CN101370921B

CN101370921B - 包含脂肪酶和漂白催化剂的组合物

Info

Publication number: CN101370921B
Application number: CN200780003000.5A
Authority: CN
Inventors: P·F·苏特; N·J·兰特; A·T·布鲁克; G·S·米拉克尔; N·J·宾尼; D·L·多赫尔蒂
Original assignee: Procter and Gamble Ltd
Current assignee: Procter and Gamble Ltd; Procter and Gamble Co
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-22
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2027-01-22
Also published as: US20070173430A1; CN101370921A; AR059154A1; EP1979456A2; WO2007087242A2; WO2007087242A3; CA2635927A1; JP2009523900A; US7786067B2

Abstract

本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：(i)脂肪酶；和(ii)能够从过氧酸接受氧原子并将其转移到可氧化基质上的漂白催化剂。

Description

包含脂肪酶和漂白催化剂的组合物

发明领域

本发明涉及包含脂肪酶和漂白催化剂的组合物。更具体地讲，本发明涉及包含脂肪酶和漂白催化剂的组合物，所述组合物能够从过氧酸接受氧原子并将其转移到可氧化基质上。本发明的组合物通常适于用作衣物洗涤组合物，并表现出良好的清洁性能和减少的恶臭，尤其是当其用于较难处理的残余奶垢时。

发明背景

在洗涤过程中，污垢诸如体垢和其它疏水性污垢(包括奶垢)非常难以从织物上移除。1980年代适用于洗涤剂的脂肪酶的出现(例如Lipolase and Lipolase Ultra，原名Novo Nordisk，现名Novozymes)为配制人员提供了一种改善油脂去除的新方法。脂肪酶催化三甘油酯的水解，三甘油酯是许多常见油污，诸如皮脂、动物脂(例如猪油、酥油、黄油)和植物油(例如橄榄油、向日葵油、花生油)的主要组分。然而这些酶通常在第一洗涤循环中效果不佳(主要在洗涤过程的干燥阶段生效)，并且在洗涤后产生恶臭。不受理论的约束，恶臭是由脂肪水解释放的脂肪酸造成的，尤其显著的是奶垢，如牛奶、奶油、黄油和酸奶。奶制品脂肪包含具有短链(例如C₄)脂肪酰单位的官能化三甘油酯。在脂解后脂肪酰会释放恶臭的挥发性脂肪酸。在固体衣物洗涤剂中使用脂肪酶的记录可参见以下文献：Enzymes in Detergency，ed.J.H.van Ee等人，Vol69Marcel Dekker Surfactant Series，Marcel Dekker，New York，997，pp93-132(ISBN0-8247-9995-X)。

最近所谓的“第一洗涤”脂肪酶已有市售，诸如Lipoprime^TM和Lipex^TM(例如Novozymes)，它们在第一洗涤循环中显示有益效果。Lipex^TM酶在WO00/60063和US6,939,702B1(Novozymes)中有详细描述。包含Lipex^TM酶的衣物洗涤剂制剂在IP.com公布的IP6443D(Novozymes)中有详细描述。然而为了更好的开发脂肪酶技术，仍需要改善其处理残余奶垢后的气味特征和对复合污垢的清洁效果。

洗涤剂制造商也已经尝试过将漂白催化剂，尤其是过氧亚胺正离子或形成过氧亚胺正离子漂白催化剂，掺入到其洗涤剂产品中以提供更好的漂白性能。EP0728181、EP0728182、EP0728183、EP0775192、US4,678,792、US5,045,223、US5,047,163、US5,360,568、US5,360,569、US5,370,826、US5,442,066、US5,478,357、US5,482,515、US5,550,256、US5,653,910、US5,710,116、US5,760,222、US5,785,886、US5,952,282、US6,042,744、WO95/13351、WO95/13353、WO97/10323、WO98/16614、WO00/42151、WO00/42156、WO01/16110、WO01/16263、WO01/16273、WO01/16274、WO01/16275、WO01/16276、WO01/16277涉及包含过氧亚胺正离子的和/或形成过氧亚胺正离子的漂白催化剂的洗涤剂组合物。

一直需要这样的衣物洗涤剂组合物：它们表现出良好的总体清洁性能、良好的冷水温度下的漂白性能、良好的油垢清洁性能、和减少的处理残余脂肪污垢(尤其是奶垢)后的恶臭。

发明人已经发现，通过组合使用脂肪酶和漂白催化剂可改善洗涤剂组合物的清洁性能，并同时减少其处理残余脂肪污垢(尤其是奶垢)后产生的恶臭。所述漂白催化剂能够从过氧酸接受氧原子并将其转移到可氧化基质上。

在本发明的另一个实施例中，发明人已经发现，组合使用脂肪酶和二酰基和/或四酰基过氧化物能改善橡皮箱管相容性特征。

在本发明的一个尤其优选的实施例中，发明人已经发现，组合使用脂肪酶和(i)能够从过氧酸接受氧原子并将其转移到可氧化基质的漂白催化剂和(ii)二酰基和/或四酰基过氧化物，能显著地改善组合物的清洁效果、减少组合物的恶臭特征、并改善组合物的橡皮箱管相容性特征。

附图说明

图1表示脂肪酶序列比对。

序列列表

序列标识号：1表示编码嗜热真菌脂肪酶的DNA序列。

序列标识号：2表示嗜热真菌脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：3表示犁头霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：4表示伞枝犁头霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：5表示米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：6表示米根霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：7表示黑曲霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：8表示塔宾曲霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：9表示尖孢镰刀菌脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：10表示异孢镰刀菌脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：11表示米曲霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：12表示卡门柏青霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：13表示臭曲霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：14表示黑曲霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：15表示米曲霉脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号：16表示Landerina penisapora脂肪酶的氨基酸序列。

发明概述

在第一实施例中，本发明提供了一种包含以下物质的组合物：(i)脂肪酶；和(ii)能够从过氧酸接受氧原子并将其转移到可氧化基质上的漂白催化剂。

在第二实施例中，本发明提供了一种包含以下物质的组合物：(i)脂肪酶；和(ii)二酰基和/或四酰基过氧化物。

发明详述

组成

所述组合物包含：(i)脂肪酶；和(ii)能够从过氧酸接受氧原子并将其转移到可氧化基质的漂白催化剂。下文详细描述了所述脂肪酶和漂白催化剂。

所述组合物适于用作衣物洗涤剂组合物、洗涤添加剂组合物、盘碟洗涤组合物、或硬质表面清洁组合物。所述组合物通常是洗涤剂组合物。所述组合物可以是织物处理组合物。所述组合物优选是衣物洗涤组合物。

组合物可以是诸如液体或固体的任何形式，尽管它优选为固体形式。通常，组合物以颗粒形式存在，诸如附聚物、喷雾干燥的粉末、挤出物、薄片、针状物、条状物、小珠、或它们的任何组合。所述组合物可为致密颗粒状形式，诸如片剂或棒状物形式。所述组合物可为某些其它单位剂型，如小袋形式，其中所述组合物通常至少部分地、优选基本上完全地被水溶性薄膜如聚乙烯醇包封。优选地，所述组合物为自由流动的颗粒形式；自由流动的颗粒形式通常是指所述组合物为单独的离散颗粒形式。所述组合物可由任何适宜的方法制得，所述方法包括附聚、喷雾干燥、挤出、搅拌、干混、液体喷雾、辊压、滚圆、压片、或它们的任何组合。

所述组合物通常具有450g/L至1,000g/L的堆积体积密度。优选的低堆积体积密度的洗涤剂组合物具有550g/L至650g/L的堆积体积密度，而优选的高堆积体积密度的洗涤剂组合物具有750g/L至900g/L的堆积体积密度。组合物也可以具有650g/L至750g/L的堆积体积密度。在洗涤过程期间，所述组合物通常与水接触，获得pH为大于7至小于13，优选大于7至小于10.5的洗涤液体。这是提供良好清洁性能、同时还确保良好织物护理特性的最佳pH。

优选地，所述组合物包含：(i)按所述组合物的重量计从0％至少于10％，优选至7％，或至4％，或从1％，或从1.5％的四乙酰基乙二胺和/或苯磺酸漂白活化剂。最优选地，所述组合物基本上不含四乙酰基乙二胺和/或苯磺酸漂白活化剂。“基本上不含”通常是指“无有意掺入地包含”。将这些漂白活化剂的含量保持在最小状态可以保持组合物良好的染料安全特征。

