CN102046783A - 包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了蛋白质工程化的方法。特别地，本发明提供了利用位点评估文库设计优化蛋白质的两种或多种性质的文库的方法。本发明还提供了适于多种用途的变体枯草杆菌蛋白酶。

Description

包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法
发明领域
本发明提供了蛋白质工程化的方法和变体蛋白酶。特别地，本发明提供了利用位点评估文库的方法。本发明还提供了用于多种用途的枯草杆菌蛋白酶变体。
发明背景
丝氨酸蛋白酶是糖基水解酶的亚类，包含具有宽范围的特异性和生物学功能的不同类别的酶。对枯草杆菌蛋白酶已经进行了大量研究，主要是出于其在清洁和饲料应用中的用途。其他工作则着眼于在各种应用中可以负面影响这些酶的功能的不良环境条件(例如，暴露于氧化剂、螯合剂、极端的温度和/或pH)。尽管如此，本领域仍然需要这样的酶系统，所述酶系统能够抵抗这些不良条件，并保留或具有提高的本领域目前已知的活性。
多种蛋白质工程化方法是已知的。通常，修饰蛋白质以得到希望的蛋白质性质。在多数方法中，将克隆的编码蛋白质的基因的核苷酸序列突变并表达修饰基因以产生突变体，对其筛选目的活性。通常，将突变体性质与野生型蛋白质的性质比较。
历史上，蛋白质设计方法接近等同于在所有蛋白质空间发现用于所希望的应用一种最佳序列的问题。该问题是极端困难并且是“NP难度的”。在复杂性理论中，被定义为P类的问题被认为是容易和有效的，对于它们的解决方法存在多项式-时间算法。NP难度问题是这样的问题，对于它们当前不知道有效的多项式时间算法，并且如果可以解决任何NP难度问题，那么可以解决所有NP难度问题(见例如，Pierce and Winfree，ProteinEngineer.，15：779-782[2002])。当前建立和筛选文库的策略一般涉及在整个序列随机产生蛋白质序列多样性或者在蛋白质内的确定位置以受控的随机方式产生蛋白质序列多样性。这些文库通常具有对于主要的目的性质为“消极”的许多成员，并且需要大量筛选来发现相对少数的积极突变。通常，忽略消极突变，并仅仅得到积极成员的序列信息。
饱和诱变(Estell et al.，in World Biotech Report 1984，vol.2：USA，Online Publications，London[1984]，181-187页；和Wells et al.，Gene 34：315-323[1985])是可以用于搜索蛋白质空间以发现优化蛋白质中一些性质的突变的一种技术。一些研究小组已经开发了通过饱和诱变鉴定待改变位点的策略(Reetz et al.，Agnew.Chem.Int.Edn.，44：4192-4196[2005]；Kato et al.，J.Mol.Biol.，351：683-692[2005]；和Sandberg et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：8367-8371[1993])，但是还没有提出用于位点鉴定的一般性系统。
此外，因为多数蛋白质工程化方法产生了大量的氨基酸突变选择，一般需要筛选许多变体来产生希望的蛋白质性质。通常，不断重复筛选来产生有益变体。从而，多数方法是费事费时的。本领域不断需要有效并且产生所希望的结果的蛋白质工程方法。
发明概述
本发明提供了蛋白质工程方法。特别地，本发明提供了利用位点评估文库的方法。具体地，本发明提供了利用对许多希望的性质所得的信息，以便理性并且有效设计将优化那些性质的文库。在一些实施方案中，本发明提供了设计对于至少两种希望的性质改进的文库。
本发明提供了鉴定蛋白质氨基酸序列中在改进蛋白质的希望性质中相关的位置的方法。在一些尤其优选的实施方案中，本发明提供了确定哪些突变是所希望的以便产生具有这些希望性质以及改进的性质的蛋白质的方法。在一些额外尤其优选的实施方案中，本发明提供了鉴定比野生型蛋白质具有特定百分数改善(例如，对于一种性质比野生型的110％更好)的氨基酸位置和突变。在仍然进一步优选的实施方案中，本发明提供了鉴定突变的方法，所述突变提供了比野生型蛋白质至少一种改进许多的性质和至少一种额外的不比野生型蛋白质显著更差的性质(例如，一种性质比野生型的110％更好，然而另一种性质不比野生型的90％更差)。在还进一步优选的实施方案中，基于该信息构建了文库。在一些实施方案中，使用所有鉴定的突变构建文库，而在一些其他实施方案中，使用所鉴定突变的子集构建文库。实际上，文库不意在局限于任何具体的成员和/或突变类型。
本发明提供了蛋白质工程化的方法，其包括步骤：提供蛋白质变体文库；在目的测试中测试蛋白质变体文库的至少一种目的性质；为所述至少一种目的性质鉴定值的范围；鉴定该值范围内与目的测试中的有利结果相关的最小值；和提供具有高于所述至少一种目的性质的范围内最小值的至少一种突变的多种蛋白质变体，从而提供包含至少一个突变的蛋白质变体文库，并且其中该文库富含在目的测试中具有有利结果的成员。在一些实施方案中，有利的结果对应于大于在上面第一步中给出的测试中观察到的最大值的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约95％的值。在一些备选实施方案中，在本发明的方法中使用一个以上的目的测试。在一些优选实施方案中，蛋白质是酶。在一些尤其优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。
本发明还提供了蛋白质工程化方法，包括步骤：提供蛋白质变体文库；在目的测试中测试蛋白质变体文库的至少两种目的性质；为所述至少两种目的性质鉴定值的范围；鉴定该值范围内与目的测试中的有利结果相关的最小值；和提供高于所述至少两种目的性质的范围的最小值的多种蛋白质变体，从而提供富含在目的测试中具有有利结果的成员的蛋白质变体文库。在一些优选实施方案中，有利的结果对应于在上面第一步中给出的测试中观察到的最大值的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约95％的值。在一些优选实施方案中，蛋白质是酶。在一些尤其优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。
本发明还提供了蛋白质工程化方法，包括步骤：提供野生型蛋白质和野生型蛋白质的蛋白质变体的文库；在目的测试中测试蛋白质变体文库和野生型蛋白质的至少一种目的性质；鉴定所述至少一种目的性质的值范围；鉴定与目的测试中有利结果相关的值范围中的最小值；鉴定与为野生型所得的结果相比具有有利结果的蛋白质变体，其中有利结果是改进的目的性质；并提供高于所述至少一种目的性质范围的最小值的多种蛋白质变体，从而提供富含在目的测试中具有有利结果的成员的改进蛋白质变体的文库。在一些优选实施方案中，所述方法还包括确定性能指数的步骤，其中通过将为每种改进的蛋白质变体得到的值和为野生型蛋白质得到的值相除确定性能指数。在一些尤其优选的实施方案中，方法还包括鉴定改进的蛋白质变体的步骤，其中改进的蛋白质变体在目的测试中实现大于1.1的性能指数值。在一些额外实施方案中，所述蛋白质是酶。在一些尤其优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些备选实施方案中，所述蛋白质选自抗体和生长因子。在额外优选的实施方案中，所述野生型蛋白质是选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶的成熟形式。在一些优选实施方案中，目的性质选自电荷、洗涤性能、硬表面清洁性能、溶解度、热稳定性、保存稳定性、洗涤剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率和底物降解。在一些实施方案中，野生型蛋白质和蛋白质变体是至少一种洗涤剂组合物的组分。在一些优选实施方案中，在配制成具有5到12.0的pH的粉状或液体洗涤剂的洗涤剂组合物中测试洗涤性能。
本发明还提供了产生在蛋白质折叠内亲本蛋白的改进变体的方法，包括：在目的测试中测定跨越目的性质范围的蛋白质折叠内测试蛋白的多种变体；鉴定与目的测试中有利结果有关的目的性质范围内的最小值；在目的测试中测试蛋白质折叠的亲本蛋白；并通过在亲本蛋白质中引入氨基酸突变产生亲本蛋白的改进变体使得改进的变体高于目的性质范围的最小值。在一些优选实施方案中，亲本蛋白和测试蛋白是不同的。在一些实施方案中，所述方法还包括确定性能指数的步骤，其中通过将为每种改进的蛋白质变体得到的值和为亲本蛋白质得到的值相除确定性能指数。在一些实施方案中，测试蛋白和亲本蛋白是酶。在一些尤其优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些备选实施方案中，测试和亲本蛋白质选自抗体和生长因子。在额外优选的实施方案中，所述亲本蛋白质是选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶的成熟形式。在一些优选实施方案中，目的性质选自电荷、洗涤性能、硬表面清洁性能、热稳定性、溶解度、保存稳定性、洗涤剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率和底物降解。在一些实施方案中，测试蛋白和亲本蛋白是至少一种洗涤剂组合物的组分。在一些备选实施方案中，改进的蛋白质是洗涤剂组合物的组分。在一些优选实施方案中，在配制成具有约5到约12.0的pH的粉状或液体洗涤剂的洗涤剂组合物中测试洗涤性能。
