBドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号6と少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。
好ましくは、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントのCドメインは、配列番号5のアルファ-アミラーゼのCドメインと少なくとも75%、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有するCドメインを含む。
好ましくは、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントのCドメインは、配列番号8と少なくとも75%、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有する。
本発明の一実施形態では、A及びBドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有し、Cドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号8と少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有する。
本発明の一実施形態では、A及びBドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸配列と100%の同一性を有し、Cドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号8と少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有する。
本発明の一実施形態では、A及びBドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有し、Cドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号8と100%の同一性を有する。
一実施形態では、本発明は、少なくとも2種の異なるアミラーゼからハイブリッドを作製する工程(ハイブリッドは、A及びBドメイン並びにCドメインを含み、A及びBドメインのアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも75%、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%又は100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも75%、好ましくは少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%又は100%同一である)及びハイブリッドに本明細書に記載されるとおりの1つ以上のアミノ酸改変を導入する工程を含むアルファ-アミラーゼバリアントを作製する方法に関する。
一実施形態では、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1及び/又は配列番号3に示されるとおりのアルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1に示されるとおりのアルファ-アミラーゼと比較して、1つ以上の改善された特性を示す。
好ましくは、改善された特性は、>1.0の改善度(IF)として表される。好ましくは、改善された熱安定性及び改善された洗浄性能に関して、改善は、改善度として表される。好ましくは、改善度は、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、1.9以上又は2.0以上である。好ましくは、洗浄性能に関するIFは、1.1以上、1.2以上又は1.3以上である。好ましくは、熱安定性に関するIFは、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上又は2.0以上である。
代わりに、アミラーゼ特性の改善は、親アルファアミラーゼと比較した改善のパーセンテージとして示される。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1又は配列番号3に示されるとおりのアルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、少なくとも0.5%、少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも110%、少なくとも120%、少なくとも130%、少なくとも140%、少なくとも150%、少なくとも160%、少なくとも170%、少なくとも180%、少なくとも190%又は少なくとも200%の改善された特性を示す。
代わりに、特に安定性の改善に関して、アミラーゼ特性の改善は、安定性負荷後の残存活性として示される。好ましくは、保管安定性は、それぞれの保管条件下での保管後、好ましくは洗剤組成物(好ましくは洗濯又は食器洗浄洗剤、好ましくは洗濯洗剤)中での保管後の残存活性として示される。好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントの残存活性は、親アミラーゼと比較して増大される。好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントの残存活性は、親アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1及び/又は3に示されるとおりのアミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、少なくとも0.5%、少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも110%、少なくとも120%、少なくとも130%、少なくとも140%、少なくとも150%、少なくとも160%、少なくとも170%、少なくとも180%、少なくとも190%又は少なくとも200%改善される。親アミラーゼと比較した残存活性も、親アミラーゼの残存活性に対するバリアントの残存活性の比を形成することによって改善度に変換され得る。
好ましくは、改善された特性は、発現、活性、安定性、熱安定性、比活性、基質特異性、pH依存活性、pH安定性、酸化安定性、触媒効率、触媒速度、化学的安定性、pH活性、保管条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質安定性、表面特性、熱活性、Ca2+依存性、洗剤中での性能、洗濯洗剤中での性能、ADW洗剤中での性能における増大からなる群から選択される1つ以上の特性である。好ましくは、改善された活性は、改善された比活性、基質特異性、pH依存活性、触媒効率、触媒速度、pH活性、基質結合、基質切断、熱活性、Ca2+依存性、洗浄性能、洗濯洗剤の洗浄性能及び/又はADW洗剤の洗浄性能である。好ましくは、改善された安定性は、改善された熱安定性、洗剤組成物(好ましくは洗濯又は食器洗浄洗剤組成物、好ましくは洗濯洗剤組成物)中での安定性、pH安定性、酸化安定性、化学的安定性、保管条件下での安定性、基質安定性及び/又は熱活性である。好ましくは、改善された特性は、改善された発現、改善された溶解性、改善された熱安定性、洗剤組成物中での改善された熱安定性、洗剤組成物中での保管における改善された安定性及び/又は改善された性能の洗浄性能である。好ましくは、改善された特性は、改善された熱安定性、好ましくは洗剤組成物中での改善された熱安定性、洗剤組成物中での保管下における改善された安定性及び/又は改善された洗浄性能である。好ましくは、改善された特性は、改善された熱安定性、洗剤組成物中での改善された熱安定性、保管条件下での改善された安定性、好ましくは洗剤組成物中での保管下における改善された安定性、好ましくは洗濯洗剤中での保管下における改善された安定性及び/又はADW洗剤中での保管下における改善された安定性、改善された洗浄性能、好ましくは洗濯洗剤の改善された洗浄性能及び/又はADW洗剤の改善された洗浄性能である。
本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントは、広い温度範囲にわたって活性であり得るが、温度は、約10℃~約95℃の範囲の任意の点である。アルファ-アミラーゼバリアントは、10℃~55℃、10℃~50℃、10℃~45℃、10℃~40℃、10℃~35℃、10℃~30℃又は10℃~25℃の温度範囲で活性であり得る。バリアントポリペプチドは、20℃~55℃、20℃~50℃、20℃~45℃、20℃~40℃、20℃~35℃、20℃~30℃又は20℃~25℃の温度範囲で活性であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して熱安定性を改善し、好ましくは洗剤組成物(好ましくは洗濯又は食器洗浄洗剤組成物、好ましくは洗濯洗剤組成物)中での熱安定性の改善である。別の実施形態では、バリアントポリペプチドは、親アルファ-アミラーゼと比較して、熱安定性を1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃又はそれを超える度C改善する。別の実施形態では、熱安定性の増大は、40℃~100℃の温度で測定される。一実施形態では、熱安定性は、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃又は90℃、好ましくは60℃又は70℃で改善される。別の実施形態では、熱安定性は、40℃~90℃、好ましくは60℃~85℃、好ましくは60℃~80℃の温度範囲で改善される。
したがって、好ましくは、改善された特性は、改善された安定性、好ましくは熱安定性である。好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された安定性、好ましくは熱安定性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、117、119、125、126、128、129、131、132、133、134、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、160、161、162、164、165、170、172、173、174、175、176、184、188、191、203、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、259、261、262、263、264、265、268、270、272、273、274、276、279、280、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、299、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、318、318、319、320、321、323、324、326、327、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、357、359、360、362、363、364、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、474、478、480及び482に対応する1つ以上の位置(配列番号3の付番に従う)でアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、好ましくは置換を含むアミラーゼである。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された安定性、好ましくは熱安定性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X1G、X1V、X1R、X2S、X2I、X3Q、X3K、X3F、X3G、X3L、X4Q、X4R、X4S、X4K、X4M、X4A、X4C、X5F、X5E、X5M、X5Y、X5R、X5Q、X5K、X5L、X5A、X5V、X5C、X5N、X5H、X5D、X5P、X5I、X6T、X6E、X6A、X6K、X6Q、X6V、X6M、X6G、X6L、X6H、X6W、X6F、X6P、X6S、X6C、X6Y、X7Y、X7S、X7H、X7C、X7Q、X7F、X7P、X7W、X7R、X7K、X7E、X7V、X7N、X8C、X8V、X8F、X8Y、X8P、X8W、X8A、X8S、X8M、X8I、X10W、X10Y、X10L、X10C、X10E、X10F、X10A、X12N、X12S、X13A、X13Y、X14N、X15R、X16F、X16R、X17K、X17V、X18R、X18M、X18F、X18K、X18T、X18I、X19P、X19L、X19F、X19Y、X19T、X19I、X19Q、X19C、X19H、X19S、X19M、X19K、X19G、X19D、X19A、X20C、X20S、X20L、X20M、X20T、X20D、X20Q、X20F、X20P、X20G、X20V、X20W、X20A、X20Y、X20H、X20K、X20E、X21S、X21E、X22E、X22F、X22A、X22D、X22M、X22T、X22K、X22Y、X22G、X22R、X22Q、X22W、X22L、X23N、X23Q、X23W、X24G、X25H、X25Y、X25K、X25F、X25S、X25C、X25D、X25A、X25G、X25W、X25Q、X25M、X25L、X26S、X26V、X26M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26P、X26Y、X26L、X27D、X27I、X27F、X27R、X27G、X27Q、X27V、X27T、X27A、X27H、X28N、X28S、X28F、X28C、X28E、X28T、X28G、X28K、X28D、X28V、X28I、X28Q、X29Y、X29L、X29P、X29W、X29K、X29F、X29N、X29H、X29D、X29V、X29G、X29Q、X29I、X30F、X30I、X30A、X30K、X30W、X30Y、X30M、X30L、X30H、X30Q、X30G、X30E、X30T、X31S、X31V、X31Q、X31T、X31N、X31W、X32T、X32H、X32W、X32F、X32Q、X32I、X32A、X32P、X32E、X32M、X32N、X32D、X32L、X33Y、X33D、X33M、X33Q、X33K、X33R、X34H、X34V、X34I、X35C、X35Y、X35P、X35T、X35M、X35H、X35A、X35V、X35I、X35G、X35Q、X35D、X35N、X35R、X35S、X35L、X36V、X36I、X36T、X36K、X36A、X36S、X36R、X36M、X36E、X36P、X36G、X36N、X36Q、X37P、X37V、X37W、X37A、X37G、X38N、X39E、X39K、X40I、X40S、X41G、X41Q、X41C、X41D、X41E、X41S、X41T、X42Q、X42V、X42I、X42C、X45N、X45G、X47S、X48F、X48I、X48M、X51T、X59T、X60T、X63V、X63C、X70N、X70L、X70M、X70F、X70Y、X71D、X72T、X72E、X72D、X72N、X72C、X73Q、X73L、X73N、X75A、X75I、X75W、X75P、X75G、X75T、X76G、X76T、X76C、X76V、X76E、X76L、X81H、X82M、X82K、X83G、X83R、X83S、X86K、X89F、X89A、X89C、X89L、X89G、X89M、X89S、X89R、X90Q、X90F、X90G、X90E、X90A、X90N、X90I、X90R、X90Y、X90V、X90S、X90M、X90D、X91S、X91Y、X91K、X91Q、X91F、X91H、X91T、X91I、X91W、X91N、X91V、X91L、X91C、X91G、X91D、X91E、X91M、X92V、X92M、X92D、X93K、X93Q、X94M、X94K、X94Y、X94D、X94A、X94V、X95V、X95I、X95E、X95L、X96N、X96K、X97V、X98G、X98E、X98N、X99K、X99H、X99N、X100D、X100K、X100L、X100F、
X103A、X106D、X108A、X109A、X113Y、X113H、X113M、X113V、X113F、X113W、X113R、X114D、X114H、X114N、X114W、X114E、X114C、X114G、X114L、X114M、X114Q、X114F、X114A、X114V、X114K、X114S、X114Y、X114R、X114I、X115C、X115K、X115N、X115T、X115M、X115S、X115Q、X115R、X115D、X115V、X116L、X117D、X117Y、X117N、X117C、X117R、X117W、X117A、X117I、X117P、X117F、X119Y、X119R、X119P、X119H、X125A、X125K、X125L、X125T、X125R、X125F、X125W、X125Q、X125V、X125Y、X125H、X125N、X125E、X125G、X125M、X126D、X128C、X128L、X128Y、X128E、X128W、X128M、X129E、X131I、X131C、X132T、X133E、X133P、X133C、X133D、X133Q、X133S、X133H、X133A、X133N、X133K、X134Y、X134W、X134F、X134P、X134E、X134V、X134L、X134M、X134T、X134C、X134I、X135M、X136D、X136E、X136F、X136M、X136P、X136H、X136C、X136A、X136W、X136L、X136N、X139C、X141V、X142C、X142W、X142Y、X142L、X142M、X142Q、X142F、X142E、X142R、X143F、X144Q、X144C、X144V、X144K、X144T、X144Y、X144E、X144G、X144N、X144S、X144R、X145A、X146C、X146H、X146K、X146T、X146E、X146S、X146D、X146W、X146F、X146L、X146G、X147M、X149E、X150Q、X150E、X150C、X151C、X151E、X154Y、X154A、X155Y、X156V、X160W、X161T、X162V、X164V、X165W、X169E、X169V、X170F、X170C、X172C、X172K、X172A、X173I、X173Y、X174P、X174M、X174E、X174S、X174H、X175G、X175Q、X175H、X176K、X188V、X188H、X191K、X191H、X191F、X191W、X191Y、
X203E、X203R、X210D、X210C、X210E、X210N、X210F、X210Y、X210M、X210Q、X210S、X210A、X211D、X211N、X211C、X211T、X211E、X211G、X211V、X211Q、X211A、X211H、X211L、X211S、X212W、X212L、X212I、X212D、X212C、X213A、X213S、X213M、X213R、X213C、X214P、X214E、X215E、X215D、X215H、X215W、X215A、X216H、X216G、X218Q、X218E、X218C、X218N、X218F、X218S、X218G、X218K、X218I、X218T、X218D、X218Y、X218H、X218L、X218V、X218A、X218W、X219E、X219Q、X219K、X219T、X219M、X219D、X219F、X219S、X219R、X219A、X219Y、X219H、X219W、X219G、X219C、X221N、X221F、X222S、X222T、X222D、X223V、X223Y、X223L、X223C、X224V、X224F、X225A、X225R、X225N、X225E、X225H、X225F、X225C、X225Y、X225I、X226C、X226W、X226I、X226R、X226Y、X226D、X226L、X226M、X226G、X226T、X226Q、X226S、X226A、X226V、X226E、X226H、X227W、X227C、X227T、X227R、X227M、X227K、X227Y、X227V、X227F、X227I、X227H、X227L、X227G、X230A、X230F、X231N、X231C、X233T、X233W、X233H、X233C、X233I、X233Y、X233M、X234C、X235M、X235V、X235L、X236Y、X237C、X237I、X238T、X240M、X242M、X243F、X245E、X245M、X245H、X249D、X249I、X250V、X251E、X251A、X251L、X251S、X251M、X251F、X252C、X252I、X252S、X253Y、X253G、X255T、X255V、X255D、X255F、X255I、X256C、X257Y、X257L、X257V、X259L、X261R、X262D、X262Y、X262C、X262P、X262E、X262H、X263I、X264T、X264W、X264H、X265S、X268G、X270A、X270Y、X272L、X272G、X273H、X273V、X273L、X273M、X273C、X273D、X273W、X273F、X273A、X273E、X273P、X273Y、X273R、X273I、X274S、X276Y、X276K、X276L、X276D、X279P、X280I、X280V、X280N、X280H、X280Y、X280K、X280R、X284Y、X284A、X284L、X284F、X284H、X284N、X284M、X285N、X285L、X285G、X285P、X286Q、X287E、X287H、X287A、X287D、X287T、X288K、X288P、X288Y、X288A、X289T、X289R、X289G、X289F、X290Q、X290N、X290M、X290D、X290W、X291D、X291Y、X291K、X291T、X292W、X292Y、X292F、X292D、X292L、X292I、X292T、X292C、X293D、X293R、X293K、X293E、X293F、X294T、X294G、X295F、X296Y、X296L、X296C、X296A、X297M、X297K、X297S、X297H、X297V、X297E、X297F、X299L、X299G、X299I、X299K、X299S、X299Y、
X301F、X302H、X302I、X302Q、X302Y、X302V、X303P、X303M、X303E、X303I、X303R、X303K、X303N、X303L、X303H、X303T、X304H、X304A、X304R、X304Y、X304D、X304N、X304M、X304E、X304P、X304W、X304K、X304T、X306M、X306E、X306A、X306G、X306W、X306V、X306S、X306I、X306H、X306T、X306D、X306Q、X306Y、X306R、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X310Q、X310A、X311G、X311E、X311H、X311A、X311K、X311T、X311N、X311R、X311Y、X312M、X312L、X313V、X314C、X314Q、X315C、X315A、X315H、X315T、X315E、X315K、X318T、X318S、X318I、X319K、X319H、X319P、X319A、X319I、X319D、X319M、X319S、X319N、X319T、X319W、X320G、X320Y、X320L、X320N、X320A、X320D、X320K、X320Q、X320E、X320H、X320C、X320S、X321E、X321W、X321T、X321A、X321N、X321V、X321K、X323K、X323G、X324W、X324K、X324Y、X326Y、X326N、X326G、X326S、X327M、X327C、X327L、X333I、X336K、X337N、X337K、X337M、X337T、X337V、X337Q、X337S、X337R、X337I、X337Y、X337G、X337F、X337A、X337L、X338G、X338T、X338S、X341V、X342P、X343W、X343Y、X344I、X344Q、X344V、X345N、X345T、X345M、X345G、X345S、X345D、X345Q、X346D、X346C、X346H、X346A、X346G、X346Q、X346N、X348T、X350P、X350H、X350K、X351M、X351A、X352S、X353H、X354Y、X354N、X354T、X354I、X355I、X355M、X357A、X358P、X359E、X360N、X360R、X360S、X360Y、X360V、X360L、X360A、X360I、X360T、X360G、X360F、X362T、X362M、X362V、X362N、X362Y、X362F、X362K、X363M、X363G、X363S、X363V、X363C、X363T、X363H、X363P、X363D、X363L、X363R、X363Q、X363E、X363Y、X363K、X363W、X363A、X364G、X364T、X364S、X364A、X364V、X364C、X364K、X364L、X364N、X366I、X366L、X366T、X367S、X367E、X368N、X368L、X368A、X370E、X370I、X372C、X372H、X372A、X372F、X372M、X372Q、X372N、X372E、X375K、X375A、X375D、X375E、X375R、X375T、X375I、X375W、X375Y、X375Q、X376S、X376R、X376M、X376I、X376V、X376Q、X376L、X378E、X378R、X378D、X378C、X379L、X379A、X379S、X381V、X381E、X382N、X382H、X382Q、X382K、X382A、X382S、X383R、X383I、X383D、X383V、X383M、X383E、X383N、X383S、X383Q、X383Y、X383C、X383H、X384W、X384Y、X384V、X384R、X384N、X384E、X384A、X384D、X384T、X384C、X384F、X384L、X384I、X384M、X384Q、X385G、X385V、X385T、X385Y、X385I、X385D、X385C、X385Q、X385A、X385W、X385L、X385H、X385M、X385N、X385S、X385F、X385E、X385R、X385P、X387N、X387C、X387E、X388R、X388F、X388H、X388V、X388E、X388M、X388I、X389G、X389K、X389H、X390P、X390N、X390R、X390F、X390M、X390D、X391T、X391F、X391S、X391A、X391G、X391M、X391N、X391Y、X391Q、X391K、X392C、X392V、X393V、X393E、X393H、X393S、X393P、X394C、X394L、X394R、X394S、X394A、X394E、X394N、X394M、X394H、X394I、X395V、X395M、X395A、X395H、X396P、X396H、X397P、X397D、X397S、X397H、X398M、X399P、X400L、X400P、X400I、X400S、X400A、X400R、X400Q、X400D、X400K、X400N、X400V、X400W、X400H、X400E、X400G、X400M、
X401M、X401K、X401T、X401I、X403N、X405H、X405V、X405T、X405C、X406P、X407S、X407R、X407D、X408Q、X408E、X408I、X410R、X410K、X410I、X410L、X410H、X413S、X414E、X414C、X414S、X415I、X415E、X416S、X418C、X418P、X418N、X421P、X421N、X424A、X426D、X426W、X427Q、X427C、X427F、X427T、X427V、X427G、X427S、X427R、X427K、X429M、X429D、X429E、X429N、X429T、X429A、X429P、X429W、X429Q、X429S、X429F、X429G、X429I、X429V、X431I、X436E、X438P、X438F、X438Y、X439K、X439C、X439P、X440V、X442Q、X443T、X443H、X445M、X445T、X445A、X445G、X445S、X445F、X445R、X445Q、X445C、X445D、X445K、X445H、X445V、X446P、X446I、X446V、X446F、X446L、X446R、X446Q、X446W、X447V、X448E、X448H、X448N、X448D、X449V、X449Y、X449F、X449L、X449P、X449G、X449W、X449M、X449R、X449N、X449K、X449Q、X449S、X449A、X451L、X453G、X453I、X453P、X453Y、X453N、X455L、X456M、X456S、X456Y、X456V、X456L、X456W、X456R、X457K、X457C、X457L、X457S、X457R、X457F、X457T、X457A、X457V、X457W、X457E、X457M、X457G、X458V、X458W、X458I、X458K、X459Q、X459D、X459I、X459K、X459C、X459V、X459E、X459Y、X460E、X460Q、X460S、X460R、X460A、X460T、X460D、X460V、X461A、X461R、X461F、X461E、X461S、X461V、X461M、X461K、X461N、X461Q、X462K、X463L、X465P、X465V、X465H、X465R、X467A、X467E、X467H、X468H、X468D、X470Q、X470T、X470A、X474P、X474H、X474F、X478A、X478E、X480Y、X480M、X480E、X480D、X480R、X482T及びX482Cからなるアミノ酸置換(配列番号3の付番に従う)の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含むアミラーゼである。
好ましくは、改善された特性は、洗剤組成物、好ましくは洗濯洗剤組成物中での改善された安定性、好ましくは洗剤組成物中での改善された熱安定性である。好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して洗剤組成物中で改善された安定性、好ましくは熱安定性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、4、6、20、25、27、28、33、38、41、70、72、73、75、81、93、94、96、115、125、126、128、134、139、160、174、175、176、210、213、250、251、253、276、291、292、299、314、318、319、323、326、338、343、352、356、359、363、364、368、372、378、379、382、385、387、388、390、393、396、398、400、405、418、434、447、449、459、460、461及び465からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置(配列番号3の付番に従う)でアミノ酸置換を含むアミラーゼである。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、洗剤組成物中で改善された安定性、好ましくは熱安定性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X4Q、X6E、X6H、X20K、X25H、X25Y、X27I、X28V、X33M、X38V、X41C、X70H、X72C、X73C、X75L、X81L、X93Q、X94M、X96Q、X115T、X125K、X125R、X126D、X128C、X134F、X134Y、X139C、X160W、X174H、X175A、X176K、X210C、X210D、X213C、X250I、X251E、X253C、X276R、X291T、X292C、X299S、X314Q、X318L、X319K、X323G、X326Y、X338S、X338T、X343W、X352C、X356V、X359W、X363M、X363S、X364T、X368F、X372C、X378E、X379A、X379R、X382Q、X385W、X387E、X387N、X387S、X388E、X388K、X388Y、X390F、X393Q、X396S、X398G、X400A、X400S、X405M、X418F、X434S、X434R、X447L、X449G、X459N、X460G、X461L、X461A及びX465Hからなるアミノ酸置換(配列番号3の付番に従う)の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含むアミラーゼである。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、洗剤組成物中で改善された安定性、好ましくは熱安定性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y+X482W、X25H+X186E+X206Y+X405M+X482W、X25H+X186E+X206Y+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X206Y+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X193E+X251E+X186E+X482W、X4Q+X193E+X206Y+X276R+X186E+X482W、X186E+X25H+X482W、X25H+X193E+X206Y+X251E+X276R+X405M+X186E+X482W、X25H+X251E+X186E+X482W、X25H+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X193E+X206Y+X405M+X186E+X482W、X3I+X356V、X3I+X356I、X83D+X94E、X94D+X125E、X131I+X377Q+X410H、X48F+X94D、X48Y+X116K+X218K、X5L+X218K+X225S、X83E+X116R+X158Y+X181E、X51V+X218K、X83E+X181E、X4Q+X7W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X37M+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25Y+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X118D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X182D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X258Q+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363H+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363N+X405M、X4Q+X176K+X181D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181F+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181N+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X136E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X100W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135T+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、
X7H+X25H+X176K+X186E+X206Y、X7W+X25H+X176K+X186E+X206Y、X25D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X186E+X206Y+X405M+X460G、X25H+X186E+X206Y+X460G、X25H+X37M+X176K+X186E+X206Y、X25H+X118D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X182D+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363H、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363N、X25H+X176K+X186E+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X181D+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181N+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181Q+X186E+X206Y、X25H+X136E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X100W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135T+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160E+X176K+X186E+X206Y、X25Y+X176K+X186E+X206Y、X87D+X186E+X315K+X420K、X87D+X186E+X226D+X314E+X420E+X461E、X87D+X186E+X226D+X420E、X87D+X186E+X226D+X420E+X461E、X87D+X186E+X314E+X471E、X87D+X186E+X311K+X314E+X420K、X87D+X186E+X160D+X461E、X87R+X186E+X315K+X461R、X87R+X186E+X226D+X471E、X87R+X186E+X226R+X314K+X420K+X461R、X87R+X186E+X226R+X311K+X420K、X87R+X186E+X314K+X315K、X87R+X186E+X311K+X314E、X87R+X186E+X420E+X450R、X87R+X186E+X450R+X452R、X186E+X315K+X420E+X452R、X186E+X226D+X314E+X461E+X471E、X186E+X226D+X314E+X452R、X186E+X226D+X314K+X460D+X471E+X485R、X186E+X226D+X311K+X460D、X186E+X226D+X461E+X471E、X186E+X314E+X460D+X461E、X186E+X314E+X420E+X452R+X461E、X186E+X314K+X450R+X460D、X186E+X460D+X471E+X485R、X186E+X311K+X314K+X452R、X186E+X311K+X461E+X485R、X186E+X311K+X420E+X471E、X186E+X420K+X450R+X471E+X485R、X186E+X420K+X450R+X485R、X186E+X452R+X461E+X471E、
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X25H+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X363E+X123D、X25H+X176K+X186E+X206Y+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X363E+X135C、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X361R、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X281N+X363E+X175D、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X473R、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X281N+X363E及びX25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X363Eからなる群から選択される置換(配列番号3の付番に従う)の組み合わせを含むアミラーゼである。
好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