优选地，所述组合物与水接触后形成洗涤液体，它具有7至10.5的pH。具有这种储备碱度特征和pH特征的组合物显示良好的脂肪酶稳定性特征。

优选地，所述组合物包含按所述组合物的重量计从0％或从1％，或从2％，或从3％，或从4％，或从5％，至30％，或至20％，或至10％的碳酸阴离子源。上述碳酸阴离子源的含量保证所述组合物具有良好的总体清洁性能和良好的漂白性能。

优选地，所述组合物包含一种染料转移抑制剂。适用的染料转移抑制剂选自由下列物质组成的组：聚乙烯吡咯烷酮，优选具有40,000Da至80,000Da，优选50,000Da至70,000Da的重均分子量；聚乙烯基咪唑，优选具有10,000Da至40,000Da，优选15,000Da至25,000Da的重均分子量；聚乙烯吡啶N-氧化物聚合物，优选具有30,000Da至70,000Da，优选40,000Da至60,000Da的重均分子量；聚乙烯吡咯烷酮和乙烯咪唑的共聚物，优选具有30,000Da至70,000Da，优选40,000Da至60,000Da的重均分子量；以及它们的任何组合。包含一种染料转移抑制剂的组合物表现出进一步改善的染料安全特征。

所述组合物可包含按所述组合物的重量计从0％至小于5％，优选至4％，或至3％，或至2％，或甚至至1％的沸石助洗剂。虽然所述组合物可包含5％重量或更高含量的沸石助洗剂，但是所述组合物优选包含小于5％重量的沸石助洗剂。所述组合物优选基本上不含沸石助洗剂。“基本上不含沸石助洗剂”通常是指没有沸石助洗剂被有意掺入所述组合物中。当所述组合物是固体衣物洗涤剂组合物并且期望所述组合物非常易溶时，尤其优选使水不溶性残余物(例如，其可沉积在织物表面上)的量为最小，并且当高度期望得到透明洗涤液体时也是如此。适用的沸石助洗剂包括沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP。

所述组合物可包含按所述组合物的重量计从0％至小于10％，或小于5％，优选至4％，或至3％，或至2％，或甚至至1％的磷酸盐助洗剂。虽然所述组合物可包含10％重量或更高含量的磷酸盐助洗剂，但是所述组合物优选包含小于10％重量的磷酸盐助洗剂。所述组合物甚至优选基本上不含磷酸盐助洗剂。“基本上不含磷酸盐助洗剂”通常是指所述组合物不包含有意添加的磷酸盐助洗剂。如果期望该组合物具有非常好的环境特性，则这是尤其优选的。适用的磷酸盐助洗剂包括三聚磷酸钠。

所述组合物可包含按所述组合物的重量计从0％至小于5％，或优选至4％，或至3％，或甚至至2％，或至1％的硅酸盐。虽然所述组合物可包含5％重量或更高含量的硅酸盐，但是所述组合物优选包含小于5％重量的硅酸盐。所述组合物甚至优选基本上不含硅酸盐。“基本上不含硅酸盐”通常是指所述组合物不包含有意添加的硅酸盐。当所述组合物是固体衣物洗涤剂组合物并且期望确保所述组合物具有良好的分配和溶解特征以及确保所述组合物溶解于水后提供透光的洗涤液体时，这是尤其优选的。硅酸盐包括水不溶性硅酸盐。硅酸盐也包括无定形硅酸盐和结晶的层状硅酸盐(如SKS-6)。硅酸盐包括硅酸钠。

所述组合物典型包含辅助成分，这些辅助成分包括：去污表面活性剂，诸如阴离子去污表面活性剂、非离子去污表面活性剂、阳离子去污表面活性剂、两性离子去污表面活性剂、两性去污表面活性剂。优选的阴离子去污表面活性剂是烷氧基化阴离子去污表面活性剂，如平均烷氧基化度为1至30，优选1至10的直链或支链、取代或未取代的C_12-18烷基烷氧基化硫酸盐，更优选平均乙氧基化度为1至10的直链或支链、取代或未取代的C_12-18烷基乙氧基化硫酸盐，最优选平均乙氧基化度为3至7的直链未取代C_12-18烷基乙氧基化硫酸盐。其它优选的阴离子去污表面活性剂是烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐，或它们的任何混合物。优选的烷基硫酸盐包括直链或支链的、取代或未取代的C_10-18烷基硫酸盐。另一种优选的阴离子去污表面活性剂是C_10-13直链烷基苯磺酸。优选的非离子去污表面活性剂是平均烷氧基化度为1至20，优选3至10的C_8-18烷基烷氧基化醇，最优选平均烷氧基化度为3至10的C_12-18烷基乙氧基化醇。优选的阳离子去污表面活性剂是一-C_6-18烷基一羟乙基二甲基氯化铵，更优选一-C_8-10烷基一羟乙基二甲基氯化铵、一-C_10-12烷基一羟乙基二甲基氯化铵和一-C₁₀烷基一羟乙基二甲基氯化铵；过氧源，如过碳酸盐和/或过硼酸盐，优选过碳酸钠。所述过氧源优选被涂层成分至少部分涂布，优选被涂层成分完全涂布，所述涂层成分为例如碳酸盐、硫酸盐、硅酸盐、硼硅酸盐或混合物，包括它们的混合盐；漂白活化剂，如四乙酰基乙二胺、羟苯磺酸盐漂白活化剂如壬酰羟苯磺酸盐、己内酰胺漂白活化剂、酰亚胺漂白活化剂如N-壬酰基-N-甲基乙酰胺；酶，如淀粉酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶、半乳糖酶、葡聚糖酶、糖酶、纤维素酶、漆酶、氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、葡聚糖酶、果胶酸裂解酶和甘露聚糖酶，尤其优选蛋白酶；抑泡体系，如硅氧烷基抑泡剂；荧光增白剂；光漂白剂；填充剂盐，如硫酸盐，优选硫酸钠；织物软化剂，如粘土、硅氧烷和/或季铵化合物，尤其优选任选地与硅氧烷组合使用的蒙脱石粘土；絮凝剂，如聚环氧乙烷；染料转移抑制剂，如聚乙烯吡咯烷酮、聚4-乙烯基吡啶N-氧化物和/或乙烯基吡咯烷酮与乙烯基咪唑的共聚物；织物完整组分，如疏水改性纤维素和由咪唑和氯环氧丙烷缩合而制得的低聚物；污垢分散剂和污垢抗再沉淀助剂，如烷氧基化聚胺和乙氧基化次乙亚胺聚合物；抗再沉淀组分，如羧甲基纤维素和聚酯；香料；氨基磺酸或其盐；柠檬酸或其盐；碳酸盐，尤其优选碳酸钠；和染料，诸如橙色染料、蓝色染料、绿色染料、紫色染料、粉红色染料、或它们的任何混合物。

本发明的第二实施例涉及一种包含以下物质的组合物：(i)脂肪酶；和(ii)二酰基过氧化物。

脂肪酶

本发明组合物的脂肪酶是脂肪酶变体，它无C-末端延伸序列，但是在亲本脂肪酶的某些区域引入突变，从而降低了产生气味的趋势。

亲本脂肪酶

亲本脂肪酶可以是真菌脂肪酶，如“同源性和序列比对”部分中所述，其氨基酸序列具有与序列标识号：2中显示的嗜热真菌脂肪酶序列至少50％的同源性。

亲本脂肪酶可以是酵母多肽，例如假丝酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母、酵母菌、裂殖酵母、或耶氏酵母多肽；或更优选地丝状真菌多肽，例如顶孢霉菌、曲霉菌、短梗霉菌、隐球菌、线黑粉酵母、镰刀霉菌、腐殖霉菌、稻瘟病菌、毛霉菌、毁丝霉菌、新考玛脂霉菌、脉孢菌、拟青霉菌、青霉菌、瘤胃真菌、裂褶菌、黄丝曲霉菌、嗜热子囊菌、草根霉菌、木霉菌、或木霉菌多肽。

在一个优选的方面，亲本脂肪酶是卡尔斯伯酵母、啤酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺氏酵母、或具有脂肪酶活性的卵形酵母多肽。

