KR20140041801A - 알파-아밀라제 스크리닝 방법 - Google Patents

알파-아밀라제 스크리닝 방법 Download PDF

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시그네 에스킬드센 라르센
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Abstract

본 발명은 모 알파-아밀라제의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물, 벡터 및 숙주 세포; 그리고 이 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

알파-아밀라제 스크리닝 방법{METHOD FOR SCREENING ALPHA-AMYLASES}
서열 목록에 대한 참고 사항
본 출원은 컴퓨터로 판독 가능한 형태로 서열 목록을 포함하며, 상기 서열 목록은 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 분야
본 발명은 저온에서 성능이 높은, 특히 세제 중에서 저온에서의 성능이 높은 알파-아밀라제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이와 같은 아밀라제를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.
알파-아밀라제(알파-1,4-글루칸-4-글루카노하이드롤라제, E.C.3.2.1.1)는, 전분과 기타 다른 선형 및 분지형의 1,4-글루코시드 올리고당체 및 다당체의 가수 분해를 촉진하는 효소 군을 구성한다.
몇 가지 알려진 응용, 예를 들어 고농도 프럭토스 시럽 제조시, 또는 전분으로부터의 에탄올 생산의 부분으로서, 예를 들어 세제, 베이킹, 양조, 전분 액화 및 당화에 있어서 알파-아밀라제의 산업적 사용은 오랜 역사가 있다. 이러한 알파-아밀라제의 용도 및 기타 다른 용도가 알려져 있으며, 미생물로부터 유래되는 알파-아밀라제, 특히 박테리아 알파-아밀라제를 이용한다.
가장 많이 사용되는 박테리아 알파-아밀라제는 비.리케니포르미스(B.licheniformis)로부터 유래되는 알파-아밀라제(터마밀(Termamyl)이라고도 알려짐)로서, 이것의 특성은 널리 규명되어 있으며, 이 효소에 대한 결정 구조도 결정되었다. 알칼리성 아밀라제, 예를 들어 SP707은 세제에 사용되는 것으로 알려진 알파-아밀라제의 특정 군을 형성한다. 이러한 공지된 박테리아 아밀라제 다수는 변형되어, 특정 응용에 있어서 자체의 기능성을 개선하였다.
알파-아밀라제의 열안정성을 증가시키는 방법에 대해서는 널리 연구되어 있다. Suzuki et al.(1989)는 비.아밀로리크패이션스(B. amyloliquefaciens) 알파-아밀라제의 특정 영역이 비.리케니포르미스 알파-아밀라제의 상응하는 영역으로 교체된 키메라 알파-아밀라제를 개시한다. 키메라 알파-아밀라제는 열안정성에 관여하는 영역들을 동정하기 위한 목적으로 구성되었다. 이와 같은 영역들은 비.아밀로리크패이션스 알파-아밀라제의 177번 내지 186번 아미노산 잔기들과 255번 내지 270번 아미노산 잔기들을 포함하는 것으로 확인되었다. Igarashi et al.(1998)는 AmyS-형 아밀라제의 열안정성이 루프(F178 내지 A184)로부터 2개의 아미노산 잔기들, 즉 R179-G180(AmyS 번호 매김)의 결실에 의해 증가될 수 있음을 나타낸다. 그러나, Shiau et al.(2003)는, 상기와 동일한 루프에 결실이 있는 AmyS 효소는 모 효소보다 고온에서의 옥수수 전분 가수 분해에 대한 비활성이 더 낮음을 나타내었는데, 이는 AmyS 아밀라제의 중요 이점들 중 하나를 부인하는 것이다.
환경적 이유로, 세척, 식기 세척 및/또는 세정 과정에 있어서 온도를 낮추는 것이 점점 중요하게 되었다. 그러나, 아밀라제를 비롯한 대부분의 효소들은 최적 온도가 저온 세척에 통상적으로 사용되는 온도를 초과한다. 알파-아밀라제는 세제 조성물에 사용되는 중요 효소로서, 이 효소의 사용은 세탁 또는 식기 세척 동안 전분 얼룩의 제거에 대하여 점점 더 중요하게 되었다. 그러므로, 온도가 낮을 때에도 세척 성능, 얼룩 제거 효능 및/또는 활성을 보유하는 알파-아밀라제 변이체를 찾아내는 것이 중요하다. 그러나, 현재 세제 효소 조성물의 효능에도 불구하고, 완전히 제거하는 것이 어려운 얼룩들이 많이 있다. 이러한 문제점들은 낮은(예를 들어, 냉수) 세척 온도 및 더 짧은 세척 주기의 사용 증가에 의해 더 심각해졌다. 그러므로, 저온에서도 기능을 발휘할 수 있음과 동시에 기타 다른 원하는 특성들, 예를 들어 비활성(아밀로스 분해 활성), 안정성 및/또는 세척 성능을 보존 또는 강화할 수 있는 아밀로스 분해 효소를 가지는 것이 바람직하다.
그러므로, 저온에서 성능이 높은, 특히 세척 성능이 높은 알파-아밀라제 및 변이체를 스크리닝하는 개선된 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
제1 양태에서, 본 발명은 저온에서 성능이 높은, 특히 세척 성능이 높은 알파-아밀라제를 스크리닝하는 개선된 방법에 관한 것으로서,
a) 알파-아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질, 예를 들어 전분에 상기 효소가 결합하는지 여부를 확인하는 단계; 및
b) 상기 기질에 대한 친화도가 낮은 알파-아밀라제, 특히 기질과의 결합성 및 활성 간 비율이 낮은 알파-아밀라제를 선별하는 단계
를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 모 알파-아밀라제의 변이체를 선별하는 방법에 관한 것으로서,
a) 모 알파-아밀라제의 표면에 위치하는 아미노산 1개 이상에서 아미노산 잔기 1개 이상을 치환, 결실 또는 삽입함으로써 변이체를 생성하는 단계;
b) 상기 변이체가 상기 알파 아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질, 예를 들어 전분에 결합하는지 여부를 테스트하는 단계; 및
c) 기질과의 결합성이 모 알파-아밀라제보다 낮은 변이체를 선별하는 단계
를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 기반으로 선별될 수 있는 변이체와, 본 발명의 방법을 사용하여 선별된 알파-아밀라제를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.
본 발명은, 아밀라제와 미가공 전분의 결합성 및 저온 성능(특히 저온에서의 세척 성능) 간에 역 상관 관계가 존재한다는 관찰 결과를 바탕으로 한다. 예를 들어 다수의 실험용 세제 아밀라제 샘플에 관한 데이터의 이용으로 AMSA 테스트에서 쌀의 전분과의 결합성 및 세정 성능 간의 명확한 상관 관계가 밝혀진다. 그러므로, 놀랍게도 고체 기질과의 결합성이 약한 알파-아밀라제는 저온에서 성능이 높은 것, 특히 저온에서 세제 중에서의 성능이 높은 것이 확인되었다.
정의
알파-아밀라제 활성: "알파-아밀라제 활성" 이라는 용어는, 전분과 기타 다른 선형 및 분지형 1,4-글루코시드 올리고당체 및 다당체의 가수 분해를 촉매하는 효소 군을 이루는 알파-1,4-글루칸-4-글루카노하이드롤라제(E.C.3.2.1.1)의 활성을 의미한다.
기질 결합성: "기질 결합성" 또는 "고체 기질과의 결합성" 또는 문법적으로 상기 용어들과 동일하다고 볼 수 있는 용어들은, 알파-아밀라제가 고체 재료에 고착된 기질을 비롯한 고체 기질에 결합하는 특성으로 이해된다. 상기 용어는 상대적 용어로서, 일반적으로는 기준 알파-아밀라제의 결합성과 비교되는 상대적 결합성으로 표현된다. 변이체의 경우 기질 결합성은 일반적으로 변이체 제조의 근원으로 사용되는 모 알파-아밀라제에 대해 상대적으로 측정된다. 기질 결합성은, 알파-아밀라제 용액과 고체 기질을 항온 처리하고 나서, 기질을 제거한 다음, 알파-아밀라제의 초기량과 고체 기질에 부착된 상태로 남아 있는 알파-아밀라제의 양 간의 분율을 측정함으로써 확인될 수 있다. 고체 기질과의 기질 결합성을 확인하기 위한 바람직한 방법은 이하 "재료 및 방법" 섹션에 개시되어 있다.
변이체 : "변이체"란 용어는, 1개 이상의(수 개의) 위치에 변형, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는, 알파-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 치환이란, 하나의 위치를 점유하고 있는 아미노산을 이 아미노산과 상이한 아미노산으로 교체하는 것을 의미하고; 결실이란, 하나의 위치를 점유하고 있는 아미노산을 제거하는 것을 의미하며; 삽입이란, 하나의 위치를 점유하고 있는 아미노산에 인접한 위치에 1개 내지 3개의 아미노산을 부가하는 것을 의미한다.
돌연 변이체 : "돌연 변이체"란 용어는, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
야생형 효소: "야생형" 알파-아밀라제란 용어는, 천연에 존재하는 미생물, 예를 들어 천연에서 발견되는 박테리아, 효모 또는 사상 진균에 의해 발현되는 알파-아밀라제를 의미한다.
모 효소 또는 모 알파-아밀라제: "모 효소" 또는 "모 알파-아밀라제"란 용어는, 본 발명의 효소 변이체를 제조하기 위해 변형이 가하여진 알파-아밀라제를 의미한다. 모 효소는 천연 생성된(야생형) 폴리펩티드 또는 이의 변이체일 수 있다. 변이체와 관련하여, 모 폴리펩티드는 특별히 변형된 변이체 내 잔기들을 제외하고는, 변이체 서열과 정확히 일치하는 서열을 가지는 폴리펩티드이다.
분리된 변이체 : "분리된 변이체"란 용어는, 사람의 손으로 변형된 변이체를 의미한다. 하나의 양태에서, 변이체의 순도는 1% 이상, 예를 들어 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상 그리고 90% 이상이다(SDS-PAGE로 측정).
실질적으로 순수한 변이체 : "실질적으로 순수한 변이체"란 용어는, 변이체와 원래부터 또는 재조합에 의해 결합된 기타 다른 폴리펩티드 물질을 10중량% 이하, 8중량% 이하, 6중량% 이하, 5중량% 이하, 4중량% 이하, 3중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하 및 0.5중량% 이하 포함하는 제조물을 의미한다. 바람직하게, 변이체의 순도는 상기 제조물 중에 존재하는 총 폴리펩티드 물질의 중량을 기준으로 92% 이상, 예를 들어 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 그리고 100% 이상이다. 본 발명의 변이체는 실질적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어 널리 공지된 재조합 방법 또는 통상적인 정제 방법에 의해 변이체를 제조함으로써 얻어질 수 있다.
성숙 폴리펩티드: "성숙 폴리펩티드"란 용어는, 번역 및 임의의 번역후 변형, 예를 들어 N-말단 가공, C-말단 가공, 당화 및 인산화 등을 거친 최종 형태의 폴리펩티드를 의미한다.
성숙 폴리펩티드 암호화 서열: "성숙 폴리펩티드 암호화 서열"이란 용어는, 알파-아밀라제 활성을 가지는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
서열 동일성: 2개의 아미노산 서열들 또는 2개의 뉴클레오티드 서열들 간 관련성은 매개 변수인 "서열 동일성"에 의해 기술된다.
본 발명의 목적을 위하여, 2개의 아미노산 서열들 간 서열 동일성 정도는 니들먼-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)(EMBOSS 팩키지(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.16:276-277)의 니들 프로그램(바람직하게는 3.0.0 버전 또는 이 이후의 버전)으로 수행)을 이용하여 측정된다. 이용된 임의의 매개 변수들로서는 갭 개방 페널티(gap open penalty)(10), 갭 연장 페널티(gap extension penalty)(0.5) 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스가 있다. 니들 아웃풋("최장 동일성(longest identity)"이라 명명)(-노브리프 옵션(-nobrief option)을 사용하여 얻어짐)은 동일성 백분율로서 사용되고, 다음과 같이 산정된다:
(동일한 잔기들 × 100) / (정렬의 길이 - 정렬 중 갭의 총수)
본 발명의 목적을 위하여, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열들 간 서열 동일성 정도는 니들먼-운치 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, 상동)(EMBOSS 팩키지(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상동)의 니들먼 프로그램(바람직하게는 3.0.0 버전 또는 이 이후의 버전)으로 수행)을 사용하여 측정된다. 이용된 임의의 매개 변수들로서는 갭 개방 페널티(10), 갭 연장 페널티(0.5) 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스가 있다. 니들 아웃풋("최장 동일성"이라 명명)(-노브리프 옵션을 사용하여 얻어짐)은 동일성 백분율로서 사용되고, 다음과 같이 산정된다:
(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 × 100) / (정렬의 길이 - 정렬 중 갭의 총수)
단편: "단편"이란 용어는, 성숙 폴리펩티드의 아미노 말단 및/또는 카복실 말단으로부터 1개 이상의(수 개의) 아미노산이 결실된 폴리펩티드를 의미하며; 여기서, 상기 단편은 알파-아밀라제 활성을 가진다.
부분 서열: "부분 서열"이란 용어는, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 5' 말단 및/또는 3' 단으로부터 1개 이상의(수 개의) 뉴클레오티드들이 결실된 폴리뉴클레오티드를 의미하며; 여기서, 상기 부분 서열은 알파-아밀라제 활성을 가지는 단편을 암호화한다.
대립 유전자 변이체 : "대립유전자 변이체"란 용어는, 동일한 염색체 위치를 점유하는 유전자의 대안형 2개 이상 중 임의의 것을 의미한다. 대립 유전자 변이는 돌연 변이를 통해 천연 발생하며, 모집단 내에 다형성을 형성한다. 유전자 돌연 변이는 침묵 돌연 변이(암호화된 폴리펩티드에 변화가 없는 돌연 변이)일 수 있거나, 또는 아미노산 서열들이 변형된 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체는 유전자의 대립 유전자 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드이다.
분리된 폴리뉴클레오티드: "분리된 폴리뉴클레오티드"란 용어는, 사람의 손으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 하나의 양태에서, 분리된 폴리뉴클레오티드의 순도는 1% 이상, 예를 들어 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상, 90% 이상 그리고 95% 이상이다(아가로스 전기 영동에 의해 측정). 폴리뉴클레오티드는 게놈 폴리뉴클레오티드, cDNA 또는 RNA이거나, 반합성 또는 합성되어 유래된 폴리뉴클레오티드들, 또는 이것들의 임의의 조합체일 수 있다.
실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드: "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드"란 용어는, 기타 다른 외부 뉴클레오티드 또는 원치않는 뉴클레오티드를 포함하지 않으며, 유전자 조작된 폴리펩티드 생산 시스템 내에서 사용되기 적당한 형태를 가지는 폴리뉴클레오티드 제조물을 의미한다. 그러므로, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 원래부터 또는 재조합에 의해 결합된 기타 다른 폴리뉴클레오티드를 10중량% 이하, 8중량% 이하, 6중량% 이하, 5중량% 이하, 4중량% 이하, 3중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하, 그리고 0.5중량% 이하 포함한다. 그러나, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 천연 생성된 5'-비번역 영역 및 3'-비번역 영역, 예를 들어 프로모터 및 종결 인자를 포함할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드의 순도는 90중량% 이상, 예를 들어 92중량% 이상, 94중량% 이상, 95중량% 이상, 96중량% 이상, 97중량% 이상, 98중량% 이상, 99중량% 이상, 그리고 99.5중량% 이상인 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 실질적으로 순수한 형태를 가지는 것이 바람직하다.
암호화 서열: "암호화 서열"이란 용어는, 제제의 폴리펩티드 생성물을 이루는 아미노산 서열을 직접 특정하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 개방 해독틀)(일반적으로 ATG 개시 코돈 또는 대안적 개시 코돈, 예를 들어 GTG 및 TTG로 시작되어, 종결 코돈, 예를 들어 TAA, TAG 및 TGA로 끝남)에 의해 결정된다. 암호화 서열은 DNA, cDNA, 합성 또는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
cDNA : "cDNA"란 용어는, 성숙한 것, 즉 스플라이싱(splicing)된 mRNA 분자(진핵 생물 세포로부터 얻어진 것)로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 이와 상응하는 게놈 DNA 내에 존재할 수 있는 인트론 서열들을 포함하지 않는다. 초기의 1차 RNA 전사체는, 성숙한 것, 즉 스플라이싱된 mRNA로서 발현되기 전, 스플라이싱을 비롯한 일련의 단계들을 통하여 가공된 mRNA의 전구체이다.
핵산 구조물: "핵산 구조물"이란 용어는, 단일 사슬 또는 이중 사슬 형태의 핵산 분자로서, 천연 생성 유전자로부터 분리된 것, 또는 천연에서는 볼 수 없거나 합성에 의한 방식으로 제조된 핵산들의 분절들을 포함하도록 변형된 것을 의미한다. 핵산 구조물이란 용어는, 핵산 구조물이 본 발명의 암호화 서열의 발현에 필요한 제어 서열들을 포함할 때 용어 "발현 카세트"와 동일한 의미를 갖는다.
제어 서열: "제어 서열"이란 용어는, 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 모든 구성 요소들을 의미한다. 각각의 제어 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 원래 존재하는 것일 수 있거나 이 폴리뉴클레오티드에 외래인 것일 수 있거나, 또는 각각이 원래 존재하는 것일 수 있거나 서로에 대해 외래인 것일 수 있다. 이와 같은 제어 서열로서는 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 종결 인자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 최소한 제어 서열들은 프로모터와, 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 제어 서열에는, 이 제어 서열들과 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역의 결찰을 촉진하는 특이적 제한 위치들을 도입하기 위한 링커들이 제공될 수 있다.
작동 가능하도록 결합된 : "작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 제어 서열이 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열을 기준으로 적당한 위치에 존재하여 암호화 서열의 발현을 유도하도록 배치된 경우를 의미한다.
발현: "발현"이란 용어는, 변이체 제조와 관련된 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비(이에 한정되는 것은 아님)를 포함한다.
발현 벡터: "발현 벡터"란 용어는, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 부가의 뉴클레오티드와 작동 가능하도록 결합되어 있는, 선형 또는 환형 DNA 분자를 의미한다.
숙주 세포: "숙주 세포"란 용어는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물 또는 발현 벡터에 의한 형질 전환, 형질 감염 및 형질 도입 등에 감수성인 임의의 유형의 세포를 의미한다. "숙주 세포"란 용어에는, 복제시 일어나는 돌연 변이로 인해 부모 세포와 동일하지 않게 된, 부모 세포의 임의의 자손도 포함된다.
전분 제거 공정: "전분 제거 공정"이란 표현은, 예를 들어 전분이 직물로부터 제거되는 세척 공정, 예를 들어 직물 세척(예를 들어, 세탁)에 있어서 전분이 제거(또는 전환)되는 임의의 종류의 공정과 관련있다. 전분 제거 공정은 또한 경질 표면의 세정, 예를 들어 식기 세척일 수 있거나, 또는 일반적인 세정 공정, 예를 들어 산업상 세정 공정 또는 영업상 세정 공정일 수 있다. 상기 표현에는 일반적으로, 기타 다른 전분 제거 공정이나 전분 전환, 에탄올 생산, 전분 액화, 직물의 풀기 제거, 종이 및 펄프 생산, 맥주 주조 및 세제 사용 공정을 포함하기도 한다.
개선된 특성: "개선된 특징"이란 용어는, 모 효소에 비하여 개량된 변이체와 연관된 특징을 의미한다. 이와 같이 개선된 특성으로서는 열활성, 열안정성, pH 활성, pH 안정성, 기질/보조 인자 특이성, 개선된 표면 특성, 생성물 특이성, 전처리된 바이오매스 존재시 안정성 또는 가용성 증가, 보관 조건 하에서의 개선된 안정성 및 화학 안정성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세척 성능: 본 발명의 내용 중 "세척 성능"이란 용어는, 예를 들어 세탁이나 경질 표면 세정, 예를 들어 식기 세척시 세정될 물체상에 존재하는 전분 또는 전분 함유 얼룩을 제거하는 효소의 능력을 일컫는데 사용된다. 세척 성능은, 소위 세기 값(intensity value)(int)(AMSA에 관한 설명 또는 비이커 세척 성능 테스트(이하 방법 섹션 참조)에서 정의됨)을 산정함으로써 정량될 수 있다.
개선된 세척 성능: 본원에서 "개선된 세척 성능"이란 용어는, 아밀라제 변이체 세척 성능이, 모 아밀라제의 세척 성능, 또는 변이체의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지되 특정 위치들 중 1개 이상의 위치에 결실이 발생하지 않은 알파-아밀라제의 세척 성능, 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 가지는 알파-아밀라제의 활성과 비교하였을 때 변화된(예를 들어, 얼룩 제거능의 강화), 변이체 효소의 성능으로서 정의된다. 일반적으로 "세척 성능"이란 용어는, 예를 들어 경질 표면의 세정능(식기 세척)을 포함할 뿐만 아니라, 섬유에 대한 세척 성능(예를 들어, 세탁), 그리고 산업상 및 영업상 세정능도 포함한다.
저온: "저온"이란, 5℃ 내지 35℃, 바람직하게는 5℃ 내지 30℃, 더 바람직하게는 5℃ 내지 25℃, 더 바람직하게는 5℃ 내지 20℃, 가장 바람직하게는 5℃ 내지 15℃, 특히 5℃ 내지 10℃의 온도를 말한다. 바람직한 구체예에서, "저온"이란, 10℃ 내지 35℃, 바람직하게는 10℃ 내지 30℃, 더 바람직하게는 10℃ 내지 25℃, 가장 바람직하게는 10℃ 내지 20℃, 특히 10℃ 내지 15℃의 온도를 말한다.
