CN103958657A - 枯草杆菌酶变体以及编码该枯草杆菌酶变体的多核苷酸 - Google Patents

枯草杆菌酶变体以及编码该枯草杆菌酶变体的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及枯草杆菌酶变体以及获得枯草杆菌酶变体的方法。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

枯草杆菌酶变体以及编码该枯草杆菌酶变体的多核苷酸
序列表的参考
本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
技术领域
本发明涉及在一种或多种特性上相对于亲本枯草杆菌酶具有改变的新枯草杆菌酶变体，这些特性包括：螯合剂稳定性、洗涤性能、热稳定性、储存稳定性或催化活性。本发明的变体适用于例如清洁和洗涤剂组合物中，如衣物洗涤剂组合物以及餐具清洗组合物，包括自动餐具清洗组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞、以及生产和使用本发明的变体的方法。而且，本发明涉及包括本发明的变体的清洁和洗涤剂组合物。
相关领域的说明
在洗涤剂工业中，酶在洗涤配方中的使用已经超过了30年。在这类配方中使用的酶包括蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或它们的混合物。在商业上最重要的酶是蛋白酶。
越来越多的商业上使用的蛋白酶是自然发生的野生型蛋白酶的工程化变体和(诺维信公司(Novozymes A/S))、 和(杰能科国际(Genencor International，Inc.))。而且，本领域中所描述的许多变体，如在WO2004/041979(诺维信公司(Novozymes A/S))中描述了在例如洗涤性能、热稳定性、储存稳定性或催化活性中相对于亲本枯草杆菌酶具有改变的枯草杆菌酶变体。这些变体适用于例如清洁或洗涤剂组合物。
已经对许多有用的枯草杆菌酶变体进行了描述，其中许多变体在不同的洗涤剂中具有提高的活性、稳定性和溶解性。WO2004/067737描述了在L75至G80区具有一个或更多个缺失并随后在相同的区域中插入一个或更多个氨基酸的枯草杆菌酶变体。然而，不同的因素使得蛋白酶的优点有了进一步的提高。如温度和pH等清洗条件会随时间而发生变化，并且许多污渍在传统的清洗条件下仍然难以去除。由此可见，不论蛋白酶开发的深入研究如何，对于新的、改善的蛋白酶仍然存在需求。
发明概述
本发明涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的75、76、77、78、79和82位置相对应的两个或更多个位置上的改变，其中各改变独立地是取代或插入，并且其中该变体具有蛋白酶活性。本发明还涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的75、76、77、78、79和82位置相对应的两个或更多个位置上的改变，其中各改变独立地是取代或插入并且其中该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有至少65％的一致性。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸、包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞、以及生产这些变体的方法。
本发明还涉及用于获得蛋白酶变体的方法，包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的75、76、77、78、79和82位置相对应的两个或更多个位置上将一种改变引入亲本枯草杆菌酶，其中这些改变是取代或插入；回收该变体并且检验所述的变体是否具有蛋白酶活性。本发明进一步地涉及组合物，如清洁和洗涤剂组合物，并且涉及本发明的这类组合物以及变体在清洁过程(如洗衣和/或餐具清洗)中的用途。
定义
蛋白酶：在此定义的术语“蛋白酶(protease)”是一种水解肽键的酶。它包括属于EC3.4酶组的任何酶(包括其十三个亚类中的各酶)。EC编号是指加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学期刊(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5、欧洲生物化学期刊1995，232，1-6、欧洲生物化学期刊1996，237，1-5、欧洲生物化学期刊1997，250，1-6、以及欧洲生物化学期刊1999，264，610-650的增刊1-5。
蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意为蛋白水解活性(EC3.4)。本发明蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。有几种蛋白酶活性类型：三种主要活性类型是：胰蛋白酶样活性，其中在P1处在Arg或Lys之后具有酰胺底物的切割；糜蛋白酶样活性，其中在P1处的疏水性氨基酸中的一个之后发生切割；以及弹性蛋白酶样活性，其在P1处在Ala之后发生切割。为了本发明的目的，根据在下面的“材料与方法”中所述的规程对蛋白酶活性进行确定。本发明的枯草杆菌酶变体具有SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的蛋白酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％。
等位变体：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意为可通过反转录由获得自原核或真核细胞的成熟的剪接mRNA分子制备而成的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，它通过一系列的步骤加工，包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
螯合剂(Chelating agent或chelator)是可与特定的金属离子形成分子的化学物，从而使这些离子失活使其不能与其他元素进行反应，由此是通过形成螯合物而抑制化学活性的一种结合剂。螯合是在配体与单一中心原子之间形成或存在的两种或更多种单独的结合。配体可以是任何有机化合物、硅酸盐或磷酸盐。在本文上下文中，术语“螯合剂(chelating agent)”包括螯合剂(chelant)、螯合剂(chelating agent)、螯合剂(chelating agent)、络合剂(complexing agent)、或可与如钙和镁等金属离子形成水溶性复合物的螯合剂(sequestering agent)。螯合物效应描述了与相似的非螯合配体对于金属离子的相比，螯合配体对于相同的金属离子的增强的亲和力。螯合剂具有与金属离子结合的能力，尤其是钙(Ca2+)离子，并且已经被广泛用在常用于如洗衣或餐具清洗等清洗过程的洗涤剂和组合物中。然而，螯合剂显示其自身会抑制酶活性。在本申请中，术语螯合剂(chelating agent)与“络合剂(complexingagent)”或“螯合剂(chelating agent)”或“螯合剂(chelant)”互换使用。
因为大多数蛋白酶在螯合剂存在下是钙敏感的，这些可能会损伤酶活性。可通过在强螯合剂存在的条件下对给定的蛋白酶进行孵育而确定蛋白酶的钙敏感性，并且分析这种孵育对谈及的蛋白酶的活性的影响。钙敏感性蛋白酶会在孵育过程中失去其大部分活性或所有活性。
编码序列：术语“编码序列(coding sequence)”意为直接指定其多肽产物的氨基酸序列的一种多核苷酸。编码序列的范围通常是由开放的阅读框来确定的，通常从ATG起始密码子或如GTG和TTG等可替代的起始密码子开始，以如TAA、TAG和TGA等终止密码子结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。
控制序列：术语“控制序列(control sequences)”意为编码本发明的变体的多核苷酸的表达所必需的所有成分。各控制序列对于编码该变体的多核苷酸可以是天然的或是外源的，或彼此之间是天然的或是外源的。这类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。在最低限度，控制序列包括一个启动子、以及转录和翻译终止信号。控制序列可具有用于引入有利于该控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域的连接的特异性限制酶切位点的接头。
洗涤剂组合物：除非另有说明，术语“洗涤剂组合物(detergentcomposition)”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；洗碗机洗碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴露、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物(detergent composition)”和“洗涤剂配制品(detergentformulation)”。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂(laundry detergent)”)。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、炊具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂(dishwashing detergent)”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。其意图是，除了根据本发明的蛋白酶变体以外，该术语涵盖了包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合剂(chelating agent)、漂白剂体系或漂白剂组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、荧光增白剂、杀细菌剂、杀真菌剂组分、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
表达：术语“表达(expression)”包括涉及该变化的生成的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体(expression vector)”意为包含对变体进行编码的多核苷酸的线状或环状DNA分子，并且可操作性地与另外的用于其表达的核苷酸相连接。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。用2X SSC、0.2％SDS在65℃下将载体材料最后清洗三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞(host cell)”意为易受包含了本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于在复制过程中发生突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞后代。
改进的特点：术语“改进的特点(improved property)”意为相比于亲本或相比于参照蛋白酶(在本申请上下文中，参照蛋白酶是对应于SEQ ID NO:4的1至269氨基酸的SEQ ID NO:4的成熟多肽)、或相比于与所述的变体氨基酸序列相同但在一个或更多个所述的指定位置上具有改变的蛋白酶，得到了改进的、与变体相关联的特征。这类改进的特点包括但不限于螯合剂稳定性、洗涤性能、蛋白酶活性、热活性图谱、热稳定性、pH值活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改进的表面性质、底物特异性、产物特异性、在经预处理的生物质的存在下增加的稳定性或溶解度、在储存条件下改进的稳定性、以及化学稳定性。
改进的化学稳定性：术语“改进的化学稳定性(improved chemicalstability)”在此定义为变体酶在一种或多种化学物存在下表现为在孵育一段时间之后仍保留酶活性，这种或这些种化学物是自然发生的或是合成的，可降低亲本酶的酶活性。改进的化学稳定性还可使得这些变体在这类化学物存在下能更好地催化反应。在本发明的一个特别的方面，这种改进的化学稳定性是洗涤剂的，尤其是液体洗涤剂的，一种改进的稳定性。根据本发明，当该变体与一种包括螯合剂的液体洗涤剂配制品相混合时，这种改进的洗涤剂稳定性尤其是指蛋白酶变体的改进的稳定性，这种液体还包括胶体或糊。这种液体洗涤剂配制品可指的是在洗衣或自动餐具清洗过程中被加入的浓缩洗涤剂，或是稀释洗涤剂，如清洗液，即加入该浓缩洗涤剂的水性溶液。
稳定性术语“稳定性(stability)”包括储存稳定性和在使用过程中的稳定性，例如在清洗过程中的稳定性，并且反应了作为时间函数的根据本发明的蛋白酶变体的稳定性，例如当蛋白酶置于溶液中时，尤其是在洗涤剂溶液中时，能够保留多少活性。这种稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂的量、表面活性剂、等等。可使用如在实例1中所描述的螯合剂稳定性测定来对蛋白酶稳定性进行测量。
改进的稳定性：术语“改进的稳定性(improved stability)”，如“改进的螯合剂稳定性(improved chelator stability)”，在此定义为相对于亲本蛋白酶的稳定性、相对于氨基酸序列与所述的变体相同但是在一个或更多个所述的指定位置上具有改变的蛋白酶、或相对于SEQ ID NO:4的成熟多肽，变体酶显示出其在含有如EDTA等螯合剂的溶液中的稳定性增加，其表现是当在如在“材料与方法”中所描述的螯合剂稳定性测定中测量时，在pH8、EDTA存在下、50℃、16分钟之后，仍然具有高于16％的残留活性。
改进的洗涤性能：术语“改进的洗涤性能(improved wash performance)”在此定义为相对于亲本蛋白酶的洗涤性能、相对于参照蛋白酶的洗涤性能、或相对于氨基酸序列与所述的变体相同但是在一个或更多个所述的指定位置上具有改变的蛋白酶，蛋白酶变体显示出了改变，例如通过增加的污渍去除性。术语“洗涤性能(wash performance)”包括在洗衣中的洗涤性能，但还指在例如，餐具清洗中的洗涤性能。可通过在自动机械应力测定(AMSA)的描述中定义的对所谓的强度值(Int)进行计算来对洗涤性能进行定量分析，例如在WO11036263的材料与方法部分中所描述的。
改进的蛋白酶活性：术语“改进的蛋白酶活性(improved protease activity)”在此定义为：通过增加的蛋白转化，相对于亲本蛋白酶的活性(或与之相比)、或与参照蛋白酶相比、或相对于氨基酸序列与所述的变体相同但是在一个或更多个所述的指定位置上具有改变的蛋白酶，显示具有改变的蛋白酶变体的改变的蛋白酶活性(如上所述的)。
分离的变体：术语“分离的变体”意为可手动改性的变体。在一个方面中，通过SDS-PAGE测定，该变体具有至少1％的纯度，例如至少5％的纯度、至少10％的纯度、至少20％的纯度、至少40％的纯度、至少60％的纯度、至少80％的纯度、以及至少90％的纯度。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸(isolated polynucleotide)”意为可手动改性的多核苷酸。在一个方面中，通过琼脂电泳测定，该分离的多核苷酸具有至少1％的纯度，例如至少5％的纯度、至少10％的纯度、至少20％的纯度、至少40％的纯度、至少60％的纯度、至少80％的纯度、至少90％的纯度、以及至少95％的纯度。多核苷酸可以是基因组来源的、cDNA来源的、RNA来源的、半合成来源的，合成来源的、或它们的任何组合。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。用2X SSC、0.2％SDS在50℃下将载体材料最后清洗三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽(mature polypeptide)”意为在翻译以及任何翻译后修饰(如N端加工，C端截短、糖基化、磷酸化等等)之后的最终形式的多肽。在一个方面中，成熟多肽对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至275、SEQ ID NO:4的氨基酸1至269、以及SEQ ID NO:6的氨基酸1至274。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列(mature polypeptide codingsequence)”意为对具有蛋白酶活性的成熟多肽进行编码的多核苷酸。在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸322至1146，基于SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10：1-6)]，对编码信号肽的SEQ ID NO:1的核苷酸1至90进行的预测。
在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸577至1140，基于SignalP(尼尔森等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10：1-6)]，对编码信号肽的SEQ ID NO:3的核苷酸1至81进行的预测。
在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸310至1131，基于SignalP(尼尔森等人，1997，蛋白质工程学(Protein Engineering)10：1-6)]，对编码信号肽的SEQ ID NO:5的核苷酸1至81进行的预测。
中度严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。用2X SSC、0.2％SDS在55℃下将载体材料最后清洗三次，每次15分钟。
中-高度严谨度条件：术语“中-高度严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。用2X SSC、0.2％SDS在60℃下将载体材料最后清洗三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体(Mutant)”意为编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语"核酸构建体"意为从天然发生的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体包含有本发明的编码序列的表达所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒(expression cassette)”是同义的。
可操作地连接的：术语“可操作地连接的(operably linked)”意为一种构型，在其中控制序列被置于相对于多核苷酸的编码序列的合适的位置上，这样使得控制序列可引导编码序列的表达。
亲本：术语“亲本(parent)”意为一种蛋白酶，对该蛋白酶进行改变以产生本发明的酶变体。由此可见，亲本是与所述的变体具有相同的氨基酸序列但在一个或更多个(例如两个或更多个)所述的指定位置上具有改变的一种蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有相同的氨基酸序列”的表达是相对于100％的序列一致性。亲本可以是天然发生的(野生型)多肽或其变体。在一个特别的实施例中，亲本是一种蛋白酶，与具有SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的多核苷酸的一致性为至少60％，例如一致性为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％。
序列一致性：通过参数“序列一致性(sequence identity)”来定义在两个氨基酸序列之间的关联性或在两个核苷酸序列之间的关联性。为了本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法来确定在两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度(尼德曼与翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453)，如在EMBOSS软件包的尼德尔(Needle)程序所实现的(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular BiologyOpen Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16：276-277)，优选的是版本3.0.0或更新的版本。所用的任选参数是开放空位罚分10、扩展空位罚分0.5、以及EBLOSUM62(EMBOSS版本BLOSUM62)替代矩阵。将尼德尔(Needle)标记的“最长一致性”的输出(采用nobrief选项获得的)用作一致性百分数，并且如以下所述进行计算：
(相同的残基数×100)/(比对长度–比对中的空位总数)
为了本发明的目的，采用尼德曼-翁施算法来确定在两种脱氧核苷酸序列之间的序列一致性的程度(尼德曼与翁施，1970，同上)，如在EMBOSS软件包的尼德尔程序所实现的(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯等人，2000，同上)，优选的是版本3.0.0或更新的版本。所用的可任选参数是开放空位罚分10、扩展空位罚分0.5、以及EDNAFULL(EMBOSS版本NCBI NUC4.4)替代矩阵。将尼德尔标记的“最长一致性”的输出(采用nobrief选项获得的)用作一致性百分数，并且如以下所述进行计算：