在另一个优选的方面，亲本脂肪酶是棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉、镰孢拟杆菌、小麦枯萎病菌、镰孢菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰刀菌、黄荆镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、念珠形镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰孢、拟枝孢镰刀菌、硫色镰刀菌、簇囊镰刀菌、类丝孢镰刀菌、镰孢霉、特异腐质霉、嗜热真菌(同物异名：高温毛壳霉)、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、链孢霉、产紫青霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉多肽。

在另一个优选的方面，亲本脂肪酶是嗜热真菌属脂肪酶。

在一个更优选的方面，亲本脂肪酶是嗜热真菌脂肪酶。在一个更优选的实施例中，亲本脂肪酶是序列标识号：2的脂肪酶。

区域识别和取代。

下文提到的区域I至区域IV的位点是序列标识号：2中的氨基酸残基位点。使用“同源性和序列比对”部分所述的方法来发现不同脂肪酶中对应的(或同源的)位点。

区域I中的取代

区域I由围绕N-末端残基E1的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域I包含对应以下位点的氨基酸残基：1至11和223至239。以下位点具有特别的意义：1、2、4、8、11、223、227、229、231、233、234和236。具体地讲，已经确认了以下取代：X1N/*、X4V、X227G、X231R和X233R。

在一个优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号：2有至少80％，诸如85％或90％，诸如至少95％或96％或97％或98％或99％的同一性。在一个更优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号：2相同。

区域II中的取代

区域II由在酰基链的一面上和在醇部分的一面上接触底物的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸或较低疏水性的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域II包含对应以下位点的氨基酸残基：202至211和249至269。以下位点具有特别的意义：202、210、211、253、254、255、256、259。具体地讲，已经确认了以下取代：X202G、X210K/W/A、X255Y/V/A、X256K/R和X259G/M/Q/V。

在一个优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号：2具有至少80％，诸如85％或90％，诸如至少95％或96％或97％或98％或99％的同一性。在一个更优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号：2相同。

区域III中的取代

区域III由形成柔性结构，从而允许底物进入活性位点的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸或较低疏水性的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域III包含对应以下位点的氨基酸残基：82至102。以下位点具有特别的意义：83、86、87、90、91、95、96、99。具体地讲，已经确认了以下取代：X83T、X86V和X90A/R。

区域IV中的取代

区域IV由静电结合至表面的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域IV包含对应以下位点的氨基酸残基：27和54至62。以下位点具有特别的意义：27、56、57、58、60。具体地讲，已经确认了以下取代：X27R、X58N/AG/T/P和X60V/S/G/N/R/K/A/L。

其它位点的氨基酸

亲本脂肪酶可任选地包含其它氨基酸的取代，尤其是少于10个或少于5个这样的取代。实施例是对应亲本脂肪酶24、37、38、46、74、81、83、115、127、131、137、143、147、150、199、200、203、206、211、263、264、265、267和269中的一个或多个位点的取代。在一个具体实施例中取代发生在对应81、143、147、150和249位点中的至少其中一个位点。在一个优选的实施例中，至少一个取代选自由下列取代组成的组：X81Q/E、X143S/C/N/D/A、X147M/Y、X150G/K和X249R/I/L。

变体可包含在限定区域I至IV之外的取代，在限定区域I至IV之外的取代数量优选地少于六个、或少于五个、或少于四个、或少于三个、或少于二个，诸如五个、或四个、或三个、或二个或一个。作为另外一种选择，变体不包含任何在限定区域I至IV之外的取代。

例如，根据本领域已知的法则可进行更多的取代，如WO92/05249、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中所述的取代。

亲本脂肪变体

在一个方面，当与所述亲本相比时，所述变体包含总计至少三个取代，所述取代选自一个或多个由以下取代组成的组：

a)区域I中的至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如两个、三个、四个、五个或六个取代，

b)区域II中的至少一个、至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如一个，两个、三个、四个、五个或六个取代，

c)区域III中的至少一个、至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如一个，两个、三个、四个、五个或六个取代，

d)和/或区域IV中的至少一个、至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如一个，两个、三个、四个、五个或六个取代。

变体与变体的亲本相比可包含取代，所述取代对应下表1中列出的那些取代。

表1：一些具体的变体。

在一个更具体的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号：2相同，从而表1的变体将会是：

表2：序列标识号：2的一些具体变体

氨基酸修饰命名

在描述如本发明所述的脂肪酶变体时，使用以下命名法以利于参考：最初氨基酸：位点：取代氨基酸。

根据此命名法，例如将位点195处的谷氨酸取代为甘氨酸，表示为G195E。在相同的位点缺失甘氨酸的话表示为G195*，而插入附加的氨基酸残基如赖氨酸表示为G195GK。一个与其它脂肪酶相比，包含一个在位点36的“缺失”氨基酸，同时在此位点插入一个天东氨酸的具体脂肪酶表示为*36D。多个突变用加号分隔，即：R170Y+G195E，表示在位点170和195处分别将酪氨酸和谷氨酸取代为精氨酸和甘氨酸。

当应用所述序列比对方法时，X231表示在亲本多肽中对应位点231的氨基酸。X231R表示此氨基酸用R置换。对序列标识号：2来说X是T，X231R因此表示在位点231处用R取代T。当一个位点(例如231)的氨基酸可以用另一个选自一组氨基酸的氨基酸取代时，例如，所述组由R和P和Y组成，用X231R/P/Y表示。

在所有情况下，使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

氨基酸分组

在本说明书中，将氨基酸按照其在pH10条件下的电荷分为带负电的、带正电的或电中性的氨基酸。因此，带负电的氨基酸是E、D、C(半胱氨酸)和Y，尤其是E和D。带正电的氨基酸是R、K和H，尤其是R和K。当形成二硫键时，中性氨基酸是G、A、V、L、I、P、F、W、S、T、M、N、Q和C。被同一组(带负电、带正电的或电中性)中的另一种氨基酸取代，被称为保守取代。

中性氨基酸可被分为疏水性的或非极性的(G、A、V、L、I、P、F、W和作为二硫键的一部分的C)和亲水性的或极性的(S、T、M、N、Q)。

氨基酸同一性

用参数“同一性”来描述两个氨基酸序列或两个核苷酸序列间的相关性。

对本发明来说，通过使用来自EMBOSS package(http：//emboss.org)2.8.0版本的Needle程序测定两个氨基酸序列的比对。Needle程序使用全局比对算法，该算法描述于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mo1.Bio1.48，443-453。使用的取代矩阵是BLOSUM62，空位开放罚分是10，空位拓展罚分是0.5。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如序列标识号：2的氨基酸1至269)和差异氨基酸序列(“外来序列”)之间的同一性程度通过以下方法计算：两个序列比对的精确匹配数目除以“发明序列”的长度或“外来序列”的长度，无论哪个序列的长度是最短的。结果表示为同一性百分比。

当“发明序列”和“外来序列”在重叠部分的相同位点具有相同的氨基酸残基时，会发生精确匹配。序列长度是序列中的氨基酸残基的数目(例如序列标识号：2的长度是269)。

亲本脂肪酶具有与嗜热真菌脂肪酶(序列标识号：2)至少50％，尤其是至少55％，至少60％，至少75％，至少85％，至少90％，超过95％或超过98％的氨基酸同一性。在一个具体实施例中，亲本脂肪酶与嗜热真菌脂肪酶(序列标识号：2)相同。

可以使用上述方法计算同一性以及同源性并用于序列比对。在本发明的情况下，同源性和序列比对计算如下。

同源性和序列比对

对本发明来说，通过本领域已知的计算机程序，如GCG程序包中所提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，“Journal of Molecular Biology”，48，443-45)，使用具有下列多肽序列对比设置的GAP，来适宜地测定同源性程度：GAP产生罚分为3.0，并且GAP延伸罚分为0.1。

在本发明中，犁头霉、伞枝犁头霉、米黑根毛霉、代氏根霉、黑曲霉、塔宾曲霉、尖孢镰刀菌、异孢镰刀菌、米曲霉、卡门柏青霉、臭曲霉、黑曲霉、嗜热真菌(同物异名：高温毛壳霉)、和Landerina penisapora脂肪酶序列中对应的(或同源的)位点通过图1中显示的序列比对确定。

