CN102712878A

CN102712878A - 含有枯草芽孢杆菌脂肪酶的洗涤剂组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN102712878A
Application number: CN2010800584192A
Authority: CN
Inventors: C·亚当斯; B·施密特
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-10-03
Also published as: BR112012017056A2; EP2516612A1; WO2011084599A1; US20120258900A1

Abstract

本发明的组合物和方法涉及从枯草芽孢杆菌克隆的脂肪酶、编码所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。所述组合物和方法特别适用于洗涤剂清洁组合物和方法中。

Description

含有枯草芽孢杆菌脂肪酶的洗涤剂组合物及其使用方法

优先权

本专利申请要求2009年12月21日提交的系列号为61/288,696的美国临时专利申请的优先权，藉此将该专利申请全文以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明的组合物和方法涉及从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)克隆的脂肪酶、编码所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。

背景技术

当前的衣物洗涤剂和/或织物护理组合物包括诸如表面活性剂、酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶)、漂白剂、助洗剂系统(buildersystem)、抑泡剂、悬污剂、去污剂、荧光增白剂、软化剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀细菌剂和芳香剂之类的活性成分的复杂组合。

脂肪分解酶(包括脂肪酶和角质酶)已被用于洗涤剂清洁组合物中，以通过水解甘油三酸酯产生脂肪酸来去除油渍。然而，清洁组合物中存在的表面活性剂和其它组分常常会抑制这些酶，干扰其除去油渍的能力。因此，需要可在清洁组合物的苛刻环境中起作用的脂肪酶和角质酶。

还需要有效进行转酯反应以便制造生物燃料、润滑剂以及其它合成和半合成烃的较为稳健且有效的脂肪酶和角质酶。优选地，这些酶将利用天然存在或常用的原料，而且在合成反应中不需要保护和去保护步骤，这些保护和去保护步骤会使合成变得复杂以及导致产生有毒废产物。

发明内容

本发明组合物和方法涉及从枯草芽孢杆菌克隆的脂肪酶A(LipA)。在一些实施方案中，LipA与细菌纤维素酶催化结构域的羧基末端融合。在一些实施方案中，细菌纤维素酶是源自在位于荷兰巴伦(Baam，TheNetherland)的皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Central Bureauvoor Schimmelcultures)以CBS 670.93(称为BCE103)保藏的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。在一些实施方案中，LipA通过可裂解连接物连接至BCE103纤维素酶。因此，在一些实施方案中，LipA不是融合蛋白。

在本发明的一个方面中，提供了重组枯草芽孢杆菌LipA多肽。在一些实施方案中，重组LipA多肽与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有80％至99％的同一性(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。在另外的实施方案中，重组LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些实施方案中，重组LipA融合蛋白与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少80％的同一性(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性)。除非具体说明，否则本文使用的术语LipA多肽涵盖LipA融合蛋白以及缺少融合搭配物的成熟LipA多肽二者。在一些实施方案中，LipA多肽是在枯草芽孢杆菌中表达。本发明还提供了表达载体，其包含以有效方式与启动子组合的编码LipA多肽的多核苷酸。

在本发明的优选方面中，提供了洗涤剂组合物，其包含重组枯草芽孢杆菌LipA多肽。在一些实施方案中，重组LipA多肽与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％的同一性(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性)。在其它实施方案中，重组LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些实施方案中，重组LipA融合蛋白与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少80％的同一性(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性)。在一些优选的实施方案中，所述组合物包含表面活性剂(离子型或非离子型)。在一些实施方案中，表面活性剂包含选自如下的一者或多者：十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4。在一些实施方案中，表面活性剂包含离子型表面活性剂。在一些优选的实施方案中，离子型表面活性剂选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合。在一些实施方案中，洗涤剂是在8.0至10.0的pH值下配制。在一些实施方案中，洗涤剂选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洗剂。在一些实施方案中，洗涤剂是以选自液体、粉末、颗粒状固体和小片的形式。在特别优选的实施方案中，在30℃至40℃的温度下，LipA多肽在洗涤剂中具有酶活性。

在相关的方面中，提供了洗涤剂组合物，其包含：来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶和表面活性剂，其中所述洗涤剂组合物在去除待清洁表面的油渍方面比不含该脂肪酶的洗涤剂组合物更有效。

在一些实施方案中，脂肪酶是LipA。在一些实施方案中，LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。

在一些实施方案中，脂肪酶包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，脂肪酶包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，脂肪酶是重组脂肪酶。在一些实施方案中，脂肪酶是在枯草芽孢杆菌中表达的重组脂肪酶。

在一些实施方案中，表面活性剂是离子型或非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是一种或多种选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合的表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂包含一种或多种选自如下的表面活性剂：十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠和C14-15链烷醇聚醚-4。

在一些实施方案中，洗涤剂组合物是在约8.0至约10.0的pH值下配制。在一些实施方案中，洗涤剂组合物是在约8.2至约10.0的pH值下配制。

在一些实施方案中，洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洗剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂组合物的形式选自液体、粉末、颗粒状固体和片。

在一些实施方案中，洗涤剂组合物在约30℃至约40℃的温度下有效水解脂质。

在一些实施方案中，与包含代替枯草芽孢杆菌脂肪酶的类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)脂肪酶变体M21L(LIPOMAX^TM)的洗涤剂组合物相比较，所述洗涤剂组合物在水解C4到C16底物方面更有效。

在一些实施方案中，洗涤剂组合物还包含蛋白酶。在一些实施方案中，洗涤剂组合物还包含枯草杆菌蛋白酶。

在另一个方面，提供了水解表面上的污垢或污渍中存在的脂质的方法，其包括使所述表面与包含重组LipA多肽和表面活性剂的洗涤剂组合物接触。前一段落、具体实施方式和实例中的洗涤剂组合物适用于此目的。

在另一个方面，提供了进行转酯反应的方法，其包括使供体分子与包含重组LipA多肽的组合物接触。在一些实施方案中，供体分子具有C4-16碳链。在一个优选的实施方案中，供体分子具有C8碳链。

根据如下描述LipA组合物和方法的这些及其它方面将显而易见。

具体实施方式

I.引言

所描述的是涉及涉及从枯草芽孢杆菌克隆的脂肪酶A(LipA)的组合物和方法。这些组合物和方法部分基于以下观察结果：克隆并表达的LipA在存在洗涤剂组合物的情况下具有羧酸酯水解酶活性。LipA的这一特征使其特别适用于多种清洁应用，在这些应用中所述酶可在存在于洗涤剂组合物中的表面活性剂和其它组分的存在下水解脂质。

尽管LipA对多种天然和合成底物显示出活性，但这种酶已显示出对C4-C16底物的偏好，对C8底物具有峰值活性。这种特异性使得LipA特别适于水解短链甘油三酸酯以及适于进行涉及短链脂肪酸的转酯反应。

II.定义

在详细描述本发明组合物和方法之前，为清楚起见定义了以下术语。未定义的术语和缩写应符合其本领域所使用的通常含义：

如本文所用，“羧酸酯水解酶”(E.C.3.1.1)是指作用于羧酸酯的酶。

如本文所用，“脂肪酶”、“脂酶”、“脂肪分解酶”、“脂肪分解多肽”或“脂肪分解蛋白”是指展现具有降解脂质的能力(如降解甘油三酸酯或磷脂的能力)的酶、多肽或蛋白质。脂肪分解酶可为例如脂肪酶、磷脂酶、酯酶或角质酶。如本文所用，脂肪分解活性可根据本领域中已知的任何程序确定(例如参见古朴塔(Gupta)等人，生物技术与应用生物化学(Biotechnol Appl Biochem)，37：63-71，2003；美国专利号5,990,069；和国际公布号WO 96/18729A1)。

如本文所用，术语“脂肪酸”是指源自动物或植物脂肪或油或含于动物或植物脂肪或油中的羧酸。脂肪酸由通常含有4-22个碳原子的烷基的链构成，并以末端羧基(-COOH)为特征。脂肪酸可为饱和的或不饱和的，以及为固体、半固体或液体。

如本文所用，术语“甘油三酸酯”是指脂肪酸与甘油形成的任何天然存在的酯。甘油三酸酯是脂肪和油的主要组分。其具有通式CH₂(OOCR₁)CH(OOCR₂)CH₂(OOCR₃)，其中R₁、R₂和R₃可具有不同链长度。

如本文所用，“酰基”是有机酸基团(RCO-)的通用名，通常是通过移除羧酸的-OH基团获得。

如本文所用，术语“酰化”是指通常在-OH基团侧将酰基置换/添加到分子中的化学转化。

如本文所用，“酰基链底物”是羧酸酯水解酶(例如角质酶、脂肪酶、酰基转移酶、转酯酶等)的供体分子。这种底物可就其碳链长度进行描述。例如，C4底物/供体具有4个碳的链长度，C8底物/供体具有8个碳的链长度等等。

如本文所用，术语“转移酶”是指催化分子或基团(例如酰基)转移至底物的酶。

如本文所用，“离去基团”是指通过另一亲核物质取代时从酰基供体裂解的亲核物质。

如本文所用，短语“洗涤剂稳定性”是指洗涤剂组合物混合物中指定洗涤剂组合物组分(如水解酶)的稳定性。

如本文所用，“过水解酶”是能够催化会导致形成适于诸如清洁、漂白和消毒之类的应用的过酸的反应的酶。

如本文所用，在短语“水性组合物”和“水性环境”中使用的术语“水性”是指由至少50％的水构成的组合物。水性组合物可含有至少50％的水、至少60％的水、至少70％的水、至少80％的水、至少90％的水、至少95％的水、至少97％的水、至少99％的水或甚至至少99％的水。

如本文所用，术语“表面活性剂”是指本领域通常认识到的具有表面活性性质的任何化合物。表面活性剂一般包括阴离子型、阳离子型、非离子型和两性离子型化合物，本文中将进一步进行描述。

如本文所用，“表面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。

术语“氧化稳定性”是指本发明脂肪酶在本文中公开的脂肪分解、水解、清洁或其它处理期间(例如当暴露于漂白剂或氧化剂或者与漂白剂或氧化剂接触时)常见的条件下，在给定时间段内保留规定量的酶活性。在一些实施方案中，脂肪酶在与漂白剂或氧化剂接触指定时间段(例如至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的脂肪分解活性。

术语“螯合剂稳定性”是指本发明脂肪酶在本文中公开的脂肪分解、水解、清洁或其它处理期间(例如当暴露于螯合剂或与螯合剂接触时)常见的条件下，在指定时间段内保留指定量的酶活性。在一些实施方案中，脂肪酶在与螯合剂接触指定时间段(例如至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的脂肪分解活性。

