CN105358685A - 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白酶变体以及用于获得蛋白酶变体的方法。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

参照序列表

本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及在一种或多种特性方面相对于亲本枯草杆菌酶(枯草杆菌蛋白酶)展示出改变的新颖蛋白酶变体，这些特性包括：洗涤性能、洗涤剂稳定性和/或储存稳定性。本发明的这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明变体的方法。此外，本发明涉及含有本发明变体的清洁剂和洗涤剂组合物。

相关技术说明

酶作为洗涤配制品的部分已经在洗涤剂工业使用了数十年。从商业视角蛋白酶在此类配制品中是最相关的酶，但是也经常使用其他酶，包括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶或这些酶的混合物。为了改进蛋白酶的成本和/或性能，目前正在进行具有改变的性质的蛋白酶的研究，例如在低温下增加的活性、增加的稳定性、在给定pH下增加的比活、改变的Ca²⁺依赖性、在其他洗涤剂成分(例如，漂白剂、表面活性剂等等)的存在下增加的稳定性等等。一种经常在洗涤剂中使用的蛋白酶家族是枯草杆菌酶。该家族之前已经进一步由斯艾森(Siezen)RJ和洛因伊森(Leunissen)JAM，1997，蛋白质科学(ProteinScience)，6,501-523分组为6个不同的亚组。这些亚组之一为包括枯草杆菌酶的枯草杆菌蛋白酶家族，例如BPN’、枯草杆菌蛋白酶309(洒维奈斯(Savinase)诺维信公司(NovozymesA/S))、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)(埃尔卡尔酶(Alcalase)诺维信公司(NovozymesA/S))、枯草杆菌蛋白酶S41(来自嗜冷的南极芽孢杆菌TA41的枯草杆菌酶，戴威尔(Davail)S等人，1994，生物化学杂志(TheJournalofBiologicalChemistry)，269(26)，99.17448-17453)和枯草杆菌蛋白酶S39(来自嗜冷的南极芽孢杆菌TA39的枯草杆菌酶，纳林科斯(Narinx)E等人，1997，蛋白质工程(ProteinEngineering)，10(11)，第1271-1279页)。TY145是来自芽胞杆菌属TY145，NCIMB40339的枯草杆菌酶，该枯草杆菌酶首次描述于WO92/17577(诺维信公司)中以及在后来的申请WO2004/067737(诺维信公司)中，披露了蛋白质工程的三维结构和用途以改变TY-145枯草杆菌酶的功能。

发明概述

本发明涉及蛋白酶变体，这些蛋白酶变体在与SEQIDNO:3的位置297对应的位置处包含改变，其中该变体具有蛋白酶活性并且其中这些变体具有与SEQIDNO:2的成熟多肽或与SEQIDNO:3至少75％一致的氨基酸序列。

本发明涉及一种用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括在包含SEQIDNO:3的位置297的钙结合部位处向亲本枯草杆菌酶中引入取代，其中该变体具有与SEQIDNO:3至少75％一致的氨基酸序列；并且回收该变体。本发明还涉及对这些变体进行编码的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及生产这些变体的方法。

序列表综述

SEQIDNO:1是从芽孢杆菌属分离的TY-145蛋白酶的DNA序列。

SEQIDNO:2是如从SEQIDNO:1推导的氨基酸序列。

SEQIDNO:3是成熟TY145的氨基酸序列。

定义

术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括任何属于EC3.4酶组的酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社(AcademicPress)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学期刊(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5、欧洲生物化学期刊1995，232，1-6、欧洲生物化学期刊1996，237，1-5、欧洲生物化学期刊1997，250，1-6、以及欧洲生物化学期刊1999，264，610-650的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是蛋白酶亚组，其特征为在活性位点上具有丝氨酸，与底物形成了共价加合物。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即一个组氨酸和一个天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

术语“蛋白酶活性”意指蛋白质分解活性(EC3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，具有在P1处Ala之后的切割。出于本发明的目的，根据以下“材料与方法(MaterialsandMethods)”所述的程序确定蛋白酶活性。本发明的这些枯草杆菌酶变体具有SEQIDNO:3的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。

术语“亲本”或蛋白酶亲本意指一种蛋白酶，对该蛋白酶进行改变以产生本发明的酶变体。因此，亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的一种蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有相同的氨基酸序列”的表达是相对于100％的序列一致性。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。在一个具体实施例中，该亲本是与具有SEQIDNO:3的多肽具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白酶。

术语“变体”意指具有蛋白酶活性的相比于其亲本在一个或多个(或一个或若干个)位置包含改变即取代、插入、和/或缺失的多肽，该亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有所述改变的蛋白酶。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于占据一个位置的氨基酸添加氨基酸(例如，1至10个氨基酸，优选地1-3个氨基酸)。

术语“分离的变体”意指通过人工修饰的变体。在一个方面，如通过SDS-PAGE确定的，该变体是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯的。

术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰的多核苷酸。在一个方面，如通过琼脂糖电泳法确定的，该分离的多核苷酸是至少1％纯的、例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。

术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

术语“基本上纯的变体”意指包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的这些变体优选以一种基本上纯的形式存在。例如，这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。

术语“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有机体(例如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的一种蛋白酶。野生型蛋白酶的实例是TY-145，即，SEQIDNO:2的成熟多肽，即氨基酸1至311或者具有SEQIDNO:3的成熟多肽。

术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列对应。

术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQIDNO:1的核苷酸1至81是信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(ProteinEngineering)10:1-6)，该成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸331至1263。

术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从原核或真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

术语“编码序列”意指直接指明其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。

术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外存在的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。

术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。

术语“控制序列”意指对于表达编码本发明变体的多核苷酸所必需的所有部件。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或者彼此可以是天然的或外源的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的额外核苷酸的线性或环形DNA分子。

术语“转录启动子”用于指为促进特定基因的转录的一个DNA区域的启动子。转录启动子典型地位于它们所调节的基因附近，在相同链上并且在上游(朝向有义链的5’区域)。

术语“转录终止子”用于指标记基因结束的基因序列区段或者供转录的基因组DNA上的操纵子。

术语“宿主细胞”意指对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“改进的特性”意指与一种变体有关的特征，该特征相比于亲本、或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶、或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶有所改进。此类改进的特性包括但不限于洗涤性能、蛋白酶活性、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改善的表面特性、底物特异性、产物特异性、增加的稳定性、在存储条件下的改进的稳定性、以及化学稳定性。

