CN108291215A

CN108291215A - 具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸

Info

Publication number: CN108291215A
Application number: CN201680055176.4A
Authority: CN
Inventors: M.杰尔曼森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2018-07-17
Also published as: US20180171318A1; WO2017064253A1; EP3362558A1

Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明进一步涉及此类多肽在洗涤剂和/或清洁过程中的用途。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞连同产生这些多肽的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸

序列表的引用

本申请含有一个处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明领域

本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸的用途。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞连同产生这些多肽的方法。本发明具体涉及具有蛋白酶活性的多肽在食品应用和洗涤剂中的用途。

背景技术

酶已经在清洁组合物中使用了数十年，如用于各种目的的洗涤剂，如在家庭护理和工业清洗中的洗衣和餐具洗涤。使用不同酶的混合物，每种酶都表现出其对构成来自各种污物的污垢的特定物质的比活性。蛋白酶是降解蛋白质的酶，并且可以用于清洗过程如餐具洗涤和洗衣以去除蛋白质污渍。最常用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，特别是枯草杆菌酶。这个家族先前已经进一步由Siezen RJ和Leunissen JAM，1997，Protein Science[蛋白质科学]6，501-523被分组为6个不同亚组。这些亚组之一是枯草杆菌蛋白酶家族，该家族包括枯草杆菌酶，如(诺维信公司(Novozymes A/S))和(汉高公司(Henkel AG))。这些年来，枯草杆菌蛋白酶和其他蛋白酶已经被基因工程化以提高其性能。典型地，将这些蛋白酶设计为满足不同目的，如增加其洗涤性能，例如，在低温条件下，和/或增加其去除某些污渍的能力。商业上已知的基因工程蛋白酶包括 (诺维信公司)、PurafectPurafect和(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))。尽管存在针对各种目的所设计的许多优化的蛋白酶，但是污渍和污物的组成非常复杂，并且洗涤条件和洗涤剂组合物改变以满足不同使用者需要。所有这些因素使得获得在清洗和洗涤剂中使用的不同类型的蛋白酶是有利的。

发明内容

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的芽孢杆菌属多肽，这些多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少98％序列同一性；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少98％序列同一性；

(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体；重组表达载体；重组宿主细胞；以及产生所述多肽的方法。

本发明还涉及洗涤剂组合物、本发明的蛋白酶在清洁和洗涤剂中的用途、包含本发明蛋白酶的洗涤剂组合物的用途、进行清洁的方法和去除污渍的方法。

本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。以及涉及产生本发明的蛋白质的方法。

序列表概述

SEQ ID NO:1是芽孢杆菌属物种蛋白酶的DNA序列

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列

SEQ ID:NO:3是成熟芽孢杆菌属物种蛋白酶的氨基酸序列

SEQ ID NO:4是TY-145蛋白酶(WO 2004/067737，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列

SEQ ID NO:5是迟缓芽孢杆菌蛋白酶的氨基酸序列

SEQ ID NO:6正向引物

SEQ ID NO:7反向引物

SEQ ID NO:8是克劳氏芽孢杆菌分泌信号的氨基酸序列

定义

“具有蛋白酶活性的多肽”或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。

术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考来自NC-IUBMB的1992年酶命名法[EnzymeNomenclature 1992]，加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press，San Diego，California)，分别包括在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1997，250，1-6；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1999，264，610-650中出版的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白质水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内切肽酶(EC 3.4.21)。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定蛋白酶活性。

术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性(EC 3.4.21.)。用于测定蛋白酶活性的若干测定在本领域是可获得的。出于本发明的目的，如在本申请的实例中所述的，可以使用Suc-AAPF-pNA测定来确定蛋白酶活性。

如在此使用的术语“分离的多肽”是指从来源分离的多肽。在一方面，该多肽是至少20％纯的，更优选至少40％纯的，更优选至少60％纯的，甚至更优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的并且甚至最优选至少95％纯的，如通过SDS-PAGE所确定。如在此使用的术语“纯的”是指样品、组合物等中的多肽纯度。因此，如至少95％纯的意指不超过5％的样品、组合物等由杂质组成。确定分离的多肽的纯度在本领域技术人员的知识范围内。

术语“基本上纯的多肽”在此指含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的该多肽与其天然地或重组地相关的其他多肽材料的多肽制剂。因此，优选的是该基本上纯的多肽按存在于该制剂中的所有多肽材料的重量计是至少92％纯的，优选至少94％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少97％纯的，更优选至少98％纯的，甚至更优选至少99％纯的，最优选至少99.5％纯的，并且甚至最优选100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来实现。

术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽是具有SEQ ID NO:3的多肽。在另一方面，成熟多肽是由SEQ ID NO:1的氨基酸319至1254或SEQ ID NO:2的氨基酸1至312编码的。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人，2000，Trends inGenetics[遗传学趋势]16:276-277；http://emboss.org)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用版本6.1.0。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。Needle标注的“最长的同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文；http://emboss.org)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用版本6.1.0。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)替代矩阵。Needle标注的“最长的同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

术语“片段”意指使一个或多个(即，若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。

术语“多肽的功能片段”或“其功能片段”用来描述衍生自更长的多肽(例如，成熟多肽)的多肽，以及已经在N-末端区或C-末端区或两个区域中截短以产生亲本多肽的片段的多肽。为了成为功能多肽，该片段必须保持全长/成熟多肽的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％的蛋白酶活性。

术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。

术语“等位基因变体”意思指占据同一染色体基因座的一个基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可能是沉默的(所编码的多肽没有改变)或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(即，若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。氨基酸位置表示为#₁、#₂等。

如在此使用的术语“取代”是指氨基酸取代，其中使用以下命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。因此，将在位置#₁处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr#₁Ala”或“T#₁A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly2#₂Arg+Ser#₅Phe”或“G#₂R+S#₅F”代表分别在位置#₂和位置#₅处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

如在此使用的术语“缺失”是指氨基酸缺失，其中使用以下命名法：初始氨基酸，位置，*。因此，在位置#₂处的甘氨酸缺失表示为“Gly#₂*”或“G#₂”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly#₂*+Ser#₃*”或“G#₂*+S#₃”。

如在此使用的术语“插入”是指氨基酸插入，其中使用以下命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入氨基酸。因此，在位置#₂处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly#₂GlyLys”或“G#₂GK”。将多个氨基酸的插入表示为[初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸#1、插入氨基酸#2等]。例如，在位置#₂处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly#₂GlyLysAla”或“G#₂GKA”。

在这类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

亲本：	变体：
		#₂	#₂#₂a#₂b
G	G-K-A

如果存在多个改变，那么包含此类多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg#₃Tyr+Gly#₄Glu”或“R#₃Y+G#₄E”代表在位置#₃和位置#₄处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接触镜、硬表面(例如瓷砖、锌、地板和桌面)、头发(香波)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾组合物)所选的任何材料/化合物，只要该组合物与蛋白酶以及该组合物中使用的其他一种或多种酶可相容即可。清洁组合物材料的特定选择可通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及组合物对于使用时的清洁条件合意的形式而容易地作出。这些术语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。旨在该术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如液体和/或固体衣物洗涤剂和精纺织物(fine fabric)洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂，连同餐具洗涤剂)。

除非另外指明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉末状的通用或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的通用洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条、肥皂条、漱口水、义齿清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和毛发染发剂；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理型添加剂。