(相同的脱氧核苷酸数×100)/(比对长度–比对中的空位总数)
基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体(substantially pure ariant)”意为包含有最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％、以及最多0.5％(按重量计)的与其天然地或重组地相关联的其他多肽材料的一种制剂。优选的是，在该制剂中存在的全部多肽材料中，该变体具有至少92％的纯度、例如至少94％的纯度、至少95％的纯度、至少96％的纯度、至少97％的纯度、至少98％的纯度、至少99％的纯度、至少99.5％的纯度、以及100％的纯度(按重量计)。本发明的这些变体优选以一种基本上纯的形式存在。可通过例如用已知的重组方法或经典纯化方法来制备该变体来完成。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸(substantially purepolynucleotide)”意为一种多核苷酸制剂，是不含其他外源性或不需要的核苷酸的，并且是以适用于基因工程多肽生产系统中的形式而存在的。由此可知，基本上纯的多核苷酸含有最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％、以及最多0.5％(按重量计)的、与其天然地或重组地相关联的其他多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然发生的5’和3’-非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸具有至少90％的纯度，例如至少92％的纯度、至少94％的纯度、至少95％的纯度、至少96％的纯度、至少97％的纯度、至少98％的纯度、至少99％的纯度、以及至少99.5％的纯度(按重量计)。本发明的多核苷酸优选以一种基本上纯的形式存在。
变体：术语“变体(变体)”意为具有包含下述改变的蛋白酶活性的多肽，即在一个或更多个(或一个或若干个)位置上发生的代、插入和/或缺失。取代意为将占据了一个位置的氨基酸用另一个不同的氨基酸来代替；缺失意为将占据了一个位置的氨基酸去除；并且插入意为加入氨基酸，例如1至10个氨基酸，如9个氨基酸、如8个氨基酸、如7个氨基酸、如6个氨基酸、如5个氨基酸、如4个氨基酸，优选的是1-3个氨基酸，更优选的是1-2个氨基酸，最优选的是与占据了一个位置的氨基酸相邻的两个氨基酸。缺失是去除至少一个或多个氨基酸，使得该变体的序列比其亲本序列短。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。用2X SSC、0.2％SDS在70℃下将载体材料最后清洗三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。用2X SSC、0.2％SDS在45℃下将载体材料最后清洗三次，每次15分钟。
洗涤性能：术语“洗涤性能(wash performance)”被用作在例如清洗过程中，如在洗衣或硬表面清洁过程中，酶的去除待清洁物品上的污渍的能力。可通过对所谓的强度值(Int)进行计算来对洗涤性能的改进进行定量分析，如在AMSA测定中所定义的，例如在WO11036263的材料与方法中所描述的。
野生型蛋白酶：术语“野生型蛋白酶”意指通过天然发生的机体表达的蛋白酶，如可在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物。野生型蛋白酶的实例是BPN’，即SEQ ID NO:2的氨基酸1至275。
转录启动子：术语“转录启动子(transcription promoter)”用于启动子，启动子是促进特定基因的转录的DNA区域。转录启动子典型地是位于其调节的基因的附近，位于相同的链上或上游(朝向有义链的5'区)。
转录终止子：术语“转录终止子(transcription terminator)”用于对用于转录的基因末端或基因组DNA的操纵子进行标记的一段基因序列。
变体命名的惯例
为了本发明的目的，在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用于确定在另一种枯草杆菌蛋白酶中的相应的氨基酸残基，其也被称作“BPN编号”。在下文中，术语“对应于(corresponding to)”应被理解为是对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置，即全文中的编号是根据BPN的编号。
将另一种枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸1至275)进行比对，并且基于该比对，采用尼德曼-翁施算法，确定对应于SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号(尼德曼与翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453)，如在EMBOSS软件包的尼德尔程序所实现的(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，赖斯等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16：276-277)，优选的是版本5.0.0或更新的版本。所用的参数是开放空位罚分10、扩展空位罚分0.5、以及EBLOSUM62(EMBOSS版本BLOSUM62)替代矩阵。在另一种枯草杆菌蛋白酶中的对应的氨基酸残基的识别可通过采用几种计算机程序与多种多肽序列进行比对来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(对数预期的多序列比较；版本3.5或更新的版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32：1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新的版本；加藤(Katoh)与库玛(Kuma)，2002，核酸研究(Nucleic Acids Research)30：3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究(Nucleic Acids Research)33：511-518；加藤与Toh(淘)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23：372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537：39-64；加藤与淘，2010，生物信息学(Bioinformatics)26：1899-1900)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新的版本；托马森(Thompson)等人，1994，核酸研究(Nucleic Acids Research)22：4673-4680)，应用其各自的默认参数。
当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)与埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295：613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱图)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个谱并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序(例如GenTHREADER)(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦谷芬(McGuffi)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST，二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化潜力)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。两个或更多个蛋白质结构可以使用各种算法如距离比对矩阵(豪尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合扩展(辛德洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)来比对，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有所感兴趣的结构的结构数据库以发现可能的结构同源物(例如，豪尔姆(Holm)和派克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用了以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代被表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表在位置205和位置411上甘氨酸(G)被精氨酸(R)并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或者“G195*+S411*”。
插入：另外的氨基酸残基的插入，例如在G195之后插入赖氨酸可表示为：Gly195GlyLys或G195GK。可替代地，另外的氨基酸残基的插入，如在G195之后插入赖氨酸可表示为：*195aL。当插入一个以上氨基酸残基时，例如在G195之后插入Lys和Ala可表示为：Gly195GlyLysAla或G195GKA。在这类情况下，还可以通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号，例如：*195aK*195bA。在以上的实施例中，序列194-196因此为：
在取代和插入发生在相同的位置上的情况下，可表示为S99SD+S99A，或简写为S99AD。相同的修饰还可表示为S99A+*99aD。
当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然是在命名中出现了简并。如果例如在上述实例中的甘氨酸之后插入甘氨酸，可表示为G195GG或*195aGbG。相同的实际改变可仅表示为A194AG或*194aG，用于下述的改变：
这类例子对本领域技术人员将是显而易见的，并且G195GG的表示以及相应的用于这种插入类型的表示由此意为包括这类等同简并表示法。
多种改变。用加号(“+”)将包括多种改变的变体分隔开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”，表示在位置170和195上用酪氨酸和谷氨酸分别取代精氨酸和甘氨酸。可空格或逗号来将可替代的多种改变分隔开，例如分别为A170Y G195E或A170Y，G195E。
不同的改变。当可以在一个位置上引入不同的改变时，用逗号将不同的改变分隔开，例如“Arg170Tyr,Glu”表示在位置170上用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。由此可见，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指定了下述变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
可替代的不同改变或可任选的取代可用括号表示，例如Arg170[Tyr,Glu]或Arg170{Tyr,Glu}或简写为R170[Y,E]或R170{Y,E}。
氨基酸位置/残基的编号
如果没有另外指出，在此使用的氨基酸编号是对应于枯草杆菌酶BPN'(BASBPN)序列的编号。BPN’序列的进一步的说明参见SEQ ID NO:2(氨基酸1至275)或斯艾森等人，蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737。
本发明的详细说明
发明人发现了在SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基75至82对应的强钙离子结合位点上具有改变的枯草杆菌酶，其中这些改变是取代或插入，导致变体在包含如EDTA等螯合剂的洗涤剂组合物中具有增加的稳定性。不被理论所束缚，目前认为在枯草杆菌蛋白酶的钙结合位点上的这些改变，如在对应于具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基75至82的区域上的BPN’(SEQ ID NO:2的氨基酸1-275)、枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:4的氨基酸1至269)或碱性蛋白酶(Alcalase)(SEQ ID NO:6的氨基酸1至274)的这些改变使得该区域与蛋白酶TY145(芽孢杆菌(Bacillus sp.)的枯草杆菌酶TY145，NCIMB40339，如在WO92/17577中所述的)的相应区域更相似或使其与TY145的序列同源，当与其亲本蛋白酶(例如SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽)相比较时，增加了枯草杆菌酶变体在含有如EDTA等螯合剂的溶液中的稳定性。具体地，发明人发现了对应于区域75至82的SEQ IDNO:2的成熟多肽的残基75、76、77、78、79和82的钙离子结合位点与TY145类型的残基或TY145的同源序列的残基之间的互换显示出，当与例如SEQ IDNO:4的成熟多肽等亲本相比较时，其在含有如EDTA等螯合剂的洗涤剂溶液中的稳定性增加。钙独立区域与已知的稳定性突变的进一步的结合导致了非常稳定的功能性的结合变体，当变体的残留活性与亲本的残留活性相比较、与具有与所述的变体相同的氨基酸序列但在一个或更多个所述的指定位置上不具有一个或更多个改变的蛋白酶相比较、或与参照蛋白酶相比较时，其在含有如EDTA等螯合剂的洗涤剂中的活性增加。具体地，在对应于具有SEQID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基75至82的区域中，将至少一个氨基酸用与TY145或同源序列的相应区域相似的氨基酸所取代，与在对应在于具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基75至82的区域中插入至少一个氨基酸相结合，产生了在含有如EDTA等螯合剂的洗涤剂组合物中非常稳定的钙独立变体。
由此可见，本发明涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体包括在与SEQID NO:2的成熟多肽的75、76、77、78、79和82位置相对应的两个或更多个位置上的改变，其中各改变独立地是取代或插入，并且其中该变体具有蛋白酶活性。术语“在……上的一个改变(an alteration at)”在本申请的上下文中意为在位置上的取代或在两个位置之间的插入。在一个优选实施例中，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中取代一个或更多个氨基酸，并且进一步地包括在对应于SEQID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中插入至少一个氨基酸，其中该变体与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有至少65％的一致性。本发明的一个方面涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在两个或更多个对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中包括改变，其中所述的两种改变是在对应于SEQ ID NO:2位置75至82的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少两个另外的氨基酸残基。在一个优选的方面中，根据本发明的枯草杆菌酶变体与亲本蛋白酶，例如SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:4的成熟多肽相比包括至少两个另外氨基酸，借此所述的另外氨基酸残基在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入两个氨基酸残基。在一个具体的优选的方面中，所述的另外氨基酸残基是选自于由以下各项组成的组：Gly或Asp，由此将对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域延伸了两个氨基酸。由此可见，本发明的一个方面涉及一种变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括两个另外氨基酸残基，借此所述的另外氨基酸残基对应于在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入两个氨基酸残基，其中所述的氨基酸残基选自于由以下各项组成的组：Gly或Asp，并且其中所述的区域延伸了两个氨基酸。由此可见，在一个特定方面中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一个另外氨基酸残基，其中在位置75与76之间插入至少一个另外氨基酸残基，如一个或多个插入*75aG，*75aD或*75a[G,D]*75b[G,D](后者表示在位置75与76之间插入两个氨基酸，其可以是下述的任何一种：*75aG+*75bG；*75aD+*75bD；*75aG+*75bD或*75aD+*75bG)，并且进一步地包括至少一个另外修饰(BPN编号，即根据SEQ ID NO:2的成熟多肽的编号)。在一个特定方面中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一种另外的氨基酸残基，其中在位置76与77之间插入至少一个另外的氨基酸残基，例如*76aG，*76aD或*76a[G,D]*76b[G,D]的一个或多个插入，并进一步包括至少一种另外修饰(BPN编号)。在一个特定方面中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一种另外的氨基酸残基，其中在位置77与78之间插入至少一个另外的氨基酸残基，例如*77aG，*77aD或*77a[G,D]*77b[G,D]的一个或多个插入，并进一步包括至少一种另外修饰(BPN编号)。在一个特定方面中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一种另外的氨基酸残基，其中在位置78与79之间插入至少一个另外的氨基酸残基，例如*78aG，*78aD或*78a[G,D]*78b[G,D]的一个或多个插入，并进一步包括至少一种另外修饰(BPN编号)。在一个特定方面中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一种另外的氨基酸残基，其中在位置79与80之间插入至少一个另外的氨基酸残基，例如*79aG，*79aD或*79a[G,D]*79b[G,D]的插入，并进一步包括至少一种另外修饰(BPN编号)。在一个特定方面中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一种另外的氨基酸残基，其中在位置80与81之间插入至少一个另外的氨基酸残基，例如*80aG，*80aD或*80a[G,D]*80b[G,D]的一个或多个插入，并进一步包括至少一种另外修饰(BPN编号)。在一个特定方面中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一种另外的氨基酸残基，其中在位置81与82之间插入至少一个另外的氨基酸残基，例如*81aG，*81aD或*81a[G,D]*81b[G,D]的一个或多个插入，并进一步包括至少一种另外修饰(BPN编号)。其中，另外修饰优选的是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]；并且其中该变体与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的一致性，但低于100％。
在一个优选的方面中，本发明涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一个取代以及至少一个插入。在另一个优选的方面中，本发明涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体包括至少一种取代，其中所述的取代是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]，并且在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中具有至少一个插入。在一个具体的优选的方面中，根据本发明的变体包括至少一个取代，其中所述的取代是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]，并且在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少两个插入。在一个具体的优选的方面中，根据本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中包括至少一个取代以及至少两个插入。在一个甚至更优选的方面中，根据本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的位置75、76、77、78、79和82的区域中包括至少两个取代，其中所述的取代是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]，其中该变体进一步地在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入两个氨基酸残基，其中所述的被插入的氨基酸残基是选自于由以下各项组成的组：Gly或Asp，并且其中所述的区域延伸了两个氨基酸。