제1 양태에서, 본 발명은 저온에서 성능이 높은, 특히 저온에서 세척 성능이 높은 알파-아밀라제를 스크리닝하는 개선된 방법에 관한 것으로서,
a) 알파-아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질, 예를 들어 전분에 상기 효소가 결합하는지 여부를 확인하는 단계; 및
b) 상기 기질에 대한 친화도가 낮은 알파-아밀라제, 특히 기질과의 결합성 및 활성 간 비율이 낮은 알파-아밀라제를 선별하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 이와 같은 양태에 의하면, 본 발명은 저온에서 성능이 높은 알파-아밀라제를 스크리닝하는 것, 특히 저온에서 세척 성능이 높은 세제 알파-아밀라제를 스크리닝하는 것에 관한 것이다. 본 방법은 저온에서의 성능이 우수한 효소를 찾기 위하여 신규의 알파-아밀라제를 스크리닝하는데 적당하다. 상기 방법은 또한 자동화되어 고 처리량 스크리닝 방법에 적합하다는 이점을 가질 수도 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 신규의 알파-아밀라제를 찾는데 적당하다. 한 가지 편리한 방법으로서는 다수의 후보 알파-아밀라제를 테스트하는 것이 있는데, 이에는 표준인 하나의 공지된 세제 알파-아밀라제가 사용되며, 이후 표준 세제 알파-아밀라제의 경우보다 기질과의 결합성이 낮은 신규의 후보 알파-아밀라제를 선별하는 것을 포함한다. 선별된 알파-아밀라제는 세척 성능이 우수한 후보 물질일 것이며, 세제 효소로서 중요한 기타 다른 특성들, 예를 들어 안정성 및 비활성 등이 추가로 테스트될 수도 있다.
야생형 아밀라제, 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 서열을 가지는 알파-아밀라제를 비롯한 몇 개의 세제 아밀라제는 문헌에 공지되어 있으며; 이와 같은 것들 중 임의의 것의 변이체, 예를 들어 WO 제2001066712호 및 WO 제2006002643호에 개시된 변이체, 그리고 이와 같이 공지된 세제 아밀라제들 중 임의의 것은 본 발명의 방법에 표준 세제 알파-아밀라제로서 적당히 포함될 수 있다.
이와 같은 구체예에서, 알파-아밀라제는 자체의 기질에 대한 결합성이 선택된 표준 세제 아밀라제의 경우보다 낮은 것, 예를 들어 표준 세제 알파-아밀라제의 결합성의 95% 미만인 것, 예를 들어 상기 결합성의 90% 미만인 것, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만인 것, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만인 것, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만인 것, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만인 것, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만인 것, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만인 것, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만인 것, 더 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 것, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 5% 미만인 것으로 선별된다.
대안적으로, SP722(표준 세제 알파-아밀라제로서 서열 번호 1의 서열을 가지는 알파-아밀라제)가 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 SP722의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 SP722의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 세척 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, SP707(표준 세제 알파-아밀라제로서 서열 번호 2의 서열을 가지는 알파-아밀라제)이 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 SP707의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 SP707의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 세척 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, AA560(표준 세제 알파-아밀라제로서 서열 번호 3의 서열을 가지는 알파-아밀라제)이 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 AA560의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 AA560의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 세척 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, SP690(표준 세제 알파-아밀라제로서 서열 번호 4의 서열을 가지는 알파-아밀라제)이 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 SP690의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 SP690의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 세척 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, KSM-AP1378(표준 세제 알파-아밀라제로서 서열 번호 5의 서열을 가지는 알파-아밀라제)이 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 KSM-AP1378의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 KSM-AP1378의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 세척 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, SP7-7(표준 세제 알파-아밀라제로서 서열 번호 6의 서열을 가지는 알파-아밀라제)가 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 SP7-7의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 SP7-7의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 세척 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 기질과의 결합성이 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제(BLA)의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 BLA의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데에 기타 다른 모 알파-아밀라제, 예를 들어 BLA, 즉 서열 번호 13의 서열을 가지는 알파-아밀라제도 사용될 수 았다.
대안적으로, 바실러스 아밀로리크패이션스 알파-아밀라제(BAN)(모 알파-아밀라제로서 서열 번호 14의 서열을 가지는 알파-아밀라제)가 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 BAN의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 BAN의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus)(지오바실러스 스테아로서모필러스(Geobacillus stearothermophilus) 알파-아밀라제(BSG)(모 알파-아밀라제로서 서열 번호 15의 서열을 가지는 알파-아밀라제)가 사용될 경우, 본 발명의 방법은 기질과의 결합성이 BSG의 기질과의 결합성보다 낮은, 바람직하게는 BSG의 기질과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 알파-아밀라제를 선별함으로써, 저온에서의 성능이 개선된 알파-아밀라제를 선별하는데 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 모 알파-아밀라제의 변이체를 선별하는 방법에 관한 것으로서,
a) 모 알파-아밀라제의 표면에 위치하는 아미노산 1개 이상에서 아미노산 잔기 1개 이상을 치환, 결실, 또는 삽입함으로써 변이체를 생성하는 단계;
b) 상기 변이체가 알파 아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질, 예를 들어 전분에 결합하는지 여부를 테스트하는 단계; 및
c) 기질과의 결합성이 모 알파-아밀라제의 경우보다 약한 변이체를 선별하는 단계
를 포함한다.
본 방법은 주로 저온에서의 성능이 개선된 변이체를 선별하는데 요망되는 임의의 공지된 알파-아밀라제를 대상으로 사용될 수 있으나, 바람직한 구체예에서 본 발명의 방법은 저온에서의 세척 성능이 개선된 변이체를 생성하는데 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은, 청정 구역, 전분을 당(발효되어 식용 에탄올이나 연료가 될 수 있는 당)으로 분해하는, 전분의 당화 또는 액화, 또는 직물 제조에 사용될 때, 저온에서의 성능이 개선된 모 알파-아밀라제의 변이체를 선별함에 있어서 해당 아밀라제를 찾는데 사용된다. 상기된 모든 용도들은 당업계에 알려져 있으며, 당업자는 본 발명의 방법에 따라서 선별된 알파-아밀라제가 상기된 용도로 어떻게 사용될 수 있는지를 이해할 것이다.
이와 같이 바람직한 구체예에서, 모 알파-아밀라제는, 세제 알파-아밀라제, 즉 세정 및 세탁에서 일반적으로 적용되는 조건 하에서 활성을 가지는 알파-아밀라제, 예를 들어 계면 활성제, 킬레이트화제 및 세제에 통상적으로 사용되는 기타 성분들이 존재할 때 활성을 가지는 알파-아밀라제, 그리고 알칼리 pH(예를 들어, pH 8~11, 예를 들어 pH 9~10)에서 활성을 가지는 알파-아밀라제일 수 있다.
변이체는 모 알파-아밀라제의 표면에 위치하는 아미노산 1개 이상에서 1개 이상의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 또는 삽입함으로써 제조될 수 있다.
당업자는, 모 분자의 표면에 위치하는 잔기들을 동정함으로써 변형될 잔기들을 동정하는 방법을 알 것이다. 이와 관련하여, 상기 분자의 표면에 위치하는 잔기들은, 최소한 잔기의 일부가 이를 둘러싸고 있는 배지와 상기 분자의 원래 형태로서 직접 접촉하고 있는 잔기들인 것으로 이해된다. 당업자는, 모 분자의 3-D 구조가 얻어질 수 있는 경우, 또는 모 알파-아밀라제를 알파-아밀라제(3-D 구조가 얻어질 수 있는 것)와 함께 정렬하여 분자 표면 상에 위치하는 잔기들이 모 알파-아밀라제의 잔기들(정렬에 있어서 알파-아밀라제의 표면에 위치하는 잔기들에 상응하는 잔기들)임을 확인함으로써도 모 분자의 3-D 구조가 얻어질 수 없는 경우, 모 분자의 3-D 구조로부터 이러한 종류의 정보를 이끌어낼 수 있다는 것을 이해할 것이다. 알파-아밀라제에 관한 3-D 구조 1개 이상은 당업계에 공지되어 있으므로, 소정의 모 알파-아밀라제의 표면상에 위치하는 잔기들을 동정하는 것은, 모 알파-아밀라제와의 서열 동일성이 가장 큰 알파-아밀라제의 3D 구조와 상기 모 알파-아밀라제를 정렬하는 것을 기반으로 하여야 할 것이다.
변이체는 모 알파-아밀라제의 표면 상에 위치하는 위치들에 존재하는 아미노산 잔기 1개 이상의 모 알파-아밀라제 표면에 위치하는 아미노산 1개 이상에서 아미노산 잔기 1개 이상을 치환, 결실, 또는 삽입함으로써 생성되는데, 예를 들어 상기 모-알파 아밀라제 표면에 위치하는 잔기 1개 이상, 예를 들어 상기 모 알파-아밀라제 표면에 위치하는 잔기 2개 이상, 예를 들어 잔기 3개 이상, 예를 들어 잔기 4개 이상, 예를 들어 잔기 5개 이상, 예를 들어 잔기 6개 이상, 예를 들어 잔기 7개 이상, 예를 들어 잔기 8개 이상, 예를 들어 잔기 9개 이상, 예를 들어 잔기 10개 이상, 예를 들어 잔기 15개 이하, 예를 들어 잔기 20개 이하, 또는 잔기 30개 이하를 치환, 결실 또는 삽입함으로써 제조된다.
변이체는 상기 분자의 표면에 위치하지 않는 아미노산 잔기 1개 이상에서의 치환, 결실 또는 삽입을 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 다수의 치환, 결실 또는 삽입은 선행 기술 문헌에 개시되어 있으며, 본 발명에 따라서 이용될 수도 있다. 이와 같이 바람직한 부가 치환, 삽입 또는 결실의 예로서는 WO 제96/23873호에 개시된 바와 같은 모 알파-아밀라제 내 잔기들 즉, D183 및 G184의 결실을 들 수 있다.
바람직하게, 모 알파-아밀라제에 대한 서열 동일성이 90% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상인 변이체가 생성된다.
변이체들은 기질에 대한 결합성이 모 알파-아밀라제의 기질에 대한 결합성보다 작은 것, 예를 들어 모 알파-아밀라제의 결합성의 95% 미만, 예를 들어 상기 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 것으로 선별된다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 서열 번호 15의 서열을 가지는 알파-아밀라제들 및 이러한 알파-아밀라제들 중 하나와의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상인 알파-아밀라제들로부터 선택되는 모 알파-아밀라제의 변이체를 선별하는 방법에 관한 것으로서,
a) 모 알파-아밀라제의 표면에 위치하는 아미노산 1개 이상에서 아미노산 잔기 1개 이상을 치환, 결실, 또는 삽입함으로써 변이체를 생성하는 단계(여기서, 변이체의 모 알파-아밀라제와의 서열 동일성은 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 97% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상임);
b) 상기 변이체가 알파 아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질, 예를 들어 전분에 결합하는지 여부를 테스트하는 단계; 및
c) 기질과의 결합성이 모 알파-아밀라제의 경우보다 약한 변이체를 선별하는 단계(여기서, 변이체의 기질 결합성은 모 알파-아밀라제의 기질 결합성의 95% 미만, 예를 들어 상기 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만임)
를 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 서열 번호 15의 서열을 가지는 알파-아밀라제들 및 이러한 알파-아밀라제들 중 하나와의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 87% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상인 알파-아밀라제로부터 선택되는 모 알파-아밀라제의 변이체에 관한 것으로서, 여기서
i) 변이체는 모 알파-아밀라제에 대한 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 87% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상이고;
ii) 변이체? 모 알파-아밀라제의 고체 기질과의 결합성과 비교하였을 때 고체 기질과의 결합성이 낮은 변이체, 예를 들어 상기 결합성이, 상기 모 알파-아밀라제의 고체 기질과의 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만이다.
이러한 변이체들은 본 발명의 방법을 통하여 제공될 수 있다.
본 발명의 변이체는 또한 모 알파-아밀라제의 표면에 위치하는 잔기 1개 이상과 기질 결합 위치의 일부가 치환 또는 결실된 변이체를 포함하기도 한다. 이와 같이 모 알파-아밀라제의 표면에 존재하는 기질 결합 위치는 소수의 모 알파-아밀라제에 관한 문헌에 개시되어 있으며, 당업자는 소정의 모 알파-아밀라제를 또 다른 알파-아밀라제 서열(기질 결합 위치가 확인된 것)과 함께 정렬함으로써, 이러한 기질 결합 위치들이 다른 모 알파-아밀라제에서도 확인될 수 있음을 알 것이다.
기질 결합 위치의 일부인 잔기의 예로서는
a) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 및 G477(서열 번호 2);
b) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 및 G477(서열 번호 5);
c) W140, W159, W1 67, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305,
K320, W347, W439, W469, G476 및 G477(서열 번호 4);
d) W138, W157, W165, E167, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, K315, W342, R437, W467 및 G475(서열 번호 13);
e) W136, W155, W163, E165, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, R315, W342, R437, W467 및 G475(서열 번호 14); 및
f) W139, W158, W166, E168, W187, E192, F260, F287, G302, G303, W345, W437, W467, G474 및 G475(서열 번호 15)
를 언급할 수 있다.
본 발명의 변이체는 또한 기질 결합 위치의 일부인 잔기에 근접하여 존재하는 위치에 부피가 큰 아미노산 잔기(예를 들어, 상기 a) 내지 h)에 언급된 잔기) 1개 이상을 도입시키는 변형 1개 이상을 포함하는 변이체도 포함한다. 이와 관련하여, 부피가 큰 아미노산 잔기는 측쇄가 큰 아미노산, 예를 들어 Tyr, Trp, Phe, His 및 Ile로부터 선택될 수 있다(여기서, Tyr 및 Trp가 바람직함). 기질 결합 위치의 일부인 잔기에 근접하여 존재한다고 함은, 변형된 잔기가 기질 결합 위치의 일부인 잔기로부터 10Å 미만, 바람직하게는 6Å 미만, 그리고 가장 바람직하게는 3Å 미만 떨어져 존재함을 의미한다. 구할 수 있는 구조 정보를 기반으로 이와 같은 잔기들을 동정하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
기타 다른 바람직한 변이체로서는 서열 번호 2의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 87% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상이되, 서열 동일성이 100% 미만이고, 다음과 같은 치환을 포함하는 변이체들을 포함한다:
H183*+G184*+W140F;
H183*+G184*+Q169N;
H183*+G184*+Q169A;
H183*+G184*+W189Y+E190P;
H183*+G184*+N260D;
H183*+G184*+G477E;
H183*+G184*+G477Q;
H183*+G184*+G477K;
H183*+G184*+W189E+E190P;
H183*+G184*+A51I+W140Y;
H183*+G184*+W140Y+W189E;
H183*+G184*+W140Y+N260P;
H183*+G184*+W140Y+W284D;
H183*+G184*+W140Y+G476R;
H183*+G184*+W140Y+G477E;
H183*+G184*+W189E+W439R;
H183*+G184*+W284D+G477E;
H183*+G184*+W439R+G476R;
H183*+G184*+W439R+G477E;
H183*+G184*+E194D;
H183*+G184*+W439R+D467K;
H183*+G184*+R320M+W439R;
H183*+G184*+W439R+K485R;
H183*+G184*+Y160S;
H183*+G184*+W189F+E190P;
H183*+G184*+F262A;
H183*+G184*+Y363H;
H183*+G184*+G476E;
H183*+G184*+N260P+W439R;
H183*+G184*+N260P+G477E;
H183*+G184*+W439R+G476R;
H183*+G184*+K72S+W140Y;
H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G;
H183*+G184*+E194S;
H183*+G184*+E345D+G477R;
H183*+G184*+K302N+W439R;
H183*+G184*+R320K+W439R
H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q;
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E;
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q;
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E;
H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R;
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y;
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q;
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K;
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R;
H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K;
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K;
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q;
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q;
H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q;
H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y;
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q;
H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.
기타 다른 바람직한 변이체로서는 상기 언급된 치환들 중 하나를 포함하는 서열 번호 2의 서열로 이루어진 변이체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 변이체로서 바람직한 것은, 서열 번호 13의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상이고, 서열 번호 13 내 K315 및/또는 W467에 상응하는 위치에서의 치환, 바람직하게는 K315ANCQEGHILMFPSTWYVM, 더 바람직하게는 K315M 및/또는 W467AF를 포함하는 변이체이다. 바람직한 구체예에서, 위치 K315에서의 치환은 또 다른 치환, 바람직하게는 G48A, T51IL, G107A, H156Y; A181T, N190F, 1201F, A209V 및 Q264S로부터 선택되는 치환과 함께 일어난다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 선별된 알파-아밀라제를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은
i) 서열 번호 1 내지 서열 번호 12의 서열들 중 하나와의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상이고;
ii) 고체 기질 또는 고착된 기질과의 결합성이, 모 알파-아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질과의 결합성의 95% 미만, 예를 들어 상기 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만임
을 특징으로 하는 변이체 알파-아밀라제를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은
i) 서열 번호 1 내지 서열 번호 12의 서열들 중 하나와의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상; 및
ii) 고체 기질 또는 고착된 기질과의 결합성이, 서열 번호 8의 서열을 가지는 알파-아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질과의 결합성의 95% 미만, 예를 들어 상기 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만임
을 특징으로 하는 변이체 알파-아밀라제를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 알파-아밀라제를 포함하는 세제 조성물에 관한 것으로서, 이 경우 쌀 전분과 알파-아밀라제의 결합성은 쌀 전분과 서열 번호 8의 서열을 가지는 알파-아밀라제의 결합성보다 낮은데, 바람직하게는 80% 미만, 더 바람직하게는 70% 미만, 더 바람직하게는 60% 미만, 더 바람직하게는 50% 미만, 더 바람직하게는 40% 미만, 더 바람직하게는 30% 미만, 더 바람직하게는 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 10% 미만이다.
알파-아밀라제와 고체 기질의 결합성 측정
본 발명의 목적을 위해서, 알파-아밀라제와 고체 기질 또는 고착된 기질의 결합성은 주로 기질과의 결합성을 측정하는 임의의 방법으로서 당업계에 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 방법은 알파-아밀라제와 고체 기질 또는 고착된 기질을 접촉시키는 단계와, 상기 기질에 결합된 알파-아밀라제의 분율을 측정하는 단계를 포함한다.
고체 기질 또는 고착된 기질은 테스트 조건 하에서 실질적으로 불용성인 임의의 기질(알파-아밀라제의 기질)일 수 있다. 고체 기질은 전분, 예를 들어 밀 전분, 옥수수 전분 또는 쌀 전분일 수 있으며, 이것들 중 쌀 전분이 바람직하다. 대안적으로, 상기 측정 단계는 고체 매트릭스 상에 고착된 알파-아밀라제의 임의의 가용성 기질 또는 불용성 기질을 포함하는 고착 기질을 사용하여 실행될 수 있다. 본 발명에 의하면 알파-아밀라제와 이의 기질간 결합성은, 전분의 존재 하에서 측정된(pH8 및 20℃) 결합 아밀라제의 분율로서 측정된다. 알파-아밀라제와 이의 기질간 결합은, 알파-아밀라제 수용액을 전분과 함께 항온 처리하고, 결합된 아밀라제의 분율을 이하에 기술된 방법을 이용하여 측정함으로써 측정될 수 있다.
변이체 지정에 대한 관례
본 발명의 목적을 위해서, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15에 개시된 성숙 폴리펩티드는 또 다른 알파-아밀라제 내 상응하는 아미노산 잔기를 확인하는데 사용된다. 또 다른 알파-아밀라제의 아미노산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15에 개시된 성숙 폴리펩티드와 함께 정렬되며, 이와 같은 정렬을 바탕으로 하였을 때 서열 번호 2에 개시된 성숙 폴리펩티드 내 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 번호는 니들먼-운치 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)(EMBOSS 팩키지(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.16:276-277)의 니들먼 프로그램(바람직하게는 3.0.0 버전 또는 이 이후의 버전)으로 수행)을 통하여 결정된다.
또 다른 알파-아밀라제 내 상응하는 아미노산 잔기의 동정 결과는, "클러스탈W(ClustalW)"를 이용하여 다수의 폴리펩티드 서열들을 정렬함으로써 확증될 수 있다(Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948).
기타 다른 효소가 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 성숙한 폴리펩티드로부터 유래되어, 통상의 서열 기반 비교가 서열간 관계를 확인하는데 실패하였을 때(Lindahl 및 Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), 기타 다른 짝 서열 비교 알고리즘(pairwise sequence comparison algorithm)이 사용될 수 있다. 검색 데이터베이스에 대한 폴리펩티드 군의 확률적 표현(프로필)을 이용하는 검색 프로그램이 사용될 경우, 서열 기반 검색법의 정확도(sensitivity)는 더욱 커질 수 있다. 예를 들어 PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 절차를 통하여 프로필들이 생성되고, 멀리 떨어져 존재하는 상동체의 특성까지도 간파될 수 있다(Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). 만일 폴리펩티드 군이나 상위군이 단백질 구조 데이터베이스의 대표예 1개 이상을 가지면 감도는 더욱더 커질 수 있다. 프로그램, 예를 들어 GenTHREADER(Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin 및 Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881)는 다양한 소스로부터 얻어진 정보를 중립 네트워크(미지의 서열에 대한 구조적 접힘 양상 예측)에 대한 인풋으로서 이용한다. 이와 유사하게, 문헌[Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919]의 방법은 미지의 구조를 가지는 서열을 SCOP 데이터베이스에 존재하는 상위군 모델과 함께 정렬하는데 사용될 수 있다. 이러한 정렬들은 결국 폴리펩티드에 대한 상동성 모델들을 생성하는데 사용될 수 있으며, 이러한 모델들은 상기와 같은 목적으로 개발된 다양한 도구들을 통해 자체의 정확도에 대해 평가될 수 있다.