术语“热稳定性”和“热稳定度”是指本发明脂肪酶在本文中公开的脂肪分解、水解、清洁或其它处理期间(例如当暴露于改变的温度时)常见的条件下暴露于标识温度指定时间段后保留指定量的酶活性。变化的温度包括增加或降低的温度。在一些实施方案中，脂肪酶在暴露于改变的温度指定时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的脂肪分解活性。

术语“清洁活性”是指在本文中公开的脂肪水解、水解、清洁或其它处理期间的常见条件下由脂肪酶实现的清洁性能。在一些实施方案中，清洁性能是通过应用针对酶敏感性污渍(例如草、血、奶或蛋蛋白)的多种清洁测定法，在污渍经历标准洗涤条件后通过多种色谱法、分光光度法或其它定量方法测定。示例性的测定法包括(但不限于)WO 99/34011和美国专利6,605,458(将二者以引用的方式并入本文)中所述的测定法，以及实例中所包括的那些方法。

术语脂肪酶的“清洁有效量”是指特定清洁组合物中实现所需水平酶活性的前文所述脂肪酶的量。这种有效量易于由本领域普通技术人员确定并且依据许多因素，如所用的特定脂肪酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成以及需要液体组合物还是干燥(例如颗粒状、条状)组合物等。

如本文所用，术语“清洁辅助材料”意指针对所需清洁组合物的特定类型和产品的形式(例如液体、颗粒、粉末、条、糊状物、喷雾、片、凝胶；或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料还优选与组合物中使用的脂肪酶相容。在一些实施方案中，颗粒状组合物为“紧凑(compact)”形式，而在其它实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。

如本文所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”是指可用于从待清洁物品如织物、器皿、隐形眼镜、其它固体表面、毛发、皮肤、牙齿等去除不期望的化合物(例如污垢或污渍)的化学成分的混合物。所述组合物或配方可视待清洁的表面、物品或织物以及组合物或制剂的所需形式而呈液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾形式。

如本文所用，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”是指拟用于供清洁染污物体的洗涤介质中的化学成分的混合物。洗涤剂组合物/制剂一般包含至少一种表面活性剂，并且可任选包含水解酶、氧化-还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。

如本文所用，“餐具洗涤组合物”是指用于清洁餐具(包括刀叉餐具)的组合物的所有形式，包括(但不限于)颗粒和液体形式。在一些实施方案中，餐具洗涤组合物是可用于自动洗碗碟机中的“自动餐具洗涤”组合物。无意于使本发明局限于任何特定类型或餐具洗涤组合物。实际上，本发明可用于清洁任何材料(包括(但不限于)陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃、丙烯酸树脂等)的餐具(例如器皿，包括(但不限于)盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀具(例如刀叉餐具，包括(但不限于)匙、刀、叉、服务用具等)。术语“餐具”在本文中用于指器皿和刀叉餐具二者。

如本文所用，术语“漂白”是指在适宜的pH和温度条件下处理材料(例如织物、衣物、浆料等)或表面足够长的时间以实现材料变亮(即，变白)和/或清洁。适于漂白的化学品的实例包括(但不限于)ClO₂、H₂O₂、过酸、NO₂等。

如本文所用，变体脂肪酶的“洗涤性能”是指变体脂肪酶对洗涤的贡献，其为组合物中未添加变体脂肪酶的洗涤剂提供附加的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下比较。

术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指在家居中实际用于器皿或衣物洗涤剂市场部分中的条件，尤其是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。

如本文所用，术语“消毒”是指去除表面的污染物以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于本发明局限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。

本文的清洁组合物的“紧凑”形式最佳由密度反映，就组成来说，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐是大量存在，通常为总组合物的约17重量％到约35重量％。相比之下，在紧凑组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施方案中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量％，或更优选不超过约5重量％的量存在。在一些实施方案中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施方案中，优选填料盐为硫酸钠。

如本文所用，术语“纺织物”或“纺织材料”是指织造物，以及适于转变成或用作纱线、机织材料、针织材料和非织造物的人造短纤维和细丝。该术语涵盖由天然以及合成(例如制造的)纤维制成的纱线。

如本文所用，术语“纯化”和“分离”是指以物理方式使对象分子(如LipA多肽)与其它分子(如蛋白质、核酸、脂质、培养基组分等)分离。一旦纯化或分离，对象分子可占样品中材料总量的至少50％，且甚至至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高(重量比)。

如本文所用，“多肽”是指包含多个通过肽键连接的氨基酸的分子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用。蛋白质可任选经过修饰(例如糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊烯化、磺酸化等)以增加功能性。当这些氨基酸序列展现活性时，其可称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，其中氨基酸序列是以标准的氨基至羧基末端取向(即N→C)给出。

术语“多核苷酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5′至3′取向提供。

如本文所用，术语“野生型”和“天然的”是指自然界中存在的多肽或多核苷酸。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。

如本文所用，“变体多肽”是指通常利用重组DNA技术，通过一个或多个氨基酸的置换、添加或缺失而源于亲本(或参考)多肽的多肽。变体多肽与亲本多肽可能有少数氨基酸残基不同，并且可通过其与亲本多肽一级氨基酸序列的同源性/同一性水平来限定。优选地，变体多肽与亲本多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。

序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数测定。(参见例如沃兹查(Altschul)等人，(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.215：403-410)；赫尼科夫(Henikoff)等人，(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：10915；卡林(Karin)等人，(1993)美国国家科学院院刊，90：5873；和海金斯(Higgins)等人(1988)基因(Gene)73：237-244)。执行BLAST分析的软件可通过美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用。还可使用FASTA(皮尔森(Pearson)等人(1988)美国国家科学院院刊，85：2444-2448)搜索数据库。两个多肽实质上一致的一个指示是第一多肽与第二多肽在免疫上交叉反应。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽具有免疫交叉反应性。因此，一种多肽与第二多肽实质上一致，例如，在此情况下两个多肽仅因保守置换而不同。

如本文所用，“变体多核苷酸”编码变体多肽；与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性；或在严格条件下与亲本多核苷酸或其互补序列杂交。优选地，变体多核苷酸与亲本多核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的核苷酸序列同一性。测定同一性百分比的方法是本领域已知的并且上文刚进行描述。

术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从获得”、“可由获得”、“分离自”和“由产生”，并且通常是指一种指定材料来源于另一指定材料或者具有可参照另一指定材料描述的特征。

如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。

如本文所用，短语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据测量杂交的条件的“严格性”程度来分类。严格性程度可例如基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严格性”通常在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)下发生；“高严格性”通常在比Tm低约5至10°下发生；“中等严格性”通常在比探针Tm低约10到20°下发生；且“低严格性”通常在比Tm低约20到25°下发生。作为另一种选择，或除此之外，杂交条件可基于杂交和/或一次或多次严格性洗涤的盐或离子强度条件，例如：6×SSC＝极低严格性；3×SSC＝低至中等严格性；1×SSC＝中等严格性；且0.5×SSC＝高严格性。在功能上，可以使用最高严格性条件来鉴别与杂交探针具有严格的同一性或接近严格的同一性的核酸序列；而高严格性条件用于鉴别与探针具有约80％或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常需要使用相对严格的条件来形成杂交物(例如，使用相对较低的盐和/或高温条件)。如本文所用，严格条件定义为50℃和0.2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)。

在关于至少两条核酸或多肽的上下文中，短语“实质上相似和实质上相同”意指，多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％的同一性，或者不包括在不增加功能性的情况下仅为避开本描述所作的氨基酸置换、插入、缺失或修饰的序列。

如本文所用，“表达载体”是指DNA构建体，其含有编码指定多肽且有效连接至能够实现该多肽在合适的宿主中表达的合适控制序列的DNA序列。这种控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在基因组插入物。一旦转化进适合宿主中，载体就可独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在一些情况下可整合进基因组本身中。

术语“重组”是指例如通过使编码序列突变以产生该变的多肽、将编码序列与另一基因的编码序列融合、使基因处于不同启动子控制下、在异源生物体中表达基因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于基因的天然表达谱的方式有条件地或组成地表达基因等，对遗传物质(即，核酸、核酸编码的多肽以及包含这些多核苷酸的载体和细胞)进行修饰以改变其序列或表达特征。一般说来，重组核酸、多肽和基于它们的细胞已通过人进行操纵使得其与自然界中存在的相关核酸、多肽和细胞不相同。

“信号序列”是指结合至多肽的N端部分，并且促进成熟形式的蛋白质从细胞分泌的氨基酸序列。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

术语“选择标记”或“可选标记”是指能够在宿主细胞中表达使得易于选择含有所引入的核酸或载体的宿主的基因。可选标记的实例包括(但不限于)抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。

如本文所用，术语“调控元件”是指控制核酸序列表达的某一方面的遗传元件。举例来说，启动子是促进有效连接的编码区的转录起始的调控元件。另外的调控元件包括剪接信号、聚腺苷酸化信号和终止信号。

如本文所用，“宿主细胞”一般为以使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或者表达所需的蛋白质变体。在载体编码蛋白质变体的前体蛋白或前原蛋白形式的情况下，这些变体在表达时通常由宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。

在将核酸序列插入细胞的语境中，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化的手段包括本领域已知的原生质体转化法、氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法等等。(参见常(Chang)和克汗(Cohen)(1979)分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，168：111-115；史密斯(Smith)等人(1986)应用与环境微生物学(Appl.Env.Microbiol.)，51：634；和法拉利(Ferrari)等人所著的综述文章，载于Harwood，Bacillus，派拉蒙出版公司(PlenumPublishing Corporation)，第57-72页，1989)。

如本文所用，术语“可选标记”或“可选择基因产物”是指编码酶活性的基因的使用，该酶活性给表达该可选标记的细胞赋予抗生素或药物抗性。

其它科技术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同(例如参见辛格立顿(Singleton)和萨斯布雷(Sainsbury)，微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第2版，约翰威立出版公司(John Wiley and Sons)，纽约(1994)；以及哈利(Hale)和马哈姆(Marham)，哈普柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary ofBiology)，哈普派尼尔(Harper Perennial)，纽约(1991))。

除非文中另外明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。

提供的小标题是出于便利的目的，不应解释为限制。在一个小标题下包括的描述可适用于本说明书整体。

III.LipA多肽和多核苷酸

A.LipA多肽

在一个方面，本发明组合物和方法提供了重组LipA多肽或其变体。示例性的LipA多肽是从枯草芽孢杆菌168分离的(GENBANK登录号P37957)。成熟LipA多肽具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。类似地，实质上一致的LipA多肽可存在于自然界中，例如存在于枯草芽孢杆菌的其它菌株或分离株中。所公开的LipA多肽也可与细菌纤维素酶催化结构域的羧基末端融合。例如，细菌纤维素酶可源自在位于荷兰巴伦的皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心以CBS 670.93(称作BCE103)保藏的芽孢杆菌属菌株。LipA多肽还可通过可裂解的连接物连接至BCE103纤维素酶。本发明组合物和方法涵盖这些和其它重组LipA多肽。