本发明还提供了分离的芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体，其中枯草杆菌蛋白酶变体是成熟形式，具有蛋白水解活性并且在选自以下位置的一个或多个位置包含取代：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273和274，其中所述位置通过与SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列对应进行编号。在一些实施方案中，所述一个或多个位置选自：1，2，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273和274，其中所述位置通过与SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列对应进行编号。在一些其他实施方案中，所述一个或多个位置选自：2，3，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21，22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91，92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112，113，114，115，116，122，123，124，125，126，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，249，250，251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，和274，其中所述位置通过与SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列对应进行编号。在一些实施方案中，所述枯草杆菌蛋白酶变体还包含选自18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一个或多个位置上的取代，并且其中所述位置通过与SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列对应进行编号。在一些优选实施方案中，所述取代包含如下的一个或多个位置：A001C，A001D，A001E，A001F，A001G，A001H，A001I，A001K，A001L，A001M，A001N，A001Q，A001R，A001S，A001V，A001W，Q002A，Q002D，Q002E，Q002G，Q002S，S003A，S003D，S003F，S003G，S003I，S003K，S003L，S003M，S003N，S003P，S003Q，S003R，S003T，S003V，S003W，S003Y，P005C，P005E，P005G，P005N，P005Q，P005T，Y006A，Y006C，Y006E，Y006F，Y006G，Y006K，Y006M，Y006N，Y006P，Y006Q，Y006R，Y006T，Y006V，Y006W，S009A，S009C，S009E，S009F，S009G，S009H，S009K，S009L，S009M，S009P，S009Q，S009R，S009T，S009V，S009W，Q010A，Q010C，Q010E，Q010F，Q010G，Q010H，Q010I，Q010K，Q010L，Q010M，Q010R，Q010S，Q010T，Q010V，Q010W，I011C，I011L，I011T，I011V，I011Y，K012A，K012C，K012D，K012E，K012F，K012G，K012H，K012I，K012N，K012Q，K012S，K012T，K012V，K012W，K012Y，A013C，A013F，A013G，A013H，A013L，A013R，A013S，A013T，A013V，P014A，P014C，P014D，P014E，P014F，P014G，P014I，P014K，P014L，P014M，P014N，P014Q，P014R，P014S，P014T，P014V，P014W，P014Y，A015C，A015D，A015E，A015F，A015G，A015H，A015I，A015K，A015L，A015M，A015P，A015Q，A015R，A015T，A015V，A015Y，L016A，L016C，L016I，L016M，L016Q，L016S，L016T，H017F，H017I，H017L，H017M，H017V，H017W，H017Y，S018A，S018E，S018F，S018G，S018H，S018I，S018K，S018L，S018M，S018N，S018P，S018Q，S018R，S018T，S018V，S018W，S018Y，Q019A，Q019C，Q019D，Q019E，Q019G，Q019I，Q019K，Q019M，Q019R，Q019T，Q019V，G020A，G020C，G020D，G020E，G020F，G020H，G020K，G020M，G020N，G020P，G020Q，G020R，G020S，G020W，Y021A，Y021C，Y021D，Y021E，Y021F，Y021G，Y021H，Y021K，Y021M，Y021R，Y021S，Y021T，Y021V，Y021W，T022A，T022C，T022E，T022F，T022G，T022H，T022I，T022K，T022L，T022M，T022N，T022Q，T022S，T022V，T022W，T022Y，S024C，S024F，S024G，S024H，S024I，S024K ，S024L，S024M，S024N，S024Q，S024R，S024T，S024W，S024Y，N025C，N025E，N025F，N025G，N025H，N025I，N025K，N025L，N025M，N025P，N025R，N025S，N025T，N025V，N025W，K027A，K027D，K027E，K027F，K027G，K027H，K027L，K027M，K027P，K027R，K027S，K027W，K027Y，S033A，S033F，S033G，S033H，S033P，S033T，S033W，I035A，I035C，I035D，I035R，I035S，I035T，I035V，D036A，D036C，D036E，D036Q，D036S，D036W，S037A，S037C，S037E，S037F，S037G ，S037H，S037K，S037L，S037M，S037P，S037Q，S037R，S037T，S037W，H039C，H039Q，H039T，H039V，P040A，P040C，P040E，P040F，P040G，P040G，P040H，P040I，P040K，P040L ，P040M，P040N，P040Q，P040R，P040S，P040T，P040V，P040W，D041E，L042I，L042M，L042V，K043A，K043C，K043D，K043E，K043F，K043G，K043I，K043L，K043M，K043N，K043R，K043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在一些优选实施方案中，所述取代包含选自：Y021H-A045V-Y217E，Y021W-S101E-G128R-Y217Q，Y021H-Y217E，Y021H-A045V-S101N-Y217Q，Y021H-A045I-Y217E，Y021H-A045I-S101E-Y217Q，Y021W-A045I-S101E-Y217E，D036N-S101E-Y217L，Y021H-A045V-Y217Q，Y021H-A045I-S101E-Y217L，Y021H-A045I-Y217E，Y021H-Y217Q，Y021W-S101E-Y217L，Y021W-A045V-S101E-Y217L，Y021H-A045V-S101E-Y217E，S101E-Y217L，Y021H-A045V-S101E-Y217Q，Y021H-Y217L，Y021W-A045I-S101N-Y217L，S101N-K213I-Y217Q，Y021W-S101N-Y217L，Y021H-S101E-Y217E，M119F-K213K-Y217Q，Y021W-A045V-Y217E，Y021W-A045I-Y217E，M119F-K213I-Y217Q，Y021W-Y217E-N212S，M119F-K213L-Y217E，K213I-Y217Q，A045I-Y217Q，Y021W-A045V-S101E-Y217Q，Y021H-A045V-S101E-Y217L，S101S-M119F-K213I-Y217Q，K213N-Y217Q，M119F-Y217Q，S024H-A092G-A114G，S101N-M119F-K213I-Y217Q，S101N-K213L-Y217Q，S101N-M119F-K213K-Y217L，S101N-M119F-K213I-Y217L，Y021H-A045V-S101E，S101N-K213L-Y217E，A045V-Y217L，S101N-K213I-Y217L，S101S-M119M-K213K-Y217L，Y021H-Y217L，S101E-K213L-Y217L，K213I-Y217E，S101N-M119F-Y217E，Y021W-A045V-Y217L，A092G-A114G，S024H-A092G-Q103E，Y021W-S101E，V26Q-K213I，Y021H-S101N，S101E-K213N-Y217E的组合。