好ましくは、改善された特性は、改善された洗浄性能である。好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された洗浄性能を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、3、4、5、6、7、20、25、33、36、37、41、51、54、72、73、75、81、82、83、94、95、96、98、100、116、118、119、120、123、126、131、135、136、139、156、158、160、163、165、169、172、174、176、177、178、180、182、185、187、188、189、191、193、208、210、218、219、222、224、225、231、238、242、243、251、252、253、258、260、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、286、297、298、299、311、314、317、318、320、321、322、323、324、326、337、343、344、350、352、356、357、358、359、360、362、363、364、365、368、370、372、378、379、382、385、387、388、390、391、393、395、396、397、400、405、410、429、434、439、456、459、460、461、463及び465からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でアミノ酸置換(配列番号3の付番に従う)を含むアミラーゼである。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された洗浄性能を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X100W、X116I、X116M、X118A、X118D、X118E、X119S、X120E、X120G、X120M、X120S、X120W、X120Y、X126D、X131Q、X135D、X135E、X135G、X135N、X135N、X135P、X135S、X135T、X135T、X135W、X136E、X139S、X156E、X160D、X160E、X163A、X163Q、X163T、X165S、X165T、X169D、X169S、X174E、X174G、X174H、X174H、X174M、X174N、X176S、X176T、X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S、X177W、X178F、X180M、X180N、X180T、X180W、X182D、X182E、X182N、X182Q、X182S、X185E、X185M、X185N、X187A、X187D、X187M、X187V、X188T、X189I、X191M、X193D、X193E、X193E、X193G、X193V、X193V、X20N、X210D、X219Q、X224F、X231D、X238A、X238F、X242N、X243D、X251T、X252S、X253C、X258F、X258Q、X258Q、X258R、X25D、X25D、X25G、X25Y、X25Y、X260H、X260H、X268F、X269M、X270A、X270Q、X271S、X272F、X272S、X273Q、X274F、X274F、X274F、X275V、X276N、X277D、X277D、X277D、X277E、X277T、X279A、X280D、X280F、X280G、X280K、X280R、X281A、X281D、X281E、X281H、X281H、X281N、X281S、X282V、X282V、X286Q、X297M、X298V、X299S、X299S、X311G、X311W、X314Q、X314Q、X314S、X317M、X318L、X318L、X320A、X321Y、X322K、X323G、X324K、X326Y、X33L、X343W、X344V、X350P、X352C、X356C、X356L、X356V、X356V、X357C、X357F、X358M、X359W、X359W、X359W、X359W、X359W、X360T、X362C、X362M、X363E、X363H、X363M、X363N、X363S、X363Y、X363Y、X364T、X365L、X365L、X365Q、X365Q、X365Y、X368F、X368F、X36H、X36K、X370S、X372C、X372M、X372S、X372T、X372T、X378E、X379R、X37F、X37L、X37M、X37W、X37Y、X382Q、X382Q、X385W、X387E、X387N、X387S、X387S、X388E、X388H、X388K、X390F、X391K、X393Q、X395C、X395M、X396C、X396S、X397S、X400A、X400L、X400S、X405H、X405M、X41C、X41G、X429P、X429P、X434E、X434H、X434R、X434S、X439K、X456S、X459N、X459N、X460G、X460G、X461A、X461L、X461R、X463A、X463V、X465H、X4Q、X5D、X6E、X6H、X6P、X72C、X73C、X73N、X75H、X75I、X75L、X75L、X75T、X7F、X7H、X7W、X81L、X82C、X82L、X83E、X94E、X95A、X96Q、X98A、X98N及びX98Vからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換(配列番号3の付番に従う)を含むアミラーゼである。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された洗浄性能を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X4Q+X7W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X37M+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25Y+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X182D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X258Q+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X281N+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363H+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363N+X405M、X4Q+X176K+X181D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181F+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181N+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X136E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X100W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135T+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、
X7H+X25H+X176K+X186E+X206Y、X7W+X25H+X176K+X186E+X206Y、X25D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X186E+X206Y+X405M+X460G、X25H+X186E+X206Y+X460G、X25H+X37M+X176K+X186E+X206Y、X25H+X118D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363H、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363N、X25H+X176K+X186E+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X181D+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181N+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181Q+X186E+X206Y、X25H+X136E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X100W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135T+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160E+X176K+X186E+X206Y、X25Y+X176K+X186E+X206Y、X51Q+X116K+X410I、X51V+X356I、X33E+X54G+X83D+X116T+X337L、X3A+X116K+X172N+X323A+X356V、X3I+X33H+X54D+X208Y+X218E+X320A、X3I+X54D+X116K+X125E+X225A、X3I+X125D+X174D+X222D+X376L+X420D、X3I+X356I、X3I+X356V、X3I+X48Y+X116T、X54D+X116K+X225S+X410Y、X83A+X94E+X158N+X172D+X323A、X83D+X125E、X83E+X181E、X83E+X116R+X158Y+X181E、X169E+X377Q、X158N+X172D、X125D+X225A+X337A+X410H、X29D+X33H+X83D+X125D+X337C+X343W、X29E+X33K+X123D+X208I+X222D+X356V、X94D+X125E、X225A+X376G+X410Y、X5L+X33K+X222D+X320K+X324M+X420E、X5L+X131L+X172K+X225S+X410I+X420E、X5L+X116T+X123D+X208F、X131I+X377Q+X410H、X131L+X320K、X116K+X181T+X225A+X320K、X116K+X125N+X158H+X225S、X116K+X131I+X158H+X174E、X116R+X169E+X420E、X116T+X181Q+X343T、X116T+X125D+X172K+X337A+X410I、X116T+X125E+X131I、X186E+X206Y、X186E+X206Y+X405M、X186E+X206Y+X251E、X186E+X206Y+X251E+X276R+X405M、X186E+X206Y+X251E+X405M、X186E+X206Y+X251E+X323G+X405M、X186E+X206Y+X323G+X405M、X186E+X405M、X186E+X193E+X206Y+X251E、X186E+X251E+X405M、
X4Q+X186E+X206Y、X4Q+X186E+X206Y+X405M、X4Q+X186E+X206Y+X251E+X276R、X4Q+X186E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X186E+X206Y+X251E+X323G+X405M、X4Q+X186E+X193E+X206Y+X405M、X4Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X186E+X206Y、X4Q+X25H+X186E+X206Y+X405M、X4Q+X25H+X186E+X206Y+X251E+X323A+X405M、X4Q+X25H+X186E+X206Y+X323G+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X460G、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X323G、X4Q+X25H+X160W+X186E+X206Y+X405M、X4Q+X25H+X160W+X186E+X206Y+X251E、X4Q+X25H+X160W+X186E+X206Y+X323G+X405M、X4Q+X25H+X160W+X186E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X186E+X193E+X206Y+X276R、X4Q+X25H+X160W+X186E+X323G、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X206Y+X251E、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X176K+X206Y、X4Q+X25H+X160W+X176K+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X176K+X186E+X206Y+X405M、X4Q+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X276R+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X323G+X405M、X4Q+X176K+X206Y、X4Q+X176K+X206Y+X405M、X4Q+X176K+X206Y+X405M+X460G、X4Q+X176K+X206Y+X460G、X4Q+X176K+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X176K+X206Y+X251E+X323A+X460G、X4Q+X160W+X176K+X186E+X206Y+X251E、X4Q+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M、X4Q+X160W+X176K+X206Y+X251E+X323G+X405M+X460G、
X25H+X186E+X206Y、X25H+X186E+X206Y+X405M、X25H+X186E+X206Y+X251E+X405M、X25H+X186E+X405M、X25H+X186E+X193E+X206Y+X405M、X25H+X176K+X186E、X25H+X176K+X186E+X276R+X323G+X405M、X25H+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X276R、X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M、X25H+X176K+X186E+X405M、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X276R+X405M、X25H+X176K+X186E+X251E+X276R、X25H+X176K+X206Y、X25H+X176K+X206Y+X405M、X25H+X176K+X206Y+X460G、X25H+X176K+X206Y+X251E、X25H+X176K+X206Y+X251E+X405M、X25H+X160W+X186E+X206Y、X25H+X160W+X186E+X206Y+X251E、X25H+X160W+X186E+X206Y+X251E+X405M、X25H+X160W+X186E+X206Y+X323G+X405M、X25H+X160W+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M、X25H+X160W+X176K+X186E+X405M、X25H+X160W+X176K+X186E+X193E+X206Y、X25H+X160W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X405M、X25H+X160W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X25H+X160W+X176K+X186E+X251E、X25H+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M、X25H+X160W+X176K+X206Y+X251E+X323G+X405M、
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好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された洗浄性能及び/又は改善された安定性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X4Q+X7W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X37M+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25Y+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X182D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X258Q+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X281N+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363H+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363N+X405M、X4Q+X176K+X181D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181F+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181N+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X136E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X100W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135T+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、
X7H+X25H+X176K+X186E+X206Y、X7W+X25H+X176K+X186E+X206Y、X25D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X186E+X206Y+X405M+X460G、X25H+X186E+X206Y+X460G、X25H+X37M+X176K+X186E+X206Y、X25H+X118D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363H、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363N、X25H+X176K+X186E+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X181D+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181N+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181Q+X186E+X206Y、X25H+X136E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X100W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135T+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160E+X176K+X186E+X206Y、X25Y+X176K+X186E+X206Y、
X51Q+X116K+X410I、X51V+X356I、X33E+X54G+X83D+X116T+X337L、X3A+X116K+X172N+X323A+X356V、X3I+X33H+X54D+X208Y+X218E+X320A、X3I+X54D+X116K+X125E+X225A、X3I+X125D+X174D+X222D+X376L+X420D、X3I+X356I、X3I+X356V、X3I+X48Y+X116T、X54D+X116K+X225S+X410Y、X83A+X94E+X158N+X172D+X323A、X83D+X125E、X83E+X181E、X83E+X116R+X158Y+X181E、X169E+X377Q、X158N+X172D、X125D+X225A+X337A+X410H、X29D+X33H+X83D+X125D+X337C+X343W、X29E+X33K+X123D+X208I+X222D+X356V、X94D+X125E、X225A+X376G+X410Y、X5L+X33K+X222D+X320K+X324M+X420E、X5L+X131L+X172K+X225S+X410I+X420E、X5L+X116T+X123D+X208F、X131I+X377Q+X410H、X131L+X320K、X116K+X181T+X225A+X320K、X116K+X125N+X158H+X225S、X116K+X131I+X158H+X174E、X116R+X169E+X420E、X116T+X181Q+X343T、X116T+X125D+X172K+X337A+X410I、X116T+X125E+X131I、X186E、X186E+X206Y、X186E+X206Y+X405M、X186E+X206Y+X251E、X186E+X206Y+X251E+X276R+X405M、X186E+X206Y+X251E+X405M、X186E+X206Y+X251E+X323G+X405M、X186E+X206Y+X323G+X405M、X186E+X405M、X186E+X193E+X206Y+X251E、X186E+X251E+X405M、X4Q+X186E+X206Y、
X4Q+X186E+X206Y+X405M、X4Q+X186E+X206Y+X251E+X276R、X4Q+X186E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X186E+X206Y+X251E+X323G+X405M、X4Q+X186E+X193E+X206Y+X405M、X4Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X186E+X206Y、X4Q+X25H+X186E+X206Y+X405M、X4Q+X25H+X186E+X206Y+X251E+X323A+X405M、X4Q+X25H+X186E+X206Y+X323G+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X460G、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X323G、X4Q+X25H+X160W+X186E+X206Y+X405M、X4Q+X25H+X160W+X186E+X206Y+X251E、X4Q+X25H+X160W+X186E+X206Y+X323G+X405M、X4Q+X25H+X160W+X186E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X186E+X193E+X206Y+X276R、X4Q+X25H+X160W+X186E+X323G、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X206Y+X251E、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M、X4Q+X25H+X160W+X176K+X206Y、X4Q+X25H+X160W+X176K+X206Y+X251E+X460G、
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好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
好ましくは、改善された特性は、改善された発現である。好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された発現を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、4、6、20、25、27、28、37、70、72、75、81、94、96、160、175、176、193、276、277、299、323、368、372、382、400、405、434、459及び461からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置(配列番号3の付番に従う)でアミノ酸置換を含むアミラーゼである。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された発現を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X4Q、X6E、X20K、X25H、X25Y、X27I、X28V、X37M、X70H、X72C、X75L、X81L、X94M、X96Q、X160W、X175A、X176K、X193E、X276R、X277D、X299S、X323G、X368F、X372C、X382Q、X400A、X405M、X434S、X459N及びX461Lからなるアミノ酸置換(配列番号3の付番に従う)の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含むアミラーゼである。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
好ましくは、改善された特性は、改善された溶解性である。好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された溶解性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、4、25、83、87、160、176、193、219、226、251、311、314、315、378、405、439、459、460、461及び471からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置(配列番号3の付番に従う)でアミノ酸置換を含むアミラーゼである。
好ましくは、親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1と比較して、改善された溶解性を示す本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、X4K、X25H、X83E、X87D、X87R、X160D、X176K、X193E、X219D、X219R、X226R、X226D、X251E、X311K、X314E、X314K、X315K、X378K、X405M、X439K、X459R、X460G、X460D、X461E及びX471Eからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換(配列番号3の付番に従う)を含むアミラーゼである。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
別の実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、上記のアミノ酸置換の1つ以上及び特定の種類の1つ以上の追加のアミノ酸、好ましくは1つ以上の追加のアミノ酸改変、好ましくはアミノ酸置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、1~50個の追加のアミノ酸改変、好ましくは1~35、1~31、1~30、1~20、1~15、1~10又は1~5個のアミノ酸改変、好ましくは置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して1~4個、好ましくは1~2個のアミノ酸欠失をさらに含む。
一実施形態では、これらの追加のアミノ酸改変は、下記のとおりの保存的置換及び/又は置換である。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、9、130、179、181、186、190、195、202、206、244、402、419、420、422、423、428、430、435、441、444、450、452、454、466、469、473、475、476、479、483及び485からなる群から選択される位置での好ましくは最大1、最大2、最大3、最大4、最大5、最大6、最大7、最大8、最大9、最大10、最大15、最大20、最大25又は全てのアミノ酸の1つ以上の追加の改変、好ましくは追加の置換を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、前記アルファ-アミラーゼバリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、
好ましくはX9D、X9F、X9K、X9L、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T、X9Y、X130V、X179G、X179L、X181D、X181E、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186E、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186N、X186Q、X186R、X186S、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195F、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X202L、X206C、X206H、X206L、X206M、X206Y、X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N、X244Q、X244V、X402T、X419C、X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L、X420Q、X422C、X422N、X422H、X423F、X423M、X423Q、X423S、X428A、X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W、X428Y、X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430I、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T、X430V、X435E、X435K、X435P、X435R、X435S、X435A、X435D、X437A、X437L、X437T、X437W、X441C、X441D、X441K、X441L、X441M、X441N、X441S、X444E、X444H、X444K、X444M、X444N、X444R、X444T、X450C、X450D、X450E、X450H、X450I、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R、X450T、X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N、X452R、X452T、X454A、X454E、X454K、X454L、X454M、X454P、X454S、X454T、X466E、X466W、X469F、X469L、X469Y、X473H、X473Q、X473R、X475A、X475K、X475N、X475E、X475L、X476G、X476E、X479A、X479I、X479K、X479M、X483F、X483I、X483L、X483Q、X483R、X485K及びX485Rからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を有し、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。好ましくは、上で挙げられる位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、181、186、195、206、441及び473からなる群から選択される位置、好ましくは位置186、195又は206、より好ましくは位置206又は195での好ましくは最大1、最大2、最大3、最大4、最大5又は全てのアミノ酸の1つ以上の追加の改変、好ましくは追加の置換を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、X181D、X181E、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186E、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186N、X186Q、X186R、X186S、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195F、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206L、X206M、X206Y、X441C、X441D、X441K、X441L、X441M、X441N、X441S、X473H、X473Q及びX473R(配列番号3の付番に従う)からなる群から選択される1つ以上の追加の置換をさらに含む。
最も好ましくは、追加の改変として、好ましくは上記の1つ以上の追加の改変と組み合わせて、本明細書に記載されるとおりの1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換を有し且つアルファ-アミラーゼ活性を有する本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号3の付番に対応する181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸の欠失、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する2つ以上のアミノ酸の欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184(配列番号3の付番に従う)に対応するアミノ酸の欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載されるとおりの1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換を有し且つアルファ-アミラーゼ活性を有する本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、位置183及び184に対応する1つ以上のアミノ酸の欠失、好ましくは位置183及び184(配列番号3の付番に従う)に対応する両方のアミノ酸の欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載されるとおりの1つ以上のアミノ酸改変、好ましくは置換を有し、且つアルファ-アミラーゼ活性を有する本発明のアルファ-アミラーゼバリアントは、R181、G182、D183及びG184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上、好ましくは2つ以上、最も好ましくは2つのアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
好ましくは、本発明は、親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、
(i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換を含み、
(ii)前記バリアントは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは少なくとも80%であるが、100%未満の配列同一性を有し、
(iii)前記バリアントは、R181、G182、D183及びG184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上、好ましくは2つ以上、最も好ましくは2つの欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、
(iv)任意選択により、前記バリアントは、本明細書に記載されるとおりの1つ以上の追加のアミノ酸置換を含み、
(v)前記バリアントは、本明細書に記載されるとおりの改善された特性を含み、及び
(vi)前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、親アミラーゼは、配列番号1である。
代替的な実施形態では、本発明は、親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントに関し、前記バリアントは、
(i)親配列と比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX9D、X9F、X9K、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T、X9Y、X179G、X181D、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186R、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206M、X206Y、X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N、X244V、X402T、X419C、X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L、X420Q、X422C、X422N、X422H、X423F、X423M、X423Q、X423S、X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W、X428Y、X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T、X430V、X435K、X435P、X435S、X435A、X435D、X437L、X437T、X437W、X441C、X441K、X441L、X441M、X441S、X444H、X444M、X444N、X444R、X444T、X450C、X450D、X450E、X450H、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R、X450T、X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N、X452T、X454A、X454E、X454K、X454L、X454P、X454S、X454T、X466E、X466W、X469F、X469L、X469Y、X475A、X475K、X475E、X475L、X479I、X479K、X479M、X483F、X483L、X483Q及びX483Rからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換、好ましくはX181D、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186R、X186V、X186W、X186Y、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206M、X206Y、X441C、X441K、X441L、X441M及びX441Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3に従うアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼであり、
(ii)前記バリアントは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも60%、好ましくは少なくとも80%であるが、100%未満の配列同一性を有し、
(iii)前記バリアントは、R181、G182、D183及びG184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上、好ましくは2つ以上、最も好ましくは2つの欠失、好ましくはD183*及びG184*を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、及び
(iv)前記バリアントは、本明細書に記載されるとおりの改善された特性を含み、及び
(v)前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する。
