CN109715792A - 枯草杆菌酶变体和对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

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CN109715792A CN201780032478.4A CN201780032478A CN109715792A CN 109715792 A CN109715792 A CN 109715792A CN 201780032478 A CN201780032478 A CN 201780032478A CN 109715792 A CN109715792 A CN 109715792A
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L.L.H.克里斯滕森
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P.K.汉森
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
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Abstract

本发明涉及适用于例如清洁或洗涤剂组合物，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物的枯草杆菌酶变体。本发明还涉及编码这些变体、表达载体、宿主细胞的分离的DNA序列，和用于产生和使用本发明变体的方法。这些变体表现出改进的稳定性。

Description

枯草杆菌酶变体和对其进行编码的多核苷酸
序列表的引用
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背景技术
技术领域
本发明涉及适用于例如清洁或洗涤剂组合物，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物的枯草杆菌酶变体。本发明还涉及编码这些变体、表达载体、宿主细胞的分离的DNA序列，和用于产生和使用本发明变体的方法。
相关领域说明
在洗涤剂工业中，酶已经在洗涤配制品中实施了几十年。此类配制品中使用的酶包含淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露糖苷酶和蛋白酶，以及其他酶或其混合物。商业上，最重要的酶是蛋白酶。
越来越多的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体Liquanase 和(诺维信公司(Novozymes A/S))、Purafect 和(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))。另外，本领域描述了许多蛋白酶变体，如WO 91/00345(诺维信公司)和WO 94/23053(诺维信公司)描述了例如在位置262处的突变。这些变体适用于例如清洁或洗涤剂组合物。
已经描述了许多有用的枯草杆菌酶变体，其中许多变体提供了在不同的洗涤剂中的改进的活性、稳定性和溶解性。
然而，各种因素使得蛋白酶的进一步改进是有利的。洗涤条件(如温度和pH)随时间而变化，并且在常规洗涤条件下许多污渍仍然难以完全去除。另外，洗涤中条件可导致酶的失活(由于例如pH、温度或螯合不稳定性)，从而导致洗涤周期期间洗涤性能的丧失。因此，尽管在蛋白酶开发上进行了密集研究，对相比于亲本蛋白酶具有改进的稳定性，特别是改进的洗涤中稳定性和/或储存稳定性，以及优选地相似的或改进的洗涤性能的新的且改进的蛋白酶仍存在需求。
发明内容
本发明涉及具有蛋白酶活性并且包含一组两个或更多个取代的枯草杆菌酶变体，这些取代选自X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
本发明进一步涉及具有蛋白酶活性并且包含取代X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]的枯草杆菌酶变体，其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
本发明进一步涉及具有蛋白酶活性并且包含一组两个或更多个取代的枯草杆菌酶变体，这些取代选自X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和
(ii)SEQ ID NO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S,D]、X260[T,A,E]、X261[N,W]；
其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：(d)该变体具有>100的半衰期改进因子；
(e)该变体具有大于70℃的解链温度(Tm)；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
本发明进一步涉及包含一组取代的枯草杆菌酶变体：X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和
(ii)SEQ ID NO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]；
其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：(d)该变体具有>100的半衰期改进因子；
(e)该变体具有大于70℃的解链温度(Tm)；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
本发明进一步涉及包含取代X262E+X209W+X205I的枯草杆菌酶变体，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；
(b)该变体具有蛋白酶活性；
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1和2；
(d)该变体具有比亲本多肽的解链温度高至少5℃的解链温度；并且
(e)该变体具有>100的半衰期改进因子。
本发明进一步涉及编码枯草杆菌酶变体的多核苷酸；组合物，优选地包含枯草杆菌酶变体的洗涤剂组合物；该组合物在清洁过程中的用途和用于获得枯草杆菌酶变体和用于从表面去除污渍的方法。
本发明进一步涉及具有蛋白酶活性并且与亲本枯草杆菌酶相比，包含选自下组的两个或更多个取代的枯草杆菌酶变体，该组由以下组成：
(i)X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]和X262[E]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:1具有至少65％的序列同一性，并且其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；或
(ii)X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]和X262[E]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:2具有至少65％的序列同一性，并且其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
附图说明
图1是枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:1)和枯草杆菌蛋白酶BPN'(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的比对，使用尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)。
定义
术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。
术语“编码序列”意指直接指定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
术语“洗涤剂组分”在本文中定义为意指可用于洗涤剂组合物中的化学物质的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、水溶助长剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。洗涤剂组合物可以包含一种或多种任何类型的洗涤剂组分。
除非另有指明，术语“洗涤剂组合物”包括所有形式的洗涤剂组合物，如凝胶、颗粒、液体、糊剂、粉末、喷雾或片剂组合物，包括重垢型液体(HDL)、精细织物液体洗涤剂、液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，例如玻璃、木材、陶瓷和金属柜台面(counter tops)和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；纺织品与衣物预除斑剂(pre-spotters)以及餐具洗涤剂，如手洗餐具洗涤剂、轻垢型餐具洗涤剂、机洗餐具洗涤剂；通用或重垢型洗涤剂、液体、凝胶或糊状形式的通用洗涤剂、液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌性手洗型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、轿车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理型。
除含有本发明的枯草杆菌酶变体外，洗涤剂配制品还可以含有一种或多种另外的酶(如淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(如，内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过氧合酶(haloperoxygenase)、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂合酶、过氧物酶、蛋白酶、黄原胶酶和木葡聚糖酶或其任何混合物)，和/或组分如表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂及荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。
术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如通过手洗或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于清洁所有形式的餐具，如盘子、杯子、玻璃杯、碗、所有形式的刀叉餐具(如匙、刀、叉)和上菜用具以及陶瓷、塑料(如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不限于任何特定类型的餐具洗涤组合物或任何特定的洗涤剂。
术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该DNA分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
术语“硬表面清洁”在本文中定义为硬表面的清洁，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体(如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤))的表面。
术语“宿主细胞”意指易于用包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
术语“改进的特性”意指与亲本枯草杆菌酶相比有所改进的一种枯草杆菌酶变体相关的特征。这种改进的特性包括但不限于洗涤性能、蛋白酶活性、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改进的表面特性、底物特异性、产物特异性、增加的稳定性、在储存条件下改进的稳定性和化学稳定性。
术语“稳定性”包括储存稳定性和使用期间(例如在洗涤过程中)的稳定性，并且反映根据本发明的枯草杆菌酶变体作为时间的函数的稳定性，例如，当枯草杆菌酶变体保持在溶液中(特别是在洗涤剂溶液中)时保留多少活性。稳定性受许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂、表面活性剂等的量。术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在本文中定义为相对于亲本枯草杆菌酶的稳定性在溶液中显示出增加的稳定性的变体枯草杆菌酶。术语“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改进的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”。
术语“改进的化学稳定性”在本文中定义为变体枯草杆菌蛋白酶在一种或多种天然存在的或合成的、降低亲本酶的酶活性的化学物质存在下孵育一段时间后显示保留酶活性。改进的化学稳定性还可导致变体在这些化学物质存在下更能催化反应。在本发明的一个具体方面，改进的化学稳定性是在洗涤剂中(特别是在液体洗涤剂中)的改进的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”具体是当本发明的枯草杆菌酶变体混入液体洗涤剂配制品并且然后在15℃和50℃之间的温度下(例如，20℃、30℃或40℃)储存时蛋白酶活性的改进的稳定性。
术语“改进的热活性”意指变体在特定温度下相对于亲本的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。热活性值提供了变体在一定温度范围内增强水解反应的催化的效率的量度。更具热活性的变体将导致通过酶组合物增强底物水解速率的增加，从而减少所需的时间和/或减少活性所需的酶浓度。可替代地，具有降低的热活性的变体将在比由亲本的温度依赖活性曲线定义的亲本的最佳温度更低的温度下提高酶促反应。
术语“改进的洗涤性能”在本文中定义为根据本发明的枯草杆菌酶变体，其相对于亲本蛋白酶的洗涤性能显示出改进的洗涤性能，例如通过增加的污渍去除。术语“洗涤性能”包括在衣物中的洗涤性能，但也包括例如在餐具洗涤中。洗涤性能可以如在本文描述的“洗涤性能”的定义下进行定量。
术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关的一种或多种或全部天然存在的组分中去除的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
术语“洗衣”涉及家庭洗衣和工业洗衣，并且意指一种用含有本发明洗涤剂组合物的溶液处理纺织品和/或织物的过程。洗衣过程可以例如使用例如家庭或工业洗衣机进行，或者可以手动进行。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化、自催化活化等之后处于其最终形式的多肽。成熟多肽可以例如是具有SEQ ID NO:1的氨基酸1至269或SEQ ID NO:2的氨基酸1至275的多肽的变体。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，并且该核酸分子包含一个或多个控制序列。
术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
术语“亲本”意指对其进行改变以产生本发明酶变体的蛋白酶。应理解，在本发明上下文中，表达“具有相同的氨基酸序列”是指100％的序列同一性。在一个具体实施例中，该亲本是与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的多肽(例如SEQ ID NO:1或2的多肽)具有至少60％同一性，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的蛋白酶。
术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一个)。EC编号参考来自NC-IUBMB的Enzyme Nomenclature 1992[1992年酶命名法]，Academic Press[学术出版社]，圣地亚哥，加利福尼亚州，分别包括在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，1223:1-5(1994)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，232:1-6(1995)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，237:1-5(1996)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，250:1-6(1997)；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊]，264:610-650(1999)中出版的增刊1-5。洗涤剂工业中最广泛使用的蛋白酶如用于衣物和餐具洗涤是丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶，它们是蛋白酶的亚组，其特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸。另外，枯草杆菌酶(和丝氨酸蛋白酶)的特征在于具有除丝氨酸外的两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸残基和天冬氨酸残基。根据Siezen等人，1991,Protein Engng[蛋白质工程]4:719-737和Siezen等人，1997,ProteinScience[蛋白质科学]6:501-523，枯草杆菌酶是指丝氨酸蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可分为6个亚支，即枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。适用于洗涤剂的蛋白酶主要是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干种蛋白酶活性类型：三种主要活性类型是：胰蛋白酶样，其中在P1处的Arg或Lys之后存在酰胺底物的裂解，胰凝乳蛋白酶样，其中在P1处的一个疏水性氨基酸之后发生裂解，和弹性蛋白酶样，其中在P1处的Ala之后发生裂解。出于本发明的目的，根据Suc-AAPF-pNA活性测定确定蛋白酶活性，如下文的材料和方法部分所述。在一方面，本发明的枯草杆菌酶变体具有亲本酶的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。在一个具体方面，本发明的枯草杆菌酶变体具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的酶活性。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：
(相同残基x 100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。
不同的严格性条件定义如下。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用1X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用1x SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用0.5X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用0.3X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用0.15X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“基本上纯的变体”意指按重量计含有最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该基本上纯的变体天然或重组相关的其他多肽物质的制剂。优选地，该变体按在制剂中存在的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的变体优选地处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该变体来实现。
术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因程化多肽生产系统内的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸含有按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该基本上纯的多核苷酸天然或重组相关的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的，至少94％纯的，至少95％纯的，至少96％纯的，至少97％纯的，至少98％纯的，至少99％纯的，以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。
术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料的任何纺织品材料，连同由这些材料制成的织物，如服装、衣服和其他物品。当使用术语织物或衣服时，旨在还包括广义术语纺织品。
术语“转化的半衰期改进因子与Δ解链温度的比率(R)”意指根据式I计算的比率：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)(例如，其中亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)。本文符号“x”意指乘法，并且与符号“·”是可互换的。计算半衰期改进因子的优选方法在本文实例4中描述。计算“转化的半衰期改进因子与Δ解链温度的比率(R)”的优选方法在本文实例9中描述。R的非限制性实例包括大于-3的R(R>-3)，大于0的R(R>0)，大于0.5的R(R>0.5)，大于1.0的R(R>1.0)，大于1.5的R(R>1.5)。
术语“解链温度”与术语“热变性温度”是可互换的，其具有常规含义，例如，其意指在加热多肽溶液后获得的热分析图(Cp对T)中的变性峰(主要吸热峰)的顶部。测量解链温度的优选方法在本文实例9中描述。
术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在三个或更多个位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸。术语“枯草杆菌酶变体”意指枯草杆菌酶亲本的变体，即枯草杆菌酶变体是与亲本枯草杆菌酶相比在三个或更多个位置处包含改变，即取代、插入和/或缺失的枯草杆菌酶。
术语“洗涤性能”用作酶在洗涤过程(如衣物或硬表面清洁)中去除待清洁的物体上存在的污渍的能力。如实例3中所述，可通过计算AMSA测定中定义的所谓的强度值(Int)将洗涤性能的改进定量。
术语“野生型枯草杆菌酶”意指由天然存在的生物体(如自然界中发现的细菌、古细菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的蛋白酶。野生型枯草杆菌酶的实例是枯草杆菌蛋白酶BPN'，即SEQ ID NO:2的氨基酸1-275。
变体命名规则
出于本发明的目的，使用枯草杆菌蛋白酶BPN'(SEQ ID NO:2的氨基酸1-275的序列(Siezen等人，1991，Protein Eng.[蛋白质工程]4:719-737))来确定另一种蛋白酶中对应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中所披露的多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种蛋白酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于：MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar，2004，Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma，2002，核酸研究30:3059-3066；Katoh等人，2005，核酸研究33:511-518；Katoh和Toh，2007，Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人，2009，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离，使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson，2000，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可以使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones，1999，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones，2003，Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander，1998，Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park，2000，Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体时，为了便于参考，采用下文描述的命名法。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、经取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和411处分别将甘氨酸(G)取代为精氨酸(R)，并且将丝氨酸(S)取代为苯丙氨酸(F)。位置前的“X”意指在该位置处的任何原始氨基酸可以被取代。例如，X9E意指除E外的在位置9处的任何氨基酸残基被E取代；X206L意指除L外的在位置206处的任何氨基酸残基被L取代；并且X262E意指除E外的在位置262处的任何氨基酸残基被E取代。
缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原有氨基酸、位置、*。因此，缺失在位置195处的甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分隔，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入：在G195后插入另外的氨基酸残基(例如赖氨酸)可以由Gly195GlyLys或G195GK所指示。可替代地，在G195后插入另外的氨基酸残基(如赖氨酸)可以由*195aK所指示。当插入一个以上氨基酸残基时，例如在G195之后插入Lys和Ala可表示为：Gly195GlyLysAla或G195GKA。在这样的情况下，在此实例中，还可以通过添加小写字母至所插入氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号，将插入的氨基酸残基进行编号：*195aK*195bA。在以上实例中，序列194至196因此将是：
在取代和插入发生在相同位置的情况下，这可以表示为S99SD+S99A或简称S99AD。相同的修饰也可以表示为S99A+*99aD。
在插入与现有氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，很明显出现了命名法中的简并。如果例如在以上实例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则这将由G195GG或*195GaG所指示。同样的实际变化也可以表示为A194AG或*194aG，用于从：
这样的情况对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且因此指示G195GG和这种类型的插入的对应指示意味着包含这种等同的简并指示。
多个改变：包含多个改变的变体由加号(“+”)分隔，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表用酪氨酸和谷氨酸分别取代在位置170和195处的精氨酸和甘氨酸。可替代地，多个改变可以分别由空格或逗号分隔，例如A170Y G195E或A170Y,G195E。