在一些实施方案中，所述取代包含选自：S024S-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114G-V246V，S024S-V028V-M050V-A092A-Q 103Q-A114A-V246V，S024S-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114G-V246V，S024H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114A-V246T，S024H-V028V-M050V-A092A-Q103E-A114A-V246V，S024H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114G-V246V，S024H-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246V，S024H-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246T，S024S-V028V-M050M-A092G-Q103Q-A114A-V246T，S024H-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T，S101E-M119N-K213N，S101N-K213I，S101N-M119H，M119H-K213I-Y217L，S101N-M119H-K213N-Y217L，S101N-K213L-Y217E，M119N-K213N-Y217L，M119F-K213L-Y217E，S101P-K213N，S101N-M119H-K213N，S101N-M119F-K213I-Y217L，K213L，M119N-K213N，K213N，K213I-Y217E，S101N-M119H-Y217Q，S101P-K213N-Y217L，M119N-K213I，K213N-Y217Q，M119H-K213N，S101N-K213L-Y217Q，S101P-K213N，S101E-K213N-Y217E，S101E-M119H-K213I-Y217Q，S101E-M119H-K213N，K213I-Y217Q，S101N-K213I-Y217Q，M119H-Y217Q，S101N-M119N-K213N-Y217Q，M119H-K213I-Y217Q，K213I-Y217Q，S101E-M119N-Y217L，M119F-K213L，M119H-K213N-Y217E，S101N-M119N-K213N-Y217Q，S101N-M119H-K213N-Y217Q，M119H-K213I-Y217Q，Y217Q，M119H-K213N-Y217Q，S101N-M119F-Y217E，M119F-Y217Q，S101N-M119F-K213I-Y217Q，S101N-K213I-Y217L，S101N-M119H-K213N-Y217L，S101E-K213L-Y217L，S101N-K213N-Y217Q，S101N-M119H-K213L，S101N-M119H-K213I，S101P-K213N-Y217L，M119F-K213I-Y217Q，S101N-K213I-Y217Q，S101E-M119H-K213I-Y217L，S101N-M119H-K213I-Y217Q，M119H-K213N-Y217E，S101N-M119N-K213N-Y217L，A048E-K213L，A048H-K213L，V026Q-A048Y-K213L，K213N，V026N-K213L，V026N-K213L，V026Y-K213N，A048D-K213N，V026Q-A048E-K213L，A048H-K213N，V026Q-A048H-K213L，A048H-K213L，K213L，K213N，V147D-K213L，K213I，V026Q-A048E-K213N，V026N-A048E-K213N，A048E-K213L，V026Y-A048E-K213I，A048D-K213N，K213I，A048H-K213N，V147D-K213N，Y021H-A045V-S101E-Y217L，Y021H-Y217L，Y021H-A045V-S101E-Y217Q，Y021H-A045I-S101E-Y217L，Y021H-Y217Q，Y021H-A045V-Y217E，A045V-Y217L，Y021H-A045V-S101N-Y217Q，Y021W-S101P-Y217L，Y021W-A045I-Y217E，Y021H-A045V-S101E-Y217E，Y021H-A045I-S101E-Y217L，Y021H-A045I-S101E-Y217Q，Y021H-A045V-Y217E，Y021W-S101E-Y217L，S101E-Y217L，Y021H-A045V-Y217Q，Y021H-Y217E，Y021W-Y217E-(N0212S)，A045I-Y217Q，Y021H-A045V-Y217E，Y021W-A045V-S101E-Y217Q，Y021H-S101E-Y217E，Y021W-S101N-Y217L，S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114A-V246T，Y021H-A045V-S101E，Y021W-A045V-S101E-Y217L，S101N-M119H-K213K-Y217Q，S101S-M119N-K213N-Y217Q，Y021H-A045V-S101P-Y217L，S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T，S101S-M119F-K213I-Y217Q，S101S-M119M-K213K-Y217L，Y021H-A045I-S101E-Y217Q，Y021H-A045V-S101E-Y217E，Y021H-A045V-S101E，Y021H-Y217L，Y021H-A045I-Y217E，Y021W-A045I-S101E-Y217E，S101N-M119F-K213K-Y217L，S101E-M119H-K213N-Y217E，Y021H-A045I-Y217E，S101S-M119H-K213L-Y217L，Y021H-Y217E，S101S-M119F-K213K-Y217Q，和Y021H-A045I-S101E-Y217L的组合。在一些实施方案中，所述取代包含选自：S024S-V028T-M050V-A092G-Q103E-A114G-V246T，S101N-M119H，M119N-K213N-Y217L，Y217L，M119N-K213N，K213N，K213N-Y217Q，S101E-K213N-Y217E，S101E-M119N-Y217L，Y217Q，S101N-M119N-K213N-Y217E，S101N-M119N-K213N-Y217L，Y021H-A045I-S101E-Y217L，S101E-Y217L，A045I-Y217Q，S101S-M119M-K213K-Y217L，Y021H-A045I-S101E-Y217L的组合。
本发明还提供了包括在实施例中提供的表中给出的变体，以及包含这些变体的组合物。
本发明还提供了分离的编码枯草杆菌蛋白酶变体的核酸、包含所述核酸的表达载体，和包含该表达载体的宿主细胞。此外，本发明提供了包含枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。在一些实施方案中，清洁组合物是洗衣洗涤剂。在一些实施方案中，洗衣洗涤剂是冷水洗涤剂、低pH洗涤剂或者浓缩洗涤剂。此外，本发明提供了生产芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括：用包含编码枯草杆菌蛋白酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；并在适于产生该枯草杆菌蛋白酶变体的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括收获产生的枯草杆菌蛋白酶变体的步骤。在一些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌物种，在这些实施方案的子集中，所述芽孢杆菌物种是枯草芽孢杆菌。此外，本发明提供了清洁方法，包括将包含织物的表面和/或物品与包含分离的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物接触。
此外，本发明提供了蛋白酶工程化方法，包括步骤：a)提供多个位点评估文库(SEL)，每个文库包含在蛋白酶的相同氨基酸位置具有不同取代的多个蛋白酶变体；b)在目的性质测试中测试SEL的蛋白酶变体和标准蛋白酶；c)为该测试的蛋白酶变体的每一种确定性能指数(PI)；d)将两个或多个氨基酸位置鉴定为非限制性位置；其中两个SEL的每一个中所述多种蛋白酶变体的至少一种具有大于0.5的PI；和f)提供多突变文库，其包含许多多取代的蛋白酶变体，每种变体在两个或更多非限制性位置包含取代。在一些实施方案中，所述测试包括选自污渍去除测定(微样品)、LAS稳定性测定、洗涤剂稳定性测定和比活性测定的两种或多种不同的测定法。在一些实施方案中，蛋白酶选自细菌丝氨酸蛋白酶、细菌枯草杆菌蛋白酶和细菌中性金属蛋白酶。