本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントにも関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う13、17、22、23、27、28、32、36、42、51、70、75、83、89、92、95、96、154、192、215、222、226、233、245、277、282、285、288、297、312、338、341、343、353、355、356、376、379、381、389、429、432、442、451、459及び463からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、最も好ましくは置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含む。本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントにも関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う13、17、23、27、36、42、51、89、92、192、215、222、233、245、277、282、288、297、312、338、341、343、353、355、356、376、379、381、389、429、432、442及び451からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、最も好ましくは置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントにも関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う13、18、146、163、170、188、224、238、242、245、353、385、388、405、432、442、474及び478からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、最も好ましくは置換を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1、配列番号3又は配列番号4、より好ましくは配列番号1又は3、最も好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントにも関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、5、7、8、9、11、16、18、19、25、26、29、30、31、35、37、40、41、43、44、46、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、71、72、73、74、77、78、79、80、81、84、85、86、87、88、90、91、93、94、97、98、101、102、103、104、105、106、107、109、110、111、112、113、114、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、151、152、153、155、157、158、159、160、161、162、163、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、188、189、190、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、216、217、218、219、220、224、225、227、228、229、230、231、232、235、238、239、241、242、243、244、246、247、248、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、269、270、272、273、274、275、276、278、279、280、281、283、284、286、287、291、292、293、294、295、296、298、299、300、302、303、304、305、306、307、310、311、313、314、315、316、317、319、320、321、322、323、324、325、328、329、330、331、332、334、335、337、339、340、342、344、345、346、347、349、350、354、357、359、360、361、362、363、364、365、368、369、371、372、373、374、375、377、380、382、383、384、385、386、387、388、390、391、393、394、395、396、397、398、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、425、427、428、430、431、433、434、435、437、438、439、441、444、445、446、447、449、450、452、454、455、457、458、460、461、462、464、465、466、467、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、481、483、484及び485からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、最も好ましくは置換を含み、
好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、181、186、195、206、441及び473からなる群から選択される位置、好ましくは位置186、195又は206、より好ましくは位置206及び/又は195での好ましくは最大1、最大2、最大3、最大4、最大5又は全てのアミノ酸の1つ以上の追加の改変、好ましくは追加の置換を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、X181D、X181E、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186E、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186N、X186Q、X186R、X186S、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195F、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206L、X206M、X206Y、X441C、X441D、X441K、X441L、X441M、X441N、X441S、X473H、X473Q及びX473R(配列番号3の付番に従う)からなる群から選択される1つ以上の追加の置換をさらに含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
本発明は、アルファ-アミラーゼ活性を有する親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントにも関し、前記バリアントは、親アルファ-アミラーゼと比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う25、116、176、181、183、186、206、225、251、320、400、402、405、408、409、410、418、419、420、422、423、437、441、444、446、449、452、458、460、466、471、473、475、484及び485からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせを含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対する少なくとも95%の同一性、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、181、186、195、206、441及び473からなる群から選択される位置、好ましくは位置186、195又は206、より好ましくは位置206及び/又は195での好ましくは最大1、最大2、最大3、最大4、最大5又は全てのアミノ酸の1つ以上の追加の改変、好ましくは追加の置換を含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、X181D、X181E、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186E、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186N、X186Q、X186R、X186S、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195F、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206L、X206M、X206Y、X441C、X441D、X441K、X441L、X441M、X441N、X441S、X473H、X473Q及びX473R(配列番号3の付番に従う)からなる群から選択される1つ以上の追加の置換をさらに含み、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184、好ましくは183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う。
核酸コンストラクト
本発明は、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドも参照する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞、好ましくはバチルス属(Bacillus)細胞において発現を改善するためのコドン最適化されたポリヌクレオチドである。
さらなる実施形態では、本発明は、高いストリンジェンシー条件、好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下において、(i)本明細書に記載されるとおりの成熟ポリヌクレオチドコード配列、又は(ii)(i)の完全長相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにも関する。
したがって、本発明は、
(a)配列番号2と少なくとも少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有する核酸配列(核酸は、アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする);
(b)配列番号1と少なくとも少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるが、100%未満の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列(ポリペプチドは、アミラーゼ活性を有する)又は本明細書に記載されるアミラーゼ活性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼバリアントをコードする核酸配列;
(c)高いストリンジェンシー条件下、好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下において、
(i)配列番号1のコード配列若しくは本明細書に記載されるアミラーゼ活性を有するいずれかのアルファ-アミラーゼバリアントのコード配列;又は
(ii)配列番号2に示されるポリヌクレオチド
の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド;
(d)(a)、(b)又は(c)の断片(断片は、アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする);又は
(e)(a)~(d)のいずれかと完全に相補的な核酸配列、
(f)単に遺伝暗号の縮重によって(a)~(e)に記載される核酸配列のいずれかと異なるポリヌクレオチド
を含む核酸、好ましくは単離された核酸、合成核酸及び/又は組み換え核酸も参照する。
本発明は、核酸コンストラクト、好ましくは本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む発現カセットも参照する。
通常、発現カセットは、3つのエレメント:プロモーター配列、オープンリーディングフレーム及び真核生物において通常ポリアデニル化部位を含有する3’非翻訳領域を含む。さらなる調節エレメントは、転写及び翻訳エンハンサーを含み得る。イントロン配列も5’非翻訳領域(UTR)に又はコード配列中に付加されて、細胞質ゾル中で蓄積する成熟したメッセージの量を増加させ得る。発現カセットは、ベクターの一部であり得るか、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その宿主細胞のゲノムと合わせて複製され得る。発現カセットは、通常、発現を増加又は減少させることができる。
本発明は、本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド又は核酸コンストラクトを含む発現ベクターも参照する。発現ベクターは、低コピー数のベクター又は高コピー数のベクターであり得る。
ベクターは、本明細書で使用する場合、宿主細胞又は宿主細胞オルガネラ中への形質転換時の外来ポリヌクレオチドの転写及び翻訳のためのセグメントを提供し得る。そのような追加のセグメントは、調節ヌクレオチド配列、特定の細胞型におけるその維持及び/又は複製に必要となる1つ以上の複製開始点、1つ以上の選択マーカー、ポリアデニル化シグナル、多重クローニング部位などの外来コード配列の挿入のために好適な部位を含み得る。一例は、ベクターがエピソームの遺伝要素(例えば、プラスミド又はコスミド分子)として細菌細胞において維持される必要がある場合である。好適な複製開始点の非限定的な例としては、f1-ori及びcolE1が挙げられる。
ベクターは、例えば、細菌宿主細胞においてプラスミドとして、宿主細胞のゲノムへの組み込みを伴わずに複製され得るか、又はそれは、宿主細胞のゲノムにそのDNAの一部又は全てを組み込み、それによりそのDNAの複製及び発現をもたらし得る。
アルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドは、標準的な組み換えDNA技術によってベクターに導入され得る。ベクターに導入されると、コード配列を含むポリヌクレオチドは、宿主細胞又は宿主細胞オルガネラに導入される(形質転換される、形質導入される、形質移入されるなど)のに好適であり得る。宿主細胞又は宿主細胞オルガネラにおけるポリヌクレオチド配列の発現に好適なクローニングベクターが選択され得る。
宿主細胞
本発明は、本明細書に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載されるとおりの核酸コンストラクト又は本明細書に記載されるとおりの発現ベクターを含む宿主細胞も参照する。本発明の一実施形態では、ベクターは、宿主細胞の形質転換のために使用される。
本明細書に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞に一過的に又は安定に導入され得、例えばプラスミドとして組み込まれずに維持され得る。通常、安定な形質転換は、外来コード配列を含む核酸の染色体への組み込み又はエピソーム(核DNAの別々の断片)としての組み込みによるものである。通常、一過的な形質転換は、外来核酸配列を含む核酸が染色体に組み込まれないことによるか又はエピソームによるものである。代わりに、本明細書に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。
核酸の宿主細胞への導入は、例えば、限定されないが、プロトプラスト形質転換(例えば、Chang and Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115を参照されたい)により、コンピテント細胞(例えば、Young and Spizizen,1961,Journal of Bacteriology 81:823-829又はDubnau and Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56:209-221を参照されたい)を使用することにより、エレクトロポレーション(例えば、Shigekawa and Dower,1988,Biotechniques 6:742-751を参照されたい)により、又は接合(例えば、Koehler and Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5271-5278を参照されたい)により行われ得る。特定の形質転換プロトコルは、宿主細胞の様々な種類に関して当技術分野で知られている(例えば、大腸菌(E.coli)プロトプラスト形質転換に関して、Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580を参照されたい)。
様々な宿主細胞が、本明細書に記載される核酸コンストラクトを発現するために使用され得る。本明細書に記載される遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞は、ポリヌクレオチドをそのような宿主細胞に導入するための本明細書に記載される方法の1つによって得ることができる。本発明の宿主細胞は、アルファ-アミラーゼバリアントを天然には発現しない。したがって、宿主細胞は、組み換え宿主細胞である;本明細書に記載される核酸コンストラクトは、宿主細胞について異種である。
一実施形態では、宿主細胞は、原核生物又は真核生物である。別の実施形態では、宿主細胞は、細菌、古細菌、真菌細胞、酵母細胞又は真核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、非ヒト宿主細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞である。細菌宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であり得る。グラム陽性細菌としては、バチルス属(Bacillus)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)、ゲオバチルス属(Geobacillus)及びオセアノバチルス属(Oceanobacillus)が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、エシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、アセトバクター属(Acetobacter)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、グルコノバクター属(Gluconobacter)が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、細菌宿主細胞は、大腸菌(Echerichia coli)細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア属(Escherichia)又はバチルス属(Bacillus)のものである。
本発明の方法において、細菌宿主細胞は、任意のバチルス属(Bacillus)細胞であり得る。本発明の実践において有用なバチルス属(Bacillus)細胞としては、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サークランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・ファーマス(Bacillus firmus)、バチルス・ロータス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・メチロトロフィカス(Bacillus methylotrophicus)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・パラリケニフォルミス(Bacillus paralicheniformis)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)及びバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細菌宿主細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)細胞である。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)細胞である。好ましくは、細菌宿主細胞は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である。
本発明の方法において、細菌宿主細胞は、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ガッセリー(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricusk)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、大腸菌(Escherichia coli)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・サーモアミノゼン(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)、コリネバクテリウム・エフィジエンス(Corynebacterium effiziens)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・デゼルティ(Corynebacterium deserti)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・ディバリカトゥム(Brevibacterium divarecatum)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・アルブス(Streptomyces albus)、ストレプトマイセス・アベルミティリス(Streptomyces avermitilis)、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、グルコノバクター・モルビフェル(Gluconobacter morbifer)、グルコノバクター・タイランディカス(Gluconobacter thailandicus)、アセトバクター・アセティ(Acetobacter aceti)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキイ(Clostridium beijerinckii)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ユベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス(Streptococcus equi subsp.,Zooepidemicus)又はバスフィア・サクシニシプロデュセンス(Basfia succiniciproducens)であり得る。
別の実施形態では、細菌宿主細胞は、目的のポリペプチドの生成、回収又は応用に好ましくない可能性がある他の遺伝子の改変、例えば欠失又は破壊をさらに含有し得る。一実施形態では、細菌宿主細胞は、プロテアーゼ欠損細胞である。別の実施形態では、細菌宿主細胞、例えばバチルス属(Bacillus)細胞は、aprE、mpr、vpr、bpr及び/又はeprを含むが、これらに限定されない細胞外プロテアーゼ遺伝子の破壊又は欠失を含む。一実施形態では、細菌宿主細胞は、胞子を生成しない。別の実施形態では、細菌宿主細胞、例えばバチルス属(Bacillus)細胞は、spoIIAC、sigE及び/又はsigGの破壊又は欠失を含む。一実施形態では、細菌宿主細胞、例えばバチルス属(Bacillus)細胞は、サーファクチンの生合成に関与する遺伝子の1つ、例えばsrfA、srfB、srfC及び/又はsrfDの破壊又は欠失を含む。例えば、米国特許第5,958,728号明細書を参照されたい。別の実施形態では、細菌宿主細胞は、ポリグルタミン酸の生合成に関与する遺伝子の1つの破壊又は欠失を含む。目的のポリペプチドの生成、回収又は応用に好ましくないamyE遺伝子を含むが、これに限定されない他の遺伝子も破壊又は欠失され得る。
別の実施形態では、細菌宿主細胞は、DH5alpha(Invitrogen)、DH10B、(Invitrogen)、Omnimax(Invitrogen)、INV110(Invitrogen)、TOP10(Invitrogen)、HB101(Promega)、SURE(Stratagene)、XL1-Blue(Stratagen)、TG1(Lucigen)及びJM109(NEB)を含むが、これらに限定されない標準的な大腸菌(E.coli)クローニング宿主細胞である。別の実施形態では、細菌宿主細胞は、B.サブチリス(B.subtilis)IG-20(BGSC 1A436)などの欠損したhsd(RI)R-M-遺伝子座又はB.サブチリス(B.subtilis)1012 WT(Mobitec)などの欠損したhsdRM1変異を有するB.サブチリス(B.subtilis)を含むが、これらに限定されない標準的なバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)クローニング宿主細胞である。
代替的なさらなる宿主細胞としては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)、フサリウム・オキシスポラム(fusarium oxysporum)、フサリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)としても知られる)、マイセリオフィソラ・サーモフィル(Myceliopthora thermophile)(C1)、サーモセロマイセス・サーモフィラ(Themothelomyces thermophila)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、トリコデルマ属(Trichoderma)、好ましくはトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)及びサッカロマイセス属(Saccharomyces)、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はリゾムコール属(Rhizomucor)が挙げられるが、これらに限定されない。
作製方法
本発明の別の実施形態は、親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントを得る方法であって、
a)配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸改変、好ましくは挿入、欠失、置換又はその組み合わせ、好ましくは置換を親アルファ-アミラーゼ、好ましくは配列番号1に導入する工程、
b)任意選択により、親アルファ-アミラーゼにおける2つ以上での欠失を、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う前記位置R181、G182、D183及びG184に導入する工程
を含み、それにより前記親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントを提供し、前記バリアントは、配列番号1のポリペプチドに対するアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有し、及び前記アルファ-アミラーゼバリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、前記親と比較して改善された特性を有する、方法である。
タンパク質配列にアミノ酸改変、例えば置換又は欠失を導入する方法は、当技術分野でよく知られている。バリアントは、部位特異的変異誘発、合成的遺伝子構築、半合成的遺伝子構築、ランダム変異誘発、シャッフリングなどの当技術分野で知られるいずれかの変異誘発手順を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発は、1つ以上の(いくつかの)変異が、親をコードするポリヌクレオチドにおける1つ以上の既定の部位で生成される技術である。部位特異的変異誘発は、所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含むPCRによってインビトロで達成され得る。部位特異的誘発は、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中の部位での制限酵素による切断を含むカセット変異誘発及びその後のポリヌクレオチド中に変異を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションによってインビトロでも実施され得る。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は、同じであり、プラスミドの粘着末端及び挿入断片が互いにライゲートすることを可能にする。例えば、Scherer and Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955;及びBarton et al.,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966を参照されたい。部位特異的変異誘発は、当技術分野で知られる方法によってインビボでも達成され得る。例えば、米国特許出願公開第2004/0171154号明細書;Storici etal.,2001,Nature Biotechnol.19:773-776;Kren et al.,1998,Nat.Med.4:285-290;及びCalissano and Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16を参照されたい。任意の部位特異的変異誘発手順が、本発明において使用され得る。バリアントを調製するために使用され得る多くの入手可能な市販のキットがある。
合成的遺伝子構築は、目的のポリペプチドをコードする設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必要とする。遺伝子合成は、Tianら(2004,Nature 432:1050-1054)により説明されている多重マイクロチップベース技術及びオリゴヌクレオチドが合成され、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で組み立てられる同様の技術などのいくつかの技術を利用して実施され得る。
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入は、既知の変異誘発、組み換え及び/又はシャッフリングの方法、続いてReidhaar-Olson and Sauer,1988,Science 241:53-57;Bowie and Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86;2152-2156;国際公開第95/17413号パンフレット;又は国際公開第95/22625号パンフレットで開示されるものなどの関連するスクリーニング手順を使用してなされ、試験され得る。使用され得る他の方法としては、エラープローンPCR、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al.,1991,Biochemistry 30;10832-10837;米国特許第5,223,409号明細書;国際公開第92/06204号パンフレット)及び領域特異的変異誘発(Derbyshire et al.,1986,Gene 46;145;Ner et al.,1988,DNA 7;127)が挙げられる。
変異誘発/シャッフリング法は、ハイスループットな自動化されたスクリーニング方法と組み合わせて、宿主細胞によって発現した、クローニングされ、変異が誘発されたポリペプチドの活性を検出することができる(Ness et al.,1999,Nature Biotechnology 17;893-896)。活性ポリペプチドをコードする変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、当技術分野の標準法を使用して迅速に配列決定され得る。これらの方法は、ポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。
半合成的遺伝子構築は、合成的遺伝子構築、及び/又は部位特異的変異誘発、及び/又はランダム変異誘発、及び/又はシャッフリングの態様を組み合わせることによって達成される。半合成構築法としては、PCR手法と組み合わせた、合成されたポリヌクレオチド断片を利用したプロセスが典型的なものである。したがって、遺伝子の規定された領域は、新規に合成され得るが、他の領域は、部位特異的変異誘発プライマーを使用して増幅され得、さらに他の領域は、エラープローンPCR又は非エラープローンPCR増幅にかけられ得る。次に、ポリヌクレオチド部分配列は、シャッフリングされ得る。
得られたアルファ-アミラーゼバリアントは、工業規模で生成され、その後、精製され得る。酵素の工業的生成は、通常、酵素を発現する宿主細胞を培養すること(発酵とも呼ばれる)によってなされる。好適な宿主細胞は、本明細書に記載される。本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントをコードする核酸配列は、宿主細胞に形質転換することができ、その後、アルファ-アミラーゼバリアントを生成する宿主細胞に好適な条件下で培養される。好ましい実施形態では、アルファ-アミラーゼバリアントは、宿主細胞から精製される。
したがって、さらに別の実施形態では、本発明は、アルファ-アミラーゼバリアントを生成する方法であって、
(a)本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸コンストラクトを含む宿主細胞を、本明細書に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを宿主細胞に導入することによって提供する工程;
(b)ポリヌクレオチドの発現に資する条件下で工程(a)の組み換え宿主細胞を培養する工程:及び
(c)任意選択により、ポリヌクレオチドによってコードされるアルファ-アミラーゼバリアントを回収する工程
を含む方法に関する。
宿主細胞の培養は、通常、組み換え細胞を増殖させ、所望のタンパク質を発現させる好適な栄養培地中で行われる。発酵の最後に、発酵ブロスは、回収され、さらに処理され得、発酵ブロスは、液体画分及び固体画分を含む。目的の酵素は、発酵ブロスからさらに精製され得る。
本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントは、微生物細胞から(発酵ブロスの液体画分中に)分泌されても又は分泌されなくてもよい(したがって発酵ブロスの細胞中に含まれる)。これに応じて、アルファ-アミラーゼバリアントは、発酵ブロスの液体画分又は細胞可溶化物から回収され得る。好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントは、好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのアミノ酸配列の末端に付加される分泌シグナルペプチドにより、細胞から発酵ブロス中に分泌される。アルファ-アミラーゼバリアントの回収は、当業者に知られる方法によって達成され得る。発酵ブロスからのタンパク質の回収のための好適な方法としては、回収、遠心分離、濾過、抽出及び沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。目的の生成物が、発酵ブロス中に沈殿するか若しくは結晶化するか又は発酵ブロスの粒子状物質に少なくとも部分的に結合する場合、追加の処理工程が、バイオマスから目的のタンパク質を放出するか又は目的のタンパク質の結晶及び沈殿物を可溶化するために必要であり得る。米国特許第6,316,240B1号明細書及び国際公開第2008/110498A1号パンフレットは、発酵中に発酵ブロスから沈殿し且つ/又は結晶化する目的のタンパク質を回収するための方法を記載する。所望のタンパク質が発酵ブロスの細胞中に含まれる場合、細胞からの目的の生成物の放出が必要となる可能性がある。細胞からの放出は、例えば、限定されないが、当業者によく知られる技術、例えばリゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス又はその組み合わせによる細胞溶解によって達成され得る。
アルファ-アミラーゼバリアントは、当技術分野で知られる方法によって発酵ブロスから精製され得る。例えば、アルファ-アミラーゼバリアントは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むが、これらに限定されない従来の手順によって発酵ブロスから単離され得る。次に、単離されたポリペプチドは、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除)、電気泳動法(例えば、分取等電点電気泳動(IEF))、溶解度の相違(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)又は抽出(例えば、Protein Purification,J.-C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989を参照されたい)を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られる様々な手順によって精製され得る。次に、精製されたポリペプチドは、限外濾過及び蒸発、特に薄膜蒸発を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られる手順によって濃縮され得る。
組成物
本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントの精製された溶液は、アルファ-アミラーゼ含有組成物、すなわち「アルファ-アミラーゼバリアント配合物」を形成するためにさらに処理され得る。したがって、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアント及び少なくとも1種の追加の構成成分を含む組成物も本明細書で特許請求される。
アルファ-アミラーゼバリアント配合物は、固体又は液体のいずれかであり得る。タンパク質配合物は、当技術分野で知られる技術を使用することによって得ることができる。例えば、限定されるものではないが、固体酵素配合物は、押し出し成形又は顆粒化によって得ることができる。好適な押し出し成形及び顆粒化技術は、当技術分野で知られており、例えば国際公開第94/19444A1号パンフレット及び国際公開第97/43482A1号パンフレットに記載される。液体酵素配合物は、酵素配合物の総重量に対して0.1重量%~40重量%、0.5重量%~30重量%、1重量%~25重量%、1重量%~10重量%又は好ましくは1~6重量%の範囲の酵素量を含み得る。
好ましくは、酵素配合物は、酵素配合物の1kg当たり1~100gの活性アルファ-アミラーゼバリアント、好ましくは5~80g/kg、5~60g/kg又は10~40g/kgの量で本発明のアルファ-アミラーゼバリアントを含む。
一実施形態では、酵素配合物、特に液体酵素配合物は、加えて、溶媒、塩、pH調節剤、保存剤、酵素安定剤及び増粘剤からなる群から選択される1種以上の追加の化合物を含む。溶媒は、水及び/又は有機溶媒であり得る。本発明の水性酵素配合物は、酵素配合物の総重量に対して約50重量%超、約60重量%超、約70重量%超又は約80重量%超の量で水を含み得る。有機溶媒は、水混和性溶媒であり得る。有機溶媒は、グリセロール、プロパンジオール、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される1つ以上であり得る。
一実施形態では、アミラーゼ配合物は、少なくとも1種の保存剤を含む。好ましくは、保存剤は、保存のために液体組成物に加えられる物質を意味し、より好ましくは、生成プロセスにおいて形成される液体組成物中に含まれる保存機能を有することが知られる化合物が保存剤という用語から除外されることを意味する。一実施形態では、保存剤は、2-フェノキシエタノール、グルタルアルデヒド、2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール及び酸形態又はその塩としてのギ酸並びに4,4’-ジクロロ2-ヒドロキシジフェニルエーテルからなる群から選択される。通常、本発明の液体組成物は、液体組成物の総重量に対して2ppm~5重量%の範囲の量など、10ppm未満の量で少なくとも1種の保存剤を含む。好ましくは、アミラーゼ配合物は、保存剤を含まないが、これは、保存剤が1ppm未満の量で含まれることを意味する。
一実施形態では、本明細書に記載される酵素配合物は、少なくとも1種の酵素安定剤を含み得る。好ましい酵素安定剤は、ポリオール(例えば、1,3-プロパンジオール、エチレングリコール、グリセロール及び1,2-プロパンジオール)、塩(例えば、CaCl2、MgCl2、NaCl)、ギ酸、ギ酸塩(例えば、ギ酸ナトリウム)、酢酸塩及びその任意の組み合わせからなる群から選択される。プロテアーゼが存在する場合、好ましくはホウ酸塩、ホウ酸、ボロン酸(例えば、4-FPBAのようなフェニルボロン酸)、ペプチドアルデヒド、ペプチドアセタール及びペプチドアルデヒドハイドロサルファイト付加体、好ましくはZ-VAL-H又はZ-GAY-Hのようなペプチドアルデヒドから選択されるプロテアーゼ阻害剤が加えられ得る。
本発明の液体酵素配合物は、発酵培地に由来する塩、産生宿主細胞に由来する細胞片、発酵中に産生宿主細胞によって産生される代謝産物などの残留している構成成分を含み得る。一実施形態では、残留している構成成分は、水性酵素配合物の総重量に対して30重量%未満、20重量%未満、10重量%未満又は5重量%未満の量で液体酵素配合物中に含まれ得る。
第2の酵素
別の実施形態では、本明細書に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアントを含む組成物は、アルファ-アミラーゼバリアントと異なる1種以上の第2の酵素をさらに含む。好ましくは、第2の酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ-ガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ-グルコシダーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、ヒアルロン酸シンターゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼからなる群から選択される。特に、第2の酵素は、プロテアーゼ、第2のアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、ヌクレアーゼ及びその任意の組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、第2の酵素は、プロテアーゼと異なるアミラーゼ、本発明のアミラーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ及びリパーゼからなる群から選択され、好ましくは、第2の酵素は、プロテアーゼ、マンナナーゼ及びリパーゼからなる群から選択され、特に好ましくはプロテアーゼ又はマンナナーゼ、最も好ましくはプロテアーゼ、好ましくはサブチリシンプロテアーゼである。
プロテアーゼ