为了找到脂肪酶序列中不显示在序列比对中的同源位点，将所关注的序列与图1中显示的序列进行比对。通过对GAP程序发现的同源性最高的序列进行GAP序列比对，将新序列与图1中的现有序列进行比对。GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version8，August1994，Genetics Computer Group，575Science DriVe，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，443-45)提供GAP。多肽序列比较使用以下设置：GAP产生罚分为3.0，并且GAP延伸罚分为0.1。

亲本脂肪酶与嗜热真菌脂肪酶(序列标识号：2)具有至少50％，尤其是至少55％，至少60％，至少75％，至少85％，至少90％，超过95％或超过98％的氨基酸同一性。在一个具体实施例中，亲本脂肪酶与嗜热真菌脂肪酶(序列标识号：2)相同。

杂交

本发明也涉及由多核苷酸编码，具有脂肪酶活性的分离多肽，所述多核苷酸在非常低的严谨性条件下，优选低严谨性条件下，更优选中严谨性条件下，更优选中-高严谨性条件下，甚至更优选高严谨性条件下，最优选非常高严谨性条件下，与下列核苷酸序列杂交：(i)核苷酸178至660，序列标识号：1，(ii)包含在核苷酸178至660的cDNA序列，序列标识号：1，(iii)(i)或(ii)的序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。序列标识号：1的子序列包含至少100个邻接核苷酸或优选至少200个邻接核苷酸。此外，子序列可编码具有脂肪酶活性的多肽片段。

对长度为至少100个核苷酸的长探针来说，将非常低至非常高的严谨性条件定义为在以下条件下进行的预杂交和杂交：42℃，5X SSPE，0.3％SDS，200ug/mL已剪切的和已变性的鱼精DNA，或者25％的甲酰氨用于非常低和低严谨性条件，35％甲酰氨用于中和中-高严谨性条件，或者50％甲酰氨用于高和非常高严谨性条件，标准Southern杂交程序杂交最优选12至24小时。

对长度为至少100个核苷酸的长探针来说，使用2X SSC，0.2％SDS，优选在至少45℃(非常低的严谨性)，更优选在至少50℃(低严谨性)，更优选在至少55℃(中严谨性)，更优选地在至少60℃(中-高严谨性)。甚至更优选在至少65℃(高严谨性)，最优选在至少70℃(非常高的严谨性)，最后洗涤载体材料三次，每次15分钟。

DNA序列、表达载体、宿主细胞、脂肪酶生产

本发明提供编码本发明脂肪酶的DNA序列、包含所述DNA序列的表达载体、和包含所述DNA序列或所述表达载体的转化宿主细胞。它们通过本领域已知的方法可获得。

本发明也提供生产脂肪酶的方法，此方法通过在有益于生产脂肪酶的条件下培养转化细胞和从所得肉汤培养基中重新获得脂肪酶来生产脂肪酶。所述方法按照本领域已知的原则进行。

脂肪酶活性

-在中性pH(LU)条件下对三丁酸甘油酯的脂肪酶活性

使用阿拉伯树胶作为乳化剂，乳化三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)来制备脂肪酶底物。然后在pH-恒定滴定试验中，在30℃，pH7或pH9条件下水解三丁酸甘油酯。一单位脂肪酶活性(1LU)相当于能够在pH7条件下，每分钟释放1微摩尔丁酸的酶量。

-效险

将描述性能与气味减少风险比的效险系数定义为：BR＝RP_avg/R。本文所述的脂肪酶变体可具有大于1，大于1.1，或甚至大于1至约1000的效险系数。

-平均相对性能

计算平均相对性能(RPavg)的程序存在本说明书的实施例5中。本文所述的脂肪酶变体可具有至少0.8，至少1.1，至少1.5，或甚至至少2至约1000的平均相对性能(RPavg)。

漂白催化剂

漂白催化剂能够从过氧酸和/或其盐接受氧原子并将氧原子转移到可氧化基质上。适用的漂白催化剂包括但不限于亚胺盐阳离子和聚离子、亚胺盐两性离子、改性的胺、改性的氧化胺、N-磺酰亚胺、N-膦酰亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮、以及它们的混合物。

适宜的亚胺盐阳离子和聚离子包括但不限于N-甲基-3，4-二氢异喹啉四氟硼酸盐，按描述于Tetrahedron(1992)，49(2)，423-38中的方法制备(参见例如，化合物4，p.433)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉对甲苯磺酸盐，按描述于美国专利5,360,569中的方法制备(参见例如，第11列，实施例1)；和N-辛基-3,4-二氢异喹啉对甲苯磺酸盐，按描述于美国专利5,360,568中的方法制备(参见例如，第10列，实施例3)。

适用的亚胺盐两性离子的包括但不限于N-(3-磺基丙基)-3，4-二氢异喹啉内盐，按描述于美国专利5,576,282中的方法制备(参见例如，第31列，实施例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉内盐，按描述于美国专利5,817,614中的方法制备(参见例如，列32，实施例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧代]-2-(磺氧基)]-3，4-二氢异喹啉内盐和2-[3-[(2-丁基辛基)氧代]-2-(磺氧基)丙基(酯)]-3,4-二氢异喹啉内盐，按描述于WO05/047264中的方法制备(参见例如，第18页，实施例8)。

适宜的改性的胺氧气转移催化剂包括但不限于1，2，3，4-四氢-2-甲基-1-羟基异喹啉，其可依照描述于Tetrahedron Letters(1987年)，28(48)，6061-6064中的方法制备。适宜的改性的氧化胺氧气转移催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧代-N-[2-(磺氧基)癸基]-1，2，3，4-四氢异喹啉钠。

适宜的N-磺酰基亚胺氧气转移催化剂包括但不限于3-甲基-1，2-苯并异噻唑-1，1-二氧化物，依照描述于Journal of Organic Chemistry(1990)，55(4)，1254-61中的方法制备。

适宜的N-膦酰基亚胺氧气转移催化剂包括但不限于[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2，4，6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可依照描述于Journal of the Chemical Society，ChemicalCommunications(1994)，(22)，2569-70中的方法制备。

适宜的N-酰基亚胺氧气转移催化剂包括但不限于[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺，其可依照描述于Polish Journal ofChemistry(2003年)，77(5)，577-590中的方法制备。

适宜的噻二唑二氧化物氧气转移催化剂包括但不限于3-甲基-4-苯基-1，2，5-噻二唑1，1-二氧化物，其可依照描述于美国专利5,753,599(第9列，实施例2)中的方法制备。

适宜的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3，3，4，4，4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可根据Tetrahedron Letters(1994)，35(34)，6329-30中所述的方法制备。

适宜的环状糖酮氧气转移催化剂包括但不限于如按美国专利6,649,085(第12列，实施例1)中的方法制备的1，2：4，5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。

所述漂白催化剂优选包含亚胺和/或羰基官能团，并且通常能够形成接受氧原子的过氧亚胺正离子和/或双环氧乙烷官能团，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子。所述漂白催化剂优选包含过氧亚胺正离子官能团和/或能够形成接受氧原子的过氧亚胺正离子官能团，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子。所述漂白催化剂优选包含环状亚胺官能团，优选其中环状部分具有五至八个原子(包括氮原子)，优选六个原子。漂白催化剂优选包含芳香亚胺官能团，优选二环芳香亚胺官能团，优选3，4-二氢异喹啉官能团。所述亚胺官能团通常是季亚胺官能团，并且通常能够形成接受氧原子的季过氧亚胺正离子官能团，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子。