공지된 구조를 가지는 단백질에 있어서, 몇 개의 도구와 원천은 구조상 정렬을 검색 및 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 단백질의 SCOP 상위군은 구조적으로 정렬되었으며, 이와 같은 정렬들은 입수 가능할뿐만 아니라 다운로드도 가능하다. 2개 이상의 단백질 구조는 다양한 알고리즘, 예를 들어 거리 정렬 매트릭스(distance alignment matrix)(Holm 및 Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) 또는 조합 연장 알고리즘(combinatorial extension algorithm)(Shindyalov 및 Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747)을 이용하여 정렬될 수 있으며, 이러한 알고리즘은 또한 생성 가능한 구조 상동체를 찾아내기 위하여, 관심있는 구조를 가지는 미지의 구조에 관한 데이터베이스에 대해 부가적으로 실행될 수 있다(예를 들어, Holm 및 Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
본 발명의 알파-아밀라제 변이체를 기술함에 있어서, 이하에 기술된 명명법은 인용의 편의를 위해 적용되는 것이다. 승인된 IUPAC 1문자 또는 3문자 아미노산 축약어가 사용된다.
치환: 아미노산 치환에 있어서는 다음과 같은 명명법이 사용된다: 원 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 그러므로 226번 위치에서 일어난 트레오닌의 알라닌으로의 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"라고 명명된다. 다수의 돌연 변이들은 더하기 표시("+")로 분리되는데, 예를 들어 "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는"G205R + S411F"는 205번 위치의 글리신(G)이 아르기닌(R)으로 치환되었고, 411번 위치의 세린(S)이 페닐알라닌(F)으로 치환되었음을 나타낸다.
결실: 아미노산 결실에 있어서는 다음과 같은 명명법이 사용된다: 원 아미노산, 위치*. 그러므로 195번 위치에서 일어난 글리신 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"라고 명명된다. 다수의 결실들은 더하기 표시("+")로 분리되는데, 예를 들어 "Gly195* + Ser411*" 또는 "G195* + S411*"로 표시된다.
삽입: 아미노산 삽입에 있어서는 다음과 같은 명명법이 사용된다: 원 아미노산, 위치, 원 아미노산, 삽입된 아미노산. 그러므로, 195번 위치의 글리신 다음에 리신이 삽입된 경우는 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"라고 명명된다. 다수의 아미노산들이 삽입된 경우는 다음과 같이 명명된다: 원 아미노산, 위치, 원 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2 등. 예를 들어 195번 위치의 글리신 다음에 리신과 알라닌이 삽입된 경우는 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"라고 명명된다.
이와 같은 경우, 삽입된 아미노산 잔기(들)는 삽입된 아미노산 잔기(들)의 앞에 있는 아미노산 잔기의 위치 번호에 소문자를 부가함으로써 번호가 매겨진다. 상기와 같은 예의 경우, 서열은 다음과 같을 것이다:
Figure pct00001
다중 변형: 다중 변형을 포함하는 변이체는 더하기 표시("+")로 분리되는데, 예를 들어 "Arg170Tyr + Gly195Glu" 또는 "R170Y + G195E"는 170번 위치의 아르기닌이 티로신으로 치환되었고, 195번 위치의 글리신이 글루탐산으로 치환되었음을 나타낸다.
상이한 치환: 특정 위치에 상이한 치환들이 도입될 수 있는 경우, 상이한 치환들은 콤마(,)로 분리되는데, 예를 들어 "Arg170Tyr,Glu"는 170번 위치에서 아르기닌이 티로신이나 글루탐산으로 치환되었음을 나타내는 것이다. 그러므로, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala"는 다음과 같은 변이체들을 지정한다:
"Tyr167Gly + Arg170Gly", "Tyr167Gly + Arg170Ala", "Tyr167Ala + Arg170Gly", "Tyr167Ala + Arg170Ala".
모 알파-아밀라제
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드(SP722)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 양태에서, 모 효소와 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 문헌[Tsukamoto et al. 1988, Biochem. Biophys.Res Comm. 151 , 25-31]에 개시되어 있는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드(SP707)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드(AA560)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 3의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드(SP690, WO9526397에 개시됨)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 4의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드(KSM-AP1378, EP670367에 개시됨)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 5의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드(sp7-7)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 6의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드(SP722 + T183* + G184*)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 7의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드(SP707 + G182* + H183*)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 8의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드(AA560+T183*+G184*)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 9의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드(SP690+T183*+G184*)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 10의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드(KSM-AP1378+D183*+G184*)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 11의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드(SP-7-7+G182*+H183*)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 12의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 13의 성숙 폴리펩티드(바실러스 리케니포르미스로부터 유래)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 13의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 13의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 13의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 13의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 14의 성숙 폴리펩티드(바실러스 아밀로리크패이션스로부터 유래)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 14의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 14의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 14의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 14의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
모 알파-아밀라제는 또한 서열 번호 15의 성숙 폴리펩티드(바실러스 스테아로서모필러스(지오바실러스 스테아로서모필러스)로부터 유래)와의 서열 동일성이 80% 이상인 폴리펩티드일 수도 있다.
다른 양태에서, 모 효소와 서열 번호 15의 성숙 폴리펩티드(알파-아밀라제 활성을 가짐)의 서열 동일성은 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%이다. 하나의 양태에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 15의 성숙 폴리펩티드와 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 5개의 아미노산, 4개의 아미노산, 3개의 아미노산, 2개의 아미노산 및 1개의 아미노산만큼 차이가 난다.
모 효소는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 모 효소는 서열 번호 15의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이 폴리펩티드로 이루어져 있다.
또 다른 구체예에서, 모 효소는 서열 번호 15의 성숙 폴리펩티드의 대립 유전자 변이체이다.
서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15의 아미노산 서열 또는 이것들의 단편은, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라서 상이한 속이나 종의 균주로부터 모 효소를 암호화하는 DNA를 동정 및 클로닝하기 위한 핵산 프로브를 디자인하는데 사용될 수 있다. 특히 이러한 프로브는 관심 있는 속이나 종의 게놈 DNA 또는 cDNA와의 혼성화(표준적인 서던 블롯팅 방법에 따름)에 사용되어, 상기 게놈 DNA 또는 cDNA 내 상기 프로브와 상응하는 유전자를 동정 및 분리할 수 있다. 이와 같은 프로브의 길이는 전체 서열의 길이보다 훨씬 짧을 수 있지만, 14개 뉴클레오티드 이상, 예를 들어 25개 뉴클레오티드 이상, 35개 뉴클레오티드 이상 또는 70개 뉴클레오티드 이상은 되어야 한다. 상기 핵산 프로브의 길이는 100개 뉴클레오티드 이상, 예를 들어 200개 뉴클레오티드 이상, 300개 뉴클레오티드 이상, 400개 뉴클레오티드 이상, 500개 뉴클레오티드 이상, 600개 뉴클레오티드 이상, 700개 뉴클레오티드 이상, 800개 뉴클레오티드 이상 또는 900개 뉴클레오티드 이상인 것이 바람직하다. DNA 프로브와 RNA 프로브 둘 다 사용될 수 있다. 상기 프로브는 통상적으로 이와 상응하는 유전자를 검출하기 위해 (예를 들어, 32P, 3H, 35S, 바이오틴 또는 아비딘으로) 표지화된다. 이러한 프로브는 본 발명에 포함된다.
기타 다른 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 상기 기술된 프로브와 혼성화되고 모 효소를 암호화하는 DNA에 대해 스크리닝될 수 있다. 이와 같이 기타 다른 유기체로부터 유래하는 게놈 DNA 또는 기타 다른 DNA는 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동이나 기타 다른 분리 기법에 의해 분리될 수 있다. 라이브러리로부터 유래하는 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로스 또는 기타 다른 적당한 담체 재료(서던 블럿팅에 사용되는 재료) 상에 옮겨져 고정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 혼성화란, 어떤 폴리뉴클레오티드가, 낮은 엄중도 조건으로부터 매우 높은 엄중도 조건에 이르는 조건 하에서 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분 서열에 상응하는, 표지화된 뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 것을 의미한다. 프로브가 혼성화되는 분자들은, 예를 들어 X선 필름 또는 당업계에 알려진 기타 다른 임의의 검출 수단을 통해 검출될 수 있다.
하나의 양태에서, 핵산 프로브는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편이다.
길이가 긴 프로브(길이 100개 뉴클레오티드 이상인 프로브)의 경우, 매우 낮은 엄중도 조건으로부터 매우 높은 엄중도 조건에 이르는 조건이란, 적당히는 12시간 내지 24시간 동안의 표준 서던 블럿팅 방법에 따라서, 5×SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성 연어 정자 DNA 200㎍/㎖, 25% 포름아미드(매우 낮은 엄중도 및 낮은 엄중도), 35% 포름아미드(중간 엄중도 및 중간-높은 엄중도), 또는 50% 포름아미드(높은 엄중도 및 매우 높은 엄중도)의 존재 하에서의 예비 혼성화 조건 및 혼성화 조건으로서 정의된다. 담체 재료는 최종적으로 3회 세척되는데, 이 경우, 다음과 같은 온도에서 15분 동안 2×SSC 및 0.2% SDS가 사용된다: 45℃(매우 낮은 엄중도), 50℃(낮은 엄중도), 55℃(중간 엄중도), 60℃(중간-높은 엄중도), 65℃(높은 엄중도) 또는 70℃(매우 높은 엄중도).
길이가 짧은 프로브(길이 약 15개 뉴클레오티드에서 약 70개 뉴클레오티드인 프로브)의 경우, 엄중도 조건이란, 적당히는 12시간 내지 24시간 동안의 표준 서던 블럿팅 방법에 따라서, 0.9M NaCl, 0.09M Tris-HCl pH 7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1×덴하르트 용액(Denhardt's solution), 1mM 피로인산나트륨, 1mM 1가 염기 인산니트륨, 0.1mM ATP 및 0.2㎎/㎖ 효모 RNA 중, 그리고 문헌[Bolton 및 McCarthy, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390]에 따른 산정법을 이용하여 산정된 Tm보다 약 5℃ 내지 약 10℃ 낮은 온도에서 이루어지는 예비 혼성화 조건 및 혼성화 조건으로서 정의된다. 담체 재료는 최종적으로 6×SSC 및 0.1% SDS 중에서 1회 세척되고(15분), 6×SSC를 사용하여 2회 세척된다(산정된 Tm보다 5℃ 내지 10℃ 낮은 온도에서 각각 15분씩).
모 효소는 임의의 속에 속하는 미생물로부터 얻어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 소정의 공급원과 연관하여 사용된 "~로부터 얻어지는"이란 용어는, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모 효소가 특정 공급원 또는 세포(특정 공급원으로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 세포)에 의해 생산됨을 의미할 것이다. 하나의 양태에서 모 효소는 세포 외에 분비된다.
모 효소는 박테리아 알파-아밀라제일 수 있다. 예를 들어 모 효소는 그람 양성 박테리아 폴리펩티드, 예를 들어 바실러스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus), 지오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 알파-아밀라제이거나, 그람 음성 박테리아 폴리펩티드, 예를 들어 캄필로박터(Campylobacter), 이.콜라이(E. coli), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 리오박터(llyobacter), 네이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella) 또는 우레아플라스마(Ureaplasma) 알파-아밀라제일 수 있다.
하나의 양태에서, 모 효소는 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리크패이션스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퍼무스(Bacillus firmus), 바실러스 로투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 알파-아밀라제이다.
다른 양태에서, 모 효소는 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis) 또는 스트렙토코커스 에퀴 아종 주에피데미쿠스(Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus) 알파-아밀라제이다.
다른 양태에서, 모 효소는 스트렙토마이세스 아크로모제네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 또는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 알파-아밀라제이다.
모 효소는 진균 알파-아밀라제일 수 있다. 예를 들어 모 효소는 효모 알파-아밀라제, 예를 들어 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 알파-아밀라제일 수 있다. 예를 들어 모 효소는 사상 진균 알파-아밀라제, 예를 들어 아크레모니움(Acremonium), 아가리쿠스(Agaricus), 알터나리아(Alternaria), 아스퍼질러스(Aspergillus), 오레오바시디움(Aureobasidium), 보트리오스파에리아(Botryospaeria), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 카에토미디움(Chaetomidium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 클라비셉스(Claviceps), 코클리오볼루스(Cochliobolus), 코프리놉시스(Coprinopsis), 콥토터메스(Coptotermes), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토코커스(Cryptococcus), 디플로디아(Diplodia), 엑시디아(Exidia), 필리바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 홀로마스티고토이데스(Holomastigotoides), 휴미콜라(Humicola), 어펙스(Irpex), 렌티뉼라(Lentinula), 렙토스파에리아(Leptospaeria), 마그나포르테(Magnaporthe), 멜라노카르푸스(Melanocarpus), 메리필러스(Meripilus), 뮤코(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 피로마이세스(Piromyces), 포이트라시아(Poitrasia), 슈도플렉타니아(Pseudoplectania), 슈도트리코님파(Pseudotrichonympha), 리조뮤코(Rhizomucor), 쉬조필럼(Schizophyllum), 사이탈리디움(Scytalidium), 탈라로마이세스(Talaromyces), 서모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트리코더마(Trichoderma), 트리코파에아(Trichophaea), 버티실리움(Verticillium), 볼바리엘라(Volvariella) 또는 자일라리아(Xylaria) 알파-아밀라제일 수 있다.
다른 양태에서, 모 효소는 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis) 또는 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 알파-아밀라제이다.
다른 양태에서, 모 효소는 아크레모니움 셀룰로리티쿠스(Acremonium cellulolyticus), 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오라이재(Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필럼(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 머다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 파니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스랜디큠(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피큠(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나튬(Chrysosporium zonatum), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 큘모럼(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아럼(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미넘(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포럼(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네건디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티큘라텀(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 샘부시넘(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로세움(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나텀(Fusarium venenatum), 휴미콜라 그리세아(Humicola grisea), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 어프렉스 락테우스(Irpex lacteus), 뮤코 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 서모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 퍼니큘로섬(Penicillium funiculosum), 페니실리움 퍼퓨로제넘(Penicillium purpurogenum), 파네로카에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 티엘라비아 아크로마티카(Thielavia achromatica), 티엘라비아 알보마이세스(Thielavia albomyces), 티엘라비아 알보필로사(Thielavia albopilosa), 티엘라비아 오스트랄레인시스(Thielavia australeinsis), 티엘라비아 피메티(Thielavia fimeti), 티엘라비아 마이크로스포라(Thielavia microspora), 티엘라비아 오비스포라(Thielavia ovispora), 티엘라비아 페루비아나(Thielavia peruviana), 티엘라비아 세토사(Thielavia setosa), 티엘라비아 스페데도니움(Thielavia spededonium), 티엘라비아 서브서모필라(Thielavia subthermophila), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트리코더마 하지아넘(Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌지(Trichoderma koningii), 트리코더마 론지브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 또는 트리코더마 비리드(Trichoderma viride) 알파-아밀라제이다.
다른 양태에서, 모 효소는 바실러스 종의 알파-아밀라제, 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 알파-아밀라제이다.
상기 언급된 종들에 있어서, 본 발명은 완전한 상태 및 불완전한 상태의 종 둘 다 포함하며, 기타 다른 분류학상 균등 균주, 예를 들어 무성 세대 균주(종의 알려진 이름이 무엇이든 상관 없음)도 포함한다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 적당한 균등 균주의 고유성(identity)을 쉽게 알 것이다.
이러한 종들의 균주는 다수의 배양 수집소, 예를 들어 미국 모식균 배양 수집소(ATCC), 독일 생물 자원 센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM), 사균배지 중앙 보관소(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS) 및 농업 리서치 서비스 특허 배양 수집소, 북부 지역 리서치 센터(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)(NRRL)를 통하여 공중이 용이하게 입수할 수 있다.
모 효소는 기타 다른 공급원, 예를 들어 자연(예를 들어, 토양, 비료 및 물 등)으로부터 분리된 미생물 또는 상기 업급된 프로브를 사용하여 천연 재료(예를 들어, 토양, 비료 및 물 등)로부터 직접 얻어진 DNA 샘플로부터도 동정되어 얻어질 수 있다. 천연 서식지로부터 직접 미생물 및 DNA를 분리하는 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이후, 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 미생물의 cDNA 라이브러리나 게놈 DNA 라이브러리, 또는 혼합된 DNA 샘플을 유사하게 스크리닝함으로써 유래될 수 있다. 일단 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로브(들)로 검출되면, 이 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 알려진 기법을 이용하여 분리 또는 클로닝될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, 상동] 참조).
모 효소는 하나의 폴리펩티드 일부가 또 다른 폴리펩티드 일부의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 하이브리드 폴리펩티드일 수 있다.
모 효소는 또한 하나의 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된, 융합 폴리펩티드 또는 절단 가능한 융합 폴리펩티드일 수 있다. 융합 폴리펩티드는, 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 또 다른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합함으로써 제조된다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열들을 결찰하여 이 서열들을 해독 틀 내에 존재하도록 만들고, 융합된 폴리펩티드의 발현을 동일한 프로모터(들) 및 종결 인자의 제어 하에 두는 것을 포함한다. 융합 단백질은 또한 번역후 융합이 진행되는 인테인 기법(intein technology)을 사용하여 구성될 수도 있다(Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
융합 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드들 간 절단 위치를 추가로 포함할 수도 있다. 융합 단백질이 분비될 때, 상기 위치는 절단되고, 이때 2개의 폴리펩티드가 방출된다. 절단 위치의 예로서는 문헌[Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576]; [Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251]; [Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493]; [Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503]; [Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381]; [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512]; [Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987]; [Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248]; 및 [Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48]에 개시된 위치들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
변이체의 제조
변이체는 당업계에 공지된 임의의 돌연 변이 유발법, 예를 들어 위치 배향 돌연 변이 유발법, 합성 유전자 구성법, 반합성 유전자 구성법, 무작위 돌연 변이 유발법 및 셔플링(shuffling) 등을 사용하여 제조될 수 있다.
위치 배향 돌연 변이 유발법은 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내 특정된 위치 1개 이상에서 1개 이상(수 개)의 돌연 변이를 발생시키는 기법이다.
위치 배향 돌연 변이 유발법은 원하는 돌연 변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 시험관 내에서 진행될 수 있다. 위치 배향 돌연 변이 유발법은 또한, 모 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 내 임의의 위치를 해당 제한 효소로 절단한 후, 상기 폴리뉴클레오티드 내에 돌연 변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 결찰하는 것을 포함하는 카세트 돌연 변이 유발법에 의해 시험관 내에서 수행될 수도 있다. 일반적으로 플라스미드와 올리고뉴클레오티드를 절단하는 제한 효소는 동일한데, 이 제한 효소는 접착 말단(sticky end)을 만드는 방식으로 플라스미드를 절단할 수 있고, 삽입물과 상기 접착 말단을 상호 결찰시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Scherer 및 Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955]; 및 [Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966]을 참조한다.
위치 배향 돌연 변이 유발법은 또한 당업계에 알려진 방법에 의해 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어 미국 특허출원공개 제2004/0171154호; 문헌[Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776]; [Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290]; 및 [Calissano 및 Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16]을 참조한다.
임의의 위치 배향 돌연 변이 유발법이 본 발명에 사용될 수 있다. 변이체를 제조하는데 사용될 수 있는 키트가 다수 시판되고 있다.
합성 유전자 구성법은 관심 있는 폴리펩티드를 암호화하는, 디자인된 폴리뉴클레오티드 분자를 시험관 내 합성하는 것을 포함한다. 유전자 합성은 다수의 기법, 예를 들어 문헌[Tian et al.,2004, Nature 432:1050-1054]에 기술된 다중체 마이크로칩 기반 기법 및 이와 유사한 기법(광 프로그래밍 가능 미세 유체 칩(photo-programable microfluidic chip) 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성 및 조립하는 기법)을 이용하여 수행될 수 있다.
단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은, 공지된 돌연 변이 유발법, 재조합법 및/또는 셔플링(shuffling)을 수행한 후, 관련된 스크리닝법, 예를 들어 문헌[Reidhaar-Olson 및 Sauer, 1988, Science 241: 53-57]; [Bowie 및 Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156]; WO 제95/17413호; 또는 WO 제95/22625호에 개시된 방법에 의해 이루어질 수 있을뿐만 아니라 테스트될 수 있다. 사용될 수 있는 기타 다른 방법으로서는 오류-유발 PCR, 파지 전시법(예를 들어, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; 미국 특허 제5,223,409호; WO 제92/06204호) 그리고 영역 배향 돌연 변이 유발법(Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127)을 포함한다.
돌연 변이 유발법/셔플링 방법은 클로닝 및 돌연 변이 유발된 폴리펩티드로서 숙주 세포에 의해 발현된 것의 활성을 확인하기 위한 고처리량 자동화 스크리닝 방법과 함께 수행될 수 있다(Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). 활성 폴리펩티드를 암호화하는 돌연 변이 유발 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수될 수 있으며, 업계의 표준 방법을 사용하여 신속하게 서열 결정될 수 있다. 이와 같은 방법들은 폴리펩티드 내 각각의 아미노산 잔기들의 중요성을 신속하게 확인할 수 있게 해준다.
반합성 유전자 구성법은, 합성 유전자 구성법 및/또는 위치 배향 돌연 변이 유발법 및/또는 무작위 돌연 변이 유발법 및/또는 셔플링의 양태들을 조합하여 수행된다. 반합성 구성법은 통상적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 단편들을 이용하는 방법을 PCR 기법과 함께 수행함으로써 진행된다. 그러므로 유전자의 특정 영역들이 새로이 합성될 수 있으며, 기타 다른 영역들은 위치 특이적 돌연 변이 유발 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 또 다른 영역들은 이 영역들을 대상으로 하는 오류 유발 PCR 증폭법 또는 비 오류 유발 PCR 증폭법으로 증폭될 수 있다. 이후, 폴리뉴클레오티드 부분 서열은 셔플링될 수 있다.