プロテアーゼは、「プロテアーゼ活性」又は「タンパク分解活性」を発揮する活性タンパク質である。タンパク質分解活性は、既定の期間でのプロテアーゼ又はタンパク質分解酵素によるタンパク質の分解の速度に関連する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントと異なる第2の酵素は、配列番号10~14のいずれかの完全長ポリペプチド配列と少なくとも40~100%の同一性を有するプロテアーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは、配列番号10、11、12、13又は14、好ましくは配列番号10に示される完全長ポリペプチド配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントと組み合わせて使用されるプロテアーゼは、配列番号10と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、以下の位置3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252及び274(BPN付番に従う)の1つ以上においてアミノ酸置換をさらに含み、タンパク質分解活性を有する。一実施形態では、そのようなプロテアーゼは、位置Asp32、His64及びSer221(BPN付番に従う)で変異されない。好ましくは、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントと組み合わせて使用されるプロテアーゼは、配列番号10と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、位置101(BPN付番に従う)でアミノ酸のグルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)、又はアスパラギン(N)、又はグルタミン(Q)、又はアラニン(A)、又はグリシン(G)、又はセリン(S)、好ましくはグルタミン酸(E)を有することによってさらに特徴付けられ、且つタンパク質分解活性を有する。最も好ましくは、プロテアーゼは、配列番号10と少なくとも80%であるが、100%未満の配列同一性を有し、位置101(BPN付番に従う)でアミノ酸のグルタミン酸(E)を有することによって特徴付けられ、且つタンパク質分解活性を有する。プロテアーゼは、R101E単独又は位置3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252及び/又は274(BPN付番に従う)での1つ以上の置換と組み合わせるなど、位置101でアミノ酸置換を含み得、且つタンパク質分解活性を有する。一実施形態では、前記プロテアーゼは、1つ以上のさらなる置換:(a)位置3でのスレオニン(3T)、(b)位置4でのイソロイシン(4I)、(c)位置63でのアラニン、スレオニン又はアルギニン(63A、63T又は63R)、(d)位置156でのアスパラギン酸又はグルタミン酸(156D又は156E)、(e)位置194でのプロリン(194P)、(f)位置199でのメチオニン(199M)、(g)位置205でのイソロイシン(205I)、(h)位置217でのアスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシン(217D、217E又は217G)、(i)(a)~(h)に従う2つ以上のアミノ酸の組み合わせを含む。好適なプロテアーゼは、配列番号10と少なくとも80%同一であり得、1つのアミノ酸((a)~(h)に従う)又はアミノ酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G又は101S(BPN付番に従う)とともに(i)に従う組み合わせを含むことによって特徴付けられ、且つタンパク質分解活性を有する。一実施形態では、プロテアーゼは、配列番号10と少なくとも80%同一であり、変異(BPN付番に従う)R101E、又はS3T+V4I+V205I、又はS3T+V4I+R101E+V205I又はS3T+V4I+V199M+V205I+L217Dを含むことによって特徴付けられ、且つタンパク質分解活性を有する。別の実施形態では、プロテアーゼは、配列番号10と少なくとも80%の同一性を有し、S3T+V4I+S9R+A15T+V68A+D99S+R101S+A103S+I104V+N218D(BPN付番に従う)を含むことによってさらに特徴付けられるアミノ酸配列を含み、且つタンパク質分解活性を有する。別の実施形態では、プロテアーゼは、配列番号10と少なくとも80%同一であり、R101E並びにS156D、L262E、Q137H、S3T、R45E,D,Q、P55N、T58W,Y,L、Q59D,M,N,T、G61D,R、S87E、G97S、A98D,E,R、S106A,W、N117E、H120V,D,K,N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A,G、Y171L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T,D及びL262N,Q,D(BPN付番に従う)からなる群から選択される1つ以上の置換を含むことによってさらに特徴付けられているアミノ酸配列を有し得、且つタンパク質分解活性を有する。
リパーゼ
「リパーゼ」、「脂肪分解酵素」、「脂質エステラーゼ」は全て、ECクラス3.1.1の酵素(「カルボキシルエステルヒドロラーゼ」)を指す。リパーゼは、リパーゼ活性(又は脂肪分解活性;トリアシルグリセロールリパーゼ、EC3.1.1.3)、クチナーゼ活性(EC3.1.1.74;クチナーゼ活性を有する酵素は、本明細書ではクチナーゼと呼ばれ得る)、ステロールエステラーゼ活性(EC3.1.1.13)及び/又はワックス-エステルヒドロラーゼ活性(EC3.1.1.50)を有する活性タンパク質を意味する。リパーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。
本発明の一態様では、好適なリパーゼ(構成成分(b))は、以下から選択される:欧州特許第258068号明細書、欧州特許第305216号明細書、国際公開第92/05249号パンフレット及び国際公開第2009/109500号パンフレットに記載されるとおりのフミコラ属(Humicola)(同義語サーモマイセス属(Thermomyces))由来、例えばH.ラヌギノーサ(H.lanuginosa)(T.ラヌギノサス(T.lanuginosus))由来の又は国際公開第WO96/13580号パンフレットに記載されるとおりのH.インソレンス(H.insolens)由来のリパーゼ;国際公開第92/05249号パンフレットに記載されるとおりのリゾムコール・ミハイ(Rhizomucor miehei)に由来するリパーゼ;シュードモナス属(Pseudomonas)の株(現在バークホルデリア属(urkholderia)に改名されたもののいくつか)由来、例えばP.アルカリゲネス(P.alcaligenes)又はP.シュードアルカリゲネス(P.pseudoalcaligenes)(欧州特許第218272号明細書、国際公開第94/25578号パンフレット、国際公開第95/30744号パンフレット、国際公開第95/35381号パンフレット、国際公開第96/00292号パンフレット)、P.セパシア(P.cepacia)(欧州特許第331376号明細書)、P.スタッツェリ(P.stutzeri)(英国特許第1372034号明細書)、P.フルオレッセンス(P.fluorescens)、シュードモナス属種(Pseudomonas sp.)の株SD705(国際公開第95/06720号パンフレット及び国際公開第96/27002号パンフレット)、P.ウィスコンシネンシス(P.wisconsinensis)(国際公開第96/12012号パンフレット)、シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)(国際公開第95/14783号パンフレット)、P.グルマエ(P.glumae)(国際公開第95/35381号パンフレット、国際公開第96/00292号パンフレット)由来のリパーゼ;ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)(国際公開第2011/150157号パンフレット)及びS.プリスティナエスピラリス(S.pristinaespiralis)(国際公開第2012/137147号パンフレット)、GDSL型ストレプトマイセス属(Streptomyces)リパーゼ(国際公開第2010/065455号パンフレット)由来のリパーゼ;国際公開第2011/084412号パンフレットで開示されるとおりのサーモビフィダ・フスカ(Thermobifida fusca)由来のリパーゼ;国際公開第2011/084417号パンフレットで開示されるとおりのゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)由来のリパーゼ;例えば、国際公開第00/60063号パンフレットで開示されるとおりのバチルス属(Bacillus)リパーゼ、Dartois et al.(1992)、Biochemica et Biophysica Acta、1131、253-360又は国際公開第2011/084599号パンフレットで開示されるとおりのB.サブチリス(B.subtilis)、B.ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)(特開昭64-074992号公報)又はB.プミルス(B.pumilus)(国際公開第91/16422号パンフレット)由来のリパーゼ;国際公開第94/01541号パンフレットで開示されるとおりのカンジダ・アンタルティカ(Candida antarctica)由来のリパーゼ;シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)(米国特許第5389536号明細書、国際公開第88/09367号パンフレット)由来のクチナーゼ;マグネポルテ・グリセア(Magnaporthe grisea)(国際公開第2010/107560号パンフレット)由来のクチナーゼ;国際公開第90/09446号パンフレット、国際公開第00/34450号パンフレット及び国際公開第01/92502号パンフレットで開示されるとおりのフサリウム・ソラニ・ピシ(Fusarum solani pisi)由来のクチナーゼ;並びに国際公開第00/34450号パンフレット及び国際公開第01/92502号パンフレットで開示されるとおりのフミコラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)由来のクチナーゼ。
そのような好適なリパーゼバリアントは、例えば、国際公開第95/22615号パンフレット、国際公開第97/04079号パンフレット、国際公開第97/07202号パンフレット、国際公開第00/60063号パンフレット、国際公開第2007/087508号パンフレット、欧州特許第407225号明細書及び欧州特許第260105号明細書で開示されるとおりの方法によって開発されるものである。
市販のリパーゼ酵素としては、商品名Lipolase(商標)、Lipex(商標)、Lipolex(商標)及びLipoclean(商標)(Novozymes A/S)、Lumafast(当初はGenencorから)、Preferenz L(DuPont)及びLipomax(Gist-Brocades/現DSM)の下で販売されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、リパーゼは、真菌トリアシルグリセロールリパーゼ(ECクラス3.1.1.3)から選択される。真菌トリアシルグリセロールリパーゼは、サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)のリパーゼから選択され得る。一実施形態では、サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269によるトリアシルグリセロールリパーゼ及び脂肪分解活性を有するそのバリアントから選択される。
サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269の完全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である脂肪分解活性を有するバリアントから選択され得る。
サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269の機能性ドメインに属さない、保存的変異のみを含む脂肪分解活性を有するバリアントから選択され得る。脂肪分解活性を有するこの実施形態のリパーゼバリアントは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269の完全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%類似し得る。
サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269と比較した場合、以下のアミノ酸置換:T231R及びN233Rを含む脂肪分解活性を有するバリアントから選択され得る。前記リパーゼバリアントは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269と比較した場合、以下のアミノ酸交換:Q4V、V60S、A150G、L227G、P256Kの1つ以上をさらに含み得る。
サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269のポリペプチド配列内にアミノ酸置換T231R、N233R、Q4V、V60S、A150G、L227G、P256Kを含む脂肪分解活性を有するバリアントから選択され得、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269の完全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも95%、少なくとも96%又は少なくとも97%類似している。
サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269内にアミノ酸置換T231R及びN233Rを含む脂肪分解活性を有するバリアントから選択され得、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269の完全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%類似している。
サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、脂肪分解活性を有する米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269のバリアントであり得、米国特許第5869438号明細書の配列番号2のアミノ酸1~269のバリアントは、アミノ酸置換T231R及びN233Rを含有することにおいて特徴付けられる。
サーモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼは、国際公開第2015/01009号パンフレットの配列番号1のアミノ酸1~269のポリペプチド配列内にアミノ酸置換N11K/A18K/G23K/K24A/V77I/D130A/V154I/V187T/T189Q又はN11K/A18K/G23K/K24A/L75R/V77I/D130A/V154I/V187T/T189Qを含む脂肪分解活性を有するバリアントから選択され得、国際公開第2015/01009号パンフレットの配列番号1のアミノ酸1~269の完全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも95%、少なくとも96%又は少なくとも97%類似している。
アミラーゼ
本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントと異なるアミラーゼは、アルファ-又はベータ-アミラーゼ(それぞれEC3.2.1.1及び3.2.1.2)から選択され得る。好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントと異なるアミラーゼもアルファ-アミラーゼ(EC3.2.1.1)である。
本発明によるアミラーゼは、多糖におけるグルコシド結合の(内部)加水分解を含む「アミロース分解活性」又は「アミラーゼ活性」を有する。アルファ-アミラーゼ活性は、当業者に知られるアルファ-アミラーゼ活性の測定のためのアッセイによって決定され得る。
本発明の一態様において、アルファ-アミラーゼバリアントと異なるアミラーゼは、以下から選択され得る:
・国際公開95/10603号パンフレットに記載されるとおりの配列番号2を有するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来のアミラーゼ。好適なバリアントは、国際公開95/10603号パンフレットに記載され、以下の位置において1つ以上の置換を含み:15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408及び444、アミロース分解活性を有する。バリアントは、国際公開第94/02597号パンフレット、国際公開第94/018314号パンフレット、国際公開第97/043424号パンフレット及び国際公開第99/019467号パンフレットの配列番号4に記載される。
・国際公開第02/10355号パンフレットで開示されるとおりの配列番号6を有するB.ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)由来のアミラーゼ又はその野生型配列を超えてC末端短縮化を任意選択により有するアミラーゼ。配列番号6の好適バリアントとしては、位置181及び/若しくは182における欠失並びに/又は位置193における置換を含むものが挙げられる。
・国際公開99/19467号パンフレットで開示されるとおりの配列番号6を有するバチルス属種(Bacillus sp.)707由来のアミラーゼ。配列番号6の好ましいバリアントは、以下の位置の1つ以上において置換、欠失又は挿入を有するものである:R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216及びK269。
・SP-722としても本明細書に記載される、国際公開第96/23872号パンフレットに記載されるとおりの配列番号2又は配列番号7を有するバチルス・ハルマパルス(Bacillus halmapalus)由来のアミラーゼ。好ましいバリアントは、国際公開第97/3296号パンフレット、国際公開第99/194671号パンフレット及び国際公開第2013/001078号パンフレットにおいて記載される。
・国際公開第00/22103号パンフレットで開示されるとおりの配列番号4を有するバチルス属種(Bacillus sp.)DSM 12649由来のアミラーゼ。
・国際公開第2009/061380号パンフレットで開示されるとおりの配列番号2を有するバチルス属(Bacillus)の株TS-23由来のアミラーゼ。使用され得るさらなるアミラーゼは、国際公開第2009/061380号パンフレットの配列番号2を有するアミラーゼ又は配列番号2と90%の配列同一性を有するそのバリアントである。配列番号2の好ましいバリアントは、以下の位置の1つ以上において置換、欠失又は挿入を有するものである:Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444及びG475。配列番号2の最も好ましいバリアントは、以下の位置の1つ以上における置換を有するものである:Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E及びG475K並びに/又は位置R180及び/若しくはS181における欠失。配列番号2の最も好ましいアミラーゼバリアントは、置換:N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K、N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K、S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K又はS125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475Kを有するものであり、バリアントは、任意選択により、位置243での置換並びに/又は位置180及び/若しくは181での欠失をさらに含む。
・国際公開第2013/184577号パンフレットで開示されるとおりの配列番号1を有するサイトファーガ属種(Cytophaga sp.)由来のアミラーゼ。
・国際公開第2010/104675号パンフレットで開示されるとおりの配列番号1を有するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)DSM 90由来のアミラーゼ。
・国際公開00/60060号パンフレットに記載されるとおりの配列番号2のアミノ酸1~485を含むバチルス属種(Bacillus sp.)由来のアミラーゼ。
・国際公開第2016/092009号パンフレットに記載されるとおりの配列番号3に従うアミラーゼから好ましくは選択される、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)又はそのバリアント由来のアミラーゼ。
・国際公開第2006/002643号パンフレットに記載されるとおりの配列番号12を有するアミラーゼ又は前記配列番号12内の置換Y295F及びM202LITVを含むアミラーゼバリアント。
・国際公開第2011/098531号パンフレットに記載されるとおりの配列番号6を有するアミラーゼ又は前記配列番号6内の193[G,A,S,T又はM]、195[F,W,Y,L,I又はV]、197[F,W,Y,L,I又はV]、198[Q又はN]、200[F,W,Y,L,I又はV]、203[F,W,Y,L,I又はV]、206[F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D又はE]、210[F,W,Y,L,I又はV]、212[F,W,Y,L,I又はV]、213[G,A,S,T又はM]及び243[F,W,Y,L,I又はV]からなる群から選択される1つ以上の位置で置換を含むアミラーゼバリアント。
・国際公開第2013/001078号パンフレットに記載されるとおりの配列番号1を有するアミラーゼ又は前記配列番号1内の位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476及びG477に対応する2つ以上の(いくつかの)位置で改変を含むアミラーゼバリアント。
・国際公開第2013/001087号パンフレットに記載されるとおりの配列番号2を有するアミラーゼ又は前記配列番号2内のW140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476及びG477に対応する位置のいずれかにおける1つ又は2つ以上の改変を任意選択により含む、前記配列番号2内の位置181+182,又は182+183又は183+184の欠失を含むアミラーゼバリアント。
・例えば、国際公開第2006/066594号パンフレットに記載されるとおりの上述のアミラーゼに由来するハイブリッドアルファ-アミラーゼであるアミラーゼ;他のアミラーゼの例は、国際公開第2006/066594号パンフレットの配列番号6に示されるB.アミロリケファシエンス(B.myloliquefaciens)に由来するa-アミラーゼの残基1~33及び国際公開第2006/066594号パンフレットの配列番号4に示されるB.リケニフォルミス(B.licheniformis)a-アミラーゼの残基36~483を含むハイブリッドa-アミラーゼ又はそれと90%の配列同一性を有するバリアントである。このハイブリッドa-アミラーゼの好ましいバリアントは、以下の位置の1つ以上において置換、欠失又は挿入を有するものである:G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209及びQ264。国際公開第2006/066594号パンフレットの配列番号6の残基1~33及び国際公開第2006/066594号パンフレットの配列番号4の残基36~483を含むハイブリッドa-アミラーゼの最も好ましいバリアントは、置換:M197T、H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S又はG48+T49+G107+H156+A181+N190+I201+A209+Q264を有するものである。
・国際公開第2014/183920号パンフレットの配列番号2と少なくとも90%の同一性を有するA及びBドメイン並びに国際公開第2014/183920号パンフレットの配列番号6と少なくとも90%の同一性を有するCドメインを有する国際公開第2014/183920号パンフレットによるハイブリッドアミラーゼ(ハイブリッドアミラーゼは、アミロース分解活性を有し;好ましくは、ハイブリッドアルファ-アミラーゼは、国際公開第2014/183920号パンフレットの配列番号23と少なくとも95%同一であり、アミロース分解活性を有する);
・国際公開第2014/183921号パンフレットで開示されるとおりの配列番号2、配列番号15、配列番号20、配列番号23、配列番号29、配列番号26、配列番号32及び配列番号3と少なくとも75%の同一性を有するA及びBドメイン並びに国際公開第2014/183921号パンフレットの配列番号6と少なくとも90%の同一性を有するCドメインを有する国際公開第2014/183921号パンフレットによるハイブリッドアミラーゼ(ハイブリッドアミラーゼは、アミロース分解活性を有し;好ましくは、ハイブリッドアルファ-アミラーゼは、国際公開第2014/183921号パンフレットで開示されるとおりの配列番号30と少なくとも95%同一であり、アミロース分解活性を有する)。
・他のアミラーゼは、国際公開第2016/203064号の配列番号1のバリアントであって、その配列番号1と少なくとも75%の配列同一性を有するバリアントである。好ましいバリアントは、配列番号1の位置1、54、56、72、109、113、116、134、140、159、167、169、172、173、174、181、182、183、184、189、194、195、206、255、260、262、265、284、289、304、305、347、391、395、439、469、444、473、476及び477に対応する1つ以上の位置において改変を含むバリアントであり、前記a-アミラーゼバリアントは、配列番号1と少なくとも75%であるが、100%未満の配列同一性を有する。
・アミラーゼの他の例は、国際公開第2001/066712号パンフレットの配列番号12を有するa-アミラーゼ又は配列番号12と少なくとも90%の配列同一性を有するバリアントである。好ましいアミラーゼバリアントは、国際公開第2001/066712号パンフレットの配列番号12の以下の位置の1つ以上における置換、欠失又は挿入を有するものである:R28、R118、N174;R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314;R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特定の好ましいアミラーゼとしては、D183及びG184の欠失を有し、且つ置換R118K、N195F、R320K及びR458Kを有するバリアント並びに群:M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345及びA339から選択される1つ以上の位置における置換をさらに有するバリアント、これら全ての位置において置換をさらに有する最も好ましいバリアントが挙げられる。
一実施形態では、少なくとも1つのアミラーゼは、商品名Duramyl(商標)、Termamyl(商標)、Fungamyl(商標)、Stainzyme(商標)、Stainzyme Plus(商標)、Natalase(商標)、Liquozyme X及びBAN(商標)、Amplify(商標)、Amplify Prime(商標)(Novozymes A/S)及びRapidase(商標)、Purastar(商標)、Powerase(商標)、Effectenz(商標)(DuPontからのM100)、Preferenz(商標)(S1000、S110、S210及びF1000;DuPont)、Excellenz(商標)(S3300)、PrimaGreen(商標)(ALL;DuPont)、Optisize(商標)(DuPont)の下で販売される製品を含むが、これらに限定されない市販のアミラーゼから選択される。
マンナナーゼ
本明細書に記載されるとおりの「マンナナーゼ」は、マンナン分解酵素の群から選択される酵素である。マンナン分解酵素は、β-マンノシダーゼ(EC3.2.1.25)、エンド-1,4-β-マンノシダーゼ(EC3.2.1.78)及び1,4-β-マンノビオシダーゼ(EC3.2.1.100)から選択され得る。好ましくは、マンナン分解酵素は、エンド-1,4-β-マンノシダーゼ(EC3.2.1.78)の群、本明細書でエンド-β-1,4-D-マンナナーゼ、β-マンナナーゼ又はマンナナーゼと呼ばれ得る酵素の群から選択される。
マンナナーゼは、特開平0304706号公報[バチルス属種(Bacillus sp.)由来のベータ-マンナナーゼ]、特開昭63056289号公報[アルカリ、熱安定性ベータ-マンナナーゼ]、特開昭63036774号公報[アルカリpHでベータ-マンナナーゼ及びベータ-マンノシダーゼを生成するバチルス属(Bacillus)微生物FERM P-8856]、特開平08051975号公報[好アルカリ性バチルス属種(Bacillus sp.)AM-001由来のアルカリベータ-マンナナーゼ]、国際公開第97/11164号パンフレット[バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)由来のマンナナーゼ]、国際公開第91/18974号パンフレット[極端なpH及び温度で活性のマンナナーゼ]、国際公開第97/11164号パンフレット[バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)由来のマンナナーゼ]、国際公開第2014/100018号パンフレット[バチルス・サークランス(Bacillus circulans)又はバチルス・レンタス(Bacillus lentus)株CMG1240からクローン化されたエンド-(3-マンナナーゼ1(Bleman1;米国特許第5,476,775号明細書を参照されたい)]に記載されるものなどのバチルス属(Bacillus)生物に由来するマンナナーゼから選択され得る。好適なマンナナーゼは、国際公開第99/064619号パンフレットに記載されている。
マンナナーゼは、国際公開第93/24622号パンフレットで開示されるものなどのトリコデルマ属(Trichoderma)生物に由来するマンナナーゼから選択され得る。
マンナナーゼは、Mannaway(登録商標)(Novozymes A/S)又はPreferenz(登録商標)(M100)(DuPont)などの市販のマンナナーゼから選択され得る。
洗剤組成物
一実施形態では、本発明は、洗剤組成物中のアルファ-アミラーゼバリアントの使用に関する。したがって、本発明は、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアント及び1種以上の洗剤構成成分を含む洗剤組成物にも関する。1種以上の洗剤構成成分は、本発明のアルファ-アミラーゼと異なる追加の酵素、界面活性剤、消泡剤、ビルディング剤(ビルダー)、ポリマー、漂白系(漂白剤)、レオロジー改質剤、ヒドロトロープ、柔軟剤、乾燥剤、増白剤、緩衝液、保存剤、防食添加剤、色素及び芳香剤からなる群から選択され得る。
好ましくは、洗剤の少なくとも1種の構成成分は、界面活性剤である。好ましくは、洗剤の少なくとも1種のさらなる構成成分は、本発明のアルファ-アミラーゼと異なる本明細書に記載されるとおりの第2の酵素である。
洗剤構成成分は、洗剤配合物の最終的な適用において2種以上の機能を有し得、したがって、本明細書で特定の機能に関連して言及される任意の洗剤構成成分も洗剤配合物の最終的な適用において別の機能を有し得る。洗剤配合物の最終的な適用における特定の洗剤構成成分の機能は、通常、洗剤配合物内のその量、すなわち洗剤構成成分の有効量に依存する。洗剤構成成分は、白色の織物、色付きの織物及び羊毛の洗濯などの所望の適用に応じて、洗剤配合物において種類及び/又は量が変動する。選択される構成成分は、洗剤配合物の物理的形態(パウチにおいて又は錠剤などとして提供される液体、固体、ゲル)にさらに依存する。例えば、洗濯配合物のために選択される構成成分は、使用される洗浄温度、洗濯機の機構(水平方向の軸の機械に対する垂直方向の軸の機械)、1洗浄サイクル当たりの水消費量のような態様及び水の平均硬度のような地理的特徴にそれ自体が関連する地域の慣習にさらに依存する。
一実施形態では、洗剤配合物は、3種以上の洗剤構成成分の配合物であり、少なくとも1種の構成成分は、しみ除去に効果的であり、少なくとも1種の構成成分は、最適なクリーニング条件を提供する際に効果的であり、少なくとも1種の構成成分は、洗剤の物理的特徴を維持する際に効果的である。
洗剤組成物は、液体若しくは固体洗剤組成物又は液体及び固体洗剤組成物の組み合わせであり得る。液体洗剤組成物は、好ましくは、ゲル洗剤組成物である。固体洗剤組成物は、石鹸バー又は粉末洗剤組成物、好ましくは粉末洗剤組成物であり得、粉末洗剤組成物は、錠剤に圧縮され得る。
洗剤組成物は、単位用量又は複数用量の組成物であり得る。洗剤組成物は、複数区画のパウチを含む、パウチの形態中にあり得る。洗剤組成物は、ホームケア並びに/又は工業及び施設(I&I)クリーニングに好適な洗濯又は食器洗浄洗剤組成物であり得る。洗濯及び食器洗浄組成物の両方は、手洗い又は自動洗浄組成物の形態であり得る。好ましくは、食器洗浄組成物は、自動食器洗浄(ADW)である。
洗剤パウチは、組成物を保持するのに好適な任意の形態、形状及び材料のものであり得、例えば水との接触前にパウチから組成物が放出できないようにする。パウチは、内体積を囲む水溶性フィルムから作られる。前記内体積は、パウチの区画に分割することができる。好ましいフィルムは、ポリマー材料、好ましくはフィルム又はシートに形成されるポリマーである。好ましいポリマー、コポリマー又はその誘導体は、選択されるポリアクリレート及び水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレートであり、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマー及びヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)である。好ましくは、フィルム中のポリマー、例えばPVAのレベルは、少なくとも約60%である。好ましい平均分子量は、通常、約20,000~約150,000となる。フィルムは、ポリアクチド及びポリビニルアルコール(Chris Craft In.Prod.Of Gary,Ind.,USによって販売される同業者信用照会先M8630の下で知られる)などの加水分解的に分解可能であり、且つ水溶性のポリマーブレンドと、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール及びその混合物のような可塑剤とを含むブレンド組成物でもあり得る。パウチは、水溶性フィルムによって分離された固体洗濯クリーニング組成物若しくは一部分の構成成分及び/又は液体クリーニング組成物若しくは一部分の構成成分を含むことができる。液体構成成分用の区画は、固体を含有する区画とは組成が異なり得る(例えば、米国特許出願公開第2009/0011970号明細書を参照されたい)。
一実施形態では、本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントは、洗剤組成物の1kg当たり1~1000mgの活性アルファ-アミラーゼバリアント、好ましくは5~500mg/kg、5~300mg/kg、10~200mg/kg又は50~200mg/kgに対応する量で洗剤組成物に加えられ得る。
一実施形態では、洗剤配合物は、5~12の範囲、好ましくは6~11の範囲、より好ましくは6~10、7~9及び7.5~8.5から選択される範囲のpHを有する。一実施形態では、配合物は、洗剤配合物、好ましくは液体洗剤配合物である。
一実施形態では、本発明による洗剤配合物は、1種以上の界面活性剤を含む。「界面活性剤」(本明細書で「界面活性薬剤」と同義的に使用される)は、液体に加えられるとき、その液体の界面での特性を変える有機化学物質を意味する。そのイオン電荷に応じて、界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性又は両性と呼ばれる。
本発明の洗剤組成物は、アニオン性、及び/若しくはカチオン性、及び/若しくは非イオン性、及び/若しくは半極性、及び/若しくは双性イオン性又はこれらの混合物であり得る1種以上の界面活性剤を含み得る。好ましい実施形態では、本発明の洗剤組成物は、少なくとも1種の界面活性剤を含む。特定の実施形態では、本発明の洗剤組成物は、1種以上の非イオン性界面活性剤及び1種以上のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、通常、約0.1~60重量%、例えば1~40重量%、3~20重量%又は3~10重量%のレベルで存在する。界面活性剤は、所望のクリーニング用途に基づいて選択され、当技術分野において知られる任意の従来の界面活性剤を含む。洗剤における使用のために当技術分野で知られる任意の界面活性剤が利用され得る。界面活性剤の非限定的な例は、開示されたMcCutcheon’s 2016 Detergents and Emulsifiers及びMcCutcheon’s 2016 Functional Materialsであり、両者は北米版及び国際版であり、MC Publishing Co,2016版である。さらなる有用な例は、当業者に知られる同じ出版物の以前の版において開示される。
そこに含まれる場合、洗剤は、通常、約1~40重量%、例えば5~30重量%、5~15重量%又は20~25重量%のアニオン性界面活性剤を含むことになる。アニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、硫酸塩及びスルホン酸塩、特に直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、LASの異性体、分岐アルキルベンゼンスルホネート(BABS)、フェニルアルカンスルホネート、アルファ-オレフィンスルホネート(AOS)、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン-2,3-ジイルビス(硫酸塩)、ヒドロキシアルカンスルホネート及びジスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などのアルキルスルフェート(AS)、脂肪族アルコールスルフェート(FAS)、第1級アルコールスルフェート(PAS)、アルコールエーテルスルフェート(アルコールエトキシスルフェート又は脂肪族アルコールエーテルスルフェートとしても知られるAES又はAEOS又はFES)、第2級アルカンスルホネート(SAS)、パラフィンスルホネート(PS)、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート(MES)を含むアルファ-スルホ脂肪酸メチルエステル(アルファ-SFMe又はSES)、アルキル-又はアルケニルコハク酸、ドデセニル/テトラデセニルコハク酸(DTSA)、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸のジエステル及びモノエステル又は石鹸並びにその組み合わせが挙げられる。
そこに含まれる場合、洗剤は、通常、約0~約10重量%のカチオン性界面活性剤を含むことになる。カチオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルエタノールアミンクワット(ADMEAQ)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド(DSDMAC)及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム、アルキル四級アンモニウム化合物、アルコキシル化四級アンモニウム(AQA)化合物及びその組み合わせが挙げられる。
そこに含まれる場合、洗剤は、通常、約0.2~40重量%のアニオン性界面活性剤、例えば0.5~30重量%、特に1~20重量%、3~10重量%、3~5重量%又は8~12重量%を含むことになる。非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート(AE又はAEO)、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪族アルコール(PFA)、アルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、例えばエトキシル化脂肪酸アルキルエステル及び/又はプロポキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート(APE)、ノニルフェノールエトキシレート(NPE)、アルキルポリグリコシド(APG)、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド(FAM)、脂肪酸ジエタノールアミド(FADA)、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド(EFAM)、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド(PFAM)、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド又はグルコサミンのN-アシルN-アルキル誘導体(グルコサミド、GA又は脂肪酸グルカミド、FAGA)、並びに商品名SPAN及びTWEENで入手可能な製品、並びにその組み合わせが挙げられる。
そこに含まれる場合、洗剤は、通常、約0~約10重量%の半極性界面活性剤を含むことになる。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルアミンオキシド、N-(ココアルキル)-N,N-ジメチルアミンオキシド及びN-(牛脂-アルキル)-N,N-ビス-(2-ヒドロキシ-エチル)アミンオキシドなどのアミンオキシド(AO)、脂肪酸アルカノールアミド及びエトキシ化脂肪酸アルカノールアミド並びにその組み合わせが挙げられる。
そこに含まれる場合、洗剤は、通常、約0~約10重量%の双性イオン性界面活性剤を含むことになる。双性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタイン、スルホベタイン及びその組み合わせが挙げられる。
本発明による洗剤配合物は、カルシウム及びマグネシウムと水溶性の錯体を形成し得る錯化剤(キレート剤(キラント)、隔離剤)、沈殿剤及びイオン交換化合物から選択される1種以上の化合物を含み得る。そのような化合物は、本明細書において「ビルダー」又は「ビルディング剤」と呼ばれる場合があるが、そのような化合物を洗剤配合物の最終的な適用においてこの機能に限定することを意味しない。