就预期用于玷污的物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代性实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。其并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于含有表面活性剂的组合物。其意图是，除了根据本发明的蛋白酶以外，该术语涵盖了可能含有以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。

术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非编织材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。

术语“纺织品”是指编织织物，连同适合于转化为或用作纱线、编织、针织以及非编织织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如，制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。

术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于用于硬表面清洁的组合物，例如餐具洗涤洗涤剂组合物、口腔洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。

术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶的量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，例如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、条)组合物等。术语蛋白酶的“有效量”是指例如在定义的洗涤剂组合物中达到希望水平的酶活性的在上文描述的蛋白酶量。

如在此使用的术语“水硬度”或“硬度(degree of hardness)”或“dH”或“°dH”是指德国硬度(degree of hardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。

在此使用术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。

术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、条、糊状、喷雾、片、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的蛋白酶可相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“压缩”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。

如在此使用的术语“去污酶(stain removing enzyme)”描述帮助从织物或硬表面去除污渍或污物的酶。去污酶对特定底物起作用，例如蛋白酶对蛋白质起作用、淀粉酶对淀粉起作用、脂肪酶和角质酶对脂质(脂肪和油)起作用、果胶酶对果胶起作用并且半纤维素酶对半纤维素起作用。污渍通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身局部变色或这在物体上留下粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于洗涤液中的污物从而导致弄脏的区域变色。当酶对存在于污渍中的其特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其底物，从而帮助在洗涤过程中去除与底物相关的污物和污渍组分。例如，当蛋白酶对草污渍起作用时，它降解草中的蛋白组分并且允许在洗涤过程中释放绿色/棕色。

在此背景下，术语“减少的量”意指在其他方面相同的条件下，该组分的量小于将用于参比过程中的量。在一个优选实施例中，该量被减少例如至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％或如另外在此所述的。

术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度体系。

术语“中洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度体系。

术语“高洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度体系。

具体实施方式

在一方面，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽，该分离多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少98％序列同一性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少98％序列同一性；(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；和(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少98％、至少99％、或100％序列同一性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。在一方面，该多肽与具有SEQ ID NO:3的多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个。因此，在一个实施例中，该分离多肽在与SEQ ID NO:4的位置S173和S175相应的一个或多个位置处具有取代。在一个具体的实施例中，在与SEQ ID NO:3的位置S173相应的位置处的取代是S173P或S173Y。在另一个具体的实施例中，该多肽在与SEQ ID NO:4的位置S173和S175相应的位置处包含两个取代，其中这些取代为S173P+S175P。

在另一个实施例中，向SEQ ID NO:3的成熟多肽中引入的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过40个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39个。

本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至312或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少98％、至少99％、或100％序列同一性的具有蛋白酶活性的多肽。在一方面，该多肽与具有SEQ ID NO:3的多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个。在另一个实施例中，向SEQ ID NO:3的多肽中引入的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过40个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39个。

在一个实施例中，该蛋白酶是具有SEQ ID NO 3的蛋白酶的变体或与SEQ ID NO 3具有至少70％序列同一性的蛋白酶，其中该变体包含选自以下列表的一个或多个突变，该列表由以下各项组成：P8L、P8D、P8K、G25L、G25C、G25W、G25R、K30E、N39D、T40R、L82H、L82G、L82F、L82I、L82V、K123P、S144L、S144I、S144F、S144V、S145R、V163W、V163R、D172N、D172K、D172E、D172W、S173P、S173Y、P174H、S175P、A175S、A175K、P174*+A175*、D176P、D176P、G180I、G180Y、G180M、D207P、D207P、Y241P、D242G、Q287G、Q287H、Q287T、Y302R、I290C、T294P、Y302I以及Y302M。

在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或其全长互补体杂交(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第二版，冷泉港，纽约)。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:3的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的菌株的、编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体而言，此类探针可以遵循标准DNA印迹程序用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。这类探针涵盖于本发明中。

可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

因此，在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸1至1254、核苷酸200至1100、核苷酸400至900、或核苷酸600至800。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQID NO:2的多肽；其成熟多肽；或它的片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

在一个实施例中，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19个。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域，有利于纯化的小的延伸。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质]，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸变化具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸变化可改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可根据本领域中已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708描述。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64描述。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。对于本发明的多肽，包含氨基酸D38、H75和S254的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化活性。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于一个或多个相同启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，在该内含肽技术中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中公开的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[生物医学与生物技术期刊]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能与遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。

具有蛋白酶活性的多肽的来源

可以从任何属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用的，术语“从…获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，从给定来源获得的多肽被分泌至细胞外。

这些多肽可以是细菌蛋白酶。例如，这些多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属蛋白酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属或脲原体属蛋白酶。

在一个实施例中，该多肽是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金杆菌蛋白酶。

在一个实施例中，该多肽是芽孢杆菌属蛋白酶，在另一个实施例中，该蛋白酶是芽孢杆菌属物种。在一个具体实施例中，该多肽是具有SEQ ID NO:3的蛋白酶或SEQ ID NO:2的成熟多肽。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本多肽。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术在本领域是熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，见上文)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽或催化结构域的分离的多核苷酸，如在此所述。因此，在一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列同一性的多核苷酸。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列同一性的成熟多肽。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特征的克隆的DNA片段，来实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application[PCR:方法和应用指南]，学术出版社(Academic Press)，纽约。可使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接活化的转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自芽孢杆菌属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人，1991，Protein Expressionand Purification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含有效地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这个或这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。因此，在一个实施例中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列同一性的多核苷酸序列，并且其中该多核苷酸有效地连接至一个或多个控制序列上，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子含有转录控制序列，其介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例为从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”中；和Sambrook等人，1989，见上文中。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端有效地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由Romanos等人，1992(见上文)描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

该控制序列也可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子有效地连接到编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，一种有效地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下酶的基因获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端可固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-末端可含有对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可需要外来的信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，(Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，见上文描述。

控制序列也可为编码处于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可从以下酶的基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。

也可为合意的是添加调节序列，所述调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列有效地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，在一个实施例中，重组表达载体包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列同一性的多核苷酸序列、启动子、以及转录和翻译停止信号。

不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列有效地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线状或闭合的环状质粒。

载体可为自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有一个或多个可选择的标记，这些标记容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以含有用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列同一性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可为与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可为非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可进一步包含使该载体能够在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。

用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene[基因]98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO 00/24883)。可根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下获得：将序列的至少一个额外拷贝整合入宿主细胞基因组，或包括与多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域的技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸有效地连接于一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。因此，在一个实施例中，该重组宿主细胞包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列同一性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列连接至一个或多个控制序列上，该一个或多个控制序列指导与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列同一性的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择会在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可为在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可为任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可为任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，Gong等人，2004,Folia Microbiol.[叶线形微生物学](布拉格)49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，Choi等人，2006,J.Microbiol.Methods[应用与环境微生物学]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)，原生质体转化(参见，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人所定义的，在：Ainsworth andBisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥，英国)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)中所描述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，且碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰刀菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法描述于EP 238023、Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156、以及WO 96/00787描述。可使用由如以下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；和Hinnen等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选实施例中，该细胞是芽孢杆菌属细胞。在一个更优选实施例中，该细胞是芽孢杆菌属物种细胞。在一个最优选实施例中，该细胞选自产生具有SEQ ID NO:3的多肽的芽孢杆菌属物种。

因此，本发明的一方面涉及产生与SEQ ID NO:3具有至少97％同一性的多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。