术语“改进的蛋白酶活性”在此被定义为通过增加的蛋白质转化而相对于(相比于)亲本枯草杆菌酶、或相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶、或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶的活性展示活性改变的蛋白酶变体的改变的蛋白酶活性(如上文所定义的)。

术语“稳定性(stability)”包括储存稳定性和在使用过程中的稳定性，例如在清洗过程中的稳定性，并且反应了作为时间函数的根据本发明的蛋白酶变体的稳定性，例如当蛋白酶变体置于溶液中时，尤其是在洗涤剂溶液中时，能够保留多少活性。这种稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂、表面活性剂的量等等。可使用如在实例2中所描述的测定来对蛋白酶稳定性进行测量。术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在此定义为相对于亲本蛋白酶的稳定性、相对于与具有所述变体具有一致的氨基酸序列但是不具有在一个或多个所述指定位置处的改变的蛋白酶或者相对于SEQIDNO:3，蛋白酶变体显示出了在溶液中增加的稳定性。术语“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改进的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”。

术语“改进的化学稳定性(improvedchemicalstability)”在此定义为变体酶在一种或多种化学物存在下表现为在孵育一段时间之后仍保留酶活性，这种或这些种化学物是天然存在的或是合成的，可降低亲本酶的酶活性。改进的化学稳定性还可使得这些变体在这类化学物存在下更能催化反应。在本发明的一个特别的方面，这种改进的化学稳定性是洗涤剂的，尤其是液体洗涤剂的一种改进的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”具体是当本发明的蛋白酶变体混入液体洗涤剂配制品并且然后在15和50℃之间的温度下储存时蛋白酶活性的改进的稳定性。在本发明中，液体洗涤剂作为洗衣液是特别有用的。

术语“改进的热活性”意指一种变体在特定温度下相对于亲本或相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。热活性值提供了变体在一定温度范围内增强水解反应的催化的效率的测量。一种具有较大热活性的变体将引起一种酶组合物在增强底物水解速率方面的增加，从而减少所需要的时间和/或降低活性所需要的酶浓度。可替代地，具有减小的热活性的一种变体将在比由亲本的温度依赖活性曲线定义的亲本的最佳温度更低的温度下提高酶促反应。

术语“改进的洗涤性能”在此被定义为根据本发明的蛋白酶变体例如通过增强的去污而相对于亲本蛋白酶的洗涤性能、相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或者相对于与所述变体具有一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶展示改进的洗涤性能。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。洗涤性能可以被量化，如在此的“洗涤性能”定义下所描述的。术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接触镜、硬表面(例如瓷砖、锌(zinc)、地板和桌面)、头发(香波)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)所选的任何材料/化合物，只要该组合物与根据本发明的蛋白酶变体以及该组合物中使用的其他一种或多种酶可相容即可。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁组合物材料。这些术语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。其意图是，这些术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物预去污剂，以及餐具洗涤剂)。

除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；洗碗机洗碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、皂棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴露、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。

就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。其意图是，除了根据本发明的变体以外，该术语涵盖了包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。

术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。

术语“纺织品”是指织造织物，连同适于转化为或用作纱线、织造、针织以及非织造织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如，制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。

术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于餐具洗涤洗涤剂组合物、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。

术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒状、棒状)组合物等。术语蛋白酶变体的“有效量”是指例如在定义的洗涤剂组合物中获得希望水平的酶活性的在上文描述的蛋白酶变体的量。

如在此使用的术语“水硬度”或“硬度(degreeofhardness)”或“dH”或“°dH”是指德国硬度(degreeofhardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。

在此使用术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。

术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的蛋白酶变体可相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“压缩”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。

如在此使用的术语“去污酶(stainremovingenzyme)”描述帮助从织物或硬表面除去污物或污垢的酶。去污酶对特定底物起作用，例如蛋白酶对蛋白质起作用、淀粉酶对淀粉起作用、脂肪酶和角质酶对脂质(脂肪和油)起作用、果胶酶对果胶起作用并且半纤维素酶对半纤维素起作用。污物通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身局部变色或这在物体上留下一个粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于洗涤液中的污物从而导致玷污的区域变色。当一种酶对存在于污物中的其特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其底物，从而帮助在洗涤过程中除去与底物相关的污垢和污物组分。例如，当一种蛋白酶对草渍起作用时，它降解草中的蛋白组分并且允许在洗涤过程中释放绿色/棕色。

在此背景下，术语“减少的量”意指在其他方面相同的条件下，该组分的量小于将用于参比过程中的量。在一个优选实施例中，该量被减少例如至少5％，如至少10％、至少15％、至少20％或如另外在此所述的。

术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度体系。

术语“中洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度体系。

术语“高洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度体系。

变体命名惯例

出于本发明的目的，在SEQIDNO:3中披露的成熟多肽用于确定另一种蛋白酶中相对应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO:3中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQIDNO:3中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。

另一种蛋白酶中对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcidsResearch)32：1792-1797)；MAFFT(6.857版或更新版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30：3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33：511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23：372-374；加藤等人，2009，分子生物学中的方法(MethodsinMolecularBiology)537：_39-64；加藤和朝都，2010，生物信息学26：_1899-1900)；以及采用ClustalW的EMBOSSEMMA(1.83版或更新版本；汤普森(Thompson)等人，1994，核酸研究22：4673-4680)。

当其他酶与SEQIDNO:3的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295：613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(NucleicAcidsRes.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。氨基酸位置表示为#₁、#₂、等等。