不同的改变：在可以在一个位置引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分隔，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
可替代地，不同的改变或任选的取代可以用括号表示，例如Arg170[Tyr,Gly]或Arg170{Tyr,Gly}或简称R170[Y,G]或R170{Y,G}。
具体实施方式
本发明涉及具有蛋白酶活性并且包含一组两个或更多个取代的枯草杆菌酶变体，这些取代选自X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
在一个实施例中，与亲本枯草杆菌酶相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性。在一个优选的实施例中，与亲本枯草杆菌酶相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性以及同等或改进的洗涤性能。
在另一个实施例中，枯草杆菌酶变体是
a)与亲本枯草杆菌酶的氨基酸序列具有至少60％但小于100％序列同一性的多肽；
b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格性条件、中严格性条件、中-高严格性条件、高严格性条件或极高严格性条件下与以下杂交：
(i)亲本枯草杆菌酶的成熟多肽编码序列或
(ii)(i)的全长互补序列；或
c)由多核苷酸编码的多肽，其与亲本枯草杆菌酶的成熟多肽编码序列具有至少60％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少65％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少70％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少75％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少80％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少85％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少90％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少93％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少95％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少96％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少97％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，枯草杆菌酶变体与亲本枯草杆菌酶具有至少98％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:1至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:2至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:3至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:4至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:5至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:6至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:7至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:8至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:9至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:10至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体具有与SEQ ID NO:11至少60％同一的氨基酸序列，如具有与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％的序列同一性。
在一方面，亲本枯草杆菌酶的改变总数为在3与30个之间，优选在3与20个之间，更优选在3与15个之间，甚至更优选在3与10个之间，最优选在3与8个之间的改变。在另一方面，亲本枯草杆菌酶的改变的总数为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个改变。
在本发明的一方面，枯草杆菌酶变体具有蛋白酶活性并且与亲本枯草杆菌酶相比包含选自下组的两个或更多个取代，该组由以下组成：
(i)X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]和X262[E]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:1具有至少65％的序列同一性，并且其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；或
(ii)X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]和X262[E]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:2具有至少65％的序列同一性，并且其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
在此方面的一个实施例中，枯草杆菌酶变体与选自下组的多肽具有至少70％的序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:1，其中该变体包含取代X262[E]和两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和
(ii)SEQ ID NO:2，其中该变体包含取代X262[E]和两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S,D]、X260[T,A,E]、X261[N,W]。
与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相比，除了取代X262[E]之外，本实施例的变体可以例如包含上文所列的三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个另外的取代。
亲本枯草杆菌酶可以例如分别与SEQ ID NO:1或2具有至少70％的序列同一性，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的序列同一性。
与亲本枯草杆菌酶相比，本发明此方面的枯草杆菌酶变体优选地还具有改进的稳定性，特别是选自下组的本文其他地方描述的一个或多个特征，该组由以下组成：
·>100的半衰期改进因子；
·解链温度(Tm)大于70℃和/或比亲本的解链温度高至少5℃；和
·转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)。
本发明的枯草杆菌酶变体可以进一步包含一种或多种另外的改变。这些氨基酸变化可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原性表位或结合结构域。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域中是已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins[蛋白质]，学术出版社(AcademicPress)，纽约中进行了描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质使得多肽的物理化学性质发生改变。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。对于BPN'(SEQ ID NO:2)，包含氨基酸S221、H64和D32的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。
在一个实施例中，枯草杆菌酶变体包含X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]。
在一个实施例中，枯草杆菌酶变体包含X194[P,A]+X204[D,N]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G,S]+X216[V,S]+X259[S,D]+X261[N,W]+X262[E]。
在一个实施例中，枯草杆菌酶变体包含X194[P]+X204[D]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G]+X216[V]+X259[D]+X261[W]+X262[E]。
在一个实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216的位置处的枯草杆菌酶变体包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:12-60。
在一个实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置256-262的位置处的枯草杆菌酶变体包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:61-109。
在一个实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置处的枯草杆菌酶变体包含选自下组的序列的组合，该组由以下组成：
SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:61；
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:62；
SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:63；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:64；
SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:65；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:66；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:67；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:68；
SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:69；
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:70；
SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:71；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:72；
SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:73；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:74；
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:75；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:76；
SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:77；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:78；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:79；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:80；
SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:81；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82；
SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:83；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:84；
SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:85；
SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:86；
SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:87；
SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:88；
SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:89；
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:90；
SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:91；
SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:92；
SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:93；
SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:94；
SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:95；
SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:96；
SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:97；
SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:98；
SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:99；
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:100；
SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:101；
SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:102；
SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:103；
SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:104；
SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:105；
SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:106；
SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:107；
SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:108；
SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:109。
在一个实施例或以上任何实施例中，枯草杆菌酶变体进一步包含在选自下组的位置处的一个或多个改变，该组由以下位置组成：3、9、20、22、24、43、48、61、72、76、78、91、99、115、117、120、120、129、131、137、141、145、158、160、160、161、163、182、185、188、191、217、238、255、275、275和275，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
在一个实施例或以上任何实施例中，枯草杆菌酶变体进一步包含选自下组的一个或多个改变，该组由以下组成：S3V、S9E、S9R、G20H、T22H、S24H、N43R、A48H、G61E、I72A、N76D、S78H、Y91H、*99aE、G115W、N117H、H120V、H120D、P129D、P131*、Q137H、S141H、R145H、A158E、G160P、G160D、S161E、S163G、Q182E、N185E、S188E、Q191N、L217M、N238H、T255E、*275aH、*275bH和*275aR，其中每个位置对应于SEQ IDNO:2的多肽的位置。
在一个实施例或以上任何实施例中，例如与SEQ ID NO:1相比，枯草杆菌酶变体包含一组改变，其中与具有SEQ ID NO 1的蛋白酶相比，该变体优选地具有改进的稳定性，该组改变选自下组，该组由以下组成：
S9E,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,L262E；
S9E,N43R,N76D,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,*99aE,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q191N,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,T255E,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T255E,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,Y209W,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,P129D,Q206L,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q137H,S141H,R145H,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aR；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,G20H,T22H,S24H,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Y91H,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N76D,V205I,Q206L,Y209W,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q182E,V205I,Q206L,Y209W,S256D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q182E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,L217M,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S216T,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S78H,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N185E,S188E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,H120V,Q182E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S256D,N261W,L262E,*275aH,*275bH；
S3V,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S3V,S9R,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,L262E；
S9E,N43R,N76D,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,*99aE,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q191N,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,T255E,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,Y209W,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,P129D,Q206L,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q137H,S141H,R145H,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aR；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,G20H,T22H,S24H,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Y91H,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N76D,V205I,Q206L,Y209W,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q182E,V205I,Q206L,Y209W,S256D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q182E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,L217M,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S216T,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S78H,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N185E,S188E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,H120V,Q182E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S256D,N261W,L262E,*275aH,*275bH；
S3V,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S3V,S9R,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E。
在一个实施例中，本发明涉及蛋白酶亲本的枯草杆菌酶变体，这些枯草杆菌酶变体与SEQ ID NO:1具有至少60％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％或100％的序列同一性，其中与SEQ ID NO:1相比枯草杆菌酶变体包含取代X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]，其中这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。如上文提及的，图1提供了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列的比对，并且技术人员可以容易地比对除了SEQ ID NO:1外的其他枯草杆菌酶亲本并找到SEQ IDNO:2中的对应氨基酸。
发明人已经发现，取代X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]为枯草杆菌酶提供了增加的稳定性(例如，>100的半衰期改进因子)。
因此，本发明的一个实施例涉及枯草杆菌酶变体，其与亲本枯草杆菌酶相比和/或与具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶相比包含突变X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E](根据SEQ ID NO:2编号)并且其与亲本枯草杆菌酶相比(例如与SEQID NO:1相比)在洗涤剂中具有增加的稳定性。
一个特别优选的实施例涉及枯草杆菌酶变体，其与SEQ ID NO:1相比包含取代X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E](根据SEQ ID NO:2编号)，并且如在本申请实例4和5中所述，当在60℃在pH 8的液体洗涤剂中47小时后测量时，其比亲本枯草杆菌酶和/或具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶具有至少5％、如至少10％、如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、或至少170％的更高的残留活性。
另一个优选的实施例涉及枯草杆菌酶变体，其与SEQ ID NO:1相比包含取代X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E](根据SEQ ID NO:2编号)，其相对于亲本或相对于SEQ ID NO:1(枯草杆菌蛋白酶309)具有t1/2半衰期改进因子，该t1/2半衰期改进因子大于1并且优选至少2、如至少5、如至少10、如至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500、至少5000、至少5500、至少6000、至少6500、至少7000、至少7500、至少8000、至少8500、至少9000、至少9500或至少10000或更多。t1/2半衰期改进因子的计算在实例4中描述。
另一个优选的实施例涉及枯草杆菌酶变体，其与SEQ ID NO:1相比包含取代X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E](根据SEQ ID NO:2编号)，其中枯草杆菌酶变体与亲本相比或与SEQ ID NO 1相比具有至少10％更多的、如至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％更多的残留活性。残留活性或t1/2的计算在本文实例4中描述。
在另一个优选的实施例中，本发明涉及枯草杆菌酶变体，其与亲本枯草杆菌酶相比和/或与具有SEQ ID NO:1的枯草杆菌酶相比包含突变X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E](根据SEQ ID NO:2编号)，并且其与亲本枯草杆菌酶相比(例如与SEQ ID NO:1相比)在洗涤剂中具有增加的稳定性，并且其与亲本枯草杆菌酶相比(例如与SEQ ID NO:1相比)具有同等或改进的洗涤性能。