由此可见，本发明涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上具有改变，其中各改变独立地是取代或插入，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性，但低于100％。本发明进一步地涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上具有改变，其中各改变独立地是取代或插入，并且其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性，但低于100％。在另一个方面中，本发明涉及枯草杆菌酶变体，该枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上具有改变，其中各改变独立地是取代或插入，并且其中该变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性，但低于100％。在一个实施例中，根据本发明的变体是一种多肽，该多肽是由与SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列或编码SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列具有至少60％的一致性的多核苷酸编码的。在一个实施例中，根据本发明的变体是一种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽的序列一致性是至少65％的一致性，例如至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性，但低于100％。
另一个实施例涉及一种获得枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上将改变引入亲本枯草杆菌酶，其中这些改变独立地是取代或插入；回收该变体并且检验所述的变体是否具有蛋白酶活性。一个特定的方面涉及一种获得枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上将改变引入亲本枯草杆菌酶，其中这些改变独立地是取代或插入；其中该变体是亲本枯草杆菌酶的变体，选自于由以下各项组成的组：
a.与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；
b.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与下述各项进行杂交：(i)SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列；
c.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列具有至少60％的一致性，或其cDNA序列；以及
d.SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
一个具体的实施例涉及一种方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上将改变引入亲本枯草杆菌酶，其中该改变独立地是取代或插入，其中该变体是亲本枯草杆菌酶的变体，与SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的一致性。另一个具体的实施例涉及一种方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上将改变引入亲本枯草杆菌酶，其中该改变独立地是取代或插入，其中该变体是亲本枯草杆菌酶的变体，与SEQ ID NO:4的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的一致性。还有另一个具体的实施例涉及一种方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上将改变引入亲本枯草杆菌酶，其中该改变独立地是取代或插入，其中该变体是亲本枯草杆菌酶的变体，与SEQ ID NO:6的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的一致性。在一个具体的实施例中，蛋白酶变体是SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中包括两个或更多个氨基酸的取代。在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域处包括两个、三个、四个或五个氨基酸的取代，其中所述的取代是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]。一个优选的实施例涉及SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的位置上包括两个、三个、四个或五个氨基酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性，但低于100％。
一个特别优选的实施例涉及SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的位置上包括两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代，其中所述的取代是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]，其中该变体进一步地在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入两个氨基酸残基，其中所述的被插入的氨基酸残基是选自于由以下各项组成的组：Gly或Asp，并且其中该变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽的一致性是至少65％，如至少70％，例如与SEQ ID NO:4的成熟多肽的序列一致性是至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但低于100％。
在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82处包括两个、三个、四个或五个氨基酸的取代，其中所述的取代是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]，其中该变体进一步地在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入两个氨基酸残基，其中所述的被插入的氨基酸残基是选自于由以下各项组成的组：Gly或Asp，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽的一致性是至少65％，如至少70％，例如与SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列一致性是至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但低于100％。
一个第三实施例涉及SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体，在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82处包括两个、三个、四个或五个氨基酸的取代，其中所述的取代是选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]，其中该变体进一步地在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入两个氨基酸残基，其中所述的被插入的氨基酸残基是选自于由以下各项组成的组：Gly或Asp，并且其中该变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽的一致性是至少65％，如至少70％，例如与SEQ ID NO:6的成熟多肽的序列一致性是至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但低于100％。
本发明提供了枯草杆菌酶变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的一个或更多个(例如若干个)位置上具有插入和/或取代。本发明还涉及蛋白酶变体，其中对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域延伸了至少一个氨基酸。除了在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中插入至少一个氨基酸以外，在这个区域中还有取代，使其与具有与所述的变体相同的氨基酸序列的但在一个或更多个所指定的位置上具有一个或更多个改变的蛋白酶相比或与参照蛋白酶相比，具有提高的螯合剂稳定性。由此可见，本发明涉及枯草杆菌蛋白酶的变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个(例如若干个)位置上包括改变，其中该变体具有蛋白酶活性。在一个实施例中，本发明涉及一种枯草杆菌酶变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中包括一个或更多个氨基酸的插入以及至少一个氨基酸的取代，其中该变体具有蛋白酶活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及一种分离的蛋白酶变体，在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中包括一个或更多个氨基酸的插入以及至少一个氨基酸的取代，其中该变体与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列一致性是至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的一致性，但低于100％。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75的位置上包括取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76的位置上包括取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置77的位置上包括取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置78的位置上包括取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79的位置上包括取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置82的位置上包括取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75和76的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75和77的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75和78的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75和79的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75和82的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76和77的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76和78的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76和79的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76和82的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置77和78的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置77和79的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置77和82的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置78和79的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置78和82的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79和82的位置上包括两个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76和77的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76和78的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76和79的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76和82的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76、77和78的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76、77和79的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76、77和82的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置77、78和79的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置77、78和82的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置78、79和82的位置上包括三个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77和78的位置上包括四个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77和79的位置上包括四个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77和82的位置上包括四个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76、77、78和79的位置上包括四个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76、77、78和82的位置上包括四个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置77、78、79和82的位置上包括四个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78和79的位置上包括五个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78和82的位置上包括五个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置76、77、78、79和82的位置上包括五个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的位置上包括六个取代，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个方面中，在本发明的变体中的改变的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
在另一个方面中，根据本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的一个或更多个(例如若干个)位置上包括改变。在另一个方面中，根据本发明的变体在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82中的任何位置相对应的两个位置上包括改变。在另一个方面中，根据本发明的变体在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82中的任何位置相对应的三个位置上包括改变。在另一个方面中，根据本发明的变体在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82中的任何位置相对应的四个位置上包括改变。在另一个方面中，根据本发明的变体在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82中的任何位置相对应的五个位置上包括改变。在另一个方面中，根据本发明的变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的各位置上包括改变。
在一个方面中，该变体在对应于位置75的位置上包括改变或由该改变组成。在另一个方面中，在对应于位置75的位置上的氨基酸被Asp或His取代，优选的是用His取代。在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H的取代，或由该取代组成。在一个特定方面中，该变体包括L75H，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个方面中，该变体在对应于位置76的位置上包括改变或由该改变组成。在另一个方面中，在对应于位置76的位置上的氨基酸被Ser、Asp或Tyr取代，优选的是用Ser取代。在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S的取代，或由该取代组成。在一个特定方面中，该变体包括N76S，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个方面中，该变体在对应于位置77的位置上包括改变或由该改变组成。在另一个方面中，在对应于位置77的位置上的氨基酸被Asp取代。在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D的取代，或由该取代组成。在一个特定方面中，该变体包括N77D，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个方面中，该变体在对应于位置78的位置上包括改变或由该改变组成。在另一个方面中，在对应于位置78的位置上的氨基酸被Gln或Gly取代，优选的是用Gly取代。在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G的取代，或由该取代组成。在一个特定方面中，该变体包括S78G，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个方面中，该变体在对应于位置79的位置上包括改变或由该改变组成。在另一个方面中，在对应于位置79的位置上的氨基酸被Ala、Gln或Tyr取代，优选的是用Gln取代。在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的I79Q的取代，或由该取代组成。在一个特定方面中，该变体包括I79Q，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
在一个方面中，该变体在对应于位置82的位置上包括改变或由该改变组成。在另一个方面中，在对应于位置82的位置上的氨基酸被Tyr取代。在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L82Y的取代，或由该取代组成。在一个特定方面中，该变体包括L82Y，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入至少一个氨基酸。