取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置#₁处的丝氨酸被色氨酸取代表示为“Ser#₁Trp”或“S#₁W”。多个突变通过加号(“+”)或逗号(，)分开，例如，“Ser#₁Trp+Ser#₂Pro”或“S#₁W，S#₂P”，分别代表位置#₁和#₂的丝氨酸(S)取代为色氨酸(W)，以及脯氨酸(P)。如果在给定位置可以取代多于一种氨基酸，那么这些氨基酸被列于括号内，例如[X]或{X}。因此，如果根据本发明的Trp和Lys可以替代占据位置#₁的氨基酸，那么这表示为X#₁{W，K}或X#₂[W，K]，其中该X表示这些不同的蛋白酶可以是亲本的，例如像具有SEQIDNO3的蛋白酶，或与其具有至少70％一致性的蛋白酶。因此，在一些情况下，这些变体表示为#₁{W，K}或X#₂P，表示待取代的氨基酸取决于亲本而变化。

缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、^*。因此，在位置#₁处的丝氨酸的缺失表示为“Ser#₁*”或“S#₁*”。多重缺失通过加号(“+”)或逗号分开，例如，“Ser#₁*+Ser#₂*”或“S#₁*，S#₂*”。

插入：另外的氨基酸残基的插入，像例如在G#₁之后插入赖氨酸可表示为：Gly#₁GlyLys或G#₁GK。可替代地，另外的氨基酸残基的插入，如在G#₁之后插入赖氨酸可表示为：*#₁aL。当插入一个以上氨基酸残基时，像例如在#₁之后插入Lys和Ala可表示为：Gly#₁GlyLysAla或G#₁GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在一个或多个插入的氨基酸残基前的氨基酸残基位置号处来对一个或多个插入的氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*#₁aK*#₁bA。

多种改变：包含多种改变的变体由加号(“+”)或由逗号(，)分开，例如“Ser#₁Trp+Ser#₂Pro”或者“S#₁W，S#₂P”代表在位置#₁和#₂处的丝氨酸分别如以上所描述的被色氨酸和脯氨酸取代。

不同的改变：可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Ser#₁Trp，Lys”或S#₁W，K代表在位置#₁上的丝氨酸被色氨酸或赖氨酸取代。因此，“Ser#₁Trp，Lys+Ser#₂Asp”表示以下变体“Ser#₁Trp+Ser#₂Pro”、“Ser#₁Lys+Ser#₂Pro”或“S#₁W，K+S#₂D”。

发明详述

之前没有预料到的是，发明人发现在SEQIDNO:3的位置297(其在TY-145的钙结合环之一中)处含有突变的蛋白酶变体相比于与所述变体具有一致的氨基酸序列但是在位置297处不具有该取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶在洗涤剂中具有改进的稳定性。对应于位置297的位置位于如图1中所示的TY-145的钙结合部位之一中。因此，本发明提供了在对应于位置297的位置处包含取代的蛋白酶变体，其中该变体具有蛋白酶活性。产生在位置297(SEQIDNO:3进行编号)包含取代新蛋白酶变体并且如“材料与方法”中所描述地测试洗涤剂中的稳定性，并且诸发明者证实在对应于成熟多肽SEQIDNO:3的位置297的位置处的取代相比于具有所述变体的一致的氨基酸序列但不具有在位置297处的取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶明显改进了洗涤剂稳定性。出人意料地，根据本发明的变体除了改进的稳定性之外还能够改善洗涤性能。因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的变体相比于具有所述变体的一致的氨基酸序列但不具有在位置297处的取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶已经改进了洗涤剂稳定性和/或改进了洗涤性能。在一个优选的实施例中，该蛋白酶变体包含SEQIDNO:3的位置297处的氨基酸的取代，其中该变体与具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有至少70％的一致性(芽孢杆菌属TY145)。因此，本发明的一个方面涉及一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与SEQIDNO:3的位置297对应的位置处包含取代，其中该变体具有与SEQIDNO:3至少70％一致的氨基酸序列；并且回收该变体。因此，本发明涉及该变体，该变体在与SEQIDNO:3的位置297对应的位置处包含氨基酸的取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该变体是一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少70％的一致性。在一个实施例中，根据本发明的变体是由多核苷酸编码多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。

一个具体的实施例，涉及蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与SEQIDNO:3的位置297对应的位置处包含取代，其中该变体是与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％，例如像至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的亲本蛋白酶变体。在一个具体的实施例中，该蛋白酶变体是一种TY-145(SEQIDNO3)变体，其包含在SEQIDNO:3的钙结合环中的位置297处的氨基酸的取代。一个优选的实施例涉及蛋白酶变体，该蛋白酶变体包含在SEQIDNO:3的位置297处的氨基酸的取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。一个具体优选的实施例涉及包含SEQIDNO:3的以下取代297{Pro，Glu}的蛋白酶变体。一个具体的实施例涉及蛋白酶变体，该蛋白酶变体包含SEQIDNO:3的以下取代297{Pro，Glu}之一，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的一致性，例如与SEQIDNO:3具有至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。另一个具体的实施例涉及蛋白酶变体，该蛋白酶变体包含SEQIDNO:3的以下取代T297{P，E}之一，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的一致性，例如与SEQIDNO:3具有至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。

在一方面，该蛋白酶变体包含位置297处的取代，在一个优选的方面，该变体在位置297处包含被P或E取代，在另一个优选的方面，该变体在位置297处包含P，在又一个优选的方面，该变体包含取代T297P，其中该亲本蛋白酶是具有SEQIDNO:3的成熟多肽。在另一个优选的方面，该变体在位置297处包含E，在又一个优选的方面，该变体包含取代T297E，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的成熟多肽。

在另一方面，该变体在位置297处包含被P或E取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％。在另一个优选的方面，该变体在位置297处包含P，在又一个优选的方面，该变体包含取代T297P，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的序列一致性，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％。在另一个优选的方面，该变体在位置297处包含E，在又一个优选的方面，该变体包含取代T297E，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％。在一个甚至进一步方面，该变体在位置297处包含被P或E取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％，并且当如在“材料与方法”下所描述的实例2中测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体的一致的氨基酸序列但是在位置297处不具有所述取代的蛋白酶亲本，具有增加的稳定性。在另一个优选的方面，该变体在位置297处包含P，在又一个优选的方面中，该变体包含取代T297P，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％，并且当如在“材料与方法”下所描述的实例2中测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体的一致的氨基酸序列但是在位置297处不具有所述取代的蛋白酶亲本，具有增加的稳定性。在另一个优选的方面，该变体在位置297处包含E，在又一个优选的方面中，该变体包含取代T297E，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％的序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％，并且当如在“材料与方法”下所描述的实例2中测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体的一致的氨基酸序列但是在位置297处不具有所述取代的蛋白酶亲本，具有增加的稳定性。