在一些实施方案中，重组LipA多肽是与实例性LipA多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列同源性的变体LipA多肽。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)，通过氨基酸序列比对来测定。

在一些实施方案中，重组LipA多肽包括不会实质上影响多肽的结构和/或功能的置换。示例性的置换是保守置换，如表I中所概述的。

表I.氨基酸置换

涉及天然存在的氨基酸的置换一般是通过使编码重组LipA多肽的核酸突变，然后在生物体中表达变体多肽来进行。涉及非天然存在的氨基酸的置换或氨基酸的化学修饰一般是在由生物体合成重组LipA多肽后通过以化学方式对所述多肽进行修饰来实现。

在一些实施方案中，变体重组LipA多肽与SEQ ID NO：3实质上一致，意指其不包含不会显著影响多肽的结构、功能或表达的氨基酸置换、插入或缺失。此类变体重组LipA多肽包括仅设计用于避开本描述的多肽。

在一些实施方案中，重组LipA多肽(包括其变体)具有羧酸酯水解酶活性，所述羧酸酯水解酶活性包括脂肪酶、酯酶、转酯酶和/或酰基转移酶活性。羧酸酯水解酶活性可使用本文所述的测定法或通过本领域已知的其它测定法来测定和测量。在一些实施方案中，重组LipA多肽在存在洗涤剂组合物的情况下具有活性。

LipA多肽包括“全长”LipA多肽中保持羧酸酯水解酶活性的片段。这些片段优选保留全长多肽的活性位点，但可具有非关键性氨基酸残基的缺失。这些片段的活性可使用本文所述的测定法或通过本领域已知的其它测定法容易地测定。在一些实施方案中，LipA多肽的片段在存在洗涤剂组合物的情况下保持羧酸酯水解酶活性。

在一些实施方案中，LipA多肽与引导LipA多肽的细胞外分泌的信号肽融合。在优选的实施方案中，脂肪酶与细菌纤维素酶的催化结构域的羧基末端融合。在特别优选的实施方案中，细菌纤维素酶源自在位于荷兰巴伦的皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心以CBS 670.93(称作BCE103)保藏的芽孢杆菌属菌株。在其它实施方案中，LipA多肽通过可裂解的连接物连接至BCE103纤维素酶。编码与BCE103纤维素酶的催化结构域融合的LipA的示例性多肽序列是SEQ ID NO：4。

在一些实施方案中，LipA多肽是在异源生物体(即，除枯草芽孢杆菌之外的生物体)中表达。示例性的异源生物体是革兰氏阳性细菌，如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(以前称为嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus))、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus th uringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌；酵母，如酵母菌属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；和丝状真菌，如曲霉菌属(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillusniger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。将核酸转化进这些生物体中的方法是本领域众所周知的。适用于转化曲霉菌属宿主细胞的程序描述于EP 238023中。

在特定的实施方案中，LipA多肽在异源生物体中作为分泌多肽表达，在此情形中，所述组合物和方法涵盖在异源生物体中将LipA多肽表达为分泌多肽的方法。

B.LipA多核苷酸

所述组合物和方法的另一个方面是编码LipA多肽(包括其变体和片段)的多核苷酸，所述多核苷酸在表达载体的背景中，是提供用于引导LipA多肽在异源生物体(例如本文中确定的那些)中表达。编码LipA多肽的多核苷酸可有效连接至调控元件(例如启动子、终止子、增强子等)以帮助表达编码的多肽。

编码LipA多肽的示例性多核苷酸序列具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。类似地，包括实质上一致的编码LipA多肽和变体的多核苷酸可存在于自然界中，例如存在于枯草芽孢杆菌的其它菌株或分离株中。鉴于遗传密码的简并性，应当理解具有不同核苷酸序列的多核苷酸可编码相同LipA多肽、变体或片段。

在一些实施方案中，编码LipA多肽的多核苷酸与示例性的编码LipA多肽的多核苷酸具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的序列同源性。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)，通过氨基酸序列比对来测定。

在一些实施方案中，编码LipA多肽的多核苷酸以框内融合于用于引导多肽的细胞外分泌的信号肽的编码序列之后(即下游)。异源信号序列包括来自细菌纤维素酶基因的信号序列。在一些实施方案中，细菌纤维素酶是源自在位于荷兰巴伦(Baam，The Netherland)的皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Central Bureau voor Schimmelcultures)以CBS670.93(称为BCE103)保藏的芽孢杆菌属菌株。多核苷酸还可与不同多肽的编码序列融合，从而编码嵌合多肽。与BCE103纤维素酶的催化结构域融合的示例性的编码LipA多肽的多核苷酸序列是SEQ ID NO：2。表达载体可提供于适于表达LipA多肽或适于在表达载体引入适合宿主细胞中之前使表达载体增殖的异源宿主细胞中。

在一些实施方案中，编码LipA多肽的多核苷酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的示例性多核苷酸(或其互补序列)在指定杂交条件下杂交。示例性的条件是严格条件和高严格条件，这些条件在本文中进行了描述。

LipA多核苷酸可为天然存在或合成的(即人造的)，并且可经过密码子优化以在不同宿主中表达、经过突变以引入克隆位点或以其它方式改变以增加功能性。

IV.LipA的活性

本文中所公开的LipA多肽在宽泛的pH条件范围内具有酶活性。在某些实施方案中，所公开的LipA多肽在约pH 4至约pH11.5具有酶活性。在优选的实施方案中，LipA多肽在约pH 8至约pH 10具有活性。应该指出的是，本文所述的pH值可在±0.2内变动。例如，约8的pH值可在pH7.8至pH 8.2变动。

本文所公开的LipA多肽可在宽泛的温度范围内(例如10℃或更低至约50℃)具有酶活性。在某些实施方案中，LipA的最佳温度范围为约10℃至约20℃、约20℃至约30℃、约30℃至约40℃或约40℃至约50℃。应该指出的是，本文所述的温度值可在±0.2℃内变动。例如，约10℃的温度可在9.8℃至10.2℃变动。

如实施例3中所示，LipA的活性在使用C8底物时最高，但使用C4和C16底物也观察到活性。相比之下，商业生产的脂肪酶LIPOMAX^TM(类产碱假单胞菌脂肪酶变体M21L，位于加利福尼亚州帕罗奥图的杰能科国际公司(Genencor Int.Inc.，Palo Alto，CA))偏好C10底物，活性在较小(例如C8)或较大(例如C16)底物的情况下下降迅速(未示出)。因此，对于特定长度的底物，LipA脂肪酶的选择性似乎不如LIPOMAX^TM的选择性，而对于具有较短链长度的底物，LipA脂肪酶的选择性优于LIPOMAX^TM。在溶液中(实施例4)以及当污渍存在于织物上时(实施例5)，LipA在存在洗涤剂组合物的情况下对于示例性油渍材料显示出水解活性。

V.包含LipA多肽的洗涤剂组合物

本文所公开的组合物和方法的一个方面是包含LipA多肽或BCE-LipA融合多肽(包括其变体或片段)的洗涤剂组合物和将这些组合物用于清洁应用的方法。清洁应用包括(但不限于)衣物或纺织物清洁、餐具洗涤(人工和自动餐具洗涤)、污渍预处理等。特定的应用是脂质作为待去除的污垢或污渍的组分的那些应用。洗涤剂组合物通常包含有效量的LipA或其变体，例如至少0.0001重量％、约0.0001至约1重量％、约0.001至约0.5重量％、约0.01至约0.1重量％或甚至约0.1至约1重量％或更高。可将浓度为约0.4g/L至约2.2g/L、约0.4g/L至约2.0g/L、约0.4g/L至约1.7g/L、约0.4g/L至约1.5g/L、约0.4g/L至约1g/L、约0.4g/L至约0.8g/L或约0.4g/L至约0.5g/L的洗涤剂组合物与有效量的LipA脂肪酶混合。洗涤剂组合物也可以约0.4ml/L至约2.6ml/L、约0.4ml/L至约2.0ml/L、约0.4ml/L至约1.5m/L、约0.4ml/L至约1ml/L、约0.4ml/L至约0.8ml/L或约0.4ml/L至约0.5ml/L的浓度存在。

除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，而且市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂或副产物)不计算在内。酶组分重量是以总活性蛋白质计。除非另作说明，否则所有百分比和比率都以重量计。除非另作说明，否则所有百分比和比率都是以总组合物计。在示例性的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。

在一些实施方案中，洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，这些表面活性剂可以是非离子型、半极性型、阴离子型、阳离子型、两性离子型或它们的组合和混合物。表面活性剂通常以约0.1重量％至60重量％的量存在。示例性的表面活性剂包括(但不限于)：十二烷基苯磺酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(例如Steol CS-370)、氢化椰油酸钠、C12乙氧基化物(Alfonic 1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4)、烷基苯磺酸钠(例如Nacconol 90G)以及它们的组合和混合物。

可用于本文所述的洗涤剂组合物的阴离子型表面活性剂包括(但不限于)：直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲烷基磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲基酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，或皂。其还可含有0-40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如，如WO 92/06154中所述)以及它们的组合和混合物。

可用于本文所述的洗涤剂组合物的非离子型表面活性剂包括(但不限于)：脂肪酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如TWEEN)、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯异醇、聚氧乙烯醚(例如TRITON和BRIJ)、聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-对叔辛基酚或辛基苯基-氧化乙烯缩合物(例如NONIDET P40)、氧化乙烯与脂肪醇的缩合物(例如LUBROL)、聚氧乙烯壬基酚、聚烷二醇(SYNPERONIC F108)、糖基表面活性剂(例如吡喃葡糖苷、硫代吡喃葡糖苷)以及它们的组合和混合物。

本文所公开的洗涤剂组合物可具有混合物，所述混合物包括(但不限于)：5％至15％阴离子型表面活性剂、＜5％的非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、膦酸盐、皂、酶、芳香剂、甲基丙酸丁基苯酯、香叶醇、沸石、聚羧酸盐、己基肉桂醛、柠檬烯、阳离子型表面活性剂、香茅醇和苯并异噻唑啉酮。

洗涤剂组合物可另外包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、发泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、水溶助剂(hydrotope)、晦暗抑制剂、荧光增白剂、织物调理剂和芳香剂。洗涤剂组合物还可包含酶，包括(但不限于)蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶或另外的羧酸酯水解酶。洗涤剂组合物的pH应为中性到碱性，如本文中所述。