因此，本发明的一方面涉及产生如下多肽的方法，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少97％同一性，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养宿主细胞；以及

(b)回收该多肽。

宿主细胞可以是细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌属、链球菌属或链霉菌属细胞。宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。宿主细胞可以是真菌细胞，该真菌细胞可以是酵母细胞。多种适合的宿主细胞描述于本申请的“宿主细胞”部分中。因此，在一个具体实施例中，该细胞是芽孢杆菌。

细胞或宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于该多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可使用酶测定法来确定多肽的活性。

可使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。

可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽，这些程序包括但不限于：色谱(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法、和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在一个替代的方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

洗涤剂组合物

本发明还涉及包含本发明的蛋白酶的组合物。优选地，这些组合物富含本发明的蛋白酶。术语“富含”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加。

在一个实施例中，本发明涉及组合物，特别是涉及如下所述包含本发明的蛋白酶和至少一种合适的清洁/洗涤剂相关成分例如下所述表面活性剂、助洗剂、漂白剂的清洁组合物和/或洗涤剂组合物。

本发明还涉及组合物，优选洗涤剂组合物，这些组合物包含具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：a)一种多肽，该多肽与SEQ IDNO:3具有至少60％序列同一性、至少65％序列同一性、至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少65％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少91％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少93％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少94％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少96％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少97％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少98％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性的并且与SEQ ID NO:3具有至少99％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，本发明的组合物包含具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的分离的多肽。

在一个实施例中，该组合物是洗涤剂组合物，其可以适于具体用途，例如衣物洗涤(特别是家用衣物洗涤)、餐具洗涤或硬表面清洁。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：待清洁的织物的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。

该洗涤剂组合物可以适合于纺织品的洗涤或适合于硬表面清洁，包括餐具洗涤(包括自动餐具洗涤)。

在本发明的一个实施例中，可以将本发明的蛋白酶以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.001-200mg的蛋白，例如0.005-100mg的蛋白，优选0.01-50mg的蛋白，更优选0.05-20mg的蛋白，甚至更优选0.1-10mg的蛋白。

可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些稳定剂例如是多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如(例如)WO 92/19709和WO 92/19708中所述进行配制，或者可以使用如WO 2005/105826和WO 2009/118375所述的肽醛或酮使根据本发明的蛋白酶稳定化。本发明的蛋白酶还可以掺入WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，将该专利通过引用而特此结合。

液体洗涤剂组合物

本发明的蛋白酶可以配制在液体衣物洗涤组合物(例如液体衣物洗涤组合物)中，该衣物洗涤组合物包含：

a)至少0.005mg活性蛋白酶/升洗涤剂，其中该蛋白酶与SEQ ID NO 3具有至少60％序列同一性，

b)2wt％至60wt％的至少一种表面活性剂，以及

c)5wt％至50wt％的至少一种助洗剂粉末组合物

该洗涤剂组合物也可以配制为用于衣物洗涤或餐具洗涤的颗粒洗涤剂。本发明的一个实施例涉及颗粒洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含

a)至少0.005mg活性蛋白酶/克组合物，其中该蛋白酶与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性，

b)5wt％至50wt％阴离子表面活性剂

c)1wt％至8wt％非离子表面活性剂，以及

d)5wt％至40wt％助洗剂，例如碳酸盐、沸石、磷酸盐助洗剂、钙螯合助洗剂或络合剂，

对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性，并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且包括本领域中已知的任何常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％，如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)、及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，具体地从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、及其组合。

助水溶剂

该洗涤剂可以含有按重量计0-5％，如约0.5％至约5％，或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂

该洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％，如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具清洗洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐(如三磷酸钠(STP或STPP))、碳酸盐(如碳酸钠)、可溶性硅酸盐(如偏硅酸钠)、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA)和三乙醇胺(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。进一步的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。

漂白系统

洗涤剂可以含有按重量计0-30％，如约1％至约20％的漂白系统。可以利用包含本领域已知的用于清洁洗涤剂中的组分的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括过氧化氢的来源；过酸的来源；和漂白催化剂或增效剂。

过氧化氢的来源：适合的过氧化氢的来源是无机过酸盐，包括碱金属盐例如过碳酸钠和过硼酸钠(通常是一水合物或四水合物)，以及过氧化氢―尿素(1/1)。

过酸的来源：过酸可以是(a)直接作为预成型过酸掺入，或(b)从过氧化氢和漂白活化剂(过水解)在洗涤液中原位形成，或(c)从过氧化氢和过氧化氢酶和后者适合的底物(例如酯)在洗涤液中原位形成。

a)适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸例如过氧苯甲酸及其环取代的衍生物、过氧基-α-萘甲酸、过氧邻苯二甲酸、过氧月桂酸、过氧硬脂酸、ε-邻苯二甲酰亚氨基过氧羊油酸[邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)]、和邻-羧基苯甲酰胺基过氧羊油酸；脂肪族和芳香族二过氧二羧酸例如二过氧十二烷二酸、二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧十三烷二酸、2-癸基二过氧丁二酸、以及二过氧邻苯二甲酸、二过氧间苯二甲酸和二过氧对苯二甲酸；过亚氨酸；过氧单硫酸；过氧二硫酸；过氧磷酸；过氧硅酸；以及所述化合物的混合物。应当理解的是，在有些情况下，所提到的过酸可能最好是作为适合的盐的添加，例如碱金属盐(例如)或碱土金属盐。

b)适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺、腈类或酸酐类别的那些，以及适用时，其盐。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸钠(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸钠、4-(癸酰基氧基)苯甲酸(DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸钠(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋精)具有它们是环境友好的优点。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。

漂白催化剂和增效剂：该漂白系统还可以包括漂白催化剂或增效剂。可用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，具体地是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2″-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。这些漂白催化剂也可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。

在其中过酸的来源包括在内的一些实施例中，可以使用具有下式之一的有机漂白催化剂或漂白增效剂：

(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9到24个碳的支链烷基或含有从11到24个碳的直链烷基，优选地每个R1独立地是含有从9到18个碳的支链烷基或含有从11到18个碳的直链烷基，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。

其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、EP 1867708(维生素K)以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。

聚合物

洗涤剂可以含有按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物(如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276以及EP 1876226(通过引用而特此结合)中。洗涤剂组合物优选包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257、WO2007/087243中。

另外的酶

洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶，如另外的蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。

其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％同一性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％同一性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme Premium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

蛋白酶：待与本发明的蛋白酶一起使用的适合的另外的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程学]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质工程学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶子组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO95/23221中所述)、以及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是于以下各项中描述的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、24、27、42、55、59、60、66、74、85、96、97、98、99、100、101、102、104、116、118、121、126、127、128、154、156、157、158、161、164、176、179、182、185、188、189、193、198、199、200、203、206、211、212、216、218、226、229、230、239、246、255、256、268以及269。其中所述位置对应于WO 2016/001449的SEQ ID NO 1所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的位置。更优选枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、S9E、A15T、S24G、S24R、K27R、N42R、S55P、G59E、G59D、N60D、N60E、V66A、N74D、N85S、N85R、、G96S、G96A、S97G、S97D、S97A、S97SD、S99E、S99D、S99G、S99M、S99N、S99R、S99H、S101A、V102I、V102Y、V102N、S104A、G116V、G116R、H118D、H118N、N120S、S126L、P127Q、S128A、S154D、A156E、G157D、G157P、S158E、Y161A、R164S、Q176E、N179E、S182E、Q185N、A188P、G189E、V193M、N198D、V199I、Y203W、S206G、L211Q、L211D、N212D、N212S、M216S、A226V、K229L、Q230H、Q239R、N246K、N255W、N255D、N255E、L256E、L256D、T268A、R269H。这些蛋白酶变体优选地是在WO 2016/001449的SEQ ID NO 1中所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的变体、或在WO 2016/001449的SEQ ID NO 2中所示的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶(BPN’)的变体。这些蛋白酶变体与WO 2016/001449的SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2优选地具有至少80％序列同一性。

