CN104903443A - α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及α-淀粉酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
对序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
相关技术说明
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些用途如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。
WO 2000/060058披露了两种α-淀粉酶AAI-6和AAI-10(作为SEQ IDNO 2和4，其在被申请中是SEQ ID NO 1和2)并且披露了其热稳定的变体。
出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经日益重要。然而，大多数酶(包括AAI-6和AAI-10的淀粉酶)具有通常高于在低温洗涤中所用温度的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。因此，重要的是找到这样的α-淀粉酶变体，它们在温度降低时保留其洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。因而，需要获得这样的淀粉分解酶，这些酶可以在低温下起作用并同时保留或增加其他令人希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能。
因而，本发明的目的在于提供以下α-淀粉酶变体:在低温下具有高性能特别是高洗涤性能的α-淀粉酶变体和/或在洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶变体和/或在洗涤剂中存储后具有高淀粉酶活性的α-淀粉酶变体。
本发明提供了与其亲本相比具有改进特性的α-淀粉酶变体。
发明概述
本发明涉及分离的α-淀粉酶变体，这些α-淀粉酶变体在对应于SEQ IDNO:1的成熟多肽的W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、F289、W284、G304、G305、W347、R439、W469、D476以及G477的两个或更多个(若干个)位置处包括改变，其中每个改变独立地是取代、缺失或插入，并且其中这些变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％或至少95％但小于100％的序列一致性，并且其中这些变体具有α-淀粉酶活性。
本发明还涉及包含这些变体的洗涤剂组合物，编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及这些变体在清洁过程中的用途。
定义
α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，其构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一个方面中，本发明的变体具有SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。
SEQ ID NO:1：
HHDGTNGTIM QYFEWNVPND GQHWNRLHNN AQNLKNAGITAIWIPPAWKG
TSQNDVGYGA YDLYDLGEFN QKGTVRTKYG TKAELERAIRSLKANGIQVYGDVVMNHKGG ADFTERVQAV EVNPQNRNQE VSGTYEIEAWTGFNFPGRGN
QHSSFKWRWY HFDGTDWDQS RQLSNRIYKF RGDGKAWDWEVDTENGNYDY
LMYADVDMNH PEVINELNRW GVWYANTLNL DGFRLDAVKHIQFSFMRNWL
GHVRGQTGKN LFAVAEYWKN DLGALENYLS KTNWTMSAFDVPLHYNLYQA
SNSGGNYDMR NLLNGTLVQR HPSHAVTFVD NHDTQPGEALESFVQGWFKP
LAYATILTRE QGYPQVFYGD YYGIPSDGVP SYRQQIDPLLKARQKYAYGP
QHDYLDHPDV IGWTREGDSS HPKSGLATLI TDGPGGSKRMYAGLKNAGET
WYDITGNRSD TVKIGSDGWG EFHVNDGSVS IYVQK
SEQ ID NO:2：
HHDGTNGTIM QYFEWNVPND GQHWNRLHNN AQNLKNAGITAIWIPPAWKG
TSQNDVGYGA YDLYDLGEFN QKGTVRTKYG TKAELERAIRSLKANGIQVY
GDVVMNHKGG ADFTERVQAV EVNPQNRNQE VSGTYQIEAWTGFNFPGRGN
QHSSFKWRWY HFDGTDWDQS RQLANRIYKF RGDGKAWDWEVDTENGNYDY
LMYADVDMDH PEVINELNRW GVWYANTLNL DGFRLDAVKHIKFSFMRDWL
GHVRGQTGKN LFAVAEYWKN DLGALENYLS KTNWTMSAFDVPLHYNLYQA
SNSSGNYDMR NLLNGTLVQR HPSHAVTFVD NHDTQPGEALESFVQGWFKP
LAYATILTRE QGYPQVFYGD YYGIPSDGVP SYRQQIDPLLKARQQYAYGR
QHDYFDHWDV IGWTREGNAS HPNSGLATIM SDGPGGSKWMYVGRQKAGEV
WHDMTGNRSG TVTINQDGWG HFFVNGGSVS VWVKR
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
表达：术语“表达”包括涉及到变体生产中的任何步骤，包括(但不局限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽。其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面中，一个片段包含至少470个氨基酸残基、至少475个氨基酸残基或至少480个氨基酸残基。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与本发明的变体相关的、与亲本相比改进的特征，该亲本与该变体仅在一个或多个声称的位置中不同。可替代地，将其与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽进行比较。此类改进的特性包括但不限于催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性以及热稳定性和改进的洗涤性能，特别是在低温下，例如5℃与35℃之间的温度，例如低于35℃或低于30℃或甚至低于20℃，或在低于15℃的温度下，或甚至在低于10℃的温度下的改进的洗涤性能。可以在这些变体中改进的另一种特性是在洗涤剂组合物中存储期间的稳定性。
洗涤性能：在本发明背景下，使用术语“洗涤性能”作为酶在例如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的能力。可以通过计算如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(ΔRem)量化洗涤性能。
改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为变体酶例如通过增加的污渍去除而相对于亲本淀粉酶的洗涤性能或相对于具有示于SEQ ID NO 1或2中的氨基酸序列的α-淀粉酶展现出淀粉酶变体的洗涤性能的改变。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。可以通过比较如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(ΔRem)测量改进的洗涤性能。
低温：“低温”是5℃-35℃，优选5℃-30℃更优选5℃-25℃，更优选5℃-20℃，最优选5℃-15℃并且特别是5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃，优选10℃-30℃，更优选10℃-25℃，最优选10℃-20℃，并且特别是10℃-15℃的温度。
δ反射值(Delta remission value，ΔRem)：在此将术语“δ反射”或“δ反射值”定义为测试材料在460nm处的反射率或反射测量值的结果，该测试材料是例如小块布样CS-28(测试材料BV中心(Center for TestmaterialsBV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)或硬表面。将该小块布样与作为背景的至少一个其他小块布样一起测量，该其他小块布样是在相同条件下洗涤的。δ反射是用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值减去未用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，成熟多肽是SEQ ID NO:1或2的氨基酸1至485。
本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者被修饰成以一种本来不存在于自然界中的方式含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行变化以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的一种多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母或丝状真菌)表达的一种α-淀粉酶。
变体命名惯例
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology) 537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，《核酸研究》25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，《分子生物学杂志》287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，《生物信息学》19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，《分子生物学杂志》313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或者组合延伸(Shindyalov和伯恩(Bourne)，1998，《蛋白质工程》11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，《生物信息学》16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。在给定位置处的氨基酸可以用任何其他氨基酸取代的情况下，将其表示为T226ACDEFGHIKLMNPQRSWVY。因此，这意味着位置226处的苏氨酸可以被选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、W、V或Y的组的一个氨基酸取代。同样地，在给定位置处的氨基酸可以用选自特定的氨基酸组的一个氨基酸取代的情况下，例如在位置226处的苏氨酸可以被酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸中的任一个取代的情况下，将其表示为T226YFH。给定位置处的不同改变还可以由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
发明详细说明
变体