변이체
모 효소 내 필수 아미노산은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 위치 배향 돌연 변이 유발법 또는 알라닌-스캐닝 돌연 변이 유발법에 따라서 동정될 수 있다(Cunningham 및 Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). 상기 알라닌-스캐닝 돌연 변이 유발 기법에 있어서, 하나의 알라닌 돌연 변이는 분자 내 매 잔기마다 도입되고, 생성된 돌연 변이 분자는 알파-아밀라제 활성에 대해 테스트되며, 그 결과, 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기가 동정된다. 또한, 문헌[Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 : 4699-4708]을 참조한다. 알파-아밀라제 또는 기타 다른 생물학적 상호 작용의 활성 위치는 또한 추정 접촉 위치 아미노산을 돌연 변이시킴과 아울러, 기법, 예를 들어 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화 기법에 의해 구조를 물리적으로 분석함으로써 확인될 수도 있다. 예를 들어 문헌[de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312]; [Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904]; [Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64]을 참조한다. 필수 아미노산의 고유성은 또한 모 효소와 관련된 폴리펩티드를 사용하여 고유성을 분석함으로써 추정될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 변이체들 중 임의의 것을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
핵산 구조물
본 발명은 또한 제어 서열과 양립 가능한 조건 하에 적당한 숙주 세포 내에서 암호화 서열의 발현을 유도하는 제어 서열 1개 이상(수 개)에 작동 가능하도록 결합되어 있는, 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드는 변이체를 발현시키는 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 벡터에 삽입되기 전에 이 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것은 발현 벡터에 따라서 바람직하거나 필요한 것일 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 변형하는 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
제어 서열은 폴리뉴클레오티드를 발현시킴에 있어서 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 변이체의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 포함한다. 돌연 변이 프로모터, 절단형 프로모터 및 하이브리드 프로모터를 비롯한 프로모터는 숙주 세포 내에서 전사 활성을 보이는 임의의 핵산 서열일 수 있으며, 이 숙주 세포에 동질성이거나 이질성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다.
박테리아 숙주 세포 내에서 본 발명의 핵산 구조물의 전사를 유도하는데 적당한 프로모터의 예로서는, 바실러스 아밀로리크패이션스 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실러스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(penP), 바실러스 스테아로서모필러스 말토게닉 아밀라제 유전자(amyM), 바실러스 서브틸리스 레반수크라제 유전자(sacB), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 이.콜라이 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리칼라 아가라제 유전자(dagA) 및 원핵 생물 베타-락타마제 유전자로부터 얻어지는 프로모터(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731)와, tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 -25)가 있다. 추가의 프로모터는 문헌["Useful proteins from recombinant bacteria", Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94]; 및 [Sambrook et al., 1989, 상동]에 기술되어 있다.
본 발명의 핵산 구조물의 전사를 사상 진균 숙주 세포 내에서 유도하는데 적당한 프로모터의 예로서는, 아스퍼질러스 니듈란스 아세타미다제, 아스퍼질러스 나이저 중성 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 산 안정 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 아와모리 글루코아밀라제(glaA), 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 오라이재 알칼리 프로테아제, 아스퍼질러스 오라이재 트리오스 인산염 이소머라제, 푸사리움 옥시스포럼 트립신 유사 프로테아제(WO 제96/00787호), 푸사리움 베네나텀 아밀로글루코시다제(WO 제00/56900호), 푸사리움 베네나텀 다리아(Daria)(WO 제00/56900호), 푸사리움 베네나텀 퀸(Quinn)(WO 제00/56900호), 리조뮤코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파제, 리조뮤코 미에헤이 아스파르트산 프로티나제, 트리코더마 리세이 베타-글루코시다제, 트리코더마 리세이 셀로비오하이드롤라제 I, 트리코더마 리세이 셀로비오하이드롤라제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 I, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 III, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 IV, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 V, 트리코더마 리세이 자일라나제 I, 트리코더마 리세이 자일라나제 II, 트리코더마 리세이 베타-자일로시다제의 유전자로부터 얻어지는 프로모터와, NA2-tpi 프로모터(아스퍼질리(Aspergilli)에서 중성 알파-아밀라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 변형 프로모터(비번역 리더가 아스퍼질리 내에서 트리오스 인산염 이소머라제를 암호화하는 유전자 유래 비번역 리더로 치환된 것)로서; 이에 관한 비제한적 예로서는 아스퍼질러스 나이저 내에서 중성 알파-아밀라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 변형 프로모터(비번역 리더가 아스퍼질러스 니듈란스 또는 아스퍼질러스 오라이재 내에서 트리오스 인산염 이소머라제를 암호화하는 유전자 유래 비번역 리더로 치환된 것)를 포함함); 및 이것들의 돌연 변이 프로모터, 절단형 프로모터 및 하이브리드 프로모터가 있다.
효모 숙주에 있어서 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지아에 알코올 탈수소 효소/글리세랄데히드-3-인산염 탈수소 효소(ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지아에 트리오스 인산염 이소머라제(TPI), 사카로마이세스 세레비지아에 메탈로티오네인(CUP1) 및 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제의 유전자로부터 얻어진다. 기타 효모 숙주 세포에 유용한 프로모터는 문헌[Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488]에 기술되어 있다.
제어 서열은 또한 숙주 세포에 의해 인지되어 전사를 종결시키는, 적당한 전사 종결 인자 서열일 수도 있다. 상기 종결 인자 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 숙주 세포 내에서 작동하는 임의의 종결 인자가 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 종결 인자는, 아스퍼질러스 니듈란스 안트라닐레이트 합성 효소, 아스퍼질러스 나이저 알파-글루코시다제, 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제 및 푸사리움 옥시스포럼 트립신 유사 프로테아제의 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포의 바람직한 종결 인자는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제, 사카로마이세스 세레비지아에 시토크롬 C(CYC1) 및 사카로마이세스 세레비지아에 글리세랄데히드-3-인산염 탈수소 효소의 유전자로부터 얻어진다. 기타 효모 숙주 세포에 유용한 종결 인자는 문헌[Romanos et al., 1992, 상동]에 기술되어 있다.
제어 서열은 또한 적당한 리더 서열 즉, mRNA의 비번역 영역(숙주 세포에 의한 번역에 중요한 영역)일 수도 있다. 리더 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 숙주 세포 내에서 작동하는 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 리더는 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제 및 아스퍼질러스 니듈란스 트리오스 인산염 이소머라제의 유전자로부터 얻어진다.
효소 숙주 세포에 적당한 리더는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 알코올 탈수소 효소/글리세르알데히드-3-인산염 탈수소 효소(ADH2/GAP)의 유전자로부터 얻어진다.
제어 서열은 또한 폴리아데닐화 서열 즉, 변이체 암호화 서열의 3'-말단에 작동 가능하도록 결합되어 있으며, 이 서열이 전사될 때 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기들을 부가하는 신호로서 숙주 세포에 의해 인지되는 서열일 수도 있다. 숙주 세포 내에서 작동하는 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스퍼질러스 니듈란스 안트라닐레이트 합성 효소, 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 알파-글루코시다제, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제 및 푸사리움 옥시스포럼 트립신 유사 프로테아제의 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌[Guo 및 Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990]에 기술되어 있다.
제어 서열은 또한 변이체의 N-말단에 결합되어 있는 신호 펩티드를 암호화하고, 변이체를 세포의 분비 경로로 유도하는 신호 펩티드 암호화 영역일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열의 5'-말단은 본래 번역 해독 틀 내에서 변이체를 암호화하는 암호화 영역 분절과 결합된 신호 펩티드 암호화 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 암호화 서열의 5'-말단은 암호화 서열에 외래인 신호 펩티드 암호화 영역을 포함할 수 있다. 외래 신호 펩티드 암호화 영역은, 암호화 서열이 본래 신호 펩티드 암호화 영역을 포함하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드 암호화 영역은 간단히 천연 신호 펩티드 암호화 영역을 치환하여, 변이체의 분비를 증가시킬 수 있다. 그러나, 빌현된 변이체를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하는 임의의 신호 펩티드 암호화 영역이 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포용으로서 유용한 신호 펩티드 암호화 서열로서는, 바실러스 NCIB 11837 말토게닉 아밀라제, 바실러스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실러스 리케니포르미스 베타-락타마제 및 바실러스 스테아로서모필러스 알파-아밀라제의 유전자, 바실러스 스테아로서모필러스 중성 프로테아제의 유전자(nprT, nprS, nprM) 및 바실러스 서브틸리스 유전자 prsA로부터 얻어지는 신호 펩티드 암호화 서열이 있다. 추가의 신호 펩티드는 문헌[Simonen 및 Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137]에 기술되어 있다.
사상 진균 숙주 세포용으로서 유용한 신호 펩티드 암호화 서열로서는, 아스퍼질러스 나이저 중성 아밀라제, 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 아밀라제, 휴미콜라 인솔렌스 셀룰라제, 휴미콜라 인솔렌스 엔도글루카나제 V, 휴미콜라 라누기노사 리파제 및 리조뮤코 미에헤이 아스파르트산 프로티나제 유전자로부터 얻어지는 신호 펩티드 암호화 서열이 있다.
효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 인버타제 유전자로부터 얻어진다. 기타 유용한 신호 펩티드 암호화 서열은 문헌[Romanos et al., 1992, 상동]에 기술되어 있다.
제어 서열은 또한 변이체의 N-말단에 위치하는 프로펩티드를 암호화하는 프로펩티드 암호화 영역일 수도 있다. 생성된 폴리펩티드는 전구 효소 또는 프로폴리펩티드(또는 몇몇 경우, 자이모겐)로서 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이며, 프로폴리펩티드로부터 유래하는 프로펩티드의 촉매 작용 또는 자가 촉매 작용에 의한 분해에 의해 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 암호화 영역은 바실러스 서브틸리스 알칼리 프로테아제(aprE), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제(nprT), 마이셀리오프토라 서모필라 라카제(WO 제95/33836호), 리조뮤코 미에헤이 아스파르트산 프로티나제 및 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자의 유전자로부터 얻어질 수 있다.
신호 펩티드 영역과 프로펩티드 영역 둘 다가 변이체의 N-말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 변이체의 N-말단 옆에 위치하고, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 N-말단 옆에 위치한다.
숙주 세포가 생장함에 따라서 상기 변이체의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열을 부가하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예로서는, 화학 자극이나 물리 자극(예를 들어, 조절 화합물의 존재)에 반응하여 유전자를 발현시키거나 발현시키지 않는 것들이 있다. 원핵 생물 시스템 내 조절 시스템으로서는 lac, tac 및 trp 작동 인자 시스템을 포함한다. 효모에 있어서는 ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에 있어서는 아스퍼질러스 나이저 글루코아밀라제 프로모터, 아스퍼질러스 오라이재 TAKA 알파-아밀라제 프로모터 및 아스퍼질러스 오라이재 글루코아밀라제 프로모터가 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예로서는 유전자를 증폭시킬 수 있는 것들이 있다. 진핵 생물 시스템에 있어서, 이와 같은 조절 서열로서는 디하이드로폴레이트 환원 효소 유전자(메토트렉세이트가 존재할 때 증폭됨)와, 메탈로티오네인 유전자(중금속이 존재할 때 증폭됨)를 포함한다. 이와 같은 경우에 있어서, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동 가능하도록 결합될 것이다.
발현 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 그리고 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 다양한 뉴클레오티드 및 제어 서열은 함께 연결되어, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 편의상 삽입된 제한 위치에 삽입하거나 이 제한 위치에서 치환시키는 제한 위치 1개 이상(수 개)을 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 이룰 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 또는 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물을 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터를 제조함에 있어서, 암호화 서열은 벡터 내에 위치하고, 이 암호화 서열은 적당한 발현용 제어 서열과 작동 가능하도록 결합된다.
재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 방법이 수행될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 통상적으로 벡터와, 이 벡터가 도입될 숙주 세포의 혼화성에 좌우될 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 환형 플라스미드일 수 있다.
벡터는 독자적으로 복제 가능한 벡터, 즉 염색체 외 실체(자체의 복제가 염색체의 복제와는 독립적으로 이루어지는 것으로서, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체를 예로 들 수 있음)로서 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 임의의 요소를 포함할 수 있다. 대안적으로 벡터는, 숙주 세포에 도입되었을 때 숙주의 게놈에 통합되어, 이 벡터가 통합된 염색체(들)가 복제될 때 함께 복제되는 것일 수 있다. 뿐만 아니라, 숙주 세포의 게놈에 도입될 완전 DNA 또는 트랜스포손을 모두 포함하는 1개의 벡터나 플라스미드, 또는 2개 이상의 벡터나 플라스미드가 사용될 수 있다.
벡터는 형질 전환, 형질 감염 또는 형질 도입 등이 일어난 세포가 용이하게 선별될 수 있도록 만드는 선별 마커를 1개 이상(수 개) 포함하는 것이 바람직하다. 선별 마커는 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성 및 영양 요구주에 대한 원영양성등을 제공하는 유전자 생산물이다.
박테리아 선별 마커의 예로서는, 바실러스 리케니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스 유래 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예를 들어 암피실린 내성, 클로람페니콜 내성, 카나마이신 내성 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커가 있다. 효모 숙주 세포에 적당한 마커로서는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 및 URA3가 있다. 사상 진균 숙주 세포에 사용되는 선별 마커로서는 amdS(아세타미다제), argB(오르니틴 카바모일 전이 효소), bar(포스피노트리신 아세틸기 전이 효소), hph(하이그로마이신 인산 전이 효소), niaD(니트레이트 환원 효소), pyrG(오로티딘-5'-인산염 탈탄산효소), sC(황산염 아데닐 전이 효소), 및 trpC(안트라닐레이트 합성 효소), 그리고 이와 같은 것들의 균등물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아스퍼질러스 세포에 사용되기 적당한 마커로서는 아스퍼질러스 니듈란스 또는 아스퍼질러스 오라이재의 amdS 및 pyrG 유전자와, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 bar 유전자가 있다.
벡터는, 게놈과는 독립적으로 세포 내에서 벡터를 자발적으로 복제시킬 수 있거나 숙주 세포의 게놈에 벡터를 통합시킬 수 있는 요소(들)를 포함하는 것이 바람직하다.
숙주 세포 게놈으로의 통합에 있어서 벡터는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상동성 또는 비상동성 재조합에 의한 게놈으로의 통합에 사용되는 벡터의 기타 다른 임의의 요소에 의존적일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 상동성 재조합에 의해 염색체(들) 내 정확한 위치(들)에 존재하는 숙주 세포 게놈으로의 통합을 유도하는 부가 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 통합될 요소들이 정확한 위치에 통합될 가능성을 높이기 위해서, 상기 요소들은 충분한 수의 핵산(상응하는 표적 서열과의 동일성이 높아서, 상동성 재조합의 성공 확률이 높은 핵산), 예를 들어 100개 내지 10,000개 염기쌍, 400개 내지 10,000개 염기쌍, 그리고 800개 내지 10,000개 염기쌍을 포함하여야 한다. 통합될 요소들은 숙주 세포 게놈 내 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 뿐만 아니라, 통합될 요소들은 비암호화 뉴클레오티드 서열 또는 암호화 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 다른 한편, 벡터는 비상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
자가 복제를 위해, 벡터는 추가로 복제원(벡터가 미지의 숙주 세포 내에서 자발적으로 복제할 수 있도록 해주는 것)을 포함할 수 있다. 복제원은 자가 복제를 매개하는 것으로서 세포 내에서 작동되는 임의의 플라스미드 복제 인자(plasmid replicator)일 수 있다. "복제원" 또는 "플라스미드 복제 인자"란 용어는, 플라스미드 또는 벡터가 생체 내에서 복제될 수 있도록 해주는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
박테리아 복제원의 예로서는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177 및 pACYC184(이.콜라이 내에서 복제 가능), 그리고 pUB110, pE194, pTA1060 및 pAMβ1(바실러스 내에서 복제 가능)의 복제원이 있다.
효모 숙주 세포 내에서 사용되는 복제원의 예로서는 2 마이크론 복제원, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합, 그리고 ARS4와 CEN6의 조합이 있다.
사상 진균 세포용으로서 유용한 복제원의 예로서는 AMA1 및 ANS1이 있다(Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et ai, 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 제00/24883호). AMA1 유전자의 분리와, 이 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구성은 WO 제00/24883호에 개시된 방법에 따라서 이루어질 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 복사체 1개 이상이 숙주 세포에 삽입될 수 있는데, 그 결과 변이체의 생산이 촉진될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 복사체 수의 증가는, 서열의 부가 복사체 1개 이상을 숙주 세포 게놈에 통합시키거나 또는 증폭 가능한 선별 마커 유전자를 폴리뉴클레오티드와 함께 포함시킴으로써(세포가 선별 마커 유전자 복사체를 다수 개 포함하는 경우) 얻어질 수 있으며, 이로써 폴리뉴클레오티드 부가 복사체들은 적당한 선별 제제의 존재 하에 세포들을 배양함으로써 선별될 수 있다.
상기된 요소들을 결찰하여 본 발명의 재조합 발현 벡터를 구성함으로써 실질적으로 순수한 변이체를 얻는데 사용되는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989, 상동] 참조).
숙주 세포
본 발명은 또한 1개 이상(수 개)의 제어 서열(본 발명의 변이체 생산을 유도하는 서열)에 작동 가능하도록 결합되어 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조물 또는 벡터는 숙주 세포에 도입되고, 그 결과 구조물 또는 벡터는 염색체 통합 인자(chromosomal integrant) 또는 전술된 바와 같은 자가 복제 염색체외 벡터로서 유지된다. "숙주 세포"란 용어는 복제시 발생한 돌연 변이로 인하여 부모 세포와 동일하지 않게 된, 부모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 변이체와 이의 공급원을 암호화하는 유전자에 따라서 광범위하게 이루어질 것이다.
숙주 세포는 변이체를 재조합적으로 생산하는데 유용한 임의의 세포, 예를 들어 원핵 생물 세포 또는 진핵 생물 세포일 수 있다.
원핵 생물 숙주 세포는 임의의 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 그람 양성 박테리아로서는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 지오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그람 음성 박테리아로서는 캄필로박터, 이.콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라 및 우레아플라스마를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
박테리아 숙주 세포는 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리크패이션스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시, 바실러스 코아귤란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 로투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 퓨밀러스, 바실러스 스테아로서모필러스, 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 임의의 바실러스 세포일 수 있다.
박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토코커스 에퀴시밀리스, 스트렙토코커스 피오제네스, 스트렙토코커스 우베리스 및 스트렙토코커스 에퀴 아종 주에피데미쿠스 세포를 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 임의의 스트렙토코커스 세포일 수도 있다.
박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토마이세스 아크로모제네스, 스트렙토마이세스 아버미틸리스, 스트렙토마이세스 코엘리칼라, 스트렙토마이세스 그리세우스 또는 스트렙토마이세스 리비단스 세포를 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 스트렙토마이세스 세포일 수 있다.
DNA를 바실러스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 원형질체 형질 전환(예를 들어, 문헌[Chang 및 Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115] 참조), 수용성 세포 사용법(예를 들어, 문한[Young 및 Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829], 또는 [Dubnau 및 Davidoff-Abelson, 1971 , J. Mol. Biol. 56: 209-221] 참조), 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Shigekawa 및 Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751] 참조) 또는 접합(예를 들어, 문헌[Koehler 및 Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 이.콜라이 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 원형질체 형질 전환(예를 들어, 문헌[Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580] 참조) 또는 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 스트렙토마이세스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 원형질체 형질 전환 및 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405] 참조), 접합(예를 들어 문헌[Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585] 참조) 또는 형질 도입(예를 들어, 문헌[Burke et al., 2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 슈도모나스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391 -397] 참조) 또는 접합(예를 들어, 문헌[Pinedo 및 Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA를 스트렙토코커스 세포에 도입하는 것은, 예를 들어 본연의 수용능(natural competence)을 이용하는 방법(예를 들어, 문헌[Perry 및 Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297] 참조), 원형질체 형질 전환(예를 들어, 문헌[Catt 및 Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070] 참조), 전기 천공법(예를 들어, 문헌[Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804] 참조) 또는 접합(예를 들어, 문헌[Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 당업계에 알려진 임의의 방법으로서 DNA를 숙주 세포에 도입하는 방법이 사용될 수 있다.
숙주 세포는 또한 진핵 생물, 예를 들어 포유 동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포일 수도 있다.
숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본원에 사용된 "진균"에는, 아스코마이코타(Ascomycota), 바시디오마이코타(Basidiomycota), 키트리디오마이코타(Chytridiomycota) 및 자이고마이코타(Zygomycota) 문, 그리고 우마이코타(Oomycota) 및 모든 불완전 진균(mitosporic fungi)(문헌[Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의된 바와 같음)이 포함된다.
진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본원에 사용된 "효모"에는 자낭 포자 형성 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자 포자 효모 및 불완전 진균에 속하는 효모(블라스토마이세테스(Blastomycetes))를 포함한다. 효모의 분류법은 앞으로 바뀔수 있으므로, 본 발명에 의하면 효모는 문헌["Biology and Activities of Yeast", Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980]에 기술된 바와 같이 정의되어야 할 것이다.
효모 숙주 세포는 칸디다, 한세뉼라(Hansenula), 클루이베로마이세스, 피치아, 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스 또는 야로위아 세포, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스버겐시스, 사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 디아스타티쿠스, 사카로마이세스 도우글라시, 사카로마이세스 클루이베리, 사카로마이세스 노르벤시스, 사카로마이세스 오비포르미스 또는 야로위아 리폴리티카 세포일 수 있다.
진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"으로서는 아문 유마이코타 및 우마이코타에 속하는 모든 사상 진균(문헌[Hawksworth et al., 1995, 상동]에 정의된 바와 같음)을 포함한다. 사상 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 기타 다른 복합 다당체로 구성된 균사벽에 의해 특징지어진다. 영양 생장은 균사가 연장됨에 따른 것이고, 탄소 이화 작용은 절대 호기적이다. 이와는 대조적으로, 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에에 의한 영양 생장은 단일 세포 엽상체의 출아에 의해 이루어지고, 탄소 이화 작용은 발효일 수 있다.