这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包含一个或多个另外的改变。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。常见的取代包括：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Asn/Gln、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Glu/Gln、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

例如，该变体可以在位置297处包含取代并且在选自下组的任一位置处进一步包含一个或多个改变，该组由以下各项组成：位置39、40、70、74、81、102、121、124、132、137、144、155、159、162、171、173、174、175、176、177、179、180、241、247、256、274和286。在一个实施例中，本发明的变体包含以下改变中的一个或多个：Y39D；T40{D，P}；Q70N；T74M；L81{F，H，V}；A102T；I121{S，C，V，T}；V124A；G132{I，E}；I137{E，C，S，A，M，T，Q，G}；S144{Q，R}；D155N；G159S；V162{W，R}；S171{W，K，E，N}；S173{P，Y}；G174{S，T，K}；S175{A，V，P}；N176G；T177S；G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，Y，A}；F180Y；T241P；I247M；H256F；S274I或V286Q。

在本发明的一个实施例中，根据本发明的变体包含任何以下变体或由其组成：

a)I137ES173YG174SS175AF180YT297P

b)I137ES173PG174KS175PN176GT177SF180YT297P

c)S173PG174KS175PN176GT177SF180YT297P

d)I137ES173PG174TS175VT177SF180YT297P

e)I137ES173PG174TV175PT177SF180YT297P

f)I137ES171NS173PG174KS175PN176GT177SF180YT297P

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244：1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。对于TY-145(SEQIDNO:3)，包含氨基酸D35、H72以及S251的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必须的。

这些变体可以由200至900个氨基酸，例如210至800、220至700、230至600、240至500、250至400、255至300、260至290、265至285、270至280、或者270、271、272、273、274、275、276、277、278、279或280个氨基酸组成。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有提高的催化活性。

在一个实施例中，该变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体的一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有改进的稳定性，其中如在此处的“材料与方法”所描述的实例2中的来测量稳定性。

在一个实施例中，根据本发明的变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体的一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有改进的稳定性。

亲本蛋白酶

蛋白酶变体

术语“变体”和术语“蛋白酶变体”是如以上所定义的。

同源枯草杆菌酶序列

两个氨基酸序列之间的同源性是在出于本发明的目的由参数“一致性”描述的背景下，两个氨基酸序列之间的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定的。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两个序列之间的“一致性百分比”。

基于本描述，对于本领域的技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源枯草杆菌酶是相当简单的。

基本上同源的亲本枯草杆菌酶变体可以具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，术语“一个或多个”与术语“若干个”是互换使用的。这些改变优选地具有微小的性质，即，不会显著地影响蛋白或多肽的三维折叠或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；小的缺失，典型的是1至约30个氨基酸的缺失；以及小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基、包括最多约20-25个残基的小接头肽、或有利于纯化的小延伸(亲和标记物)，如聚组氨酸序段(tract)或蛋白A(尼尔逊(Nilsson)等人，1985，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)4：1075；尼尔逊等人，1991，酶学方法(MethodsEnzymol.)198：3。通常还参见福特(Ford)等人，1991，蛋白表达纯化(ProteinExpressionandPurification)2：95-107。

尽管如上所述的这些改变优选地具有微小的性质，这类改变还可以是实质性的，如均作为氨基末端或羧基末端延伸的最多达300个氨基酸或更多个氨基酸的较大的多肽的融合。

亲本枯草杆菌酶可以包含SEQIDNO:3的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有蛋白酶活性的片段，或者由其组成。在一个方面，该亲本枯草杆菌酶包含SEQIDNO:3的氨基酸序列或者由其组成。

该亲本枯草杆菌酶可以是(a)一种与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；(b)一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中或高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交；或c)由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽。

在一方面，该亲本与具有SEQIDNO:3的、具有蛋白酶活性的多肽具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，或100％的序列一致性。

在一个方面，亲本的氨基酸序列与具有SEQIDNO:2的成熟多肽的不同不超过10个氨基酸，例如1、3、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在另一方面，该亲本包含SEQIDNO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQIDNO:2的氨基酸1至311或由其组成。

在另一个方面，该亲本是由在非常低严格条件下、低严格条件下、中严格条件下、或高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,ALaboratoryManual)，第2版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约)。

可以使用SEQIDNO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQIDNO:3的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸与和(i)SEQIDNO:1；(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列；(iii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列；(iv)其全长互补体；或者(v)其子序列相对应的标记的核酸探针；在非常低至非常高严格条件下杂交。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，核酸探针是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核苷酸探针是SEQIDNO:1的80至1140个核苷酸长片段，例如长度为90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100核苷酸。在另一方面，该核酸探针是编码SEQIDNO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一个方面，该核酸探针是SEQIDNO:1或编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列。

在另一方面，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或者编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，或100％的序列一致性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。

该亲本可以从任何属的有机体中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是细菌蛋白酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。

在一个方面中，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)蛋白酶。

在一方面，该亲本是芽胞杆菌属蛋白酶，例如，具有SEQIDNO：3的蛋白酶或SEQIDNO2的成熟多肽。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures,CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有蛋白酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)在SEQIDNO:3的位置297处向亲本枯草杆菌酶中引入取代，其中该变体具有蛋白酶活性；以及(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(NucleicAcidsRes.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(NatureBiotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(FungalGenet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625所披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；US5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

因此，本发明还涉及用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括在SEQIDNO:3的位置297处向亲本蛋白酶中引入取代；并且回收该变体。

另一个实施例涉及用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括在包含SEQIDNO:3的位置297的钙结合环中的一个或多个氨基酸的取代，尤其是如上所描述的方法，其中该亲本蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性的多肽；

一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中或高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交；

一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少70％一致性；以及

SEQIDNO:2的成熟多肽的片段，其具有蛋白酶活性。

因此，一个具体的方面涉及用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括在包含SEQIDNO:3的位置297的钙结合环中向亲本蛋白酶中引入取代，其中该一个或多个取代是在SEQIDNO:3中进行的，并且其中这些取代选自下组，该组由取代T297{P，E}组成。