本发明涉及分离的α-淀粉酶变体，这些α-淀粉酶变体在对应于SEQ IDNO:1的成熟多肽的以下位置的一个、两个或更多个(若干个)位置处包括改变：W140；W159；W167、Q169、W189、E194、N260、F262、F289、W284、G304、G305、W347、R439、W469、D476以及G477，其中每个改变独立地是取代、缺失或插入，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％或至少95％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
本发明还涉及分离的α-淀粉酶变体，这些α-淀粉酶变体在对应于SEQID NO:2的成熟多肽的以下位置的一个、两个或更多个(若干个)位置处包括改变：W140；W159；W167、Q169、W189、E194、N260、F262、F289、W284、S304、G305、W347、W439、W469、G476以及G477，其中每个改变独立地是取代、缺失或插入，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％或至少95％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
因而，提供了与亲本α-淀粉酶相比或与SEQ ID NO:1或2的α-淀粉酶相比在低温下具有改进的洗涤性能的变体。
在一个实施例中，这些改变是取代。
在本发明的另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的三个或更多个处包括改变。
在本发明的又另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的四个或更多个处包括改变。
在本发明的又另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的五个或更多个处包括改变。
在本发明的又另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的六个或更多个处包括改变。
在本发明的又另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的七个或更多个处包括改变。
在本发明的又另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的八个或更多个处包括改变。
在本发明的又另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的九个或更多个处包括改变。
在本发明的又另一个实施例中，这些变体可以在以上提到的所述位置的十个或更多个处包括改变。
在本发明的一个方面中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置140处的取代。该取代可以是W140ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，但是优选地，它是W140YFH并且最优选地，它是W140Y。
在本发明的另一个方面中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置159处的取代。该取代可以是W159ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选W159YFH。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置167处的取代。该取代可以是W167ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选W167YHF。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置169处的取代。该取代可以是Q169ACDEFGHIKLMNPWRSTVY中的任一个。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置189处的取代。该取代可以是W189ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个。可替代地，E190P可以被取代。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置194处的取代。该取代可以是E194ACDWFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选E194D。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置260处的取代。该取代可以是N260ACFGHIKLMWPQ RSTVY中的任一个，优选N260G或N260P或N260A。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置262处的取代。该取代可以是F262ACDEWGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选F262P或F262G。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置284处的取代。该取代可以是W284ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选W284G或W284H。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置F289处的取代。该取代可以是F289ACDEWGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选F289H。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置304处的取代。该取代可以是G304ACEFHIKLMPQRWTVY中的任一个，优选地，它是G304K或G304R或G304Q或G304E，并且最优选地，它是G304K。I在其他淀粉酶(例如，SEQ ID NO:2的淀粉酶)中，在此位置中的天然存在的氨基酸是S。所以，当使用此类其他淀粉酶作为这些变体的起点时，该取代可以是S304ACEFHIKLMPQRWTVY中的任一个；优选地，它是S304K或S304R或S304Q或S304E，并且最优选地，它是S304K。
在本发明的另一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置305处的取代。该取代可以是G305ACEFWHIKLMPQRTVY中的任一个，优选地，它是G305K或G305R或G305Q或G305E，并且最优选地，它是G305K。
在本发明的一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置347处的取代。该取代可以是W347ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选W347Y或W347F或W347H。
在本发明的另一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置439处的取代。该取代可以是R439ACDEFGHIKLMNPQSTVY中的任一个；优选地，它是R439N或R439Q的取代。I在其他淀粉酶(例如，SEQ ID NO:2的淀粉酶)中，在此位置中的天然存在的氨基酸是W。所以，当使用此类其他淀粉酶作为这些变体的起点时，该取代可以是W439ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个，优选地，它是W439N或W439Q的取代。
在本发明的另一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置469处的取代。该取代可以是W469ACDEFGHIKLMNPQRSTVY中的任一个；优选地，它是W469T或W469N。
在本发明的另一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置476处的取代。该取代可以是D476ACEFHIKLMPQRTVWY中的任一个，优选地，它是D476K或D476R或D476Q或D476E，并且最优选地，它是D476K。I在其他淀粉酶(例如，SEQ ID NO:2的淀粉酶)中，在此位置中的天然存在的氨基酸是G。所以，该取代可以是G476ACEFHIKLMPQRTVWY中的任一个，优选地，它是G476K或G476R或G476Q或G476E，并且最优选地，它是G476K。
在本发明的另一个实施例中，当使用SEQ ID NO:1编号时，以上提到的一个、两个或更多个取代中的一个可以是位置477处的取代。该取代可以是G477ACEFHIKLMPQRTVWY中的任一个，优选地，它是G477K或G477R或G477Q或G477E，并且最优选地，它是G477K。
本发明的发明人考虑了以下变体在低温洗涤下具有特别高的性能，这些变体与SEQ ID NO:1或2具有至少85％序列一致性并且具有以上提到的取代中的一个、两个或更多个。具体而言，对于SEQ ID NO:1或2的变体或与SEQ ID NO:1或2具有至少85％序列一致性的变体，有利的是用例如任何氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸)取代该分子的表面上的色氨酸(例如，位置140、159、167、189、284、347、439、469处的色氨酸)并且用一个更大的氨基酸(如谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸)取代这些色氨酸的附近区域(表面上)的甘氨酸或丝氨酸。这是例如G304EQRK或G305EQRK或D476EQRK或G477EQRK的取代。此类取代降低了α-淀粉酶的底物结合并改进了低温洗涤下的洗涤性能。
当使用SEQ ID NO:1编号时，本发明的变体可以进一步包括选自下组的两个位置的缺失，该组由以下各项组成：R181、G182、D183以及G184，优选R181+G182、或G182+D183或R181+G184或G182+G184，或更优选D183+G184的缺失。已经发现，这样的一种双缺失稳定该分子。
本发明的变体可以进一步包括选自下组的取代中的至少一个，该组由以下各项组成：G109A、G149A、K179L、G186A、E190P、N195F、M202LIT、V206YF、Y243F、S244QAEDN以及N209D，并且是当使用SEQID NO:1编号时。这些取代同样为这些α-淀粉酶提供改进的稳定性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+R439N
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+D476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:1的α-淀粉酶具有至少85％但小于100％的序列一致性。优选地，这些变体进一步包括氨基酸占据的位置R181+G182、或G182+D183，或最优选D183+G184的缺失。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+R439N
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+D476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:1的α-淀粉酶具有至少90％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+R439N
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+D476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:1的α-淀粉酶具有至少95％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+R439N