사상 진균 숙주 세포는 아크레모니움, 아스퍼질러스, 오레오바시디움, 비저칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스, 크리소스포리움, 코프리누스(Coprinus), 코리올러스(Coriolus), 크립토코커스, 필리바시디움, 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테, 뮤코, 미셀리오프토라, 네오칼리마스틱스, 뉴로스포라, 파에실로마이세스, 페니실리움, 파네로카에테, 플레비아(Phlebia), 피로마이세스, 플루로투스(Pleurotus), 쉬조필럼, 탈라로마이세스, 서모아스쿠스, 티엘라비아, 톨리포클라디움, 트라메테스(Trametes) 또는 트리코더마 세포일 수 있다.
예를 들어 사상 진균 숙주 세포는 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 포에티두스, 아스퍼질러스 퓨미가투스, 아스퍼질러스 자포니쿠스, 아스퍼질러스 니듈란스, 아스퍼질러스 나이저, 아스퍼질러스 오라이재, 비저칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 파노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브버미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스, 크리소스포리움 케라티노필럼, 크리소스포리움 루크노웬스, 크리소스포리움 머다리움, 크리소스포리움 파니콜라, 크리소스포리움 퀸스랜디큠, 크리소스포리움 트로피큠, 크리소스포리움 조나튬, 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올러스 허수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스, 푸사리움 세레알리스, 푸사리움 크룩웰렌스, 푸사리움 큘모럼, 푸사리움 그라미네아럼, 푸사리움 그라미넘, 푸사리움 헤테로스포럼, 푸사리움 네건디, 푸사리움 옥시스포럼, 푸사리움 레티큘라텀, 푸사리움 로세움, 푸사리움 샘부시넘, 푸사리움 사르코크로움, 푸사리움 스포로트리키오이데스, 푸사리움 설푸레움, 푸사리움 토룰로세움, 푸사리움 트리코테시오이데스, 푸사리움 베네나텀, 휴미콜라 인솔렌스, 휴미콜라 라누기노사, 뮤코 미에헤이, 마이셀리오프토라 서모필라, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 퍼퓨로제넘, 파네로카에테 크리소스포리움, 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플루로터스 에린지이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스, 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 버시칼라(Trametes versicolor), 트리코더마 하지아넘, 트리코더마 코닌지, 트리코더마 론지브라키아텀, 트리코더마 리세이 또는 트리코더마 비리드 세포일 수 있다.
진균 세포는 원형질체를 형성하는 단계, 원형질체를 형질 전환시키는 단계 및 그 자체로서 알려져 있는 방식으로 세포벽을 재생시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 형질 전환될 수 있다. 아스퍼질러스 및 트리코더마 숙주 세포를 형질 전환하는데 적당한 방법들은 EP 제238023호 및 문헌[Yelton et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474]에 기술되어 있다. 푸사리움 종을 형질 전환하는데 적당한 방법들은 문헌[Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156], 및 WO 제96/00787호에 기술되어 있다. 효모는 문헌[Becker 및 Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York]; [Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163]; 및 [Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920]에 기술된 방법을 통하여 형질 전환될 수 있다.
제조 방법
본 발명은 또한 (a) 변이체 발현에 적당한 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 변이체 제조 방법에 관한 것이다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 방법을 통하여 변이체를 제조하는데 적당한 영양 배지 중에서 배양된다. 예를 들어 세포는 진탕 플라스크 배양, 또는 실험실이나 산업용 발효조 내 폴리펩티드가 발현 및/또는 분리될 수 있는 조건 하에 적당한 배지 중에서 수행되는 소규모 또는 대규모 발효(연속, 회분식, 유가 또는 고상 발효 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 탄소와 질소 공급원, 그리고 무기염을 포함하는 적당한 영양 배지 중에서 이루어진다. 적당한 배지는 상업상 공급처로부터 구입되거나, 또는 (예를 들어, 미국 모식균 배양 수집소 카탈로그에) 공개된 조성물로부터 제조될 수 있다. 만일 변이체가 영양 배지에 분비되면, 변이체는 이 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 만일 변이체가 영양 배지에 분비되지 않는다면, 변이체는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
변이체는 당업계에 공지된 방법으로서 변이체에 특이적인 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 이와 같은 검출 방법은 특이 항체를 사용하는 것, 효소 산물을 생성하는 것, 또는 효소 기질이 없어지는 것을 살피는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어 효소 분석법은 변이체의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
변이체는 당업계에 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들어 변이체는 수집, 원심 분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 통상의 방법을 통하여 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
변이체는 실질적으로 순수한 변이체를 얻기 위한 방법으로서, 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 크기별 배제 크로마토그래피), 전기 영동법(예를 들어, 예비적 등전점 전기 영동법), 용해도 차이를 이용하는 방법(예를 들어, 황산암모늄 침전법), SDS-PAGE 또는 추출(예를 들어, 문헌[Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조](이에 한정되는 것은 아님)을 통하여 정제될 수 있다.
대안적인 양태에서, 변이체는 회수되지 않고, 이 변이체를 발현하는 본 발명의 숙주 세포가 변이체 공급원으로 사용된다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 조성물에는 이와 같은 변이체가 증가되어 존재한다. "증가되어 존재하는"이란 용어는, 조성물의 알파-아밀라제 활성이 증가되었음(증가 팩터 = 1.1)을 의미한다.
본 발명의 조성물은 주요 효소 성분으로서 변이체를 포함할 수 있다(예를 들어, 1 성분 조성물). 대안적으로, 본 발명의 조성물은 다수의 효소 활성(예를 들어, 아미노펩티다제, 아밀라제, 탄수화물 가수 분해 효소, 카복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 사이클로덱스트린 글리코실 전이 효소, 데옥시리보뉴클레아제, 에스터라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 할로퍼옥시다제, 인버타제, 라카제, 리파제, 만노시다제, 옥시다제, 펙틴 분해 효소, 펩티도글루타미나제, 퍼옥시다제, 피타제, 폴리페놀옥시다제, 단백 분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나제 또는 자일라나제 활성)을 가질 수 있다. 추가 효소(들)는, 예를 들어 아스퍼질러스 속에 속하는 미생물, 예를 들어 아스퍼질러스 아큘레아투스, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 포에티두스, 아스퍼질러스 퓨미가투스, 아스퍼질러스 자포니쿠스, 아스퍼질러스 니듈란스, 아스퍼질러스 나이저 또는 아스퍼질러스 오라이재; 푸사리움 속에 속하는 미생물, 예를 들어 푸사리움 박트리디오이데스, 푸사리움 세레알리스, 푸사리움 크룩웰렌스, 푸사리움 큘모럼, 푸사리움 그라미네아럼, 푸사리움 그라미넘, 푸사리움 헤테로스포럼, 푸사리움 네건디, 푸사리움 옥시스포럼, 푸사리움 레티큘라텀, 푸사리움 로세움, 푸사리움 샘부시넘, 푸사리움 사르코크로움, 푸사리움 설푸레움, 푸사리움 토룰로세움, 푸사리움 트리코테시오이데스 또는 푸사리움 베네나텀; 휴미콜라 속에 속하는 미생물, 예를 들어 휴미콜라 인솔렌스 또는 휴미콜라 라누기노사; 또는 트리코더마 속에 속하는 미생물, 예를 들어 트리코더마 하지아넘, 트리코더마 코닌지, 트리코더마 론지브라키아텀, 트리코더마 리세이 또는 트리코더마 비리드에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있으며, 액체나 무수 조성물의 형태를 가질 수 있다. 예를 들어 본 발명의 조성물은 과립이나 미소 과립의 형태를 가질 수 있다. 변이체는 당업계에 공지된 방법들에 따라서 안정화될 수 있다.
세제 조성물
하나의 구체예에서, 본 발명은 1개 이상의 추가 세정 조성물의 성분들과 함께 본 발명의 효소를 포함하는 세제 조성물에 관한다.
추가 성분들의 선택은 당업자의 능력 범위 안에 있으며, 이와 같은 추가 성분으로서는 통상의 성분들, 예를 들어 이하에 제시된 바와 같은 비제한적으로 예시된 성분들을 포함한다. 성분들의 선택은, 섬유 관리용인지 여부, 아니면 세정될 섬유의 유형, 오염물의 종류 및/또는 오염 정도, 세정이 행하여지는 온도, 그리고 세제 제품의 조성을 고려하여 이루어질 수 있다. 이하 예시된 성분들은 구체적인 기능에 따라서 일반 표제에 의해 분류되지만, 당업자에 의해 이해될 바와 같이 이와 같은 성분은 추가 기능들도 포함할 수 있으므로 상기 분류는 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 효소
본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 세제 조성물에 세척액 1리터당 단백질 0.001㎎ 내지 100㎎에 해당하는 양, 예를 들어 단백질 0.01㎎ 내지 100㎎에 해당하는 양, 바람직하게는 단백질 0.005㎎ 내지 50㎎에 해당하는 양, 더 바람직하게는 단백질 0.01㎎ 내지 25㎎에 해당하는 양, 훨씬 더 바람직하게는 단백질 0.05㎎ 내지 10㎎에 해당하는 양, 가장 바람직하게는 단백질 0.05㎎ 내지 5㎎에 해당하는 양, 그리고 가장 바람직하게는 단백질 0.01㎎ 내지 1㎎에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 세제 조성물의 효소(들)는 통상의 안정화제, 예를 들어 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤, 당 또는 당 알코올, 젖산, 붕산 또는 붕산 유도체, 예를 들어 방향족 붕산염 에스테르, 또는 페닐 보론산 유도체, 예를 들어 4-포르밀페닐 보론산을 사용하여 안정화될 수 있으며, 이 조성물은 예를 들어 WO 제92/19709호 및 WO 제92/19708호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 본원에 참고용으로 인용되어 있는 WO 제97/07202호에 개시된 세제 조성물에 혼입될 수도 있다.
계면 활성제
본 발명의 세제 조성물은 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 비이온성 및/또는 반극성 및/또는 양쪽 이온성 계면 활성제 1개 이상 또는 이것들의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 세제 조성물은 1개 이상의 비이온성 계면활성제와 1개 이상의 음이온성 계면 활성제의 혼합물을 포함한다. 계면 활성제(들)는 통상적으로 약 0.1중량% 내지 60중량%, 예를 들어 약 1중량% 내지 약 40중량%, 또는 약 3중량% 내지 약 20중량%, 또는 약 3중량% 내지 약 10중량%의 수준으로 존재한다. 계면 활성제(들)는 원하는 세정 용도를 바탕으로 선택되며, 당업계에 공지된 통상의 계면 활성제(들)를 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 계면 활성제로서 세탁 세제에 사용되는 것이 사용될 수 있다.
세제가 본 발명의 조성물에 포함될 때, 이 세제는 보통 음이온성 계면 활성제를 약 1중량% 내지 약 40중량%, 예를 들어 약 5중량% 내지 약 30중량%, 예를 들어 약 5중량% 내지 약 15중량%, 또는 약 20중량% 내지 약 25중량% 포함할 것이다. 음이온성 계면 활성제의 비제한적 예로서는 황산염 및 설폰산염, 구체적으로 선형 벤젠설폰산알킬(LAS), LAS의 이성체, 분지형 벤젠설폰산알킬(BASS), 알칸설폰산페닐, 알파-설폰산올레핀(AOS), 설폰산올레핀, 설폰산알켄, 황산알칸-2,3-디일비스, 알칸설폰산하이드록시 및 2설폰산염, 황산알킬(AS), 예를 들어 도데실 황산 나트륨(SDS), 지방 알코올 황산염(FAS), 1차 알코올 황산염(PAS), 알코올 에테르황산염(AES, AEOS 또는 FES, 알코올 에톡시황산염 또는 지방 알코올 에테르 황산염이라고도 알려짐), 2차 설폰산알칸(SAS), 설폰산파라핀(PS), 설폰산에스테르, 설폰화 지방산 글리세롤 에스테르, 알파-설포 지방산 메틸 에스테르(알파-SFMe 또는 SES), 예를 들어 에스테르설폰산메틸(MES), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 도데세닐/테트라데세닐 숙신산(DTSA), 아미노산의 지방산 유도체, 설포-숙신산의 디에스테르 및 모노에스테르 또는 비누, 그리고 이것들의 조합물을 포함한다.
세제가 본 발명의 조성물에 포함될 때, 이 세제는 보통 양이온성 계면 활성제를 약 0중량% 내지 약 40중량% 함유할 것이다. 양이온성 계면 활성제의 비제한적 예로서는 4차 알킬디메틸에탄올아민(ADMEAQ), 브롬화 세틸트리메틸암모늄(CTAB), 염화 디메틸디스테아릴암모늄(DSDMAC) 및 알킬벤질디메틸암모늄과, 이것들의 조합물, 알킬 4차 암모늄 화합물, 아록실화 4차 암모늄(AQA)을 포함한다.
세제가 본 발명의 조성물에 포함될 때, 이 세제는 보통 비이온성 계면 활성제를 약 0.2중량% 내지 약 40중량%, 예를 들어 약 0.5중량% 내지 약 30중량%, 특히 약 1중량% 내지 약 20중량%, 약 3중량% 내지 약 10중량%, 예를 들어 약 3중량% 내지 약 5중량%, 또는 약 8중량% 내지 약 12중량% 포함한다. 비이온성 계면 활성제의 비제한적인 예로서는 에톡실화 알코올(AE 또는 AEO), 프로폭실화 알코올, 프로폭실화 지방 알코올(PFA), 알콕실화 지방산 알킬 에스테르, 예를 들어 에톡실화 및/또는 프로폭실화 지방산 알킬 에스테르, 에톡실화 알킬페놀(APE), 에톡실화 노닐페놀(NPE), 알킬폴리글리코시드(APG), 알콕실화 아민, 지방산 모노에탄올아미드(FAM), 지방산 디에탄올아미드(FADA), 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드(EFAM), 프로폭실화 지방산 모노에탄올아미드(PFAM), 폴리하이드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실 N-알킬 유도체(글루카미드, GA 또는 지방산 글루카미드, FAGA), 그리고 상품명 스판(SPAN) 및 트윈(TWEEN)으로 시판중인 제품과, 이것들의 조합물을 포함한다.
세제가 본 발명의 조성물에 포함될 때, 이 세제는 보통 반극성 계면 활성제를 약 0중량% 내지 약 40중량% 포함할 것이다. 반극성 계면 활성제의 비제한적 예로서는 산화아민(AO), 예를 들어 산화 알킬디메틸아민, 산화 N-(코코알킬)-N,N-디메틸아민 및 산화 N-(수지-알킬)-N,N-비스(2-하이드록시에틸)아민, 지방산 알카놀아미드 및 에톡실화 지방산 알카놀아미드와, 이것들의 조합물을 포함한다.
세제가 본 발명의 조성물에 포함될 때, 이 세제는 보통 양쪽 이온성 계면 활성제를 약 0중량% 내지 약 40중량% 포함할 것이다. 양쪽 이온성 계면 활성제의 비제한적 예로서는 베타인, 알킬디메틸베타인, 설포베타인 및 이것들의 조합물을 포함한다.
향수성 물질
향수성 물질은 수용액 중에 소수성 화합물을 용해시키는(또는 이와 반대로, 비극성 환경 중에 극성 물질을 용해시키는) 화합물이다. 통상적으로 향수성 물질은 친수성 및 소수성 두 가지 성질을 모두 가지지만(소위 계면 활성제의 양쪽성); 향수성 물질의 분자 구조는 보통 자발적인 자가 응집성에 유리하지는 않다(예를 들어, 문헌[Hodgdon 및 Kaler(2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128] 참조). 향수성 물질은, 미셀, 라멜라 또는 기타 다른 정의가 잘된 중간 상을 형성하는 지질과 계면 활성제에서 확인되는 바와 같이, 임계 농도 이상의 농도로 존재할 경우 자가 응집 현상을 일으키지 않는다. 그 대신, 다수의 향수성 물질들은 그 농도가 증가함에 따라서 응집체 크기가 증가하는 연속형 응집 과정을 보인다. 그러나, 다수의 향수성 물질들은 상 거동, 안정성, 그리고 극성 및 무극성 물질을 함유하는 시스템, 예를 들어 물, 오일, 계면 활성제 및 중합체의 혼합물의 콜로이드 특성을 바꾼다. 향수성 물질은 제약업계, 개인 캐어용품 업계, 식품 업계로부터 기타 기술 분야에 이르기까지 여러 산업 분야에서 통상적으로 사용된다. 향수성 물질을 세제 조성물에 사용하면, 원치 않는 현상, 예를 들어 상 분리 또는 점도 증가가 유도되지 않으면서, 예를 들어 (물을 제거하여 액체 세제를 조밀화하는 공정에서와 같이) 농도가 더 진한 계면 활성제 제제가 제조될 수 있다.
세제는 향수성 물질을 0중량% 내지 5중량%, 예를 들어 약 0.5중량% 내지 약 5중량%, 또는 약 3중량% 내지 약 5중량% 함유할 수 있다. 세탁용 세제에 사용되는 것으로 당업계에 알려진 임의의 향수성 물질이 사용될 수 있다. 향수성 물질의 비제한적인 예로서는 벤젠설폰산나트륨, p-톨루엔설폰산나트륨(STS), 자일렌설폰산나트륨(SXS), 큐멘설폰산나트륨(SCS), 시멘설폰산나트륨, 산화아민, 알코올 및 폴리글리콜에테르, 하이드록시나프톤산나트륨, 하이드록시나프탈렌설폰산나트륨, 에틸헥실황산나트륨 및 이것들의 조합물을 포함한다.
빌더 ( builder ) 및 코빌더( cobuilder )
본 발명의 세제 조성물은 세제 빌더나 코빌더, 또는 이것들의 혼합물을 약 0중량% 내지 65중량%, 예를 들어 약 10중량% 내지 약 40중량% 함유할 수 있다. 식기 세척용 세제 중 빌더의 함량은 통상적으로 40% 내지 65%, 특히 50% 내지 65%이다. 빌더 및/또는 코빌더는 특히 Ca 및 Mg와 수용성 착물을 생성하는 킬레이트제일 수 있다. 세탁 또는 식기 세척용 세제, 또는 산업용이나 영업용 세정 과정에 사용되는 세제에 사용되는 것으로 당업계에 알려진 임의의 빌더 및/또는 코빌더가 사용될 수 있다. 빌더의 비제한적 예로서는 제올라이트, 이인산염(피로인산염), 삼인산염, 예를 들어 삼인산나트륨(STP 또는 STPP), 탄산염, 예를 들어 탄산나트륨, 가용성 규산염, 예를 들어 메타규산나트륨, 다층 규산염(예를 들어, 획스트(Hoechst)사 SKS-6), 에탄올아민, 예를 들어 2-아미노에탄-1-올(MEA), 이미노디에탄올(DEA), 2, 2', 2"-니트릴로트리에탄올(TEA), 카복시메틸리눌린(CMI) 및 이것들의 조합물을 포함한다.
본 발명의 세제 조성물은 또한 세제 코빌더 또는 이의 혼합물을 0중량% 내지 50중량%, 예를 들어 약 10중량% 내지 약 40중량% 함유할 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은 코빌더만을 함유할 수 있거나, 아니면 이 코빌더와 빌더(예를 들어, 제올라이트 빌더)를 함께 포함할 수도 있다. 코빌더의 비제한적인 예로서는 폴리아크릴레이트들의 동종 중합체 또는 이것들의 공중합체, 예를 들어 폴리(아크릴산)(PAA) 또는 코폴리(아크릴산/말레산)(PAA/PMA)을 포함한다. 추가의 비제한적 예로서는 시트르산염, 킬레이트화제, 예를 들어 아미노카복실산염, 아미노폴리카복실산염 및 포스폰산염, 그리고 알킬- 또는 알케닐숙신산을 포함한다. 추가 구체예로서는 2, 2', 2"-니트릴로트리아세트산(NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 이미노디숙신산(IDS), 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산(EDDS), 메틸글리신디아세트산(MGDA), 글루탐산-N,N-디아세트산(GLDA), 1-하이드록시에탄-1,1-디일비스(포스폰산)(HEDP), 에틸렌디아민테트라키스(메틸렌)테트라키스(포스폰산)(EDTMPA), 디에틸렌트리아민펜타키스(메틸렌)펜타키스(포스폰산)(DTPMPA), N-(2-하이드록시에틸)이미노디아세트산(EDG), 아스파르트산-N-모노아세트산(ASMA), 아스파르트산-N,N-디아세트산(ASDA), 아스파르트산-N-모노프로피온산(ASMP), 이미노디숙신산(IDA), N-(2-설포메틸)아스파르트산(SMAS), N-(2-설포에틸)아스파르트산(SEAS), N-(2-설포메틸)글루탐산(SMGL), N-(2-설포에틸)글루탐산(SEGL), N-메틸이미노디아세트산(MIDA), α-알라닌-N,N-디아세트산(α-ALDA), 세린-N,N-디아세트산(SEDA), 이소세린-N,N-디아세트산(ISDA), 페닐알라닌-N,N-디아세트산(PHDA), 안트라닐산-N,N-디아세트산(ANDA), 설파닐산-N,N-디아세트산(SLDA), 타우린-N,N-디아세트산(TUDA), 설포메틸-N,N-디아세트산(SMDA), 에틸리덴디아민트리아세트산 N-(하이드록시에틸)(HEDTA), 디에타놀글리신(DEG), 디에틸렌트리아민 펜타(메틸렌 포스폰산)(DTPMP), 아미노트리스(메틸렌포스폰산)(ATMP) 및 이것들의 조합물과 염을 포함한다. 빌더 및/또는 코빌더의 추가 예는, 예를 들어 WO 제09/102854호 및 US 제5977053호(물때 형성 억제제, 예를 들어 포스폰산염)에 개시되어 있다.