所述漂白催化剂优选具有符合以下化学式的化学结构：

其中：n和m独立地为0至4，优选n和m都为0；每个R¹独立地选自取代或未取代的选自由下列组成的组的基团：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合的芳基、杂环、稠合的杂环、硝基、卤素、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基，和烷氧羰基；并且任何两个邻近的R¹取代基可结合形成稠合的芳基、稠合的碳环或稠合的杂环；每个R²独立地选自取代或未取代的基团，所述基团独立地选自由下列组成的组：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烃基、杂环、烷氧基、芳羰基、羧烷基和酰胺基；任何R²可与任何其它R²相连接以形成公共环部分；任何偕R²可结合形成羰基；并且其中任何两种R²可结合形成取代或未取代的稠合不饱和部分；R³为C₁至C₂₀取代或未取代的烷基；R⁴为氢或所述Q_t-A部分，其中：Q为支化或未支化的亚烷基，t＝0或1，并且A为阴离子基团，所述阴离子基团选自由下列基团组成的组：OSO₃ ^-、SO₃ ^-、CO₂ ^-、OCO₂ ^-、OPO₃ ^2-、OPO₃H^-和OPO₂ ^-；R⁵为氢或-CR¹¹R¹²-Y-G_b-Y_c-[(CR⁹R¹⁰)_y-O1_k-R⁸部分，其中：每个Y独立地选自由下列基团组成的组：O、S、N-H或N-R⁸；并且每个R⁸独立地选自由下列基团组成的组：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论取代或未取代，所述部分具有的碳原子均小于21；每个G独立地选自由下列基团组成的组：CO、SO₂、SO、PO和PO₂；R⁹和R¹⁰独立地选自由下列基团组成的组：H和C₁-C₄烷基；R¹¹和R¹²独立地选自由下列基团组成的组：H和烷基，或者当结合在一起时，它们可形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，则c必须＝0；y为1至6的整数；k为0至20的整数；R⁶为H或烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且如果X存在的话，它是一种合适的电荷平衡抗衡离子，当R⁴为氢时X优选存在，合适的X包括但不限于氯化物、溴化物、硫酸盐、甲硫酸盐、磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、四氟化硼合磷酸盐。

在本发明的一个实施例中，所述漂白催化剂具有符合下文通式的结构：

其中R¹³是包含三至24个碳原子(包括所述支链碳原子)的支链烷基或包含一至24个碳原子的直链烷基；R¹³优选是包含八至18个碳原子的支链烷基或包含八至十八个碳原子的直链烷基；R¹³优选地选自由下列基团组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-己基癸基、正-十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基；R¹³优选地选自由下列基团组成的组：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异十三烷基和异十五烷基。

苯磺酸和/或羟苯甲酸漂白活化剂

所述组合物优选地包含(i)苯磺酸漂白活化剂和/或羟苯甲酸漂白活化剂和(ii)过氧化物源。通常羟苯甲酸漂白活化剂以其盐的形式存在。苯磺酸漂白活化剂优选地包括具有以下通式的漂白活化剂：

R-(C＝O)-L

其中R是任选支链的烷基。当漂白活化剂是疏水性时，它具有6至14个碳原子，或8至12个碳原子，并且L是离去基团。合适的离去基团的实例为苯甲酸及其衍生物，尤其是它们的盐。另一种尤其优选的离去基团是苯磺酸。合适的漂白活化剂包括十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸盐、3，5，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、壬酰氨基癸酰基苯磺酸盐和壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)。合适的漂白活化剂还公开于WO98/17767中。当洗涤剂组合物包含低含量的或沸石助洗剂和磷酸盐助洗剂时，这些漂白活化剂掺入到所述组合物中是尤其优选的。发明人已经发现，组合使用这些漂白活化剂、过氧化物源以及上文详述的漂白催化剂、和脂肪酶，尤其是在不够标准的洗涤剂组合物中(诸如包含低含量沸石助洗剂和磷酸盐助洗剂的组合物)，能改善总体清洁性能、改善橡皮箱管相容性特征并减少组合物的恶臭特征。

二酰基过氧化物

在另一个实施例中，所述组合物包含：(i)脂肪酶；和(ii)二酰基和/或四酰基过氧化物。发明人已经发现，这些组合物显示出优良的橡皮软管相容性。已知二酰基过氧化物和四酰基过氧化物会侵蚀橡皮，诸如自动洗衣机的橡皮箱管，经过多个洗涤循环后这会导致橡皮箱管故障。发明人已经发现，二酰基过氧化物和/或四酰基过氧化物与脂肪酶的组合能解决此橡皮箱管不相容性问题。

二酰基过氧化物漂白剂优选地选自以下通式的二酰基过氧化物：

R¹-C(O)-OO-(O)C-R²

其中R¹代表C₆-C₁₈烷基，优选C₆-C₁₂烷基，所述烷基包含一个至少5个碳原子的直链，并且任选地包含一个或多个取代基(例如-N⁺(CH₃)₃，-COOH或-CN)和/或一个或多个插入部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)，插入到烷基的相邻碳原子之间，R²代表一个与过氧化物部分相容的脂族基团，R¹和R²共包含8至30个碳原子。在一个优选的方面，R¹和R²是直链未取代的C₆-C₁₂烷基链。R¹和R²最优选彼此相同。尤其优选二酰基过氧化物，其中R¹和R²是C₆-C₁₂烷基。优选至少其中一个，最优选R基团(R₁或R₂)中只有一个在α位点不包含支环或侧环，或优选在α和β位点都不包含支环或侧环，或最优选在α、β和γ位点都不包含支环或侧环。在一个更优选的实施例中，DAP可以是不对称的，以使得R1酰基优选地迅速水解以产生过酸，但是R2酰基的水解较慢。

四酰基过氧化物漂白剂优选地选自以下通式的四酰基过氧化物：

R³-C(O)-OO-C(O)-(CH₂)n-C(O)-OO-C(O)-R³

其中R³代表C₁-C₉烷基，优选C₃-C₇基团，并且n代表2至12的整数，优选包括4至10的整数。

优选地，二酰基和/或四酰基漂白剂的量足以提供按所述洗涤液体重量计至少0.5ppm，更优选至少10ppm，甚至更优选至少50ppm。在一个优选的实施例中，所述洗涤剂的量足以提供按所述洗涤液体的重量计约0.5至约300ppm，更优选约30至约150ppm。

预成形的过氧酸

预成形的过氧酸或其盐通常是过氧羧酸或其盐，或者过氧磺酸或其盐。

预成形的过氧酸或其盐优选地是过氧羧酸或其盐，通常具有符合以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁴选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁴基团可以为直链或支链的、取代或未取代的；并且Y为任何合适的抗衡离子，用以达到电中性，Y优选地选自氢、钠或钾。R¹⁴优选地为直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、它们的任何一种盐、或它们的任何组合。优选地，过氧酸或其盐具有在30℃至60℃范围内的熔点。

预成形的过氧酸或其盐也可以为过氧磺酸或其盐，通常具有符合以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁵选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁵基团可以为直链或支链的、取代或未取代的；并且Z为任何合适的抗衡离子，用以达到电中性，Z优选地选自氢、钠或钾。R¹⁵优选地为直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。

实例

脂肪酶变体实例

用作缓冲剂和底物的化学物质是至少试剂级的商业产品。

-培养基和溶液：LAS(Surfac PS^TM)和沸石A(Wessalith P^TM)。所用的其它成分是标准实验室试剂。

-材料：EMPA221，来自EMPA St.Gallen，Lerchfeldstrasse5，CH-9014St.Gallen，Switzerland

实施例1：酶生产

使用本领域的标准方法，构建一个包含编码脂肪酶的基因的质粒并将其转染进入合适的宿主细胞。

使用恒温34℃，起始体积1.2升的培养基进行补料分批发酵。培养基的最初pH设为6.5。一旦pH升至7.0，通过加入10％H3PO4来保持此值恒定。培养基中的溶解氧水平通过改变搅拌速率以及使用每升培养基每分钟1.0升空气的固定通风速率进行控制。在整个补料分批发酵阶段，进料速率维持在一个恒定的水平。分批培养基包含麦芽糖浆作为碳源，尿素和酵母提取物作为氮源，以及痕量金属和盐的混合物。在补料分批发酵阶段连续加入的进料包含麦芽糖浆作为碳源，然而加入尿素和酵母提取物是为了确保充足的氮源供应。

使用本领域已知的标准方法进行脂肪酶的纯化，例如通过过滤发酵上清液和后续的疏水色谱和阴离子交换液，例如实施例3中EP0851913所述的方法。

实施例2：AMSA-自动机械应力检测分析法-用于计算相对性能 (RP)。

使用自动机械应力检测分析法(AMSA)测试本专利申请的酶变体。通过AMSA测试，能检测大量小体积酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有多个用于测试溶液的狭槽，以及一个牢固挤住织物样品，以使其在所有狭槽开口处被洗涤的封盖。在洗涤期间，剧烈摇动所述板、测试溶液、织物和封盖以使得测试溶液接触织物，并施加机械应力。更详细的描述可参见WO02/42740，尤其是第23至24页的段落“Special method embodiments”。包含洗涤剂测试溶液的容器由在一个金属板中的圆柱形孔洞(直径6mm，深10mm)组成。脏污的织物(测试物质)位于金属板的顶部，用作在容器上的封盖和密封件。另一个金属板位于脏污织物的顶部以避免从任何一个容器溢出任何液体。两个金属板连同脏污织物一起以30Hz的频率和2mm的振幅上下振动。