在掺入至少一种助洗剂的一些实施方案中，以清洁组合物的重量计洗涤剂组合物包含至少约1％、约3％至约60％或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂可包括(但不限于)：聚磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸盐化合物；醚羟基聚羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸；和羧甲基氧基琥珀酸；聚乙酸(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的多种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐；以及聚羧酸盐，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1，3，5-三甲酸、羧甲基氧基琥珀酸以及它们的可溶性盐。实际上，可设想任何合适的助洗剂都可用于本发明多个实施方案中。

在一些实施方案中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，如柠檬酸盐和聚磷酸盐(例如三聚磷酸钠和六水合三聚磷酸钠、

三聚磷酸钾以及三聚磷酸钠与三聚磷酸钾的混合物等)。可设想任何合适的助洗剂都可用于本发明中，包括本领域已知的那些助洗剂(例如参见EP2100949)。

如本文所指出的那样，在一些实施方案中，本文所述的清洁组合物还包含辅助材料，包括(但不限于)：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其它酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、芳香剂、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒(color speckle)、银护理剂(silvercare)、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载剂、加工助剂、颜料和pH控制剂(例如参见美国专利号6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，将所有专利都以引用的方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施方案在下文中举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的LipA变体不相容的实施方案中，则使用保持清洁辅助材料与脂肪酶分离(即，相互不接触)直到两种组分的组合适宜的合适方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如软胶囊法(gelcap)、包封法、片剂法、物理分离法等)。

有利地，本文所述的清洁组合物用于例如洗衣应用、硬质表面清洁、餐具洗涤应用，以及化妆品应用，如假牙、牙齿、毛发和皮肤。此外，归因于在较低温度溶液中效用增加的独特优势，使得本文所述的LipA多肽理想地适合于洗衣应用。另外，LipA酶可用于颗粒状和液体组合物中。

本文所述的LipA多肽也可用于清洁添加剂产品。在一些实施方案中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，本发明提供清洁添加剂产品，其包含至少一种所公开的LipA多肽，当需要额外漂白效用时，所述清洁添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。此类情形包括(但不限于)低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，添加剂产品为其最简单的形式，即一种或多种脂肪酶。在一些实施方案中，添加剂被包装成用于添加到清洁过程中的剂型。在一些实施方案中，添加剂被包装成用于添加到采用过氧源并且增加的漂白效用是所需的清洁过程中的剂型。任何合适的单一的剂量单位形式都可用于本发明，包括(但不限于)：丸剂、片剂、软胶囊剂，或其它单一剂量单位如预先测量的粉末或液体。在一些实施方案中，包括填料或载剂材料以增加所述组合物的体积。合适的填料或载剂材料包括(但不限于)多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等。适于液体组合物的填料或载剂材料包括(但不限于)水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。这些醇的实例包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组合物含有约5％至约90％的这类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施方案中，清洁添加剂包含辅助成分，下文将予以更完整地描述。

本发明清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的单独或与其它脂肪酶和/或另外的酶组合的本文所述LipA多肽中的至少一种。所需的酶水平通过添加一种或多种所公开的LipA多肽来实现。通常，本发明清洁组合物将包含至少约0.0001重量％、约0.0001至约10重量％、约0.001至约1重量％或甚至约0.01至约0.1重量％的所公开的LipA多肽中的至少一种。

通常配制本文的清洁组合物而使得，在水性清洁操作中使用期间，洗涤水的pH为约5.0至约11.5或甚至约7.5至约10.5。液体产品制剂通常配制成净pH为约3.0至约9.0或甚至约3至约5。颗粒状洗衣用产品通常配制成pH为约9至约11。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员众所周知的。

合适的低pH清洁组合物的净pH通常为约3至约5，并且通常不含在此类pH环境中水解的表面活性剂。这类表面活性剂包括包含至少一个氧化乙烯部分或甚至约1至约16摩尔氧化乙烯的烷基硫酸钠表面活性剂。这类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，用以使此类清洁组合物的净pH为约3至约5。这些组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施方案中，所述组合物为液体，而在其它实施方案中，其为固体。这类液体组合物的pH通常是以净pH度量。这类固体组合物的pH是以所述组合物的10％固形物溶液测量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施方案中，除非另作说明，否则所有pH测量值都是在20℃下取得。

在一些实施方案中，当将LipA多肽用于颗粒状组合物或液体中时，LipA多肽宜呈封装的粒子形式以保护LipA多肽在储存期间免受颗粒状组合物中其它组分的影响。此外，封装还是控制LipA多肽在清洁过程期间的可用性的手段。在一些实施方案中，封装可增强LipA多肽和/或其它酶的性能。就这一点而言，本发明的LipA多肽用本领域已知的任何合适的封装材料封装。在一些实施方案中，封装材料通常封装本文所述LipA多肽的催化剂的至少一部分。通常，封装材料具有水溶性和/或水分散性。在一些实施方案中，封装材料的玻璃转变温度(Tg)为0℃或更高。玻璃转变温度在PCT申请WO 97/11151中进行了更详细的描述。封装材料通常选自如下：碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲壳质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡以及它们的组合。当封装材料是碳水化合物时，其通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型的实施方案中，封装材料是淀粉(例如参见EP 0922499；US 4,977,252；US 5,354,559；和US 5,935,826)。在一些实施方案中，封装材料是由诸如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物之类的塑料制成的微球体；可使用的市售微球体包括(但不限于)由

(瑞士斯托克韦斯文肯(Stockviksverken，Sweden))以及PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、

和

(宾夕法尼亚州翠谷的PQ公司(PQ Corp.，Valley Forge，PA))提供的微球体。

在将包含LipA的洗涤剂组合物用于清洁应用时，将织物、纺织物、餐具或其它待清洁的表面在存在LipA洗涤剂组合物的情况下温育足以允许LipA水解污垢或污渍中存在的脂质的时间，然后通常用水或另一种水性溶剂冲洗，以去除LipA洗涤剂组合物和水解的脂质。

如本文所述，LipA多肽特别可用于清洁行业，包括(但不限于)衣物和餐具洗涤剂。这些应用使酶处于多种环境压力下。LipA多肽因其在多种条件下的稳定性而能够具有优于许多当前所用酶的优点。

实际上，洗涤过程中所涉及的脂肪酶暴露于多种洗涤条件，包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，不同地理区中使用的洗涤剂制剂在洗涤水中存在不同浓度的其相关的组分。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约4,500到5,000ppm的洗涤剂组分，而日本的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。

低洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。日本的洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约667ppm的洗涤剂组分。

中等洗涤剂浓度包括在洗涤水中存在介于约800ppm至约2,000ppm之间的洗涤剂组分的洗涤剂。北美的洗涤剂一般被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约975ppm的洗涤剂组分。巴西通常在洗涤水中具有大约1,500ppm的洗涤剂组分。

高洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在超过约2,000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲的洗涤剂一般被认为是高洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约4,500至5,000ppm的洗涤剂组分。

拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可在中等洗涤剂浓度至高洗涤剂浓度之间，因为其在洗涤水中具有1,500ppm至6,000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西通常在洗涤水中具有大约1,500ppm的洗涤剂组分。然而，其它高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理位置(不限于其它拉丁美洲国家)也可具有高洗涤剂浓度系统，即，在洗涤水中存在高达约6,000ppm的洗涤剂组分。

根据前述内容，很明显在全世界范围内，典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度在低于约800ppm洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度地理位置”；例如在日本约667ppm)至介于约800ppm至约2,000ppm之间(“中等洗涤剂浓度地理位置”；例如在美国约975ppm，在巴西约1,500ppm)再到高于约2,000ppm(“高洗涤剂浓度地理位置”；例如在欧洲约4,500ppm至约5,000ppm，以及在高泡磷酸盐助洗剂地理位置中约6,000ppm)间变动。

典型的洗涤溶液的浓度是凭经验确定。例如，在美国，典型洗涤机器容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约975ppm的洗涤剂浓度，须将约62.79g洗涤剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。该量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加入洗涤水中的典型量。

再举个例子，不同地理位置使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常介于约10℃至约30℃之间(例如为约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常介于约30℃至约60℃之间(例如为约40℃)。然而，为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用于洗衣以及餐具洗涤应用。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”利用在约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃范围内的所有其它组合和在10℃至40℃内的所有范围的温度下进行的洗涤。

再举个例子，不同地理位置的水硬度通常不同。水硬度经常按每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺的格令数(grain)来描述。硬度是水中钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量的量度。在美国，大多数水都较硬，但硬度不同。中等硬度(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(ppm转化成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数)硬度矿物质。

表II.水硬度水平

水	每加仑格令数	份每一百万份
			软	小于1.0	小于17
略硬	1.0至3.5	17至60
			中等硬度	3.5至7.0	60至120

硬	7.0至10.5	120至180
			极硬	大于10.5	大于180

欧洲的水硬度通常是每加仑的混合Ca²⁺Mg²⁺高于约10.5(例如约10.5至约20.0)格令(例如每加仑的混合Ca²⁺/Mg²⁺为约15格令)。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，但小于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为约6格令。日本的水硬度通常小于北美的水硬度，通常小于约4，例如每加仑混合的Ca²⁺/Mg²⁺为约3格令。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了在至少一组洗涤条件(例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出出乎意料的洗涤性能的LipA多肽。在一些实施方案中，LipA多肽的洗涤性能与其它脂肪酶相当。在一些实施方案中，较于当前市售的脂肪酶，LipA多肽展现出增强的洗涤性能。因此，在一些优选的实施方案中，本文中提供的LipA多肽展现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在多种条件下的清洁能力和/或增强的螯合剂稳定性。此外，LipA多肽可用于不包含洗涤剂(单独或与助洗剂和稳定剂组合)的清洁组合物中。

在本发明的一些实施方案中，以清洁组合物的重量计，清洁组合物包含水平为约0.00001％至约10％的至少一种本发明LipA多肽，以及以组合物的重量计，余量(例如约99.999％至约90.0％)包含清洁辅助材料。在本发明的其它方面中，以组合物的重量计，清洁组合物包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的至少一种LipA多肽，清洁组合物的余量(例如约99.9999重量％至约90.0重量％、约99.999重量％至约98重量％、约99.995重量％至约99.5重量％)包含清洁辅助材料。

在一些实施方案中，本文所述的清洁组合物包含一种或多种另外的洗涤剂酶，该酶可提供清洁性能和/或织物护理和/或餐具洗涤益处。合适的酶的实例包括(但不限于)：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶以及它们的混合物。在一些实施方案中，使用包含常规应用性酶的酶组合(即“混合物(cocktail)”)，如使用蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶联合淀粉酶。