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+D476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:1的α-淀粉酶具有至少97％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:1的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+R439N
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+D476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:1的α-淀粉酶具有至少98％但小于100％的序列一致性。
在又另一个方面中，本发明涉及变体，其中这些改变由SEQ ID NO:1中的以下改变组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304KL279T+W284G+H324N+G305RL279T+W284G+H324N+R439NL279T+W284G+H324N+W469TL279T+W284G+H324N+D476KL279T+W284G+H324N+G477RG304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
在又另一个方面中，本发明涉及变体，其中这些改变由SEQ ID NO:2中的以下改变组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+W439R
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+G476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
在又另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:2的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304KL279T+W284G+H324N+G305RL279T+W284G+H324N+W439RL279T+W284G+H324N+W469TL279T+W284G+H324N+G476KL279T+W284G+H324N+G477RG304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:2的α-淀粉酶具有至少85％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:2的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+W439R
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+G476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:2的α-淀粉酶具有至少90％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:2的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+W439R
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+G476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:2的α-淀粉酶具有至少95％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:2的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+W439R
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+G476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:2的α-淀粉酶具有至少96％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面中，本发明涉及以下变体，这些变体在对应于SEQ IDNO:2的多肽的位置的位置中包括选自下组的修饰，该组由以下各项组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+W439R
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+G476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K
其中这些变体与SEQ ID NO:2的α-淀粉酶具有至少97％但小于100％的序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体包括2与20之间个改变，例如2与10之间或2与5之间，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。优选地，这些改变是取代和/或缺失。
在一个实施例中，本发明提供了以下变体，这些变体由450至490，例如460至485、465至483、480至483个氨基酸，如481、482、483或484个氨基酸(优选483个)组成。
在一个实施例中，该变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列一致性。
这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包含一个或多个额外的变化。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH、改进洗涤性能等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以识别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化效率。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化速率。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的化学稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的氧化稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的pH活性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的pH稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的比活性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的储存条件下稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有降低的底物结合。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物特异性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的底物稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的表面特性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的热活性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的热稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的洗涤性能，特别是低温下的改进的洗涤性能。
亲本α-淀粉酶
该亲本α-淀粉酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；(b)SEQ ID NO:1的成熟多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性或(c)一种与针对SEQ ID NO:1的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
在另一个方面中，该亲本α-淀粉酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；(b)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性或(c)一种与针对SEQ ID NO:2的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性的多肽。
在一个方面中，该亲本与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一个方面中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在一个方面中，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一个方面中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。
在又另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:1或2的成熟多肽的等位基因变体。
亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属α-淀粉酶。优选的菌株是芽孢杆菌属DSM 12650(AAI-6α-淀粉酶)或DSM 12651(AAI-10α-淀粉酶)。根据国际承认用于专利程序的微生物菌种保藏布达佩斯条约，在1999年1月25日，将这些菌株保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutshe Sammmlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124布伦瑞克(Braunschweig)，德国。因此，在一个方面中，该亲本是芽孢杆菌属AAI-6α-淀粉酶或芽孢杆菌属AAI-10α-淀粉酶，例如SEQ IDNO:1或2的α-淀粉酶。还可以通过本领域已知的方法人工制备SEQ ID NO 1和2的α-淀粉酶及其变体。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的以下位置的两个或更多个位置处向亲本α-淀粉酶中引入改变：W140；W159；W167、Q169、W189、E194、N260、F262、F289、W284、G304、G305、W347、R439、W469、D476以及G477，其中每个改变独立地是取代、缺失或插入并且该变体具有α-淀粉酶活性；并且(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，《自然生物技术》(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，《自然医学》(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，《真菌遗传学简讯》(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，《自然》432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖α-淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins fromrecombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖α-淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKAα-淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代)；及其突变型启动子、截短型启动子以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKAα-淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’-末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、米曲霉TAKAα-淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖α-淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子以及米曲霉葡糖α-淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，《蛋白质纯化》(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明的一种变体的组合物。优选地，这些组合物富含这种变体。术语“富含”意指该组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，富集因子为1.1。