本发明的变体可包含另外的稳定和/或性能增强突变，如S3V、S9E、S9R、G20H、T22H、S24H、N43R、A48H、G61E、I72A、N76D、S78H、Y91H、*99aE、G115W、N117H、H120V、H120D、P129D、P131*、Q137H、S141H、R145H、A158E、G160P、G160D、S161E、S163G、Q182E、N185E、S188E、Q191N、L217M、N238H、T255E、*275aH、*275bH和*275aR。
在一个实施例中并且根据以上实施例中的任一项，本发明的变体与SEQID NO 1相比包含以下取代：
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L2
62E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N2
61W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S25
9D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S25
6D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
其中变体与具有SEQ ID NO 1的蛋白酶相比具有改进的稳定性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体选自下组，该组由以下组成：
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L26
2E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N26
1W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S25
9D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S25
6D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与选自下组的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体包含一组取代(或氨基酸)：X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：
(d)该变体具有>100的半衰期改进因子(例如，与亲本多肽相比，例如该亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)；
(e)该变体具有大于70℃的解链温度和/或该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，其中所述亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含选自下组的两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个)取代(或氨基酸)，该组由以下组成：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和
(ii)SEQ ID NO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含选自下组的两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个)取代(或氨基酸)，该组由以下组成：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S,D]、X260[T,A,E]、X261[N,W]。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有以下特征：
d)该变体具有>100的半衰期改进因子(例如，与选自下组的亲本多肽相比，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)；
(e)该变体具有大于70℃的解链温度和/或该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)(例如选自下组的亲本多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，优选地所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体包含取代(或氨基酸)：X194[P,A]+X204[D,N]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G,S]+X216[V,S]+X259[S,D]+X261[N,W]+X262[E]。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体包含取代(或氨基酸)：X194[P]+X204[D]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G]+X216[V]+X259[D]+X261[W]+X262[E]。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:4的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:5的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:7的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:9的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:10的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:11的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216的位置处(例如使用SEQ IDNO:2的编号)包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:12-60。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置256-262的位置处(例如使用SEQ IDNO:2的编号)包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:61-109。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置处包含选自下组的序列的组合，该组由以下组成：
SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:61；
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:62；
SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:63；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:64；
SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:65；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:66；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:67；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:68；
SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:69；
SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:70；
SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:71；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:72；
SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:73；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:74；
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:75；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:76；
SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:77；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:78；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:79；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:80；
SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:81；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:82；
SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:83；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:84；
SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:85；
SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:86；
SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:87；
SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:88；
SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:89；
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:90；
SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:91；
SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:92；
SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:93；
SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:94；
SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:95；
SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:96；
SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:97；
SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:98；
SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:99；
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:100；
SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:101；
SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:102；
SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:103；
SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:104；
SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:105；
SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:106；
SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:107；
SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:108；
SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:109。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体在选自下组的位置处包含一个或多个改变(例如取代、插入或缺失)，该组由以下组成：3、9、20、22、24、43、48、61、72、76、78、91、99、115、117、120、120、129、131、137、141、145、158、160、160、161、163、182、185、188、191、217、238、255、275、275和275，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体包含选自下组的一个或多个改变(例如取代、插入或缺失)，该组由以下组成：S3V、S9E、S9R、G20H、T22H、S24H、N43R、A48H、G61E、I72A、N76D、S78H、Y91H、*99aE、G115W、N117H、H120V、H120D、P129D、P131*、Q137H、S141H、R145H、A158E、G160P、G160D、S161E、S163G、Q182E、N185E、S188E、Q191N、L217M、N238H、T255E、*275aH、*275bH和*275aR，其中每个位置对应于SEQ IDNO:2的多肽的位置(例如使用SEQID NO:2的编号)。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与SEQID NO:1相比具有总数为至少5个的改变，如5与26个之间，如5与20个之间，如5与15个之间，如5与10个之间的改变。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体由250至290个、260至280个、268至275个、269至271个或269个氨基酸组成。枯草杆菌酶变体还可以由150至350个，例如175至330个、200至310个、220至300个、240至290个、260至280个或269个、270个、271个、272个、273个、274个或275个氨基酸组成。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有>100的半衰期改进因子，优选地所述变体具有>300的半衰期改进因子，进一步优选地所述变体具有>500的半衰期改进因子，更优选地所述变体具有>700的半衰期改进因子，甚至更优选地所述变体具有>1000的半衰期改进因子，并且最优选地所述变体具有>1400的半衰期改进因子。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有大于70℃的解链温度(Tm)和/或该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度，优选地所述Tm大于75℃，进一步优选地所述Tm大于80℃，最优选地所述Tm大于90℃。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)(例如选自下组的亲本多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，优选地所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的洗涤稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的储存稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体包含取代(或氨基酸)：X262E+X209W+X205I，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQID NO:2的编号)；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；
其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：
(d)该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度；
(e)该变体具有>100的半衰期改进因子(例如，与亲本多肽相比，例如该亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685xln(半衰期改进因子)，其中所述亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5；
(g)变体具有大于70℃的解链温度(Tm)，优选地所述Tm大于75℃，进一步优选地所述Tm大于80℃，最优选地所述Tm大于90℃。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体包含以下特征：如以上描述的(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体包含取代L262E+Y209W+V205I，其中该变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有在包含50mM HEPES(pH 7.8)和2mM CaCl2的溶液中测量的其解链温度，其中所述测量在至少83℃的温度进行(例如，通过差示扫描量热法测量)。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有一组选自下组的改变，该组由以下组成：
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有>100的半衰期改进因子，优选地所述变体具有>300的半衰期改进因子，进一步优选地所述变体具有>500的半衰期改进因子，更优选地所述变体具有>700的半衰期改进因子，甚至更优选地所述变体具有>1000的半衰期改进因子，并且最优选地所述变体具有>1400的半衰期改进因子。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有大于70℃的解链温度(Tm)，优选地所述Tm大于75℃，进一步优选地所述Tm大于80℃，最优选地所述Tm大于90℃。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，其中所述亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的洗涤稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
根据一个实施例和/或以上实施例中的任一项，本发明的枯草杆菌酶变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的储存稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
在一个实施例中，与亲本枯草杆菌酶相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性。在一个优选的实施例中，与亲本枯草杆菌酶相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性以及同等或改进的洗涤性能。
在一个实施例中，与亲本枯草杆菌酶相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，特别是改进的洗涤稳定性。在一个优选的实施例中，与亲本枯草杆菌酶相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，特别是改进的储存稳定性以及同等或改进的洗涤性能。
在一个实施例中，与亲本枯草杆菌酶相比，枯草杆菌酶变体具有改进的稳定性，特别是改进的洗涤稳定性以及同等或改进的洗涤性能，其中使用如WO 2016/174234中所述的‘洗涤中稳定性测定’测量洗涤稳定性，并使用如实例3中所述的自动机械应力测定(AMSA)测量洗涤性能。
亲本蛋白酶
亲本或前体蛋白酶可以是任何枯草杆菌酶，或如下定义的甚至更优选的任何枯草杆菌蛋白酶。。
切割蛋白底物中的酰胺键的酶可被分类为蛋白酶，或(可互换地)分类为肽酶(参见Walsh，1979，Enzymatic Reaction Mechanisms[酶反应机制]，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)，旧金山，第3章)。
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点存在必需丝氨酸残基的酶(White，Handler和Smith，1973“生化原理”(Principles of Biochemistry)，第五版，麦格劳希尔出版公司(McGraw-Hill Book Company)，纽约，第271-272页)。
细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围为20,000至45,000道尔顿。它们可被二异丙基氟磷酸抑制。它们水解单末端酯并且在活性上类似于同样为丝氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。更狭义的术语，碱性蛋白酶(涵盖一个亚组)反映了一些丝氨酸蛋白酶从pH 9.0-11.0的高最适pH(综述参见Priest，1977，Bacteriological Rev.[细菌学评论]41:711-753)。
枯草杆菌酶
表示为枯草杆菌酶的丝氨酸蛋白酶的一个亚组由Siezen等人，1991，ProteinEngng[蛋白质工程]4:719-737中和Siezen等人，1997，Protein Science[蛋白质科学]6:501-523提出。它们是通过对先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的超过170种氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶先前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了多种多样的枯草杆菌酶，并且已确定许多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述，参见Siezen等人(1997)。
枯草杆菌蛋白酶
枯草杆菌酶的一个亚组是枯草杆菌蛋白酶，它们为来自S8家族，特别是来自S8A子族的丝氨酸蛋白酶，如由MEROPS数据库(merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝S8)所定义的。
枯草杆菌蛋白酶BPN'和枯草杆菌蛋白酶309分别具有MEROPS编号S08.034和S08.003。
亲本枯草杆菌酶
术语“亲本枯草杆菌酶”描述了根据Siezen等人，1997，Protein Science[蛋白质科学]6:501-523定义的枯草杆菌酶。更详细的信息参见以上“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从自然来源中分离的枯草杆菌酶，其中在保留枯草杆菌酶特征的同时，已对其进行后续修饰(如氨基酸侧链的替代，取代、缺失和/或插入)。此外，亲本枯草杆菌酶可以是通过DNA改组技术制备的枯草杆菌酶，如由Ness等人，1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896所述的。
可替代地，术语“亲本枯草杆菌酶”可称为“前体枯草杆菌酶”，并用于描述其中进行突变以获得本发明变体的起始蛋白酶。亲本枯草杆菌酶优选地是枯草杆菌蛋白酶亚组。
枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或“真”枯草杆菌蛋白酶，包括“经典的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(诺维信公司)和枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。BPN'是来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN'，枯草杆菌蛋白酶BPN'具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。Siezen等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或高碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶并且包括酶，如：枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(杰能科国际公司)、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(诺维信公司)、碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)和具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的枯草杆菌蛋白酶309(诺维信公司))。
供参考，下文的表1给出了本文提及的各种枯草杆菌酶的一些首字母缩略词的列表。有关进一步的首字母缩略词，参见Siezen等人(1991和1997)。
表1：各种枯草杆菌酶的首字母缩略词
同源枯草杆菌酶序列
在此上下文中，出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同源性由参数“同一性”描述，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如上所述的Needleman-Wunsch算法确定。除了氨基酸比对之外，来自程序的结果还计算两个序列之间的“百分比一致性”。
基于本描述，对于本领域的技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源枯草杆菌酶是常规的。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:9的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列或由其组成。
该亲本多肽可以是与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，该亲本多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:11的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列或由其组成。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本枯草杆菌酶可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，亲本分泌至细胞外。
亲本可以是细菌蛋白酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属或脲原体属蛋白酶。
在一方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌蛋白酶。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center,NRRL)。