这些插入可以是下述各项中的任何一项：当根据SEQ ID NO:2的成熟多肽进行编号时，在位置75与76(*75)之间的至少一个插入、在位置76与77(*76)之间的至少一个插入、在位置77与78(*77)之间的至少一个插入、在78与79(*78)之间的至少一个插入、在位置79与80(*79)之间的至少一个插入、在位置80与81(*80)之间的至少一个插入、在位置81与82(*81)之间的至少一个插入。甚至更优选地，这些插入是选自于由以下各项组成的组：*75aG，*75aD，*75aG+*75bD，*75aD+*75bG，*75aD+*75bD，*75aG+*75bG；*76aG，*76aD，*76aG+*76bD，*76aD+*76bG，*76aD+*76bD，*76aG+*76bG；*77aG，*77aD，*77aG+*77bD，*77aD+*77bG，*77aD+*77bD，*77aG+*77bG；*78aG，*78aD，*78aG+*78bD，*78aD+*78bG，*78aD+*78bD，*78aG+*78bG；*79aG，*79aD，*79aG+*79bD，*79aD+*79bG，*79aD+*79bD，*79aG+*79bG；*80aG，*80aD，*80aG+*80bD，*80aD+*80bG，*80aD+*80bD，*80aG+*80bG；*81aG，*81aD，*81aG+*81bD，*81aD+*81bG，*81aD+*81bD，*81aG+*81bG。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75和76的位置上的改变，或由该改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75和77的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75和78的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76和77的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76和78的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置77和78的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置77和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置77和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置78和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置78和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76和77的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76和78的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、77和78的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、77和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、77和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、78和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、78和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、77和78的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、77和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、77和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、78和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、78和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置77、78和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置77、78和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置77、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置78、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76、77和78的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76、77和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76、77和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、77、78和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、77、78和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、78、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置77、78、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76、77、78和79的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76、77、78和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置76、77、78、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体包括在对应于位置75、76、77、78、79和82的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括一个或更多个(例如若干个)取代和/或一个或更多个(例如若干个)插入，或由这些取代和/或插入组成，该取代选自于由以下各项组成的组：L75[D,H]、N76[S,D,Y]、N77[D]、S78[Q,G]、I79[A,T,Q]和L82[Y]，优选地选自于由以下各项组成的组：L75H、N76S、N77D、S78G、I79Q和L82Y。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H的取代，或由该取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S的取代，或由该取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+S78G+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+S78G+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G+I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+S78G+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+S78G+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G+I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G+I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G+I79Q的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G+I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G+I79Q+L82Y的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H的取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S的取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的I79Q+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+I79Q+PL82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+S78G+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+S78G+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+I79Q+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的S78G+I79Q+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+S78G+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N77D+S78G+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+S78G+I79Q+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N77D+S78G+I79Q+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G+I79Q的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的N76S+N77D+S78G+I79Q+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
在另一个方面中，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中包括对SEQ ID NO:4的成熟多肽的L75H+N76S+N77D+S78G+I79Q+L82Y的多个取代以及一个或更多个(例如若干个)插入，或由它们组成。
其中这些插入可以是下述各项中的任何一项：当根据SEQ ID NO:2的成熟多肽进行编号时，在位置75与76(*75)之间的至少一个插入、在位置76与77(*76)之间的至少一个插入、在位置77与78(*77)之间的至少一个插入、在78与79(*78)之间的至少一个插入、在位置79与80(*79)之间的至少一个插入、在位置80与81(*80)之间的至少一个插入、在位置81与82(*81)之间的至少一个插入。甚至更优选地，这些插入是选自于由以下各项组成的组：*75aG，*75aD，*75aG+*75bD，*75aD+*75bG，*75aD+*75bD，*75aG+*75bG；*76aG，*76aD，*76aG+*76bD，*76aD+*76bG，*76aD+*76bD，*76aG+*76bG；*77aG，*77aD，*77aG+*77bD，*77aD+*77bG，*77aD+*77bD，*77aG+*77bG；*78aG，*78aD，*78aG+*78bD，*78aD+*78bG，*78aD+*78bD，*78aG+*78bG；*79aG，*79aD，*79aG+*79bD，*79aD+*79bG，*79aD+*79bD，*79aG+*79bG；*80aG，*80aD，*80aG+*80bD，*80aD+*80bG，*80aD+*80bD，*80aG+*80bG；*81aG，*81aD，*81aG+*81bD，*81aD+*81bG，*81aD+*81bD，*81aG+*81bG。
这些变体可进一步地包括在一个或更多个(例如若干个)其他位置上的一个或更多个另外的改变。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小连接子肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸序列(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath(诺伊拉特)和R.L.Hill(希尔)1979年描述于The Proteins(蛋白质)中，Academic Press(学术出版社)，纽约。常见的取代包括：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Asn/Gln、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Glu/Gln、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸变化是这样一种性质的变化，多肽的物理-化学特性被改变。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值等。
例如，这些变体可包括在对应于位置75、76、77、78、79和82的位置上的两个改变，并且进一步地包括在下述位置中的任何位置上的改变：位置167、170、191、261和262(根据SEQ ID NO:2的成熟多肽进行编号)。在一个优选的实施例中，在选自下组的任何位置上的改变是取代，该组由以下各项组成：167、170、191、261和262。在一个具体的优选实施例中，根据本发明的变体包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的一个位置上的两种改变，其中至少一种改变是插入，并且其中该变体进一步地包括一个或更多个取代，这个或这些取代选自于由以下各项组成的组：Y167A、R170S、A191N、N261D和L262Q。
在本发明的一个实施例中，根据本发明的变体包括任何下述变体，或由其组成：
L75D+*75aG+*75bG+N76S+N77D+S78G+I79A+V81I+L82Y
L75D+*75aG+*75bG+N76S+N77D+S78Q+I79A+V81I+L82Y
L75D+*75aG+*75bG+N76D+N77N+S78G+I79T+V81I+L82Y
L75H+*75aG+*75bG+N76Y+N77D+S78G+I79Q+V81I+L82Y
L75H+*75aG+*75bG+N76S+S78G+I79Q+L82Y+Y167A
L75H+*75aG+*75bG+N76S+S78G+I79Q+L82Y+Q191N
L75H+*75aG+*75bG+N76S+S78G+I79Q+L82Y+Y167A+R170S
L75H+*75aG+*75bG+N76S+S78G+I79Q+L82Y+Y167A+R170SA194P
L75H+*75aG+*75bG+N76S+S78G+I79Q+L82Y+N261D+L262Q
L75H+*75aD+*75bG+N76S+S78G+I79Q+L82Y
其中*75aD与*75bG是指在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的环中在位置75之后或在位置75与76之间插入Asp和Gly。
定点诱变可以根据本领域已知程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，Science(科学)244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的蛋白酶活性以识别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如德福斯(de Vos)等人，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；沃勒达尔(Wlodaver)等人，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。对于BPN’(SEQ ID NO:2的成熟多肽)，包括氨基酸S221、H64和D32的催化三联体对于酶的蛋白酶活性非常重要。
这些变体可由200至900个氨基酸组成，例如210至800、220至700、230至600、240至500、250至400、255至300、260至290、265至285、270至280或270、271、272、273、274、275、276、277、278、279或280个氨基酸。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有提高的催化活性。
在一个实施例中，与亲本酶相比、或与具有与所述的变体一致的氨基酸序列但在一个或更多个所述的指定位置上具有改变的蛋白酶相比、或与参照蛋白酶相比，该变体具有提高的螯合剂稳定性，其中如在此的“材料与方法”中的实例2中所述的对螯合剂稳定性进行测定。
亲本蛋白酶
切割蛋白底物中的酰胺键的酶可被分类为蛋白酶，或(可互换地)分类为肽酶(参见沃尔什(Walsh)，1979，酶促反应机制(Enzymatic ReactionMechanisms.)弗里曼(W.H.Freeman)和孔帕尼(Company)，旧金山，第3章)。
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点处存在一个必需丝氨酸残基的酶(怀特(White)，汉德勒(Handler)和史密斯(Smith)，1973，“Principlesof Biochemistry(生物化学原理)”，第五版，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，NY，第271-272页)。
细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围为20,000至45,000道尔顿。它们被二异丙基氟磷酸抑制。它们水解简单末端酯，并且其活性与真核糜蛋白酶(也是一种丝氨酸蛋白酶)相似。一个范围更窄的术语，碱性蛋白酶，涵盖了一个亚组，反映了某些丝氨酸蛋白酶的高pH最佳值，从pH9.0至11.0(评论参见普里斯特(Priest)(1977)细菌学评论(Bacteriological Rev.)41711-753)。
枯草杆菌酶
丝氨酸蛋白酶亚组暂且是指枯草杆菌酶，由斯艾森(Siezen)等人在蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人在蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523中提出的。通过对超过170个的先前被称作枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行同源性分析定义了这些酶。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据斯艾森等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了大量的枯草杆菌酶，并已测定了一些枯草杆菌酶的氨基酸序列。对此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述参见斯艾森等人(1997)。
枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或“真”枯草杆菌蛋白酶，包括“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(诺维信公司(Novozymes A/S))以及枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。BPN’是来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)BPN’的枯草杆菌蛋白酶BPN’，对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽，即SEQ ID NO:2的氨基酸1至275。
斯艾森等人(同上)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶，并且包括多种酶，如枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(杰能科国际(Genencor International，Inc.))、枯草杆菌蛋白酶309(赛威蛋白酶 诺维信公司(Novozymes A/S))、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(诺维信公司(Novozymes A/S))、以及碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。
枯草杆菌蛋白酶
枯草杆菌蛋白酶是来自S8家族，尤其是来自S8A亚家族的丝氨酸蛋白酶，如由MEROPS数据库所定义的(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝S8)。BPN’和赛威蛋白酶(Savinase)分别具有MEROPS编号S08.034和S08.003。
亲本枯草杆菌酶
术语“亲本枯草杆菌酶”描述了根据斯艾森等人(1991以及1997)定义的一种枯草杆菌酶。进一步的详细内容参见上述的“枯草杆菌酶”的说明。亲本枯草杆菌酶还可以是从天然来源分离的一种枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶的特性的同时还进行了后续的修饰。此外，亲本枯草杆菌酶可以是由DNA改组技术制备的一种枯草杆菌酶，如由内斯(J.E.Ness)等人在自然生物科技(Nature Biotechnology)17，893-896(1999)中所述的。
可替代地，术语“亲本枯草杆菌酶”可命名为“野生型枯草杆菌酶”。
提供了关于在此提及的不同的枯草杆菌酶的首字母缩略词的一个表，可用于参考，其他首字母缩略词参见斯艾森等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737以及斯艾森等人蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523。
表III
枯草杆菌酶的修饰