该组合物可以包括一种变体作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。例如可以通过属于以下属的微生物来产生另外的一种或多种酶：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉菌、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或柔毛腐质霉；或者木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明针对以下洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的α-淀粉酶变体。
另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液体0.001-100mg的蛋白，例如0.01-100mg的蛋白，优选是0.005-50mg的蛋白，更优选是0.01-25mg的蛋白，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白，最优选是0.05-5mg的蛋白，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。
本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约0％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约0％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
助水溶剂
助水溶剂是一种化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述(2007)，胶体&界面科学新见(Current Opinion inColloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。
洗涤剂可以包括按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约10％至约40％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50％，例如约10％至约40％的洗涤剂共助洗剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂在例如WO 09/102854、US 5977053中描述。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-20％，如大约0％至大约10％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物+餐具洗涤+I&I洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过白啶酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
该洗涤剂可以包括按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的一种聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO 2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化合物分解酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最优pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有一种序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或一种家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有一种序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、Celluclean ClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰刀菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO05/040372中)，以及衍生自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO 95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenzTm、EffectenzTm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶：
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶：
可以与本发明的变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有一个缺失并且在位置193中具有一个取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的变体。SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476，使用WO96/023873的SEQ ID 2编号。更优选的变体是在选自181、182、183以及184的两个位置中具有缺失的那些，例如181和182、182和183或位置183和184。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在C-末端具有截短和/或在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase和Preferenz S100、Preferenz S110(来自杰能科国际公司/杜邦(Genencor International Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶
根据本发明的过氧化物酶是由如由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)陈述的酶分类EC 1.11.1.7包括的过氧化物酶，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中描述的那些。
根据本发明的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶加以分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。
在一个实施例中，本发明的卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的一个优选方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。
已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceoushyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，比如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已经从细菌，如假单胞菌属(例如，吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
在一个优选实施例中，该卤代过氧化物酶可源自弯孢属，特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)和不等弯孢，例如如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS 102.42或描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS 444.70；或可源自如描述于WO 01/79459中的Drechslerahartlebii、如描述于WO 01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiellasalina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium sp.。
根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来自真菌的适合实例包括可源自以下项的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。
来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或源自嗜热毁丝霉，如披露于WO95/33836中。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包括一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是无尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆料。
无尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括黏土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基芪-磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的ParawhiteKX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子或阴离子对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个芯结构和连接至该芯结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。芯结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用结合在此)。此外，随机接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他合适的辅料包括但不局限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、和用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及，羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970 A1)。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征：