在进一步的实施方案中，本发明提供了产生芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的多取代的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括：在第一种性质的第一种测试和第二种性质的第二种测试中测试多种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体，其中亲本枯草杆菌蛋白酶的性质在每种测试中被给予1.0的值，有利的第一种或第二种性质具有大于1.0的值，并且过分不利的第一种或第二种性质具有小于约0.80的值或者在一些优选实施方案中，小于约0.60；鉴定至少一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第一种性质相关并且不与过分不利的第二种性质相关的取代；鉴定至少一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第二种性质相关并且不与过分不利的第一种性质相关的取代；并将来自前面步骤的取代引入枯草杆菌蛋白酶中以产生多取代的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施方案中，方法还包括在第一种测试和第二种测试中测试多取代的枯草杆菌蛋白酶变体，其中改进的枯草杆菌蛋白酶变体实现在第一种和第二种中测试中均大于1.0的值，或者在第一种测试中大于1.0的值并且在第二种测试中为0.80到1.0的值。在一些实施方案中，方法还包括产生改进的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施方案中，第一种和第二种性质负相关。在一些实施方案中，有利的第一种或第二种性质具有大于约1.2的值。在一些实施方案中，过分不利的第一种或第二种性质具有小于约0.40的值。在一些实施方案中，第一种性质是稳定性，第二种性质是洗涤性能。在这些性质的子集中，稳定性包括洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包括洗涤剂中的血奶墨(BMI)洗涤性能。在一些实施方案中，亲本细菌枯草杆菌蛋白酶是具有SEQ ID NO：2给出的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。在其他实施方案中，亲本细菌枯草杆菌蛋白酶是迟缓芽孢杆菌(B.lentus)GG36枯草杆菌蛋白酶的野生型，具有SEQ ID NO：562给出的氨基酸序列，或者是BPN”，包含Y217L取代(SEQ IDNO：565)，单独或者与其他修饰组合。在本发明的一些实施方案中，在具有5到12.0的pH的粉状或者液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。所述步骤不意在局限于上面所列的确切顺序，因为任何合适的顺序可用于本发明。然而，在一些优选实施方案中，所述取代是在亲本枯草杆菌蛋白酶中具有大于约50％或大于约65％的溶剂可及表面(SAS)的位置中。
附图简述
图1A提供了pHPLT-VAAc1的图，而图1B提供了pHPLT-BPN’的图。
图2A描述了北美洗衣洗涤剂中BPN’-Y217L CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的函数。类似地，图2B描绘了在北美洗衣洗涤剂中GG36CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的函数。
图3A描绘了西欧液体洗衣洗涤剂中BPN’-Y217L CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的函数。类似地，图3B描绘了西欧液体洗衣洗涤剂中GG36CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的函数。
图4A描绘了日本粉状洗衣洗涤剂中BPN’-Y217L CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的函数。类似地，图4B描绘了日本粉状洗衣洗涤剂中GG36 CCL的BMI清洁性能作为电荷改变的函数。
图5A描绘了自动餐具洗涤剂中BPN’-Y217L CCL的烘焙蛋黄清洁性能作为电荷改变的函数。类似地，图5B描绘了自动餐具洗涤剂中GG36CCL的烘焙蛋黄清洁性能作为电荷改变的函数。
图6描绘了对于含有80种变体的文库，LAS/EDTA稳定性作为相对于亲本BPN’-Y217L的净电荷改变的函数。
发明描述
本发明提供了蛋白质工程化方法。特别地，本发明提供了利用位点评估文库的方法。
为了实际目的，通常不必在蛋白质空间中发现最好的序列以便产生对于具体应用为最优的蛋白质。对于多数应用，待解决的问题是鉴定满足或者超过许多性质所需的最小值的至少一种蛋白质序列。这需要对于具体性质有益的突变的知识，以及对于任何希望的性质有害的那些突变的知识。本发明通过鉴定蛋白质中可以被改变以改善主要性质和将对于其他性质的值保持在希望的范围内的那些位置，提供了满足该目标的方法。
本发明提供了通过在每个位点建立“文库评估文库”评估蛋白质中所有位置的所有目的性质的方法。在优选实施方案中，这些文库在每个位置含有9-19个突变，并且用于评估每个位置在工程化蛋白质和构建文库中的用途。测量相对于亲本酶的每种性质并且计算每种突变体相对于野生型的表观自由能差异。然后将这些delta delta G(“即，ΔΔG”)表观值用于确定可加性。
一种分析变体的理想方法将是通过在目的过程中变体相对于亲本蛋白的自由能差异。过程的吉布斯自由能代表系统可以做功的最大量。相对于亲本酶的自由能改变(ΔΔG)在如下给出：
ΔΔG＝-RT ln(k变体/k亲本)
其中k变体是变体酶的速率常数，并且k亲本是亲本酶的速率常数，R是气体常数，T是绝对温度。多数测定法没有被构建成允许测定真正的自由能，因此我们利用量
ΔΔGapp＝-RT ln(P变体/P亲本)
其中P变体是变体的性能值，P亲本是在相同条件下亲本酶的性能值。可以预期ΔΔGapp值对于数据分布和可加性具有与ΔΔG相似的方式。然而，因为ΔΔG是与亲本酶相比变体可以做功的最大量，所以量ΔΔGapp将通常低估了ΔΔG并且导致似乎协同的结果，因为两个相加位置的性质可以大于通过将它们ΔΔGapp值相加预测的值。
本发明的方法用于设计有效文库，该文库用于平行地改造多个性质。尽管在本文描述了一些酶，但是方法适用于任何用于工程化的目的蛋白质。通过在每个位置引入12到19个取代，如本文所述的构建位点评估文库(SEL)。使用活性和稳定性测定法分析所得的突变。将野生型氨基酸列为每个位置的参考点。对于每种性质，用测量结果确定亲本蛋白的ΔΔGapp的平均值和标准差。将亲本平均值(μ亲本)归一化为0，并确定ΔΔGapp的标准差(σ亲本)。这些值用作分子的每个位置上每种性质的参考值。检验位点评估数据的性质之间的相关性证据。将每种性质的ΔΔGapp值对每种其他性质作图并计算相关系数。蛋白质底物的两种活性测量结果是相关的。
为了分析氨基酸序列内的位置，定义了两种类型的位点。“非生产性”位点没有好于亲本酶的突变体，而“生产性”位点具有至少一个好于亲本酶的取代。位点将是生产性的概率通过生产性位点除以位点总数给出。尽管任一突变将好于亲本酶的概率很低(即，6％-28％)，但是给定位点将具有至少一个向上突变(Up mutation)的概率相当高。
重要的是确定生产性和非生产性位点在结构特征(例如，埋藏的氨基酸、相互作用的氨基酸、活性位点附近的位置，等等)方面在蛋白酶中是怎样分布的，以及在进化中保守的或者可改变的序列位点。为了做出该确定，检查结构并将序列与非冗余同源物比对。
如实施例中指出，任何性质的有害突变与每个其他性质的有害突变相关，不管性质的相关性如何。仅仅少数位置(5-10％)具有对所有性质有害的突变。这些位置定义了“折叠”(fold)并且在进化中保守。其含意是尽管对于任何性质，有益突变的鉴定需要该性质的真实预测筛选，但是鉴定可能对任一性质有害的突变可以使用ANY筛选完成。一种简化的蛋白质工程化策略是建立SEL并使用简单的活性和/或稳定性筛选方法进行筛选。鉴定有害突变并且具有很少有害突变的那些位置用于构建文库和组合突变来改进多种性质。而且，挑选在蛋白质表面上、有很少的相互作用并且在序列比对中可变的位点提供了高比例的生产性位点。在分子内部、具有许多接触并且在进化中强烈保守的位点具有有害突变的概率很高并且应该避免。设想用于分析序列和/或结构信息的任何合适方法将可用于本发明，包括但不限于计算机和/或电学方法和/或程序。
方法提供了对于两种性质的每一种具有大于5％wt活性和小于5％活性的变体数目的逐对比较，以及这两种性质的相关系数。
文库设计
在一些尤其优选的实施方案中，位点评估文库用于组合文库设计。常规的定向进化建立了随机文库并且为单一性质筛选大量文库，将这些组合并重复该方法。如一些研究人员已经发现(见例如，Bloom et al.，Curr.Opin.Struct.Biol.，15：447-452[2005]；Bloom et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：5869-5874[2006]；和Guo et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9205-9210[2004])，一种性质的积极突变的积累通常导致其他性质中的降低。任一突变对于任一性质将是向上的概率是小的，并且任一突变将是向下的概率是高的(＞85％)，并且积累三个(3)以上增加活性的突变将导致一些其他性质的降低的概率是相当高的。通过使用位点评估数据建立将对于多种性质有益的文库避免了该问题。在组合文库中不包括非生产性位点，并且通过向上的突变百分比进一步对生产性位点分类。