在此使用的术语“修饰(modification(s))”被定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及编码枯草杆菌酶的DNA的基因操作。这个或这些修饰可以是一个或多个氨基酸侧链的一个或多个替换、在感兴趣的一个或多个氨基酸中或其上的一个或多个取代、一个或多个缺失和/或一个或多个插入。
枯草杆菌酶变体
术语“变体(variant)”和术语“枯草杆菌酶变体(subtilase variant)”如上定义。
同源枯草杆菌酶序列
为了本发明的目的，在本文上下文中由参数“一致性”对两个氨基酸序列之间的同源性进行描述，使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定在两个氨基酸序列之间的一致性的程度。程序的输出是对在氨基酸比对以外的两个序列之间的“一致性百分数”的计算。
基于这一描述，本领域的普通技术人员可常规对合适的同源枯草杆菌酶进行确认，其可根据本发明进行修改。
基本上同源的亲本枯草杆菌酶变体可具有一个或更多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在本文上下文中，术语“一个或更多个(one or more)”可与术语“若干个(several)”互换使用。这些改变优选地具有微小的性质，即，不会显著地影响蛋白或多肽的三维折叠或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；小的缺失，典型的是1至约30个氨基酸的缺失；以及小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基、包括最多约20-25个残基的小接头肽、或有利于纯化的小延伸(亲和标记物)，如聚组氨酸序列(tract)或蛋白A(尼尔逊(Nilsson)等人，1985，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)4：1075；尼尔逊等人，1991，酶学方法(Methods Enzymol.)198：3。通常还参见福特(Ford)等人，1991，蛋白表达纯化(Protein Expressionand Purification)2：95-107。
尽管如上所述的这些改变优选地具有微小的性质，这类改变还可以是实质性的，如均作为氨基末端或羧基末端延伸的最多达300个氨基酸或更多个氨基酸的较大的多肽的融合。
亲本枯草杆菌酶可包括SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列或其等位变体，或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在一个方面中，亲本枯草杆菌酶包括SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列，或由其组成。
亲本枯草杆菌酶可以是：(a)由与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有至少65％序列一致性的多肽；(b)由在中或高严谨度条件下与下列各项进行杂交的多核苷酸编码的多肽：(i)SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列，(ii)编码SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列；或(c)由与SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。
在一个方面中，该亲本与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列一致性为至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的一致性、或100％，它们具有蛋白酶活性。在一个方面中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有不超过10个的氨基酸是不同的，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列，或由其组成。在另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽，或由其组成。在另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至275，或由其组成。在另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:4的氨基酸1至269，或由其组成。在还有另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:6的氨基酸1至274，或由其组成。
在另一个方面中，该亲本是包含至少202个氨基酸残基的SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的片段，例如SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的从位置28至位置230。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的等位变体。
在另一个方面中，该亲本是由多核苷酸编码的，该多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中度严谨度条件、或高严谨度条件或非常高严谨度条件下与下述各项进行杂交：(i)SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列，(ii)编码SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列，(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港出版社(ColdSpring Harbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1、3或5的多核苷酸或其子序列、以及SEQ ID NO:2、4或6的多肽或其片段可被用于设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆编码来自不同属或种类的菌株的亲本的DNA。具体地说，可以使用这类探针，遵循DNA印迹程序，与感兴趣细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别并分离出其中的相应基因。这类探针可以比整个序列短很多，但长度应有至少15个核苷酸，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度是至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA探针与RNA探针两者都可以使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA，来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。合适的来自这些文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1、3、或5或其子序列杂交的克隆或DNA，将该载体材料用于DNA印迹中。
为了本发明的目的，杂交是指在非常低到非常高严谨度条件下，多核苷酸与标记的核酸探针进行杂交，该标记的核酸探针对应于下述各组：(i)SEQID NO:1、3或5；(ii)SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列；(iii)编码SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列；(iv)其全长互补序列；或(v)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在一个方面中，核酸探针是SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列。在另一个方面中，核酸探针是长度为80至1140个核苷酸的SEQ ID NO:1、3或5的片段，例如长度为90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100个核苷酸。在另一个方面中，核酸探针是编码SEQ ID NO:2、4或6的多肽的多核苷酸、其成熟多肽、或其片段。在另一方面中，核酸探针分别是SEQ ID NO:1、3或5或是编码SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列。
在另一个实施例中，亲本是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQID NO:1、3或5的成熟多核苷酸编码序列的序列一致性为至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％。
多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N末端或C末端。
该亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本发明的多肽的N-末端或C-末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，1993，EMBOJ.(欧洲分子生物学学会杂志)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，Science(科学)266:776-779)。
融合多肽可以进一步包括两个多肽之间的一个切割位点。在融合蛋白分泌之后，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(工业微生物学与生物技术杂志)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000,J.Biotechnol.(生物技术杂志)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997,Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995,Biotechnology(生物技术)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991,Biotechnology(生物技术)9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986,Biochemistry(生物化学)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995,Biotechnology(生物技术)13:982-987；卡特(Carter)等人，1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics(蛋白质:结构、功能和遗传学)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003,Drug Discovery World(世界药物发现)4:35-48。
可从任何种属的生物体中获得亲本。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由一种多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是一种细菌蛋白酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性菌多肽，如芽孢杆菌(Bacillus)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、地芽孢杆菌(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶，或是革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭菌属(Fusobacterium)、幽门螺杆菌(Helicobacter)、Ilyobacter(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。
在一个方面中，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。
在一个方面中，亲本是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)蛋白酶，例如SEQ ID NO:2的蛋白酶或其成熟多肽。在一个方面中，亲本是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)蛋白酶，例如SEQ ID NO:4的蛋白酶或其成熟多肽。在一个方面中，亲本是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)蛋白酶，例如SEQ ID NO:6的蛋白酶或其成熟多肽。
公众可容易地从众多培养物收藏单位中获得这些种类的菌种，这些培养物收藏单位例如：美国种质保存中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰国际微生物菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center，NRRL)。
可从其他来源确定并得到亲本，这些来源包括使用上述的探针从大自然(例如土壤、堆肥、水等等)中分离的微生物或从天然物质(例如土壤、堆肥、水等等)中直接得到的DNA样本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域公知的。然后可用在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中进行筛选的类似方法来得到编码亲本的多核苷酸。一旦用探针检测到编码亲本的多核苷酸，可采用本领域的普通技术人员已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如萨姆布鲁克等人，1989，同上)。
变体的制备
本发明还涉及获得具有蛋白酶活性的变体的方法，该方法包括：(a)在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个(例如若干个)位置上将改变引入亲本枯草杆菌酶，其中该变体具有蛋白酶活性；并且(b)回收该变体。
可采用本领域已知的任何诱变方法来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等等。
定点诱变是一种技术，其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或更多个定义的位点上引入一个或更多个(例如若干个)突变。
通过涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的使用的PCR可以体外实现定点诱变。还可以通过以下方式在体外进行定点诱变：涉及由一种限制性内切酶在包括编码该亲本的多核苷酸的质粒的一个位点处进行切割的盒式诱变，并且随后连接一种包含该多核苷酸中的突变的寡核苷酸。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如谢雷尔(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究，18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，Nature Biotechnol.(自然生物技术)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，Nat.Med.(自然医学)4:285-290；以及卡利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，Fungal Genet.Newslett.(真菌遗传学通讯)43:15-16。
在本发明中，可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，例如由田(Tian)等人(2004，自然432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术以及其中在光可编程的微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如瑞达尔-奥尔逊(Reidhaar-Olson)和索尔(Sauer)，1988，Science(科学，241:53-57；鲍威(Bowie)和索尔，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)，86:2152-2156；WO95/17413或WO95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及定区诱变(德比希尔(Derbyshire)等人，1986，Gene(基因)46:145；内尔(Ner)等人，1988,DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999,Nature Biotechnology(自然生物技术)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
合适的本发明还涉及包含编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短的及杂合启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于引导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的适用启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)青霉素酶基因(penP)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因(amyM)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(阿盖斯(Agaisse)和里瑞克拉斯(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13：97-107)，
大肠肝菌乳糖操纵子、大肠肝菌启动子(E.coli lac operon，E.coli trc promoter)(埃贡(Egon)等人，1988，基因杂志(Gene)69：301-315)，天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(Streptomyces coelicolor agarase gene)(dagA)，以及原核BETA-内酰胺酶基因(维拉(Villa)-卡玛诺夫(Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75：3727-3731)，以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：21-25)。在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980年科学美国人(ScientificAmerican)242：74-94的“重组细菌的有用蛋白”中，以及在萨姆布鲁克等人，1989，同上中，对另外的启动子进行了描述。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。
该控制序列还可以是转录终止子，它可被宿主细胞识别而终止转录。该终止子序列是可操作地连接到编码该变体的多核苷酸的3'端的。可以使用任何在宿主细胞中起作用的终止子。
可从克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌(Escherichia coli)核醣体RNA(rrnB)中获得用于细菌宿主细胞优选的终止子。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177：3465-3471)中得到的。
该控制序列还可以是信号肽编码区域，编码与变体的N端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’端可固有地包含信号肽编码序列，该序列可在翻译阅读框内与编码该变体的编码序列段自然连接。可替代地，编码序列的5’端可包含与对于该编码序列是外来的信号肽编码序列。如果该编码序列天然不含信号肽编码序列，就需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可简单地替换天然信号肽编码序列，用来加强变体的分泌。然而，可以使用将表达的变体引导进入宿主细胞的分泌通道中的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是可从下述各组的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌(Bacillus)NCIB11837麦芽糖淀粉酶，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)枯草杆菌蛋白酶，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BETA内酰胺酶，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)，以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，Microbiological Reviews(微生物学评论)57:109-137描述了另外的信号肽。