一実施形態では、本発明の洗剤配合物は、グルコン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホスホン酸ナトリウム、アミノカルボン酸ナトリウム、ポリカルボン酸ナトリウム、ポリスルホン酸ナトリウム及びポリホスホン酸ナトリウムなどの非リン酸系ビルダーから選択される少なくとも1種のビルダーを含む。一実施形態では、本発明の洗剤配合物は、強力な金属イオン捕捉ビルダーを含む。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、リン酸塩を含まず、本質的にリン酸塩系ビルダーを含まないことを意味する。本明細書では、「本質的にリン酸塩を含まない」は、リン酸塩及びポリリン酸塩の含量が、重量測定によって決定され、それぞれの本発明の洗剤組成物を参照して合計で10ppm~1重量%の範囲にあることを意味するものとして理解されるべきである。別の好ましい実施形態では、洗剤配合物は、ホスホン酸塩を含み、ホスホン酸塩は、好ましくは、DTPMP及び/又はHEDPである。
一実施形態では、本発明の洗剤配合物は、クエン酸のモノアルカリ及びジアルカリ金属塩及び特に、モノナトリウム塩及び好ましくは三ナトリウム塩、クエン酸のアンモニウム塩又は置換アンモニウム塩並びにそのようなクエン酸から選択される少なくとも1種の「クエン酸塩」を含む。クエン酸塩は、無水化合物又は例えばクエン酸ナトリウム二水和物などの水和物として用いられ得る。クエン酸塩は、洗剤配合物の総重量に対して0重量%~約20重量%の範囲、約0.5重量%~約10重量%の範囲又は1~5重量%の範囲の総量で含まれ得る。一実施形態では、本発明の洗剤配合物は、洗剤配合物の総量に対して約1~3%の範囲のクエン酸塩の総量を含む。
本発明の洗剤組成物は、1種以上のケイ酸塩を含み得る。本発明に関連して、「ケイ酸塩」は、特に、二ケイ酸ナトリウム及びメタケイ酸ナトリウム、ゼオライトAのようなアルミノケイ酸ナトリウムなどのアルミノケイ酸塩(すなわちNa12(AlO12(SiO12*27HO)及び層状ケイ酸塩、特に式アルファ-NaSi、ベータ-NaSi及びデルタ-NaSiのものが挙げられる。
本発明の洗剤組成物は、1種以上の炭酸塩を含み得る。「炭酸塩」という用語は、アルカリ金属炭酸塩及びアルカリ金属炭酸水素塩を含み、ナトリウム塩が好ましい。炭酸ナトリウム(NaCO)が特に好ましい。
本発明の洗剤組成物は、1種以上のリン酸塩を含み得る。「ホスホン酸塩」としては、2-ホスホニウムブタン-1,2,4-トリカルボン酸(PBTC);エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMPA);1-ヒドロキシエタン-1,1-ジホスホン酸(HEDP)、CHC(OH)[PO(OH);アミノトリス(メチレンホスホン酸)(ATMP)、N[CHPO(OH);アミノトリス(メチレンホスホナート)、ナトリウム塩(ATMP)、N[CHPO(ONa);2-ヒドロキシエチルイミノビス(メチレンホスホン酸)、HOCHCHN[CHPO(OH);ジエチレントリアミンペンタ(メチレンホスホン酸)(DTPMP)、(HO)POCHN[CHCHN[CHPO(OH);ジエチレントリアミンペンタ(メチレンホスホナート)、ナトリウム塩、C(28-x)Na15(x=7);ヘキサメチレンジアミン(テトラメチレンホスホナート)、カリウム塩、C10(28-x)12(x=6);及びビス(ヘキサメチレン)トリアミン(ペンタメチレンホスホン酸)、(HO)POCHN[(CHN[CHPO(OH)が挙げられるが、これらに限定されない。その塩も好適であり得る。
本発明の洗剤組成物は、1種以上のアミノカルボン酸塩を含み得る。好適な「アミノカルボン酸塩」の非限定的な例としては、ジエタノールグリシン(DEG)、ジメチルグリシン(DMG)、ニトリロ三酢酸(NTA)、N-ヒドロキシエチルアミノ二酢酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、N-(2ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸(HEIDA)、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、N-ヒドロキシエチル-エチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)及びメチルグリシン二酢酸(MGDA)、グルタミン酸-二酢酸(GLDA)、イミノジコハク酸(IDS)、ヒドロキシイミノジコハク酸、エチレンジアミンジコハク酸(EDDS)、アスパラギン酸-二酢酸並びにそのアルカリ金属塩又はアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。さらに好適なものは、アスパラギン酸-N-モノ酢酸(ASMA)、アスパラギン酸-N,N-二酢酸(ASDA)、アスパラギン酸-N-モノプロピオン酸(ASMP)、N-(2-スルホメチル)アスパラギン酸(SMAS)、N-(2-スルホメチル)アスパラギン酸(SEAS)、N-(2-スルホメチル)グルタミン酸(SMGL)、N-(2-スルホメチル)グルタミン酸(SEGL)、N-メチルイミノ二酢酸(MIDA)、アルファ-アラニン-N,N-二酢酸(アルファ-ALDA)、セリン-N,N-二酢酸(SEDA)、イソセリン-N,N-二酢酸(ISDA)、フェニルアラニン-N,N-二酢酸(PHDA)、アントラニル酸-N,N-二酢酸(ANDA)、スルファニル酸-N,N-二酢酸(SLDA)、タウリン-N,N-二酢酸(TUDA)及びスルホメチル-N,N-二酢酸(SMDA)並びにそのアルカリ金属塩又はアンモニウム塩である。用語「アンモニウム塩」は、これに関連して使用する場合、持続的に又は一時的に四級化されている窒素原子を有する少なくとも1つのカチオンとの塩を指す。持続的に四級化されている少なくとも1つの窒素原子を有するカチオンの例としては、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、ジメチルジエチルアンモニウム及びn-C10~C20-アルキルトリメチルアンモニウムが挙げられる。一時的に四級化されている少なくとも1つの窒素原子を有するカチオンの例としては、モノメチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、モノエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、n-C10~C20-アルキルジメチルアンモニウム2-ヒドロキシエチルアンモニウム、ビス(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム、トリス(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム、N-メチル2-ヒドロキシエチルアンモニウム、N,N-ジメチル-2-ヒドロキシエチルアンモニウム及び特にNH などの保護されたアミン及びアンモニアが挙げられる。
一実施形態では、本発明の洗剤組成物は、2種以上のビルダーを含む。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、洗剤組成物の総重量に対して、0.2重量%未満のニトリロ三酢酸(NTA)又は0.01~0.1重量%のNTAを含有する。
一実施形態では、本発明の洗剤組成物は、メチルグリシン二酢酸(MGDA)、グルタミン酸二酢酸(GLDA)及びその対応する塩、例えばそのアルカリ(ナトリウムなど)塩から選択される少なくとも1種のアミノカルボン酸塩を、洗剤組成物の総重量に対して0.1重量%~25.0重量%の範囲、1.0重量%~18.0重量%の範囲、3.0重量%~15.0重量%の範囲、3.0重量%~10.0重量%の範囲又は5.0重量%~8.0重量%の範囲の量で含む。
本発明の洗剤配合物は、1種以上のヒドロトロープを含み得る。1種以上のヒドロトロープは、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、1,2-プロピレングリコール及び制約のない標準的な条件下で水混和性である当技術分野で知られるさらなる有機溶媒などの有機溶媒から選択され得る。一実施形態では、本発明の洗剤配合物は、洗剤配合物の総重量に対して、5~10重量%の範囲、好ましくは約6重量%の総量で1,2-プロピレングリコールを含む。ヒドロトロープのさらなる非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、p-トルエンスルホン酸ナトリウム(STS)、キシレンスルホン酸ナトリウム(SXS)、クメンスルホン酸ナトリウム(SCS)、シメンスルホン酸ナトリウム、アミン酸化物、アルコール及びポリグリコールエーテル、ナトリウムヒドロキシナフトエート、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムエチルヘキシル並びにその組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、洗剤組成物は、少なくとも1種の保存剤を含む。好ましくは、保存剤は、保存のために液体組成物に加えられる物質を意味し、より好ましくは、生成プロセスにおいて形成される液体組成物中に含まれる保存機能を有することが知られる化合物が保存剤という用語から除外されることを意味する。一実施形態では、保存剤は、2-フェノキシエタノール、グルタルアルデヒド、2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール及び酸形態又はその塩としてのギ酸並びに4,4’-ジクロロ2-ヒドロキシジフェニルエーテルからなる群から選択される。通常、本発明の液体組成物は、液体組成物の総重量に対して2ppm~5重量%の範囲の量など、10ppm未満の量で少なくとも1種の保存剤を含む。好ましくは、液体組成物は、保存剤を含まないが、これは、保存剤が1ppm未満の量で含まれることを意味する。
洗剤配合物は、プロテアーゼ、本発明のアルファ-アミラーゼバリアントと異なるアミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、フィターゼ、DNアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチン分解酵素、カルボヒドラーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キサンタナーゼ、キシログルカナーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、本発明によるアルファ-アミラーゼバリアントではない1種以上の他の酵素を含み得る。好ましくは、洗剤配合物は、本明細書で開示されるとおりの少なくとも1種のプロテアーゼ、好ましくは配合物10~14のいずれか、好ましくは配列番号10と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプロテアーゼを含む。特に好ましい追加の酵素は、本明細書の他の箇所で開示され、その記載は、本明細書のこの部分にも参照により組み込まれる。
洗剤配合物は、カルシウム及び/又はマグネシウムイオンの水溶性供給源を含み得る。一実施形態では、洗剤配合物は、上で開示されるとおりのポリオール及び水溶性塩から選択される少なくとも1種の酵素安定剤を含む。
洗剤配合物は、上で開示されるとおりのホウ素含有化合物及びペプチド安定剤から選択される少なくとも1種の酵素安定剤を含み得る。
一実施形態では、本発明は、液体洗剤配合物、より好ましくは液体洗濯洗剤配合物を提供する方法であって、1つ以上の工程において、
(a)本発明による少なくとも1種のアルファ-アミラーゼバリアント(アミラーゼは、本発明の酵素調製物内で提供される);及び
(b)クリーニング性能において有効であるか又は洗剤の物理的特徴を維持する際に有効な量で存在する界面活性剤、ビルダー及びヒドロトロープから選択される少なくとも1種の洗剤構成成分
を混合する工程を含む方法に関する。
好ましくは、洗剤組成物は、下の表1aに従う。
代替的な洗剤配合物は、下の表1bに従う洗剤組成物である。
表1a及び表1bにおいて示される洗剤配合物に1種以上の酵素が本明細書に記載されるとおりに加えられ得る。
使用方法
本発明は、ホームケア及びI&Iクリーニングを含む洗濯又は硬質表面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける本明細書に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアントの使用にも関する。したがって、本発明は、洗剤中での改善されたアルファ-アミラーゼ安定性及び/又は洗剤組成物の改善された洗浄性能を提供するための本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントを含む組成物の使用にも関する。
したがって、本発明は、改善されたアルファ-アミラーゼ安定性及び/又は洗浄性能を有する洗剤組成物を提供するための方法であって、
a)本明細書に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアント;及び
b)1種以上の洗剤構成成分
を含む洗剤組成物の使用を含む方法も参照する。
好ましい実施形態
特に、本明細書で好ましいのは、以下である。
好ましい実施形態1.)親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントであって、
(i)a)配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸置換、又は
b)親配列と比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX9D、X9F、X9K、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T、X9Y、X179G、X181D、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186R、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206M、X206Y、X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N、X244V、X402T、X419C、X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L、X420Q、X422C、X422N、X422H、X423F、X423M、X423Q、X423S、X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W、X428Y、X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T、X430V、X435K、X435P、X435S、X435A、X435D、X437L、X437T、X437W、X441C、X441K、X441L、X441M、X441S、X444H、X444M、X444N、X444R、X444T、X450C、X450D、X450E、X450H、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R、X450T、X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N、X452T、X454A、X454E、X454K、X454L、X454P、X454S、X454T、X466E、X466W、X469F、X469L、X469Y、X475A、X475K、X475E、X475L、X479I、X479K、X479M、X483F、X483L、X483Q及びX483Rからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換、好ましくはX181D、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186R、X186V、X186W、X186Y、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X206C、X206H、X206M、X206Y、X441C、X441K、X441L、X441M及びX441Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換、又は
c)親配列と比較して、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う1、2、3、5、7、8、9、11、16、18、19、25、26、29、30、31、35、37、40、41、43、44、46、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、71、72、73、74、77、78、79、80、81、84、85、86、87、88、90、91、93、94、97、98、101、102、103、104、105、106、107、109、110、111、112、113、114、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、151、152、153、155、157、158、159、160、161、162、163、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、188、189、190、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、216、217、218、219、220、224、225、227、228、229、230、231、232、235、238、239、241、242、243、244、246、247、248、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、269、270、272、273、274、275、276、278、279、280、281、283、284、286、287、291、292、293、294、295、296、298、299、300、302、303、304、305、306、307、310、311、313、314、315、316、317、319、320、321、322、323、324、325、328、329、330、331、332、334、335、337、339、340、342、344、345、346、347、349、350、354、357、359、360、361、362、363、364、365、368、369、371、372、373、374、375、377、380、382、383、384、385、386、387、388、390、391、393、394、395、396、397、398、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、425、427、428、430、431、433、434、435、437、438、439、441、444、445、446、447、449、450、452、454、455、457、458、460、461、462、464、465、466、467、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、481、483、484及び485からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、
(ii)配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも91%、少なくとも91.5%、少なくとも92.0%、少なくとも92.5%、少なくとも93.0%、少なくとも93.5%、94.0%、少なくとも94.5%、より好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも95.5%、少なくとも96.0%、少なくとも96.5%、少なくとも97.0%、少なくとも97.5%、少なくとも98.0%、少なくとも98.5%、少なくとも99.0%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を有し、及び
(iii)アルファ-アミラーゼ活性を有する、アルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態2.):アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1若しくは配列番号3によるアミラーゼ又は配列番号1若しくは配列番号3と少なくとも60%の配列同一性を有するアルファ-アミラーゼであり、最も好ましくは、アルファ-アミラーゼバリアントのための親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼであり、好ましくは、アミノ酸置換の結果として生じるアミノ酸残基は、配列番号3又は5における対応する位置でのアミノ酸残基と同一ではない、先行する好ましい実施形態によるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態3.):アルファ-アミラーゼバリアントは、上記の位置でのアミノ酸置換の1~30個、好ましくは1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~8又は2~5個、好ましくは3~30、3~25、3~20、3~15、3~10、3~8又は3~5個、好ましくは4~30、4~25、4~20、4~15、4~10又は4~8個を含む、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼ。
好ましい実施形態4.):アルファ-アミラーゼバリアントは、任意選択により、1~30、1~20、1~10又は1~5個の追加の保存的アミノ酸置換を好ましくは親アルファ-アミラーゼのいずれかの機能性ドメインの外部、好ましくは親アルファ-アミラーゼの触媒活性ドメインの外部にさらに含む、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼ。
好ましい実施形態5.):バリアントは、A及びBドメイン並びにCドメインを含み、A及びBドメインのアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも75%であるが、100%未満同一であり、及びCドメインのアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも75%であるが、100%未満同一である、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼ。
好ましい実施形態6.):1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う、4、25、100、135、135、135、135、160、176、193、251、258、276、299、323、363、363、382、405、460及び482からなる群から選択されるか又は4、7、25、37、70、100、118、135、160、176、193、210、251、281、258、323、361、363、368、405、434、441、459、460、451及び482からなる群から選択される、好ましくは25、100、135、176、193及び460からなる群から選択される、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態7.):1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX100D、X100F、X100K、X100L、X103A、X106D、X108A、X109A、X10A、X10C、X10E、X10F、X10L、X10W、X10Y、X113F、X113H、X113M、X113R、X113V、X113W、X113Y、X114A、X114C、X114D、X114E、X114F、X114G、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114N、X114Q、X114R、X114S、X114V、X114W、X114Y、X115C、X115D、X115K、X115M、X115N、X115Q、X115R、X115S、X115T、X115V、X116I、X116K、X116L、X116M、X116R、X116T、X117A、X117C、X117D、X117F、X117I、X117N、X117P、X117R、X117W、X117Y、X118A、X118D、X118E、X119H、X119P、X119R、X119S、X119Y、X120E、X120G、X120M、X120S、X120W、X120Y、X123D、X123S、X125A、X125D、X125E、X125F、X125G、X125H、X125K、X125L、X125M、X125N、X125Q、X125R、X125T、X125V、X125W、X125Y、X126D、X128C、X128E、X128L、X128M、X128W、X128Y、X129E、X12N、X12S、X131C、X131I、X131L、X131Q、X131W、X132T、X133A、X133C、X133D、X133E、X133H、X133K、X133N、X133P、X133Q、X133S、X134C、X134E、X134F、X134I、X134L、X134M、X134P、X134T、X134V、X134W、X134Y、X135D、X135E、X135G、X135M、X135N、X135P、X135S、X135T、X135W、X136A、X136C、X136D、X136E、X136F、X136H、X136L、X136M、X136N、X136P、X136W、X139C、X139S、X13A、X13Y、X141V、X142C、X142E、X142F、X142L、X142M、X142Q、X142R、X142W、X142Y、X143F、X144C、X144E、X144G、X144K、X144N、X144Q、X144R、X144S、X144T、X144V、X144Y、X145A、X146C、X146D、X146E、X146F、X146G、X146H、X146K、X146L、X146S、X146T、X146W、X147M、X149E、X14N、X150C、X150E、X150Q、X151C、X151E、X154A、X154Y、X155Y、X156E、X156V、X158H、X158N、X158Y、X15R、X160D、X160E、X160W、X161T、X162V、X163A、X163Q、X163T、X164V、X165S、X165T、X165W、X169A、X169D、X169E、X169S、X169V、X16F、X16R、X170C、X170F、X172A、X172C、X172D、X172K、X172N、X173I、X173Y、X174D、X174E、X174G、X174H、X174M、X174N、X174P、X174S、X174T、X175A、X175G、X175H、X175Q、X176K、X176S、X176T、X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S、X177W、X178F、X17K、X17V、X180M、X180N、X180T、X180W、X182D、X182E、X182N、X182Q、X182S、X185E、X185M、X185N、X187A、X187D、X187M、X187V、X188H、X188T、X188V、X189I、X18F、X18I、X18K、X18M、X18R、X18T、X191F、X191H、X191K、X191M、X191W、X191Y、X192A、X192T、X193D、X193E、X193G、X193V、
X19A、X19C、X19D、X19F、X19G、X19H、X19I、X19K、X19L、X19M、X19P、X19Q、X19S、X19T、X19Y、X1R、X1V、X203E、X203R、X208F、X208I、X208Y、X20A、X20C、X20D、X20E、X20F、X20G、X20H、X20K、X20L、X20M、X20N、X20P、X20Q、X20S、X20T、X20V、X20W、X20Y、X210A、X210C、X210D、X210E、X210F、X210M、X210N、X210Q、X210S、X210Y、X211A、X211C、X211D、X211E、X211G、X211H、X211L、X211N、X211Q、X211S、X211T、X211V、X212C、X212D、X212I、X212L、X212W、X213A、X213C、X213M、X213R、X213S、X214E、X214P、X215A、X215D、X215E、X215H、X215W、X216G、X216H、X218A、X218C、X218D、X218E、X218F、X218G、X218H、X218I、X218K、X218L、X218N、X218Q、X218S、X218T、X218V、X218W、X218Y、X219A、X219C、X219D、X219E、X219F、X219G、X219H、X219K、X219M、X219Q、X219R、X219S、X219T、X219W、X219Y、X21E、X21S、X221F、X221N、X222D、X222K、X222S、X222T、X223C、X223L、X223V、X223Y、X224F、X224V、X225A、X225C、X225E、X225F、X225H、X225I、X225N、X225R、X225S、X225Y、X226A、X226C、X226D、X226E、X226G、X226H、X226I、X226L、X226M、X226Q、X226R、X226S、X226T、X226V、X226W、X226Y、X227C、X227F、X227G、X227H、X227I、X227K、X227L、X227M、X227R、X227T、X227V、X227W、X227Y、X22A、X22D、X22E、X22F、X22G、X22K、X22L、X22M、X22Q、X22R、X22T、X22W、X22Y、X230A、X230F、X231C、X231D、X231N、X233C、X233H、X233I、X233M、X233T、X233W、X233Y、X234C、X235L、X235M、X235V、X236Y、X237C、X237I、X238A、X238F、X238T、X23N、X23Q、X23W、X240M、X242M、X242N、X243D、X243F、X245E、X245H、X245M、X249D、X249I、X24G、X250V、X251A、X251E、X251F、X251L、X251M、X251S、X251T、X252C、X252I、X252S、X253C、X253G、X253Y、X255D、X255F、X255I、X255T、X255V、X256C、X257L、X257V、X257Y、X258F、X258Q、X258R、X259L、X25A、X25C、X25D、X25F、X25G、X25H、X25K、X25L、X25M、X25Q、X25S、X25W、X25Y、X260H、X261R、X262C、X262D、X262E、X262H、X262P、X262Y、X263I、X264H、X264T、X264W、X265S、X268F、X268G、X269M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26L、X26M、X26P、X26S、X26V、X26Y、X270A、X270Q、X270Y、X271S、X272F、X272G、X272L、X272S、X273A、X273C、X273D、X273E、X273F、X273H、X273I、X273L、X273M、X273P、X273Q、X273R、X273V、X273W、X273Y、X274F、X274S、X275V、X276D、X276K、X276L、X276N、X276R、X276Y、X277D、X277E、X277T、X279A、X279P、
X27A、X27D、X27F、X27G、X27H、X27I、X27Q、X27R、X27T、X27V、X280D、X280F、X280G、X280H、X280I、X280K、X280N、X280R、X280V、X280Y、X281A、X281D、X281E、X281H、X284A、X284F、X284H、X284L、X284M、X284N、X284Y、X285G、X285L、X285N、X285P、X286Q、X287A、X287D、X287E、X287H、X287T、X288A、X288K、X288P、X288Y、X289F、X289G、X289R、X289T、X28C、X28D、X28E、X28F、X28G、X28I、X28K、X28N、X28Q、X28S、X28T、X28V、X290D、X290M、X290N、X290Q、X290W、X291D、X291K、X291T、X291Y、X292C、X292D、X292F、X292I、X292L、X292T、X292W、X292Y、X293D、X293E、X293F、X293K、X293R、X294G、X294T、X295F、X296A、X296C、X296L、X296Y、X297E、X297F、X297H、X297K、X297M、X297S、X297V、X299G、X299I、X299K、X299L、X299S、X299Y、X29D、X29E、X29F、X29G、X29H、X29I、X29K、X29L、X29N、X29P、X29Q、X29V、X29W、X29Y、X2I、X2S、X301F、X302H、X302I、X302Q、X302V、X302Y、X303E、X303H、X303I、X303K、X303L、X303M、X303N、X303P、X303R、X303T、X304A、X304D、X304E、X304H、X304K、X304M、X304N、X304P、X304R、X304T、X304W、X304Y、X306A、X306D、X306E、X306G、X306H、X306I、X306M、X306Q、X306R、X306S、X306T、X306V、X306W、X306Y、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X30A、X30E、X30F、X30G、X30H、X30I、X30K、X30L、X30M、X30Q、X30T、X30W、X30Y、X310A、X310Q、X311A、X311E、X311G、X311H、X311K、X311N、X311R、X311T、X311Y、X312L、X312M、X313V、X314C、X314E、X314K、X314Q、X315A、X315C、X315E、X315H、X315K、X315T、X318I、X318S、X318T、X319A、X319D、X319H、X319I、X319K、X319M、X319N、X319P、X319S、X319T、X319W、X31N、X31Q、X31S、X31T、X31V、X31W、X320A、X320C、X320D、X320E、X320G、X320H、X320K、X320L、X320N、X320Q、X320S、X320Y、X321A、X321E、X321K、X321N、X321T、X321V、X321W、X323A、X323G、X323K、X323L、X323V、X324K、X324L、X324M、X324W、X324Y、X326G、X326N、X326S、X326Y、X327C、X327L、X327M、X32A、X32D、X32E、X32F、X32H、X32I、X32L、X32M、X32N、X32P、X32Q、X32T、X32W、X333I、X334T、X336K、X337A、X337C、X337F、X337G、X337I、X337K、X337L、X337M、X337N、X337Q、X337R、X337S、X337T、X337V、X337Y、X338G、X338S、X338T、
X33D、X33E、X33H、X33K、X33M、X33Q、X33R、X33Y、X341V、X342P、X343L、X343T、X343W、X343Y、X344I、X344Q、X344V、X345D、X345G、X345M、X345N、X345Q、X345S、X345T、X346A、X346C、X346D、X346G、X346H、X346N、X346Q、X348T、X34H、X34I、X34V、X350H、X350K、X350P、X351A、X351M、X352S、X353H、X354I、X354N、X354T、X354Y、X355I、X355M、X356I、X356V、X357A、X358I、X358L、X358N、X358P、X358V、X359E、X35A、X35C、X35D、X35G、X35H、X35I、X35L、X35M、X35N、X35P、X35Q、X35R、X35S、X35T、X35V、X35Y、X360A、X360F、X360G、X360I、X360L、X360N、X360Q、X360R、X360S、X360T、X360V、X360Y、X362F、X362K、X362M、X362N、X362T、X362V、X362Y、X363A、X363C、X363D、X363E、X363G、X363H、X363K、X363L、X363M、X363P、X363Q、X363R、X363S、X363T、X363V、X363W、X363Y、X364A、X364C、X364G、X364K、X364L、X364N、X364S、X364T、X364V、X366I、X366L、X366T、X367E、X367S、X368A、X368F、X368L、X368N、X36A、X36E、X36G、X36I、X36K、X36M、X36N、X36P、X36Q、X36R、X36S、X36T、X36V、X370E、X370I、X372A、X372C、X372E、X372F、X372H、X372M、X372N、X372Q、X375A、X375D、X375E、X375I、X375K、X375Q、X375R、X375T、X375W、X375Y、X376G、X376I、X376K、X376L、X376M、X376Q、X376R、X376S、X376V、X377Q、X378C、X378D、X378E、X378R、X379A、X379L、X379S、X37A、X37G、X37M、X37P、X37T、X37V、X37W、X381E、X381V、X382A、X382H、X382K、X382L、X382N、X382Q、X382S、X383C、X383D、X383E、X383H、X383I、X383M、X383N、X383Q、X383R、X383S、X383V、X383Y、X384A、X384C、X384D、X384E、X384F、X384I、X384L、X384M、X384N、X384Q、X384R、X384T、X384V、X384W、X384Y、X385A、X385C、X385D、X385E、X385F、X385G、X385H、X385I、X385L、X385M、X385N、X385P、X385Q、X385R、X385S、X385T、X385V、X385W、X385Y、X387C、X387E、X387N、X388E、X388F、X388H、X388I、X388M、X388R、X388V、X389G、X389H、X389K、X38N、X390D、X390F、X390M、X390N、X390P、X390R、X391A、X391F、X391G、X391K、X391M、X391N、X391Q、X391S、X391T、X391Y、X392C、X392V、X393E、X393H、X393P、X393S、X393V、X394A、X394C、X394E、X394H、X394I、X394L、X394M、X394N、X394R、X394S、X395A、X395H、X395M、X395V、X396H、X396P、X397D、X397H、X397P、X397S、X398M、X399P、
X39E、X39K、X3A、X3F、X3G、X3I、X3K、X3L、X3Q、X3V、X400A、X400D、X400E、X400G、X400H、X400I、X400K、X400L、X400M、X400N、X400P、X400Q、X400R、X400S、X400V、X400W、X401I、X401K、X401M、X401T、X403N、X405C、X405H、X405M、X405T、X405V、X406P、X407D、X407R、X407S、X408E、X408I、X408Q、X40I、X40S、X410H、X410I、X410K、X410L、X410P、X410R、X410Y、X413S、X414C、X414E、X414S、X415E、X415I、X416S、X418C、X418N、X418P、X41C、X41D、X41E、X41G、X41Q、X41S、X41T、X421N、X421P、X424A、X426D、X426W、X427C、X427F、X427G、X427K、X427Q、X427R、X427S、X427T、X427V、X429A、X429D、X429E、X429F、X429G、X429I、X429M、X429N、X429P、X429Q、X429S、X429T、X429V、X429W、X42C、X42I、X42Q、X42V、X431I、X434S、X436E、X438F、X438P、X438Y、X439K、X439C、X439P、X440V、X442Q、X443H、X443T、X445A、X445C、X445D、X445F、X445G、X445H、X445K、X445M、X445Q、X445R、X445S、X445T、X445V、X446F、X446I、X446L、X446P、X446Q、X446R、X446V、X446W、X447V、X448D、X448E、X448H、X448N、X449A、X449F、X449G、X449K、X449L、X449M、X449N、X449P、X449Q、X449R、X449S、X449V、X449W、X449Y、X451L、X453G、X453I、X453N、X453P、X453Y、X455L、X456L、X456M、X456R、X456S、X456V、X456W、X456Y、X457A、X457C、X457E、X457F、X457G、X457K、X457L、X457M、X457R、X457S、X457T、X457V、X457W、X458I、X458K、X458V、X458W、X459C、X459D、X459E、X459I、X459K、X459N、X459Q、X459R、X459V、X459Y、X45G、X45N、X460A、X460D、X460E、X460G、X460Q、X460R、X460S、X460T、X460V、X461A、X461E、X461F、X461K、X461L、X461M、X461N、X461Q、X461R、X461S、X461V、X462K、X463L、X465H、X465P、X465R、X465V、X467A、X467E、X467H、X468D、X468H、X470A、X470Q、X470T、X471E、X474F、X474H、X474P、X478A、X478E、X47S、X480D、X480E、X480M、X480R、X480Y、X482C、X482T、X482W、