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包括从0％-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂也可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的α-淀粉酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的肥皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将一固体物体(例如洗衣皂条)放置于一个容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。
洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、α-淀粉酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的α-淀粉酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
颗粒洗涤剂配制品
如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO 04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂制剂在以下文献中描述：WO 09/124162、WO09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO09/112296、WO 09/112298、WO 09/103822、WO 09/087033、WO09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO09/122125、WO 09/095645、WO 09/040544、WO 09/040545、WO09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO09/068501、WO 09/065770、WO 09/021813、WO 09/030632和WO09/015951。
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO2011005623、WO 2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO2011005630、WO 2011005830、WO 2011005912、WO 2011005905、WO2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO 2010120863、WO2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO2010033897、WO 2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO2010030539、WO 2010024467、WO 2010024469、WO 2010024470、WO2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、
WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO2010102861、WO 2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO2010069742、WO 2010069718、WO 2010069957、WO 2010057784、WO2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO 2010003792、
WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO2010115813、WO 2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO2010094356、WO 2010084203、WO 2010078979、WO 2010072456、WO2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO 2010066486、WO2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO 2010031607、WO 2010000636。
用途
本发明还涉及用于使用α-淀粉酶变体的方法。
本发明的α-淀粉酶变体可用于洗涤剂组合物、衣物洗涤、餐具洗涤和/或低温清洁过程以及硬表面清洁(ADW、洗车、工业表面)。
用于洗涤剂。可以将本发明的多肽被添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
洗涤剂组合物可以进一步配制为单位剂量形式或为肥皂条或洗衣条，
在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。在另一个方面中，本发明提供了一种适合在35℃或低于35℃的温度进行清洁的洗涤剂。
方法
用于确定α-淀粉酶活性的pNP-G7测定法
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。缩写为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡萄糖苷酶进一步消化水解底物以释放自由PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM Hepes(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0)。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM Hepes、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、>4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-pNP底物混合，产生底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))，1mMCaCl2，pH 8.0。
程序：
将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来执行测定。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm在5分钟范围内每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
确定与淀粉的结合
测定原理：
将淀粉酶变体在不溶性生米淀粉存在或不存在下在选择的pH值、在选择的时间并且在选择的温度温育，其中所述选择的pH值处于pH 4.0至11.0的范围，这取决于待选择的α-淀粉酶应用的预期pH值；例如对于洗涤剂应用，适当地选择处于碱性区域内的pH，如pH 8.0或pH 10.0；所述选择的时间通常在5分钟和1小时之间，优选地在10至30分钟范围内，如10分钟或30分钟；所述选择的温度通常处于0℃至30℃范围内，优选地在4℃。在离心之后，确定上清液中的淀粉酶活性。在大米淀粉存在和不存在下孵育的样品的活性的差异是淀粉酶与不溶性淀粉结合的量度。
材料与方法：
大米淀粉(西格玛公司(Sigma Inc)，目录号S7260)、Hepes、氯化钙、Triton X-100、甘氨酸、EnzChek Ultra淀粉酶分析试剂盒(生命技术公司(Life Technologies)，目录号E33651)、用于孵育和稀释的96微孔板(Nunc，目录号269620)和用于荧光测量的96孔半区域黑色平板(康宁公司(Corning)，目录号3694)。
测定缓冲液含有50mM Hepes(pH 8.0)，0.1mM CaCl2和0.01％TritonX-100。将酶蛋白溶液用测定缓冲液稀释至0.15mg/ml。高pH结合缓冲液含有50mM甘氨酸-NaOH(pH 10.0)和0.01％Triton X-100。在测定缓冲液中和/或在高pH结合缓冲液中制备用于SEQ ID NO:1和2的变体的大米淀粉溶液(2.5％)。根据制造商的说明书制备EnzCheck Ultra淀粉酶底物溶液并且在测定缓冲液中将其稀释至50μg/ml。
a)将含有大米淀粉(2.5％)或不含米淀粉的100μl缓冲液添加至96微孔板中并且在4℃预孵育30分钟。
b)将20μl酶溶液添加至以上孔并且将平板置于混合器上并在4℃以900转/分钟混合30分钟。
c)将平板在4℃以2000转/分钟离心5分钟以便使淀粉沉淀下来，并将上清液小心地移出并在分析缓冲液中稀释至大约1250倍，从而酶蛋白浓度是大约20ng/mL。
d)将25μl的稀释的酶样品添加至含有25μl EnzCheck Ultra淀粉酶底物溶液的96孔半区域黑色平板，并将该平板立即置于平板读数仪中用于荧光测量。
e)以激发波长485nm和发射波长512nm在25℃测量荧光强度的变化(ΔF.I.)30分钟。取得0.5分钟至5分钟的时间间隔之间的荧光读数用于计算活性(即)，荧光强度变化/分钟(ΔF.I./min)。
用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
为了评定洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行衣物洗涤实验。使用AMSA，可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，盖子将待洗涤的织物样品对槽开口强力挤压。在洗涤期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。
可以在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
标准洗涤剂和测试材料可以如下：
试验材料从EMPA试验材料AG隔室(EMPA Testmaterials AG，12，CH-9015St.Gallen，瑞士)以及从测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)和WFK测试织物有限公司(WFK Testgewebe GmbH)(Christenfeld 10，D-41379 Brüggen，德国)获得。
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝4:1:7.5)添加到测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达，Midtager 29，DK-2605丹麦，或Expression 10000XL，丹麦爱普生(Epson Danmark)，Transformervej 6，2730Herlev，丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
I n t = r 2 + g 2 + b 2 .