표백 시스템
본 발명의 세제는 표백 시스템을 0중량% 내지 20중량%, 예를 들어 약 0중량% 내지 약 10중량% 함유할 수 있다. 임의의 표백 시스템으로서 세탁 + 식기 세척 + I&I 세제에 사용되는 것으로 당업계에 알려진 것이 사용될 수 있다. 적당한 표백 시스템 성분으로서는 표백 촉매, 광표백제, 표백 활성화제, 과산화수소 공급원, 예를 들어 과탄산나트륨 및 과붕산나트륨, 예비 생성된 과산 및 이것들의 혼합물을 포함한다. 예비 생성된 과산으로서 적당한 것은 과산화카복실산 및 염, 과탄산 및 염, 과이미드산 및 염, 과산화일황산 및 염, 예를 들어 옥손(Oxone; R) 및 이것들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표백 시스템의 비제한적 예로서는 과산화물 기반 표백 시스템(예를 들어, 무기염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 예를 들어 과붕산염의 나트륨염(일반적으로 일수화물 또는 사수화물), 과탄산염, 과황산염, 과인산염, 과규산염을 포함할 수 있음)뿐만 아니라, 과산 생성 표백 활성화제를 포함한다. 본원에서 표백 활성화제란, 과산화수소와 같은 과산소 표백제와 반응하여 과산을 생성하는 화합물을 의미한다. 이와 같이 생성된 과산은 활성화된 표백제를 이룬다. 본원에 사용되기에 적당한 표백 활성화제로서는 에스테르 아미드, 이미드 또는 무수물 군에 속하는 것들을 포함한다. 이에 관한 적당한 예로서는 테트라세틸 아틸렌 디아민(TAED), 설폰산 나트륨 3,5,5 트리메틸헥사노일옥시벤젠, 디퍼옥실 도데카논산, 벤젠설폰산 4-(도데카노일옥시)(LOBS), 벤젠설폰산 4-(데카노일옥시), 벤조산 4-(데카노일옥시)(DOBS), 벤젠설폰산 4-(3,5,5-트리메틸헥사노일옥시)(ISONOBS), 테트라아세틸에틸렌디아민(TAED) 및 벤젠설폰산 4-(노나노일옥시)(NOBS) 및/또는 WO 제98/17767호에 개시된 것들이 있다. 관심 있는 표백 활성화제의 특정 군은 EP 제624154호에 개시되어 있으며, 상기 군은 시트르산 아세틸트리에틸(ATC)이라는 점에서 특히 바람직하다. ATC 또는 짧은 사슬 트리글리세라이드, 예를 들어 트리아신은 추후 시트르산과 알코올로 분해되므로 환경 친화적이라는 이점이 있다. 뿐만 아니라, 시트르산 아세틸트리에틸 및 트리아세틴은 보관시 제품 중 가수 분해에 대한 안정성이 우수하고, 효율적인 표백 활성화제이다. 마지막으로, ATC는 세탁용 첨가제에 우수한 조제 능력(building capacity)을 제공한다. 대안적으로 표백 시스템은, 예를 들어 아미드, 이미드 또는 설폰류의 과산화산을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 과산, 예를 들어 6-(프탈로일아미노)과카프론산(PAP)을 포함할 수도 있다. 표백 시스템은 또한 표백 촉매를 포함할 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 표백 성분은 다음과 같은 화학식을 가지는 유기 촉매들
Figure pct00002
(상기 식중, R1은 각각 독립적으로 9개 내지 24개의 탄소를 함유하는 분지형 알킬기 또는 11개 내지 24개의 탄소를 함유하는 선형 알킬기이고, 바람직하게, R1은 각각 독립적으로 9개 내지 18개의 탄소를 함유하는 분지형 알킬기 또는 11개 내지 18개의 탄소를 함유하는 선형 알킬기이며, 더 바람직하게, R1은 각각 독립적으로 2-프로필헵틸, 2-부틸옥틸, 2-펜틸노닐, 2-헥실데실, n-도데실, n-테트라데실, n-헥사데실, n-옥타데실, 이소-노닐, 이소-데실, 이소-트리데실 및 이소-펜타데실로 이루어진 군으로부터 선택됨)
(iii) 상기 (i) 및 (ii)의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 촉매일 수 있다. 기타 다른 예시적인 표백 시스템은, 예를 들어 WO 제2007/087258,호 WO 제2007/087244호, WO 제2007/087259호, WO 제2007/087242호에 기술되어 있다. 적당한 광표백제는, 예를 들어 설폰화 아연 프탈로시아닌일 수 있다.
중합체
세제는 중합체를 0중량% 내지 10중량%, 예를 들어 0.5중량% 내지 5중량%, 2중량% 내지 5중량%, 0.5중량% 내지 2중량% 또는 0.2중량% 내지 1중량% 함유할 수 있다. 당업계에 세탁, 식기 세척 및 I&I 세제에 사용되는 것으로 알려진 임의의 중합체가 사용될 수 있다. 상기 중합체는 상기 기술된 바와 같은 코빌더로서 작용을 할 수 있거나, 아니면 재부착 방지 특성, 섬유 보호 특성, 오염물 탈락 특성, 염료 전사 억제 특성 및/또는 기름때 세정 특성을 제공할 수 있다. 예시적 재부착 방지 중합체로서는 (카복시메틸)셀룰로스(CMC), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(비닐피롤리돈)(PVP), 폴리(에틸렌글리콜) 또는 폴리산화에틸렌(PEG), 에톡실화 폴리(에틸렌이민), 폴리카복실레이트, 예를 들어 PAA, PAA/PMA 및 메타크릴산라우릴/아크릴산 공중합체를 포함한다. 예시적 섬유 보호 중합체로서는 소수성으로 변형된 CMC(HM-CMC) 및 실리콘을 포함한다. 예시적 오염물 탈락 중합체로서는 테레프탈산 및 올리고머 글리콜의 공중합체를 포함한다. 예시적 염료 전사 억제 중합체로서는 PVP, 폴리(비닐이미다졸)(PVI) 및 폴리산화비닐피리딘-N(PVPO 또는 PVPNO)을 포함한다. 기타 다른 예시적 중합체는, 예를 들어 WO 제2006/130575호에 개시되어 있다.
섬유 색상 부여제
본 발명의 세제 조성물은 또한 세제 조성물 중에 제제화될 때 섬유 표면상에 침착될 수 있는 섬유 색상 부여제, 예를 들어 염료 또는 안료를 포함할 수도 있다(이 경우, 섬유가 상기 세제 조성물을 포함하는 세척액과 접촉되면 가시 광선의 흡수/반사를 통해 상기 섬유의 색이 바뀜). 형광 증백제는 적어도 일부 가시 광선을 방사한다. 이와는 반대로, 섬유 색상 부여제는 이것이 가시 광선 스펙트럼의 적어도 일부를 흡수할 때 표면의 색을 바꾸어준다. 적당한 섬유 색상 부여제로서는 염료와 염료-점토 접합물을 포함하며, 또한 안료도 포함할 수 있다. 적당한 염료는 소분자 염료와 중합체 염료를 포함한다. 적당한 소분자 염료는 색 지수(C.I.) 분류군상 다이렉트 블루(Direct Blue), 다이렉트 레드(Direct Red), 다이렉트 바이올렛(Direct Violet), 액시드 블루(Acid Blue), 액시드 레드(Acid Red), 액시드 바이올렛(Acid Violet), 베이직 블루(Basic Blue), 베이직 바이올렛(Basic Violet) 및 베이직 레드(Basic Red)에 속하는 염료들로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자 염료들, 또는 이것들의 혼합물, 예를 들어 WO 제2005/03274호, WO 제2005/03275호, WO 제2005/03276호 및 EP 제1876226호(본원에 참조로 포함되어 있음)에 기술된 것들을 포함한다. 본 발명의 세제 조성물은 바람직하게 섬유 색상 부여제를 약 0.00003중량% 내지 약 0.2중량%, 약 0.00008중량% 내지 약 0.05중량% 또는 약 0.0001중량% 내지 약 0.04중량% 포함한다. 상기 조성물은 섬유 색상 부여제를 0.0001중량% 내지 0.2중량% 포함할 수 있는데, 이는 이 조성물이 단위 투여용 파우치의 형태를 가질 때 특히 바람직할 수 있다. 적당한 색상 부여제는 예를 들어 WO 제2007/087257호 및 WO 제2007/087243호에도 개시되어 있다.
(추가) 효소
세제 첨가제와 세제 조성물은 [추가] 효소들, 예를 들어 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 탄수화물 가수 분해 효소, 셀룰라제, 펙티나제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 예를 들어 라카제 및/또는 퍼옥시다제를 1개 이상 포함할 수 있다.
일반적으로, 선별된 효소(들)의 특성들은 선택된 세제의 특성과 양립될 수 있어야 하고(즉, 최적 pH, 기타 다른 효소 성분 및 비 효소 성분과의 혼화성 등), 이 효소(들)는 유효량으로 존재하여야 한다.
셀룰라제 : 적당한 셀룰라제로서는 박테리아 또는 진균 유래의 것들을 포함한다. 화학 변형 돌연 변이체 또는 단백질 조작 돌연 변이체도 포함된다. 적당한 셀룰라제로서는 바실러스, 슈도모나스, 휴미콜라, 푸사리움, 티엘라비아, 아크레모니움 속으로부터 유래되는 셀룰라제, 예를 들어 휴미콜라 인솔렌스, 마이셀리오프토라 서모필라 및 푸사리움 옥시스포럼(US 제4,435,307호, US 제5,648,263호, US 제5,691,178호, US 제5,776,757호 및 WO 제89/09259호에 개시됨)으로부터 생산된 진균 셀룰라제를 포함한다.
특히 적당한 셀룰라제로서는 (섬유의) 색상을 보호해 주는 이점(color care benefit)을 가지는 알칼리성 또는 중성 셀룰라제가 있다. 이와 같은 셀룰라제의 예로서는 EP 제0 495 257호, EP 제0 531 372호, WO 제96/11262호, WO 제96/29397호 및 WO 제98/08940호에 기술된 셀룰라제가 있다. 기타 다른 예로서는 셀룰라제 변이체, 예를 들어 WO 제94/07998호, EP 제0 531 315호, US 제5,457,046호, US 제5,686,593호, US 제5,763,254호, WO 제95/24471호, WO 제98/12307호 및 PCT/DK98/00299호에 기술된 것들이 있다.
시판중인 셀룰라제로서는 셀루자임(Celluzyme)™, 케어자임(Carezyme)™(노보자임스 A/S(Novozymes A/S)), 클라지나제(Clazinase)™, 퓨라닥스 HA(Puradax HA)™(제넨코 인터내셔날 인코포레이션(Genencor International Inc.)) 및 KAC-500(B)™(카오 코포레이션(Kao Corporation))를 포함한다.
프로테아제: 적당한 프로테아제로서는 동물, 식물, 미생물 기원의 것들을 포함한다. 미생물 기원의 것이 바람직하다. 화학 변형 돌연 변이체 또는 단백질 조작 돌연 변이체가 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 바람직하게는 알칼리성 미생물 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리성 프로테아제의 예로서는 서브틸리신, 특히 바실러스로부터 유래되는 것들, 예를 들어 서브틸리신 노보, 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168(WO 제89/06279호에 기술됨)이 있다. 트립신 유사 프로테아제의 예로서는 트립신(예를 들어, 돼지나 소로부터 기원된 트립신) 및 푸사리움 프로테아제(WO 제89/06270호 및 WO 제94/25583호에 기술됨)가 있다.
유용한 프로테아제의 예로서는 WO 제92/19729호, WO 제98/20115호, WO 제98/20116호 및 WO 제98/34946호에 기술된 변이체, 특히 27번, 36번, 57번, 76번, 87번, 97번, 101번, 104번, 120번, 123번, 167번, 170번, 194번, 206번, 218번, 222번, 224번, 235번 및 274번 위치 중 1개 이상에 치환이 일어난 변이체가 있다.
시판중인 프로테아제 효소로서 바람직한 것으로서는 알칼라제(Alcalase)™, 사비나제(Savinase)™, 프리마제(Primase)™, 듀랄라제(Duralase)™, 에스페라제(Esperase)™, 칸나제(Kannase)™(노보자임스 A/S), 막사타제(Maxatase)™, 막사칼(Maxacal)™, 막사펨(Maxapem)™, 프로페라제(Properase)™, 퓨라펙트(Purafect)™, 퓨라펙트 OxP™, FN2™ 및 FN3™(제넨코 인터내셔날 인코포레이션)를 포함한다.
리파제 : 적당한 리파제로서는 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함한다. 화학 변형 돌연 변이체 또는 단백질 조작 돌연 변이체가 포함된다. 유용한 리파제의 예로서는 휴미콜라(이명: 서모마이세스(Thermomyces)), 예를 들어 에이치.라누기노사(티.라누기노서스) 유래 리파제(EP 제258 068호 및 EP 제305 216호에 기술됨), 에이치.인솔렌스 유래 리파제(WO 제96/13580호에 기술됨), 슈도모나스 리파제, 예를 들어 피.알칼리제네스 또는 피.슈도알칼리제네스 유래 리파제(EP 제218 272호), 피.세파시아(P. cepacia) 유래 리파제(EP 제331 376호), 피.스투체리(P. stutzeri) 유래 리파제(GB 제1,372,034호), 피.플루오레센스 유래 리파제, 슈도모나스 종 균주 SD 705 유래 리파제(WO 제95/06720호 및 WO 제96/27002호), 피.위스콘시넨시스 유래 리파제(WO 제96/12012호), 바실러스 리파제, 예를 들어 비.서브틸리스 유래 리파제(Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), 비.스테아로서모필러스 유래 리파제(JP 제64/744992호) 또는 비.퓨밀러스(B. pumilus) 유래 리파제(WO 제91/16422호)를 포함한다.
기타 다른 예로서는 리파제 변이체, 예를 들어 WO 제92/05249호, WO 제94/01541호, EP 제407 225호, EP 제260 105호, WO 제95/35381호, WO 제96/00292호, WO 제95/30744호, WO 제94/25578호, WO 제95/14783호, WO 제95/22615호, WO 제97/04079호 및 WO 제97/07202호에 기술된 것들이 있다.
시판중인 리파제 효소로서 바람직한 것으로는 리폴라제(Lipolase)™, 리폴라제 울트라(Lipolase Ultra)™ 및 리펙스(Lipex)™(노보자임스 A/S)를 포함한다.
아밀라제: 적당한 아밀라제(α 및/또는 β)로서는 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함한다. 화학 변형 돌연 변이체 또는 단백질 조작 돌연 변이체가 포함된다. 아밀라제로서는, 예를 들어 바실러스, 예를 들어 바실러스 리케니포르미스의 특정 균주로부터 얻어지는 α-아밀라제(이에 관하여는 GB 제1,296,839호에 상세히 기술됨)를 포함한다.
유용한 아밀라제의 예로서는 WO 제94/02597호, WO 제94/18314호, WO 제96/23873호 및/또는 WO 제97/43424호에 기술된 변이체, 특히 15번, 23번, 105번, 106번, 124번, 128번, 133번, 154번, 156번, 181 번, 188번, 190번, 197번, 202번, 208번, 209번, 243번, 264번, 304번, 305번, 391번, 408번 및 444번 위치 중 1개 이상에 치환이 일어난 변이체가 있다.
시판중인 아밀라제로서는 스타인자임(Stainzyme)™, 스타인자임™ 플러스, 나탈라제(Natalase)™, 듀라밀(Duramyl)™, 터마밀(Termamyl)™, 펀가밀(Fungamyl™ 및 BAN™(노보자임스 A/S), 라피다제(Rapidase)™, 파워라제(Powerase)™ 및 퓨라스타(Purastar)™(제넨코 인터내셔날 인코포레이션)가 있다.
퍼옥시다제 / 옥시다제 : 적당한 퍼옥시다제/옥시다제로서는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함한다. 화학 변형 돌연 변이체 또는 단백질 조작 돌연 변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다제의 예로서는 코프리누스, 예를 들어 씨.시네레우스 유래 퍼옥시다제와, 이의 변이체(WO 제93/24618호, WO 제95/10602호 및 WO 제98/15257호에 기술된 것)를 포함한다.
시판중인 퍼옥시다제로서는 가드자임(Guardzyme)™(노보자임스 A/S)을 포함한다.
1개 이상의 효소를 함유하는 별도의 첨가제들을 첨가하거나, 또는 이와 같은 효소들 전부를 포함하는 혼합 첨가제를 첨가함으로써 세제 효소(들)는 본 발명의 세제 조성물 중에 포함될 수 있다. 본 발명의 세제 첨가제, 즉 별도의 첨가제 또는 혼합 첨가제는, 예를 들어 과립, 액체 및 슬러리 등으로서 제형화될 수 있다. 바람직한 세제 첨가제 제형은 과립, 특히 비 비산 과립, 액체, 특히 안정화된 액체 또는 슬러리이다.
비 비산 과립은, 예를 들어 US 제4,106,991호 및 US 제4,661,452호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있으며, 임의로는 당업계에 공지된 방법들에 의해 코팅될 수 있다. 왁스질 코팅재의 예로서는 평균 몰 중량이 1000 내지 20000인 폴리(산화에틸렌) 제품(폴리에틸렌글리콜, PEG); 산화에틸렌 단위 16개 내지 50개를 가지는 에톡실화 노닐페놀; 에톡실화 지방 알코올(알코올은 12개 내지 20개의 탄소 원자를 함유하며, 산화에틸렌 단위는 15개 내지 80개 존재함); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세라이드가 있다. 필름 형성 코팅재로서 유동층 기법에 사용되기 적당한 것의 예는 GB 제1483591호에 제공되어 있다. 액체 효소 제조물은, 예를 들어 확립된 방법들에 따라서, 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알코올, 젖산 또는 붕산을 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 제238,216호에 개시된 방법에 따라서 제조될 수 있다.
부가 재료
세탁, 식기 세척 또는 I&I 세제에 사용되는 것으로 당업계에 알려진 임의의 세제 성분들도 사용될 수 있다. 기타 선택적 세제 성분들로서는 부식 방지제, 수축 방지제, 오염물 재부착 방지제, 구김 방지제, 살균제, 결합제, 부식 억제제, 붕해제/붕해 제제, 염료, 효소 안정화제(붕산, 붕산염, CMC 및/또는 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜 포함), 섬유 유연제, 예를 들어 점토, 충전제/가공 보조제, 형광 증백제/형광 발광제, 거품 촉진제, 거품(비누 거품) 조절제, 향수, 오염물 현탁제, 유연제, 비누 거품 억제제, 변색 억제제 및 심지제 단독 또는 이것들의 조합물을 포함된다. 세탁, 식기 세척 또는 I&I 세제에 사용되는 것으로 당업계에 알려진 임의의 성분도 사용될 수 있다. 이러한 성분들의 선택은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
분산제 : 본 발명의 세제 조성물은 또한 분산제를 함유할 수도 있다. 특히 분말형 세제는 분산제를 포함할 수 있다. 적당한 수용성 유기 재료로서는 동종 중합 또는 공중합 산 또는 이의 염을 포함하는데, 예를 들어 폴리카복실산은 2개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 격리된 카복실 라디칼들을 2개 이상 포함한다. 적당한 분산제는, 예를 들어 문헌[Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.]에 기술되어 있다.
염료 전사 억제제: 본 발명의 세제 조성물은 또한 1개 이상의 염료 전사 억제제를 포함할 수도 있다. 적당한 중합체 염료 전사 억제제로서는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-산화물 중합체, N-비닐피롤리돈과 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈, 폴리비닐이미다졸 또는 이것들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 염료 전사 억제제가 본 발명의 조성물 중에 존재할 때, 이 염료 전사 억제제는 조성물의 중량을 기준으로 약 0.0001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5% 또는 약 0.1% 내지 약 3%의 수준으로 존재할 수 있다.
형광 증백제 : 본 발명의 세제 조성물은 또한 착색된 물품을 선명하게 만들 수 있는 추가 성분들, 예를 들어 형광 증백제 또는 형광 발광제를 함유하는 것이 바람직할 것이다. 형광 발광제가 존재하는 경우, 이 형광 발광제는 약 0.01% 내지 약 0.5%의 수준으로 존재하는 것이 바람직하다. 세탁용 세제 조성물에 사용되기 적당한 임의의 형광 증백제가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 형광 증백제로서는, 디아미노스틸벤-설폰산 유도체, 디아릴피라졸린 유도체 및 비스페닐-디스티릴 유도체 군에 속하는 것들이 있다. 형광 증백제의 디아미노스틸벤-설폰산 유도체류의 예로서는 디설폰산 4,4'-비스-(2-디에탄올아미노-4-아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2'; 디설폰산 4,4'-비스-(2,4-디아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2'; 디설폰산 4,4'-비스-(2-아닐리노-4(N-메틸-N-2-하이드록시-에틸아미노)-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2'; 디설폰산 4,4'-비스-(4-페닐-2,1,3-트리아졸-2-일)스틸벤-2,2'; 디설폰산 4,4'-비스-(2-아닐리노-4(1-메틸-2-하이드록시-에틸아미노)-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤-2,2' 및 설폰산 2-(스틸빌-4"-나프토-1,2':4,5)-1,2,3-트리졸-2"의 나트륨 염들을 포함한다. 바람직한 형광 증백제로서는, 스위스 바젤 소재, 시바-가이기 아게(Ciba-Geigy AG)로부터 시판중인 티노팔(Tinopal) DMS 및 티노팔 CBS가 있다. 티노팔 DMS는 디설폰산 4,4'-비스-(2-모폴리노-4-아닐리노-s-트리아진-6-일아미노)스틸벤의 2나트륨염이다. 티노팔 CBS는 디설폰산 2,2'-비스-(페닐-스티릴)의 2나트륨 염이다. 형광 증백제로서 바람직한 것으로는 시판중인 파라화이트(Parawhite) KX[인도 뭄바이 소재, 파라마운트 미네랄스 앤드 케미컬스(Paramount Minerals and Chemicals)]가 있다. 본 발명에 사용하기 적당한 기타 다른 형광 물질로서는 1-3-디아릴 피라졸린 및 7-알킬아미노쿠마린을 포함한다. 적당한 형광 발광제 수준은, 하한 수준, 약 0.01wt%, 약 0.05wt%, 약 0.1wt% 또는 심지어 약 0.2wt%로부터 상한 수준 0.5wt% 또는 심지어 0.75wt%에 이르기까지이다.