该控制序列还可以是对定位在变体的N端上的前肽进行编码的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。可以从下述各组的基因中获得前肽编码序列：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中性蛋白酶(nprT)，嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO95/33836)，米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶，以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α因子。
在信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入供表达的适当载体中来进行表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。
该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中不依赖该基因组而自主复制的一种或多种元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。
对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含可扩增的选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，并且由此是该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞(host cell)”包括由于在复制过程中发生突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭菌属(Fusobacterium)、幽门螺杆菌(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌(Bacillus)的细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属(Streptococcus)的细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌(Streptococcus equi)亚种兽疫链球菌(Zooepidemicus)的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属(Streptomyces)的细胞，包括但不限于产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)和变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的细胞。
可通过下述方法实现将DNA导入芽孢杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168：111-115)、感受态细胞转化(参见，例如杨格(Young)和斯皮兹曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81：823-829，或杜博楠(Dubnau)和大卫多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56：209-221)、电穿孔(参见，例如茂川(Shigekawa)和道尔，1988，生物技术(Biotechniques)6：742-751)、或结合(参见，例如凯勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169：5271-5278)。通过原生质体转化(参见例如，哈那汗(Hanahan)，1983,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔等人，1988，核酸研究16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。通过原生质体转化和电穿孔(参见例如龚(Gong)等人，2004,Folia Microbiol.(Praha)(FOLIA微生物(布拉格))49:399-405)，轭合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989,J.Bacteriol.(细菌学杂志)171:3583-3585)，或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)98:6289-6294)可以实现将DNA引入到链霉菌细胞中。通过电穿孔(参见例如，崔(Choi)等人，2006,J.Microbiol.Methods(微生物学方法杂志)64:391-397)或轭合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005,Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌细胞中。通过天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和仓光(Kuramitsu)，1981，Infect.Immun.(感染与免疫)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和朱力克(Jollick)，1991，Microbios(微生物)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)65:3800-3804)或者轭合(参见，例如，克拉维尔(Clewell)，1981，Microbiol.Rev.(微生物学评论)45:409-436)可以实现将DNA引入到链球菌细胞中。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA导入宿主细胞的任何方法。
生产方法
本发明还涉及用于生成变体的方法，该方法包括：(a)在适于该变体表达的条件下对本发明的宿主细胞进行培养；以及(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法以在适于生成变体的营养培养基中对宿主细胞进行培养。合适的例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。合适的该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。合适的合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体，以获得大致上纯的变体，这些程序包括，但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、有差别的溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如Protein Purification(蛋白纯化)，Janson(詹森)和Ryden(赖登)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。
组合物
在一个特定的方面中，与亲本酶相比、或与具有与所述的变体一致的氨基酸序列但在一个或更多个所述的指定位置上具有改变的蛋白酶相比、或与参照蛋白酶相比，根据本发明的变体具有提高的螯合剂稳定性，其中可按照此处的“材料与方法”中的实例2中所述的对对抗螯合剂的稳定性进行测定。
由此可见，在一个优选的实施例中，该组合物是一种洗涤剂组合物，并且本发明的一个方面涉及包括根据本发明的变体的洗涤剂组合物在如衣物或硬表面清洁等清洁过程的用途。
另外的组分的选择是在业内熟知的，并且包括传统的成分，包括下面说明的示例性的非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括额外的功能性。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液体0.001-100mg的蛋白，例如0.01-100mg的蛋白，优选是0.005-50mg的蛋白，更优选是0.01-25mg的蛋白，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白，最优选是0.05-5mg的蛋白，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白。
可使用传统的稳定剂来稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些稳定剂是例如多元醇，如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且可以如在例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制该组合物，或者如在WO2005/105826和WO2009/118375中所述的可使用肽醛或酮对根据本发明的变体进行稳定。
本发明的变体还可以结合到WO97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
表面活性剂
洗涤剂组合物可包括一种或更多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或两性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)，LAS的异构体，支链烷基苯磺酸盐(BABS)，苯基链烷磺酸盐，α-烯烃磺酸盐(AOS)，烯烃磺酸盐，链烯烃磺酸盐，链烷-2,3-二基双(硫酸盐)，羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐，烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，脂肪醇硫酸盐(FAS)，伯醇硫酸盐(PAS)，醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)，仲链烷磺酸盐(SAS)，石蜡烃磺酸盐(PS)，酯磺酸盐，磺化的脂肪酸甘油酯，α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括：烷基二甲基乙醇胺季铵盐(ADMEAQ)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，二甲基二硬脂基氯化铵(DSDMAC)，和烷基苄基二甲基铵，以及它们的组合，烷基季铵化合物，烷氧基化季铵(AQA)。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极化表面活性剂。半极化表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、和磺基甜菜碱，及其组合。
助水溶剂
助水溶剂是一种化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)，然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如Hodgdon(霍奇登)和Kaler(卡勒)(2007)的综述，Current Opinion in Colloid&Interface Science(胶体&界面科学新见)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集并且脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相状态、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。洗涤剂组合物中助水溶剂的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。
洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。
增效剂和助增效剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂增效剂或助增效剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，增效剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。增效剂剂和/或助增效剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何增效剂和/或助增效剂。增效剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自Hoechst(赫斯特公司)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA和2,2’,2”-次氨基三乙醇(TEA)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂助增效剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括助增效剂，或结合一种增效剂，例如沸石增效剂。助增效剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或链烯基琥珀酸。另外的特定实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)，及其组合和盐。另外的示例性增效剂和/或助增效剂描述于例如WO09/102854、US5977053中。
漂白系统
洗涤剂可包含按重量计0-10％，如约1％至约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂，光漂白剂(photobleach)，漂白活化剂，过氧化氢源(例如过碳酸钠和过硼酸钠)，预成型的过酸及其混合物。合适的适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过白啶酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单-或四-水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐，结合形成漂白活化剂的过酸。漂白活化剂在此指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。合适的有待于在此使用的合适的漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。合适的合适的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、双过氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)，和/或WO98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中，并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像Triacin(特雷森))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的增效能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中各R1独立地是含有9至24个碳原子的支链烷基或含有11至24个碳原子的直链烷基，优选地各R1独立地是含有9至18个碳原子的支链烷基或含有11至18个碳原子的直链烷基，更优选地，各R1独立地是选自于由以下各项组成的组：2-丙基庚基，2-丁基辛基，2-戊基壬基，2-己基癸基，正十二烷基，正十四烷基，正十六烷基，正十八烷基，异壬基，异癸基，异十三烷基和异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259、WO2007/087242中。合适的合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物的功能可以是如以上提到的助增效剂，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抗发泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上述特性和/或多于一种的下述主旨。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了上述聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还包括织物调色剂，如配制在洗涤剂组合物中的染料或颜料，当所述的织物与包括所述的洗涤剂组合物的清洗液相接触时，该织物调色剂会沉淀在织物上，这样会通过可见光的吸收/反射而改变所述的织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物着色剂改变表面的色彩。合适的合适的织物着色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括色素。合适的合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物着色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物着色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的合适的着色剂还披露于例如WO2007/087257、WO2007/087243中。
(另外的)酶
在一个实施例中，根据本发明的10R样变体与一种或更多种酶相组合，如至少两种酶，更优选的是至少三种、四种或五种酶。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白水解活性、淀粉分解活性、脂肪分解活性、半纤维素分解活性或果胶分解活性。
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种额外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的清洁剂相容(即最佳pH，与其他酶的和非酶的成分的相容性等)，并且这一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：合适的合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。合适的合适的纤维素酶包括从以下各项中得到的纤维素酶：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)，例如披露于US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中的由特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。
合适的尤其合适的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如描述于WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中的那些。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(Novozymes A/S(诺维信公司))、ClazinaseTM　、和Puradax HATM(Genencor International Inc.(杰能科国际公司))、以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation(花王株式会社)。
蛋白酶：
蛋白酶可以是动物源的、植物源的或微生物源的，包括化学或基因修饰的突变体。优选的是微生物源。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的，如胰蛋白酶，或是S8家族的，如枯草杆菌蛋白酶。金属蛋白酶可以例如是嗜热菌蛋白酶或是例如来自M4、M5、M7或M8家族的蛋白酶。
术语“枯草杆菌酶(subtilases)”是指丝氨酸蛋白酶亚组，根据斯艾森等人，蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737以及斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523。丝氨酸蛋白酶是蛋白酶亚组，其特征是在活性位点上具有丝氨酸，与底物形成了共价加合物。此外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征是具有远离丝氨酸的两个活性位点氨基酸残基，也就是组氨酸和天冬氨酸残基。
枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于下述各项：芽孢杆菌(Bacillus)，如枯草杆菌蛋白酶迟缓(subtilisin lentus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺沃(subtilisin Novo)，枯草杆菌蛋白酶卡尔斯贝尔格(subtilisinCarlsberg)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，枯草杆菌蛋白酶BPN’，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(如在WO89/06279中所述的)，以及蛋白酶PD138(WO93/18140)。在WO98/020115、WO01/44452、WO01/58275、WO01/58276、WO03/006602和WO04/099401中对另外的丝氨酸蛋白酶实例进行了描述。BLAP的氨基酸序列示于US5,352,604的图29中。
胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)以及镰孢属(Fusarium)蛋白酶，如在WO89/06270和WO94/25583中所述的。有用的蛋白酶的实例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述的变体，尤其是在一个或更多个下述位置上具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
金属蛋白酶的实例是中性金属蛋白酶，如在WO07/044993中所述的。
优选的可商购蛋白酶包括：AlcalaseTM，CoronaseTM，DurazymTM，EsperaseTM，EverlaseTM，KannaseTM，LiquanaseTM，Liquanase UltraTM，OvozymeTM，PolarzymeTM，PrimaseTM，RelaseTM，SavinaseTM和Savinase UltraTM，(诺维信公司(Novozymes a/s))，AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))，BLAP and BLAP X(德国汉高公司(Henkel AG&Co.KGaA))，ExcellaseTM，FN2TM，FN3TM，FN4TM，MaxacalTM，MaxapemTM，MaxataseTM，ProperaseTM，PurafastTM，PurafectTM，Purafect OxPTM，PurafectTMPrime以及PuramaxTM(杰能科国际(Genencor International，Inc.))。
脂酶和角质酶：合适的合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌的脂肪酶，例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)，如描述于EP258068和EP305216中，来自腐质霉，例如像描述于WO96/13580中的腐蚀菌(H.insolens)的角质酶，假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、斯氏假单胞菌(GB1,372,034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属株系SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(WO96/12012)，芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达特斯(Dartois)等人，1993，BiochemicaetBiophysicaActa(生物化学与生物物理学报)，1131:253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO91/16422)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、WO00/060063、WO2007/087508和WO2009/109500中的那些。
优选的可商购脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM和LipexTM；LecitaseTM、LipolexTM；LipocleanTM、LipoprimeTM(Novozymes A/S(诺维信公司))。其他可商购的脂肪酶包括Lumafast(Genencor Int Inc(杰能科国际公司))；Lipomax(Gist-Brocades公司/Genencor Int Inc(杰能科国际公司))以及来自Solvay(苏威公司)的芽孢杆菌脂肪酶。
淀粉酶：合适的合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌，例如地衣芽孢杆菌的特定株系的α-淀粉酶，更加详细地描述于GB1,296,839中。
有用的淀粉酶的实例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的变体，尤其是在以下一个或多个位置上被取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
可商购的淀粉酶是StainzymeTM，StainzymeTM Plus，NatalaseTM，DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM以及BANTM(诺维信公司(NovozymesA/S))，RapidaseTM以及PurastarTM(杰能科国际(Genencor International，Inc.))。
过氧化物酶/氧化酶：合适的合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括鬼伞属(Coprinus)的过氧化物酶，例如灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述的。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S(诺维信公司))。
这一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，如粒料、液体、浆料、等。优选的洗涤剂添加剂配制品为粒料，尤其是无尘粒料；液体，特别是稳定的液体；或浆料。
可以产生无尘粒料，例如像在US4,106,991和4,661,452中所披露的，并且可以任选地通过本领域已知方法进行包被。蜡质包被材料的实例是具有1000至20000的平均分子量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇包含从12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单和二以及三酸甘油酯。GB1483591中给出了适于通过流化床技术而应用的成膜包被材料的实例。例如，液体酶制剂可根据既定方法通过添加多元醇例如丙二醇，糖或糖醇、丙醇酸或硼酸来稳定。受保护的酶可根据EP238,216中披露的方法制备。
辅助材料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解剂(disintegrationagent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇例如丙二醇)、织物整理剂包括黏土、填充剂/加工助剂、荧光剂增白剂/光增亮剂、泡沫促进剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、和芯吸剂，单独亦或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择很好地在普通技术人员知识内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物可含有分散剂。具体地粉状洗涤剂可以包括分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中多羧酸包含至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。例如合适的分散剂描述于Powdered Detergents,Surfactant science series(粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列)71卷中，Marcel Dekker,Inc.(马塞尔·德克尔公司)。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可包括一种或更多种染料转移抑制剂。合适的合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，按组合物重量计，染料转移抑制剂可以按以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物优选的还包含可使被清洁的物品着色的另外的组分，如荧光增白剂(fluorescent whitening agent)或光增亮剂(optical brighteners)。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是Tinopal(天来宝)DMS和Tinopal(天来宝)CBS，从Ciba-Geigy AG(汽巴-嘉基股份有限公司),巴塞尔，瑞士可得。Tinopal(天来宝)DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯二磺酸的二钠盐。Tinopal(天来宝)CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的是，荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由Paramount Minerals and Chemicals(派拉蒙矿物和化学品公司)，孟买，印度供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
合适的合适的荧光增白剂水平包括从约0.01、从0.05、从约0.1或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5或甚至0.75wt％的较高水平。
去污聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可包括一种或更多种去污聚合物，其可去除织物(如棉和聚酯织物)上的污渍，尤其是可去除聚酯织物上的疏水污渍。这些去污聚合物可例如是非离子或阴离子对苯二酸酯聚合物、聚己内酰胺及相关的共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如在粉末状洗涤剂、表面活性剂科学系列(Powdered Detergents，Surfactant scienceseries)第71卷中，第7章，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)所述的。另一种类型的去污聚合物是包括芯结构和连接到那个芯结构的多个烷氧基化基团的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物。该芯结构可包括聚亚烷基亚胺结构或烷醇胺结构，详见在WO2009/087523中所述的(通过引用结合于此)。此外，无规接枝共聚物是合适的去污聚合物。合适的接枝共聚物详见在WO2007/138054，WO2006/108856和WO2006/113314中所述的(通过引用结合于此)。其他去污聚合物包括取代多糖结构，尤其是取代纤维素结构，如改性纤维素衍生物，如在EP1867808或WO2003/040279中所述的(均通过引用结合于此)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、以及它们的混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、两性离子改性的纤维素、以及它们的混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、以及它们的混合物。
抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可包括一种或更多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、以及乙氧基化聚乙烯亚胺。如上所述的去污聚合物下的纤维素基聚合物也可以用作抗再沉积剂。
其他合适的辅助材料包括但不限于抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、超氧化物歧化酶抑制剂、溶剂、和用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物还可以是任何方便的形式，例如条棒、均匀片剂、具有两层或更多层的片剂、常规的或紧密的粉末剂、颗粒剂、糊剂、凝胶、或者常规的、紧密的或浓缩的液体。
洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器剂量单位的形式。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性薄膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是高分子材料，优选被制成薄膜或薄片的形式的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及,羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜可以是共混物组合物，该共混物组合物包括水可降解的并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由Gary,Ind.，US(盖里，印第安纳州，美国)的Chris Craft In.Prod.(克里斯克拉夫特工业产品公司)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考：(US2009/0011970A1)
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解特性曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。其他类型的液体，包括但不局限于链烷醇、胺、二醇、醚和多元醇，可以包含在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
颗粒洗涤剂配制品
进行配制如描述于WO09/092699、EP1705241、EP1382668、WO07/001262、US6472364、WO04/074419或WO09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品进行配制描述于以下各项中：WO09/124162、WO09/124163、WO09/117340、WO09/117341、WO09/117342、WO09/072069、WO09/063355、WO09/132870、WO09/121757、WO09/112296、WO09/112298、WO09/103822、WO09/087033、WO09/050026、WO09/047125、WO09/047126、WO09/047127、WO09/047128、WO09/021784、WO09/010375、WO09/000605、WO09/122125、WO09/095645、WO09/040544、WO09/040545、WO09/024780、WO09/004295、WO09/004294、WO09/121725、WO09/115391、WO09/115392、WO09/074398、WO09/074403、WO09/068501、WO09/065770、WO09/021813、WO09/030632和WO09/015951。
WO2011025615、WO2011016958、WO2011005803、WO2011005623、WO2011005730、WO2011005844、WO2011005904、WO2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO2011005905、WO2011005910、WO2011005813、WO2010135238、WO2010120863、WO2010108002、WO2010111365、WO2010108000、WO2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO2010033746、WO2010033747、WO2010033897、WO2010033979、WO2010030540、WO2010030541、WO2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO2010024470、WO2010025161、WO2010014395、WO2010044905、
WO2010145887、WO2010142503、WO2010122051、WO2010102861、WO2010099997、WO2010084039、WO2010076292、WO2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO2010057784、WO2010054986、WO2010018043、WO2010003783、WO2010003792、
WO2011023716、WO2010142539、WO2010118959、WO2010115813、WO2010105942、WO2010105961、WO2010105962、WO2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO2010072456、WO2010069905、WO2010076165、WO2010072603、WO2010066486、WO2010066631、WO2010066632、WO2010063689、WO2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO2010000636。
用途
本发明还针对根据本发明的变体或其组合物在纺织品或织物洗衣中的使用方法，如居家衣物清洗和工业衣物清洗。
本发明还针对根据本发明的变体或其组合物在硬表面清洁中的使用方法，如自动餐具清洗(ADW)、洗车、以及工业表面清洁。
可以将本发明的枯草杆菌酶变体加入到洗涤剂组合物中，并由此成为洗涤剂组合物的组分。由此可见，本发明的一个方面涉及洗涤剂组合物的用途，该组合物包括：一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的区域中的两个或更多个氨基酸的改变，其中该改变是取代或插入，并且其中在清洁过程中，如在洗衣和/或硬表面清洁过程中，该变体与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有至少60％的一致性。另一个方面涉及洗涤剂组合物的用途，该组合物包括：一种变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入一个或更多个氨基酸，并且进一步地包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的位置上的一个或更多个取代，其中该变体与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列一致性是至少60％，如至少65％，如至少70％，例如其与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列一致性是至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性，但低于100％。
本发明的一个实施例涉及蛋白酶变体的用途，包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中插入一个或更多个氨基酸，并且进一步地包括在对应于位置75、76、77、78、79和82的位置上的一个或更多个取代，其中在清洁过程中，如在洗衣和/或硬表面清洁过程中，该变体与SEQID NO:2、4或6的成熟多肽的序列一致性是至少60％，如至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性，但低于100％，其中当在实例2中如在“材料与方法”中所述的进行检验时，相对于亲本、相对于具有与所述的变体一致的氨基酸序列但在一个或更多个所述的指定位置上具有改变的蛋白酶、或相对于参照蛋白酶，该变体具有提高的螯合剂稳定性。
洗涤剂组合物可根据本发明进行配制，例如制成手洗或机洗的洗涤剂组合物，该组合物包括适用于沾污织物的预处理的洗衣添加剂组合物以及加入漂洗的织物柔软剂组合物，或制成用于普通家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或被制成手洗或机洗餐具清洗操作的洗涤剂组合物。
在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括在此所述的本发明的多肽的。
清洁过程或纺织品保养过程可以例如是一种洗衣过程、餐具清洗过程、或硬质表面的清洁过程，如瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽、洗手盆和手术器械的清洁过程。洗衣过程可以例如是家居洗衣过程，但它还可能是工业洗衣过程。此外，本发明涉及织物和/或服装的洗衣过程，其中该过程包括用含有洗涤剂组合物和本发明的至少一种蛋白酶变体的清洗溶液对织物进行处理。清洁过程或纺织品保养过程可以例如在机器清洗过程中或在手动清洗过程中进行。该清洗溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水性清洗溶液。