清洁组合物
本发明的清洁组合物有利地用于例如洗涤应用、硬表面清洁、自动洗碟应用，以及美容应用，如义齿、牙齿、头发和皮肤。然而，由于在较低温度溶液中增加的有效性的独特优点，本发明的酶理想地适于洗涤应用。此外，本发明的酶可用于粒状和液体组合物中。
本发明的变体蛋白酶也可以用于清洁添加剂产品中。在一些实施方案中，可用于低温溶液清洁应用。添加剂产品在其最简单的形式中可以是一种或多种蛋白酶。在一些实施方案中，将添加剂以剂型包装用于加入清洁过程中。任何合适的单一剂型也可以用于本发明，包括但不限于，丸剂、片剂、软胶囊、或者其他单一剂量单位，如预先测量的粉剂或液体。在一些实施方案中，包括填充剂或载体材料以增加此类组合物的体积。合适的填充剂或者载体材料包括但不限于，多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石粉、粘土等等。用于液体组合物的合适填充剂或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二元醇。此类醇的实例包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组合物含有约5％到约90％的此类物质。酸性填充剂可用于降低pH。备选地，清洁添加剂包括如下文更详细描述的附属成分。
本清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的至少一种本文提供的蛋白酶变体，其单独或者与其他蛋白酶和/或额外酶组合。通过加入一种或多种本发明的蛋白酶变体实现酶的所需水平。典型的，本清洁组合物将包含至少约0.0001重量百分比，约0.0001到约1、约0.001到约0.5、或甚至约0.01到约0.1重量百分比的至少一种本发明的变体蛋白酶。
典型地配制本文的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有约5.0到约11.5或甚至约7.5到约10.5的pH。典型地配制液体产品制剂以具有约3.0到约9.0或甚至约3到约5的净pH。典型地配制粒状洗衣产品以具有约9到约11的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等等，并且是本领域技术人员公知的。
合适的低pH清洁组合物通常具有约3到约5的净pH，并且通常没有在这种pH环境中水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括烷基硫酸钠表面活性剂，其包含至少一个环氧乙烷部分或者甚至约1到约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物通常包含足够量的pH修饰剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或者氢氯酸，以提供具有约3到约5的净pH的此类清洁组合物。此类组合物通常包含至少一种酸稳定的酶。在一些实施方案中，组合物是液体，而在其他实施方案中，它们是固体。此类液体组合物的pH通常测量为净pH。此类固体组合物的pH作为所述组合物的10％固体溶液测量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施方案中，在20℃进行所有pH测量。
在一些实施方案中，当变体蛋白酶用于粒状组合物或液体中时，希望变体蛋白酶为经封装颗粒形式以保护该变体蛋白酶免于保存期间粒状组合物的其他组分的作用。此外，封装也是在清洁过程中控制变体蛋白酶可用性的一种手段。在一些实施方案中，封装增强了变体蛋白酶和/或额外酶的性能。在这方面，用本领域已知的任何合适的封装材料封装本发明的变体蛋白酶。在一些实施方案中，封装材料通常封装本发明变体蛋白酶的至少部分催化剂。通常，封装材料是水溶性的和/或水可分散的。在一些实施方案中，封装材料具有0℃或更高的玻璃转化温度(Tg)。玻璃转化温度在WO 97/11151中更详细描述。封装材料选自糖类、天然或合成的树胶、壳多糖、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡和其组合。当封装材料是糖类时，其通常选自单糖、寡糖、多糖和其组合。通常，封装材料是淀粉。合适的淀粉描述于EP 0 922 499；US 4,977,252；US 5,354,559，和US 5,935,826。在一些实施方案中，封装材料是塑料如热塑塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和其混合物制成的微球体；可使用的可商购微球体包括以EXPANCEL
Figure BPA00001263671500251
(Stockviksverken，Sweden)，和PM 6545，PM 6550，PM 7220，PM 7228，EXTENDOSPHERES
Figure BPA00001263671500252
LUXSIL
Figure BPA00001263671500253
Q-CEL
Figure BPA00001263671500254
和SPHERICEL
Figure BPA00001263671500255
(PQ Corp.，Valley Forge，PA)提供的微球体。
如本文所述，本发明的变体蛋白酶可尤其用于清洁工业，包括，但不限于洗衣和洗碟洗涤剂。这些应用将酶置于多种环境胁迫下。本发明的变体蛋白酶由于在多种条件下的稳定性相对于许多当前使用的酶提供了益处。
实际上，有多种洗涤条件，包括参与洗涤的蛋白酶所暴露的不同的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间长度。此外，用于不同的地理区域的洗涤剂制剂存在于洗涤水中的相关组分具有不同浓度。例如，欧洲洗涤剂通常在洗涤水中具有约4500-5000ppm的洗涤剂组分，而日本洗涤剂通常在洗涤水中具有约667ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约975ppm的洗涤剂组分。
低洗涤剂浓度系统包括其中在洗涤水中存在少于约800ppm洗涤剂组分的洗涤剂。日本洗涤剂通常被认为是低洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约667ppm的洗涤剂组分。
中洗涤剂浓度包括其中在洗涤水中存在约800ppm到约2000ppm洗涤剂组分的洗涤剂。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约975ppm的洗涤剂组分。巴西洗涤剂通常具有存在于洗涤水中约1500ppm的洗涤剂组分。
高洗涤剂浓度系统包括洗涤剂，其中洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。通常认为欧洲洗涤剂是高洗涤剂浓度系统，其通常在洗涤水中含有约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲洗涤剂通常是高泡磷酸增洁洗涤剂，拉丁美洲使用的洗涤剂范围可落入中洗涤剂浓度和高洗涤剂浓度之间，因为它们在洗涤水中的洗涤剂组分范围在1500ppm至6000ppm。如上所述，巴西洗涤剂通常在洗涤水中含有约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其他高泡磷酸增洁洗涤剂地区，不限于其他拉丁美洲国家，可具有高洗涤剂浓度系统，在洗涤水中存在高达约6000ppm的洗涤剂组分。
鉴于上述内容，很显然，典型的洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度在世界范围内变动，从低于约800ppm的洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度系统”)，例如日本的约667ppm，到在约800ppm至约2000ppm之间(“中洗涤剂浓度系统”)，例如美国的约975ppm和巴西的约1500ppm，到大于约2000ppm(“高洗涤剂浓度系统”)，例如欧洲的约4500ppm至约5000ppm，以及高泡磷酸增洁洗涤剂地区的约6000ppm。
根据经验确定典型洗涤溶液的浓度。例如，在美国，典型的洗衣机容纳体积约64.4L的洗涤溶液。因此，为了获得洗涤溶液中约975ppm的洗涤剂浓度，应该向64.4L洗涤溶液中添加62.79g的洗涤剂组合物。该量是消费者利用洗涤剂提供的量杯量入洗涤水中的典型量。
在另一实例中，不同地区使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水的温度通常低于欧洲使用的温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常在10至30℃(如，约20℃)，而欧洲洗涤水温度一般在30至60℃(如，约40℃)。
在另一实例中，不同地区通常具有不同的水硬度。水硬度一般通过每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令(grain)数来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的度量。美国的多数水是硬水，但硬度值不同。中等硬度水(60-120ppm)至硬水(121-181ppm)具有60至181ppm的硬度矿物(ppm转换成格令/美制加仑是：ppm数除以17.1等于格令/加仑)。