除本文中提供的LipA多肽外，任何其它合适的脂肪酶都可用于本发明组合物中。合适的脂肪酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。本发明涵盖经过化学方式或遗传修饰的突变体。可用的脂肪酶的实例包括：绵毛状腐质菌(Humicola lanuginosa)脂肪酶(例如参见EP 258068和EP 305216)；米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(例如参见EP 331376)；假丝酵母属(Candida)脂肪酶，例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极假丝酵母脂肪酶A或B；例如参见EP 218272)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(例如参见EP 214761)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(例如参见EP 238023)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(例如参见GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶；达托斯(Dartois)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)1131：253-260，1993)；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶(例如参见JP 64/744992)；和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶(例如参见WO 91/16422)。

此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明一些实施方案中，包括(但不限于)：卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见山口(Yamaguchi)等人，基因(Gene)103：61-67，1991)、白地酶(Geotricum candidum)脂肪酶(参见岛田(Schimada)等人，生物化学杂志(J.Biochem.)，106：383-388，1989)和多种根霉属(Rhizopus)脂肪酶如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见哈斯(Hass)等人，基因109：117-113，1991)、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(钉宫(Kugimiya)等人，生物科学生物技术和生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)56：716-719，1992)和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。

其它类型的脂肪分解酶(如角质酶)也可用于本发明一些实施方案中，包括(但不限于)：源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和源自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solanipisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。

其它合适的脂肪酶包括市售脂肪酶，如M1LIPASE^TM、LUMA FAST^TM和LIPOMAX^TM(丹尼斯克美国公司(Danisco US Inc)，杰能科分公司(Genencor Division)，位于美国加利福尼亚州帕罗奥图)；

和

ULTRA(位于丹麦哥本哈根的诺维信公司(Novozymes，Copenhagen，Denmark))；和LIPASE P^TM(日本的天野制药有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，Japan))。

在本发明一些实施方案中，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％的脂肪酶，以组合物重量计余量为清洁辅助材料。在本发明的其它方面中，以本发明清洁组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％脂肪酶的脂肪酶。

在本发明一些实施方案中，可使用任何合适的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的酶。在一些实施方案中，包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶，包括本领域已知的大量经过工程改造的枯草杆菌蛋白酶中的任一种。多种蛋白酶描述于WO95/23221；WO 92/21760；美国专利公布No.2008/0090747；和美国专利号5,801,039、No.5,340,735、No.5,500,364、No.5,855,625；US RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628；以及多个其它专利中。在一些其它实施方案中，金属蛋白酶可用于本发明，包括(但不限于)WO 07/044993中所述的中性金属蛋白酶。

在本发明一些实施方案中，可使用任何合适的淀粉酶。在一些实施方案中，也可使用适用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如α和/或β淀粉酶)。合适的淀粉酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施方案中包括经化学或遗传修饰的突变体。可用于本发明的淀粉酶包括(但不限于)从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶(例如参见GB 1,296,839)。可用于本发明的市售淀粉酶包括(但不限于)：

STAINZYME

STAINZYME和BAN^TM(诺维信公司)以及POWERASE^TM、

和

P(杰能科公司)。

在本发明的一些实施方案中，以所公开的清洁组合物的重量计，该清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％的另外的淀粉酶的淀粉酶，且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明其它方面中，以清洁组合物的重量计，清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶的淀粉酶。

在一些其它的实施方案中，任何合适的纤维素酶都可用于本发明的清洁组合物。合适的纤维素酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施方案中包括经化学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括(但不限于)特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(例如参见美国专利号4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的纤维素酶(例如参见EP 0495257)。可用于本发明中的市售纤维素酶包括(但不限于)：

(诺维信公司)以及KAC-500(B)^TM(花王公司(Kao Corporation))。在一些实施方案中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失(例如参见美国专利号5,874,276)。在一些实施方案中，以本发明的清洁组合物重量计，该清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外的纤维素酶的纤维素酶，且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明其它方面中，以清洁组合物的重量计，清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶的纤维素酶。

适用于洗涤剂组合物中的任何甘露聚糖酶也可用于本发明。合适的甘露聚糖酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施方案中包括经化学或遗传修饰的突变体。多种可用于本发明的甘露聚糖酶是已知的(例如参见美国专利号6,566,114、美国专利号6,602,842和美国专利号6,440,991，将所有这些专利都以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，以所公开的清洁组合物的重量计，该组合物还包含水平为约0.00001％至约10％的另外的甘露聚糖酶的甘露聚糖酶，且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明其它方面中，以清洁组合物的重量计，清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％甘露聚糖酶的甘露聚糖酶。

在一些实施方案中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本发明组合物中。在一些可供选择的实施方案中，氧化酶与氧气联合使用。这两种类型的酶优选连同增强剂一起用于“溶液漂白”(即，当织物一起在洗涤液中洗涤时防止纺织品染料由染色的织物转移到另一织物)(例如参见WO 94/12621和WO 95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括(但不限于)植物、细菌或真菌来源的酶。在一些实施方案中包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施方案中，以本发明的清洁组合物的重量计，该清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％的另外的过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶，且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明其它方面中，以本发明的清洁组合物的重量计，该清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶。

在一些实施方案中，可使用另外的酶，包括(但不限于)过水解酶(例如参见WO 05/056782)。此外，在一些特别优选的实施方案中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其一种或多种另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，设想这些酶的多种混合物都可用于本发明。还设想LipA多肽与一种或多种另外的酶的不同水平都可独立地在约10％的范围内，该清洁组合物的余量为清洁辅助材料。易于通过考虑待清洁表面、物品或织物以及针对在使用(例如通过使用洗涤剂)期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁辅助材料。

合适的清洁辅助材料的实例包括(但不限于)：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其它酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构增塑剂、分散剂、抑泡剂、染料、芳香剂、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(例如参见美国专利号6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有专利都以引用的方式并入本文中)。特定清洁组合物材料的实施方案在下文中举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的所公开的LipA多肽不相容的实施方案中，则使用保持清洁辅助材料与脂肪酶分离(即，相互不接触)直到两种组分的组合适宜的适合方法。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如软胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等)。

在一些优选的实施方案中，适用于清洁需要去除污渍的多种表面的组合物中包括有效量的一种或多种本文提供的LipA多肽。这些清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、织物和餐具之类的应用的清洁组合物。实际上，在一些实施方案中，本发明提供织物清洁组合物，而在其它实施方案中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供适于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括洁牙剂、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物)、皮肤和毛发清洁组合物。预期本发明涵盖任何形式(即，液体、颗粒状、条状、半固体、凝胶、乳液、片、胶囊等)的洗涤剂组合物。

举例来说，下文将更详细地描述可使用所公开的LipA多肽的若干清洁组合物。在所公开的清洁组合物被配制成适用于洗衣机洗涤方法中的组合物的一些实施方案中，本发明组合物优选含有至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁辅助材料，所述清洁辅助材料优选选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、悬污剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施方案中，洗衣组合物还含有软化剂(即作为额外的清洁辅助材料)。本发明组合物还可使用固体或液体形式的洗涤添加剂产品。所述添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可在洗涤过程的任何阶段添加。在一些实施方案中，在20℃下测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1,200g/L的范围内，而在其它实施方案中，其在约500至约950g/L组合物的范围内。

在配制为用于人工餐具洗涤方法中的组合物的实施方案中，本发明组合物优选含有至少一种表面活性剂，以及优选至少一种另外的选自如下的清洁辅助材料：有机聚合化合物、泡沫增强剂、第II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和另外的酶。

在一些实施方案中，多种清洁组合物如美国专利号6,605,458中提供的组合物可与本发明LipA多肽一起使用。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明LipA多肽的组合物是紧凑的颗粒状织物清洁组合物，而在其它实施方案中，所述组合物是适用于清洗有色织物的颗粒状织物清洁组合物，在另外的实施方案中，所述组合物是通过洗涤能力提供软化作用的颗粒状织物清洁组合物，在其它实施方案中，所述组合物是重垢液体织物清洁组合物。在一些实施方案中，包含至少一种本发明LipA多肽的组合物是织物清洁组合物，如美国专利号6,610,642和No.6,376,450中所述的组合物。此外，本发明LipA多肽可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别具有实用性的颗粒状衣物洗涤组合物中(例如参见美国专利号6,610,642)。

在一些可供选择的实施方案中，本发明提供包含至少一种本文提供的LipA多肽的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明LipA多肽的组合物是硬质表面清洁组合物，如美国专利号6,610,642号、No.6,376,450和No.6,376,450中所述的组合物。

在其它实施方案中，本发明提供包含至少一种本文提供的LipA多肽的餐具洗涤组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明LipA多肽的组合物是硬质表面清洁组合物，如美国专利号6,610,642和No.6,376,450中所述的组合物。在一些其它实施方案中，本发明提供包含至少一种本文提供的LipA多肽的餐具洗涤组合物。在一些其它实施方案中，包含至少一种本发明LipA多肽的组合物包含口腔护理组合物，如美国专利号6,376,450和No.6,376,450中所述的组合物。上述美国专利号6,376,450、No.6,605,458、No.6,605,458和No.6,610,642中所含的化合物和清洁辅助材料的配制和描述可用于本文提供的LipA多肽。

本发明的清洁组合物可配制成任何合适的形式并通过配制人员选择的任何方法制备，其非限制性实例描述于美国专利号5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利都以引用的方式并入本文中。当低pH清洁组合物是所需的时，通过添加诸如单乙醇胺或酸性材料(如HCl)之类的材料来调整此类组合物的pH。

尽管不是实现本发明目的所必需的，但下文示例的辅助材料的非限制性表单适用于本发明清洁组合物。在一些实施方案中，掺入这些辅助材料，例如以帮助或增强清洁性能以便处理待清洁的基底，或改变清洁组合物的美观性，如利用芳香剂、着色剂、染料等情形就是如此。应了解，这些辅助材料是除本发明LipA多肽外的物质。这些另外的组分的精确性质以及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和打算使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括(但不限于)：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、另外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、芳香剂、结构增塑剂、织物软化剂、载剂、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开内容外，此类其它辅助材料和使用水平的适合实例见于美国专利号5,576,282、No.6,306,812和No.6,326,348(以引用的方式并入)中。上述辅助成分可构成本发明清洁组合物的余量。

在一些实施方案中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自：非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子型表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物。在一些低pH清洁组合物实施方案(例如净pH为约3至约5的组合物)中，组合物通常不含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信此类表面活性剂可能会被所述组合物的酸性内含物水解。在一些实施方案中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1％至约60％的水平存在，而在可供选择的实施方案中，所述量为约1％至约50％，而在其它实施方案中，所述水平为约5％至约40％。