可以使用上文提及的探针，从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述亲本。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合DNA样品获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见，例如Sambrook等人，1989，见上文)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有蛋白酶活性的枯草杆菌酶变体的方法，这些方法包括：
(a)向亲本枯草杆菌酶(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)中引入取代X194[P,A]+X195[G,E]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[S,D]+X259[S,D]+X260[T,A,E]+X261[N,W]+X262[E]；并且
(b)回收该变体。
本发明还涉及用于获得具有蛋白酶活性的枯草杆菌酶变体的方法，这些方法包括：
(a)向亲本枯草杆菌酶中引入取代X262[E]和至少两个选自下组的另外的取代(例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个)，该组由以下组成：
(i)X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:1具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，或
(ii)X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ IDNO:2具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；并且
(b)回收该变体。
本发明还涉及用于获得具有蛋白酶活性的枯草杆菌酶变体的方法，这些方法包括：
(a)向亲本枯草杆菌酶(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)中引入取代X262E+X209W+X205I；并且
(b)回收该变体。
本发明还涉及用于获得具有如以上描述的蛋白酶活性的枯草杆菌酶变体的任何方法，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:1具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如，US2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004，Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；US 5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用的蛋白质]”；以及在Sambrook等人,1989(见上文)。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加所述基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
该控制序列还可以是信号肽编码区域，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'-端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码序列所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。
载体优选地含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码所述变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，该载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点、以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
可以将本发明编码变体的多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可为任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、和变铅青链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49：399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171：3583-3585)或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98：6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域中已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定所述变体的活性。
变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版社(VCHPublishers),纽约,1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明的枯草杆菌酶变体的组合物。在一个实施例中，该组合物是洗涤剂组合物。
本发明还涉及包含本发明的枯草杆菌酶变体的组合物，并且进一步包含：一种或多种洗涤剂组分；和/或一种或多种另外的酶；优选地所述组合物是包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物。
本发明还涉及包含本发明的枯草杆菌酶变体的组合物，并且进一步包含选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下组成：淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过氧合酶(haloperoxygenase)、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂合酶、过氧物酶、蛋白酶、黄原胶酶、地衣多糖酶和木葡聚糖酶，或其任何混合物。
本发明还涉及包含本发明的枯草杆菌酶变体的组合物，其中所述组合物是处于条、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个区室的小袋、常规或压型粉末、颗粒、糊剂、凝胶或常规、压型或浓缩液体形式的洗涤剂组合物。
本发明还涉及本发明的任何组合物在清洁过程，如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤中的用途。
另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：待清洁的织物的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。
在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包含本发明的枯草杆菌酶变体和一种或多种洗涤剂组分，如表面活性剂、水溶助长剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的枯草杆菌酶变体以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：0.01-200mg酶蛋白/升洗涤液，优选0.05-50mg酶蛋白/升洗涤液，特别是0.1-10mg酶蛋白/升洗涤液。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，如0.001％-30％，如0.01％-20％，如0.5％-15％的酶蛋白。
用于在洗衣造粒中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％、例如0.01％-10％、例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％、例如0.1％-5％的酶蛋白。
可以使用常规的稳定剂来稳定酶，如本发明的枯草杆菌酶变体，这些稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物，或者如在WO 2005/105826和WO 2009/118375中所述的可使用肽醛或酮对根据本发明的变体进行稳定。
本发明的变体还可以掺入到WO 97/07202(通过引用结合在此)中所披露的洗涤剂配制品中。
本发明的枯草杆菌酶变体可以配制在液体洗衣组合物(如液体洗衣组合物)中，该组合物包含：
a)至少0.01mg的活性枯草杆菌酶变体/升洗涤剂，
b)2wt％至60wt％的至少一种表面活性剂
c)5wt％至50wt％的至少一种助洗剂
该洗涤剂组合物可以配制在用于衣物洗涤的颗粒洗涤剂中。这类洗涤剂可包含：
a)至少0.01mg的活性蛋白酶变体/克组合物
b)阴离子表面活性剂，优选地5wt％至50wt％
c)非离子表面活性剂，优选地1wt％至8wt％
d)助洗剂，优选地5wt％至40wt％，如碳酸盐、沸石、磷酸盐助洗剂、钙掩蔽助洗剂或络合剂。
尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被本领域技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性和/或两性离子型或其混合物。在一个特定实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。典型地，表面活性剂按重量计以从约0.1％至60％，如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择表面活性剂，并且包括本领域中已知的任何常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于洗涤剂中的任何表面活性剂。表面活性剂降低洗涤剂中的表面张力，这使得清洁的污渍被提起并分散，并且然后洗去。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约1％至约40％，如从约5％至约30％，包含从约5％至约15％或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯及其组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如从约0.5％至约30％、尤其是从约1％至约20％、从约3％至约10％、如从约3％至约5％或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约0％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约0％至约10％的两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％，如约5％至约45％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂，或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别地50％-65％。助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。助洗剂和/或共助洗剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域中已知的用于衣物洗涤剂中的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。
洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-20％，例如约5％至约10％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或与助洗剂，例如沸石助洗剂结合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。其他非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂如氨基羧化物、氨基多羧化物和膦酸酯，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 2009/102854和US 5,977,053中。
本发明的枯草杆菌酶变体也可以配制在餐具洗涤组合物中，优选是自动餐具洗涤组合物(ADW)，该组合物包含：
a)至少0.01mg的根据本发明的活性蛋白酶变体，和
b)10wt％-50wt％的助洗剂，优选选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物，和
c)至少一种漂白组分。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-50％，如约0.1％至约25％的漂白系统。漂白系统去除经常因氧化所致的褪色，并且许多漂白剂还具有强的杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。可以利用本领域中已知的用于衣物洗涤剂中的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预制过酸包括但不限于过氧羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚氨酸和盐、过氧单硫酸和盐，例如臭氧(R)，以及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成性漂白活化剂组合的过氧化物基的漂白系统，这些系统可以包含例如无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在本文意指与过氧漂白剂如过氧化氢反应形成过酸的化合物。如此形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧十二烷酸、4-(十二烷酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)和/或WO 98/17767中披露的那些。目的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酯如三乙酸甘油酯具有环境友好的优点，因为它最终降解成柠檬酸和醇。另外，在储存之后，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物添加剂提供良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统也可以包含过酸如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂或促进剂。
可用于本发明组合物的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰-胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，具体地是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。漂白催化剂也可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。
在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由具有下式的有机催化剂组成：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259和WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
水溶助长剂
水溶助长剂是溶解水溶液中的疏水化合物(或相反地，非极性环境中的极性物质)的化合物。典型地，水溶助长剂同时具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而水溶助长剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如Hodgdon和Kaler的综述，2007，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体&界面科学新见]，12:121-128。水溶助长剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助长剂显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助长剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。通常地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中使用水溶助长剂。水溶助长剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。
洗涤剂可以含有按重量计0-5％，如约0.5％至约5％或约3％至约5％的水溶助长剂。可以利用本领域中已知的用于洗涤剂中的任何水溶助长剂。水溶助长剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠及其组合。
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于洗涤剂中的任何聚合物。聚合物可以作为如上文提及的共助洗剂发挥作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油脂清洁和/或消泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提及的特性和/或多于一种的下文提及的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)和聚羧酸酯如PAA、PAA/PMA、聚天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性的CMC(HM-CMC)和硅酮、对酞酸和低聚二醇类的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二酸酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)和聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。其他的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)和乙氧基硫酸双季铵盐(diquaternium ethoxy sulfate)。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。还考虑了以上提及的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当该织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括该洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变该织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少一部分可见光光谱时，它们改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入以下颜色索引(C.I.)分类的染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如，如描述于WO 2005/003274、WO 2005/003275、WO2005/003276和EP 1876226(特此通过引用的方式结合)中。该洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO 2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种(另外的)酶，如淀粉酶、阿拉伯糖酶、糖酶、纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶)、角质酶、半乳聚糖酶、卤代加过氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶(例如漆酶和/或过氧化物酶)、果胶酶、果胶裂合酶、蛋白酶、木聚糖酶、黄原胶酶、和木葡聚糖酶。
一般而言，选择的酶的特性应当与所选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶成分或非酶成分的相容性等)，并且所述酶应当以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是描述于EP 495257、EP 531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如描述于WO 94/07998、EP 531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的那些。
表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的纤维素酶的实例描述于WO 02/99091中。
纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且尤其是在对应于WO 02/99091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选地从P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R中选择。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、和KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶
该组合物可包含一种或多种另外的蛋白酶，这些蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源，例如植物或微生物来源的那些。微生物来源是优选的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 2007/044993(杰能科国际公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
适合的可商购蛋白酶包括以下商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、和(诺维信公司)，以下商品名出售的那些： PurafectPurafectPurafectPurafect 和(丹尼斯克集团/杜邦公司)、AxapemTM(吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades N.V.))、BLAP(US 5352604的图29中所示的序列)和其变体(汉高公司)和来自花王株式会社的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变酶或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如，如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 2010/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 2010/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 2011/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 2011/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 2011/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO2012/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 2007/87508和WO 2009/109500中的那些。
优选的商业脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)、Lumafast(最初来自杰能科)和Lipomax(最初来自吉斯特-博克德斯公司)。
再其他实例是脂肪酶，有时称为酰基转移酶或过水解酶，例如与南极假丝酵母脂肪酶A(Candida antarctica lipase A)具有同源性的酰基转移酶(WO 2010/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 2005/056782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 2009/067279)、和耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是用于来自亨斯迈纺织品私人有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle PowerBleach中的S54V变体(WO 2010/100028)。
淀粉酶
可以与本发明的枯草杆菌酶变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
合适的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424和WO 99/19467的SEQ ID NO:4中，如在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的合适的淀粉酶包括具有在WO 02/10355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是具有在位置181和182处的缺失和在位置193处的取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包含示出于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示出于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。这种杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ IDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
其他适合的淀粉酶是具有WO 99/19467中的SEQ ID NO:6序列的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/23873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是那些在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的变体：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用WO 96/23873的SEQ ID2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置中具有缺失的那些，如位置181和182、182和183、或位置183和184。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184处具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 2008/153815的SEQ ID NO:2、WO01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶或与WO 2008/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％的序列同一性的其变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 2009/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:2的优选变体是具有C末端截短和/或在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E和G475K，和/或在位置R180和/或S181或者T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，