在以下一个或多个位置包含取代的蛋白酶变体,该位置相应于WO 2004/067737的SEQ ID NO:1的位置171、173、175、179或180，其中所述蛋白酶变体与WO 2004/067737的SEQID NO:1具有至少75％但少于100％的序列同一性。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商标名下出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、Blaze100T、Blaze125T、Blaze150T、和(诺维信公司(Novozymes A/S))，在以下商标名下出售的那些：PurafectPurafect Excellenz P1000^TM、Excellenz P1250^TM、Preferenz P100^TM、PurafectPreferenz P110^TM、Effectenz P1000^TM、Effectenz P1050^TM、PurafectEffectenz P2000^TM、和(丹斯尼克公司(Danisco)/杜邦公司(DuPont))、Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.)、BLAP(在US5352604的图29中所示的序列)及其变体(汉高公司)和来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如描述于EP258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。

其他实例是例如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所描述的那些脂肪酶变体。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。

淀粉酶：可以与本发明的蛋白酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。这种杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

另外的适合的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的变体的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

能被使用的另外的淀粉酶是那些具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的淀粉酶或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQID NO:7的优选的变体是在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的变体的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置中具有缺失的那些，例如位置181和182、182和183、或位置183和184。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。

其他可以使用的淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2或WO 01/66712的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是具有C末端截短和/或在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包含取代和/或在位置180和/或位置181处包含缺失。

其他的合适的淀粉酶是具有在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的淀粉酶或与SEQID NO:12具有90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。

其他的实例是淀粉酶变体，例如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternational Inc./DuPont))。

过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶、及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司)。

可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。

无尘颗粒例如可以如在US 4,106,991和4,661,452中所披露的那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有从12个至20个碳原子并且存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。

分散剂

本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。适合的分散剂例如描述于Powdered Detergent[粉末洗涤剂]，Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]，第71卷，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)。

染料转移抑制剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。

荧光增白剂

本发明的洗涤剂组合物将优选地还含有另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物类型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。

适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污垢释放聚合物

本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉和基于聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents[粉末洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如EP1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。在以上污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他适合的辅料

包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何合宜的形式，例如，条，均质片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个隔室的袋，常规或压型粉末，颗粒，糊剂，凝胶或常规、压型或浓缩液体。洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器配量单位的形式。袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，其包含可水解降解的并且是水溶性聚合物的共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在商品参考号M8630下，如由克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris CraftIn.Prod.)，盖里，印第安纳州，美国销售)加增塑剂，如甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与含有固体的室不同。参考：(US2009/0011970 A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。因此，可以避免组分间的不良的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且高达95％的水，如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

洗衣皂条

本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(如衣物皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地是条的形式但也可能是其他的固体形状如圆形或椭圆。

该衣物皂条可以含有一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，因此该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗涤皂条还可以含有络合剂像EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合的污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、粘合剂、浸出剂、漂白活化剂、粘土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散剂、增亮剂、织物柔软剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备含有肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包含研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。

颗粒洗涤剂配制品

如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO09/021813、WO 09/030632以及WO 09/015951。

WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO 2011005830、WO2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO2010120863、WO 2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO 2010024467、WO2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、WO2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO 2010099997、WO2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO 2010069957、WO2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO 2010003792、WO2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO 2010105942、WO2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO 2010078979、WO2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO 2010066486、WO2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO 2010049187、WO2010031607、WO 2010000636。

用途

本发明针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物的方法。本发明可以在纺织品和织物的湿洗(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)中使用其组合物。本发明针对用于在硬表面清洁例如自动餐具洗涤(ADW)、汽车洗涤以及工业表面清洁中使用其组合物的方法。

本发明蛋白酶在洗涤剂组合物和清洁过程中的用途

对于洗涤剂配制者而言重要的污物和污渍由许多不同物质构成，已经开发具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用至其中的清洁过程中特异性地改进污渍去除。本领域中已知的去污酶包括以下酶，例如糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶以及果胶酶。

在一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的分离的多肽在洗涤剂组合物和清洁过程，例如洗衣和硬表面清洁中的用途。

在另一方面，本发明涉及本发明的蛋白酶在洗涤剂组合物和清洁过程，例如洗衣和硬表面清洁中的用途。因此，在一个实施例中，本发明展示了本发明的蛋白酶对各种污渍以及在各种条件下的洗涤效果。在本发明的一个具体实施例中，该洗涤剂组合物及在清洁过程中的用途涉及本发明的蛋白酶与以上提及的去污酶中的至少一种一起使用。

在本发明的一个优选方面，本发明的蛋白酶可以与另外的酶组合，这些另外的酶具体描述于“其他酶”部分中；优选地将本发明的蛋白酶与至少两种酶，更优选是至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如碳水化合物分解活性(carbolytic activity)、蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。在本发明的一个实施例中，本发明的蛋白酶可以与一种或多种金属蛋白酶组合，例如M4金属蛋白酶，包括Neutrase^TM或嗜热菌蛋白酶。此类组合可以进一步包含如上概述的其他洗涤剂酶的组合。

清洁过程或纺织品护理过程可以例如是洗衣过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。洗衣过程可以例如是家用洗衣，但是它也可以是工业洗衣。此外，本发明涉及用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用含有洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品护理过程。洗涤溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水性洗涤溶液。

经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或本发明的纺织品保养过程可以是常规的可洗涤洗衣，例如家用洗涤。优选地，洗衣的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的实例是棉布和/或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。

最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或新酶相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)具有替代和/或改进的特性时，需要新酶来实现与传统洗涤剂组合物比较时类似或改进的洗涤性能。

本发明的蛋白酶可用于蛋白质污渍去除过程。蛋白质污渍可能是如食品污渍等污渍，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其组合。

典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污渍被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。再其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。

在一个具体实施例中，本发明涉及包含本发明的蛋白酶的组合物在洗衣或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包含以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分。

因此，在一个实施例中，本发明涉及包含与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的多肽的组合物在衣物或餐具洗涤中的用途，其中该组合物进一步包含以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分。

在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量有所减少。优选地，作为表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分按以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个实施例中，将本发明的蛋白酶用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。

洗涤方法

包含本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物理想地适用于在洗衣应用中使用。因此，本发明包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包含能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约8的pH。可以在溶液中按以下浓度使用这些组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约90℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。

在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下进行该洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。

在多个具体实施例中，在以下硬度下进行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。

本发明涉及用包含本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。

一个优选实施例涉及清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包含本发明的蛋白酶的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合物是一种洗涤剂组合物并且该过程是一个洗衣或餐具洗涤过程。

另一个实施例涉及一种用于从织物上除去污渍的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包含本发明的蛋白酶的组合物接触。

在一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包含至少一种如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，如选自下组的酶，该组由以下各项组成：糖酶、淀粉酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶或角质酶或其组合。在又另一个优选实施例中，这些组合物包含减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分或聚合物。