在一些实施方案中，本发明清洁组合物含有至少一种螯合剂。合适的螯合剂可包括(但不限于)：铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。在使用至少一种螯合剂的实施方案中，以本发明清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.1％至约15％或甚至约3.0％至约10％螯合剂。

在一些其它实施方案中，本文中提供的清洁组合物含有至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括(但不限于)：聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；去污聚合物，如聚对苯二甲酸；粘土，如高岭土、蒙脱土、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土以及它们的混合物。

如本文所指出的那样，在一些实施方案中，抗再沉积剂可用于本发明的一些实施方案中。在一些优选的实施方案中，可使用非离子型表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施方案中，非离子型表面活性剂可用于表面修饰目的，尤其用于被单料子，以避免成膜和起斑以及用于改善光泽度。这些非离子型表面活性剂也可用于防止污垢再沉积。在一些优选的实施方案中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子型表面活性剂(例如参见EP 2100949)。

在一些实施方案中，本发明清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括(但不限于)：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，以本发明的清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％。

在一些实施方案中，硅酸盐包括在本发明的组合物中。在一些此类实施方案中，使用硅酸钠(例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施方案中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些优选的实施方案中，以组合物的重量计，硅酸盐以约5％至约15％的水平存在。

在一些另外的实施方案中，本发明清洁组合物还含有分散剂。合适的水溶性有机材料包括(但不限于)均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中多聚羧酸包含至少两个羧基，彼此以不超过两个碳原子分开。

在一些其它实施方案中，利用任何合适的技术使清洁组合物中使用的酶稳定。在一些实施方案中，本文所用的酶由成品组合物中存在的可给该酶提供钙和/或镁离子的水溶性钙和/或镁离子源来稳定。在一些实施方案中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐(包括碱土金属，如钙盐)。设想用于稳定酶的各种技术可用于本发明。例如，在一些实施方案中，本文所采用的酶由成品组合物中存在的可给该酶提供锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性的这类离子源，以及其它金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于本发明一些实施方案中。合适的寡糖和多糖(例如糊精)的实例是本领域已知的(例如参见WO 07/145964)。在一些实施方案中，也可使用可逆的蛋白酶抑制剂，如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或必要时，可使用三肽醛进一步改进稳定性。

在一些实施方案中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施方案中，本发明清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂可包括(但不限于)过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施方案中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体形式，无额外保护，但在一些另外的实施方案中，所述盐带涂层。本领域已知的任何适合的盐都可用于本发明(例如参见EP 2100949)。

在一些实施方案中，将漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，这些有机过酸前体在60℃和低于60℃温度下进行的清洁过程中会增强漂白作用。适用于本文中的漂白活化剂包括在过氧化氢解条件下提供优选具有约1至约10个碳原子，尤其约2至约4个碳原子的脂族过氧羧酸和/或任选取代的过苯甲酸的化合物。另外的漂白活化剂是本领域已知的并且可用于本发明(例如参见EP 2100949)。

此外，在一些实施方案中以及如本文中进一步描述的，本发明清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一些实施方案中，可使用三氮杂环壬烷锰和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。其它漂白催化剂可用于本发明中(例如参见US 4,246,612、5,227,084、4,810410、WO 99/06521和EP 2100949)。

在一些实施方案中，本发明清洁组合物含有一种或多种催化性金属络合物。在一些实施方案中，可使用含金属漂白催化剂。在一些优选的实施方案中，金属漂白催化剂包含催化剂系统，所述催化剂系统包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有极低或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，和对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的金属封锁剂(sequestrate)，尤其可使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐(例如参见美国专利号4,430,243)。在一些实施方案中，借助于锰化合物来催化本发明的清洁组合物。这些化合物及其水平是本领域众所周知的(例如参见美国专利号5,576,282)。在另外的实施方案中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物中。多种钴漂白催化剂是本领域已知的(例如参见美国专利号5,597,936和No.5,595,967)且易于用已知程序制备。

在一些另外的实施方案中，本发明清洁组合物包括大多环刚性配位体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践(但绝非限制)，在一些实施方案中，对本发明提供的组合物和清洁方法进行调整以在水性洗涤介质中提供约至少1ppm的活性MRL物质，而在一些优选的实施方案中在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm，更优选约0.05ppm至约10ppm且最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。

在一些实施方案中，本发明过渡金属漂白催化剂中的优选过渡金属包括(但不限于)锰、铁和铬。优选的MRL还包括(但不限于)交叉桥接的特异性超刚性配位体(例如5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL易于用已知程序制备(例如参见WO 2000/32601和美国专利号6,225,464)。

在一些实施方案中，本发明清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或减少包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)在内的金属的锈污、腐蚀和/或氧化。合适的金属护理剂包括EP 2100949、WO9426860和WO 94/26859中所述的金属护理剂。在一些实施方案中，金属护理剂是锌盐。在一些其它实施方案中，本发明清洁组合物包含约0.1重量％至约5重量％的一种或多种金属护理剂。

如上文所述，本发明清洁组合物可配制成任何合适的形式并由配制者选择的任何方法制备，其非限制性实例描述于美国专利号5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利都以引用的方式并入本文中。在低pH清洁组合物是所需的一些实施方案中，通过添加诸如HCl之类的酸性材料来调整此类组合物的pH。

本文所公开的清洁组合物可用于清洁位置(situs)(例如表面、餐具或织物)。通常，使所述位置的至少一部分与纯的形式的本发明清洁组合物或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的实施方案接触，随后任选洗涤和/或冲洗所述位置。对本发明来说，“洗涤”包括(但不限于)擦洗和机械搅动。在一些实施方案中，清洁组合物在溶液中通常以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1∶1至约30∶1。

VI.作为化学试剂的LipA多肽

LipA对短链脂质的偏好使本发明多肽特别可用于进行涉及C4-C16底物的转酯反应。示例性的应用是乳脂的水解；结构化的甘油三酸酯的合成；聚合物的合成和降解；乳化剂和表面活性剂的形成；个人护理产品、医药和农用化学品的成分的合成；用于制备用作芳香剂和香料的酯；用于制备生物燃料和合成润滑剂；用于形成过酸；和用于油脂化工中的其它应用。上述酶的其它用途在美国专利公布20070026106、20060078648和20050196766中以及在WO 2005/066347中描述，这些文献都以引用的方式并入本文。

一般说来，在适于进行转酯反应的条件下，将底物和受体分子在存在LipA多肽或其变体的情况下温育，随后任选从反应物中分离出产物。或者，这些条件可在食品的情形中，并且产物可不经分离即变为食品的组分。

根据前面的描述和以下的实施例，本发明组合物和方法的其它方面和实施例将显而易见。

实施例

提供以下实施例以论证和说明本发明的某些优选实施例和方面，而不应该理解为限制。

在以下实验公开内容中，将应用以下缩写：M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；nM(纳摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量)；ND(未进行)；rpm(每分钟转数)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；MgCl₂(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积比)；v/v(体积比)；g(重力)；OD(光密度)；ppm(份每一百万份)；m-(间-)；o-(邻-)；p-(对-)；BCE(BCE103纤维素酶)；Glu-BL(地衣芽孢杆菌谷氨酰内肽酶I)LipA(枯草芽孢杆菌脂肪酶A)；NEFA(非酯化脂肪酸)；p-NP(对-硝基苯基)；以及SRI(去污指数)。

实施例1

枯草芽孢杆菌脂肪酶(LipA)的克隆和表达

先前已经鉴别出枯草芽孢杆菌lipA(或lip)基因(达托斯等人，生物化学与生物物理学学报，1131：253-260，1992))，其序列如GENBANK登录号P37957所示。用限制性酶BamHI和HindIII消化枯草芽孢杆菌表达载体p2JMagk103-lnk2-BBI-AV(科利尔(Collier)等人，蛋白质表达与纯化(Prot.Expr.Purif.)，68：146-160，2009)。分离缺少BBI-AV基因序列的DNA片段，并用作表达骨架。将该片段与以类似方式消化的编码枯草芽孢杆菌LipA酶的基因连接，产生具有BCE103纤维素酶氨基末端和LipA羧基末端的融合蛋白(BCE-LipA)。

在BCE-LipA融合蛋白中，BCE103纤维素酶通过连接物连接至LipA，所述连接物对由酸/热或用谷氨酰内肽酶(例如Glu-BL，来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶I)处理引起的裂解敏感(沃格坦兹(Vogtentanz)，蛋白质表达与纯化，55：40-52，2007；和科利尔等人，蛋白质表达与纯化，68：146-160，2009)。因此，尽管呈融合蛋白形式的LipA具有活性，但必要时，可从BCE103纤维素酶融合搭配物裂解LipA。简而言之，在摇瓶中产生融合蛋白后，可通过在37℃下用2μg/ml Glu-BL过夜处理来实现对无细胞培养液中的融合蛋白的有效裂解。

用于产生BCE-LipA融合蛋白的枯草芽孢杆菌脂肪酶A(LipA)合成基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：1示出：

GGATCCAGACGATGAGGCAGAACACAATCCAGTCGTTATGGTTCACGGTATTGGAGGGGCTAGCTTCAATTTTGCGGGAATTAAGTCATATCTCGTATCTCAGGGCTGGTCGCGGGACAAGCTGTATGCAGTCGACTTTTGGGACAAGACAGGCACAAATTATAACAATGGACCGGTATTATCACGATTTGTGCAAAAGGTTTTAGATGAAACGGGTGCGAAAAAAGTGGATATTGTCGCTCACAGCATGGGGGGCGCGAACACACTTTACTACATAAAAAATCTGGACGGCGGAAATAAAGTTGCAAACGTCGTGACGCTTGGCGGCGCGAACCGTCTTACGACAGGAAAGGCGTTACCTGGTACAGATCCAAATCAAAAGATTTTATACACATCCATTTACAGCAGTGCCGATATGATTGTCATGAATTACTTATCAAGATTAGATGGTGCTAGAAACGTTCAAATCCATGGCGTTGGACACATCGGCCTTCTGTACAGCAGCCAAGTCAACAGCCTGATTAAAGAAGGGCTGAACGGCGGGGGCCAGAATACGAATTAAAAGCTT