X48F、X48I、X48M、X48Y、X4A、X4C、X4K、X4M、X4Q、X4R、X4S、X51Q、X51T、X51V、X54D、X54G、X54Q、X59T、X5A、X5C、X5D、X5E、X5F、X5H、X5I、X5K、X5L、X5M、X5N、X5P、X5Q、X5R、X5V、X5Y、X60T、X63C、X63V、X6A、X6C、X6E、X6F、X6G、X6H、X6K、X6L、X6M、X6P、X6Q、X6S、X6T、X6V、X6W、X6Y、X70F、X70H、X70L、X70M、X70N、X70Y、X71D、X72C、X72D、X72E、X72N、X72T、X73L、X73N、X73Q、X75A、X75G、X75I、X75L、X75P、X75T、X75W、X76C、X76E、X76G、X76L、X76T、X76V、X7C、X7E、X7F、X7H、X7K、X7N、X7P、X7Q、X7R、X7S、X7V、X7W、X7Y、X81H、X81L、X82K、X82M、X83A、X83D、X83E、X83G、X83R、X83S、X86K、X87D、X87R、X89A、X89C、X89F、X89G、X89L、X89M、X89R、X89S、X8A、X8C、X8F、X8I、X8M、X8P、X8S、X8V、X8W、X8Y、X90A、X90D、X90E、X90F、X90G、X90I、X90M、X90N、X90Q、X90R、X90S、X90V、X90Y、X91C、X91D、X91E、X91F、X91G、X91H、X91I、X91K、X91L、X91M、X91N、X91Q、X91S、X91T、X91V、X91W、X91Y、X92D、X92M、X92V、X93K、X93Q、X94A、X94D、X94E、X94K、X94M、X94V、X94Y、X95E、X95I、X95L、X95V、X96K、X96N、X96Q、X97V、X98E、X98G、X98N、X99H、X99K、X99N、X100W及びX1Gからなるアミノ酸置換の群から選択される、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態8.):181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する2つ以上のアミノ酸の欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184に対応するアミノ酸の欠失、好ましくはD183*及びG184*をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態9.):前記親アルファ-アミラーゼと比較して、1つ以上の改善された特性を示し、好ましくは、前記改善された特性は、>1.0の改善度(IF)として測定され、好ましくは、改善度は、1.2以上、好ましくは1.3以上である、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態10.):1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う、X4Q、X25H、X100W、X135E、X135T、X135W、X135D、X160W、X176K、X193E、X251E、X258Q、X276R、X299S、X323G、X363E、X363H、X382Q、X405M、X460G及びX482Wからなるアミノ酸置換の群から選択されるか又は1つ以上のアミノ酸置換は、X4Q、X7H、X7W、X25H、X25Y、X37M、X70H、X100W、X118D、X135T、X160W、X176K、X193E、X210C、X251E、X281N、X258Q、X323G、X361R、X363E、X363H、X363N、X368F、X405M、X434R、X441Q、X459N、X460G、X451L及びX482Wからなるアミノ酸置換の群から選択され、好ましくは、1つ以上のアミノ酸置換は、X25H、X25Y、X100W、X135T、X176K、X193E及びX460Gからなるアミノ酸置換の群から選択される、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態11.):X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y+X482W、X25H+X186E+X206Y+X405M+X482W、X25H+X186E+X206Y+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X482W、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X482W、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X482W、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X25H+X176K+X186E+X206Y、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X206Y+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X206Y+X251E+X460G+X482W、X4Q+X25H+X176K+X193E+X251E+X186E+X482W、X4Q+X193E+X206Y+X276R+X186E+X482W、X186E+X25H+X482W、X25H+X193E+X206Y+X251E+X276R+X405M+X186E+X482W、X25H+X251E+X186E+X482W、X25H+X160W+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、X193E+X206Y+X405M+X186E+X482W、X3I+X356V、X3I+X356I、X83D+X94E、X94D+X125E、X131I+X377Q+X410H、X48F+X94D、X48Y+X116K+X218K、X5L+X218K+X225S、X83E+X116R+X158Y+X181E、X51V+X218K、X83E+X181E、
X4Q+X7W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X37M+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X4Q+X25Y+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X118D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X182D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X258Q+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X460G、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363E+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363H+X405M、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X363N+X405M、X4Q+X176K+X181D+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181F+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181N+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X176K+X181Q+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X136E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X100W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135T+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X135W+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160D+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X4Q+X160E+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、
X7H+X25H+X176K+X186E+X206Y、X7W+X25H+X176K+X186E+X206Y、X25D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X186E+X206Y+X405M+X460G、X25H+X186E+X206Y+X460G、X25H+X37M+X176K+X186E+X206Y、X25H+X118D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X182D+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363H、X25H+X176K+X186E+X206Y+X363N、X25H+X176K+X186E+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X460G、X25H+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X460G、X25H+X176K+X181D+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181N+X186E+X206Y、X25H+X176K+X181Q+X186E+X206Y、X25H+X136E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X100W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135E+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135T+X176K+X186E+X206Y、X25H+X135W+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160D+X176K+X186E+X206Y、X25H+X160E+X176K+X186E+X206Y、X25Y+X176K+X186E+X206Y、
X87D+X186E+X315K+X420K、X87D+X186E+X226D+X314E+X420E+X461E、X87D+X186E+X226D+X420E、X87D+X186E+X226D+X420E+X461E、X87D+X186E+X314E+X471E、X87D+X186E+X311K+X314E+X420K、X87D+X186E+X160D+X461E、X87R+X186E+X315K+X461R、X87R+X186E+X226D+X471E、X87R+X186E+X226R+X314K+X420K+X461R、X87R+X186E+X226R+X311K+X420K、X87R+X186E+X314K+X315K、X87R+X186E+X311K+X314E、X87R+X186E+X420E+X450R、X87R+X186E+X450R+X452R、X186E+X315K+X420E+X452R、X186E+X226D+X314E+X461E+X471E、X186E+X226D+X314E+X452R、X186E+X226D+X314K+X460D+X471E+X485R、X186E+X226D+X311K+X460D、X186E+X226D+X461E+X471E、X186E+X314E+X460D+X461E、X186E+X314E+X420E+X452R+X461E、X186E+X314K+X450R+X460D、X186E+X460D+X471E+X485R、X186E+X311K+X314K+X452R、X186E+X311K+X461E+X485R、X186E+X311K+X420E+X471E、X186E+X420K+X450R+X471E+X485R、X186E+X420K+X450R+X485R、X186E+X452R+X461E+X471E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M、X25H+X176K+X186E+X206Y、X83E+X186E+X219D+X226R、X83E+X186E+X219R+X226D+X314E+X452R、X83E+X186E+X219R+X226R、X83E+X186E+X160D+X219D+X226R+X452R、X83R+X186E+X219R+X226D、X160D+X186E+X315K+X450R、X160D+X186E+X226D+X314K+X460D+X461E、X160D+X186E+X226D+X314K+X420E、X160D+X186E+X314K+X485R、X160D+X186E+X420E+X452R、X160D+X186E+X420K+X460D、X186E+X276R、X186E+X206Y、X186E+X206Y+X276R、X186E+X206Y+X276R+X405M、X186E+X206Y+X405M、X186E+X206Y+X251E、X186E+X206Y+X251E+X276R、X186E+X206Y+X251E+X276R+X405M、X186E+X206Y+X251E+X405M、X186E+X206Y+X251E+X323G+X405M、X186E+X206Y+X323G+X405M、X186E+X405M、X186E+X193E+X206Y+X405M、X186E+X193E+X206Y+X251E、X186E+X251E、X186E+X251E+X405M、
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X25H+X176K+X186E+X206Y、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X258Q+X363E+X123D、X25H+X176K+X186E+X206Y+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X181Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X258Q+X363E+X135C、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X361R、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X281N+X363E+X175D、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X181Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X473R、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X258Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X281N+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X181Q+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E+X258Q+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X193E+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X135T+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X100W+X363E、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X281N、X25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X281N+X363E及びX25H+X176K+X186E+X206Y+X135T+X258Q+X363E、
X25H+X176K+X251E+X405M、
X25H+X176K+X251E+X405M+X482W、
X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、
X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
X251E+X405M、
X251E+X405M+X439K、
X251E+X405M+X482W、
X251E+X405M+X439K+X482W、
X405M+X439K、
X405M+X482W、
X405M+X439K+X482W、
X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、
X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
X116K+X181T、
X116K+X181T+X225A、
X181T+X225A+X320K、及び
X116K+X181T+X225A+X320K
からなる群から選択される、好ましくは、
X4Q+X25H、
X4Q+X25H+X176K、
X4Q+X25H+X176K+X186E、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、
X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K+X482W、
X25H+X176K、
X25H+X176K+X186E、
X176K+X186E、
X25H+X176K+X186E+X251E、
X25H+X176K+X186E+X251E+X405M、
X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、及び
X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K+X482W、
X25H+X176K+X251E+X405M、
X25H+X176K+X251E+X405M+X482W、
X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、
X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
X251E+X405M、
X251E+X405M+X439K、
X251E+X405M+X482W、
X251E+X405M+X439K+X482W、
X405M+X439K、
X405M+X482W、
X405M+X439K+X482W、
X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、
X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
X116K+X181T、
X116K+X181T+X225A、
X116K+X181T+X225A+X320K、
X181T+X225A+X320K、及び
X181T+X225A+X320K、
最も好ましくは、X116K+X181T+X225A、X116K+X181T+X225A+X320K、X25H+X176K、X25H+X176K+X186E、X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W又はX4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、最も好ましくはX25H+X176K+X186E、X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W又はX116K+X181T+X225A+X320K
から選択される置換の組み合わせを含む、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態12.):未指定の位置(すなわちX)でのアミノ酸残基は、配列番号1又は3、好ましくは配列番号1において、それぞれの位置(配列番号3の付番に従う)で示されるアミノ酸残基に対応する、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態13.):配列番号3の付番に従う欠失D183*及びG184*を含む、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態14.):9、130、179、181、186、190、195、202、206、244、402、419、420、422、423、428、430、435、441、444、450、452、454、466、469、473、475、476、479、483及び485からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置での追加のアミノ酸置換、好ましくはX9D、X9F、X9K、X9L、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T、X9Y、X130V、X179G、X179L、X181D、X181E、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186E、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186N、X186Q、X186R、X186S、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195F、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X202L、X206C、X206H、X206L、X206M、X206Y、X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N、X244Q、X244V、X402T、X419C、X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L、X420Q、X422C、X422N、X422H、X423F、X423M、X423Q、X423S、X428A、X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W、X428Y、X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430I、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T、X430V、X435E、X435K、X435P、X435R、X435S、X435A、X435D、X437A、X437L、X437T、X437W、X441C、X441D、X441K、X441L、X441M、X441N、X441S、X444E、X444H、X444K、X444M、X444N、X444R、X444T、X450C、X450D、X450E、X450H、X450I、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R、X450T、X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N、X452R、X452T、X454A、X454E、X454K、X454L、X454M、X454P、X454S、X454T、X466E、X466W、X469F、X469L、X469Y、X473H、X473Q、X473R、X475A、X475K、X475N、X475E、X475L、X476G、X476E、X479A、X479I、X479K、X479M、X483F、X483I、X483L、X483Q、X483R、X485K及びX485Rからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上の追加のアミノ酸置換をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態15.):置換の数は、配列番号1と比較して、1~30個、好ましくは1~25、1~20、1~15、1~10又は1~5個、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~8又は2~5個、好ましくは3~30、3~25、3~20、3~15、3~10、3~8又は3~5個、好ましくは4~30、4~25、4~20、4~15、4~10又は4~8個である、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態16.):配列番号3の付番に従うX100D、X100F、X100K、X100L、X103A、X106D、X108A、X109A、X10A、X10C、X10E、X10F、X10L、X10W、X10Y、X113F、X113H、X113M、X113R、X113V、X113W、X113Y、X114A、X114C、X114D、X114E、X114F、X114G、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114N、X114Q、X114R、X114S、X114V、X114W、X114Y、X115C、X115D、X115K、X115M、X115N、X115Q、X115R、X115S、X115T、X115V、X116I、X116K、X116L、X116M、X116R、X116T、X117A、X117C、X117D、X117F、X117I、X117N、X117P、X117R、X117W、X117Y、X118A、X118D、X118E、X119H、X119P、X119R、X119S、X119Y、X120E、X120G、X120M、X120S、X120W、X120Y、X123D、X123S、X125A、X125D、X125E、X125F、X125G、X125H、X125K、X125L、X125M、X125N、X125Q、X125R、X125T、X125V、X125W、X125Y、X126D、X128C、X128E、X128L、X128M、X128W、X128Y、X129E、X12N、X12S、X131C、X131I、X131L、X131Q、X131W、X132T、X133A、X133C、X133D、X133E、X133H、X133K、X133N、X133P、X133Q、X133S、X134C、X134E、X134F、X134I、X134L、X134M、X134P、X134T、X134V、X134W、X134Y、X135D、X135E、X135G、X135M、X135N、X135P、X135S、X135T、X135W、X136A、X136C、X136D、X136E、X136F、X136H、X136L、X136M、X136N、X136P、X136W、X139C、X139S、X13A、X13Y、X141V、X142C、X142E、X142F、X142L、X142M、X142Q、X142R、X142W、X142Y、X143F、X144C、X144E、X144G、X144K、X144N、X144Q、X144R、X144S、X144T、X144V、X144Y、X145A、X146C、X146D、X146E、X146F、X146G、X146H、X146K、X146L、X146S、X146T、X146W、X147M、X149E、X14N、X150C、X150E、X150Q、X151C、X151E、X154A、X154Y、X155Y、X156E、X156V、X158H、X158N、X158Y、X15R、X160D、X160E、X160W、X161T、X162V、X163A、X163Q、X163T、X164V、X165S、X165T、X165W、X169A、X169D、X169E、X169S、X169V、X16F、X16R、X170C、X170F、X172A、X172C、X172D、X172K、X172N、X173I、X173Y、X174D、X174E、X174G、X174H、X174M、X174N、X174P、X174S、X174T、X175A、X175G、X175H、X175Q、X176K、X176S、X176T、X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S、X177W、X178F、X17K、X17V、X180M、X180N、X180T、X180W、X182D、X182E、X182N、X182Q、X182S、X185E、X185M、X185N、X187A、X187D、X187M、X187V、X188H、X188T、X188V、X189I、X18F、X18I、X18K、X18M、X18R、X18T、X191F、X191H、X191K、X191M、X191W、X191Y、X192A、X192T、X193D、X193E、X193G、X193V、
X19A、X19C、X19D、X19F、X19G、X19H、X19I、X19K、X19L、X19M、X19P、X19Q、X19S、X19T、X19Y、X1R、X1V、X203E、X203R、X208F、X208I、X208Y、X20A、X20C、X20D、X20E、X20F、X20G、X20H、X20K、X20L、X20M、X20N、X20P、X20Q、X20S、X20T、X20V、X20W、X20Y、X210A、X210C、X210D、X210E、X210F、X210M、X210N、X210Q、X210S、X210Y、X211A、X211C、X211D、X211E、X211G、X211H、X211L、X211N、X211Q、X211S、X211T、X211V、X212C、X212D、X212I、X212L、X212W、X213A、X213C、X213M、X213R、X213S、X214E、X214P、X215A、X215D、X215E、X215H、X215W、X216G、X216H、X218A、X218C、X218D、X218E、X218F、X218G、X218H、X218I、X218K、X218L、X218N、X218Q、X218S、X218T、X218V、X218W、X218Y、X219A、X219C、X219D、X219E、X219F、X219G、X219H、X219K、X219M、X219Q、X219R、X219S、X219T、X219W、X219Y、X21E、X21S、X221F、X221N、X222D、X222K、X222S、X222T、X223C、X223L、X223V、X223Y、X224F、X224V、X225A、X225C、X225E、X225F、X225H、X225I、X225N、X225R、X225S、X225Y、X226A、X226C、X226D、X226E、X226G、X226H、X226I、X226L、X226M、X226Q、X226R、X226S、X226T、X226V、X226W、X226Y、X227C、X227F、X227G、X227H、X227I、X227K、X227L、X227M、X227R、X227T、X227V、X227W、X227Y、X22A、X22D、X22E、X22F、X22G、X22K、X22L、X22M、X22Q、X22R、X22T、X22W、X22Y、X230A、X230F、X231C、X231D、X231N、X233C、X233H、X233I、X233M、X233T、X233W、X233Y、X234C、X235L、X235M、X235V、X236Y、X237C、X237I、X238A、X238F、X238T、X23N、X23Q、X23W、X240M、X242M、X242N、X243D、X243F、X245E、X245H、X245M、X249D、X249I、X24G、X250V、X251A、X251E、X251F、X251L、X251M、X251S、X251T、X252C、X252I、X252S、X253C、X253G、X253Y、X255D、X255F、X255I、X255T、X255V、X256C、X257L、X257V、X257Y、X258F、X258Q、X258R、X259L、X25A、X25C、X25D、X25F、X25G、X25H、X25K、X25L、X25M、X25Q、X25S、X25W、X25Y、X260H、X261R、X262C、X262D、X262E、X262H、X262P、X262Y、X263I、X264H、X264T、X264W、X265S、X268F、X268G、X269M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26L、X26M、X26P、X26S、X26V、X26Y、X270A、X270Q、X270Y、X271S、X272F、X272G、X272L、X272S、X273A、X273C、X273D、X273E、X273F、X273H、X273I、X273L、X273M、X273P、X273Q、X273R、X273V、X273W、X273Y、X274F、X274S、X275V、X276D、X276K、X276L、X276N、X276R、X276Y、X277D、X277E、X277T、X279A、X279P、X27A、X27D、X27F、X27G、X27H、X27I、X27Q、X27R、X27T、X27V、X280D、X280F、X280G、X280H、X280I、X280K、X280N、X280R、X280V、X280Y、X281A、X281D、X281E、X281H、X284A、X284F、X284H、X284L、X284M、X284N、X284Y、X285G、X285L、X285N、X285P、X286Q、X287A、X287D、X287E、X287H、X287T、X288A、X288K、X288P、X288Y、X289F、X289G、X289R、X289T、X28C、X28D、X28E、X28F、X28G、X28I、X28K、X28N、X28Q、X28S、X28T、X28V、X290D、X290M、X290N、X290Q、X290W、X291D、X291K、X291T、X291Y、X292C、X292D、X292F、X292I、X292L、X292T、X292W、X292Y、X293D、X293E、X293F、X293K、X293R、X294G、X294T、X295F、X296A、X296C、X296L、X296Y、X297E、X297F、X297H、X297K、X297M、X297S、X297V、X299G、X299I、X299K、X299L、X299S、X299Y、
X29D、X29E、X29F、X29G、X29H、X29I、X29K、X29L、X29N、X29P、X29Q、X29V、X29W、X29Y、X2I、X2S、X301F、X302H、X302I、X302Q、X302V、X302Y、X303E、X303H、X303I、X303K、X303L、X303M、X303N、X303P、X303R、X303T、X304A、X304D、X304E、X304H、X304K、X304M、X304N、X304P、X304R、X304T、X304W、X304Y、X306A、X306D、X306E、X306G、X306H、X306I、X306M、X306Q、X306R、X306S、X306T、X306V、X306W、X306Y、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X30A、X30E、X30F、X30G、X30H、X30I、X30K、X30L、X30M、X30Q、X30T、X30W、X30Y、X310A、X310Q、X311A、X311E、X311G、X311H、X311K、X311N、X311R、X311T、X311Y、X312L、X312M、X313V、X314C、X314E、X314K、X314Q、X315A、X315C、X315E、X315H、X315K、X315T、X318I、X318S、X318T、X319A、X319D、X319H、X319I、X319K、X319M、X319N、X319P、X319S、X319T、X319W、X31N、X31Q、X31S、X31T、X31V、X31W、X320A、X320C、X320D、X320E、X320G、X320H、X320K、X320L、X320N、X320Q、X320S、X320Y、X321A、X321E、X321K、X321N、X321T、X321V、X321W、X323A、X323G、X323K、X323L、X323V、X324K、X324L、X324M、X324W、X324Y、X326G、X326N、X326S、X326Y、X327C、X327L、X327M、
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X39E、X39K、X3A、X3F、X3G、X3I、X3K、X3L、X3Q、X3V、X400A、X400D、X400E、X400G、X400H、X400I、X400K、X400L、X400M、X400N、X400P、X400Q、X400R、X400S、X400V、X400W、X401I、X401K、X401M、X401T、X403N、X405C、X405H、X405M、X405T、X405V、X406P、X407D、X407R、X407S、X408E、X408I、X408Q、X40I、X40S、X410H、X410I、X410K、X410L、X410P、X410R、X410Y、X413S、X414C、X414E、X414S、X415E、X415I、X416S、X418C、X418N、X418P、X41C、X41D、X41E、X41G、X41Q、X41S、X41T、X421N、X421P、X424A、X426D、X426W、X427C、X427F、X427G、X427K、X427Q、X427R、X427S、X427T、X427V、X429A、X429D、X429E、X429F、X429G、X429I、X429M、X429N、X429P、X429Q、X429S、X429T、X429V、X429W、X42C、X42I、X42Q、X42V、X431I、X434S、X436E、X438F、X438P、X438Y、X439K、X439C、X439P、X440V、X442Q、X443H、X443T、X445A、X445C、X445D、X445F、X445G、X445H、X445K、X445M、X445Q、X445R、X445S、X445T、X445V、X446F、X446I、X446L、X446P、X446Q、X446R、X446V、X446W、X447V、X448D、X448E、X448H、X448N、X449A、X449F、X449G、X449K、X449L、X449M、X449N、X449P、X449Q、X449R、X449S、X449V、X449W、X449Y、X451L、X453G、X453I、X453N、X453P、X453Y、X455L、X456L、X456M、X456R、X456S、X456V、X456W、X456Y、X457A、X457C、X457E、X457F、X457G、X457K、X457L、X457M、X457R、X457S、X457T、X457V、X457W、X458I、X458K、X458V、X458W、X459C、X459D、X459E、X459I、X459K、X459N、X459Q、X459R、X459V、X459Y、X45G、X45N、X460A、X460D、X460E、X460G、X460Q、X460R、X460S、X460T、X460V、X461A、X461E、X461F、X461K、X461L、X461M、X461N、X461Q、X461R、X461S、X461V、X462K、X463L、X465H、X465P、X465R、X465V、X467A、X467E、X467H、X468D、X468H、X470A、X470Q、X470T、X471E、X474F、X474H、X474P、X478A、X478E、X47S、X480D、X480E、X480M、X480R、X480Y、X482C、X482T、X482W、
X48F、X48I、X48M、X48Y、X4A、X4C、X4K、X4M、X4Q、X4R、X4S、X51Q、X51T、X51V、X54D、X54G、X54Q、X59T、X5A、X5C、X5D、X5E、X5F、X5H、X5I、X5K、X5L、X5M、X5N、X5P、X5Q、X5R、X5V、X5Y、X60T、X63C、X63V、X6A、X6C、X6E、X6F、X6G、X6H、X6K、X6L、X6M、X6P、X6Q、X6S、X6T、X6V、X6W、X6Y、X70F、X70H、X70L、X70M、X70N、X70Y、X71D、X72C、X72D、X72E、X72N、X72T、X73L、X73N、X73Q、X75A、X75G、X75I、X75L、X75P、X75T、X75W、X76C、X76E、X76G、X76L、X76T、X76V、X7C、X7E、X7F、X7H、X7K、X7N、X7P、X7Q、X7R、X7S、X7V、X7W、X7Y、X81H、X81L、X82K、X82M、X83A、X83D、X83E、X83G、X83R、X83S、X86K、X87D、X87R、X89A、X89C、X89F、X89G、X89L、X89M、X89R、X89S、X8A、X8C、X8F、X8I、X8M、X8P、X8S、X8V、X8W、X8Y、X90A、X90D、X90E、X90F、X90G、X90I、X90M、X90N、X90Q、X90R、X90S、X90V、X90Y、X91C、X91D、X91E、X91F、X91G、X91H、X91I、X91K、X91L、X91M、X91N、X91Q、X91S、X91T、X91V、X91W、X91Y、X92D、X92M、X92V、X93K、X93Q、X94A、X94D、X94E、X94K、X94M、X94V、X94Y、X95E、X95I、X95L、X95V、X96K、X96N、X96Q、X97V、X98E、X98G、X98N、X99H、X99K、X99N、X100W及びX1Gからなるアミノ酸置換の群から選択されるアミノ酸置換の1個以上、好ましくは1~30個を有する配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、好ましくは1~10個の保存的アミノ酸置換をさらに含み、且つ/又は