其中所述变体是C-末端截短的并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 2013/184577的SEQ ID NO:1的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K、以及G477K中具有取代，和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体包含以下取代：
E187P+I203Y+G476K
E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K
并且任选地进一步包含在位置241处的取代和/或在位置178和/或位置179处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 2010/104675的SEQ ID NO:1的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。
SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K，和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体包含取代N21D+D97N+V128I，并且任选地进一步包含在位置200处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQID NO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQID NO:12的以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X和BANTM(来自诺维信公司)，和RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100和Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司)。
过氧物酶/氧化酶
适合的过氧物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧物酶的实例包括来自鬼伞属，例如，来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧物酶及其变体，如描述于WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中的那些。
可商购的过氧物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别是非尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基苯酚；乙氧基化的脂肪醇，其中该醇包含从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酸酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。
辅料
也可以利用本领域中已知的用于衣物洗涤剂中的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括单独的或组合的防蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、防皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂/崩解试剂、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂，包括粘土、填料/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、泡沫促进剂、泡沫(肥皂泡沫)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂和芯吸剂。可以利用本领域中已知的用于衣物洗涤剂中的任何成分。这类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。适合的分散剂例如描述于PowderedDetergents[粉末洗涤剂]，Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]，第71卷，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)中。
染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物将优选地还含有另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂当存在时，该增亮剂优选地以约0.01％至约05％的水平存在。可以在本发明的组合物中使用适用于衣物洗涤剂组合物中的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯衍生物。二氨基茋-磺酸衍生物型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4'-双(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐和2-(茋基-4"-萘并-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。适当的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污垢释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如基于棉和聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如PowderedDetergents[粉末洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物，所述聚合物包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化物基团。该核心结构可以包含聚烯亚胺结构或聚烷醇胺结构，如详细描述于WO 2009/087523(通过引用特此结合)中的。此外，无规接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314(特此通过引用的方式并入)中。其他污垢释放聚合物是经取代的多糖结构，尤其是经取代的纤维素结构，例如经修饰的纤维素衍生物，例如描述于EP 1867808或WO 03/040279中的那些(将二者都通过援引特此并入)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、两性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。上文在污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、防皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如，条，均一片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个隔室的小袋，常规或压型粉末，颗粒，糊剂，凝胶或常规、压型或浓缩液体。存在多种洗涤剂配制品形式，如层(相同或不同相)、小袋、以及用于机器给药单位的形式。
可以将小袋配置为单一区室或多区室。它可以具有合适保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。小袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。该内体积可以分成小袋的区室。优选的膜是聚合材料，优选地被成型为膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧基甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量典型地将是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Indiana,US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris CraftIn.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些小袋可以包含由水溶性膜分隔的固体衣物洗涤剂组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或部分组分。液体组分的区室可以在组成上不同于含有固体的区室。参见，例如US 2009/0011970。
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分离。因而可以避免在组分之间的不利的储存相互作用。在清洗溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位给药的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且高达95％的水，如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
衣物皂条
本发明的酶可以添加到衣物皂条中并用于手洗衣物、织物和/或纺织品。术语衣物皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于他们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(例如洗衣皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地是条的形式但也可能是其他的固体形状如圆形或椭圆形。
该洗衣皂条可以含有一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
衣物皂条还可以含有络合剂像EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合的污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定试剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、粘合剂、浸出剂、漂白活化剂、黏土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散剂、增亮剂、织物柔软剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。
衣物皂条可以在常规的衣物皂条制造设备中加工，如但不限于：混合器、压条机，例如两级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模、冷却隧道和包装纸。本发明不限于通过任何一种方法制备衣物皂条。可以在过程的不同阶段向皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备含有皂、酶、任选的一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂和一价阳离子和有机阴离子的盐的预混物，并且然后将混合物压条。酶和任选的另外的酶可以同时添加作为蛋白酶抑制剂，例如以液体形式。除了混合步骤和压条步骤之外，该过程可进一步包括研磨、挤出、切割、冲压、冷却和/或包装的步骤。
颗粒状洗涤剂配制品
颗粒状洗涤剂可以如WO 2009/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 2007/001262、US 6,472,364、WO 2004/074419或WO 2009/102854中描述的进行配制。其他洗涤剂配制品描述于以下文献中：WO 2009/124162、WO 2009/124163、WO 2009/117340、WO 2009/117341、WO 2009/117342、WO 2009/072069、WO 2009/063355、WO 2009/132870、WO 2009/121757、WO 2009/112296、WO 2009/112298、WO 2009/103822、WO 2009/087033、WO 2009/050026、WO 2009/047125、WO 2009/047126、WO 2009/047127、WO 2009/047128、WO 2009/021784、WO 2009/010375、WO 2009/000605、WO 2009/122125、WO 2009/095645、WO 2009/040544、WO 2009/040545、WO 2009/024780、WO 2009/004295、WO 2009/004294、WO 2009/121725、WO 2009/115391、WO 2009/115392、WO 2009/074398、WO 2009/074403、WO 2009/068501、WO 2009/065770、WO 2009/021813、WO 2009/030632、WO 2009/015951、WO 2011/025615、WO 2011/016958、WO 2011/005803、WO 2011/005623、WO 2011/005730、WO 2011/005844、WO 2011/005904、WO 2011/005630、WO 2011/005830、WO 2011/005912、WO 2011/005905、WO 2011/005910、WO 2011/005813、WO 2010/135238、WO 2010/120863、WO 2010/108002、WO 2010/111365、WO 2010/108000、WO 2010/107635、WO 2010/090915、WO 2010/033976、WO 2010/033746、WO 2010/033747、WO 2010/033897、WO 2010/033979、WO 2010/030540、WO 2010/030541、WO 2010/030539、WO 2010/024467、WO 2010/024469、WO 2010/024470、WO 2010/025161、WO 2010/014395、WO 2010/044905、WO 2010/145887、WO 2010/142503、WO 2010/122051、WO 2010/102861、WO 2010/099997、WO 2010/084039、WO 2010/076292、WO 2010/069742、WO 2010/069718、WO 2010/069957、WO 2010/057784、WO 2010/054986、WO 2010/018043、WO 2010/003783、WO 2010/003792、WO 2011/023716、WO 2010/142539、WO 2010/118959、WO 2010/115813、WO 2010/105942、WO 2010/105961、WO 2010/105962、WO 2010/094356、WO 2010/084203、WO 2010/078979、WO 2010/072456、WO 2010/069905、WO 2010/076165、WO 2010/072603、WO 2010/066486、WO 2010/066631、WO 2010/066632、WO 2010/063689、WO 2010/060821、WO 2010/049187、WO 2010/031607、和WO 2010/000636。
用途
本发明还涉及用于在纺织品和织物洗涤如家庭衣物洗涤和工业衣物洗涤中使用根据本发明的枯草杆菌酶变体或其组合物的方法。
本发明还涉及用于在清洁硬表面例如地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)中使用根据本发明的变体或其组合物的方法。
可以将本发明的枯草杆菌蛋白酶变体添加至洗涤剂组合物中，并由此成为洗涤剂组合物的组分。因此，本发明的一方面涉及枯草杆菌酶变体在清洁过程(如洗衣和/或硬表面清洁)中的用途。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
在一个具体方面，本发明提供了包含如本文所述的本发明多肽的洗涤剂添加剂。
该清洁过程或纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(例如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用衣物洗涤，但是也可以是工业衣物洗涤。此外，本发明涉及用于洗涤织物和/或服装的过程，其中该过程包括用含有洗涤剂组合物和至少一种本发明蛋白酶变体的洗液处理织物。例如，可以在机器清洁过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗液可以是例如含有洗涤剂组合物的水性洗液。
最近几年，人们对替代洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这来源于用可再生生物组分如酶和多肽替代石油化学品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变时，需要与先前使用的洗涤剂酶(如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)相比具有替代性和/或改进特性的新酶活性或新酶，以实现当与传统洗涤剂组合物相比时相似的或改进的洗涤性能。
本发明进一步涉及本发明枯草杆菌酶变体在蛋白质污渍去除过程中的用途。蛋白质污物可以是如以下的污物，如：食物污渍，例如婴儿食品、可可、蛋或奶，或其他污渍如皮脂、血液、墨水或草、或其组合。
洗涤方法
本发明涉及用洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法，该洗涤剂组合物包含本发明的蛋白酶变体。
一个优选的实施例涉及清洁方法，该方法包括在适合于清洁物体的条件下将该物体与包括本发明的蛋白酶变体的洗涤剂组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，洗涤剂组合物用于衣物或餐具洗涤过程中。
仍另一个实施例涉及用于从织物或餐具去除污渍的方法，该方法包括在适合于清洁该物体的条件下将该织物或餐具与包括本发明的蛋白酶的组合物接触。
还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。蛋白酶可以用于本领域熟知的任何织物处理方法中(参见，例如US 6,077,316)。例如，在一方面，通过包括使该织物与溶液中的蛋白酶接触的方法改进织物的触感和外观。在一方面，在压力下用所述溶液处理该织物。
本发明的洗涤剂组合物适用于衣物和硬表面应用，包括餐具洗涤。因此，本发明包括用于洗涤织物或洗涤餐具的方法。该方法包括使待清洁的织物/餐具与包含根据本发明的洗涤剂组合物的溶液接触的步骤。该织物可以包括在正常消费者使用条件下能够被清洗的任何织物。餐具可以包括任何餐具，例如陶器、用餐工具、陶瓷、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。该溶液优选地具有从约5.5至约11.5的pH。可以在溶液中按以下浓度使用组合物：从约100ppm，优选地500ppm至约15,000ppm。水温范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃和约90℃。水与织物比率典型地是从约1:1至约30:1。
可以使用常规稳定剂和蛋白酶抑制剂来稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、不同的盐(例如NaCl、KCl)、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))、或肽醛(如二肽醛、三肽醛或四肽醛或醛类似物)(或者具有形式B1-B0-R，其中R是H、CH3、CX3、CHX2、或CH2X(X＝卤素)，B0是单个氨基酸残基(优选地具有一个任选取代的脂肪族或芳香族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基组成(优选一个、两个或三个)，任选地包含一个N-末端保护基团，或者如描述于WO 2009/118375、WO 98/13459中的)或者蛋白类型的蛋白酶抑制剂，例如RASI、BASI、WASI(水稻、大麦和小麦的双功能α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。该组合物可以例如如WO 92/19709、WO 92/19708和US6,472,364中所述进行配制。在一些实施例中，本文采用的这些酶由存在于为这些酶提供此类离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，连同其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))稳定化。
在一些优选的实施例中，本文提供的洗涤剂组合物被典型地这样配制，使得用于水性清洁操作过程中，洗涤水具有以下pH：从约5.0至约12.5，或在替代性实施例中，或从约5.0至约11.5，或在可替代实施例中甚至为从约6.0至约10.5。在一些优选的实施例中，将颗粒或液体洗衣产品配制成具有从约6至约8的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
本发明进一步在如下段落中定义：
1.一种枯草杆菌酶变体，其包含一组选自以下的两个或更多个取代(或氨基酸)：X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者所有所述取代，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。
2.如段落1中所述的枯草杆菌酶变体，其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：
(d)该变体具有>100的半衰期改进因子(例如，与亲本多肽相比，例如该亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)；
(e)该变体具有大于70℃的解链温度和/或该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，其中所述亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
3.如段落1-2中任一项所述的枯草杆菌酶变体，其中所述变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含选自下组的两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个)取代(或氨基酸)，该组由以下组成：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和
(ii)SEQ ID NO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含选自下组的两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个)取代(或氨基酸)，该组由以下组成：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]。
4.如段落1-3中任一项所述的变体，其中
(d)该变体具有>100的半衰期改进因子(例如，与选自下组的亲本多肽相比，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)；
(e)该变体具有大于70℃的解链温度和/或该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)(例如选自下组的亲本多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，优选地所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
5.如段落1-4中任一项所述的变体，其中所述组包含取代(或氨基酸)：X194[P,A]+X204[D,N]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G,S]+X216[V,S]+X259[S,D]+X261[N,W]+X262[E]。
6.如段落1-5中任一项所述的变体，其中所述组包含取代(或氨基酸)：X194[P]+X204[D]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G]+X216[V]+X259[D]+X261[W]+X262[E]。
7.如段落1-6中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
8.如段落1-7中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
9.如段落1-8中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
10.如段落1-9中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
11.如段落1-10中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
12.如段落1-11中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
13.如段落1-12中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
14.如段落1-13中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
15.如段落1-14中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:9的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
16.如段落1-15中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
17.如段落1-16中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:11的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
18.如段落1-17中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216的位置处(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)包含选自下组的序列，该组由以下组成：
19.如段落1-18中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置256-262的位置处(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)包含选自下组的序列，该组由以下组成：
20.如段落1-19中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置处(例如使用SEQ ID NO:2的编号)包含选自下组的序列的组合，该组由以下组成：
21.如段落1-20中任一项所述的变体，该变体进一步包含在选自下组的位置处的一个或多个改变(例如取代、插入或缺失)，该组由以下位置组成：3、9、20、22、24、43、48、61、72、76、78、91、99、115、117、120、120、129、131、137、141、145、158、160、160、161、163、182、185、188、191、217、238、255、275、275和275，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)。