编码BCE-LipA融合蛋白的基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：2示出：

GATGATTATTCAGTTGTAGAGGAACATGGGCAACTAAGTATTAGTAACGGTGAATTAGTCAATGAACGAGGCGAACAAGTTCAGTTAAAAGGGATGAGTTCCCATGGTTTGCAATGGTACGGTCAATTTGTAAACTATGAAAGCATGAAATGGCTAAGAGATGATTGGGGAATAACTGTATTCCGAGCAGCAATGTATACCTCTTCAGGAGGATAATTGACGATCCATCAGTAAAGGAAAAAGTAAAAGAGACTGTTGAGGCTGCGATAGACCTTGGCATATATGTGATCATTGATTGGCATATCCTTTCAGACAATGACCCGAATATATATAAAGAAGAAGCGAAGGATTTCTTTGATGAAATGTCAGAGTTGTATGGAGACTATCCGAATGTGATATACGAAATTGCAAATGAACCGAATGGTAGTGATGTTACGTGGGACAATCAAATAAAACCGTATGCAGAAGAAGTGATTCCGGTTATTCGTGACAATGACCCTAATAACATTGTTATTGTAGGTACAGGTACATGGAGTCAGGATGTCCATCATGCAGCCGATAATCAGCTTGCAGATCCTAACGTCATGTATGCATTTCATTTTTATGCAGGAACACATGGACAAAATTTACGAGACCAAGTAGATTATGCATTAGATCAAGGAGCAGCGATATTTGTTAGTGAATGGGGGACAAGTGCAGCTACAGGTGATGGTGGTGTGTTTTTAGATGAAGCACAAGTGTGGATTGACTTTATGGATGAAAGAAATTTAAGCTGGGCCAACTGGTCTCTAACGCATAAGGATGAGTCATCTGCAGCGTTAATGCCAGGTGCAAATCCAACTGGTGGTTGGACAGAGGCTGAACTATCTCCATCTGGTACATTTGTGAGGGAAAAAATAAGAGAATCAGCATCTGACAACAATGATCCCATACCGGATCCAGACGATGAGGCAGAACACAATCCAGTCGTTATGGTTCACGGTATTGGAGGGGCTAGCTTCAATTTTGCGGGAATTAAGTCATATCTCGTATCTCAGGGCTGGTCGCGGGACAAGCTGTATGCAGTCGACTTTTGGGACAAGACAGGCACAAATTATAACAATGGACCGGTATTATCACGATTTGTGCAAAAGGTTTTAGATGAAACGGGTGCGAAAAAAGTGGATATTGTCGCTCACAGCATGGGGGGCGCGAACACACTTTACTACATAAAAAATCTGGACGGCGGAAATAAAGTTGCAAACGTCGTGACGCTTGGCGGCGCGAACCGTCTTACGACAGGAAAGGCGTTACCTGGTACAGATCCAAATCAAAAGATTTTATACACATCCATTTACAGCAGTGCCGATATGATTGTCATGAATTACTTATCAAGATTAGATGGTGCTAGAAACGTTCAAATCCATGGCGTTGGACACATCGGCCTTCTGTACAGCAGCCAAGTCAACAGCCTGATTAAAGAAGGGCTGAACGGCGGGGGCCAGAATACGAATTAA

成熟LipA酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：3示出：

AEHNPVVMVHGIGGASFNFAGIKSYLVSQGWSRDKLYAVDFWDKTGTNYNNGPVLSRFVQKVLDETGAKKVDIVAHSMGGANTLYYIKNLDGGNKVANVVTLGGANRLTTGKALPGTDPNQKILYTSIYSSADMIVMNYLSRLDGARNVQIHGVGHIGLLYSSQVNSLIKEGLNGGGQNTN

BCE-LipA融合蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO：4示出：DDYSVVEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMKWLRDDWGITVFRAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDWHILSDNDPNIYKEEAKDFFDEMSELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVTWDNQIKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTWSQDVHHAADNQLADPNVMYAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDEAQVWIDFMDERNLSWANWSLTHKDESSAALMPGANPTGGWTEAELSPSGTFVREKIRESASDNNDPIPDPDDEAEHNPVVMVHGIGGASFNFAGIKSYLVSQGWSRDKLYAVDFWDKTGTNYNNGPVLSRFVQKVLDETGAKKVDIVAHSMGGANTLYYIKNLDGGNKVANVVTLGGANRLTTGKALPGTDPNQKILYTSIYSSADMIVMNYLSRLDGARNVQIHGVGHIGLLYSSQVNSLIKEGLNGGGQNTN

使用先前所述的方法(沃格坦兹，蛋白质表达与纯化，55：40-52，2007)，在枯草芽孢杆菌细胞(degU^Hy32，oppA，ΔspoIIE，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB，amyE::xylRPxylAcomK-ermC)中产生BCE-LipA融合蛋白。

实施例2

BCE-LipA融合蛋白的纯化

用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液对按14L规模分批发酵枯草芽孢杆菌表达株所获得的超滤浓缩物进行5倍稀释，并添加硫酸铵至1M终浓度。收集由硫酸铵沉淀得到的沉淀丸粒并用于进一步纯化。使用了用50mMTris-HCl(pH 8.0)缓冲液中的1M硫酸铵平衡的FastFlow苯基琼脂糖凝胶柱。以平衡流速的一半(12ml/min)对样品进行上样，并在上样后用平衡缓冲液洗涤。使用梯度以将缓冲液中硫酸铵的浓度由1M降低至0M。用50mM Tris(pH 8.0)缓冲液洗掉柱中的污染蛋白质。用含50mM Tris HCl(pH 8.0)和40％丙二醇的缓冲液洗脱BCE-LipA蛋白。使用下文所述的丁酸对硝基苯(pNP)酯测定法来测定级分。汇集含有脂肪酶活性的级分，并用具有10K膜的搅拌池进行浓缩以供后续使用。

实施例3

BCE-LipA对对-硝基苯基酯的水解

测定了BCE-LipA融合蛋白对三种具有不同酯链长度的不同对硝基苯(pNP)酯底物的脂肪酶活性，以确定LipA的链长度偏好。表3-1提供了pNP酯底物的细节。

使用再悬浮于如下两种缓冲液其中之一中的乙醇(5％)中的0.8mMpNP酯制备含pNP酯底物的反应乳液：0.05M HEPES，6mM CaCl₂，调至pH 8.2；或0.05M CAPS，6mM CaCl₂，调至pH 10。为帮助pNP-酯的乳化，向两种缓冲液添加0.5％阿拉伯树胶。

将pNP-酯/缓冲液悬浮液混合，超声处理2分钟，将100μL各悬浮液转移至含有20μL酶样品的96孔微量滴定板的孔中。在15分钟的周期期间以OD₄₀₅nm监测释放的pNP的产生，并用空白值(不含酶)进行校正。记录下每分钟产生的pNP产物，并针对孔中添加的酶样品进行归一化(ΔOD/分钟/mg添加的酶)。计算出针对不同底物的相对酶活性，并针对最高活性(例如将针对辛酸pNP酯底物的活性设为100)将使用每种底物获得的产物释放的速率归一化。

如表3-2中所示，BCE-LipA在pH 8.2和pH 10下均对4至16个碳长的pNP-酯底物显示出活性。

实施例4

在存在和不存在洗涤剂的情况下由BCE-LipA进行的甘油三酸酯水解

测定BCE-LipA多肽在存在和不存在洗涤剂的情况下对三辛酸酯和三油酸酯底物的水解。三辛酸甘油酯(CAS 538-23-8)和三油酸甘油酯(CAS122-32-7)底物都购自西格玛公司。在本实验中使用如下市售洗涤剂：(1)联合利华公司(Unilever)的奥妙洁彩液体洗涤剂(OMO color，liquiddetergent)；(2)宝洁公司(Procter&Gamble)的Ariel洁彩液体洗涤剂；(3)布鲁姆勒公司

的Biotex洁彩粉末洗涤剂；和(4)宝洁公司的Ariel洁彩粉末洗涤剂。

奥妙洁彩液体洗涤剂

奥妙洁彩液体洗涤剂组合物包含5-15％阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂、＜5％皂、阳离子型表面活性剂、膦酸盐、芳香剂、甲基丙酸丁基苯酯、香茅醇、酶和苯并异噻唑啉酮。奥妙洁彩液体洗涤剂含有以下表面活性剂：C12-15链烷醇聚醚-7、十二烷基苯磺酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠和氢化椰油酸钠。

奥妙洁彩液体洗涤剂的成分如下：水、C12-15链烷醇聚醚-7、十二烷基苯磺酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、丙二醇、氢化椰油酸钠、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸钠、芳香剂、硫酸钠、氢氧化钠、丁基苯基甲基丙醛、山梨糖醇、香茅醇、蛋白酶、苯并异噻唑啉酮、硼酸、(4-甲酰基苯基)、淀粉酶、CI-45100和CI 42051。

Ariel洁彩液体洗涤剂

Ariel洁彩液体洗涤剂组合物包含5-15％阴离子型表面活性剂、＜5％非离子型表面活性剂、膦酸盐、皂、酶、芳香剂、甲基丙酸丁基苯酯和香叶醇。Ariel洁彩液体洗涤剂含有以下表面活性剂：十二烷基苯磺酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠和C12-14链烷醇聚醚-4。

Ariel洁彩液体洗涤剂的成分如下：十二烷基苯磺酸钠、柠檬酸钠、棕榈仁油酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、变性醇、C14-15链烷醇聚醚-4、硼酸mea酯(mea-borate)、季铵化硫酸化乙氧基化六亚甲基二胺(sulfated ethoxylated hexamethylenediamine quaternized)、丙二醇、水、氢化蓖麻油、香精、蛋白酶、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸钠、C12-15醇、糖苷酶、聚乙烯吡啶-n-氧化物、聚乙二醇、硫酸钠、氯化钠、二甲硅油、着色剂、二氧化硅、丁基苯基甲基丙醛和香叶醇。

Biotex洁彩粉末洗涤剂

Biotex洁彩粉末洗涤剂组合物包含15-30％沸石、5-15％阴离子型表面活性剂、＜5％皂、多聚羧酸盐、膦酸盐、酶和芳香剂。Biotex洁彩粉末洗涤剂含有C12-15链烷醇聚醚-7表面活性剂。

Biotex洁彩液体洗涤剂的成分如下：沸石、碳酸钠、硫酸钠、水、C12-15链烷醇聚醚-7、牛油酸钠、马来酸-丙烯酸共聚物钠盐、柠檬酸钠、月桂基聚氧乙烯醚-7、纤维素胶、月桂基聚氧乙烯醚-5、EDTMP钠盐、香精、羟乙磷酸四钠(tetrasodium etidronate)、枯草杆菌蛋白酶、淀粉酶、三酰基甘油脂肪酶和纤维素酶。

Ariel洁彩粉末洗涤剂

Ariel洁彩粉末洗涤剂组合物包含5-15％阴离子型表面活性剂、沸石、＜5％非离子型表面活性剂、多聚羧酸盐、膦酸盐、酶、芳香剂、己基肉桂醛、柠檬烯和甲基丙酸丁基苯酯。Ariel洁彩粉末洗涤剂含有以下表面活性剂：十二烷基苯磺酸钠、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠和C12-15链烷醇聚醚-7。