本发明的一个方面涉及生产根据本发明的变体的方法，其中该方法包括在包含SEQIDNO:3的位置297的钙结合环中的氨基酸的取代，其中

该变体与SEQIDNO:3具有至少70％且小于100％的序列一致性，并且

该变体具有蛋白酶活性。

在一个实施例中，根据所述方法生产的变体包括在对应于SEQIDNO:3的位置297的位置处被选自{P，E}的氨基酸取代。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(originofreplication)”或“质粒复制子(plasmidreplicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。

组合物

在某一方面中，根据本发明的这些变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体的一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶在洗涤剂中具有改进的稳定性，其中如在此处的“材料与方法”所描述的实例2中的来测量稳定性。

因此，在一个优选的实施例中，该组合物是一种洗涤剂组合物，并且本发明的一个方面涉及包括根据本发明的变体的洗涤剂组合物在如衣物或硬表面清洁等清洁过程的用途。

另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

本发明的洗涤剂组合物

在本发明的一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下各项的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升洗涤液体0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质，优选是0.005-50mg的蛋白质，更优选是0.01-25mg的蛋白质，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白质，最优选是0.05-5mg的蛋白质，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白质。

可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些稳定剂例如为多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如(例如)WO92/19709和WO92/19708中所述进行配制，或者可以使用如WO2005/105826和WO2009/118375所述的肽醛或酮使根据本发明的变体稳定化。

本发明的变体还可以结合到WO97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，该专利通过引用结合在此。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、二甲基双十八烷基氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、以及其组合、烷基季铵化合物、烷氧基化的季铵(AQA)。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、以及其组合。

助水溶剂

助水溶剂是一种化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见(CurrentOpinioninColloid&InterfaceScience)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合一种助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO09/102854、US5977053中。

漂白系统

该洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如约1％至约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidicacid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。漂白活化剂在此指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、双过氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)，和/或WO98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R¹独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259、WO2007/087242中。合适的合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包括所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的着色剂还披露于例如WO2007/087257、WO2007/087243中。

(另外的)酶

在一个实施例中，将根据本发明的变体与一种或多种酶，例如至少两种酶，更优选是至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。

洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包括一种或多种额外的酶，例如碳水化合物活性酶，如糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程处理的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307以及WO99/001544中的那些纤维素酶变体。

其他纤维素酶是具有一种序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶,该序列与WO2002/099091的SEQIDNO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性,或一种家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有一种序列，该序列与WO2001/062903的SEQIDNO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(NovozymesA/S))、CarezymePremium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和PuradaxHA^TM(杰能科国际公司(GenencorInternationalInc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(KaoCorporation))。

甘露聚糖酶：

适合的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或特异腐质霉。适合的甘露聚糖酶描述于WO1999/064619中。一种可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。

纤维素酶：

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的完整纤维素酶或单组分葡聚糖内切酶。包括化学或基因修饰的突变体。该纤维素酶可以，例如，是通常就称为内切葡聚糖酶的单-组分的内切-1,4-β-葡聚糖酶的单-组分或混合物。适合的纤维素酶包括一种真菌纤维素酶，该真菌纤维素酶来自特异腐质霉(US4,435,307)或来自木霉属，例如里氏木霉或绿色木霉。纤维素酶的实例在EP0495257进行了描述。其他适合的纤维素酶来自梭孢壳菌属，例如如在WO96/29397中描述的土生梭孢壳霉或如在WO91/17244中描述的尖镰孢，或者来自如在WO02/099091和JP2000210081中所描述的芽孢杆菌属。其他实例是例如描述于WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307中的那些纤维素酶变体，可商购的纤维素酶包括和 (诺维信公司(NovozymesA/S))、PuradaxHA、和PuradaxEG(可从杰能科公司(Genencor)获得)。

蛋白酶：

适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程处理的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US7262042和WO09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO92/175177、WO01/016285、WO02/026024以及WO02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO89/06270、WO94/25583和WO05/040372中)，以及衍生自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO05/052161和WO05/052146中)。

进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO92/21760、WO95/23221、EP1921147以及EP1921148中描述的)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO07/044993(杰能科国际公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO92/19729、WO96/034946、WO98/20115、WO98/20116、WO99/011768、WO01/44452、WO03/006602、WO04/03186、WO04/041979、WO07/006305、WO11/036263、WO11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,RS103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、Ultra、Ultra、 Ultra、 Ultra、和(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：PurafectPreferenz^Tm、PurafectEffectenz^Tm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-BrocasesN.V.))、BLAP(序列示于US5352604的图29中)及其变体(汉高股份(HenkelAG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶：

适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO95/06720&WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO12/137147)。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP407225、WO92/05249、WO94/01541、WO94/25578、WO95/14783、WO95/30744、WO95/35381、WO95/22615、WO96/00292、WO97/04079、WO97/07202、WO00/34450、WO00/60063、WO01/92502、WO07/87508以及WO09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE7家族的过水解酶(WO09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(HuntsmanTextileEffectsPteLtd)的商业产品GentlePowerBleach中所用的S54V变体)(WO10/100028)。

淀粉酶：

可以与本发明的蛋白酶变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程处理的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO95/10603中的SEQIDNO:2的淀粉酶或其与SEQIDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO94/02597、WO94/18314、WO97/43424以及WO99/019467的SEQIDNO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO02/010355中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO2006/066594的SEQIDNO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQIDNO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

适合的另外的淀粉酶是具有WO99/019467中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO96/023873的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的那些或其与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO96/023873的SEQID2用于编号，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO08/153815中的SEQIDNO:2、WO01/66712中的SEQIDNO:10的淀粉酶或其与WO08/153815的SEQIDNO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQIDNO:10具有90％序列一致性的变体。WO01/66712中的SEQIDNO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO09/061380中的SEQIDNO:2的淀粉酶或其与SEQIDNO:2具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQIDNO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQIDNO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO13184577中的SEQIDNO:1的淀粉酶或其与SEQIDNO:1具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQIDNO:1的更优选变体是以下位置：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K和G477K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQIDNO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K，