所述检测分析法在下文指定的试验条件下进行：

表3

通过在50℃下混合5g(Santa Maria，Denmark)姜黄和100g(38％脂肪，Arla，Denmark)霜膏来制备霜膏姜黄样品，混合物在此温度下保留约20分钟并过滤(50℃)移除任何不溶解的颗粒。混合物冷却至20℃，将棉纺样品，EMPA221，浸入此霜膏姜黄混合物，然后在室温下干燥过夜并冷冻直至使用。在2005年5月27日提交的专利申请PA200500775中公开了霜膏姜黄样品的制备方法。

酶变体的性能可通过用具体酶变体洗涤的织物样品的颜色亮度进行测量。亮度也可用白光照明时从织物样品反射的光强度表示。当织物脏污时，其反射光的强度比清洁织物的反射光强度低。因此反射光的强度可用于测量酶变体的洗涤性能。

使用一种专业的平面扫描器(PFU DL2400pro)进行颜色测量，此扫描器用于获取洗涤织物样品的图象。扫描分辨率为200dpi，输出色深24位。为了获得精确的结果，用Kodak反射IT8色卡频繁校准扫描仪。

使用一个特别设计的应用软件(Novozymes Color Vector Analyzer)来从扫描图象中提取光强度值。所述程序从图象中检索24位像素值并将其转化成红、绿和蓝(RGB)值。通过将RGB值相加作为载体，然后提取所得载体的长度来计算强度值(Int)：

Int = \sqrt{r^{2} + g^{2} + b^{2}}

变体的洗涤性能(P)根据以下公式计算：

P＝Int(v)-Int(r)其中

Int(v)是用测试酶洗涤的织物表面的光强度值，Int(r)是不用测试酶洗涤的织物表面的光强度值。

根据定义，规定相对性能得分是AMSA洗涤的结果：相对性能得分(RP)是测试酶变体的性能(P)之和与参考酶性能的比值：RP＝P(测试酶)/P(参考酶)。

RPavg是指在所有四种酶浓度下(0.125，0.25，0.5，1.0mg ep/1)与参考酶相比较的平均相对性能

RPavg＝avg(RP(0.125)，RP(0.25)RP(0.5)，RP(1.0))

如果变体性能优于参考酶，则认为它表现出改善的洗涤性能。在本发明的情况下，参考酶是序列标识号：2的脂肪酶，它具有T231R+N233R的取代。

实施例3：用于计算效险的GC-气相色谱。

通过固相微萃取气相色谱法(SPME-GC)，使用以下方法测量脂肪酶洗涤样品中的丁酸释放。将在包含1mg/L脂肪酶的表3指定溶液中洗涤的四个织物片(直径5mm)转移到气相色谱(GC)瓶。在一个配有一个Stabilwax-DA w/Integra-Guard柱(30m，0.32mm内径和0.25micro-m df)和一个Carboxen PDMS SPME纤维(75micro-m)的Varian3800GC上分析样品。每个样品在40℃预培养10分钟，然后用SPME纤维在织物片上的顶部空间中取样20分钟。随后将样品注入色谱柱(进样口温度＝250℃)。柱流量＝2mL氦/分钟。柱温箱温度梯度：0分钟＝40℃，2分钟＝40℃，22分钟＝240℃，32分钟＝240℃。用FID检测器检测丁酸，并基于丁酸标准曲线计算丁酸的量。

脂肪酶变体的风险性能气味(R)是从脂肪酶变体洗涤样品释放的丁酸与从序列标识号：2的脂肪酶洗涤样品释放的丁酸量之间的比率。序列标识号：2的脂肪酶具有T231R+N233R(参考酶)的取代，两个值都使用从无脂肪酶的洗涤样品释放的丁酸量进行校正。根据以下公式计算变体的风险(R)：

气味＝1mg酶蛋白测得的微克丁酸/1空白校正

α_测试酶＝气味_测试酶-空白

α_参考酶＝气味_参考酶-空白

R＝α_测试酶/α_参考酶

如果一个变体的R系数小于1，即认为它表现出比参考减少的气味。

实施例4：相对于在280nm的吸光度的活性(LU)

通过以下检测分析法LU/A280测定脂肪酶相对于在280nm的吸光度的活性：

使用在上文的脂肪酶活性部分描述的方法测定脂肪酶活性。测量脂肪酶在280nm的吸光度(A280)并计算LU/A280比率。变体的LU/A280除以参考酶的LU/A280来计算相对LU/A280。在本发明的情况下，参考酶是序列标识号：2的脂肪酶，它具有T231R+N233R的取代。

实施例5：BR-效险

将描述性能与气味减少风险比的效险系数因此定义为：BR＝RP_avg/R

如果一个变体的BR系数高于1，即认为它表现出改善的洗涤性能和减少的气味。

应用以上方法获得的结果如下：

表4

WO2000/060063描述了表4中的参考脂肪酶和变体7和8。

实施例6

BR-效险

测量表5中列出的变体的效险。用与实施例5中所述方法相同的方法测量效险系数，所有列出的变体其效险系数都大于1。

表5

在WO2000/060063中描述了参考脂肪酶。

漂白催化剂实施例

实施例6：制备硫酸单-[2-(3，4-二氢异喹啉-2-基)-1-(2-乙基己氧基甲基)乙基]酯内盐

制备2-乙基己基缩水甘油醚：向配备装有环氧氯丙烷(15.62g，0.17摩尔)的加料漏斗的火焰干燥的、500mL圆底烧瓶添加2-乙基己醇(16.5g，0.127摩尔)和氯化锡(0.20g，0.001摩尔)。使反应保持在氩气氛中，并且使用油浴加热至90℃。将环氧氯丙用60分钟时间滴入搅拌的溶液中，之后在90℃下搅拌18个小时。将所述反应用真空蒸馏头装配，并且1-氯-3-(2-乙基己氧基)丙-2-醇在0.2mmHg下蒸馏。将所述1-氯-3-(2-乙基己氧基)丙-2-醇(4.46g，0.020摩尔)溶解于四氢呋喃(50mL)并在室温下氩气氛中搅拌。向搅拌的溶液中加入叔丁醇钾(2.52g，0.022摩尔)，并将悬浮液在室温下搅拌18小时。接着将反应蒸发至干，将剩余物溶解于己烷中并且用水(100mL)洗涤。分出己烷相，用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发至干，得到粗制的2-乙基己基缩水甘油醚，其可通过真空蒸馏来进一步纯化。

制备硫酸单-[2-(3,4-二氢异喹啉-2-基)-1-(2-乙基己氧基甲基)乙基]酯内盐：向一个火焰干燥的250mL三颈圆底烧瓶(配备有冷凝管、干燥氩气入口、磁力搅拌棒、温度计和加热浴)中，加入3,4-二氢异喹啉(0.40摩尔，依照U.S.5,576,282实施例I中所述制备)、2-乙基己基缩水甘油醚(0.38摩尔，依照上文所述制备)、SO₃-DMF复合物(0.38摩尔)和乙腈(500mL)。将反应升温至80℃并且在该温度下搅拌72个小时。将反应冷却至室温，蒸发至干，并使残留物从乙酸乙酯和/或乙醇中重结晶出来，得到所需的产物。可用其它溶液来替换溶剂乙腈，包括但不限于1,2-二氯乙烷。