9、130、179、181、186、190、195、202、206、244、402、419、420、422、423、428、430、435、441、444、450、452、454、466、469、473、475、476、479、483及び485からなる群から選択される位置に対応する1~10個の位置で追加のアミノ酸置換、好ましくはX9D、X9F、X9K、X9L、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T、X9Y、X130V、X179G、X179L、X181D、X181E、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186E、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186N、X186Q、X186R、X186S、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195F、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X202L、X206C、X206H、X206L、X206M、X206Y、X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N、X244Q、X244V、X402T、X419C、X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L、X420Q、X422C、X422N、X422H、X423F、X423M、X423Q、X423S、X428A、X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W、X428Y、X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430I、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T、X430V、X435E、X435K、X435P、X435R、X435S、X435A、X435D、X437A、X437L、X437T、X437W、X441C、X441D、X441K、X441L、X441M、X441N、X441S、X444E、X444H、X444K、X444M、X444N、X444R、X444T、X450C、X450D、X450E、X450H、X450I、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R、X450T、X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N、X452R、X452T、X454A、X454E、X454K、X454L、X454M、X454P、X454S、X454T、X466E、X466W、X469F、X469L、X469Y、X473H、X473Q、X473R、X475A、X475K、X475N、X475E、X475L、X476G、X476E、X479A、X479I、X479K、X479M、X483F、X483I、X483L、X483Q、X483R、X485K及びX485Rからなるアミノ酸置換の群から選択される1~10個の追加のアミノ酸置換をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態17.):表8~12のいずれかから選択される、好ましくは配列番号3の付番に従うN25H+R176K+G186E+I206Y+R181Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+T193E、N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E+I206Y、N25H+G186E+I206Y+L405M、N25H+G186E+I206Y、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E、G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M、N25H+R176K+G186E+I206Y、G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M、G4Q+I206Y+N460G、G4Q+N25H+R176K+I206Y+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+T193E+T251E+G186E、G4Q+T193E+I206Y+E276R+G186E、G186E+N25H、N25H+T193E+I206Y+T251E+E276R+L405M+G186E、N25H+T251E+G186E、N25H+Y160W+R176K+G186E+T251E+L405M、T193E+I206Y+L405M+G186E、N25H+R176K+G186E+I206Y+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+R181Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Q359R、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+G258Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y100W+Y135T+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+G258Q、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+G258Q+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y135T+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y363E、N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+Y482W、N25H+R176K+G186E+I206Y+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+Y482W、G4Q+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+L405M+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+T251E+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+L405M+Y482W、N25H+G186E+I206Y+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+N460G、N25H+R176K+G186E+T193E+I206Y+T251E+N460G+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+I206Y+T251E+N460G+Y482W、N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+Y482W、N25H+R176K+G186E+N195F+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+Y482W、G4Q+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+Y482W、G4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+L405M+Y482W、N25H+G186E+N195F+L405M+Y482W、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+N460G、G4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+N460G、N25H+R176K+G186E+T193E+N195F+T251E+N460G+Y482W及びG4Q+N25H+R176K+G186E+N195F+T251E+N460G+Y482Wからなる群から選択される置換の組み合わせを含む、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
好ましい実施形態18.):先行する実施形態のいずれか1つによるアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド。
好ましい実施形態19.):実施形態18.)によるポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクター。
好ましい実施形態20.):実施形態18.)によるポリヌクレオチド、実施形態19.)による核酸コンストラクト又は実施形態19.)による発現ベクターを含む宿主細胞。
好ましい実施形態21.):アルファ-アミラーゼバリアントと異なる1種以上の第2の酵素を含み、好ましくは、第2の酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ又はマンナナーゼ、好ましくはマンナナーゼ又はプロテアーゼ、特に好ましくはプロテアーゼ、好ましくはサブチリシンプロテアーゼ、好ましくは配列番号10~14、好ましくは配列番号1のいずれかと少なくとも60%の配列同一性を有するサブチリシンプロテアーゼであり、好ましくは、プロテアーゼは、BPN付番に従う位置101でグルタミン酸を含む、先行する実施形態に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントを含む組成物。
好ましい実施形態22.):組成物は、好ましくは、洗剤組成物の1kg当たり活性アルファ-アミラーゼバリアントの1~1000mgの量で先行する好ましい実施形態におけるアルファ-アミラーゼバリアントを含み、好ましくは本発明のアルファ-アミラーゼと異なる追加の酵素、界面活性剤、消泡剤、ビルディング剤(ビルダー)、ポリマー、漂白系(漂白剤)、レオロジー改質剤、ヒドロトロープ、柔軟剤、乾燥剤、増白剤、緩衝液、保存剤、防食添加剤、色素及び芳香剤からなる群から選択される少なくとも1種の追加の構成成分を好ましくは5~500mg/kg、5~300mg/kg、10~200mg/kg、50~200mg/kg含む洗剤組成物であり、好ましくは、洗剤の少なくとも1種の構成成分は、界面活性剤及び/又はビルダー、好ましくは強力な金属イオン捕捉ビルダーである、先行する好ましい実施形態に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントを含む組成物。
好ましい実施形態23.):洗剤組成物は、好ましくは、パウチの形態における液体又は固体、好ましくは洗濯洗剤組成物又は自動食器洗浄(ADW)洗剤組成物である、実施形態21.)及び22.)による組成物。
好ましい実施形態24.):アルファ-アミラーゼバリアントを生成する方法であって、
a.前記アルファ-アミラーゼバリアントの発現に好適な条件下で実施形態20.)による前記宿主細胞を培養すること;及び
b.前記アルファ-アミラーゼバリアントを回収すること
を含む方法。
好ましい実施形態25.):洗濯又は硬質表面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける先行する実施形態に記載されるとおりのアルファ-アミラーゼバリアントの使用。
好ましい実施形態26.):1つ以上のアミノ酸置換は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う、
a)4、429及び459からなる群から選択されるか、又は
b)4、25、116、176、225、251、320、400、405、408、410、418、429、446、449、458、459、460、471及び482からなる群から選択されるか、又は
c)4、25、176、251、405及び482からなる群から選択されるか、又は
d)4、6、10、12、13、14、15、17、20、21、22、23、24、27、28、32、34、36、38、39、42、45、47、51、70、75、76、83、89、92、95、96、99、100、108、115、154、156、164、191、192、213、215、221、222、223、226、233、234、236、237、240、245、249、268、271、277、282、285、288、289、290、297、301、308、309、312、326、327、333、336、338、341、343、348、351、352、353、355、356、358、366、367、370、376、379、381、389、392、399、413、424、426、429、432、436、440、442、443、448、451、453、456、459、463、468及び480からなる群から選択されるか、又は
e)4、429及び459からなる群から選択されるか、又は
f)4、10、12、13、14、15、17、20、21、23、24、27、34、36、38、39、42、45、47、51、89、92、99、100、108、115、164、191、192、213、221、222、223、233、234、236、237、240、245、249、268、271、282、288、289、290、297、301、308、309、312、326、327、333、336、338、341、343、348、351、352、353、355、356、358、366、367、370、376、379、381、389、392、413、424、426、429、432、440、442、443、448、451、453、456、468及び480からなる群から選択されるか、又は
g)4及び429からなる群から選択されるか、又は
h)13、17、22、23、27、28、32、36、42、51、70、75、83、89、92、95、96、154、192、215、222、226、233、245、277、282、285、288、297、312、338、341、343、353、355、356、376、379、381、389、429、432、442、451、459及び463からなる群から選択されるか、又は
i)13、17、23、27、36、42、51、89、92、192、215、222、233、245、277、282、288、297、312、338、341、343、353、355、356、376、379、381、389、429、432、442及び451からなる群から選択されるか、又は
j)13、18、146、163、170、188、224、238、242、245、353、385、388、405、432、442、474及び478からなる群から選択されるか、又は
1、2、3、5、7、8、9、11、16、18、19、25、26、29、30、31、35、37、40、41、43、44、46、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、71、72、73、74、77、78、79、80、81、84、85、86、87、88、90、91、93、94、97、98、101、102、103、104、105、106、107、109、110、111、112、113、114、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、151、152、153、155、157、158、159、160、161、162、163、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、185、186、187、188、189、190、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、216、217、218、219、220、224、225、227、228、229、230、231、232、235、238、239、241、242、243、244、246、247、248、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、269、270、272、273、274、275、276、278、279、280、281、283、284、286、287、291、292、293、294、295、296、298、299、300、302、303、304、305、306、307、310、311、313、314、315、316、317、319、320、321、322、323、324、325、328、329、330、331、332、334、335、337、339、340、342、344、345、346、347、349、350、354、357、359、360、361、362、363、364、365、368、369、371、372、373、374、375、377、380、382、383、384、385、386、387、388、390、391、393、394、395、396、397、398、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、425、427、428、430、431、433、434、435、437、438、439、441、444、445、446、447、449、450、452、454、455、457、458、460、461、462、464、465、466、467、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、481、483、484及び485からなる群から選択されるか、又は
k)25、116、176、181、183、186、206、225、251、320、400、402、405、408、409、410、418、419、420、422、423、437、441、444、446、449、452、458、460、466、471、473、475、484及び485からなる群から選択されるか、又は
l)25及び176からなる群から選択されるか、又は
m)4、25、176、251、405、439及び482からなる群から選択されるか、又は
n)25、176及び186からなる群から選択されるか、又は
o)4、25、176、186、251、405、439及び482からなる群から選択されるか、又は
p)116、181、225及び320からなる群から選択され、
好ましくは、25及び176からなる群から選択されるか、又は4、25、176、251、405、439及び482からなる群から選択されるか、又は116、181、225及び320からなる群から選択される、先行する好ましい実施形態のいずれかによるアルファ-アミラーゼバリアント。
[実施例1]
改善された親アルファ-アミラーゼ
ALBAアミラーゼ(配列番号3)は、アミラーゼの安定性の増大をもたらすアミノ酸G182及びD183を欠失させることによって改変された。得られたアミラーゼバリアントは、配列番号4に示されるとおりのアミラーゼAである。アミラーゼAの洗浄性能は、微小な規模の洗浄試験及びラウンダオメーターを使用して、本明細書に記載されるアルファ-アミラーゼバリアントのための親アミラーゼとして機能したアミラーゼB(配列番号1において示される)と比較された。
微小な規模のクリーニング性能試験のために、アミラーゼA及びBを使用して、洗浄液に60分間加えられた0.02、0.05及び0.1ppmのアミラーゼで室温において水(15°dH)により希釈された3.3g/L ES1-C(上記の表1bに記載される)中において古びたトウモロコシデンプンのしみ(CS-126)の汚れを除去した後、その後、流水下で5分間すすぎ、乾燥させた。
洗浄性能は、洗浄される織物の着色の輝度として測定される。輝度は、白色光で照射されたときの試料から反射される光の強度としても表すことができる。試料にしみがあるとき、反射光の強度は、清浄な試料のものよりも低くなる。換言すると、より清浄な試料はより多くの光を反射し、より高い強度を有することになる。したがって、反射光の強度は、洗浄性能を測定するために使用することができる。色測定は、結果として個々のしみに対するRGB値の平均を有するデジタル色測定によりなされる。洗剤基剤に関する値は減算され、アミラーゼAのものに対するアミラーゼBの性能の比が作成され、100%を超える値は、アミラーゼAによる性能より高い性能を示す。
以下の表2において、少なくとも2つの実験の平均が与えられる。
同一の洗浄試験を、上の表1aの配合物Aによる異なる洗剤を使用して、洗浄液に60分間加えられた0.02、0.05又は0.1ppmのアミラーゼで室温において実施した後、流水下で5分間すすぎ、乾燥させ、RGB値の平均として反射光の強度に関して測定した。洗剤基剤に関する値は減算され、アミラーゼAのものに対するアミラーゼBの性能の比が作成され、100%を超える値は、アミラーゼAによる性能より高い性能を示す。
以下の表3において、少なくとも2つの実験の平均が与えられる。
ラウンダオメーター洗浄試験のために、アミラーゼA及びBを使用して、異なる汚れのしみ(CS-129の古びたタピオカ、EMPA161の綿デンプン、CS-26トウモロコシデンプン、CS-28米デンプン、CS-28タピオカデンプン)を40℃において水(15°dH)で希釈された3.5g/Lの市販のPersil Non-Bio中において洗浄液に40分間加えられた0.02、0.05又は0.1ppmのアミラーゼで洗浄した後、流水下で5分間すすぎ、乾燥させ、RGB値の平均として反射光の強度に関して測定した。洗剤基剤に関する値は減算され、アミラーゼAのものに対するアミラーゼBの性能の比が作成され、100%を超える値は、アミラーゼAによる性能より高い性能を示す。
以下の表4において、少なくとも2つの実験の平均が与えられる。
上の表から、アミラーゼBが全ての試験された洗剤においてアミラーゼAより優れていることが明らかになる。
[実施例2]
親アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントの改善された熱安定性
より安定なバリアントは、熱負荷アッセイを使用して同定された。したがって、アミラーゼB(実施例1において試験される;配列番号1)のアルファ-アミラーゼの特異な変異を発現するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)の個々の上清を、100mM HEPES(pH8)を使用して384ウェルプレートに希釈し、アミラーゼBは陽性対照であった。希釈液を2つのプレートに分け、一方のプレートは、8℃で保管されベースライン活性を表し、他方のプレートは92℃で10分間インキュベートされて、負荷値を表した。活性測定のために、3μLの試料を27μLの1.1%赤色デンプン溶液(100mM HEPES pH8中)に加える。混合物を室温で10分間インキュベートした。反応を、60μLの氷冷エタノール(95%)を加えることによって停止し、遠心分離後、40μLの上清を除去し、新規の384ウェルプレートに加えた。510nmでの吸光度が記録された。負荷試料の吸光度値をベースライン試料に関する吸光度値で割ることにより、残存活性が計算された。改善度は、アミラーゼB(配列番号1)の残存活性に対するバリアントの残存活性の比である。表において、親に対して温度安定性が上昇したアミラーゼバリアントが与えられる(配列番号3に従う付番)。
結果は、以下の表5において与えられる。
[実施例3]
アミラーゼB(配列番号1)に対する40℃での上の表1aの配合物Aによる洗剤中での配列番号1の単一点変異の保管安定性。
改善された熱安定性が洗剤中における安定性の上昇にも関連するかどうかをさらに評価するために、アミラーゼB(配列番号1)のバリアントを洗剤中に配合し、40℃で3日の保管後のそれらの残存活性に関して試験した。
液体洗濯洗剤中の保管は、上の表1aの配合物Aによる洗剤中でアミラーゼをインキュベートすることによってなされた。したがって、アミラーゼを発現するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来の5μLの希釈された上清を、45μLの洗剤に加えた。混合物を40℃でインキュベートし、指定の時点後、5μLの洗剤混合物を除去し、45μL MOPS緩衝液(50mM、1mM CaCl2 pH7.0で補充された)を使用して希釈した。25μLのこの混合物に、25μLのInfinityアミラーゼ試薬を加えた。活性は、5分間にわたる5点のMaxVとして計算される405nmでの勾配である。残存活性は、保管時間後の活性をゼロ時の試料の活性で割ることによって計算された。残存活性は、参照アミラーゼB(配列番号1)の残存活性と比較された。
下の表6において、アミラーゼB(配列番号1)に対して改善された残存活性を有する変異が与えられる(配列番号3に従う付番)。
[実施例4]
40℃で7日間のES1-C洗剤中での保管安定性。
改善された熱安定性が洗剤中における安定性の上昇にも関連するかどうかをさらに評価するために、アミラーゼB(配列番号1)のバリアントを洗剤中に配合し、40℃で7日の保管後のそれらの残存活性に関して試験した。
液体洗濯洗剤中での保管は、ES1-C(上の表1bにおいて記載されるとおり)洗剤中でアミラーゼをインキュベートすることによってなされた。したがって、アミラーゼを発現するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来の5μLの希釈された上清を、45μLの洗剤に加えた。混合物を40℃でインキュベートし、指定の時点後、5μLの洗剤混合物を除去し、45μL MOPS緩衝液(50mM、1mM CaCl2 pH7.0で補充された)を使用して希釈した。25μLのこの混合物に、25μLのInfinityアミラーゼ試薬を加えた。活性は、5分間にわたる5点のMaxVとして計算される405nmでの勾配である。残存活性は、保管時間後の活性をゼロ時の試料の活性で割ることによって計算された。残存活性は、参照アミラーゼB(配列番号1)の残存活性と比較された。下の表7において、配列番号1に対して改善された残存活性を有する変異が与えられる(配列番号3に従う付番)。
[実施例5]
安定化変異のコンビナトリアルライブラリー
アミラーゼB(配列番号1)における変異を組み合わせて、アミラーゼB(配列番号1)に対して複数の変異を有するアミラーゼを作製した。改善された熱安定性が洗剤中における安定性の上昇にも関連するかどうかをさらに評価するために、アミラーゼB(配列番号1)のバリアントを上の表1aの配合物Aによる洗剤中に配合し、指定時点後のそれらの残存活性に関して試験した。保管は、プロテアーゼ(加えられる場合:R101E変異(BPNの付番)を含むバチルス・レンタス(Bacillus lentus)(BLAP)由来の0.3g/Lのサブチリシンプロテアーゼ)の添加の有り無し両方で40℃又は50℃において行われた。
液体洗濯洗剤中での保管は、洗剤中でアミラーゼをインキュベートすることによってなされた。したがって、アミラーゼを発現するバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来の25μLの希釈された上清を、475μLの洗剤に加えた。混合物を40℃でインキュベートし、指定の時点後、10μLの洗剤混合物を除去し、90μL MOPS緩衝液(50mM、1mM CaCl2 pH7.0で補充された)を使用して希釈した。50μLのこの混合物に、50μLのInfinityアミラーゼ試薬を加えた。活性は、5分間にわたる5点のMaxVとして計算される405nmでの勾配である。残存活性は、保管時間後の活性をゼロ時の試料の活性で割ることによって計算された。残存活性は、参照アミラーゼB(配列番号1)の残存活性と比較された。以下の表の付番は、配列番号3に従う。
下の表8において、結果は、プロテアーゼの存在下において40℃で保管された28日の保管後の残存活性に関して示される。
下の表9において、結果は、プロテアーゼの非存在下において40℃で保管された洗剤中での7日の保管後の残存活性に関して示される。
下の表10において、結果は、プロテアーゼ(洗剤中において0.3g/Lのプロテアーゼ)の存在下において40℃で保管された洗剤中での7日の保管後の残存活性に関して示される。
下の表11において、結果は、プロテアーゼの非存在下において50℃で保管された洗剤中での8日の保管後の残存活性に関して示される。
下の表12において、結果は、プロテアーゼの非存在下において40℃で保管された洗剤中での7日の保管後の残存活性に関して示される。
[実施例6]
洗浄試験
目的の位置でいくつかのアミノ酸置換を含有するアミラーゼB(配列番号1)のバリアントの微小な規模の洗浄試験については、布地としてCS-126を使用して実施例1に記載される方法を使用して洗浄性能について評価された。
以下の表13は、単一のアミノ酸置換(配列番号3に従う付番)を含有するアミラーゼBバリアントに関する結果を記載する。
以下の表14は、アミラーゼBにおいて複数のアミノ酸置換(配列番号3に従う付番)を含有するアミラーゼBバリアントに関する結果を記載する。

Claims (20)

  1. 親アルファ-アミラーゼのアルファ-アミラーゼバリアントであって、
    (i)配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従う25、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、47、48、51、54、59、60、63、70、71、72、73、75、76、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、103、106、108、109、113、114、115、116、117、119、120、123、125、126、128、129、131、132、133、134、135、136、139、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、154、155、156、158、160、161、162、163、164、165、169、170、172、173、174、175、176、177、178、180、182、184、185、187、188、189、191、192、193、203、208、210、211、212、213、214、215、216、218、219、221、222、223、224、225、226、227、230、231、233、234、235、236、237、238、240、242、243、245、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、279、280、281、282、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、301、302、303、304、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、317、318、319、320、321、322、323、324、326、327、333、334、336、337、338、341、342、343、344、345、346、348、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、366、367、368、370、372、375、376、378、379、381、382、383、384、385、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、405、406、407、408、410、413、414、415、416、418、421、424、426、427、429、431、432、434、436、438、439、440、442、443、445、446、447、448、449、451、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463、465、467、468、470、471、474、478、480及び482からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置でのアミノ酸改変を含み、
    (ii)配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1又は配列番号3、より好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも60%であるが、100%未満の配列同一性、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を有し、及び
    (iii)アルファ-アミラーゼ活性を有し、好ましくは、前記アルファ-アミラーゼバリアントのための前記親アルファ-アミラーゼは、配列番号1によるアミラーゼである、アルファ-アミラーゼバリアント。
  2. 配列番号3に記載されるアミノ酸配列の付番に従うX25H、X25A、X25C、X25D、X25F、X25G、X25K、X25L、X25M、X25Q、X25S、X25W、X25Y、X100D、X100F、X100K、X100L、X103A、X106D、X108A、X109A、X10A、X10C、X10E、X10F、X10L、X10W、X10Y、X113F、X113H、X113M、X113R、X113V、X113W、X113Y、X114A、X114C、X114D、X114E、X114F、X114G、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114N、X114Q、X114R、X114S、X114V、X114W、X114Y、X115C、X115D、X115K、X115M、X115N、X115Q、X115R、X115S、X115T、X115V、X116I、X116K、X116L、X116M、X116R、X116T、X117A、X117C、X117D、X117F、X117I、X117N、X117P、X117R、X117W、X117Y、X118A、X118D、X118E、X119H、X119P、X119R、X119S、X119Y、X120E、X120G、X120M、X120S、X120W、X120Y、X123D、X123S、X125A、X125D、X125E、X125F、X125G、X125H、X125K、X125L、X125M、X125N、X125Q、X125R、X125T、X125V、X125W、X125Y、X126D、X128C、X128E、X128L、X128M、X128W、X128Y、X129E、X12N、X12S、X131C、X131I、X131L、X131Q、X131W、X132T、X133A、X133C、X133D、X133E、X133H、X133K、X133N、X133P、X133Q、X133S、X134C、X134E、X134F、X134I、X134L、X134M、X134P、X134T、X134V、X134W、X134Y、X135D、X135E、X135G、X135M、X135N、X135P、X135S、X135T、X135W、X136A、X136C、X136D、X136E、X136F、X136H、X136L、X136M、X136N、X136P、X136W、X139C、X139S、X13A、X13Y、X141V、X142C、X142E、X142F、X142L、X142M、X142Q、X142R、X142W、X142Y、X143F、X144C、X144E、X144G、X144K、X144N、X144Q、X144R、X144S、X144T、X144V、X144Y、X145A、X146C、X146D、X146E、X146F、X146G、X146H、X146K、X146L、X146S、X146T、X146W、X147M、X149E、X14N、X150C、X150E、X150Q、X151C、X151E、X154A、X154Y、X155Y、X156E、X156V、X158H、X158N、X158Y、X15R、X160D、X160E、X160W、X161T、X162V、X163A、X163Q、X163T、X164V、X165S、X165T、X165W、X169A、X169D、X169E、X169S、X169V、X16F、X16R、X170C、X170F、X172A、X172C、X172D、X172K、X172N、X173I、X173Y、X174D、X174E、X174G、X174H、X174M、X174N、X174P、X174S、X174T、X175A、X175G、X175H、X175Q、X176K、X176S、X176T、X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S、X177W、X178F、X17K、X17V、X180M、X180N、X180T、X180W、X182D、X182E、X182N、X182Q、X182S、X185E、X185M、X185N、X187A、X187D、X187M、X187V、X188H、X188T、X188V、X189I、
    X18F、X18I、X18K、X18M、X18R、X18T、X191F、X191H、X191K、X191M、X191W、X191Y、X192A、X192T、X193D、X193E、X193G、X193V、X19A、X19C、X19D、X19F、X19G、X19H、X19I、X19K、X19L、X19M、X19P、X19Q、X19S、X19T、X19Y、X1R、X1V、X203E、X203R、X208F、X208I、X208Y、X20A、X20C、X20D、X20E、X20F、X20G、X20H、X20K、X20L、X20M、X20N、X20P、X20Q、X20S、X20T、X20V、X20W、X20Y、X210A、X210C、X210D、X210E、X210F、X210M、X210N、X210Q、X210S、X210Y、X211A、X211C、X211D、X211E、X211G、X211H、X211L、X211N、X211Q、X211S、X211T、X211V、X212C、X212D、X212I、X212L、X212W、X213A、X213C、X213M、X213R、X213S、X214E、X214P、X215A、X215D、X215E、X215H、X215W、X216G、X216H、X218A、X218C、X218D、X218E、X218F、X218G、X218H、X218I、X218K、X218L、X218N、X218Q、X218S、X218T、X218V、X218W、X218Y、X219A、X219C、X219D、X219E、X219F、X219G、X219H、X219K、X219M、X219Q、X219R、X219S、X219T、X219W、X219Y、X21E、X21S、X221F、X221N、X222D、X222K、X222S、X222T、X223C、X223L、X223V、X223Y、X224F、X224V、X225A、X225C、X225E、X225F、X225H、X225I、X225N、X225R、X225S、X225Y、X226A、X226C、X226D、X226E、X226G、X226H、X226I、X226L、X226M、X226Q、X226R、X226S、X226T、X226V、X226W、X226Y、X227C、X227F、X227G、X227H、X227I、X227K、X227L、X227M、X227R、X227T、X227V、X227W、X227Y、X22A、X22D、X22E、X22F、X22G、X22K、X22L、X22M、X22Q、X22R、X22T、X22W、X22Y、X230A、X230F、X231C、X231D、X231N、X233C、X233H、X233I、X233M、X233T、X233W、X233Y、X234C、X235L、X235M、X235V、X236Y、X237C、X237I、X238A、X238F、X238T、
    X23N、X23Q、X23W、X240M、X242M、X242N、X243D、X243F、X245E、X245H、X245M、X249D、X249I、X24G、X250V、X251A、X251E、X251F、X251L、X251M、X251S、X251T、X252C、X252I、X252S、X253C、X253G、X253Y、X255D、X255F、X255I、X255T、X255V、X256C、X257L、X257V、X257Y、X258F、X258Q、X258R、X259L、X260H、X261R、X262C、X262D、X262E、X262H、X262P、X262Y、X263I、X264H、X264T、X264W、X265S、X268F、X268G、X269M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26L、X26M、X26P、X26S、X26V、X26Y、X270A、X270Q、X270Y、X271S、X272F、X272G、X272L、X272S、X273A、X273C、X273D、X273E、X273F、X273H、X273I、X273L、X273M、X273P、X273Q、X273R、X273V、X273W、X273Y、X274F、X274S、X275V、X276D、X276K、X276L、X276N、X276R、X276Y、X277D、X277E、X277T、X279A、X279P、X27A、X27D、X27F、X27G、X27H、X27I、X27Q、X27R、X27T、X27V、X280D、X280F、X280G、X280H、X280I、X280K、X280N、X280R、X280V、X280Y、X281A、X281D、X281E、X281H、X284A、X284F、X284H、X284L、X284M、X284N、X284Y、X285G、X285L、X285N、X285P、X286Q、X287A、X287D、X287E、X287H、X287T、X288A、X288K、X288P、X288Y、X289F、X289G、X289R、X289T、X28C、X28D、X28E、X28F、X28G、X28I、X28K、X28N、X28Q、X28S、X28T、X28V、X290D、X290M、X290N、X290Q、X290W、X291D、X291K、X291T、X291Y、X292C、X292D、X292F、X292I、X292L、X292T、X292W、X292Y、X293D、X293E、X293F、X293K、X293R、X294G、X294T、X295F、X296A、X296C、X296L、X296Y、X297E、X297F、X297H、X297K、X297M、X297S、X297V、X299G、X299I、X299K、X299L、X299S、X299Y、