实例

实例1：表达与纯化：

来自芽孢杆菌属物种(SEQ ID NO 1)的编码基因的分离、基因组测序和鉴定。

将来自芽孢杆菌属物种的细菌菌株芽孢杆菌属物种从环境样品中分离，并且将通过16S核糖体亚基基因的的测序所鉴定的物种在表1中列出。

表1：

通过使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国)分离来自细菌菌株的染色体DNA。将2ug的染色体DNA送至FASTERISSA，瑞士进行基因组测序。通过Illumina测序来对基因组进行测序。分析得到的基因组序列，并且使用BLAST程序通过检索与蛋白酶TY-145(SEQ ID NO:4)进行比较来鉴定S8蛋白酶。编码本发明多肽的鉴定基因的DNA序列作为SEQ ID NO:1包括在序列表中。

来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶在枯草芽孢杆菌表达宿主中的克隆与表达。

为了来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶(SEQ ID NO:3)的表达克隆，使用线性整合载体系统。线性整合构建体是PCR融合产物，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间的基因连同强启动子与氯霉素抗性标记的融合制备。通过重叠延伸拼接(SOE)PCR进行融合(Horton，R.M.、Hunt，H.D.、Ho，S.N.、Pullen，J.K.以及Pease，L.R.(1989)，Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes，gene splicingby overlap extension[不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接的工程化杂种基因]Gene[基因]77:61-68)。专利申请WO 2003/095658中也描述了SOE PCR方法。在三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包括稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金杆菌cryIIIA启动子组成。编码氯霉素乙酰基转移酶的基因被用作标记(描述于例如Diderichsen，B.；Poulsen,G.B.；Joergensen,S.T.；A useful cloning vector forBacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的有用的克隆载体]30:312(1993))。在芽孢杆菌染色体上通过同源重组将最终的基因构建体整合到果胶酸裂解酶位点中。用含有至两个侧翼载体片段的突出端的基因特异性引物从对应的菌株的染色体DNA扩增基因片段(以下列出了引物序列)。用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQ ID NO:8))代替天然的分泌信号来表达所有的基因。

用于PCR扩增的引物：

正向引物：GTTCATCGATCGCATCGGCTCAGCAGGTTGAGAGCAATGA(SEQ ID NO:6)

反向引物：GCGTTTTTTTATTGATTAACGCGTTTACTTTACACGCGGGAAGC(SEQ ID NO:7)

使这两个载体片段和该基因片段经受SOE PCR反应，以将这三个片段装配到线性载体构建体中。将等分部分的该PCR产物转化到枯草芽孢杆菌中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB琼脂板上选择转化体。使含有该整合表达构建体的所得重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。收获含有酶的上清液并如以下所述的将这些酶进行纯化。

实例2来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的纯化

将培养液离心(26000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余的芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液以1:1与3.0M(NH₄)₂SO₄混合，并且将该混合物施加到苯基-琼脂糖FF(高取代(high sub))柱(来自GE医疗公司(GE Healthcare))上，该柱以100mM H₃BO₃、10mM MES/NaOH、2mM CaCl₂、1.5M(NH₄)₂SO₄(pH 6.0)平衡。在用平衡缓冲液洗涤该柱之后，将蛋白酶用100mM H₃BO₃、10mMMES、2mM CaCl₂(pH 6.0)进行逐步洗脱。收集洗脱峰(含有蛋白酶活性)，并且施加至在100mM H₃BO₃、10mM MES、2mM CaCl₂(pH 6.0)中平衡的杆菌肽琼脂糖柱(来自Upfront层析公司(Upfront chromatography))上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将蛋白酶用具有25％(v/v)2-丙醇的100mM H₃BO₃、10mM MES、2mM CaCl₂、1M NaCl(pH 6.0)洗脱。将洗脱峰(含有蛋白酶活性)转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的20mM MES、2mM CaCl₂(pH6.0)。经G25转移的峰是纯化的制剂，并且将其用于进一步实验。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白酶制剂，并且将凝胶用考马斯染色，看到了大约36-37kDa的主带，并且看到了两条分别为大约29Da和7-8kDa的次带。埃德曼降解显示次带代表带切口的蛋白酶分子。这得到如下事实的支持，即如果在没有还原剂的情况下跑胶，在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅看到一条带，表明分子内硫桥连接了带切口的蛋白酶分子的两部分。

通过蛋白酶活性测定使用Suc-AAPF-pNA作为底物测试纯化的蛋白酶的活性。如下进行该测定：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨(Bachem)L-1400)。

温度：室温(25℃)

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 9.0。

将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD₄₀₅的初始增加作为蛋白酶活性的量度。

本领域技术人员已知替代性测定，可以使用这些替代性测定以便确定具有蛋白酶活性的多肽或像这样的蛋白酶的活性。

实例3通过定点诱变构建蛋白酶变体

定点变体是构建自包含根据本发明的具体的取代的芽孢杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)。使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸(在所得序列中引入了所希望的突变)，通过传统的DNA片段克隆制得这些变体(Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]，第2版，冷泉港，1989)。

对应于在希望的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列合成诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离。以此方式，构建并产生下表2中所列的变体。

为了测试本发明的蛋白酶变体，将包含本发明的变体的突变DNA转化到一个感受态枯草芽孢杆菌菌株并使用标准方案发酵(TB-甘油介质，3-4天，30℃)。

表2-SEQ ID NO:3的变体

实例4：用来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶进行TOM洗涤

使用Tergo-O-Meter(TOM)洗涤系统，使用洗衣液标准洗涤剂在六种不同的污渍上测试来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤性能。Tergo-O-Meter(TOM)是中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试多达16种不同洗涤条件。TOM基本上是大型的具有多达16个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机并且在实验期间，它们中的每一者含有特定洗涤剂/酶系统的溶液和污染的和未污染的织物。使用污染的和未污染的织物，可以确定该特定洗涤剂/酶系统的性能。可以通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体。因为TOM烧杯没有盖子，在TOM实验过程中抽取样品是可能的，并且从而便于选择在洗涤过程中在线收集信息。TOM标准洗涤系统主要可以用于洗涤剂和酶的中等规模测试，在US或LA(拉丁美洲)或AP(亚太地区)洗涤条件下。在TOM实验中，如‘压载物与污物’的比率和‘织物与洗涤液’的比率的因素可以变化。因此，TOM提供了在小规模实验(如AMSA和微型洗涤)与在顶部加载型衣物洗涤机中的更费时的全规模实验之间的联系。通过使用水浴进行TOM实验，水浴具有多达16个钢制烧杯并且每个烧杯一个旋转臂，每个烧杯的容量是500或1200mL的洗涤剂溶液。该实验在从5℃至80℃的温度范围内进行。水浴充满去离子水，并且旋转速度设为70至120rpm/min。所有烧杯都是干净的并且不含微量的先前测试材料。然后在桶中制备具有所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度的洗涤溶液。洗涤剂在磁搅拌10min期间溶解。洗涤溶液在制备之后30至60min之内使用。将1000ml洗涤溶液添加至各TOM烧杯，并且开始在120rpm下搅拌。向用于测试本发明酶的那些烧杯中，将酶添加至烧杯中。将与压载物混合的小块布样(亦称“织物”)喷湿并装入烧杯中。当小块布样和压载物添加到烧杯中时开始时间测量。洗涤进行30分钟，并且通过停止搅拌烧杯来停止。将洗涤加载物从TOM烧杯转移到筛，以便用冷自来水冲洗。将小块布样和压载物转移到欧洲洗涤机，进行14min的冲洗循环。将小块布样与压载物分离并且置于被纸覆盖的托盘上。将另一张纸加至小块布样的顶部。使小块布样干燥过夜，并且然后如以下所描述的在Color Eye下测量。实验条件总结于表3中。