其中这些变体任选地进一步在位置241处包括取代和/或在位置178和/或位置179处包括缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO10104675中的SEQIDNO:1的淀粉酶或其与SEQIDNO:1具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQIDNO:1的更优选变体是以下位置：N21D、D97N、V128IK177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQIDNO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N21D+D97N+V128I，

其中这些变体任选地进一步在位置200处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO01/66712中的SEQIDNO:12的α-淀粉酶或与SEQIDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO01/66712中的SEQIDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

其他实例是例如描述于WO2011/098531、WO2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、特妙淀粉酶^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、LiquozymeX及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、PreferenzS1000、PreferenzS100及PreferenzS110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternationalInc./DuPont))。

过氧化物酶/氧化酶

根据本发明的过氧化物酶是由如由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)陈述的酶分类EC1.11.1.7包括的过氧化物酶，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。

适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程处理的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP179,486)，及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602以及WO98/15257中描述的那些。

根据本发明的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶加以分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。

在一个实施例中，本发明的卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的一个优选方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。

已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceoushyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，比如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。

还已经从细菌，如假单胞菌属(例如，吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。

在一个优选实施例中，该卤代过氧化物酶可源自弯孢属，特别是疣枝弯孢(Curvulariaverruculosa)和不等弯孢，例如如描述于WO95/27046中的不等弯孢CBS102.42或描述于WO97/04102中的疣枝弯孢CBS147.63或疣枝弯孢CBS444.70；或可源自如描述于WO01/79459中的Drechslerahartlebii，如描述于WO01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiellasalina)、如描述于WO01/79461中的Phaeotrichoconiscrotalarie或如描述于WO01/79460中的Geniculosporiumsp.。

根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC1.3.3.5)。

优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。

来自真菌的适合实例包括可源自以下项的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP2238885)。

来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。

优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO97/08325中；或源自嗜热毁丝霉，如披露于WO95/33836中。

其他酶：根据本发明的蛋白酶变体还可以与另外的酶结合，如果胶裂解酶，例如Pectawash^TM，叶绿素酶等等。本发明的蛋白酶变体可以与任何另外的酶混合。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆体等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆体。

非尘颗粒可以例如如在US4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇含有12至20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegrationagent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。

分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker)。

染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4’-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐、4,4’-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙胺基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐以及2-(芪基(stilbyl)-4”-萘-1.,2’:4,5)-1,2,3-三唑-2”-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-GeigyAG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4’-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2’-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的ParawhiteKX，由派拉蒙矿物与化学(ParamountMineralsandChemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker，Inc.)。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO2006/108856以及WO2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP1867808或WO2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他合适的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂、用于液体清洁剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制品

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两层或更多层的片剂、常规的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或常规的、压缩的或浓缩的液体。

洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器配量单位的形式。

袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(ChrisCraftIn.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US2009/0011970A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

这些形式的定义/特征：

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0％-30％的有机溶剂。

液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

颗粒洗涤剂配制品

如描述于WO09/092699、EP1705241、EP1382668、WO07/001262、US6472364、WO04/074419或WO09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO09/124162、WO09/124163、WO09/117340、WO09/117341、WO09/117342、WO09/072069、WO09/063355、WO09/132870、WO09/121757、WO09/112296、WO09/112298、WO09/103822、WO09/087033、WO09/050026、WO09/047125、WO09/047126、WO09/047127、WO09/047128、WO09/021784、WO09/010375、WO09/000605、WO09/122125、WO09/095645、WO09/040544、WO09/040545、WO09/024780、WO09/004295、WO09/004294、WO09/121725、WO09/115391、WO09/115392、WO09/074398、WO09/074403、WO09/068501、WO09/065770、WO09/021813、WO09/030632以及WO09/015951。

WO2011025615、WO2011016958、WO2011005803、WO2011005623、WO2011005730、WO2011005844、WO2011005904、WO2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO2011005905、WO2011005910、WO2011005813、WO2010135238、WO2010120863、WO2010108002、WO2010111365、WO2010108000、WO2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO2010033746、WO2010033747、WO2010033897、WO2010033979、WO2010030540、WO2010030541、WO2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO2010024470、WO2010025161、WO2010014395、WO2010044905、

WO2010145887、WO2010142503、WO2010122051、WO2010102861、WO2010099997、WO2010084039、WO2010076292、WO2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO2010057784、WO2010054986、WO2010018043、WO2010003783、WO2010003792、

WO2011023716、WO2010142539、WO2010118959、WO2010115813、WO2010105942、WO2010105961、WO2010105962、WO2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO2010072456、WO2010069905、WO2010076165、WO2010072603、WO2010066486、WO2010066631、WO2010066632、WO2010063689、WO2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO2010000636。

方法和用途

本发明还针对用于在纺织品和织物的洗涤例如家用衣物洗涤以及工业衣物洗涤中使用其组合物的方法。

本发明还针对用于在硬表面清洁例如自动餐具洗涤(ADW)、汽车洗涤以及工业表面清洁中使用其组合物的方法。

可以将本发明的蛋白酶变体添加到洗涤剂组合物中并且因此使其成为该洗涤剂组合物的组分。因此，本发明的一个方面涉及包含一种蛋白酶变体的洗涤剂组合物在清洁过程例如衣物洗涤和/或硬表面清洁(例如餐具洗涤)中的用途，其中所述变体包括在包含SEQIDNO:3的位置297的钙结合环中的氨基酸的取代，其中该变体与SEQIDNO3具有至少70％的一致性。另一方面涉及包含变体的洗涤剂组合物的用途，其中所述变体包含以下取代T297{P，E}之一，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且该变体具有蛋白酶活性。

本发明的一个实施例涉及蛋白酶变体在如衣物和/或硬表面清洁等清洁过程中的用途，该蛋白酶变体包括SEQIDNO:3的以下取代T297{P，W}之一，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性，并且其中当如在“材料与方法”下所述的实例2中进行测试时，该变体相对于亲本或相对于具有与所述变体的一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶亲本具有增加的洗涤剂稳定性。