Ariel洁彩粉末洗涤剂的成分如下：硫酸钠、碳酸钠、膨润土、十二烷基苯磺酸钠、硅铝酸钠、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、丙烯酸/MA共聚物钠盐、水、柠檬酸、二甲硅油、C12-15链烷醇聚醚-7、硫酸镁、十二烷基苯磺酸钠、香精、纤维素胶、氯化钠、羟乙磷酸四钠、甲苯磺酸钠、淀粉、辛烯基琥珀酸钠、聚乙二醇、糖苷酶、乙二胺二琥珀酸三钠、硫酸、乙醇酸钠、苯基丙基醚甲基硅油、聚丙烯酸钠、十二烷基苯磺酸、含二氧化硅的二氯二甲基硅烷RX、着色剂、甘油、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、氢氧化钠、C10-16烷基苯磺酸、丁基苯基甲基丙醛、己基肉桂醛和沉香醇(linalool)。

如下使洗涤剂热失活：将液体洗涤剂在95℃水浴中放置2小时，而在热板上将粉末洗涤剂于水中的0.1g/mL配制物煮沸1小时。热处理使市售洗涤剂配方中的任何蛋白质组分失去酶活性，而保留非酶洗涤剂组分的性质。加热后，稀释洗涤剂并测定脂肪酶活性。

由预先悬浮于以下两种缓冲液之一中的乙醇(5％)中的0.4％三辛酸酯或三油酸酯制备三辛酸酯和三油酸酯的反应乳液：0.05M HEPES，调至pH 8.2；或0.05M CAPS，调至pH 10。将缓冲液调至pH 8.2以用于液体洗涤剂，调至pH 10以用于粉末洗涤剂。对于两种缓冲液，水硬度都调至6mM CaCl₂。将2％阿拉伯树胶加至两种缓冲液中，以帮助甘油三酸酯乳化。

由预先悬浮于以下两种缓冲液之一中的乙醇(5％)中的0.4％三辛酸酯制备三辛酸酯在每一洗涤剂中的反应乳液：0.05M HEPES，调至pH 8.2；或0.05M CAPS，调至pH 10。对于两种缓冲液，将水硬度均调至240ppm。最终测定混合物含有不同量的洗涤剂，以帮助甘油三酸酯乳化。

通过应用高剪切力混合2分钟(24,000m^-1；Ultra Turrax T25，杰克-库克公司(Janke&Kunkel))来制备反应乳液，然后转移150μL至已装有30μL酶样品的96孔微量滴定板的孔中。使用用于定量测定非酯化脂肪酸(NEFA)的体外酶比色测定法来测量游离脂肪酸的产生。这种方法对游离脂肪酸是特异性的，并且取决于脂肪酸在存在所添加的酰基辅酶A(CoA)合成酶的情况下对CoA的酰化。因而产生的酰基-CoA被添加的酰基-CoA氧化酶氧化，并在存在过氧化物酶的情况下产生过氧化氢。这使得3-甲基-N-乙基N(β-羟乙基)-苯胺与4-氨基安替比林发生氧化缩合反应，形成可用比色法测量的紫色加合物。使用NEFA HR(2)试剂盒(德国沃克化学品公司(Wako Chemicals GmbH，Germany))中的材料，通过将30μL水解溶液转移至已装有120μL NEFA A溶液的96孔微量滴定板的孔中，来测定在30℃下温育6分钟后产生的游离脂肪酸的量。在30℃下温育3分钟后添加60μL NEFA B溶液。在30℃下温育4.5分钟后，在520nm下测量OD值。

表4-1示出了BCE-LipA对三油酸酯和三辛酸酯的水解。甘油三酸酯水解的数据以μmol游离脂肪酸测定。结果是相对于对缓冲液中的三辛酸酯(C8)的活性(设为100)报导。

表4-2示出了在pH 8.2和pH 10.0下在存在或不存在多种洗涤剂的情况下BCE-LipA对三辛酸酯的水解。在存在洗涤剂的情况下三辛酸酯水解的数据是在测试的两种pH值下，以在存在洗涤剂的情况下三辛酸酯水解相对于在不存在洗涤剂的情况下三辛酸酯水解的百分比报导。

BCE-LipA在多种液体和粉末洗涤剂中显示出脂肪酶活性，随洗涤剂浓度而变化。

实施例5

BCE-LipA的清洁性能

以微样片(microswatch)测定方法测试BCE-LipA对染污织物的清洁性能。使用按24孔板格式(丹麦能肯公司(Nunc，Denmark))设置的含脂质技术污渍(lipid-containing technical stain)(CS-61样片，购自荷兰测试材料中心(Center for Testmaterials，Netherlands))进行去污实验。每一测定孔设置成装有预先切割的13mm CS-61样片块。样片在放入24孔板中之前用反射计(CR-400，康佳美能达(Konica Minolta))预先读数。

所用缓冲液为20mM HEPES(最终浓度)，pH 8.2，用于测试液体洗涤剂；以及20mM CAPS(最终浓度)，pH 10.0，用于测试粉末洗涤剂。对于两种缓冲液，水硬度都调至240ppm。所用市售热灭活洗涤剂与实施例4的甘油三酸酯水解测定法中所述的相同。

简而言之，将900μl合适的缓冲液添加至24孔板的每一装有样片的孔中。为起始反应，向每孔添加100μL体积的酶样品。在37℃下，以200rpm振荡板30分钟。温育后，移除反应缓冲液，并用1mL蒸馏水冲洗每个孔中的织物三次。移出经过冲洗的样片后，在50℃下干燥样片4小时，随后测量反射率。清洁计算为每一样片清洁后与清洁前反射计测量结果的差异。反射率的测量是通过用分光光度计(CR-400，康佳美能达)获取CIEL＊a＊b＊测量值来进行。使用如下公式，计算经过洗涤的织物相对于未洗涤织物的去污指数差异(ΔSRI)值：

在该公式中，ΔL、Δa、Δb分别是清洁前与清洁后CIE L＊、CIE a＊和CIE b＊值的差异，其中L＊定义亮度，且a＊和b＊定义色度(例如参见：精确的对色用语：使用仪器感觉进行色控制(Precise Color Communication：Color Control From Perception to Instrumentation)，日本大阪的康佳美能达公司(Konica Minolta Sensing，Inc.，Osaka，Japan)，第32-59页，1998)。

BCE-LipA在来自联合利华公司的奥妙洁彩液体洗涤剂、来自宝洁公司的Ariel洁彩液体洗涤剂、来自宝洁公司的Ariel洁彩粉末洗涤剂和来自布鲁姆勒公司的Biotex洁彩粉末洗涤剂中展现出显著的清洁性能。

实施例6

包含LipA的液体衣物洗涤剂组合物

在本实施例中，提供液体衣物洗涤剂组合物的多种制剂。在每一所述制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

#1：添加1N HCl水溶液以将制剂的净pH调至约3至约5的范围内。以上实施例6(I)-(II)的pH为约5至约7，6(III)-(V)的pH为约7.5至约8.5。

实施例7

包含LipA的手洗餐具洗涤液组合物

在本实施例中，提供多种手洗餐具洗涤液制剂。在每一所述制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

实施例7(I)-(VI)的pH为约8至约11。

实施例8

包含LipA的自动餐具洗涤液组合物

在本实施例中，提供了多种自动餐具洗涤液制剂。在每一所述制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

实施例9

包含LipA的颗粒状和/或片状洗衣组合物

本实施例提供了颗粒状和/或片状衣物洗涤剂的多种制剂。在每一所述制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

＊芳香剂、染料、增亮剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。

实施例10

包含LipA的另外的液体衣物洗涤剂

本实施例提供了液体衣物洗涤剂的其它制剂。在每一所述制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

实施例11

包含LipA的高密度餐具洗涤剂

本实施例提供了高密度餐具洗涤剂的多种制剂。在每一所述紧凑型制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

＊增亮剂/染料/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。实施例11(I)至(VI)的pH为约9.6到约11.3。

实施例12

包含LipA的片状餐具洗涤剂组合物

本实施例提供了多种片状餐具洗涤剂制剂。以下本发明的片状洗涤剂组合物是通过使用标准的12头旋转式压机在13KN/cm²的压力下压缩颗粒状餐具洗涤剂组合物来制备。在每一所述制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

＊增亮剂/SRP1/羧甲基纤维素钠/光漂白剂/MgSO₄/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。实施例12(I)至12(VII)的pH为约10至约11.5；12(VIII)的pH为8-10。实施例12(I)至12(VIII)的片重量为约20克至约30克。

实施例13

包含LipA的硬质表面清洗液

本实施例提供了硬质表面清洗液的多种制剂。在每一所述制剂中，都包括浓度为约0.0001至约10重量％的BCE-LipA或LipA。在一些可供选择的实施例中，配制者可根据其需求决定使用其它浓度。

实施例13(I)至(VII)的pH为约7.4至约9.5。

Claims

1.一种洗涤剂组合物，其包含：

来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶，和

表面活性剂，

其中所述洗涤剂组合物在去除待清洁表面的油渍方面比不存在所述脂肪酶的洗涤剂组合物更有效。

2.根据权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶为LipA。

3.根据权利要求2所述的洗涤剂组合物，其中所述LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。

4.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶包含与SEQID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶是重组脂肪酶。

7.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶是在枯草芽孢杆菌中表达的重组脂肪酶。

8.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂是离子型或非离子型表面活性剂。

9.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂是一种或多种选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合的表面活性剂。

10.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂包含一种或多种选自如下的表面活性剂：十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠和C14-15链烷醇聚醚-4。

11.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其是在约8.0至约10.0的pH下配制。

12.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其是在约8.2至约10.0的pH下配制。

13.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洗剂。

14.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述组合物的形式选自液体、粉末、颗粒状固体和片。

15.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物在约30℃至约40℃的温度下有效水解脂质。

16.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物在水解C4至C16底物方面比包含代替枯草芽孢杆菌脂肪酶的类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)脂肪酶变体M21L(LIPOMAX^TM)的等同洗涤剂组合物更有效。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的洗涤剂组合物，其还包含蛋白酶。

18.根据权利要求17所述的洗涤剂组合物，其还包含枯草杆菌蛋白酶。

19.一种用于水解表面上的污垢或污渍中存在的脂质的方法，其包括使所述表面与根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物接触。

20.一种用于进行转酯反应的方法，其包括使供体分子与根据权利要求1-18中任一项所述的洗涤剂组合物接触。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述供体分子包含C4-C16碳链。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述供体分子包含C8碳链。