经受本发明的清洗、清洁或纺织品保养过程的织物和/或服装可以是常规耐洗的衣物，例如家居的衣物。优选地，衣物的主要部分是服装和织物，包括针织、梭织、牛仔布、无纺布、毛毡、纱线和毛巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素制品，包括棉、亚麻(flax)、亚麻布(linen)、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维、或人造纤维素制品(例如来源于木浆)，包括粘胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(tricell)、莱赛尔纤维或它们的共混物。这些织物也可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、开司米、马海毛、兔毛和蚕丝，或合成聚合物、如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和弹性纤维/氨纶、或它们的共混物，以及纤维素类纤维和非纤维素类纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/粘胶与下述一种或多种伴随材料的共混物，如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳纶纤维)、以及含纤维素纤维(例如人造丝/粘胶、苎麻、亚麻(flax)、亚麻布(linen)、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔)。
最近几年以来，出现了越来越大的兴趣在洗涤剂中用如酶和多肽等可再生的生物组分来替换来源于石油化工产品的组分而不危害洗涤性能。
本发明还涉及本发明的枯草杆菌酶变体在蛋白质污渍去除的过程中的用途。蛋白质类污渍可能是如食品污渍等污渍，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、奶、墨水、草、或它们的组合。
典型的洗涤剂组合物除了酶以外包括多种组分，这些组分具有不同作用，一些组分如表面活性剂在洗涤剂中降低表面张力，使得要被清洁的污渍可被提升并分散，然后可被洗去，其他组分如漂白系统往往通过氧化进行褪色，并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，并用于消毒和灭菌。还有如助洗剂和螯合剂等其他组分可通过除去液体中的金属离子而使洗涤水软化。
在一个具体的实施例中，本发明涉及包括本发明的蛋白酶变体的组合物的用途，其中所述的酶组合物在衣物清洗或餐具清洗中进一步地包括以下各项中的至少一种或更多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合剂(chelating agent)、漂白剂系统或漂白剂组分。
在本发明的一个优选的实施例中，与不加入本发明的蛋白酶变体的表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合剂(chelating agent)、漂白剂系统和/或漂白剂成分的用量相比，表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合剂(chelating agent)、漂白剂系统和/或漂白剂组分的用量降低了。优选地，与不加入本发明的蛋白酶变体的系统中的组分的用量相比，如与此类组分的传统用量相比，至少一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合剂(chelating agent)、漂白剂系统和/或漂白剂组分的用量减少了至少1％、如至少2％、如至少3％、如至少4％、如至少5％、如至少6％、如至少7％、如至少8％、如至少9％、如至少10％、如至少15％、如至少20％、如至少25％、如至少30％、如至少35％、如至少40％、如至少45％、如至少50％。在一个方面中，在洗涤剂组合物中使用本发明的蛋白酶变体，其中所述的组合物不含以下各项中的至少一种组分：表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合剂(chelating agent)、漂白剂系统或漂白剂组分、和/或聚合物。
以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料和方法
常规分子生物学方法：
除非特别指明，DNA操作和转化利用分子生物学的标准方法进行(萨姆布鲁克等人(1989)；奥苏贝尔(Ausubel)等人(1995)；哈伍德(Harwood)与卡廷(Cutting)(1990)。
蛋白酶测定：
1)Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM丁二酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mMCABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、以及11.0。
20μl蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀释)与100μl测定缓冲液混合。通过加入100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的升高，作为蛋白酶活性的测量结果。
2)蛋白酶高灵敏(Protazyme AK)测定：
底物：蛋白酶高灵敏(Protazyme AK)片(交联的染色酪蛋白；来自于麦格酶公司(Megazyme))
温度：37℃(或设定为其他测定温度)。
测定缓冲液：100mM丁二酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mMCABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH6.5或pH7.0。
将一片蛋白酶高灵敏(Protazyme AK)轻轻搅拌悬浮在2.0ml0.01％TritonX-100中。将500μl的此悬浮液和500μl测定缓冲液分散在微量离心管中，并放在冰上。将20μl蛋白酶溶液(在0.01％Triton X-100中稀释)加入到该冰冷却的混合物中。通过将试管转移到恒温37℃混匀仪上并高速(1400rpm)振荡，开始进行测定。15分钟之后，将试管放回冰浴中。将混合物在冰冷离心机中离心几分钟以除去未反应的底物，并且将200μl上清液转移至微量滴定板上。测定上清液在650nm的吸光度。用20μl0.01％Triton X-100代替样品中的蛋白酶溶液，平行测定，并且从蛋白酶样品测量值中减去它的值。
活性位点滴定(AST)
实验装置：
活性缓冲液：100mM Tris-HCl、0.0225％Brij35，pH8.6
抑制剂原液：2.0*10-4M糜蛋白酶抑制剂-2(CI-2)(还可使用其他枯草杆菌蛋白酶抑制剂进行活性位点滴定)
底物原液：溶解在DMSO底物溶液中的100mg/mL Suc-AAPF-pNA：将原液在Tris缓冲液中稀释至1.0mg/mL
制备各变体的稀释液，加入到96孔微滴定板的两个相邻的行中(1+2、3+4等等)，而这两行的抑制剂溶液的浓度是不同的。通常两行中第二行的抑制剂的稀释要高1.5倍，用来覆盖更广泛的浓度范围。与赛威蛋白酶(Savinase)变体一起使用的抑制剂是糜蛋白酶抑制剂2，已知其与赛威蛋白酶(Savinase)紧密结合，抑制常数是Ki<10-10M。在初始振荡之后，将板在室温下孵育1小时，用以确保抑制剂结合的完全平衡。孵育之后，在各孔中加入30μL底物溶液，并且立即振荡后，在分光光度计(分子设备光谱马克思加(MolecularDevices Spectra Max Plus)384)上每隔10秒测定一次吸光度，持续3分钟。为了能够计算浓度，A或B行中的酶必须完全灭活。因为各孔中的抑制剂的浓度是已知的，假设CI-2抑制剂与蛋白酶的结合率是1:1，酶的逐步抑制使得可能对变体的浓度进行估算。
活性位点滴定的一般原理见科泽(Kézdy)和凯瑟(Kaiser)-酶学方法(Methods in Enzymology)第19卷，1970，pp3-20。
螯合剂稳定性测定
使用下述溶液对样品进行制备：
Tris缓冲液：100mM Tris-HCl、0.045％Brij-35，pH8
EDTA原液：100mM EDTA，在milli-Q水中
对于蛋白酶活性测定：
活性缓冲液：100mM Tris-HCl、0.0225％Brij35，pH8.6
底物原液：100mg/mL Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，溶解在DMSO中
底物溶液：将原液在活性缓冲液中稀释至0.5mg/mL，pH8.6
如上所述，用糜蛋白酶抑制剂2a作为抑制剂使用活性位点滴定来确定微纯化的变体的浓度。
为了确保具有不同孵育时间的板是一致的，在含有各微纯化变体的96孔微滴定板中制备母板，并制备作为参照的赛威蛋白酶(Savinase)(SEQ ID NO:4的成熟多肽)。使用Tris缓冲液(pH8)将变体稀释至各孔中的总浓度为2.5ppm。对各变体用四种EDTA浓度进行制备：0、25、35和50mM，各孔的总体积是100μL。所有实验均制备三份，全程将样品置于冰上。从各母板转移30μL至两个不同的96孔板，一个板用于无应力的样品的活性测定，另一块板用于在50℃下孵育指定的时间。为了进行活性测定，将2.5μL样品转移到384孔板上，并与7.5μL缓冲液混合。通过快速分配装置(Thermo MULTIDROP384)加入40μL底物溶液，并且测定吸光度之前将板立即混合，用分光光度计(珀金埃尔默En视觉阅读器(PerkinElmer En Vision Reader))对384板在405nm处测定吸光度，每60秒测定一次，持续20分钟。通过吸光曲线的线性部分的线性回归，对最大速度以及由此酶的活性进行估算。使用加热块(聚合酶链反应周期计PCR块，BIORAD C1000热取样器)进行温度孵育。选择PCR块来降低可能的边缘效应。在插入样品之前将块预加热至50℃。10分钟孵育之后，将样品从PCR块上取下，如上所述对残留活性进行测定。
实例1：枯草杆菌酶变体的制备和纯化
变体的制备和表达
在本研究中使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的衍生物(孔斯特(F.Kunst)等人，“革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组全序列”自然(Nature)390(6657)：249-256(1997))。如前所述进行枯草芽孢杆菌(B.subtilis)转化(阿纳格诺斯托普洛斯(Anagnostopolous，C.)，和斯皮宰曾(J.Spizizen).1961“枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转化的要求”细菌学杂志(J.Bacteriol.)81：741-746)。所有常规的分子生物学程序都是按照由萨姆布鲁克等人所述的方案(1989)进行的。
变体的发酵
可以通过本领域公知的或如下的方法来进行发酵。将具有相关表达质粒的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌种在含有2％脱脂牛奶和9ug/ml氯霉素的LB(卢里亚贝尔塔尼(Luria Bertani))琼脂板上进行平板划线分离(萨姆布鲁克等人(1989))，并且在33℃生长过夜。来自各板的单克隆接种在10mL24孔微孔板(沃特曼公司(Whatman Ltd.))中的、含有6ug/ml氯霉素的3mL芽孢杆菌生长培养基(TB-Gly生长培养基)，并在30℃和220rpm下孵育4天。TB-Gly生长培养基由以下各项组成：13,3g/L胰蛋白胨，26,6g/L酵母提取液，0,44v/v％甘油，调节至pH7。通过在2500rpm下离心10分钟从发酵液中除去细胞和其它不溶物，并且收集上清液用于微纯化。
纯化
下述溶液用于微纯化：
结合缓冲液：0.5M CHES，25mM硼酸钠，10mM CaCl2，pH10.0
清洗缓冲液A：0.1M CHES，25mM硼酸钠，2mM CaCl2，pH9.5
清洗缓冲液B：25mM Tris，25mM硼酸钠，2mM CaCl2，pH9.5
清洗缓冲液C：10mM Tris，25mM硼酸钠，2mM CaCl2，pH9.5
洗脱缓冲液：50mM醋酸钠，2mMCaCl2，pH4.8
储存缓冲液：0.5M Mes，pH7.0
再生缓冲液：0.1M柠檬酸，pH3.5
微纯化是基于使用的色谱分离材料(巯基乙基吡啶(MEP)-HyperCel，来自颇尔公司(Pall公司))的疏水性相互作用。向96孔沃特曼尤尼过滤器(Whatman Unifilter)800μL滤板(沃特曼公司)的各孔中加入100μl的MEPHyperCel层析介质浆料(生物色谱公司(BioSepra)，悬浮在1M NaCl、20％EtOH中，约70-75％v/v)。真空除去液体(沃特曼公司，UNIVAC3)，并将MEP HyperCel用200μl的清洗缓冲液A在室温下洗涤两次，每次10分钟。各个步骤之后真空除去所使用的清洗缓冲液。在最初的清洗步骤之后，在各孔中加入100μl结合缓冲液。此外，在各孔中加入400μl变体发酵液的上清液。如前所述收集上清液。为了使得蛋白酶变体结合到MEP HyperCell上，将过滤板在室温下振摇孵育1小时(海道夫公司(Heidolph)，Titramax101,1200rpm)，用以搅起MEP HyperCell分子用于最佳结合。真空除去并且收集细胞和未结合的材料，以测量非结合活性，与含有微纯化蛋白的上清液中的活性相比较。在结合步骤之后执行下面的清洗步骤。用清洗缓冲液A清洗层析介质一次，用清洗缓冲液B清洗两次并且用清洗缓冲液C清洗两次。在每次清洗步骤中，加入200μl清洗缓冲液，并且将板在室温下振摇孵育10分钟。在各个步骤中，在孵育之后真空除去清洗缓冲液。为了将蛋白酶变体从柱上释放出来，在各孔中加入200μl洗脱缓冲液。将滤板(尤尼过滤器(UNIFILTER))在室温下振摇孵育10分钟后，将结合的变体从MEP-HyperCel上释放并进入溶液中。将含有蛋白酶变体的洗脱缓冲液真空转移到含有100μl储存缓冲液的96孔板中。向板中加入另外的200μl洗脱缓冲液以重复洗脱步骤。在孵育10分钟之后，将这些洗脱蛋白与第一次洗脱的洗脱蛋白进行合并。在-18℃储存微纯化的变体。
实例2：测试枯草杆菌酶变体
表1
如螯合剂稳定性测定项下的材料与方法中所述，在50℃、pH8、有或没有EDTA存在条件下孵育10分钟之后，对各变体检测Suc-AAPF-pNA底物的残留活性。以升高的EDTA浓度下的活性除以未添加EDTA的活性，对各变体计算其残留活性。将10分钟之后的无EDTA的残留活性百分数设为100％，用于参照酶(SEQ ID NO:4的成熟多肽)和变体。
如表1所示，参照酶在三种EDTA浓度25、35和50中都是不稳定的。直到增加至25mM，这些变体仅受到EDTA的轻微影响，并且到35mMEDTA，所有变体具有显著较高的活性。由此可见，当与参照蛋白酶(对应于SEQ ID NO:4的氨基酸1至269的SEQ ID NO:4的成熟多肽)，所有变体在含有EDTA的溶液中均具有升高的稳定性。
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (35)

1.一种枯草杆菌酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上的改变，其中各改变独立地是取代或插入，并且其中该变体具有蛋白酶活性。
2.如权利要求1所述的变体，其中至少一个改变是插入。
3.如权利要求1或2所述的变体，其中至少一个改变是取代。
4.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体包括在位置75与82之间的两个另外的氨基酸。
5.如权利要求4所述的变体，其中所述变体包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中的两个另外的氨基酸残基，借此所述的另外的氨基酸残基对应于在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75至82的区域中的两个氨基酸残基的插入，其中所述的被插入的氨基酸残基是选自于由以下各项组成的组：Gly或Asp，并且其中所述的区域延伸了两个氨基酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，该变体与亲本蛋白酶的氨基酸序列的序列一致性是至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是低于100％，其中所述的亲本是选自于由SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽所组成的蛋白酶的组。
7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，其中该变体是由150至350个氨基酸组成的，例如175至330、200至310、220至300、240至290、260至280、270至275个氨基酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，其中改变的个数是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75的位置上的改变。
10.如权利要求9所述的变体，其中该改变是一种采用Asp或His的取代。
11.如权利要求1-10中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置76的位置上的改变。
12.如权利要求11所述的变体，其中该改变是采用Ser、Asp或Tyr的取代。
13.如权利要求1-12中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置77的位置上的改变。
14.如权利要求13所述的变体，其中该改变是采用Asp的取代。
15.如权利要求1-14中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置78的位置上的改变。
16.如权利要求15所述的变体，其中该改变是采用Gly或Gln的取代。
17.如权利要求1-16中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置79的位置上的改变。
18.如权利要求17所述的变体，其中该改变是采用Ala、Thr或Gln的取代。
19.如权利要求1-18中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置82的位置上的改变。
20.如权利要求19所述的变体，其中该改变是采用Tyr的取代。
21.如权利要求1-20中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82中的任何位置的三个位置上的改变。
22.如权利要求1-20中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的四个位置上的改变。
23.如权利要求1-20中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的五个位置上的改变。
24.如权利要求1-20中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的各位置上的改变。
25.如权利要求1-24中任一项所述的变体，该变体包括一个或更多个取代，该一个或更多个取代选自于由以下各项组成的组：L75H、N76S、N77D、S78G、I79Q和L82Y。
26.如权利要求1-25中任一项所述的变体，该变体包括任何下述另外的取代：Y167A、R170S、A191N、N261D、L262Q。
27.如权利要求1-26中任一项所述的变体，与该亲本相比，或与一种参照蛋白酶相比，该变体具有提高的螯合剂稳定性。
28.一种组合物，该组合物包括权利要求1-27中任一项所述的变体。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中该组合物是一种清洁和/或一种洗涤剂组合物。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的变体用于一种清洁过程的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其中该清洁过程是洗衣。
32.根据权利要求31所述的用途，其中该清洁过程是硬表面清洁，如餐具清洗。
33.一种获得枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置75、76、77、78、79和82的两个或更多个位置上将改变引入亲本枯草杆菌酶，其中该改变独立地是取代或插入；回收该变体并且检验所述的变体是否具有蛋白酶活性。
34.如权利要求33所述的方法，其中该变体是选自于由以下各项组成的组的一种亲本枯草杆菌酶的一种变体：
a.与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；
b.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与下述各项进行杂交：(i)SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列；
c.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、3或5的成熟多肽编码序列具有至少60％的一致性，或其cDNA序列；以及
d.SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
35.如权利要求34所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:2、4或6的成熟多肽的序列一致性是至少60％，例如至少65％，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
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