오염물 탈락 중합체: 본 발명의 세제 조성물은 또한 1개 이상의 오염물 탈락 중합체(섬유, 예를 들어 면 섬유 및 폴리에스테르 기반 섬유로부터 오염물을 제거하는 것을 도와주는 중합체, 특히 폴리에스테르 기반 섬유로부터 소수성 오염물을 제거하는 것을 도와주는 중합체)를 포함할 수도 있다. 오염물 탈락 중합체는, 예를 들어 비이온성 또는 음이온성 테레프탈레이트 기반 중합체, 폴리비닐 카프로락탐 및 관련 공중합체, 비닐 그래프트 공중합체, 폴리에스테르, 폴리아미드(예를 들어, 문헌[Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Chapter 7, Marcel Dekker, Inc.] 참조)일 수 있다. 오염물 탈락 중합체의 또 다른 유형으로서는 양쪽 친매성 알콕실화 기름때 세정 중합체(코어 구조를 포함하고, 이 코어 구조에 다수의 알콕실레이트기가 결합되어 있음)가 있다. 코어 구조는 폴리알킬렌이미드 구조 또는 폴리알카놀아민 구조를 포함할 수 있다(WO 제2009/087523호(본원에 참조로 포함됨)에 상세히 기술됨). 뿐만 아니라, 무작위 그래프트 공중합체는 적당한 오염물 탈락 중합체이다. 적당한 그래프트 공중합체는 WO 제2007/138054호, WO 제2006/108856호 및 WO 제2006/113314호(본원에 참조로 포함된)에 상세히 기술되어 있다. 기타 다른 오염물 탈락 중합체로서는 치환된 다당체 구조, 특히 치환된 셀룰로스 구조, 예를 들어 변형된 셀룰로스 유도체, 예를 들어 EP 제1867808호 또는 WO 제2003/040279호(이 문헌들은 둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것들이 있다. 적당한 셀룰로스 중합체로서는 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 셀룰로스 아미드 및 이것들의 혼합물을 포함한다. 적당한 셀룰로스 중합체로서는 음이온 변형 셀룰로스, 비이온 변형 셀룰로스, 양이온 변형 셀룰로스, 양쪽성 이온 변형 셀룰로스 및 이것들의 조합물을 포함한다. 적당한 셀룰로스 중합체로서는 메틸 셀룰로스, 카복시 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 하이드록실 에틸 셀룰로스, 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스, 에스테르 카복시 메틸 셀룰로스 및 이것들의 혼합물을 포함한다.
재부착 방지제: 본 발명의 세제 조성물은 또한 1개 이상의 재부착 방지제, 예를 들어 카복시메틸셀룰로스(CMC), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리옥시에틸렌 및/또는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 아크릴산의 동종 중합체, 아크릴산과 말레산의 공중합체, 그리고 에톡실화 폴리에틸렌이민을 포함할 수도 있다. 상기 "오염물 탈락 중합체"에 기술된 셀룰로스 기반 중합체도 재부착 방지제로서 작용할 수도 있다.
기타 다른 적당한 부가 물질로서는 수축 방지제, 구김 방지제, 살균제, 결합제, 담체, 염료, 효소 안정화제, 섬유 유연제, 충전제, 거품 조절제, 향수성 물질, 향수, 안료, 비누 거품 억제제, 용제, 액체 세제용 구조화제 및/또는 구조 탄력화제(structure elasticizing agent)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세제 제품들의 제형화
본 발명의 세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어 바, 균질 정제, 2개 이상의 층을 가지는 정제, 표준 분말(regular powder) 또는 조밀 분말(compact powder), 과립, 페이스트, 겔, 그리고 표준, 조밀 또는 농축 액체의 형태를 가질 수 있다.
세제 제형의 형태: 레이어스(layers)(동일한 상들 또는 상이한 상들로 이루어진 것), 파우치 및 기계 투여 단위(machine dosing unit).
파우치는 하나의 구획을 가지거나 다수의 구획들을 가지는 형태를 가질 수 있다. 파우치는, 예를 들어 조성물을 방출시키지 않고 이 조성물을 담기에 적당한 임의의 형태 및 모양을 가질 수 있고 이에 적당한 재료로 이루어질 수 있으므로, 상기 조성물은 물과 접촉하기 전에 파우치로부터 방출되는 일이 없다. 상기 파우치는 자체의 내부 공간이 수용성 필름으로 둘러싸인 형태로 제조된다. 상기 내부 공간은 파우치의 구획들로 구분될 수 있다. 바람직한 필름은 중합체 재료, 바람직하게는 필름이나 시트로 성형되는 중합체 재료로 제조된 것이다. 중합체, 공중합체 또는 이것들의 유도체는, 바람직하게 폴리아크릴레이트, 수용성 아크릴레이트 공중합체, 메틸 셀룰로스, 카복시 메틸 셀룰로스, 나트륨 덱스트린, 에틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 말토덱스트린, 폴리메타크릴레이트로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 폴리비닐 알코올 공중합체 및 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스(HPMC)로부터 선택된다. 바람직하게 필름 중 중합체, 예를 들어 PVA의 수준은 약 60% 이상이다. 바람직한 평균 분자량은 통상적으로 약 20,000 내지 약 150,000일 것이다. 필름은 또한 가수 분해될 수 있으면서 수용성인 중합체 배합물, 예를 들어 폴리락티드 및 폴리비닐 알코올(상품명 M8630(Chris Craft In. Prod. Of Gary, Ind., US)으로서 알려짐)과, 가소제, 예를 들어 글리세롤, 에틸렌 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 솔비톨 및 이것들의 혼합물을 포함하는 배합 조성물로 이루어질 수도 있다. 파우치는 고체 세탁용 세정 조성물 또는 이를 구성하는 성분, 및/또는 액체 세정 조성물 또는 이를 구성하는 성분(수용성 필름으로 격리됨)을 포함할 수 있다. 액체 성분용 구획은 조성면에서 고체를 담고 있는 구획과 차이가 있을 수 있다(US 제2009/0011970호 A1).
세제 성분들은 수용성 파우치 내부 구획들 또는 정제의 상이한 층들 사이의 구획에 의해 상호 물리적으로 분리될 수 있다. 그러므로, 보관시 성분들 간에 좋지 않은 상호 작용이 일어나는 것을 막을 수 있다. 구획들 각각의 상이한 용해 프로필은 선택된 성분들의 세척 용액 중 용해를 지연시킬 수도 있다.
과립형 세제의 제형
과립형 세제는 WO 제09/092699호, EP 제1705241호, EP 제1382668호, WO 제07/001262호, US 제6472364호, WO 제04/074419호 또는 WO 제09/102854호에 기술된 바와 같이 제형화될 수 있다. 기타 다른 유용한 세제 제형은 WO 제09/124162호, WO 제09/124163호, WO 제09/117340호, WO 제09/117341호, WO 제09/117342호, WO 제09/072069호, WO 제09/063355호, WO 제09/132870호, WO 제09/121757호, WO 제09/112296호, WO 제09/112298호, WO 제09/103822호, WO 제09/087033호, WO 제09/050026호, WO 제09/047125호, WO 제09/047126호, WO 제09/047127호, WO 제09/047128호, WO 제09/021784호, WO 제09/010375호, WO 제09/000605호, WO 제09/122125호, WO 제09/095645호, WO 제09/040544호, WO 제09/040545호, WO 제09/024780호, WO 제09/004295호, WO 제09/004294호, WO 제09/121725호, WO 제09/115391호, WO 제09/115392호, WO 제09/074398호, WO 제09/074403호, WO 제09/068501호, WO 제09/065770호, WO 제09/021813호, WO 제09/030632호, 및 WO 제09/015951호에 기술되어 있다.
WO 제2011025615호, WO 제2011016958호, WO 제2011005803호, WO 제2011005623호, WO 제2011005730호, WO 제2011005844호, WO 제2011005904호, WO 제2011005630호, WO 제2011005830호, WO 제2011005912호, WO 제2011005905호, WO 제2011005910호, WO 제2011005813호, WO 제2010135238호, WO 제2010120863호, WO 제2010108002호, WO 제2010111365호, WO 제2010108000호, WO 제2010107635호, WO 제2010090915호, WO 제2010033976호, WO 제2010033746호, WO 제2010033747호, WO 제2010033897호, WO 제2010033979호, WO 제2010030540호, WO 제2010030541 호, WO 제2010030539호, WO 제2010024467호, WO 제2010024469호, WO 제2010024470호, WO 제2010025161호, WO 제2010014395호, WO 제2010044905호, WO 제2010145887호, WO 제2010142503호, WO 제 2010122051호, WO 제2010102861호, WO 제2010099997호, WO 제2010084039호, WO 제2010076292호, WO 제2010069742호, WO 제2010069718호, WO 제2010069957호, WO 제2010057784호, WO 제2010054986호, WO 제2010018043호, WO 제2010003783호, WO 제2010003792호, WO 제2011023716호, WO 제2010142539호, WO 제2010118959호, WO 제2010115813호, WO 제2010105942호, WO 제2010105961호, WO 제2010105962호, WO 제2010094356호, WO 제2010084203호, WO 제2010078979호, WO 제2010072456호, WO 제2010069905호, WO 제2010076165호, WO 제2010072603호, WO 제2010066486호, WO 제2010066631호, WO 제2010066632호, WO 제2010063689호, WO 제2010060821호, WO 제2010049187호, WO 제2010031607호, WO 제O2010000636호
용도
본 발명은 또한 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이기도 하다.
세탁/직물/섬유(가정용 세탁, 산업용 세탁)
경질 표면 세정(ADW, 자동차 세척, 산업 기자재 표면)
세제에 있어서의 용도
본 발명의 폴리펩티드는 세제 조성물에 첨가되어 이 조성물의 구성 성분이 될 수 있다.
본 발명의 세제 조성물은, 예를 들어 손 세척용 세제 조성물 또는 기계 세탁용 세제 조성물(얼룩진 섬유의 전처리에 적당한 세탁용 추가 조성물 및 린스가 첨가된 섬유 유연제 조성물 포함)로서 제형화될 수 있거나, 아니면 일반적으로 가정용 경질 표면 세정시 사용되는 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 아니면 설거지 또는 기계에 의한 식기 세척용으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 세제 조성물은 단위 투여형 또는 비누 바 또는 세탁 바의 형태로 제형화될 수도 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 세제 첨가제를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 35℃ 또는 이 이하의 온도에서 행하여지는 세정에 적합한 세제를 제공한다.
방법
AMSA 를 이용하는 알파-아밀라제의 세척 성능 평가
세제 기반 조성물 중 알파-아밀라제 변이체의 세척 성능을 평가하기 위하여, 세척 실험이 수행될 수 있었다. 본 효소는 자동 기계적 스트레스 분석법(Automatic Mechanical Stress Assay; AMSA)을 사용하여 테스트된다. AMSA 테스트를 통하여 소용량 효소-세제 용액의 세척 성능이 다수 회 평가될 수 있다. AMSA 플레이트는 테스트 용액이 들어갈 구멍 다수 개와, 세척될 직물 견본을 꽉 쥐어짜는 뚜껑(상기 구멍 전부의 입구에 끼워 맞춰짐)을 가진다. 세척시, 플레이트, 테스트 용액, 직물 및 뚜껑은 격렬하게 진탕되는데, 이때, 테스트 용액은 직물과 접촉하게 되고, 기계적 스트레스는 규칙적이고 주기적인 진동의 형태로 가하여진다. 이에 관한 추가 설명에 관하여는 WO 제02/42740호, 특히 23페이지 내지 24 페이지 "Special method embodiments"을 참조한다.
세척 성능에 관한 일반적인 설명
물(15°dH), 세제(예를 들어, 이하 기술된 바와 같은 견본 세제 A) 0.8g/L 또는 50mM HCO3 -와, 본 발명의 효소(예를 들어, 테스트 용액 1리터당 효소 단백질 0.1㎎, 0.2㎎, 0.3㎎, 0.4㎎, 0.8㎎ 및/또는 1.2㎎의 농도로 존재)를 포함하는 테스트 용액을 제조하였다. 전분(예를 들어, CS-28(Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, The Netherlands)) 얼룩이 묻은 섬유를 상기 용액에 담그고, 이를 20℃에서 30분 동안 세척하거나, 또는 15℃에서 20분 동안 세척하거나, 또는 15℃에서 45분 동안 세척하거나, 또는 15℃나 40℃에서 20분 동안 세척하였다(실시예에 구체적으로 기술됨). 상기 섬유를 흐르는 수돗물에 충분히 헹군 후 암실에서 건조한 다음, 세척 성능의 척도로서, 얼룩진 섬유의 광도 또는 반사도 값(reflectance value)을 측정하였다. 효소 단백질을 사용하지 않은 테스트는 델타 소광 값(delta remission value; ΔREM)을 구하기 위한 블랭크(blank)로 사용하였다. 대안적으로 테스트 용액의 세척 성능을 모 알파-아밀라제의 세척 성능과 비교하였다(이때, 모 알파-아밀라제의 성능 분석 결과 에는 수치 100이 부여되고, 변이체의 성능 분석 결과가 이 값과 비교됨). 바람직하게, 예를 들어 세척 용액 중에서 섬유를 진탕, 회전 또는 교반시킴으로써 세척 단계에서 기계적 스트레스를 가하였다.
이하에 지정된 실험 조건 하에서 AMSA 세척 성능 실험을 수행하였다:
표 A: 실험 조건
Figure pct00003
표 B: 견본 세제 A
Figure pct00004
물의 경도는, 테스트 시스템에 CaCl2, MgCl2 및 NaHC03(Ca2 +:Mg2 +:HC03 - = 4:1:7.5)를 첨가하여 15?H로 맞추었다. 직물을 세척한 후, 이 직물에 수돗물을 흘려보내고 나서 건조하였다.
표 C: 실험 조건
Figure pct00005
표 D: 견본 세제 X
Figure pct00006
(*견본 X는 AEO를 포함하지 않고 혼합됨. AEO는 별도로 세척 과정에 첨가됨)
12?H 물 중 세척 용액의 대략적인 pH 측정(Ca:Mg:HC03 = 2:1:4.5)
물의 경도는, 테스트 시스템에 CaCl2, MgCl2 및 NaHC03(Ca:Mg:HC03 = 2:1:4.5)를 첨가하여 12?H로 맞추었다. 직물을 세척한 후, 이 직물에 수돗물을 흘려보내고 나서 건조하였다.
세척 성능은 세척된 직물 색의 위도로 특정된다. 휘도는 또한 백색광을 비추었을 때 샘플로부터 반사되는 빛의 세기로서 표현될 수도 있다. 샘플에 얼룩이 졌을 때, 이 샘플로부터 반사되는 반사광의 세기는 깨끗한 샘플로부터 반사되는 반사광의 세기보다 작다. 그러므로, 반사광의 세기는 세척 성능을 측정하는데 사용될 수 있는 것이다.
직물의 색상은 전문가용 평판 스캐너(코닥 iQ스마트(Kodak iQsmart), 코닥사)(세척된 직물의 이미지를 포착하는데 사용됨)로 평가된다.
스캐닝된 이미지들로부터 빛의 세기에 대한 값을 추출하기 위해서, 이 이미지로부터 구한 24-비트 픽셀 값들은 레드, 그린 및 블루에 대한 값(RGB)들로 변환된다. 세기 값(Int)은, RGB 값들을 벡터값으로서 함께 더한 다음, 구하여진 벡터의 길이를 취함으로써 산정된다:
Figure pct00007
직물:
직물 샘플 CS-28(쌀 전분으로 얼룩진 면)은 네덜란드 3133 KT 블라르딘겐(P.O.Box 120) 소재, 센터 포 테스트매트리얼즈 비브이(Center For Testmaterials BV)로부터 입수된다.
비이커를 사용한 세척 성능 테스트
본 분석법은 상부에 샘플이 로딩된 세척 기계를 사용하는 소규모 모델 분석법으로서, 아밀라제의 세척 성능을 평가하는데 사용된다.
250㎖들이 비이커와 패들형 교반 장치(각 방향으로 180°만큼 진동 회전 동작 부여; 주파수 = 분당 80)를 사용하는 비이커 세척 성능 테스트는 다음과 같은 단계들을 포함한다: 50mM NaHC03 및 0.4㎎/L 효소를 함유하는 세척 용액(6℃, 15?H, pH8.0) 100㎖를 제공하는 단계; CS-28 견본(5×5㎝) 2개와 EMPA 162 견본(5×5㎝) 2개를 세척 용액에 가하여 세척 과정을 개시하는 단계; 교반 속도를 80rpm으로 설정하는 단계; 60분 경과후 교반을 멈추고 나서, 상기 견본들을 흐르는 수돗물(냉수)에 헹구는 단계; 헹구어진 견본들을 암실에서 밤새도록 건조하는 단계; 그리고 이하에 기술된 바와 같이 칼라 아이(Color Eye)를 사용하여 460㎚에서의 입사광 소광 정도를 측정함으로써 세척 성능을 평가하는 단계.
장비 및 재료
물이 순환하고 있는 수조(5℃); 유리 비이커(250㎖들이); 비이커(용량 = 세척 용액 100㎖) 1개당 회전 암 1개; 테스트 견본: CS-28(쌀 전분 얼룩이 진 면)(Center for Testmaterials BV, Vlaardingen, The Netherlands) 및 EMPA 162(쌀 전분 얼룩이 진 면/폴리에스테르)(EMPA Testmaterials AG, St. Gallen, Switzerland)(상기 견본들은 5㎝×5㎝로 자름).
세척 용액: 50mM NaHC03 완충액, pH 8.0, 물의 경도: 15?H, 칼슘:마그네슘 비율 = 4:1.
아밀라제 스톡 용액: 용액 1㎖당 효소 1㎎ - 초순수(밀리Q(MilliQ) 수) 중 0.1%(w/v) 트리톤 X-100 및 0.1mM CaCl2 용액이 아밀라제 희석에 사용된다(아밀라제 희석 완충액).
칼라 아이 측정법
세척 성능은 델타 소광 값(ΔREM)으로 표현된다. 견본들의 광 반사도 평가는, 맥베쓰 칼라 아이 7000(Macbeth Color Eye 7000) 반사광 분광 분석계(매우 작은 타원형(즉 0.7㎠(약 0.7㎝×1.0㎝)) 조리개 보유)를 사용하여 수행되었다. 측정은 UV를 제외한 입사광의 존재 하에서 수행되었으며, 460㎚에서의 소광 값이 추출되었다. 측정이 수행되기 전, 측정될 견본은 동일한 종류의 또 다른 견본의 위에 놓아지며, 이로써, 측정 구멍쪽으로 견본을 밀어 올리는 피스톤에서 빛이 반사되는 것을 줄였다. 아밀라제로 세척된 견본의 소광 값으로부터 아밀라제가 첨가되지 않은채 세척된 견본(대조군)의 소광 값을 공제함으로써, 각각의 견본에 대한 델타 소광 값이 산정되었다.
소형 세척 로봇을 이용한 알파-아밀라제의 세척 성능 평가:
소형 세척 로봇은 소규모의 세탁기 모델로서, 아밀라제의 세척 성능을 평가하는데 사용된다.
100㎖들이 비이커에 세척 용액 60㎖가 첨가되었으며, 이 용액은 15℃ 또는 40℃로 가열된다. 그 다음, 여기에 효소(농도: 용액 1L당 효소 단백질 0.00㎎; 0.015㎎; 0.05㎎; 0.25㎎; 0.50㎎; 1.00㎎)가 첨가된다. 받침대에 걸린 직물(CS-28; 쌀 전분 얼룩이 진 면)은, 임의의 농도의 효소를 함유하는 세척 용액에 침지되며, 20분 동안 세척된다. 세척이 끝난 후, 열이 가하여지지 않은 건조 상자에서 상기 받침대에 걸려 있던 직물이 건조된다. 직물의 소광값은 짜이쯔(ZEISS) MCS 521 VIS 분광 분석계를 사용하여 460㎚에서 측정된다. 아밀라제로 세척된 직물의 소광 값으로부터 아밀라제가 첨가되지 않은채 세척된 직물(대조군)의 소광 값을 공제함으로써, 각각의 직물에 대한 델타 소광값이 산정되었다.
알파-아밀라제 활성 측정용 pNP - G7 분석법
알파-아밀라제 활성은 G7-pNP 기질을 사용하는 방법을 통해 측정될 수 있다. 4,6-에틸리덴(G7)-p-니트로페닐(G1)-α,D-말토헵타오시드의 축약어인 G7-pNP는, 엔도-아밀라제, 예를 들어 알파-아밀라제에 의해 절단될 수 있는 차단형 올리고당이다. 절단 후, 키트에 포함된 알파-글루코시다제는 가수 분해된 기질을 분해하여, 황색을 띄는 유리 p-니트로페닐(pNP) 분자를 방출시키는데, 이러한 특성을 이용하면 가시 분광 분석법(λ=405㎚(400㎚ 내지 420㎚))으로 상기 효소의 활성이 측정될 수 있다. G7-pNP 기질과 알파-글루코시다제를 포함하는 키트는 로쉐(Roche)/히타치(Hitachi)에 의해 제조된다(cat.No.11876473).
시약:
본 키트에 포함된 G7-pNP 기질은 22mM 4,6-에틸리덴-G7-pNP 기질 및 52.4mM HEPES(2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-에탄설폰산), pH 7.0)을 함유한다.
알파-글루코시다제 시약은 52.4mM HEPES, 87mM NaCl, 12.6mM MgCl2, 0.075mM CaCl2, ≥ 4 kU/L 알파-글루코시다제를 함유한다.
기질 작용 용액은, 알파-글루코시다제 시약 1㎖를 G7-pNP 기질 0.2㎖와 혼합하여 제조된다. 이 기질 작용 용액은 사용 직전에 제조된다.