实施例7：制备硫酸单硫酸单-[2-(3,4-二氢异喹啉-2-基)-1-(2-丁基辛氧基甲基)乙基]酯内盐

依照实施例1制备所需产物，但是用2-己基辛醇替代2-乙基己醇。

组合物实施例

以下掺入组合物的脂肪酶是表4的实施例5中描述的脂肪酶变体1至5以及它们的组合物。

实施例8：衣物洗涤剂组合物

以下的衣物洗涤组合物A、B、C和D适用于本发明。在洗涤过程中通常将这些组合物加入到水中，浓度为80g/L至120g/L。

以下的衣物洗涤组合物E、F、G和H适用于本发明。在洗涤过程中通常将这些组合物加入到水中，浓度为80g/L至120g/L。

以下的衣物洗涤组合物I、J、K和L适用于本发明。在洗涤过程中通常将这些组合物加入到水中，浓度为20g/L至60g/L。

由下列配方举例说明具有颗粒状衣物洗涤剂形式的漂白洗涤剂组合物。在25℃下，用于洗涤织物的任何下述组合物在水中的浓度为600ppm至10000ppm，典型的中间条件为2500ppm，并且水与织物的比率为25：1。典型的pH为约10，但可通过改变酸与烷基苯磺酸的钠盐形式的比例来调节pH。

*在表4的实施例5中描述了脂肪酶变体1至5、以及它们的组合。

*依照实施例6或7或其混合物制备的有机催化剂。

**二酰基过氧化物优选的是双壬酰过氧化物。

虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明实质和范围的情况下可以做出多个其他改变和变型。因此，权利要求书意欲包括在本发明范围内的所有这样的改变和变型。在发明详述中引用的所有文件都在相关部分中引入以供参考；对于任何文件的引用不应当解释为承认其是有关本发明的现有技术。

序列表

<110>Procter & Gamble Company

<120>包含脂肪酶和漂白催化剂的组合物

<130>10283M

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(807)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(1)..()

<400>1

gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat 48

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc gag gta gag aag gcg gat 144

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct gga gtg ggc gat gtc acc 192

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa ttg atc gtc ctc tct ttc 240

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc ggg aat ctt aac ttc gac 288

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt gcc gga gca gac ctg cgt 480

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc 528

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca gag tac tgg atc aaa tct 672

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat atc gtg aag ata gaa ggc 720

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg gat atc cct 768

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210>2

<211>269

<212>PRT

<213>嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus)

<400>2

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210>3

<211>265

<212>PRT

<213>犁头霉(Absidia reflexa)

<400>3

Ser Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile

1 5 10 15

Lys Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg

20 25 30

Thr Val Ile Pro Gly Gly Arg Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala

35 40 45

Ser Asn Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr

50 55 60

Asn Val Leu Val Ala Val Gly Glu Lys Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val

65 70 75 80

Phe Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe

85 90 95

Val Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly

100 105 110

Phe Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val

115 120 125

Lys Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr

145 150 155 160

His His Gly His Ala Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg

165 170 175

Ile Gly Thr Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro

180 185 190

Tyr Gln Arg Leu Val His Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys

210 215 220

Asp Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys

225 230 235 240

Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr

245 250 255

Leu Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu

260 265

<210>4

<211>264

<212>PRT

<213>伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)

<400>4

Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile Lys

1 5 10 15

Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr

20 25 30

Val Ile Pro Gly Gly Gln Trp Ser Cys Pro His Cys Asp Val Ala Pro

35 40 45

Asn Leu Asn Ile Thr Lys Thr Phe Thr Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn

50 55 60

Val Leu Val Ala Val Gly Glu Asn Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val Phe

65 70 75 80

Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe Val

85 90 95

Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe

100 105 110

Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys

115 120 125

Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly His

130 135 140

Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His

145 150 155 160

His Gly His Asp Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile

165 170 175

Gly Thr Pro Glu Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr

180 185 190

Gln Arg Leu Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Gly

195 200 205

Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp

210 215 220

Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser

225 230 235 240

Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu

245 250 255

Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu

260

<210>5

<211>269

<212>PRT

<213>米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400>5

Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val

20 25 30

Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp

35 40 45

Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala

50 55 60

Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro

85 90 95

Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu

100 105 110

Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp

115 120 125

Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser

130 135 140

Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg

145 150 155 160

Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln

165 170 175

Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly

180 185 190

Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu

195 200 205

Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile

210 215 220

Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu

225 230 235 240

Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp

245 250 255

His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

260 265

<210>6

<211>271

<212>PRT

<213>米根霉(Rhizopus oryzae)

<400>6

Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile

1 5 10 15

Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg

20 25 30

Ser Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp

35 40 45

Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp

50 55 60

Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu

65 70 75 80

Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val

85 90 95

Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala

100 105 110

Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val

115 120 125

Val Gln Glu Gln Leu Thr Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr

130 135 140

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu

145 150 155 160

Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr

165 170 175

Val Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu

180 185 190

Ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val

195 200 205

Pro His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu

210 215 220

Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu

225 230 235 240

Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile

245 250 255

Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu

260 265 270

<210>7

<211>267

<212>PRT

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>7

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr

20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile

35 40 45

Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser

50 55 60

Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro

85 90 95

Gln Cys Asn Gly Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Val

100 105 110

Ser Val Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Lys Gln Gln Val Ser Gln

115 120 125

Tyr Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser

130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile

145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala

165 170 175

Ser Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln

180 185 190

Tyr Phe Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro

195 200 205

Val Glu Gln Gly Tyr Ala His Gly Gly Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp

210 215 220

Pro Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln

225 230 235 240

Cys Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr

245 250 255

Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly Ala Cys Thr Trp

260 265

<210>8

<211>266

<212>PRT

<213>塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)

<400>8

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr

20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile

35 40 45

Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser

50 55 60

Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro

85 90 95

Gln Cys Asn Ser Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Ile

100 105 110

Ser Val Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Gln Gln Gln Val Ser Gln

115 120 125

Phe Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser

130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile

145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Asn Gln Ala Phe Ala Ser

165 170 175

Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln Tyr

180 185 190

Phe Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro Ala

195 200 205

Asp Glu Gly Tyr Ala His Gly Val Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp Pro

210 215 220

Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln Cys

225 230 235 240

Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr Tyr

245 250 255

Phe Gly Met Thr Ser Gly His Cys Thr Trp

260 265

<210>9

<211>276

<212>PRT

<213>尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)

<400>9

Ala Val Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile

1 5 10 15

Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser

20 25 30

Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly

35 40 45

Ala Thr Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly

50 55 60

Tyr Val Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg

65 70 75 80

Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln

85 90 95

Glu Asp Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln

100 105 110

Arg Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser

115 120 125

Ala Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser Thr Gly His Ser

130 135 140

Leu Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly

145 150 155 160

Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn

165 170 175

Ala Gln Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg

180 185 190

Val Thr His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe

195 200 205

Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Asp Lys Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala

225 230 235 240

Ala Asn Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala

245 250 255

His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe

260 265 270

Ser Trp Arg Arg

275

<210>10

<211>273

<212>PRT

<213>异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)

<400>10

Thr Val Thr Thr Gln Asp Leu Ser Asn Phe Arg Phe Tyr Leu Gln His

1 5 10 15

Ala Asp Ala Ala Tyr Cys Asn Phe Asn Thr Ala Val Gly Lys Pro Val

20 25 30

His Cys Ser Ala Gly Asn Cys Pro Asp Ile Glu Lys Asp Ala Ala Ile

35 40 45

Val Val Gly Ser Val Val Gly Thr Lys Thr Gly Ile Gly Ala Tyr Val

50 55 60

Ala Thr Asp Asn Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Val Arg Gly Ser

65 70 75 80

Ile Asn Val Arg Asn Trp Ile Thr Asn Phe Asn Phe Gly Gln Lys Thr

85 90 95

Cys Asp Leu Val Ala Gly Cys Gly Val His Thr Gly Phe Leu Asp Ala

100 105 110

Trp Glu Glu Val Ala Ala Asn Val Lys Ala Ala Val Ser Ala Ala Lys

115 120 125

Thr Ala Asn Pro Thr Phe Lys Phe Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly

130 135 140

Gly Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Asp Gly Phe

145 150 155 160

Pro Phe Asp Leu Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Asp Phe

165 170 175

Phe Ala Asn Phe Val Thr Gln Gln Thr Gly Ala Glu Tyr Arg Val Thr

180 185 190

His Gly Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Ile Val Phe Gly Tyr

195 200 205

Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Gly Gly Pro Leu Asp Lys

210 215 220

Asp Tyr Thr Val Thr Glu Ile Lys Val Cys Glu Gly Ile Ala Asn Val

225 230 235 240

Met Cys Asn Gly Gly Thr Ile Gly Leu Asp Ile Leu Ala His Ile Thr

245 250 255

Tyr Phe Gln Ser Met Ala Thr Cys Ala Pro Ile Ala Ile Pro Trp Lys

260 265 270

Arg

<210>11

<211>278

<212>PRT

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>11

Asp Ile Pro Thr Thr Gln Leu Glu Asp Phe Lys Phe Trp Val Gln Tyr

1 5 10 15

Ala Ala Ala Thr Tyr Cys Pro Asn Asn Tyr Val Ala Lys Asp Gly Glu

20 25 30

Lys Leu Asn Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Asp Val Glu Ala Ala Gly