用于自动餐具洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
进行洗涤实验，以便评估所选α-淀粉酶变体在餐具洗涤洗涤剂组合物中的洗涤性能。可以使用自动机械应力测定(AMSA)测试本申请的α-淀粉酶变体。使用AMSA，可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，盖子将待洗涤的三聚氰胺瓦片对槽开口强力挤压。在洗涤期间，板、测试溶液、三聚氰胺瓦片和盖子剧烈振动从而使测试溶液与玷污的三聚氰胺瓦片接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
可以在根据以下一个或多个表指定的实验条件下进行实验：
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝4:1:10)添加到测试系统中将水硬度调节至17°dH。在洗涤之后，将三聚氰胺瓦片用自来水沖洗并干燥。
将酶变体的性能作为用该特定α-淀粉酶洗涤的三聚氰胺瓦片的颜色的亮度来测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量蛋白酶的洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))，Midtager29，DK-2605丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤三聚氰胺瓦片的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，使用专门设计的软件应用程序(诺维信颜色矢量分析仪(Novozymes Colour Vector Analyzer))。该程序从图像中检索24位像素值并将其转化成红、绿和蓝色的值(RGB)。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
I n t = r 2 + g 2 + b 2 .
纺织品：
带有淀粉的标准三聚氰胺瓦片(例如DM-77和DM-78)可以获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
AMSA洗涤性能
通过如方法部分中所述的AMSA测试方法测试变体和对应的亲本α-淀粉酶的洗涤性能。将结果给出为(变体的性能-空白的性能)除以(亲本的性能-空白的性能)乘以100，其中空白是通过在相同的条件下、但是不存在α-淀粉酶时洗涤所获得的性能。
Terg-O-tometer(TOM)洗涤测定
Tergo-To-Meter(TOM)是一种中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试12种不同洗涤条件。TOM基本上是大型的具有多达12个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机器并且在实验期间，它们中的每一者将含有特定洗涤剂/酶系统的溶液并且对玷污的和未玷污的织物测试其性能。通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体。因为TOM杯子不含盖子，所以有可能在TOM实验期间收回样品并且在洗涤期间在线分析信息。
TOM标准洗涤系统主要用于清洁剂和酶的中等规模测试，在例如US或LA/AP洗涤条件下。在一个TOM实验中，如压载物与污物的比率和织物与洗涤液的比率的因素可以变化。因此，TOM提供了在小规模实验(如AMSA和微型洗涤)与在顶部加载型洗衣机中的更费时的全规模实验之间的联系。
设备：水浴具有12个钢制烧杯并且每个烧杯1个旋转臂，每个烧杯的容量是500或1200mL的洗涤剂溶液。温度范围是从5℃至80℃。水浴应当用去离子水填充。转动速度可以设定到高达70至120转/分钟。
TOM洗涤性能
通过添加CaCl2、MgCl2和NAHCO3将水硬度调节至下述强度。如下所述，在一个桶中制备具有所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度的洗涤溶液。洗涤剂在磁搅拌10min期间溶解。
在Terg-O-Tometer中，根据以下设置设定水浴中的温度和转速(rpm)。当根据设置调节温度(公差是+/-0.5℃)时，将洗涤溶液根据下文描述的量添加至TOM烧杯中。
在烧杯中以120rpm进行搅拌。将2个大米淀粉小块布样(CS-28)和污垢压载物添加至每个烧杯中并且根据下文所述的时间进行洗涤。将小块布样在冷自来水中冲洗5min。将小块布样于黑暗中静置干燥过夜。
纺织品：纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
污垢压载物：污垢压载物(棉花/聚酯上的大米淀粉)(EMPA 162)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。Bistro肉汁(063KC)、Frij巧克力奶昔、Heinz意大利面条(113KC)、Herseys双层巧克力获得自Warwick Equest有限公司，55单元，康塞特商业园(Consett Business Park)，康塞特，达勒姆郡，DH86BN，英国
表1：实验条件
洗涤剂和试验材料如下：
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度来测量，表示为反射值。使用Macbeth 7000 Color Eye分光光度计进行反射测量。测量每个干小块布样。由于存在来自背景的干扰风险，在测量反射期间将小块布样置于4层织物的顶部。在460nm处测量反射。不包括UV滤光片。计算小块布样的反射的平均结果。
培养基和溶液
清洁组合物：
标准洗涤剂1和2
标准1 标准2
组分 ％w/w ％w/w
LAS 12 12
AEOS 4,9 4,9
皂(可可) 2,75 2,75
皂(大豆) 2,75 2,75
AEO N25-7 11 11
NaOH 1,75 1,75
乙醇 3 3
MPG 6 6
甘油 1,7 1,7
TEA 3,3 3,3
甲酸钠 1 1
柠檬酸钠 2 2
HEDP 0 0,5
PCA(Sokalan CP-5) 0,18 0,18
离子交换水 34,2 34,2
DTMPA 0,2 0
标准洗涤剂A
标准洗涤剂X
化合物 wt％
表面活性剂系统
LAS 15
AEO 2*
皂 0
助洗剂系统
碳酸钠 20
二硅酸钠 12
沸石A 15
PCA 1
硫酸钠 37
将*标准X混合，不含AEO。将AEO单独添加至洗涤。
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (50)

1.一种α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、F289、W284、G304、G305、W347、R439、W469、D476以及G477的两个或更多个(若干个)位置处包括改变，其中每个改变独立地是取代、缺失或插入，并且其中该变体与SEQ ID NO:1或2的成熟多肽具有至少85％，例如至少90％但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
2.如权利要求1所述的变体，该变体在所述位置的三个或更多个处包括改变。
3.如权利要求1或2所述的变体，该变体在所述位置的四个或更多个处包括改变。
4.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在所述位置的五个或更多个处包括改变。
5.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在所述位置的六个或更多个处包括改变。
6.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在所述位置的七个或更多个处包括改变。