表3：用于洗衣实验的实验条件

通过向测试系统中添加CaCl₂、MgCl₂及NaHCO₃来调节水硬度。

表4：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值

表4的结果显示，包含芽孢杆菌属物种的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋(CS-37)、血/奶/墨(C-05、EMPA117)、血(CS-01)、巧克力/奶(C-H010，PC-03)和草(062KC)污渍的洗涤性能。

表5：在20℃下，与洗涤剂TY-145蛋白酶(SEQ ID NO 8)相比，包含来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤剂的相对洗涤性能

实例5：使用来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶进行AMSA洗涤

使用自动机械应力测定(AMSA)，使用洗衣液标准洗涤剂在五种不同技术污渍上测试来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤性能。通过AMSA，可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液在洗衣中的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，该盖子将待洗涤的纺织品对槽开口强力挤压。在洗涤期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是在第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。

表6：标准洗涤剂和测试材料如下：

测试材料从EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG，12，CH-9015St.Gallen，瑞士)，从测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)和WFK测试织物有限公司(WFK Testgewebe GmbH)(Christenfeld10，D-41379Brüggen，德国)获得。

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水漂洗并干燥。

将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak)，Midtager 29，DK-2605丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(Int)：

使用单循环洗涤程序，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表7中所指定。

表7：用于洗衣实验的实验条件

表8：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤剂的Δ强度值

表8的结果显示，包含芽孢杆菌属物种的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋(CS-38)、血/奶/墨(EMPA117EH)、血(CS-01)和巧克力/奶(PC-03，C-03)的洗涤性能。

实例6：来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的AMSA剂量反应洗涤

使用四种不同洗涤剂在三种不同污渍上测试来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的剂量反应洗涤性能。

如在AMSA中针对洗衣方法所描述的，使用单循环洗涤程序，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表9中所指定。

表9：用于洗衣实验的实验条件

通过向测试系统中添加CaCl₂、MgCl₂及NaHCO₃来调节水硬度。在洗涤之后，将纺织品用自来水漂洗并干燥。

表10：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的性能

表10的结果显示，包含芽孢杆菌属物种的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋、血/奶和巧克力/奶的洗涤性能。

实例7：来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的微型洗涤结果

使用微型洗涤系统，使用洗衣液标准洗涤剂在一种技术污渍上测试来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤性能。

微型洗涤测定是如下测试方法，其中污染的纺织品被连续地提起放进测试溶液中并且随后漂洗。

表11：在以下指定的实验条件下进行洗涤实验：

测试材料从EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG，12，CH-9015St.Gallen，瑞士)，从测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)和WFK测试织物有限公司(WFK Testgewebe GmbH)(Christenfeld 10，D-41379 Brüggen，德国)获得。

随后将纺织品风干并且将洗涤性能测量为这些纺织品的颜色的亮度。还可以将亮度表示为反射比(R)，反射比是当用白光照射时，从测试材料反射或发射的光的量度。使用Zeiss MCS 521 VIS分光光度计在460nm处测量纺织品的反射比(R)。根据制造商的方案进行测量。

通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem_酶。

如在微型洗涤测定中针对洗衣方法所描述的，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表12中所指定。

表12：用于微型洗涤洗衣实验的实验条件

表13：在30℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤剂的Δ强度值

洗涤剂	酶剂量nM	洗衣液标准洗涤剂
			芽孢杆菌属物种	0.0	0
	1.2	0
				2.4	0
	4.7	0.3
				9.5	0.4
	28.4	2.3

表13的结果显示，包含芽孢杆菌属物种的洗涤剂改进了在30℃下对巧克力/奶的洗涤性能。

实例8：来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的满量程洗涤结果

在满量程洗涤(full scale wash)中，测试来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤性能。在洗衣液标准洗涤剂B中，在14种不同的污渍上在90nM下测试洗涤性能。

洗涤并冲洗之后，将小块布样摊开铺平并且允许在室温下风干过夜。在洗涤的次日评估所有洗涤。使用具有非常小孔径的Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计进行小块布样的光反射评估。在入射光中没有UV的情况下进行测量并且提取460nm处的反射。在未洗涤的和洗涤的小块布样上进行测量。将有待测量的测试小块布样放置在相同类型和颜色的另一个小块布样的顶部。

通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem_酶。将洗涤性能表示为Δ反射值(ΔRem)。

用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表14中所指定。

表14：用于满量程洗涤洗衣实验的实验条件

通过将CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。

表15：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值

污渍	90nM
		CS-01	2.1
WE5DASBWKc	2.7
		C-05	4.6
EMPA 116	6.1
		EMPA 117	7.1
C-03	1.2
		PC-03	6.0
C-H010	4.8
		EMPA 112	5.3
CS-37	13.0
		10EG	7.0
C-10	6.2

表15的结果显示，包含芽孢杆菌属物种的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋(CS-37，WFK10EG)、血(CS-01，WE5DASBWKc)、血/奶/墨(C-05，EMPA116，EMPA117)，草(EMPA164)、奶(C-10)和巧克力/奶(C-H010，PC-03，C-03，EMPA112)的洗涤性能。

实例9：SEQ ID NO:3变体的储存稳定性测定

标准B型洗涤剂：DC-2011-00146-35

测定缓冲液：100mM Tris，pH 8.6。

底物溶液：在测定缓冲液中0.72mg/ml Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(巴亨公司L-1400)

在标准B型洗涤剂中蛋白酶变体的储存稳定性通过以下来评估：将蛋白酶与洗涤剂混合并在32℃或35℃孵育0、2-2.5和23-25小时后测量残留蛋白酶活性。所有变体一式两份进行测试，并且在所有平板上包括SEQ ID NO 3参比培养上清液。将含有蛋白酶变体(或作为参照的SEQ ID NO 3)的30μl培养上清液与270μl标准B型液体洗涤剂在微量滴定板(Nunc U96PP 0.5ml)的孔中使用磁棒进行混合(在Zephyr移液工作站(CaliperLifeSciences公司)上持续30min)。然后将20μl的这种混合物转移至另一个微量滴定板(加有磁棒的Nunc U96PP 0.5ml)中，并且与150μl测定缓冲液混合(在Zephyr上至少混合5min)。将30μl的这种稀释液转移至Nunc F 96-MTP中，并且在添加70μl底物溶液后，通过每20sec在405nm下测量吸光度持续5min来确定非应激样品的初始活性(在SpectraMax Plus上)。从在405nm下的吸光度初始线性增加的斜率确定活性。在密封后，将洗涤剂板在艾本德恒温混匀仪(Eppendorf Thermomixer)中在32℃或35℃下进行孵育(未振荡)。在2-2.5和23-25小时孵育后，抽取20μl样品，并且像初始非应激活性一样，测量应激样品的残余活性。

在用洗涤剂孵育过程中的活性下降被假定为指数式的。从Log(活性)对孵育时间的线性回归发现半衰期(T1/2)，并且将半衰期改进因子(T1/2IF)计算为相对于该PTYH004参考的半衰期的蛋白酶变体的半衰期。