35 40 45

Ser Thr Val Lys Leu Ser Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala

50 55 60

Gly Phe Val Ala Val Asp Asn Thr Asn Lys Ala Ile Val Val Ala Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Tyr Ser Ile Arg Asn Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe Pro

85 90 95

Gln Thr Asp Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe

100 105 110

Trp Thr Ala Trp Lys Val Val Arg Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Asp

115 120 125

Glu Leu Lys Pro Glu His Ser Asp Tyr Lys Ile Val Val Val Gly His

130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr

145 150 155 160

Lys Asn Tyr Asp Ala Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Arg Val Ala

165 170 175

Asn Lys Pro Leu Ala Glu Phe Ile Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg

180 185 190

Phe Thr His Asn Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met

195 200 205

Gly Tyr Val His Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn

210 215 220

Thr Thr Val Thr Asp Asn Gln Val Thr Val Leu Asp Gly Tyr Val Asn

225 230 235 240

Phe Lys Gly Asn Thr Gly Thr Ser Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala

245 250 255

Phe His Ser His Val Trp Tyr Phe Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly

260 265 270

Pro Gly Leu Pro Leu Arg

275

<210>12

<211>278

<212>PRT

<213>卡门柏青霉(Penicillium camemberti)

<400>12

Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln Tyr

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val Gly Asp

20 25 30

Lys Leu Ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu Ala Thr Gly

35 40 45

Ala Thr Val Ser Tyr Asp Phe Ser Asp Ser Thr Ile Thr Asp Thr Ala

50 55 60

Gly Tyr Ile Ala Val Asp His Thr Asn Ser Ala Val Val Leu Ala Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Tyr Ser Val Arg Asn Trp Val Ala Asp Ala Thr Phe Val

85 90 95

His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe

100 105 110

Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys

115 120 125

Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His

130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly

145 150 155 160

Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe

180 185 190

Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser

195 200 205

Met Gly Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn

210 215 220

Asn Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val

225 230 235 240

Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe

245 250 255

Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro

260 265 270

Gly Leu Pro Phe Lys Arg

275

<210>13

<211>270

<212>PRT

<213>臭曲霉(Aspergillus foetidus)

<400>13

Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asp Ser Asn

20 25 30

Leu Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr

35 40 45

Thr Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Ser Thr Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile

85 90 95

Leu Glu Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly

100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile

115 120 125

Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg

145 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile

165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala

180 185 190

Asn Phe Arg Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro

195 200 205

Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Asn Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser Val Leu

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu

260 265 270

<210>14

<211>270

<212>PRT

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>14

Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn

20 25 30

Val Thr Cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr

35 40 45

Lys Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Ser Thr Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile

85 90 95

Leu Gln Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly

100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile

115 120 125

Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg

145 150 155 160

Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala

180 185 190

Asn Phe Pro Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro

195 200 205

Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu

260 265 270

<210>15

<211>269

<212>PRT

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>15

Asp Val Ser Ser Ser Leu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys

20 25 30

Leu Thr Cys Ser Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr

35 40 45

Gln Ser Leu Asp Glu Phe Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala

50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Ala Asp Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Ala Asp Leu Ala Asn Trp Val Ala Asn Leu Asn Phe Gly

85 90 95

Leu Glu Asp Ala Ser Asp Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly

100 105 110

Phe Trp Lys Ala Trp Ser Glu Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val

115 120 125

Glu Ser Ala Leu Ser Asp His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly

130 135 140

His Ser Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg

145 150 155 160

Asn Ser Gly His Ser Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu

165 170 175

Gly Asn Glu Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly

180 185 190

Asn Tyr Arg Val Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro

195 200 205

Thr Leu Leu Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser

210 215 220

Ala Asp Glu Ala Thr Val Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu Val Thr Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Ile Asp

245 250 255

Ala His Arg Trp Tyr Phe Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

260 265

<210>16

<211>251

<212>PRT

<213>Landerina penisapora

<400>16

Pro Gln Asp Ala Tyr Thr Ala Ser His Ala Asp Leu Val Lys Tyr Ala

1 5 10 15

Thr Tyr Ala Gly Leu Ala Tyr Gln Thr Thr Asp Ala Trp Pro Ala Ser

20 25 30

Arg Thr Val Pro Lys Asp Thr Thr Leu Ile Ser Ser Phe Asp His Thr

35 40 45

Leu Lys Gly Ser Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Asn Glu Pro Cys Lys Glu

50 55 60

Ile Ile Val Ala Tyr Arg Gly Thr Asp Ser Leu Ile Asp Trp Leu Thr

65 70 75 80

Asn Leu Asn Phe Asp Lys Thr Ala Trp Pro Ala Asn Ile Ser Asn Ser

85 90 95

Leu Val His Glu Gly Phe Leu Asn Ala Tyr Leu Val Ser Met Gln Gln

100 105 110

Val Gln Glu Ala Val Asp Ser Leu Leu Ala Lys Cys Pro Asp Ala Thr

115 120 125

Ile Ser Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Cys Ile Ser

130 135 140

Met Val Asp Thr Ala Gln Arg His Arg Gly Ile Lys Met Gln Met Phe

145 150 155 160

Thr Tyr Gly Gln Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Phe Ala Glu Tyr Val

165 170 175

Glu Asn Leu Gly His Pro Val Phe Arg Val Val Tyr Arg His Asp Ile

180 185 190

Val Pro Arg Met Pro Pro Met Asp Leu Gly Phe Gln His His Gly Gln

195 200 205

Glu Val Trp Tyr Glu Gly Asp Glu Asn Ile Lys Phe Cys Lys Gly Glu

210 215 220

Gly Glu Asn Leu Thr Cys Glu Leu Gly Val Pro Phe Ser Glu Leu Asn

225 230 235 240

Ala Lys Asp His Ser Glu Tyr Pro Gly Met His

245 250

Claims

1.一种洗涤剂组合物，所述组合物包含：

a) 亲本脂肪酶的变体，其中所述亲本脂肪酶与序列标识号：2 相同，并且所述变体的突变选自以下取代中的一组取代：

1) T231R + N233R + I255Y

2) I90A + T231R + N233R + I255V；和

b) 能够从过氧酸接受氧原子并将其转移到可氧化基质上的漂白催化剂。

2. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述漂白催化剂具有与以下化学式对应的化学结构：

其中 R¹³ 是包含 3 至 24 个碳原子的支链烷基或包含 1 至 24 个碳原子的直链烷基。

3. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述漂白催化剂具有与以下化学式对应的化学结构：

其中 R¹³ 选自由下列组成的组：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。

4. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述组合物包含按所述组合物的重量计小于 5% 的过氧化物源。

5. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述组合物包含按所述组合物的重量计 5% 至 10% 的碳酸根阴离子源。

6. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述组合物包含染料转移抑制剂。

7. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述组合物包含：

a)按所述组合物的重量计小于 5% 的沸石助洗剂；

b)任选地，按所述组合物的重量计小于 5% 的磷酸盐助洗剂；和

c)任选地，按所述组合物的重量计小于 5% 的硅酸盐。

8. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述组合物包含二酰基和/或四酰基过氧化物。

9. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述组合物包含羟苯磺酸盐漂白活化剂和过氧化物源。

10. 如权利要求 1 所述的组合物，其中所述组合物包含预成形的过氧酸。

11. 一种组合物，所述组合物包含：

a) 脂肪酶；所述脂肪酶包含亲本脂肪酶的变体，其中所述亲本脂肪酶与序列标识号：2 相同，并且所述变体的突变选自以下取代中的一组取代：

1) T231R + N233R + I255Y

2) I90A + T231R + N233R + I255V；和

b) 二酰基和/或四酰基过氧化物。

12. 如权利要求 11 所述的组合物，其中所述组合物包含漂白催化剂，所述漂白催化剂能够从过氧酸接受氧原子并将所述氧原子转移到可氧化基质上。