7.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在所述位置的八个或更多个处包括改变。
8.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在所述位置的九个或更多个处包括改变。
9.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中这些改变是取代。
10.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：W140ACDEFGHIKLMNPQRSTVY，优选W140YFH，最优选W140Y。
11.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：W159ACDEFGHIKLMNPQRSTVY，优选W159YFH。
12.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：W167ACDEFGHIKLMNPQRSTVY，优选W167YFH。
13.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：Q169ACDEFGHIKLMNPWRSTVY。
14.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：W189ACDEFGHIKLMNPQRSTVY，优选W189YFHEDQN。
15.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：E194ACDWFGHIKLMNPQRSTVY，优选E194DNS，最优选E194D。
16.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：N260ACFGHIKLMWPQRSTVY，优选N260G或N260P或N260A。
17.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：F262ACDEWGHIKLMNPQRSTVY，优选F262P或F262G。
18.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：W284ACDEFGHIKLMNPQRSTVY，优选W284G或W284H。
19.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：F289ACDEWGHIKLMNPQRSTVY，优选F289H。
20.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：G304ACEFHIKLMNPQRWTVY，优选G304KRQE，最优选G304K。
21.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：G305ACEFWHIKLMNPQRTVY，优选G305KRQE，最优选G305K。
22.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：W347ACDEFGHIKLMNPQRSTVY，优选W347YFH。
23.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：R439ACDEFGHIKLMNPQSTVY，优选R439NQT。
24.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：W469ACDEFGHIKLMNPQRSTVY，优选W469T或W469N。
25.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：D476ACEFHIKLMNPQRTVWY，优选地，其是D476K或D476R或D476Q或D476E，并且最优选地，其是D476K。
26.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该两个或更多个改变包括以下取代：G477ACEFHIKLMNPQRTVWY，优选G477K或G477R或G477Q或G477E，并且最优选地，其是G477K。
27.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在选自下组的两个位置中进一步包括缺失，该组由以下各项组成：当使用SEQ ID NO:1编号时R181、G182、D183和G184，优选R181+D183、或R181+184、或R181+G182、或G182+D183、或G182+G184，或更优选D183+G184的缺失。
28.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体进一步包括选自下组的取代中的至少一个，该组由以下各项组成：当使用SEQ ID NO:1编号时，G109A、G149A、K179L、G186A、E190P、N195F、M202LIT、V206YF、N209D、Y243F、S244QAEDN。
29.根据以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ IDNO:1的以下位置的位置中包括改变：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+R439N
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+D476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K。
30.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中这些改变由在对应于SEQ ID NO:1的以下位置的位置中的改变组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+R439T
W140Y+W469T
W140Y+D476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+R439T
Y160S+W469T
Y160S+D476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+R439K
N260P+W469R
N260P+D476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+R439N
W284G+W469T
W284G+D476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+R439N
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+D476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+R439K
G304K+W469R
G304K+D476K
G304K+G477R
G305K+R439K
G305K+W469R
G305K+D476K
G305K+G477R
R439N+W469R
R439N+D476K
R439N+G477R
W469T+D476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+D476K
W140Y+E212D+G305K+D476K
W140Y+G305K+R439N+D476K
W140Y+G305K+W469T+D476K
W140Y+G304R+D476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+R439N+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+R439N+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K。