本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。

在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。

清洁过程或者纺织品保养过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗涤，但是它也可以是工业洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用包含一种洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶变体的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水洗溶液。

经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或者本发明的纺织品保养过程可以是常规的可洗涤衣物洗涤，例如家用洗涤。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。

最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时相似或改进的洗涤剂性能。

本发明进一步涉及本发明的蛋白酶变体在除去蛋白质污物过程中的用途。蛋白质污物可能是如食品污物等污物，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、奶、墨水、草、或其组合。

典型的洗涤剂组合物包含除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污物被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且很多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。

在一个具体实施例中，本发明涉及包含本发明的蛋白酶变体的一种组合物在衣物洗涤或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包含以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分。

在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶变体情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量有所减小。优选地，是一种表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分以以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶变体的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个方面中，将本发明的蛋白酶变体用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。

洗涤方法

本发明的洗涤剂组合物理想地适用于在洗衣应用中使用。因此，本发明包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约11.5的pH。可在溶液中以以下浓度使用组合物：从约100ppm、优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。

在多个具体实施例中，在以下pH下执行该洗涤方法：从约5.0至约11.5、或者从约6至约10.5、约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9、或者约7至约8、约8至约11、约8至约10、约8至约9、约9至约11、约9至约10、约10至约11，优选约5.5至约11.5。

在多个具体实施例中，在以下硬度下执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约16°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。

本发明涉及一种使用包含本发明的蛋白酶变体的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。

一个优选的实施例涉及一种清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包含本发明的蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合物是一种洗涤剂组合物并且该过程是一个衣物洗涤或餐具洗涤过程。

另一个实施例涉及一种用于从织物上除去污物的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包含本发明的蛋白酶的组合物接触。

在一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包含至少一种如以上“其他酶”部分列出的额外的酶，如选自下组的酶，该组由水解酶(如蛋白酶)、脂肪酶和角质酶、糖酶(如淀粉酶)、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、以及果胶酶或其组合组成。在另一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物包含减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、助溶剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分或聚合物。

还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。可以任何织物处理方法使用蛋白酶，这些方法在本领域是已熟知的(参见，例如，US6,077,316)。例如，在一个方面，通过一种方法改善织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一个方面中，在压力下用该溶液处理该织物。

在一个实施例中，在纺织品编织过程中或之后或者在脱浆阶段或一个或多个另外的织物加工步骤过程中应用该蛋白酶变体。在纺织品编织过程中，螺纹暴露于大量的机械应变中。在机械织布机上进行编织之前，为了提高拉伸强度并防止破裂，经常在经纱上涂上淀粉浆或淀粉衍生物。可以采用蛋白酶变体来除去这些蛋白质浆或蛋白质衍生物。在编织完纺织品之后，织物可以进行到脱浆阶段。这之后可以是一个或多个另外的织物加工步骤。脱浆是从纺织品上除去浆料的作用。编织后，为了确保均匀和耐洗效果，应在对织物进行进一步加工之前除去所涂的浆料。还提供了一种脱浆方法，该方法包括通过酶的作用酶促水解浆料。

在此应用中针对蛋白酶变体披露的所有问题、主题以及实施例还可应用于在此所述的方法和用途。因此，明确参考对于也在此描述的这些方法和用途的所述披露。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

材料与方法

用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)

为了评定洗涤性能，在衣物洗涤中可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA平板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Specialmethodembodiments)”段落。

将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(KodakiQsmart(柯达(Kodak))，Midtager29，DK-2605(丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

$Int\sqrt{r^2+g^2+b^2}.$

表1：标准洗涤剂和测试材料的组成

模型洗涤剂和测试材料如下：

表1b

用于稳定性测试的液体模型洗涤剂

常规分子生物学方法：

除非另外提及，使用标准分子生物学方法(萨姆布鲁克等人(1989)；奥苏贝尔(Ausubel)等人(1995)；哈伍德(Harwood)和卡廷(Cutting)(1990))进行DNA操纵和转化。

蛋白酶活性测定：

1)Suc-AAPF-pNA活性测定：

可以通过使用Suc-AAPF-PNA底物的方法确定蛋白水解活性。Suc-AAPF-PNA是N-丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且它是可以被内切蛋白酶切割的封闭的肽。切割之后，释放游离的PNA分子并且它具有黄色，并且因此可以在波长405nm下通过可见光分光光度计来测量。该Suc-AAPF-PNA底物由巴亨公司(Bachem)(目录号L1400，溶解于DMSO中)来生产。

将待分析的蛋白酶样品稀释于残余活性缓冲液中(100mMTrispH8.6)。通过将60μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加140μl底物工作溶液(0.72mg/ml在100mMTrispH8.6中)来进行测定。将溶液在室温下混合并且在OD405nm在5分钟范围内每20秒测量吸收。

在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的蛋白酶的比活性(活性/mg酶)成比例。蛋白酶样品应稀释至其中斜率是线性的水平。

实例1：蛋白酶变体的制备和测试

变体的制备和表达

构建TY145蛋白酶(SEQIDNO:3)的定点诱变变体，这些变体包含根据本发明的N-末端侧上的170至180区中的特定的插入/缺失/取代。这些变体是通过传统的克隆DNA片段制得(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第2版，冷泉港，1989)，使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸，这些寡核苷酸在所得序列中引入了所希望的突变。对应于希望的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列合成诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离。以此方式，构建并产生下表2a中所列的变体。

变体发酵

可以通过本领域熟知的或如以下的方法进行发酵。将具有相关表达质粒的枯草杆菌菌株划线接种在具有相关抗生素(6μg/ml氯霉素)的LB-琼脂板上，并在37℃下生长过夜。

将菌落转移到在500ml摇瓶中补充有相关抗生素的100mlPS-1培养基上，该500ml摇瓶含有富营养培养基(例如，PS-1:100g/L蔗糖(丹尼斯克(Danisco)目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/LNa₂HPO₄.12H₂O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L普朗尼克(Pluronic)PE6100(BASF102-3098))。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。通过在4500rpm下离心20-25分钟从发酵液中除去细胞和其他未溶解的材料。然后，过滤出上清液以获得澄清溶液。