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欧洲水硬度通常大于10.5(例如10.5-20.0)格令/加仑混合的Ca2+/Mg2+(例如，约15格令/加仑混合的Ca2+/Mg2+)。北美水硬度通常大于日本水硬度，但小于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在3-10格令之间、3-8格令或约6格令。日本水硬度通常低于北美水硬度，一般低于4，例如3格令/加仑混合的Ca2+/Mg2+。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了在至少一组洗涤条件下(例如，水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)，表现出令人惊讶的洗涤性能的变体蛋白酶。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白酶与其他枯草杆菌蛋白酶的洗涤性能是相当的。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白酶表现出比当前可商购的枯草杆菌蛋白酶增强的洗涤性能。因此，在本发明的一些优选实施方案中，本文提供的变体蛋白酶表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可再次单独或者与增洁剂和稳定剂组合用于不包括洗涤剂的清洁组合物中。
在本发明的一些实施方案中，清洁组合物包含本发明的至少一种变体蛋白酶，其水平是占组合物重量的约0.00001％至约10％，以及包含清洁辅助材料的余量(balance)(例如，占组合物重量的约99.999％至约90.0％)。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物包含至少一种变体蛋白酶，水平为占组合物重量的约0.0001％至约10％，约0.001％至约5％，约0.001％至约2％，约0.005％至约0.5％，以及包含清洁辅助材料的清洁组合物余量(例如，以重量计约99.9999％至约90.0％，约99.999％至约98％，约99.995％至约99.5％)。
在一些实施方案中，优选的清洁组合物除了本文提供的一种或多种变体蛋白酶之外，还包含一种或多种其他酶或酶衍生物，所述酶或酶衍生物提供清洁性能和/或织物护理益处。此类酶包含但不限于其他蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶(例如，虫漆酶)和/或甘露聚糖酶。
任何适合的蛋白酶都可用于本发明的组合物。合适的蛋白酶包含动物、植物或微生物来源的。在一些尤其优选的实施方案中，使用微生物蛋白酶。在一些实施方案中，包含化学的或遗传修饰的变体。在一些实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例包含枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属物种(例如，枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌)的蛋白酶，以及枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168。其他实例包含在美国专利号RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628中描述的变体蛋白酶，均引入本文作为参考。其他蛋白酶的实例包含但不限于胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，和WO 89/06270中描述的镰孢菌(Fusarium)蛋白酶。优选的市售蛋白酶包括MAXATASE
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MAXACALTM、MAXAPEMTM、OPTICLEAN
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OPTIMASE
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PROPERASE
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PURAFECT
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和PURAFECT
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OXP(Genencor)、ALCALASE
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SAVINASEPRIMASE
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DURAZYMTM、RELASE和ESPERASE(Novozymes)和BLAPTM(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien，Duesseldorf，德国)。在WO95/23221，WO 92/21760，和美国专利号5,801,039，5,340,735，5,500,364，5,855,625，US RE 34,606，5,955,340，5,700,676，6,312,936，和6,482,628，和多种其他专利中描述了多种蛋白酶。
此外，任何适合的脂肪酶都可用于本发明。合适的脂肪酶包含但不限于细菌或真菌来源的。本发明涵盖了化学或遗传修饰的突变体。有用的脂肪酶的实例包括Humicola lanuginosa脂肪酶(参见例如，EP 258 068和EP 305 216)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如，EP 238 023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶，例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如，南极假丝酵母脂肪酶A或B，参见例如EP 214 761)、假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如，枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta 1131：253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如JP 64/744992)；和短芽孢杆菌脂肪酶(参见例如WO91/16422))。
此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明的一些实施方案，包含但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见，Yamaguchi等人，Gene 103：61-67[1991])、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见，Schimada等人，J.Biochem.，106：383-388[1989])和多种根霉(Rhizopus)脂肪酶，例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见，Hass等人，Gene 109：117-113[1991])、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.56：716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其他类型的脂肪水解酶(如角质酶)也可用于本发明的一些实施方案中，包含但不限于源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)，和源自腐皮镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。
其他合适的脂肪酶包含市售脂肪酶例如M1 LIPASETM、LUMA FASTTM和LIPOMAXTM(Genencor)；LIPOLASE
Figure BPA00001263671500301
和LIPOLASEULTRA(Novozymes)；和LIPASE PTM″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，日本)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含脂肪酶，水平为占组合物重量的约0.00001％至约10％，以及占组合物重量的余量清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物还包含脂肪酶，水平为占组合物重量的约0.0001％至约10％，约0.001％至约5％，约0.001％至约2％，约0.005％至约0.5％。