22.如段落1-21中任一项所述的变体，该变体进一步包含选自下组的一个或多个改变(例如取代、插入或缺失)，该组由以下组成：S3V、S9E、S9R、G20H、T22H、S24H、N43R、A48H、G61E、I72A、N76D、S78H、Y91H、*99aE、G115W、N117H、H120V、H120D、P129D、P131*、Q137H、S141H、R145H、A158E、G160P、G160D、S161E、S163G、Q182E、N185E、S188E、Q191N、L217M、N238H、T255E、*275aH、*275bH和*275aR，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)。
23.如段落1-22中任一项所述的变体，该变体是枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:1)的变体，该变体包含选自下组的一组改变，该组由以下组成：
S9E,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,L262E；
S9E,N43R,N76D,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,*99aE,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q191N,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,T255E,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T255E,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,Y209W,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,P129D,Q206L,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q137H,S141H,R145H,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aR；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,G20H,T22H,S24H,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
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S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
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S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Y91H,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
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S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,L217M,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S216T,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S78H,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N185E,S188E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,H120V,Q182E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S256D,N261W,L262E,*275aH,*275bH；
S3V,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S3V,S9R,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
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S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,L262E；
S9E,N43R,N76D,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,*99aE,P131*,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,Q206L,Y209W,S256D；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q191N,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S212G,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,T255E,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,H120V,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N76D,Q206L,Y209W,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q137H,S141H,R145H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
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S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
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S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,G195E,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,Q206L,Y209W,S259D,T260A,L262E,*275aR；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,Y209W,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q206L,S256D,L262E；
S9E,G61E,N76D,P129D,Q206L,T260A,L262E；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,G61E,N76D,Q137H,S141H,R145H,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aR；
S9E,G61E,N76D,N204D,Q206L,Y209W,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,G20H,T22H,S24H,N43R,N76D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,G160D,S161E,S163G,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,P129D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,T260A,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E,*275aR；
S9E,N43R,N76D,N117H,H120D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,Y91H,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N43R,A48H,N76D,N117H,A194P,G195E,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N238H,L262E；
S9E,N76D,V205I,Q206L,Y209W,N261W,L262E；
S9E,N76D,Q182E,V205I,Q206L,Y209W,S256D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,Q182E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,L217M,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,G115W,A194P,Q206L,Y209W,S216T,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S78H,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,N117H,A194P,Q206L,Y209W,N238H,S259D,T260A,L262E；
S9E,N43R,N76D,N185E,S188E,A194P,Q206L,Y209W,S259D,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,H120V,Q182E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S256D,N261W,L262E,*275aH,*275bH；
S3V,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S3V,S9R,N76D,H120V,Q182E,N185E,S188E,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S256D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S188E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,G160P,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,L262E,*275aH,*275bH；
S9E,N43R,N76D,A158E,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A158E,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,G160P,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,S161E,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S216V,S259D,N261W,L262E
S9E,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)。
24.如段落1-23中任一项所述的变体，其中与SEQ ID NO:1相比，改变的总数为至少5个，如在5与26个之间，如在5与20个之间，如在5与15个之间，如在5与10个之间的改变。
25.如段落1-24中任一项所述的变体，其中该变体由250至290、260至280、268至275、269至271或269个氨基酸组成。
26.如段落1-25中任一项所述的变体，其中所述变体具有>100的半衰期改进因子，优选地所述变体具有>300的半衰期改进因子，进一步优选地所述变体具有>500的半衰期改进因子，更优选地所述变体具有>700的半衰期改进因子，甚至更优选地所述变体具有>1000的半衰期改进因子，并且最优选地所述变体具有>1400的半衰期改进因子。
27.如段落1-26中任一项所述的变体，其中所述变体具有大于70℃的解链温度(Tm)和/或该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度，优选地所述Tm大于75℃，进一步优选地所述Tm大于80℃，最优选地所述Tm大于90℃。
28.如段落1-27中任一项所述的变体，其中所述变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)(例如选自下组的亲本多肽，该组由以下组成：SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，优选地所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
29.如段落1-28中任一项所述的变体，其中所述变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的洗涤稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
30.如段落1-29中任一项所述的变体，其中所述变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的储存稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
31.一种包含如下取代(或氨基酸)的枯草杆菌酶变体：X262E+X209W+X205I，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置(例如使用SEQ ID NO:2的编号)；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；
其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：
(d)该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度；
(e)该变体具有>100的半衰期改进因子(例如，与亲本多肽相比，例如该亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，其中所述亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5；
(g)变体具有大于70℃的解链温度(Tm)，优选地所述Tm大于75℃，进一步优选地所述Tm大于80℃，最优选地所述Tm大于90℃。
32.如段落1-30中任一项所述的枯草杆菌酶变体，其中所述变体包含取代(或氨基酸)：X262E+X209W+X205I，其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：
(d)该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度；
(e)该变体具有>100的半衰期改进因子(例如，与亲本多肽相比，例如该亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，其中所述亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5；
(g)变体具有大于70℃的解链温度(Tm)，优选地所述Tm大于75℃，进一步优选地所述Tm大于80℃，最优选地所述Tm大于90℃。
33.如段落31所述的变体，该变体包含以下特征：(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。
34.如段落31-33中任一项所述的变体，该变体包含取代L262E+Y209W+V205I，其中该变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性。
35.如段落31-34中任一项所述的变体，其中所述解链温度在包含50mM HEPES(pH7.8)和2mM CaCl2的溶液中测量，其中所述测量在至少83℃的温度进行(例如，通过差示扫描量热法测量)。
36.如段落31-35中任一项所述的变体，该变体是枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:1)的变体，该变体包含选自下组的一组改变，该组由以下组成：
S9E,N43R,N76D,A194P,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S259D,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,A194P,N204D,V205I,Q206L,Y209W,S212G,S216V,S256D,S259D,T260E,N261W,L262E；
S9E,N43R,N76D,V205I,Q206L,Y209W,S259D,N261W,L262E。
37.如段落31-36中任一项所述的变体，其中所述变体具有>100的半衰期改进因子，优选地所述变体具有>300的半衰期改进因子，进一步优选地所述变体具有>500的半衰期改进因子，更优选地所述变体具有>700的半衰期改进因子，甚至更优选地所述变体具有>1000的半衰期改进因子，并且最优选地所述变体具有>1400的半衰期改进因子。
38.如段落31-37中任一项所述的变体，其中所述变体具有大于70℃的解链温度(Tm)，优选地所述Tm大于75℃，进一步优选地所述Tm大于80℃，最优选地所述Tm大于90℃。
39.如段落31-38中任一项所述的变体，其中该变体具有比亲本多肽(例如选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)的解链温度高至少5℃的解链温度。
40.如段落31-39中任一项所述的变体，其中该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)，其中所述亲本多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
41.如段落31-40中任一项所述的变体，其中所述变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的洗涤稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
42.如段落31-41中任一项所述的变体，其中所述变体与亲本多肽(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)相比具有改进的储存稳定性(例如在洗涤剂组合物中)。
43.一种包含如段落1-42中任一项所述的变体的组合物。
44.如段落43所述的组合物，该组合物进一步包含：
i)一种或多种洗涤剂组分；和/或
ii)一种或多种另外的酶；
优选地所述组合物是包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物。
45.如段落43-44中任一项所述的组合物，该组合物包含选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下组成：淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过氧合酶(haloperoxygenase)、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂合酶、过氧物酶、蛋白酶、黄原胶酶、地衣多糖酶和木葡聚糖酶，或其任何混合物。
46.如段落43-45中任一项所述的组合物，其中所述组合物是处于条、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个区室的小袋、常规或压型粉末、颗粒、糊剂、凝胶或常规、压型或浓缩液体形式的洗涤剂组合物。
47.如段落43-46中任一项所述的组合物用于清洁过程如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤的用途。
48.一种用于产生如段落1-42中任一项所述的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括：
(a)向亲本枯草杆菌酶(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)中引入取代X194[P,A]+X195[G,E]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[S,D]+X259[S,D]+X260[T,A,E]+X261[N,W]+X262[E]；并且
(b)回收该变体。
49.一种用于产生如段落1-42中任一项所述的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括：
(a)向亲本枯草杆菌酶中引入取代X262[E]和至少两个选自下组的另外的取代(例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个)，该组由以下组成：
(i)X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:1具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，或
(ii)X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]，其中亲本枯草杆菌酶与SEQ IDNO:2具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；并且
(b)回收该变体。
50.一种用于产生如段落31-42中任一项所述的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括
(a)向亲本枯草杆菌酶(例如，选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)中引入取代X262E+X209W+X205I；并且
(b)回收该变体。
51.如段落50所述的方法，其中该亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:1具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
材料和方法
Suc-AAPF-pNA活性测定
可以通过采用Suc-AAPF-PNA作为底物的方法确定蛋白水解活性。Suc-AAPF-PNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且是可以被内切蛋白酶切割的封闭肽。切割后，释放出游离的PNA分子，所述PNA分子具有黄色并且因此可以通过可见分光光度法在波长405nm处进行测量。Suc-AAPF-PNA底物由巴亨公司(Bachem)(目录号L1400，溶解于DMSO)制造。
将有待分析的蛋白酶样品稀释于残留活性缓冲液(100mM Tris pH 8.6)中。通过将30μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板中并添加70μl底物工作溶液(0.72mg/ml在100mM Tris pH 8.6中)来进行测定。将溶液在室温混合并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(吸光度/分钟)与所讨论的蛋白酶的活性成正比。将蛋白酶样品稀释至斜率为线性的水平。
实例1：枯草杆菌蛋白酶309变体的制备和表达
下面总结了突变和表达盒到枯草芽孢杆菌的引入。通过PCR进行所有DNA操作(例如，Sambrook等人；Molecular Cloning[分子克隆]；冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press))。
使用编码枯草杆菌蛋白酶309变体的重组枯草杆菌构建体来接种包含富营养培养基(例如，100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/LNa2HPO4.12H2O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L替代-Dowfax63N10(陶氏化学(Dow))的摇瓶。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。
实例2：枯草杆菌蛋白酶309变体的纯化
将培养液在26000x g离心20分钟，并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便去除剩余芽孢杆菌属宿主细胞。用3M Tris碱将0.2μm滤液中的pH调节至pH 8，并将pH调节的滤液应用于在20mM Tris/HCl、1mMCaCl2、pH 8.0中平衡的MEP Hypercel柱(颇尔公司(Pall Corporation))。用平衡缓冲液洗涤柱后，将该柱用20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2、pH 4.5逐步洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析，并且合并峰级分。将来自该MEPHypercel柱的合并物的pH用20％(v/v)CH3COOH或3M Tris碱调节至pH 6，并且将经pH调节的合并物用去离子水稀释至与20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)相同的电导率。将经稀释的合并物施加至在20mM MES/NaOH、2mM CaCl2(pH 6.0)中平衡的快流柱(GE医疗公司(GE Healthcare))上。在用平衡缓冲液洗涤该柱之后，在相同的缓冲剂中将蛋白酶变体经五个柱体积的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱。使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析，并且通过SDS-PAGE将活性级分进行分析。将级分(其中在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的仅观察到一条带)合并为纯化的制剂并且用于另外的实验。
实例3：枯草杆菌蛋白酶309变体的洗涤性能
使用自动机械应力测定(AMSA)评估在衣物洗涤中的枯草杆菌蛋白酶309变体的洗涤性能，其中可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，该盖子将待洗涤的纺织品对槽开口强力挤压。在洗涤期间，将平板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的段落“具体方法实施例”。
在表2中指定的实验条件下进行衣物洗涤实验。
表2
洗涤剂剂量 2.0g/L
测试溶液体积 160μL(20μL酶+140μL洗涤剂)
pH 8.4
洗涤时间 20分钟
温度 20℃
水硬度 12°dH
标准洗涤剂和测试材料如在表3中所述：
表3：标准洗涤剂和测试材料的组合物
测试材料获得自测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV)，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。也可以将亮度表示为当用白光照射样品时从样品反射的光的强度。当样品受污时，反射光的强度低于干净样品。因此，反射光的强度可以用来衡量洗涤性能。
使用柯达iQsmart平板扫描仪(Kodak Midtager 29、DK-2605丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度的值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(Int)：