희석 완충액: 50mM MOPS, 0.05%(w/v) 트리톤 X100(폴리에틸렌글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르(C14H22O(C2H4O)n(n = 9~10))), 1mM CaCl2, pH 8.0.
방법:
분석될 아밀라제 샘플은 희석 완충액으로 희석되고, 희석된 샘플의 pH를 7로 만들었다. 분석은, 희석된 효소 샘플 20㎕를 96웰 미세 역가 평판에 옮긴 후, 여기에 기질 작용 용액 80㎕를 첨가함으로써 수행되었다. 이 용액이 혼합되고 나면, 실온에서 1분 동안 예비 항온 처리되고, 흡광도(OD 405㎚)는 총 5분에 걸쳐 20초마다 측정된다.
시간 의존성 흡광도 곡선의 기울기(분당 흡광도)는 소정의 조건 하에서 미지의 알파-아밀라제의 비활성(효소 1㎎당 활성)에 정비례한다. 아밀라제 샘플은 곡선의 기울기가 0.4 흡광도 단위/분 이하의 수준이 되도록 희석되어야 한다.
전분과의 결합성 측정
분석 원리:
아밀라제 변이체는, 선택될 알파-아밀라제의 용도에 따라서 의도로 하는 pH 값에 따라서 선택된 pH 값(pH 4.0~11.0)(예를 들어, 세제용으로 사용되는 경우 pH는 알칼리 범위(예를 들어, pH8.0 또는 pH10.0)에서 적당히 선택됨); 선택된 시간 동안(일반적으로 5분 내지 1시간, 바람직하게는 10분 내지 30분, 예를 들어 10분 또는 30분); 그리고 선택된 온도(일반적으로 0℃ 내지 30℃, 바람직하게는 4℃)에서, 불용성 미가공 쌀 전분의 존재 하 또는 부재 하에 항온 처리된다. 원심 분리후, 상청액을 사용하여 아밀라제 활성이 측정된다. 쌀 전분의 존재하 및 부재하에서 항온 처리된 샘플간 활성의 차이는 아밀라제와 불용성 전분의 결합성의 척도가 된다.
재료 및 방법:
쌀 전분(시그마 인코포레이션(Sigma Inc.), Cat No.S7260), HEPES, 염화칼슘, 트리톤 X-100, 글리신, 엔즈체크 울트라 아밀라제 어세이 키트(EnzChek Ultra Amylase Assay Kit)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), Cat No.E33651), 96마이크로웰 평판(항온 처리 및 희석용)(Nunc, Cat No.269620) 및 96웰 하프 에어리어 블랙 평판(형광도 측정용)(코닝(Corning)사, Cat No.3694).
분석 완충액은 50mM HEPES(pH8.0), 0.1mM CaCl2 및 0.01% 트리톤 X-100을 함유하였다. 효소 단백질 용액은 분석 완충액으로 0.15㎎/㎖로 희석되었다. 고 pH 결합 완충액은 50mM 글리신-NaOH(pH 10.0) 및 0.01% 트리톤 X-100을 함유하였다. 분석 완충액 중 쌀 전분 용액(2.5%)(서열 번호 14의 변이체용)과 고 pH 결합 완충액 중 쌀 전분 용액(2.5%)(서열 번호 2의 변이체용)이 제조되었다. 엔즈체크 울트라 아밀라제 기질 용액은 제조자의 지침에 따라서 제조되었으며, 분석 완충액 중에 50㎍/㎖의 농도로 희석되었다.
a) 쌀 전분을 포함하는 완충액(2.5%) 또는 포함하지 않는 완충액(2.5%) 100㎕는 96 마이크로웰 평판에 가하여지고, 이후 4℃에서 30분 동안 예비 항온 처리되었다.
b) 효소 용액 20㎕는 상기 평판의 웰에 가하여지고, 이 평판은 혼합기에 넣어져 900rpm에서 혼합되었다(30분, 4℃).
c) 전분을 침강시키기 위해 평판은 2000rpm에서 원심 분리되었으며(5분, 4℃), 상청액은 조심스럽게 분리된 후 분석 완충액 중 약 1250배 희석되어, 효소 단백질 농도가 약 20ng/㎖가 되도록 만들어졌다.
d) 희석된 효소 샘플 25㎕는 96웰 하프 에어리어 블랙 평판(엔즈체크 울트라 아밀라제 기질 용액 25㎕ 포함)에 가하여졌으며, 이 평판은 즉시 평판 판독기에 넣어져 형광도를 측정하였다.
e) 형광 강도의 변화량(ΔF.I.)이 측정되었다(25℃, 30분, 여기 파장 = 485㎚ 및 방사 파장 = 512㎚). 분당 형광 강도(ΔF.I./분)로 표시되는 활성 차를 산정하기 위하여 시간 간격(0.5분 내지 5분)을 두고 형광도가 판독되었다.
Figure pct00008
실시예
실시예 1: 아밀로스와의 결합성 및 세척 성능의 측정
전분과의 결합성을 측정하는 방법과 AMSA 세척 성능 테스트 방법(상기 "방법" 섹션에 기술됨)을 이용하여, 다수의 아밀라제와 이의 변이체를 대상으로 아밀로스와의 결합성 및 세척 성능에 대해 분석하였다.
결합성 분석은 pH8.0 및 4℃에서 결합 시간 10분 동안 수행하였다. 5%(w/v) 아밀로스(시그마 A0512)를 사용하여 결합성을 테스트하였으며, AMSA 세척 성능 테스트에 관하여 기술된 바와 같이 세척 성능 테스트를 수행하였다(견본 세제 A 사용, 효소 투여량 = 세척 용액 1L당 효소 단백질 0.4㎎, 세척 온도 = 15℃). 세척 시간은 45분이었다.
결과를 이하 표 1에 제시하였다.
Figure pct00009
상기 결과들로부터, 아밀로스와 결합된 아밀라제의 분율 및 세척 성능 간에는 역의 상관 관계가 존재함을 명확히 알 수 있었다.
실시예 2: 미가공 쌀 전분과의 결합성 및 세척 성능의 측정
원리:
본 실험은 실시예 1에 기술된 바와 동일한 원리에 따라서 실시하였는데, 다만, 아밀로스 대신 5%(w/v) 쌀 전분(시그마 S7260) 현탁액만을 사용하였다. 결합성 분석은 pH8.0 및 4℃에서 결합 시간 10분 동안 실시하였다.
Figure pct00010
실시예 3: 아밀로펙틴과의 결합성 측정
본 실험은 실시예 1에 기술된 바와 동일한 원리에 따라서 실시하였는데, 다만, 아밀로스 대신 5%(w/v) 아밀로펙틴 현탁액(플루카(Fluka)사)(옥수수로 제조)만을 사용하였다.
Figure pct00011
실시예 4: 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제의 변이체 (서열 번호 13)
서열 번호 13의 서열을 가지는 비.리케니포르미스 알파-아밀라제의 변이체를 제조하였다. 테스트된 변이체는 서열 번호 13의 서열을 가지는 모 알파-아밀라제의 경우와 비교하였을 때 전분과의 결합성이 작았으며 세척 성능은 우수하였다.
pH8 및 5℃에서 5%(w/v) 불용성 쌀 전분을 사용하여 결합성 분석을 수행하였다(결합 시간 = 10분).
"소형 세척 로봇을 이용한 알파-아밀라제의 세척 성능 평가" 섹션에 기술된 조건 하에서 소형 세척기를 사용하여 변이체의 세척 성능을 테스트한 결과, 변이체(0.5㎎/L, 40℃)의 세척 성능은 바실러스 리케니포르미스 유래 모 알파-아밀라제의 세척 성능과 비교하였을 때 개선되었음을 알 수 있었다. 세척 시간은 20분이었다.
세척 성능 = 값(변이체 - 블랭크) / 값(터마밀-블랭크) * 100
Figure pct00012
실시예 5: 바실러스 sp 707 알파-아밀라제 변이체 (서열 번호 2)
서열 번호 2의 서열을 가지는 알파-아밀라제의 추가 변이체를 생성한 다음, 이 변이체를 대상으로 기질 결합성을 테스트하고, AMSA 세척 성능도 테스트하였다(세척 용액 1L당 효소 단백질 0.3㎎, 15℃, 20분, 견본 세제 X 사용). pH10.0에서 2.5%(w/v) 불용성 쌀 전분을 사용하여 결합 분석을 실시하였다(결합 시간 = 10분, 4℃). 변이체의 세척 성능을 모 알파-아밀라제(서열 번호 2의 서열 포함하고, 변형 H183*+G184* 발생)의 세척 성능과 비교하여 나타내었다.
Figure pct00013
실시예 6: 바실러스 sp 707 알파-아밀라제 변이체 (서열 번호 2)
서열 번호 2의 서열을 가지는 알파-아밀라제의 추가 변이체를 생성한 다음, 이 변이체를 대상으로 기질 결합성과 저온에서의 세척 성능을 테스트하였으며, 모 알파-아밀라제(서열 번호 2의 서열 포함하고, 변형 H183*+G184* 발생)의 기질 결합성보다 기질 결합성이 약한 변이체를 선별하였다. AMSA 세척 테스트를 수행하였다(세척 용액 1L당 효소 단백질 0.3㎎, 15℃, 20분, 견본 세제 X 사용). 변이체의 세척 성능을 모 알파-아밀라제(서열 번호 2의 서열 포함하고, 변형 H183*+G184* 발생)의 세척 성능과 비교하여 나타내었다.
Figure pct00014
실시예 7: 바실러스 sp 707 알파-아밀라제 변이체 (서열 번호 2)
서열 번호 2의 서열을 가지는 알파-아밀라제의 추가 변이체를 생성한 다음, 이 변이체를 대상으로 기질 결합성과 저온에서의 세척 성능을 테스트하였으며, 모 알파-아밀라제(서열 번호 2의 서열 포함하고, 변형 H183*+G184* 발생)의 기질 결합성보다 기질 결합성이 약한 변이체를 선별하였다. AMSA 세척 테스트를 수행하였다(세척 용액 1L당 효소 단백질 0.3㎎, 15℃, 20분, 견본 세제 X 사용). pH8 및 4℃에서 결합성 분석을 수행하였다(결합 시간 = 10분). 변이체의 세척 성능을 모 알파-아밀라제(서열 번호 2의 서열 포함하고, 변형 H183*+G184* 발생)의 세척 성능과 비교하여 나타내었다.
Figure pct00015
본원에 기술 및 청구된 발명은 본원에 개시된 특정 양태에 의해 그 범주가 제한되지는 않는데, 그 이유는 이러한 양태들은 본 발명의 몇몇 양태들을 예시하고자 하는 것이기 때문이다. 임의의 균등한 양태들은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 실제로, 본원에 나타내고 기술된 변형예들에 더하여 본 발명의 다양한 변형예들은 앞서 기술된 사항들로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이와 같은 변형예들도 또한 첨부된 특허청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 모순이 있는 경우, 용어의 정의를 포함하여 본원에 개시된 내용이 우선할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S <120> Method for screening alpha-amylases <130> 12087-WO-PCT <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Lys Arg 485 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 3 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 3 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 4 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys 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Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Arg Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Ser Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ala 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 14 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 14 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser 35 40 45 Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu 65 70 75 80 Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser 115 120 125 Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly 145 150 155 160 Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg 165 170 175 Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Lys <210> 15 <211> 515 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 15 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn 210 215 220 Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly 245 250 255 Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys 260 265 270 Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp 275 280 285 Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr 290 295 300 Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro 305 310 315 320 Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln 325 330 335 Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val 405 410 415 Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val 435 440 445 Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp 465 470 475 480 Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr 485 490 495 Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val 500 505 510 Ala Trp Pro 515

Claims (17)

  1. a) 알파-아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질, 예를 들어 전분에 알파-아밀라제가 결합하는지 여부를 확인하는 단계; 및
    b) 기질에 대한 결합성이 낮은 알파-아밀라제를 선별하는 단계
    를 포함하는, 저온에서 성능이 높은 알파-아밀라제를 스크리닝하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 알파-아밀라제는 저온에서 세척 성능이 높은 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알파-아밀라제는 전분과의 결합성이, 서열 번호 8의 서열을 가지는 알파-아밀라제의 전분과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 65% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 방법.
  4. a) 모 알파-아밀라제의 표면에 위치하는 아미노산 1개 이상에서 아미노산 잔기 1개 이상을 치환, 결실 또는 삽입함으로써 변이체를 생성하는 단계;
    b) 상기 변이체가 상기 알파 아밀라제의 고체 기질 또는 고착된 기질, 예를 들어 전분에 결합하는지 여부를 테스트하는 단계; 및
    c) 기질과의 결합성이 모 알파-아밀라제보다 낮은 변이체를 선별하는 단계
    를 포함하는, 모 알파-아밀라제의 변이체를 선별하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 모 알파-아밀라제는 서열 번호 1 내지 서열 번호 15의 서열들 중 하나와의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상인 아밀라제들로부터 선택되는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 변이체는 전분과의 결합성이 모 알파-아밀라제의 전분과의 결합성의 90% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 80% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 70% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 65% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 60% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 50% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 40% 미만, 바람직하게는 상기 결합성의 30% 미만, 더 바람직하게는 상기 결합성의 20% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 상기 결합성의 10% 미만인 방법.
  7. 알파-아밀라제 활성을 가지고, 서열 번호 1 내지 서열 번호 15의 서열들 중 하나와의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상인 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 치환, 삽입 및 결실로부터 선택되는 변형 1개 이상(예를 들어, 수 개)에 의해 모 알파-아밀라제로부터 유도되고, 상기 변이체 알파-아밀라제는 모 알파-아밀라제와 비교하였을 때 고체 전분과의 결합성이 더 낮고, 저온(예를 들어, 15℃)에서의 세척 성능이 더 높은 변이체 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 분자의 표면에 존재하는 기질 결합 위치 1개 이상에 있는 아미노산 잔기가 변형된 변이체 알파-아밀라제.
  9. 제7항에 있어서,
    a) 서열 번호 2의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상이고, 181번 + 182번 위치 또는 182번 + 183번 위치 또는 183번 + 184번 위치의 결실을 포함하며, 서열 번호 2의 W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 및 G477에 상응하는 위치 중 임의의 위치에 1개 또는 2개 또는 그 이상의 변형을 추가로 포함하는 변이체 알파-아밀라제;
    b) 서열 번호 5의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상이고, 181번 + 182번 위치 또는 182번 + 183번 위치 또는 183번 + 184번 위치의 결실을 포함하며, 서열 번호 5의 W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 및 G477에 상응하는 위치 중 임의의 위치에 1개 또는 2개 또는 그 이상의 변형을 추가로 포함하는 변이체 알파-아밀라제;
    c) 서열 번호 4의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상이고, 181번 + 182번 위치 또는 182번 + 183번 위치 또는 183번 + 184번 위치의 결실을 포함하며, 서열 번호 4의 W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 및 G477에 상응하는 위치 중 임의의 위치에 1개 또는 2개 또는 그 이상의 변형을 추가로 포함하는 변이체 알파-아밀라제;
    d) 서열 번호 13의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상이고, 서열 번호 13의 W138, W157, W165, E167, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, K315, W342, R437, W467 및 G475에 상응하는 위치 중 임의의 위치에 변형을 포함하는 변이체 알파-아밀라제;
    e) 서열 번호 14의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상이고, 176번 + 177번 위치 또는 177번 + 178번 위치 또는 178번 + 179번 위치의 결실을 포함하며, 서열 번호 14의 W136, W155, W163, E165, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, R315, W342, R437, W467 및 G475에 상응하는 위치 중 임의의 위치에 1개 또는 2개 또는 그 이상의 변형을 추가로 포함하는 변이체 알파-아밀라제; 및
    f) 서열 번호 15의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 서열 동일성이 85% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 90% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 97% 이상, 더 바람직하게는 서열 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 동일성이 99% 이상이고, 179번 + 180번 위치 또는 180번 + 181번 위치 또는 181번 + 182번 위치의 결실을 포함하며, 서열 번호 15의 W139, W158, W166, E168, W187, E192, F260, F287, G302, G303, W345, W437, W467, G474 및 G475에 상응하는 위치 중 임의의 위치에 1개 또는 2개 또는 그 이상의 변형을 추가로 포함하는 변이체 알파-아밀라제
    (여기서, 상기 a) 내지 f)의 변형은 바람직하게 치환임)
    로부터 선택되는 변이체 알파-아밀라제.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 2의 서열과의 서열 동일성이 90% 이상이고, 서열 번호 2의 서열 내 다음과 같은 위치들에 상응하는 위치들에 변형을 포함하는 변이체 알파-아밀라제:
    H183*+G184*+W140F;
    H183*+G184*+Q169N;
    H183*+G184*+Q169A;
    H183*+G184*+W189Y+E190P;
    H183*+G184*+N260D;
    H183*+G184*+G477E;
    H183*+G184*+G477Q;
    H183*+G184*+G477K;
    H183*+G184*+W189E+E190P;
    H183*+G184*+A51I+W140Y;
    H183*+G184*+W140Y+W189E;
    H183*+G184*+W140Y+N260P;
    H183*+G184*+W140Y+W284D;
    H183*+G184*+W140Y+G476R;
    H183*+G184*+W140Y+G477E;
    H183*+G184*+W189E+W439R;
    H183*+G184*+W284D+G477E;
    H183*+G184*+W439R+G476R;
    H183*+G184*+W439R+G477E;
    H183*+G184*+E194D;
    H183*+G184*+W439R+D467K;
    H183*+G184*+R320M+W439R;
    H183*+G184*+W439R+K485R;
    H183*+G184*+Y160S;
    H183*+G184*+W189F+E190P;
    H183*+G184*+F262A;
    H183*+G184*+Y363H;
    H183*+G184*+G476E;
    H183*+G184*+N260P+W439R;
    H183*+G184*+N260P+G477E;
    H183*+G184*+W439R+G476R;
    H183*+G184*+K72S+W140Y;
    H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G;
    H183*+G184*+E194S;
    H183*+G184*+E345D+G477R;
    H183*+G184*+K302N+W439R;
    H183*+G184*+R320K+W439R;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E;
    H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R;
    H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q;
    H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q;
    H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q; 및
    H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.
  11. 제10항에 있어서, 다음과 같은 것들로부터 선택되는 변형을 포함하는 서열 번호 2의 서열로 이루어진 변이체 알파-아밀라제:
    H183*+G184*+W140F;
    H183*+G184*+Q169N;
    H183*+G184*+Q169A;
    H183*+G184*+W189Y+E190P;
    H183*+G184*+N260D;
    H183*+G184*+G477E;
    H183*+G184*+G477Q;
    H183*+G184*+G477K;
    H183*+G184*+W189E+E190P;
    H183*+G184*+A51I+W140Y;
    H183*+G184*+W140Y+W189E;
    H183*+G184*+W140Y+N260P;
    H183*+G184*+W140Y+W284D;
    H183*+G184*+W140Y+G476R;
    H183*+G184*+W140Y+G477E;
    H183*+G184*+W189E+W439R;
    H183*+G184*+W284D+G477E;
    H183*+G184*+W439R+G476R;
    H183*+G184*+W439R+G477E;
    H183*+G184*+E194D;
    H183*+G184*+W439R+D467K;
    H183*+G184*+R320M+W439R;
    H183*+G184*+W439R+K485R;
    H183*+G184*+Y160S;
    H183*+G184*+W189F+E190P;
    H183*+G184*+F262A;
    H183*+G184*+Y363H;
    H183*+G184*+G476E;
    H183*+G184*+N260P+W439R;
    H183*+G184*+N260P+G477E;
    H183*+G184*+W439R+G476R;
    H183*+G184*+K72S+W140Y;
    H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G;
    H183*+G184*+E194S;
    H183*+G184*+E345D+G477R;
    H183*+G184*+K302N+W439R;
    H183*+G184*+R320K+W439R;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E;
    H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R;
    H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q;
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q;
    H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q;
    H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y;
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q; 및
    H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 14의 서열과의 서열 동일성이 90% 이상이고, 서열 번호 14의 서열 내 다음과 같은 위치에 상응하는 위치에 변형을 포함하는 변이체 알파-아밀라제:
    E178*+G179*;
    E178*+G179*+T36N;
    E178*+G179*+W136Y;
    E178*+G179*+W155Y;
    E178*+G179*+W155F;
    E178*+G179*+W163Y;
    E178*+G179*+G299E;
    E178*+G179*+G299K;
    E178*+G179*+G299R;
    E178*+G179*+R315M;
    E178*+G179*+R315A;
    E178*+G179*+R315Q; 및
    E178*+G179*+W342Y.
  13. 제12항에 있어서, 다음과 같은 것들로부터 선택되는 변형을 포함하는 서열 번호 14의 서열로 이루어진 변이체 알파-아밀라제:
    E178*+G179*;
    E178*+G179*+T36N;
    E178*+G179*+W136Y;
    E178*+G179*+W155Y;
    E178*+G179*+W155F;
    E178*+G179*+W163Y;
    E178*+G179*+G299E;
    E178*+G179*+G299K;
    E178*+G179*+G299R;
    E178*+G179*+R315M;
    E178*+G179*+R315A;
    E178*+G179*+R315Q; 및
    E178*+G179*+W342Y.
  14. 제7항에 있어서, 서열 번호 13의 서열과의 서열 동일성이 90% 이상이고, 서열 번호 13의 서열 내 K315 및/또는 W467 위치에 상응하는 위치에 변형을 포함하는 변이체 알파-아밀라제.
  15. 제14항에 있어서, 치환 K315M을 포함하는 서열 번호 13의 서열로 이루어진 변이체 알파-아밀라제.
  16. 제7항 내지 제15항 중 어느 하나의 항의 변이체 알파-아밀라제를 포함하는 세제 조성물.
  17. 세탁이나 자동화된 식기 세척을 포함하는 경질 표면 세정과 같은 세정 과정에 있어서 제7항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 의한 변이체 알파-아밀라제의 용도.
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