31.根据以上权利要求中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ IDNO:2的以下位置的位置中包括改变：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+W439R
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+G476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K。
32.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中这些改变由在对应于SEQ ID NO:2的以下位置的位置中的改变组成：
W140Y+Y160S
W140Y+E194D
W140Y+N260P
W140Y+G304K
W140Y+G304R
W140Y+W439T
W140Y+W469T
W140Y+G476K
W140Y+G477R
Y160S+E194D
Y160S+E212D
Y160S+N260P
Y160S+G304K
Y160S+G304R
Y160S+W439T
Y160S+W469T
Y160S+G476K
Y160S+G477R
N260P+G304K
N260P+G305R
N260P+W439K
N260P+W469R
N260P+G476K
N260P+G477R
W284G+G304K
W284G+G305R
W284G+W439R
W284G+W469T
W284G+G476K
W284G+G477R
L279T+W284G+H324N+G304K
L279T+W284G+H324N+G305R
L279T+W284G+H324N+W439R
L279T+W284G+H324N+W469T
L279T+W284G+H324N+G476K
L279T+W284G+H324N+G477R
G304K+W439K
G304K+W469R
G304K+G476K
G304K+G477R
G305K+W439K
G305K+W469R
G305K+G476K
G305K+G477R
W439R+W469R
W439R+G476K
W439R+G477R
W469T+G476K
W469T+G477R
W140Y+G304R+G475K
W140Y+N260P+G304R+G475K
W140Y+E212D+G304R+G475K
W140Y+G304R+W438R+G475K
W140Y+G304R+W468T+G475K
W140Y+G305K+G475K
W140Y+N260P+G305K+G476K
W140Y+E212D+G305K+G476K
W140Y+G305K+W439R+G476K
W140Y+G305K+W469T+G476K
W140Y+G304R+G476K
W140Y+N260P+G304R+G477K
W140Y+E212D+G304R+G477K
W140Y+G304R+W439R+G477K
W140Y+G304R+W469T+G477K
W140Y+G305K+G477K
W140Y+W284K+G305K+G477K
W140Y+N260P+G305K+G477K
W140Y+E212D+G305K+G477K
W140Y+G305K+W439R+G477K以及
W140Y+G305K+W469T+G477K。
33.如权利要求1-32中任一项所述的变体，其中改变的数目是2-20，例如2-10和2-5，比如2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
34.如权利要求1-32中任一项所述的变体，其中该变体由450至490个，例如460至485个、480至484个氨基酸，比如483个氨基酸组成。
35.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％序列一致性。
36.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％序列一致性。
37.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％序列一致性。
38.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体是选自下组的亲本α-淀粉酶的变体，该组由以下各项组成：
a.一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％的序列一致性；
b.一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％的序列一致性；
c.SEQ ID NO:1的成熟多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性；
d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性；
e.一种多肽，该多肽与针对SEQ ID NO:1的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性；
f.一种多肽，该多肽与针对SEQ ID NO:2的成熟多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性。
39.如权利要求38所述的变体，其中该亲本与SEQ ID NO:1或2具有至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
40.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1或2的成熟多肽或者由其组成。
41.如权利要求1-40中任一项所述的变体，该变体相对于该亲本具有一种改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性、热稳定性，以及优选地低温下的改进的洗涤性能。
42.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体是一种分离的变体。
43.一种洗涤剂组合物，包括如权利要求1-42中任一项所述的变体α-淀粉酶。
44.根据权利要求1-42中任一项所述的变体α-淀粉酶在一种清洁过程中的用途，该清洁过程是例如衣物洗涤或包括自动化餐具洗涤的硬表面清洁。
45.一种编码如权利要求1-42中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。
46.一种包括如权利要求45所述的多核苷酸的核酸构建体。
47.一种包括如权利要求45所述的多核苷酸的表达载体。
48.一种包括如权利要求45所述的多核苷酸的宿主细胞。
49.一种生产α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：
a.在适于表达该变体的条件下培养如权利要求48所述的宿主细胞；并且
b.回收该变体。
50.一种用于获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ IDNO:1的成熟多肽的以下位置的两个或更多个位置处向与SEQ ID NO:1或2具有至少85％序列一致性的亲本α-淀粉酶中引入改变：W140；W159；W167、Q169、W189、E194、N260、F262、F289、W284、G304、G305、W347、R439、W469、D476以及G477，其中每个改变独立地是取代、缺失或插入并且该变体具有α-淀粉酶活性；并且回收该变体。
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