    X29D、X29E、X29F、X29G、X29H、X29I、X29K、X29L、X29N、X29P、X29Q、X29V、X29W、X29Y、X2I、X2S、X301F、X302H、X302I、X302Q、X302V、X302Y、X303E、X303H、X303I、X303K、X303L、X303M、X303N、X303P、X303R、X303T、X304A、X304D、X304E、X304H、X304K、X304M、X304N、X304P、X304R、X304T、X304W、X304Y、X306A、X306D、X306E、X306G、X306H、X306I、X306M、X306Q、X306R、X306S、X306T、X306V、X306W、X306Y、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X30A、X30E、X30F、X30G、X30H、X30I、X30K、X30L、X30M、X30Q、X30T、X30W、X30Y、X310A、X310Q、X311A、X311E、X311G、X311H、X311K、X311N、X311R、X311T、X311Y、X312L、X312M、X313V、X314C、X314E、X314K、X314Q、X315A、X315C、X315E、X315H、X315K、X315T、X318I、X318S、X318T、X319A、X319D、X319H、X319I、X319K、X319M、X319N、X319P、X319S、X319T、X319W、X31N、X31Q、X31S、X31T、X31V、X31W、X320A、X320C、X320D、X320E、X320G、X320H、X320K、X320L、X320N、X320Q、X320S、X320Y、X321A、X321E、X321K、X321N、X321T、X321V、X321W、X323A、X323G、X323K、X323L、X323V、X324K、X324L、X324M、X324W、X324Y、X326G、X326N、X326S、X326Y、X327C、X327L、X327M、X32A、X32D、X32E、X32F、X32H、X32I、X32L、X32M、X32N、X32P、X32Q、X32T、X32W、X333I、X334T、X336K、X337A、X337C、X337F、X337G、X337I、X337K、X337L、X337M、X337N、X337Q、X337R、X337S、X337T、X337V、X337Y、X338G、X338S、X338T、
    X33D、X33E、X33H、X33K、X33M、X33Q、X33R、X33Y、X341V、X342P、X343L、X343T、X343W、X343Y、X344I、X344Q、X344V、X345D、X345G、X345M、X345N、X345Q、X345S、X345T、X346A、X346C、X346D、X346G、X346H、X346N、X346Q、X348T、X34H、X34I、X34V、X350H、X350K、X350P、X351A、X351M、X352S、X353H、X354I、X354N、X354T、X354Y、X355I、X355M、X356I、X356V、X357A、X358I、X358L、X358N、X358P、X358V、X359E、X35A、X35C、X35D、X35G、X35H、X35I、X35L、X35M、X35N、X35P、X35Q、X35R、X35S、X35T、X35V、X35Y、X360A、X360F、X360G、X360I、X360L、X360N、X360Q、X360R、X360S、X360T、X360V、X360Y、X362F、X362K、X362M、X362N、X362T、X362V、X362Y、X363A、X363C、X363D、X363E、X363G、X363H、X363K、X363L、X363M、X363P、X363Q、X363R、X363S、X363T、X363V、X363W、X363Y、X364A、X364C、X364G、X364K、X364L、X364N、X364S、X364T、X364V、X366I、X366L、X366T、X367E、X367S、X368A、X368F、X368L、X368N、
    X36A、X36E、X36G、X36I、X36K、X36M、X36N、X36P、X36Q、X36R、X36S、X36T、X36V、X370E、X370I、X372A、X372C、X372E、X372F、X372H、X372M、X372N、X372Q、X375A、X375D、X375E、X375I、X375K、X375Q、X375R、X375T、X375W、X375Y、X376G、X376I、X376K、X376L、X376M、X376Q、X376R、X376S、X376V、X377Q、X378C、X378D、X378E、X378R、X379A、X379L、X379S、X37A、X37G、X37M、X37P、X37T、X37V、X37W、X381E、X381V、X382A、X382H、X382K、X382L、X382N、X382Q、X382S、X383C、X383D、X383E、X383H、X383I、X383M、X383N、X383Q、X383R、X383S、X383V、X383Y、X384A、X384C、X384D、X384E、X384F、X384I、X384L、X384M、X384N、X384Q、X384R、X384T、X384V、X384W、X384Y、X385A、X385C、X385D、X385E、X385F、X385G、X385H、X385I、X385L、X385M、X385N、X385P、X385Q、X385R、X385S、X385T、X385V、X385W、X385Y、X387C、X387E、X387N、X388E、X388F、X388H、X388I、X388M、X388R、X388V、X389G、X389H、X389K、X38N、X390D、X390F、X390M、X390N、X390P、X390R、X391A、X391F、X391G、X391K、X391M、X391N、X391Q、X391S、X391T、X391Y、X392C、X392V、X393E、X393H、X393P、X393S、X393V、X394A、X394C、X394E、X394H、X394I、X394L、X394M、X394N、X394R、X394S、X395A、X395H、X395M、X395V、X396H、X396P、X397D、X397H、X397P、X397S、X398M、X399P、
    X39E、X39K、X3A、X3F、X3G、X3I、X3K、X3L、X3Q、X3V、X400A、X400D、X400E、X400G、X400H、X400I、X400K、X400L、X400M、X400N、X400P、X400Q、X400R、X400S、X400V、X400W、X401I、X401K、X401M、X401T、X403N、X405C、X405H、X405M、X405T、X405V、X406P、X407D、X407R、X407S、X408E、X408I、X408Q、X40I、X40S、X410H、X410I、X410K、X410L、X410P、X410R、X410Y、X413S、X414C、X414E、X414S、X415E、X415I、X416S、X418C、X418N、X418P、X41C、X41D、X41E、X41G、X41Q、X41S、X41T、X421N、X421P、X424A、X426D、X426W、X427C、X427F、X427G、X427K、X427Q、X427R、X427S、X427T、X427V、X429A、X429D、X429E、X429F、X429G、X429I、X429M、X429N、X429P、X429Q、X429S、X429T、X429V、X429W、X42C、X42I、X42Q、X42V、X431I、X434S、X436E、X438F、X438P、X438Y、X439K、X439C、X439P、X440V、X442Q、X443H、X443T、X445A、X445C、X445D、X445F、X445G、X445H、X445K、X445M、X445Q、X445R、X445S、X445T、X445V、X446F、X446I、X446L、X446P、X446Q、X446R、X446V、X446W、X447V、X448D、X448E、X448H、X448N、X449A、X449F、X449G、X449K、X449L、X449M、X449N、X449P、X449Q、X449R、X449S、X449V、X449W、X449Y、X451L、X453G、X453I、X453N、X453P、X453Y、X455L、X456L、X456M、X456R、X456S、X456V、X456W、X456Y、X457A、X457C、X457E、X457F、X457G、X457K、X457L、X457M、X457R、X457S、X457T、X457V、X457W、X458I、X458K、X458V、X458W、X459C、X459D、X459E、X459I、X459K、X459N、X459Q、X459R、X459V、X459Y、
    X45G、X45N、X460A、X460D、X460E、X460G、X460Q、X460R、X460S、X460T、X460V、X461A、X461E、X461F、X461K、X461L、X461M、X461N、X461Q、X461R、X461S、X461V、X462K、X463L、X465H、X465P、X465R、X465V、X467A、X467E、X467H、X468D、X468H、X470A、X470Q、X470T、X471E、X474F、X474H、X474P、X478A、X478E、X47S、X480D、X480E、X480M、X480R、X480Y、X482C、X482T、X482W、X48F、X48I、X48M、X48Y、X4A、X4C、X4K、X4M、X4Q、X4R、X4S、X51Q、X51T、X51V、X54D、X54G、X54Q、X59T、X5A、X5C、X5D、X5E、X5F、X5H、X5I、X5K、X5L、X5M、X5N、X5P、X5Q、X5R、X5V、X5Y、X60T、X63C、X63V、X6A、X6C、X6E、X6F、X6G、X6H、X6K、X6L、X6M、X6P、X6Q、X6S、X6T、X6V、X6W、X6Y、X70F、X70H、X70L、X70M、X70N、X70Y、X71D、X72C、X72D、X72E、X72N、X72T、X73L、X73N、X73Q、X75A、X75G、X75I、X75L、X75P、X75T、X75W、X76C、X76E、X76G、X76L、X76T、X76V、X7C、X7E、X7F、X7H、X7K、X7N、X7P、X7Q、X7R、X7S、X7V、X7W、X7Y、X81H、X81L、X82K、X82M、X83A、X83D、X83E、X83G、X83R、X83S、X86K、X87D、X87R、X89A、X89C、X89F、X89G、X89L、X89M、X89R、X89S、X8A、X8C、X8F、X8I、X8M、X8P、X8S、X8V、X8W、X8Y、X90A、X90D、X90E、X90F、X90G、X90I、X90M、X90N、X90Q、X90R、X90S、X90V、X90Y、X91C、X91D、X91E、X91F、X91G、X91H、X91I、X91K、X91L、X91M、X91N、X91Q、X91S、X91T、X91V、X91W、X91Y、X92D、X92M、X92V、X93K、X93Q、X94A、X94D、X94E、X94K、X94M、X94V、X94Y、X95E、X95I、X95L、X95V、X96K、X96N、X96Q、X97V、X98E、X98G、X98N、X99H、X99K、X99N、X100W及びX1Gからなるアミノ酸置換の群から選択される、
    好ましくはX4Q、X25H、X100W、X135E、X135T、X135W、X135D、X160W、X176K、X193E、X251E、X258Q、X276R、X299S、X323G、X363E、X363H、X382Q、X405M、X460G及びX482Wから選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、請求項1に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  3. X25H+X176K、
    X25H+X176K+X186E、
    X25H+X176K+X186E+X251E+X405M、
    X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X482W、
    X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K、
    X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K+X482W、
    X25H+X176K+X251E+X405M、
    X25H+X176K+X251E+X405M+X482W、
    X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、
    X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
    X176K+X186E、
    X251E+X405M、
    X251E+X405M+X439K、
    X251E+X405M+X482W、
    X251E+X405M+X439K+X482W、
    X405M+X439K、
    X405M+X482W、
    X405M+X439K+X482W、
    X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K、
    X4Q+X25H+X176K+X186E+X251E+X405M+X439K+X482W、
    X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K、
    X4Q+X25H+X176K+X251E+X405M+X439K+X482W、
    X116K+X181T+X225A、
    X181T+X225A+X320K、
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    X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X181Q+X281N+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X181Q+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X181Q+X363H+X254Q、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X258Q、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X258Q+X281N+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X258Q+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X258Q+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q+X258Q、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q+X258Q+X281N、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q+X258Q+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q+X258Q+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q+X281N+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X181Q+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X135T+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X100W+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X258Q、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X258Q+X8A、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X258Q+X281N+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X258Q+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X281N、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X181Q+X258Q、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X181Q+X258Q+X281N、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X181Q+X258Q+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X135T+X363H、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X363E、X4Q+X176K+X186E+X193E+X206Y+X251E+X405M+X363H、
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    からなる群から選択される置換の組み合わせを含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従い、前記バリアントは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、請求項1又は2に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  4. 配列番号1、3、4又は配列番号15~41のいずれか、好ましくは配列番号1に記載されるアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%、好ましくは少なくとも91%又は少なくとも95%であるが、100%未満の配列同一性を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  5. A及びBドメイン並びにCドメインを含み、前記A及びBドメインのアミノ酸配列は、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも75%であるが、100%未満同一であり、及び前記Cドメインのアミノ酸配列は、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも75%であるが、100%未満同一である、請求項1~4のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  6. 前記親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1及び/又は配列番号3に記載される前記親アルファ-アミラーゼと比較して、好ましくは配列番号1に記載される前記親アルファ-アミラーゼと比較して、1つ以上の改善された特性を示し、好ましくは発現、活性、安定性、熱安定性、比活性、基質特異性、pH依存活性、pH安定性、酸化安定性、触媒効率、触媒速度、化学的安定性、pH活性、保管条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質安定性、表面特性、熱活性、Ca2+依存性、洗浄性能、洗濯洗剤中での洗浄性能及び/又はADW洗剤中での洗浄性能における増大を有し、好ましくは、前記改善された特性は、改善された熱安定性、洗剤組成物中での保管下における改善された安定性及び/又は改善された洗浄性能、最も好ましくは改善された熱安定性、好ましくは洗剤組成物、好ましくは洗濯又は食器洗浄洗剤組成物、好ましくは洗濯洗剤組成物中での改善された熱安定性である、請求項1~5のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  7. 前記改善された特性は、>1.0の改善度(IF)として表され、好ましくは、前記改善度は、1.1以上、好ましくは1.2以上、より好ましくは1.3以上である、請求項7に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  8. 181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する1つ以上のアミノ酸での欠失、好ましくは181、182、183及び184からなる群から選択される位置に対応する2つ以上のアミノ酸の欠失、好ましくは位置181及び182、182及び183又は183及び184に対応するアミノ酸の欠失をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う、請求項1~7のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  9. 配列番号1と比較した置換の数は、1~30個、好ましくは1~25、1~20、1~15、1~10、2~10、3~10又は1~5個、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25個の置換である、請求項1~8のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  10. X25H、X25A、X25C、X25D、X25F、X25G、X25K、X25L、X25M、X25Q、X25S、X25W、X25Y、X100D、X100F、X100K、X100L、X103A、X106D、X108A、X109A、X10A、X10C、X10E、X10F、X10L、X10W、X10Y、X113F、X113H、X113M、X113R、X113V、X113W、X113Y、X114A、X114C、X114D、X114E、X114F、X114G、X114H、X114I、X114K、X114L、X114M、X114N、X114Q、X114R、X114S、X114V、X114W、X114Y、X115C、X115D、X115K、X115M、X115N、X115Q、X115R、X115S、X115T、X115V、X116I、X116K、X116L、X116M、X116R、X116T、X117A、X117C、X117D、X117F、X117I、X117N、X117P、X117R、X117W、X117Y、X118A、X118D、X118E、X119H、X119P、X119R、X119S、X119Y、X120E、X120G、X120M、X120S、X120W、X120Y、X123D、X123S、X125A、X125D、X125E、X125F、X125G、X125H、X125K、X125L、X125M、X125N、X125Q、X125R、X125T、X125V、X125W、X125Y、X126D、X128C、X128E、X128L、X128M、X128W、X128Y、X129E、X12N、X12S、X131C、X131I、X131L、X131Q、X131W、X132T、X133A、X133C、X133D、X133E、X133H、X133K、X133N、X133P、X133Q、X133S、X134C、X134E、X134F、X134I、X134L、X134M、X134P、X134T、X134V、X134W、X134Y、X135D、X135E、X135G、X135M、X135N、X135P、X135S、X135T、X135W、X136A、X136C、X136D、X136E、X136F、X136H、X136L、X136M、X136N、X136P、X136W、X139C、X139S、X13A、X13Y、X141V、X142C、X142E、X142F、X142L、X142M、X142Q、X142R、X142W、X142Y、X143F、X144C、X144E、X144G、X144K、X144N、X144Q、X144R、X144S、X144T、X144V、X144Y、X145A、X146C、X146D、X146E、X146F、X146G、X146H、X146K、X146L、X146S、X146T、X146W、X147M、X149E、X14N、X150C、X150E、X150Q、X151C、X151E、X154A、X154Y、X155Y、X156E、X156V、X158H、X158N、X158Y、
    X15R、X160D、X160E、X160W、X161T、X162V、X163A、X163Q、X163T、X164V、X165S、X165T、X165W、X169A、X169D、X169E、X169S、X169V、X16F、X16R、X170C、X170F、X172A、X172C、X172D、X172K、X172N、X173I、X173Y、X174D、X174E、X174G、X174H、X174M、X174N、X174P、X174S、X174T、X175A、X175G、X175H、X175Q、X176K、X176S、X176T、X177A、X177G、X177K、X177N、X177P、X177R、X177S、X177W、X178F、X17K、X17V、X180M、X180N、X180T、X180W、X182D、X182E、X182N、X182Q、X182S、X185E、X185M、X185N、X187A、X187D、X187M、X187V、X188H、X188T、X188V、X189I、X18F、X18I、X18K、X18M、X18R、X18T、X191F、X191H、X191K、X191M、X191W、X191Y、X192A、X192T、X193D、X193E、X193G、X193V、X19A、X19C、X19D、X19F、X19G、X19H、X19I、X19K、X19L、X19M、X19P、X19Q、X19S、X19T、X19Y、X1R、X1V、X203E、X203R、X208F、X208I、X208Y、X20A、X20C、X20D、X20E、X20F、X20G、X20H、X20K、X20L、X20M、X20N、X20P、X20Q、X20S、X20T、X20V、X20W、X20Y、X210A、X210C、X210D、X210E、X210F、X210M、X210N、X210Q、X210S、X210Y、X211A、X211C、X211D、X211E、X211G、X211H、X211L、X211N、X211Q、X211S、X211T、X211V、X212C、X212D、X212I、X212L、X212W、X213A、X213C、X213M、X213R、X213S、X214E、X214P、X215A、X215D、X215E、X215H、X215W、X216G、X216H、X218A、X218C、X218D、X218E、X218F、X218G、X218H、X218I、X218K、X218L、X218N、X218Q、X218S、X218T、X218V、X218W、X218Y、X219A、X219C、X219D、X219E、X219F、X219G、X219H、X219K、X219M、X219Q、X219R、X219S、X219T、X219W、X219Y、X21E、X21S、X221F、X221N、X222D、X222K、X222S、X222T、X223C、X223L、X223V、X223Y、X224F、X224V、X225A、X225C、X225E、X225F、X225H、X225I、X225N、X225R、X225S、X225Y、X226A、X226C、X226D、X226E、X226G、X226H、X226I、X226L、X226M、X226Q、X226R、X226S、X226T、X226V、X226W、X226Y、X227C、X227F、X227G、X227H、X227I、X227K、X227L、X227M、X227R、X227T、X227V、X227W、X227Y、
    X22A、X22D、X22E、X22F、X22G、X22K、X22L、X22M、X22Q、X22R、X22T、X22W、X22Y、X230A、X230F、X231C、X231D、X231N、X233C、X233H、X233I、X233M、X233T、X233W、X233Y、X234C、X235L、X235M、X235V、X236Y、X237C、X237I、X238A、X238F、X238T、X23N、X23Q、X23W、X240M、X242M、X242N、X243D、X243F、X245E、X245H、X245M、X249D、X249I、X24G、X250V、X251A、X251E、X251F、X251L、X251M、X251S、X251T、X252C、X252I、X252S、X253C、X253G、X253Y、X255D、X255F、X255I、X255T、X255V、X256C、X257L、X257V、X257Y、X258F、X258Q、X258R、X259L、X260H、X261R、X262C、X262D、X262E、X262H、X262P、X262Y、X263I、X264H、X264T、X264W、X265S、X268F、X268G、X269M、X26A、X26D、X26E、X26F、X26L、X26M、X26P、X26S、X26V、X26Y、X270A、X270Q、X270Y、X271S、X272F、X272G、X272L、X272S、X273A、X273C、X273D、X273E、X273F、X273H、X273I、X273L、X273M、X273P、X273Q、X273R、X273V、X273W、X273Y、X274F、X274S、X275V、X276D、X276K、X276L、X276N、X276R、X276Y、X277D、X277E、X277T、X279A、X279P、X27A、X27D、X27F、X27G、X27H、X27I、X27Q、X27R、X27T、X27V、X280D、X280F、X280G、X280H、X280I、X280K、X280N、X280R、X280V、X280Y、X281A、X281D、X281E、X281H、X284A、X284F、X284H、X284L、X284M、X284N、X284Y、X285G、X285L、X285N、X285P、X286Q、X287A、X287D、X287E、X287H、X287T、X288A、X288K、X288P、X288Y、X289F、X289G、X289R、X289T、
    X28C、X28D、X28E、X28F、X28G、X28I、X28K、X28N、X28Q、X28S、X28T、X28V、X290D、X290M、X290N、X290Q、X290W、X291D、X291K、X291T、X291Y、X292C、X292D、X292F、X292I、X292L、X292T、X292W、X292Y、X293D、X293E、X293F、X293K、X293R、X294G、X294T、X295F、X296A、X296C、X296L、X296Y、X297E、X297F、X297H、X297K、X297M、X297S、X297V、X299G、X299I、X299K、X299L、X299S、X299Y、X29D、X29E、X29F、X29G、X29H、X29I、X29K、X29L、X29N、X29P、X29Q、X29V、X29W、X29Y、X2I、X2S、X301F、X302H、X302I、X302Q、X302V、X302Y、X303E、X303H、X303I、X303K、X303L、X303M、X303N、X303P、X303R、X303T、X304A、X304D、X304E、X304H、X304K、X304M、X304N、X304P、X304R、X304T、X304W、X304Y、X306A、X306D、X306E、X306G、X306H、X306I、X306M、X306Q、X306R、X306S、X306T、X306V、X306W、X306Y、X307F、X307M、X308S、X309H、X309L、X309Q、X30A、X30E、X30F、X30G、X30H、X30I、X30K、X30L、X30M、X30Q、X30T、X30W、X30Y、X310A、X310Q、X311A、X311E、X311G、X311H、X311K、X311N、X311R、X311T、X311Y、X312L、X312M、X313V、X314C、X314E、X314K、X314Q、X315A、X315C、X315E、X315H、X315K、X315T、X318I、X318S、X318T、X319A、X319D、X319H、X319I、X319K、X319M、X319N、X319P、X319S、X319T、X319W、X31N、X31Q、X31S、X31T、X31V、X31W、X320A、X320C、X320D、X320E、X320G、X320H、X320K、X320L、X320N、X320Q、X320S、X320Y、X321A、X321E、X321K、X321N、X321T、X321V、X321W、X323A、X323G、X323K、X323L、X323V、X324K、X324L、X324M、X324W、X324Y、X326G、X326N、X326S、X326Y、X327C、X327L、X327M、
    X32A、X32D、X32E、X32F、X32H、X32I、X32L、X32M、X32N、X32P、X32Q、X32T、X32W、X333I、X334T、X336K、X337A、X337C、X337F、X337G、X337I、X337K、X337L、X337M、X337N、X337Q、X337R、X337S、X337T、X337V、X337Y、X338G、X338S、X338T、X33D、X33E、X33H、X33K、X33M、X33Q、X33R、X33Y、X341V、X342P、X343L、X343T、X343W、X343Y、X344I、X344Q、X344V、X345D、X345G、X345M、X345N、X345Q、X345S、X345T、X346A、X346C、X346D、X346G、X346H、X346N、X346Q、X348T、X34H、X34I、X34V、X350H、X350K、X350P、X351A、X351M、X352S、X353H、X354I、X354N、X354T、X354Y、X355I、X355M、X356I、X356V、X357A、X358I、X358L、X358N、X358P、X358V、X359E、X35A、X35C、X35D、X35G、X35H、X35I、X35L、X35M、X35N、X35P、X35Q、X35R、X35S、X35T、X35V、X35Y、X360A、X360F、X360G、X360I、X360L、X360N、X360Q、X360R、X360S、X360T、X360V、X360Y、X362F、X362K、X362M、X362N、X362T、X362V、X362Y、X363A、X363C、X363D、X363E、X363G、X363H、X363K、X363L、X363M、X363P、X363Q、X363R、X363S、X363T、X363V、X363W、X363Y、X364A、X364C、X364G、X364K、X364L、X364N、X364S、X364T、X364V、X366I、X366L、X366T、X367E、X367S、X368A、X368F、X368L、X368N、X36A、X36E、X36G、X36I、X36K、X36M、X36N、X36P、X36Q、X36R、X36S、X36T、X36V、X370E、X370I、X372A、X372C、X372E、X372F、X372H、X372M、X372N、X372Q、X375A、X375D、X375E、X375I、X375K、X375Q、X375R、X375T、X375W、X375Y、X376G、X376I、X376K、X376L、X376M、X376Q、X376R、X376S、X376V、X377Q、X378C、X378D、X378E、X378R、X379A、X379L、X379S、X37A、X37G、X37M、X37P、X37T、X37V、X37W、X381E、X381V、X382A、X382H、X382K、X382L、X382N、X382Q、X382S、X383C、X383D、X383E、X383H、X383I、X383M、X383N、X383Q、X383R、X383S、X383V、X383Y、X384A、X384C、X384D、X384E、X384F、X384I、X384L、X384M、X384N、X384Q、X384R、X384T、X384V、X384W、X384Y、X385A、X385C、X385D、X385E、X385F、X385G、X385H、X385I、X385L、X385M、X385N、X385P、X385Q、X385R、X385S、X385T、X385V、X385W、X385Y、X387C、X387E、X387N、X388E、X388F、X388H、X388I、X388M、X388R、X388V、X389G、X389H、X389K、X38N、X390D、X390F、X390M、X390N、X390P、X390R、X391A、X391F、X391G、X391K、X391M、X391N、X391Q、X391S、X391T、X391Y、X392C、X392V、X393E、X393H、X393P、X393S、X393V、X394A、X394C、X394E、X394H、X394I、X394L、X394M、X394N、X394R、X394S、X395A、X395H、X395M、X395V、X396H、X396P、X397D、X397H、X397P、X397S、X398M、X399P、
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  11. 9、130、179、181、186、190、195、202、206、244、402、419、420、422、423、428、430、435、441、444、450、452、454、466、469、473、475、476、479、483及び485からなる群から選択される位置に対応する1つ以上の位置での追加のアミノ酸改変、好ましくは追加の置換、好ましくはX9D、X9F、X9K、X9L、X9N、X9P、X9Q、X9S、X9T、X9Y、X130V、X179G、X179L、X181D、X181E、X181F、X181H、X181I、X181N、X181Q、X181S、X181T、X181V、X181W、X181Y、X186A、X186C、X186D、X186E、X186F、X186H、X186I、X186K、X186L、X186M、X186N、X186Q、X186R、X186S、X186V、X186W、X186Y、X190H、X195F、X195H、X195K、X195L、X195W、X195Y、X202L、X206C、X206H、X206L、X206M、X206Y、X244A、X244C、X244D、X244E、X244F、X244G、X244H、X244M、X244N、X244Q、X244V、X402T、X419C、X420D、X420E、X420G、X420H、X420K、X420L、X420Q、X422C、X422N、X422H、X423F、X423M、X423Q、X423S、X428A、X428C、X428D、X428E、X428G、X428I、X428K、X428L、X428M、X428N、X428R、X428S、X428V、X428W、X428Y、X430A、X430C、X430D、X430E、X430F、X430G、X430I、X430L、X430P、X430Q、X430S、X430T、X430V、X435E、X435K、X435P、X435R、X435S、X435A、X435D、X437A、X437L、X437T、X437W、X441C、X441D、X441K、X441L、X441M、X441N、X441S、X444E、X444H、X444K、X444M、X444N、X444R、X444T、X450C、X450D、X450E、X450H、X450I、X450L、X450M、X450P、X450Q、X450R、X450T、X452A、X452C、X452E、X452F、X452I、X452K、X452M、X452N、X452R、X452T、X454A、X454E、X454K、X454L、X454M、X454P、X454S、X454T、X466E、X466W、X469F、X469L、X469Y、X473H、X473Q、X473R、X475A、X475K、X475N、X475E、X475L、X476G、X476E、X479A、X479I、X479K、X479M、X483F、X483I、X483L、X483Q、X483R、X485K及びX485Rからなるアミノ酸置換の群から選択される1つ以上の追加のアミノ酸置換をさらに含み、付番は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に従う、請求項1~10のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアント。
  12. 請求項1~11のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド。
  13. 請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクター。
  14. 請求項12に記載のポリヌクレオチド、請求項13に記載の核酸コンストラクト又は請求項13に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  15. 請求項1~11のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアント及び少なくとも1種の追加の構成成分を含む組成物。
  16. 洗剤組成物、好ましくは洗濯洗剤組成物又は自動食器洗浄(ADW)洗剤組成物である、請求項15に記載の組成物。
  17. 1種以上の界面活性剤及び/又は1種以上のビルダー、好ましくは強力な金属イオン捕捉ビルダーを含む、請求項16に記載の組成物。
  18. 請求項1~17のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアントと異なる1種以上の第2の酵素、好ましくはプロテアーゼ、第2のアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ及びヌクレアーゼからなる群から選択される、特に好ましくはプロテアーゼ、マンナナーゼ及びリパーゼ、最も好ましくはプロテアーゼから選択される1種以上の第2の酵素を含む、請求項15~17のいずれか一項に記載の組成物。
  19. アルファ-アミラーゼバリアントを生成する方法であって、
    a.前記アルファ-アミラーゼバリアントの発現に好適な条件下において、請求項14に記載の宿主細胞を培養すること;及び
    b.前記アルファ-アミラーゼバリアントを回収すること
    を含む方法。
  20. 洗濯又は硬質表面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける、請求項1~11のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼバリアントの使用。
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