结果示于表4中。结果作为与枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:1)相比的相对性能和两种不同小块布样的两种酶浓度30和60nM的平均值给出。与枯草杆菌蛋白酶309(SEQ IDNO:1)相比，低于0.8的RP值被认为更差，0.8-1.2被认为是同等，1.2或更高被认为更好。
表4：相比于枯草杆菌蛋白酶309，变体的AMSA相对性能。
实例4：加速储存稳定性测定
在60℃下孵育长达48小时的情况下，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。
使用0.01％Triton X-100将含有25-75μg/ml活性蛋白酶的培养上清液稀释1、2、4和8倍。对于每个变体，包括具有每种稀释液的2个孔。使用磁棒(在Zephyr移液站(CaliperLifeSciences)上30min)，将30μl稀释的蛋白酶样品与270μl标准O洗涤剂在微量滴定板(Nunc U96PP 0.5ml)的孔中混合。然后将20μl的这种混合物转移至另一个微量滴定板(加有磁棒的Nunc U96PP 0.5ml)中，并且与80μl 100mM Tris(pH 8.6)混合(在Zephyr上至少5min)。将30μl的这种稀释液转移至Nunc F 96-MTP中，并且在添加70μl底物溶液后，通过每20sec在405nm下测量吸光度持续5min来确定非应激样品的初始活性(在SpectraMax Plus上)。在密封后，将洗涤剂板在艾本德恒温混匀仪(Eppendorf Thermomixer)中在60℃下进行孵育(未振荡)。在1、4、23和47小时孵育后，抽取20μl样品，并且像初始非应激活性一样，测量应激样品的残余活性。
在用洗涤剂孵育过程中的活性下降被假定为指数式的。从Log(活性)对孵育时间(0小时、1小时、4小时、23小时和47小时)的线性回归发现半衰期(T1/2)，并且将半衰期改进因子(T1/2IF)计算为相对于SEQ ID NO 1的半衰期的蛋白酶变体的半衰期。这意指Savinase(枯草杆菌蛋白酶309)的T1/2是1。
表5.洗涤剂的组合物
表6在标准O中的加速储存稳定性结果。T1/2IF：相对于枯草杆菌蛋白酶309或枯草杆菌蛋白酶309+N76D参比物的半衰期改进因子
实例5：加速储存稳定性测定
在60℃下孵育长达48小时的情况下在CNS(中国国家标准)洗涤剂中，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。否则，在与实例4相同的条件下进行该实验。
表7洗涤剂的组合物
在该实验中，稳定性在CNS(中国国家标准)中测试，并且将表8中的结果表示为T1/2IF：相对于如在实例4中描述的枯草杆菌蛋白酶309或枯草杆菌蛋白酶309+N76D的半衰期改进因子。
1：T1/2IF>1000；
2：500≤T1/2IF≤1000；
3：50≤T1/2IF<500。
表8：在CNS中的加速的储存稳定性结果，A栏＝相对于枯草杆菌蛋白酶309+N76D的T1/2IF，B栏＝相对于枯草杆菌蛋白酶309的T1/2IF。
实例6：枯草杆菌蛋白酶309变体物质(sp.)的AMSA洗涤性能
使用自动机械应力测定(AMSA)，使用液体衣物洗涤剂测试枯草杆菌蛋白酶309变体对三种不同的技术污渍的洗涤性能，如实例3中所述的。
表9：标准洗涤剂和测试材料如下：
测试材料从EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG，12，CH-9015 St.Gallen，瑞士)，从测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)获得。
使用颜色测量并且计算如实例3中所述的强度值，将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。
使用单循环洗涤程序进行实验，其中洗涤剂组合物和小块布样并且实验条件如下表10中所指定。
表10：衣物实验的实验条件
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水漂洗并干燥。
表11：在20℃下与具有枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的洗涤剂相比，枯草杆菌蛋白酶309变体的相对性能
表11的结果示出，在20℃下在巧克力/牛奶上(PC-03，C-03)，相比于枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶309变体具有改进的或同等性能的洗涤性能。
表12：在20℃下在EMPA117EH棉/聚酯污渍上的血液/牛奶/油墨上，与具有枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的洗涤剂相比，来自芽孢杆菌属物种枯草杆菌蛋白酶309变体的蛋白酶的相对性能。
表12的结果示出，在20℃下额外加热的在EMPA117EH，在棉/聚酯上的血液/牛奶/墨水上，相比于枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶309变体具有改进的或同等性能的洗涤性能。
实例7：枯草杆菌蛋白酶309变体在微型洗涤中的测试
使用微型洗涤系统，使用洗衣液洗涤剂在一种技术污渍上测试来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶的洗涤性能。
微型洗涤测定是如下测试方法，其中污染的纺织品被连续地提起放进测试溶液中并且随后冲洗。
表13：在以下指定的实验条件下进行洗涤实验：
测试材料获得自EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG12,CH-9015圣加仑州(St.Gallen),瑞士)。
随后将纺织品风干并且将洗涤性能测量为这些纺织品的颜色的亮度。还可以将亮度表示为反射比(R)，反射比是当用白光照射时，从测试材料反射或发射的光的量度。使用Zeiss MCS 521 VIS分光光度计在460nm处测量纺织品的反射比(R)。根据制造商的方案进行测量。
通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem酶。
如在微型洗涤测定中针对洗衣方法所描述的，用描述于表13中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表14中所指定。
表14：用于微型洗涤衣物洗涤实验的实验条件
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至8.4°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水漂洗并干燥。
表15：在25℃下与具有枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的洗涤剂相比，来自芽孢杆菌属物种枯草杆菌蛋白酶309变体的蛋白酶的相对性能
表15的结果显示，在25℃下在血液/牛奶/墨水上，相比于枯草杆菌蛋白酶309(SEQID NO 1)，枯草杆菌蛋白酶309变体示出改进的或同等的洗涤性能。
实例8：加速储存稳定性测定
在58℃，pH 9下孵育长达48小时的情况下，在CNS(中国国家标准)洗涤剂中，使用加速测定评估蛋白酶变体在液体洗涤剂中的储存稳定性。
否则，在与实例4和5相同的条件下进行该实验。
将表16中的结果表示为T1/2IF：相对于如在实例4中描述的枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的半衰期改进因子。
1：T1/2IF>1000；
2：500≤T1/2IF≤1000；
3：50≤T1/2IF<500。
表16：加速储存稳定性结果在CNS中，相对于枯草杆菌蛋白酶309
实例9：稳定性基序的鉴定
针对SEQ ID NO:1的各组变体，分析半衰期改进因子(T1/2IF)、解链温度(Tm)和转化的半衰期改进因子与Δ解链温度的比率(R)。比率(R)根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)。亲本多肽是具有Tm＝80.5℃的SEQ ID NO:1。相对于枯草杆菌蛋白酶309(SEQID NO 1)的半衰期改进因子(T1/2IF)如在本文实例4中描述的进行计算。获得的结果显示在下表17-20中。使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡特维，新泽西州，美国)通过差示扫描量热法(DSC)测定SEQ ID NO:1的变体的热稳定性。在200K/小时的恒定的程序化加热速率下，在加热缓冲液(50mM HEPES缓冲液，pH 7.8，其中添加了2mM CaCl2)中的酶溶液(大约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对T)中，热变性温度(或解链温度，Tm(℃))取自变性峰(主要的吸热峰)的顶端。将样品溶液和参比溶液(大约0.2ml)从10℃下的储存条件下装载到量热仪中(参比溶液：不具有酶的缓冲液CaCl2)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃至100℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的精度确定解链温度(Tm)。
表17.SEQ ID NO:1的第一组变体的突变、对应的半衰期改进因子(T1/2IF)、解链温度(Tm)和转化的半衰期改进因子的比率(R)之间的相关性：
对表17中所示数据的后续分析揭示了一组取代，所述取代跨越对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置作为共有稳定性基序。因此，在分析的变体中鉴定了以下一组取代(即，共有稳定性基序)，这组取代大大改进了与SEQ ID NO:1相比的变体的稳定性(例如，T1/2IF>100)：X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]。分析的变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％但小于100％的序列同一性，每个变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]和另外地：半衰期改进因子>100，或解链温度(Tm)大于70℃，或转化的半衰期改进因子与Δ解链温度的比率(R)大于-3。
表18.SEQ ID NO:1的第二组变体的突变、对应的半衰期改进因子(T1/2IF)、解链温度(Tm)和转化的半衰期改进因子的比率(R)之间的相关性：
对上表18中所示数据的后续分析揭示了在分析变体中存在的一组取代(即，共有稳定性基序)：X262E+X209W+X205I，这组取代类似地大大改进了与SEQ ID NO:1相比的变体的稳定性(例如，T1/2IF>100)。分析的变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％但小于100％的序列同一性，并且每种变体具有比亲本多肽(SEQ ID NO:1)的解链温度高至少5℃的解链温度，并且每种变体进一步地具有>100的半衰期改进因子。
针对SEQ ID NO:1的第三组变体，还分析半衰期改进因子(T1/2IF)、Δ解链温度(ΔTm)和转化的半衰期改进因子与Δ解链温度的比率(R)。比率(R)根据如上所释的式I计算。亲本多肽是具有Tm＝80.5℃的SEQ ID NO:1。相对于枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO 1)的半衰期改进因子(T1/2IF)如在本文实例4中描述的进行计算。获得的结果显示在下表19中。
表19.SEQ ID NO:1的第三组变体的突变、对应的半衰期改进因子(T1/2IF)、Δ解链温度(ΔTm)和转化的半衰期改进因子的比率(R)之间的相关性：
对表19中所示数据的后续分析揭示了一组取代，所述取代跨越对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置作为共有稳定性基序。因此，在分析的变体中鉴定了以下一组取代(即，共有稳定性基序)，这组取代大大改进了与SEQ ID NO:1相比的变体的稳定性(例如，T1/2IF>100)：X194[P,A]+X195[E,G]+X204[D,N]+X205[I,V]+X206[L,Q]+X209[W,Y]+X212[G,S]+X216[V,S]+X256[D,S]+X259[D,S]+X260[A,E,T]+X261[W,N]+X262[E]。分析的变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％但小于100％的序列同一性，每个变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]和另外地：半衰期改进因子>100，或Δ解链温度(ΔTm)大于5℃，或转化的半衰期改进因子与Δ解链温度的比率(R)大于-3(R>-3)。
SEQ ID NO:12-60在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216的位置处被鉴定为单独的基序，而SEQ ID NO:60-109在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置256-262的位置处被鉴定为单独的基序。表20显示了在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置处的序列(即基序)的组合，该序列的组合在分析的变体数据组中被鉴定。
表20.在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置处的序列(即基序)的鉴定的组合：
序列表
<110> 诺维信公司
<120> 枯草杆菌酶变体和对其进行编码的多核苷酸
<130> 14195-WO-PCT
<160> 109
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 迟缓芽孢杆菌
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 3
<211> 275
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌168
<400> 3
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser
130 135 140
Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly
145 150 155 160
Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala
180 185 190
Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr
225 230 235 240
Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr
245 250 255
Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 4
<211> 274
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌DY
<400> 4
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val
1 5 10 15
Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ala Ala Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp
100 105 110
Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala Ser
130 135 140
Gly Ile Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ser
145 150 155 160
Gln Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val
165 170 175
Gly Ala Val Asp Ser Asn Lys Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly
180 185 190
Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Val Ser Val Tyr Ser Thr Tyr
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
210 215 220
His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Tyr Pro Thr Leu
225 230 235 240
Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Asn Leu
245 250 255
Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala
260 265 270
Ala Gln
<210> 5
<211> 274
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 5
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val
1 5 10 15
Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp
100 105 110
Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg
130 135 140
Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn
145 150 155 160
Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val
165 170 175
Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly
180 185 190
Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr
195 200 205
Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
210 215 220
His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu
225 230 235 240
Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu
245 250 255
Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala
260 265 270
Ala Gln
<210> 6
<211> 268
<212> PRT
<213> 迟缓芽孢杆菌
<400> 6
Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Ser Phe Ile Asn Thr Gln Gln Ala His
1 5 10 15
Asn Arg Gly Ile Phe Gly Asn Gly Ala Arg Val Ala Val Leu Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Ala Ser His Pro Asp Leu Arg Ile Ala Gly Gly Ala Ser Phe
35 40 45
Ile Ser Ser Glu Pro Ser Tyr His Asp Asn Asn Gly His Gly Thr His
50 55 60
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
65 70 75 80
Val Arg Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Leu Lys Val Leu Asp Arg Asn
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Leu Ala Ser Val Ala Gln Gly Ile Glu Trp Ala Ile
100 105 110
Asn Asn Asn Met His Ile Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Thr Ser Gly
115 120 125
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Arg Ala Asn Asn Ala Gly Ile
130 135 140
Leu Leu Val Gly Ala Ala Gly Asn Thr Gly Arg Gln Gly Val Asn Tyr
145 150 155 160
Pro Ala Arg Tyr Ser Gly Val Met Ala Val Ala Ala Val Asp Gln Asn
165 170 175
Gly Gln Arg Ala Ser Phe Ser Thr Tyr Gly Pro Glu Ile Glu Ile Ser
180 185 190
Ala Pro Gly Val Asn Val Asn Ser Thr Tyr Thr Gly Asn Arg Tyr Val
195 200 205
Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala
210 215 220
Ala Leu Val Lys Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Thr Asn Asn Gln Ile Arg
225 230 235 240
Gln Arg Ile Asn Gln Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Leu Tyr
245 250 255
Gly Asn Gly Leu Val His Ala Gly Arg Ala Thr Gln
260 265
<210> 7
<211> 269
<212> PRT
<213> 嗜碱芽孢杆菌PB92
<400> 7
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 8
<211> 268
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌YaB
<400> 8
Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Asn Arg Val Gln Ala Pro Ile Ala Gln
1 5 10 15
Ser Arg Gly Phe Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Ser Asn His Ala Asp Leu Arg Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
35 40 45
Val Pro Gly Glu Pro Asn Ile Ser Asp Gly Asn Gly His Gly Thr Gln
50 55 60
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
65 70 75 80
Val Ala Pro Asn Val Asp Leu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Ala Ala
100 105 110
Asn Asn Gly Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser Ala Gly
115 120 125
Ser Ala Thr Met Glu Gln Ala Val Asn Gln Ala Thr Ala Ser Gly Val
130 135 140
Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Asn Val Gly Phe
145 150 155 160
Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn
165 170 175
Asn Asn Arg Ala Thr Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
180 185 190
Ala Pro Gly Val Gly Val Gln Ser Thr Val Pro Gly Asn Gly Tyr Ala
195 200 205
Ser Phe Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala
210 215 220
Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg
225 230 235 240
Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Thr Thr Gln Phe
245 250 255
Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 9
<211> 272
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种NKS-21
<400> 9
Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Pro Tyr Ile Tyr Ser Asp Val Val His
1 5 10 15
Arg Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
20 25 30
Gly Val Ala Pro His Pro Asp Leu His Ile Arg Gly Gly Val Ser Phe
35 40 45
Ile Ser Thr Glu Asn Thr Tyr Val Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His
50 55 60
Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Tyr Gly Val Leu Gly
65 70 75 80
Val Ala Pro Gly Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Arg Asn
85 90 95
Gly Ser Gly Ser His Ala Ser Ile Ala Gln Gly Ile Glu Trp Ala Met
100 105 110
Asn Asn Gly Met Asp Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly
115 120 125
Ser Thr Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asn Ala Gly Val
130 135 140
Leu Leu Ile Gly Ala Ala Gly Asn Ser Gly Gln Gln Gly Gly Ser Asn
145 150 155 160
Asn Met Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Ser Val Met Ala Val Gly Ala
165 170 175
Val Asp Gln Asn Gly Asn Arg Ala Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Ser Glu
180 185 190
Leu Glu Ile Met Ala Pro Gly Val Asn Ile Asn Ser Thr Tyr Leu Asn
195 200 205