表16：标准B型中变体的储存稳定性，T1/2IF：相对于SEQ ID NO 3参考的半衰期改进因子

序列表

<110> 诺维信A/S

<120> 具有蛋白酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸

<130> 12773-WO-PCT

<160> 8

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(81)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1254)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (319)..(1254)

<400> 1

atg aag aaa aaa aga ata att gga tca gcg gta tta agt gtc gca atg 48

Met Lys Lys Lys Arg Ile Ile Gly Ser Ala Val Leu Ser Val Ala Met

-105 -100 -95

ggg ctt tct gta ttt gca tca ggg gca ttt ggc cag cag gtt gag agc 96

Gly Leu Ser Val Phe Ala Ser Gly Ala Phe Gly Gln Gln Val Glu Ser

-90 -85 -80 -75

aat gaa acc tac cgg gtc gtt att cag gga cca agt gcg gaa aag gca 144

Asn Glu Thr Tyr Arg Val Val Ile Gln Gly Pro Ser Ala Glu Lys Ala

-70 -65 -60

aag gca aaa tcg aac tac gga gta cgg tgg gat ttt gga cag aaa ggt 192

Lys Ala Lys Ser Asn Tyr Gly Val Arg Trp Asp Phe Gly Gln Lys Gly

-55 -50 -45

ttt act aca aca gtc aat gct aaa cag tat cag gca ctt tta aaa aat 240

Phe Thr Thr Thr Val Asn Ala Lys Gln Tyr Gln Ala Leu Leu Lys Asn

-40 -35 -30

aaa aac tta aag att gat aga gta gat gaa gtt aag aat gca cct gtg 288

Lys Asn Leu Lys Ile Asp Arg Val Asp Glu Val Lys Asn Ala Pro Val

-25 -20 -15

aca gct gca aaa cct gga tcg ggg gct gca tca gct ccg gca gac ggt 336

Thr Ala Ala Lys Pro Gly Ser Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Asp Gly

-10 -5 -1 1 5

aca cct tgg gga att gag gcc att tat aat gac agc tcc atc caa agc 384

Thr Pro Trp Gly Ile Glu Ala Ile Tyr Asn Asp Ser Ser Ile Gln Ser

10 15 20

act tca ggc gga aat ggg gta aaa gtt gcc gtg ctg gac aca ggg gta 432

Thr Ser Gly Gly Asn Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val

25 30 35

aat aca gcg cat gct gac ctt gct gga caa gct gaa cag tgt aaa gac 480

Asn Thr Ala His Ala Asp Leu Ala Gly Gln Ala Glu Gln Cys Lys Asp

40 45 50

ttt aca caa aga aag aca cct tta att gac gga agc tgc gga gac aag 528

Phe Thr Gln Arg Lys Thr Pro Leu Ile Asp Gly Ser Cys Gly Asp Lys

55 60 65 70

aac gga cac ggc aca cat gtt gcg ggt act gta ctg gct cat ggc ggc 576

Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala His Gly Gly

75 80 85

gct aac gga caa ggc gtt tat ggg gtc gct cca gac gca gat ctc tgg 624

Ala Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro Asp Ala Asp Leu Trp

90 95 100

gca tat aag gtg tta aat gac aga gga tca ggg tat tct gat gac atc 672

Ala Tyr Lys Val Leu Asn Asp Arg Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Asp Ile

105 110 115

gcc gga gct att aag cat gcg gcc gat gaa gcg gtc cgc aca gga tct 720

Ala Gly Ala Ile Lys His Ala Ala Asp Glu Ala Val Arg Thr Gly Ser

120 125 130

aaa gtg gtc att tcc atg tca tta ggt tca agc tct aaa agc aca ttg 768

Lys Val Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Ser Ser Ser Lys Ser Thr Leu

135 140 145 150

att gca gat gca gtt gat tac gca tac agc aaa ggt gtc ctg gta gtg 816

Ile Ala Asp Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Ser Lys Gly Val Leu Val Val

155 160 165

gct gct gcc gga aat gat ggt cct gcc gat aac acg att ggc tat cct 864

Ala Ala Ala Gly Asn Asp Gly Pro Ala Asp Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

170 175 180

ggc gca ttg gtg aat gct gtt gca gtg gcg gct ctt gaa aat gtt cag 912

Gly Ala Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala Leu Glu Asn Val Gln

185 190 195

caa aat gga tcc tac cgt gtt gca gat ttt tca tca cgg ggc aat cct 960

Gln Asn Gly Ser Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser Ser Arg Gly Asn Pro

200 205 210

gca act gat ggc gac ttc gtg att cag gag cgt gat gtt gag gtg tct 1008

Ala Thr Asp Gly Asp Phe Val Ile Gln Glu Arg Asp Val Glu Val Ser

215 220 225 230

gca cca ggc aga gcg att gaa tcc aca tgg tat gat ggc agc tac agc 1056

Ala Pro Gly Arg Ala Ile Glu Ser Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Ser

235 240 245

aca atc agc ggc aca tcc atg gct act ccc cat gta tcc gga ttg gct 1104

Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Leu Ala

250 255 260

gct aag atc tgg gcc caa aat cca tcc atg tcc cat aca cag ctt cgc 1152

Ala Lys Ile Trp Ala Gln Asn Pro Ser Met Ser His Thr Gln Leu Arg

265 270 275

gcc gag ctt cag agc cgg gcc aag caa aat gat att ctt ggc gga aca 1200

Ala Glu Leu Gln Ser Arg Ala Lys Gln Asn Asp Ile Leu Gly Gly Thr

280 285 290

gga gct gcc gct gga gat gat tat gca tca ggc ttt ggc ttc ccg cgt 1248

Gly Ala Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly Phe Gly Phe Pro Arg

295 300 305 310

gta aag taa 1257

Val Lys

<210> 2

<211> 418

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 2

Met Lys Lys Lys Arg Ile Ile Gly Ser Ala Val Leu Ser Val Ala Met

-105 -100 -95

Gly Leu Ser Val Phe Ala Ser Gly Ala Phe Gly Gln Gln Val Glu Ser

-90 -85 -80 -75

Asn Glu Thr Tyr Arg Val Val Ile Gln Gly Pro Ser Ala Glu Lys Ala

-70 -65 -60

Lys Ala Lys Ser Asn Tyr Gly Val Arg Trp Asp Phe Gly Gln Lys Gly

-55 -50 -45

Phe Thr Thr Thr Val Asn Ala Lys Gln Tyr Gln Ala Leu Leu Lys Asn

-40 -35 -30

Lys Asn Leu Lys Ile Asp Arg Val Asp Glu Val Lys Asn Ala Pro Val

-25 -20 -15

Thr Ala Ala Lys Pro Gly Ser Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Asp Gly

-10 -5 -1 1 5

Thr Pro Trp Gly Ile Glu Ala Ile Tyr Asn Asp Ser Ser Ile Gln Ser

10 15 20

Thr Ser Gly Gly Asn Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val

25 30 35

Asn Thr Ala His Ala Asp Leu Ala Gly Gln Ala Glu Gln Cys Lys Asp

40 45 50

Phe Thr Gln Arg Lys Thr Pro Leu Ile Asp Gly Ser Cys Gly Asp Lys

55 60 65 70

Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala His Gly Gly

75 80 85

Ala Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro Asp Ala Asp Leu Trp

90 95 100

Ala Tyr Lys Val Leu Asn Asp Arg Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Asp Ile