实例2：

在该实例中，使用以上描述的PNA-Suc-AAPF测定来确定在液体模型洗涤剂(表1b)的存在下孵育之后剩余的蛋白酶活性。总的来说，在指定的温度、和孵育时间下在液体模型洗涤剂(表1b(90％的终浓度))中孵育之后确定剩余的蛋白酶活性，并且然后将该活性与在4℃下非应激孵育的活性进行比较。为了确定在洗涤剂中的蛋白酶稳定性，通过在酶稀释缓冲液(100mMTrispH8.6、0.0225％(w/V)Brij-35、2mMCaCl₂)中稀释而将待测试酶调节至0.15mg/ml的酶蛋白的浓度。将30μl的蛋白酶溶液和270μl液体模型洗涤剂(表1b)转移至96孔微量滴定板(Nunc96UPP)中，一式四份。将一个小磁体(5×2mm)放置在每个孔中，并且将该共混物在磁力搅拌器上在室温下搅拌30分钟。在混合后，将20μl转移至新96孔微量滴定板上，并且在4℃下孵育24小时(非应激样品)。用铝箔仔细热封微量滴定板并且下指定的温度下孵育24小时(应激样品)。在孵育之后，如在PNA-Suc-AAPF测定中描述地分析板上的样品的蛋白酶活性，用于确定剩余的蛋白酶活性。应当注意，为了降低测定中来自除了该酶的其他洗涤剂成分的干扰，将非应激样品和应激样品都稀释到相同的蛋白浓度。

在孵育之后，回收20μl的应激样品并且添加150μl剩余活性缓冲液(100mMTrispH8.6)，并且使用磁力搅拌器混合5分钟。转移60μl的稀释的样品至新的96孔微量滴定板上。在使用之前，在剩余活性缓冲液中制备PNA-Suc-AAPF底物工作溶液(0.72mg/ml在100mMTrispH8.6中)。添加140μl底物工作溶液至稀释的样品中，混合并且立即在室温下每20秒测量在405nm下的吸光度，持续5-10分钟。使用仅来自动力学曲线的线性范围的Vmax。通过添加150μl剩余活性缓冲液(100mMTrispH8.6)至具有20μl非应激样品的微量滴定板(在4℃下孵育)上重复非应激样品的剩余活性测量，并且使用磁力搅拌器混合5分钟。转移60μl的稀释的样品至新的96孔微量滴定板上。添加140μl底物工作溶液至稀释的样品中，混合并且立即在室温下每20秒测量在405nm下的吸光度，持续5-10分钟。使用仅来自动力学曲线的线性范围的Vmax。

在所有的试验中确保在所有测试微量滴定板上至少包括参照蛋白酶一次。

剩余活性(％RA)计算为％RA＝100*Vmax(应激样品)/Vmax(非应激样品)。

计算半衰期(T1/2(h))：T1/2(小时)＝T(小时)*LN(0.5)/LN(％RA/100)，其中T为孵育时间(小时)并且％RA是剩余活性。

表3：在不同温度下测量的变体的稳定性

Claims (20)

1.一种蛋白酶变体，包含SEQIDNO:3的位置297中的氨基酸的取代，其中

该变体与SEQIDNO:3具有至少75％且小于100％的序列一致性，并且

该变体具有蛋白酶活性。

2.根据权利要求1所述的变体，其中与SEQIDNO:3的位置297对应的位置处的氨基酸选自下组，该组由以下各项组成：取代Pro、Glu。

3.如权利要求1-2中任一项所述变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：Y39D；T40{D，P}；Q70N；T74M；L81{F，H，V}；A102T；I121{S，C，V，T}；V124A；G132{I，E}；I137{E，C，S，A，M，T，Q，G}；S144{Q，R}；D155N；G159S；V162{W，R}；S171{W，K，E，N}；S173{P，Y}；G174{S，T，K}；S175{A，V，P}；N176G；T177S；G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，Y，A}；F180Y；T241P；I247M；H256F；S274I或V286Q。

4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中该变体选自以下变体：

I137ES173YG174SS175AF180YT297P

I137ES173PG174KS175PN176GT177SF180YT297P

S173PG174KS175PN176GT177SF180YT297P

I137ES173PG174TS175VT177SF180YT297P

I137ES173PG174TV175PT177SF180YT297P

I137ES171NS173PG174KS175PN176GT177SF180YT297P。

5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，其中该变体相比于亲本或相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有改进的洗涤剂稳定性。

6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，其中该变体选自下组，该组由以下各项组成：

与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的多肽；

由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中、或高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交；

由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少75％序列一致性；以及

SEQIDNO:2的成熟多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

7.如权利要求2-6中任一项所述的变体，其中该变体与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。

8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，其中相比于SEQIDNO:3，改变的总数为1-20个，例如1-10个和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。

9.一种用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括在SEQIDNO:3的位置297处向亲本枯草杆菌酶中引入取代，其中该变体具有与SEQIDNO:3至少75％一致的氨基酸序列；并且回收该变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中该蛋白酶变体通过如下方法获得，该方法包括在与SEQIDNO:3的成熟多肽的位置297对应的位置处的选自下组的一个氨基酸的取代，该组由以下各项组成：Pro或Glu。

11.根据权利要求10所述的方法，其中该蛋白酶变体与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少70％，例如像至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶选自下组，该组由以下各项组成：

与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的多肽；

由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中或高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交；

由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少75％序列一致性；以及

SEQIDNO:2的成熟多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶与SEQIDNO:3具有至少70％，例如像至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。

14.一种清洁组合物，包含根据权利要求1-8中任一项中所述的变体。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中该组合物是洗涤剂组合物。

16.根据权利要求14或15中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自以下中的一种或多种另外的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、和/或过氧化物酶。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的组合物，处于以下形式：棒，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，常规的或压缩的粉末，颗粒，膏，凝胶，或者常规的、压缩的或浓缩的液体。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的组合物在清洁过程，例如衣物洗涤、硬表面清洁、餐具洗涤或自动化餐具洗涤中的用途。

19.根据权利要求1-8中任一项所述的变体在清洁过程，例如衣物洗涤或餐具洗涤中的用途。

20.一种用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面接触根据权利要求14-17中任一项所述的组合物。