任何适合在碱性溶液中使用的淀粉酶(α和/或β)都可用于本发明。合适的淀粉酶包含但不限于细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。可用于本发明的淀粉酶的实例包含但不限于获得自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(参见例如，GB 1,296,839)。可用于本发明的市售淀粉酶包含但不限于DURAMYLTERMAMYL
Figure BPA00001263671500304
FUNGAMYL
Figure BPA00001263671500305
和BANTM(Novozymes)，以及RAPIDASE
Figure BPA00001263671500306
和MAXAMYLP(Genencor)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含淀粉酶，水平为占组合物重量的约0.00001％至约10％的其他淀粉酶，以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物还包含淀粉酶，水平为占组合物重量的约0.0001％至约10％，约0.001％至约5％，约0.001％至约2％，约0.005％至约0.5％。
在一些其他实施方案中，任何合适的纤维素膜可用于本发明的清洁组合物。合适的纤维素酶包含但不限于细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。合适的纤维素酶的实例包含但不限于Humicola insolens纤维素酶(参见例如，美国专利号4,435,307)。特别适合的纤维素酶是有颜色护理益处的纤维素酶(参见例如，EP 0 495 257)。可用于本发明的市售纤维素酶包含但不限于CELLUZYME
Figure BPA00001263671500308
(Novozymes)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。在一些实施方案中，掺入的纤维素酶是成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段，其中缺失了N端部分(参见例如，美国专利号5,874,276)。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物还可以包含纤维素酶，水平为占组合物重量的约0.00001％至约10％的其他纤维素酶，以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物还包含纤维素酶，水平为占组合物重量的约0.0001％至约10％，约0.001％至约5％，约0.001％至约2％，约0.005％至约0.5％。
任何适合在洗涤剂组合物中使用的甘露聚糖酶都可用于本发明。合适的甘露聚糖酶包含但不限于细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。可用于本发明的多种甘露聚糖酶是已知的(参见例如，美国专利号6,566,114、美国专利号6,602,842和美国专利号6,440,991，均引入本文作为参考)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含甘露聚糖酶，水平为占组合物重量的约0.00001％至约10％的其他甘露聚糖酶，以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物还包含甘露聚糖酶，水平为占组合物重量的约0.0001％至约10％，约0.001％至约5％，约0.001％至约2％，约0.005％至约0.5％。
在一些实施方案中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本发明的组合物中。在一些备选实施方案中，氧化酶与氧组合使用。两类酶都用于“溶液漂白”(即，当在洗涤液中同时洗涤织物时，防止纺织品染料从染色的织物转移到其他织物上)，优选与增效剂一起使用(参见例如，WO 94/12621和WO 95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包含但不限于植物、细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物还包含过氧化物酶和/或氧化酶，其水平为占组合物重量的约0.00001％至约10％的其他过氧化物酶和/或氧化酶，以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物还包含过氧化物酶和/或氧化酶，水平为占组合物重量的约0.0001％至约10％，约0.001％至约5％，约0.001％至约2％，约0.005％至约0.5％。
在一些实施方案中，可以应用额外的酶，包括但不限于过水解酶(见例如WO 05/056782)。此外，在一些尤其优选的实施方案中，在本文包括上述酶的混合物，尤其一种或多种额外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，本发明可以考虑使用上述酶的多种混合物。考虑变体蛋白酶以及一种或多种其他酶的不同水平均可独立的达到10％，清洁组合物的余量为清洁辅助材料。通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及在使用过程中(例如，提供洗涤洗涤剂使用)用于清洁条件的组合物的期望形态，可以方便的确定对清洁辅助材料的具体选择。
合适的清洁辅助材料的实例包含但不限于表面活性剂、增洁剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、光学增白剂、土壤释放聚合物、染料转移剂、分散剂、消泡剂、染料、香料、着色剂、填充盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调节剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色斑、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(参见例如，美国专利号6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，均引入本文作为参考)。下文详细示例了特定清洁组合物材料的实施方案。在清洁辅助材料与清洁组合物中的本发明变体蛋白酶不相容的实施方案中，使用合适的方法将清洁辅助材料和一种或多种蛋白酶分隔(即，不彼此接触)，直至适合组合这两种组分时。此类分隔方法包括本领域已知的任何合适方法(例如，软胶囊、封装、片剂、物理分隔等)。
在一些优选实施方案中，组合物中包含有效量的本文提供的一种或多种变体蛋白酶，所述组合物用于清洁多种需要去除蛋白质污渍的表面。此类清洁组合物包含用于以下应用的清洁组合物，如清洁硬表面、织物和餐具。实际上，在一些实施方案中，本发明提供了织物清洁组合物，而在其他实施方案中，本发明提供了非织物清洁组合物。值得注意的，本发明还提供了适合个人护理的清洁组合物，包含口腔护理(包含洁牙剂、牙膏、漱口剂等，以及洁齿组合物)、皮肤和头发清洁组合物。本发明旨在涵盖任何形式的洗涤剂组合物(即，液体、颗粒、条形、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊等)。
作为示例，下文更详细地描述了可使用本发明的变体蛋白酶的一些清洁组合物。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物配制成适合衣物机洗方法的组合物，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂和至少一种增洁剂化合物，以及一种或多种清洁辅助材料，所述材料优选选自有机聚合化合物、漂白剂、其他酶、消泡剂、分散剂、石灰皂分散剂、土壤悬浮剂和抗再沉积剂以及缓蚀剂。在一些实施方案中，洗衣组合物还含有软化剂(即，作为其他的清洁辅助材料)。本发明的组合物还可用于固体或液体形式的洗涤剂添加剂产品。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施方案中，本文的洗衣洗涤洗涤剂组合物的密度为约400到约1200g/升，而在其他实施方案中，在20℃测量的密度为约500到约950g/升组合物。
在配制成用于手工洗碟方法的组合物的实施方案中，本发明的组合物优选包含至少一种表面活性剂和优选至少一种其他的清洁辅助材料，所述材料选自有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和其他酶。
在一些实施方案中，本发明的变体蛋白酶可用于多种清洁组合物，例如在美国专利号6,605,458中提供的。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是致密的颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施方案中，组合物是用于着色织物洗涤的颗粒状织物清洁组合物，在其他实施方案中，组合物是通过洗涤力提供软化的颗粒状织物清洁组合物，在其他实施方案中，组合物是重役型液体织物清洁组合物。在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是织物清洁组合物，例如在美国专利号6,610,642和6,376,450中描述的。此外，本发明的变体蛋白酶可用于在欧洲或日本洗涤条件下的特定用途的颗粒状衣物洗涤剂组合物(参见例如，美国专利号6,610,642)。