105 110 115

Ala Gly Ala Ile Lys His Ala Ala Asp Glu Ala Val Arg Thr Gly Ser

120 125 130

Lys Val Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Ser Ser Ser Lys Ser Thr Leu

135 140 145 150

Ile Ala Asp Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Ser Lys Gly Val Leu Val Val

155 160 165

Ala Ala Ala Gly Asn Asp Gly Pro Ala Asp Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

170 175 180

Gly Ala Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala Leu Glu Asn Val Gln

185 190 195

Gln Asn Gly Ser Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser Ser Arg Gly Asn Pro

200 205 210

Ala Thr Asp Gly Asp Phe Val Ile Gln Glu Arg Asp Val Glu Val Ser

215 220 225 230

Ala Pro Gly Arg Ala Ile Glu Ser Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Ser

235 240 245

Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Leu Ala

250 255 260

Ala Lys Ile Trp Ala Gln Asn Pro Ser Met Ser His Thr Gln Leu Arg

265 270 275

Ala Glu Leu Gln Ser Arg Ala Lys Gln Asn Asp Ile Leu Gly Gly Thr

280 285 290

Gly Ala Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly Phe Gly Phe Pro Arg

295 300 305 310

Val Lys

<210> 3

<211> 312

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 3

Ser Ala Pro Ala Asp Gly Thr Pro Trp Gly Ile Glu Ala Ile Tyr Asn

1 5 10 15

Asp Ser Ser Ile Gln Ser Thr Ser Gly Gly Asn Gly Val Lys Val Ala

20 25 30

Val Leu Asp Thr Gly Val Asn Thr Ala His Ala Asp Leu Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Arg Lys Thr Pro Leu Ile Asp

50 55 60

Gly Ser Cys Gly Asp Lys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr

65 70 75 80

Val Leu Ala His Gly Gly Ala Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala

85 90 95

Pro Asp Ala Asp Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Asn Asp Arg Gly Ser

100 105 110

Gly Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Gly Ala Ile Lys His Ala Ala Asp Glu

115 120 125

Ala Val Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Lys Ser Thr Leu Ile Ala Asp Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Ser

145 150 155 160

Lys Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Asp Gly Pro Ala Asp

165 170 175

Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Gly Ala Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala

180 185 190

Ala Leu Glu Asn Val Gln Gln Asn Gly Ser Tyr Arg Val Ala Asp Phe

195 200 205

Ser Ser Arg Gly Asn Pro Ala Thr Asp Gly Asp Phe Val Ile Gln Glu

210 215 220

Arg Asp Val Glu Val Ser Ala Pro Gly Arg Ala Ile Glu Ser Thr Trp

225 230 235 240

Tyr Asp Gly Ser Tyr Ser Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro

245 250 255

His Val Ser Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ala Gln Asn Pro Ser Met

260 265 270

Ser His Thr Gln Leu Arg Ala Glu Leu Gln Ser Arg Ala Lys Gln Asn

275 280 285

Asp Ile Leu Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Ala Ser

290 295 300

Gly Phe Gly Phe Pro Arg Val Lys

305 310

<210> 4

<211> 311

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 4

Ala Val Pro Ser Thr Gln Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ser Ile Tyr Asn

1 5 10 15

Asp Gln Ser Ile Thr Lys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ile Lys Val Ala

20 25 30

Val Leu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Ser His Leu Asp Leu Ala Gly Ser

35 40 45

Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Asn Pro Leu Val Asp Gly

50 55 60

Ser Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

65 70 75 80

Leu Ala His Gly Gly Ser Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro

85 90 95

Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Asn Gly Ser Gly

100 105 110

Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Val Ala Asp Glu Ala

115 120 125

Ser Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser

130 135 140

Ala Lys Asp Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Gly Lys

145 150 155 160

Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Gly Ser Asn

165 170 175

Thr Ile Gly Phe Pro Gly Gly Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala

180 185 190

Leu Glu Asn Val Gln Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser

195 200 205

Ser Arg Gly Asn Pro Ala Thr Ala Gly Asp Tyr Ile Ile Gln Glu Arg

210 215 220

Asp Ile Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser Val Glu Ser Thr Trp Tyr

225 230 235 240

Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His

245 250 255

Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser Ala Asn Thr Ser Leu Ser

260 265 270

His Ser Gln Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys Val Tyr Asp

275 280 285

Ile Lys Gly Gly Ile Gly Ala Gly Thr Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly

290 295 300

Phe Gly Tyr Pro Arg Val Lys

305 310

<210> 5

<211> 269

<212> PRT

<213> 迟缓芽孢杆菌

<400> 5

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 正向引物

<400> 6

gttcatcgat cgcatcggct cagcaggttg agagcaatga 40

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 反向引物

<400> 7

gcgttttttt attgattaac gcgtttactt tacacgcggg aagc 44

<210> 8

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 克劳氏芽孢杆菌分泌信号

<400> 8

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala

20 25

Claims

1.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

2.根据权利要求1所述的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至312或是具有SEQ ID NO:3的多肽。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:3的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:3相比包含选自以下列表的一个或多个改变，该列表由以下各项组成：P8L、P8D、P8K、G25L、G25C、G25W、G25R、K30E、N39D、T40R、L82H、L82G、L82F、L82I、L82V、K123P、S144L、S144I、S144F、S144V、S145R、V163W、V163R、D172N、D172K、D172E、D172W、S173P、S173Y、P174H、S175P、A175S、A175K、P174*+A175*、D176P、D176P、G180I、G180Y、G180M、D207P、D207P、Y241P、D242G、Q287G、Q287H、Q287T、Y302R、I290C、T294P、Y302I以及Y302M。

6.一种组合物，包含具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性、至少65％序列同一性、至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补链杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性、至少65％序列同一性、至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性；

(d)变体，该变体包含SEQ ID NO:3的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

7.根据权利要求6所述的组合物，该组合物是洗涤剂组合物，例如用于洗衣或自动餐具洗涤的组合物。

8.根据权利要求7所述的组合物，该组合物进一步包含选自以下中的一种或多种另外的酶：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、或其任何混合物。

9.根据权利要求7或8中任一项所述的组合物，包含选自以下项的一种或多种组分：表面活性剂、助洗剂、漂白系统、聚合物以及助水溶剂。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物呈条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，常规的或压缩的粉末，颗粒，膏，凝胶，或常规的、压缩的或浓缩的液体的形式。

11.根据权利要求5至10中任一项所述的组合物在清洁过程，例如洗衣、硬表面清洁、餐具洗涤或自动化餐具洗涤中的用途。

12.具有蛋白酶活性的多肽在清洁过程中的用途，其中该具有蛋白酶活性的多肽是：与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的多肽。

13.一种用于从表面除去污渍的方法，该方法包括使该表面与根据权利要求5至10中任一项所述的组合物接触。

14.一种编码根据权利要求1至5中任一项所述的多肽的分离的多核苷酸。

15.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据权利要求14所述的多核苷酸，该多核苷酸有效地连接至指导该多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

16.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据权利要求14所述的多核苷酸，该多核苷酸有效地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

17.一种产生根据权利要求1至5中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；以及

(b)回收该多肽。

18.根据权利要求17所述的方法，其中该细胞是芽孢杆菌。

19.一种产生具有蛋白酶活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养根据权利要求16所述的宿主细胞；以及

(b)回收该多肽。