Asn Gly Tyr Arg Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val
210 215 220
Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys His Pro His Leu Thr Ala
225 230 235 240
Ala Gln Ile Arg Asn Arg Met Asn Gln Thr Ala Ile Pro Leu Gly Asn
245 250 255
Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Leu Val Asp Ala Glu Tyr Ala Ala Gln
260 265 270
<210> 10
<211> 269
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种 G-825-6
<400> 10
Asn Gln Val Thr Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Ala
1 5 10 15
Trp Thr Arg Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Val Arg Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Val Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Val
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asn Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Gln Trp Thr
100 105 110
Ala Gln Asn Asn Ile His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Val
115 120 125
Gly Ser Gln Thr Leu Glu Leu Ala Val Asn Gln Ala Thr Asn Ala Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Ser Gly Thr Val Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Leu Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Leu Asn Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile
225 230 235 240
Arg Gln His Leu Thr Ser Thr Ala Thr Ser Leu Gly Asn Ser Asn Gln
245 250 255
Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 11
<211> 279
<212> PRT
<213> 普通嗜热放线菌
<400> 11
Tyr Thr Pro Asn Asp Pro Tyr Phe Ser Ser Arg Gln Tyr Gly Pro Gln
1 5 10 15
Lys Ile Gln Ala Pro Gln Ala Trp Asp Ile Ala Glu Gly Ser Gly Ala
20 25 30
Lys Ile Ala Ile Val Asp Thr Gly Val Gln Ser Asn His Pro Asp Leu
35 40 45
Ala Gly Lys Val Val Gly Gly Trp Asp Phe Val Asp Asn Asp Ser Thr
50 55 60
Pro Gln Asn Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Ile Ala Ala
65 70 75 80
Ala Val Thr Asn Asn Ser Thr Gly Ile Ala Gly Thr Ala Pro Lys Ala
85 90 95
Ser Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Asn Ser Gly Ser Gly Thr Trp
100 105 110
Thr Ala Val Ala Asn Gly Ile Thr Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala Lys
115 120 125
Val Ile Ser Leu Ser Leu Gly Gly Thr Val Gly Asn Ser Gly Leu Gln
130 135 140
Gln Ala Val Asn Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ser Val Val Val Ala Ala
145 150 155 160
Ala Gly Asn Ala Gly Asn Thr Ala Pro Asn Tyr Pro Ala Tyr Tyr Ser
165 170 175
Asn Ala Ile Ala Val Ala Ser Thr Asp Gln Asn Asp Asn Lys Ser Ser
180 185 190
Phe Ser Thr Tyr Gly Ser Val Val Asp Val Ala Ala Pro Gly Ser Trp
195 200 205
Ile Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Ser Leu Ser Gly Thr
210 215 220
Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser
225 230 235 240
Gln Gly Arg Ser Ala Ser Asn Ile Arg Ala Ala Ile Glu Asn Thr Ala
245 250 255
Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Ala Lys Gly Arg Val Asn
260 265 270
Ala Tyr Lys Ala Val Gln Tyr
275
<210> 12
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 12
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 13
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 14
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 15
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 16
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 16
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 17
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 18
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 19
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1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Val
20
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 20
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Val
20
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 21
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 22
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 23
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 24
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 24
Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Pro Glu Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Pro Glu Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 29
Pro Glu Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Pro Glu Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 31
Pro Glu Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 32
Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Ser
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
<210> 36
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 36
Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 39
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1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Val
20
<210> 40
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
<210> 42
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asp Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 45
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 46
Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Ser
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 48
Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Thr Tyr Ala Ser
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 53
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 54
Pro Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Leu Ser Thr Trp
1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
<210> 56
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
<210> 57
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 58
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1 5 10 15
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20
<210> 59
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
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1 5 10 15
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20
<210> 60
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置194-216的位置处
的序列
<400> 60
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1 5 10 15
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20
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 61
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1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 62
Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 63
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 64
Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 65
Asp Leu Gly Ser Thr Trp Glu
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 66
Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 67
Ser Leu Gly Ser Thr Trp Glu
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 68
Asp Leu Gly Ser Thr Trp Glu
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 69
Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 70
Asp Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 71
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 72
Ser Leu Gly Ser Thr Trp Glu
1 5
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 73
Asp Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 74
Ser Leu Gly Ser Ala Asn Glu
1 5
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 75
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 76
Asp Leu Gly Ser Ala Asn Glu
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 77
Asp Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 78
Ser Leu Gly Ser Ala Asn Glu
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 79
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 80
Ser Leu Gly Asp Thr Asn Glu
1 5
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 81
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 82
Asp Leu Gly Asp Glu Trp Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 83
Asp Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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的序列
<400> 84
Asp Leu Gly Ser Ala Asn Glu
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 85
Asp Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 86
Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser Leu Gly Ser Ala Asn Glu
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 88
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser Leu Gly Ser Thr Trp Glu
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 90
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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Asp Leu Gly Ser Thr Trp Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 94
Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 95
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 96
Ser Leu Gly Asp Thr Asn Glu
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 97
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 98
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 99
Asp Leu Gly Asp Glu Trp Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 100
Asp Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 101
Ser Leu Gly Asp Ala Asn Glu
1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 102
Ser Leu Gly Asp Thr Asn Glu
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 103
Ser Leu Gly Asp Thr Trp Glu
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 104
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
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<400> 105
Ser Leu Gly Asp Thr Asn Glu
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 106
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 107
Ser Leu Gly Asp Thr Asn Glu
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 108
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在对应于SEQ ID NO: 2的多肽的位置256-262的位置处
的序列
<400> 109
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Glu
1 5

Claims (16)

1.一种枯草杆菌酶变体，其包含一组选自以下的两个或更多个以下取代：X194[P,A]、X195[E,G]、X204[D,N]、X205[I,V]、X206[L,Q]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[D,S]、X259[D,S]、X260[A,E,T]、X261[W,N]和X262[E]，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；
(b)该变体具有蛋白酶活性；并且
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:1，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；并且
(ii)SEQ ID NO:2，其中所述枯草杆菌酶变体包含两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]；
其中所述变体进一步具有选自下组的一种或多种特征，该组由以下组成：
(d)该变体具有>100的半衰期改进因子；
(e)该变体具有大于70℃的解链温度(Tm)；
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
2.如权利要求1所述的变体，其中该变体与选自下组的多肽具有至少70％的序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：
(i)SEQ ID NO:1，其中该变体包含取代X262[E]和两个或更多个以下取代：X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]；和
(ii)SEQ ID NO:2，其中该变体包含取代X262[E]和两个或更多个以下取代：X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S,D]、X260[T,A,E]、X261[N,W]。
3.如权利要求1或2所述的变体，其中所述组包含以下取代：X194[P,A]+X204[D,N]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G,S]+X216[V,S]+X259[S,D]+X261[N,W]+X262[E]。
4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中所述组包含以下取代：X194[P]+X204[D]+X205[I]+X206[L]+X209[W]+X212[G]+X216[V]+X259[D]+X261[W]+X262[E]。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216的位置处包含选自下组的序列，该组由以下组成：
6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置256-262的位置处包含选自下组的序列，该组由以下组成：
7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置194-216和256-262的位置处包含选自下组的序列的组合，该组由以下组成：
8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，其进一步包含在选自下组的位置处的一个或多个改变，该组由以下位置组成：3、9、20、22、24、43、48、61、72、76、78、91、99、115、117、120、120、129、131、137、141、145、158、160、160、161、163、182、185、188、191、217、238、255、275、275和275，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，其进一步包含选自下组的一个或多个改变，该组由以下组成：S3V、S9E、S9R、G20H、T22H、S24H、N43R、A48H、G61E、I72A、N76D、S78H、Y91H、*99aE、G115W、N117H、H120V、H120D、P129D、P131*、Q137H、S141H、R145H、A158E、G160P、G160D、S161E、S163G、Q182E、N185E、S188E、Q191N、L217M、N238H、T255E、*275aH、*275bH和*275aR，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置。
10.如权利要求1-9中任一项所述的变体，其中与SEQ ID NO:1相比，改变的总数为至少5个，如在5与26个之间，如在5与20个之间，如在5与15个之间，如在5与10个之间的改变。
11.一种包含取代X262E+X209W+X205I的枯草杆菌酶变体，其中
(a)这些位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置；
(b)该变体具有蛋白酶活性；
(c)该变体与选自下组的多肽具有至少65％但小于100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1和2；
(d)该变体具有比亲本多肽的解链温度高至少5℃的解链温度；并且
(e)该变体具有>100的半衰期改进因子。
12.如权利要求11所述的变体，其中：
(f)该变体具有转化的半衰期改进因子与Δ解链温度之比大于-3的比率(R)，其中所述比率根据式I计算：R＝-ΔΔG去折叠/ΔTm，其中所述ΔTm＝Tm(变体)-Tm(亲本多肽)，其中所述ΔΔG去折叠＝-2685x ln(半衰期改进因子)；优选地，所述比率R大于0，进一步优选地所述比率R大于0.5，更优选地所述比率R大于1.0并且最优选地所述比率R大于1.5。
13.一种包含如权利要求1-12中任一项所述的变体的组合物。
14.如权利要求13所述的组合物，其进一步包含：
i)一种或多种洗涤剂组分；和/或
ii)一种或多种另外的酶。
15.如权利要求1-12中任一项所述的变体或如权利要求13或14所述的组合物在清洁过程如衣物清洁或硬表面清洁如餐具洗涤中的用途。
16.一种用于产生如权利要求1-10中任一项所述的枯草杆菌酶变体的方法，该方法包括：
(a)向亲本枯草杆菌酶引入取代X262[E]和两个或更多个选自下组的另外的取代，该组由以下组成：
(i)X194[P]、X195[E]、X204[D]、X205[I]、X206[L]、X209[W]、X212[G]、X216[V]、X256[D]、X259[D]、X260[A,E]、X261[W]，其中该亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:1具有至少65％的序列同一性，或
(ii)X194[A]、X195[G]、X204[D,N]、X205[V]、X206[L]、X209[W,Y]、X212[G,S]、X216[V,S]、X256[S,D]、X259[S]、X260[T,A,E]、X261[N,W]，其中该亲本枯草杆菌酶与SEQ ID NO:2具有至少65％的序列同一性；并且
(b)回收该变体。
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