在一些备选实施方案中，本发明提供了硬表面清洁组合物，其包含至少一种本文提供的变体蛋白酶。从而，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，如美国专利号6,610,642，6,376,450和6,376,450中描述的那些。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的洗碟组合物。从而，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，如美国专利号6,610,642和6,376,450中描述的那些。在还进一步的实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文提供的变体蛋白酶的洗碟组合物。在一些进一步的实施方案中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物包括口腔护理组合物，如美国专利号6,376,450和6,376,450中的那些。前述美国专利号6,376,450，6,605,458，6,605,458和6,610,642中所含的化合物和清洁辅助材料的配制和描述可用于本文提供的变体蛋白酶。
将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并且通过配制人员所选的任何方法制备，其非限制性实例在美国专利号5,879,584，5,691,297，5,574,005，5,569,645，5,565,422，5,516,448，5,489,392和5,486,303中描述，将它们都引入本文作为参考。当希望低pH清洁组合物时，通过加入物质如单乙醇胺或酸性物质如HCl调节此类组合物的pH。
尽管不是本发明的目的必需，下文阐明的辅助物的非限制性列表适用于本清洁组合物。在一些实施方案中，掺入这些辅助物例如以帮助或增强清洁性能，用于处理待清洁的基质，或者修饰清洁组合物的美观，如香料、着色剂、染料等。可以理解将此类辅助物加入到本发明的变体蛋白酶。这些额外组分的精确性质，和其掺入水平将取决于组合物的物理形式和待使用其的清洁操作的性质。合适的辅助物材料包括但不限于，表面活性剂、增洁剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、额外的酶，和酶稳定剂、催化物质、漂白激活剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢来源、预形成的过酸、聚合的分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构增塑剂、衣物柔顺剂、载体、助水溶物、加工助剂和/或色素。除了下面的公开，此类其他辅助物的合适实例和使用水平见引入本文作为参考的美国专利号5,576,282，6,306,812和6,326,348。前述辅助物成分可以构成本发明的清洁组合物的余量。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂和其混合物。
在一些额外实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂增洁剂或增洁剂系统。增洁剂包括但不限于，多磷酸的碱金属盐、铵盐和烷醇铵盐、碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐、铝硅酸增洁剂多元羧酸混合物、羟基多元羧酸醚、马来酐和乙烯或乙烯基甲醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三硫酸，和羧基甲氧基琥珀酸、多乙酸的多种碱金属盐、铵盐和取代铵盐，如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸，以及多元羧酸，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1，3，5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸，和其可溶盐。
在一些进一步的实施方案中，本文的清洁组合物含有螯合剂。合适的螯合剂包括铜、铁和/或锰螯合剂和其混合物。
在一些还进一步的实施方案中，本文提供的清洁组合物含有沉积助剂。合适的沉积助剂包括聚乙二醇、聚丙二醇、多元羧酸、污物释放聚合物，如聚对苯二甲酸、粘土，如高岭土、蒙脱石、atapulgite、伊利石、皂粘土、多水高岭土和其混合物。
在一些额外实施方案中，本发明的清洁组合物还包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合的染料转移抑制剂包括，但不限于，聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。
在一些额外实施方案中，本发明的清洁组合物还包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚或共聚酸或它们的盐，其中多元羧酸包含通过不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。
在一些尤其优选的实施方案中，清洁组合物包含一种或多种洗涤剂酶，其提供了清洁性能和/或织物护理益处。合适的酶的实例包括但不限于，半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶(pentosanases)、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶，和淀粉酶，或其混合物。典型的组合是常规可应用的酶包括至少一种蛋白酶、至少一种脂肪酶、至少一种角质酶，和/或至少一种纤维素膜与至少一种淀粉酶的混合物。
在一些进一步的实施方案中，用于清洁组合物中的酶通过任何合适的技术稳定化。在一些实施方案中，本文使用的酶通过在成品组合物中存在钙和/或镁离子的水溶性来源稳定化，所述组合物为所述酶提供此类离子。
在一些其他实施方案中，本发明的清洁组合物包含催化性金属络合物。一种类型的含有金属的漂白催化剂是这样的催化剂系统，其含有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子，如铜、铁、钛、钌、钨、钼、或者锰阳离子，和具有很小或没有漂白催化活性的辅助金属阳离子，如锌或者铝阳离子，和对于催化性和辅助金属阳离子具有确定的稳定性常数的螯合剂，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)和其水溶性盐。此类催化剂在美国专利号4,430,243中公开。
在一些实施方案中，通过锰化合物催化本文的组合物。此类化合物和使用水平是本领域公知的并且包括，例如美国专利号5,576,282中公开的基于锰的催化剂。此外，可用于本文的钴漂白催化剂是已知的，并且例如在美国专利号5,597,936和5,595,967中描述。此类钴催化剂容易通过已知的方法制备，如在美国专利号5,597,936和5,595,967中教导。在一些实施方案中，本文提供的组合物也合适地包括大聚合环状刚性配体(即“MRL”)的过渡金属络合物。作为实际的内容，并且不作为限制，本文的组合物和清洁方法可调节来在水性洗涤介质中提供至少一亿分之一数量级的活性MRL种类，并且将优选在洗涤液中提供约0.005ppm到约25ppm，更优选约0.05ppm到约10ppm，最优选约0.1ppm到约5ppm的MRL。在本过渡金属漂白催化剂中的优选过渡金属包括锰、铁和铬。本文优选的MRL是特定类型的交联桥接的超刚性配体，如5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷。合适的过渡金属MRL可通过公知的方法容易的制备，如WO 00/332601和美国专利号6,225,464中教导的方法。
如上面指出的，将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并通过配制人员所选的任何方法制备，其非限制性实例在美国专利号5,879,584，5,691,297，5,574,005，5,569,645，5,516,448，5,489,392和5,486,303中描述，将它们都并入本文作为参考。
本文公开的清洁组合物可用于清洁一个部位(如表面、餐具或者织物)。通常，该部位的至少一部分与纯形式的或者洗涤液中稀释形式的本清洁组合物的实施方案接触，然后将该部位任选洗涤和/或冲洗。对于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于，擦洗和机械搅拌。在一些实施方案中，清洁组合物通常以溶液中约500ppm到约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常为约5℃到约90℃，当部位包含织物时，水与织物质量比通常为约1∶1到约30∶1。
在额外实施方案中，本发明还提供了利用多种表面活性剂和表面活性剂掺和物评估和改进洗涤剂组合物中蛋白酶性能的组合物和方法。使用实验设计软件，设计单纯点阵混合物实验来评估液体洗衣洗涤剂中最常用的表面活性剂存在下蛋白酶的活性；即直链烷基苯磺酸盐(LAS)、烷基乙氧基硫酸盐(AES)，和醇乙氧基化物(AE)。LAS和AES是阴离子表面活性剂，而AE是非离子表面活性剂。
令人惊奇地，确定了为了蛋白酶的最佳性能选择表面活性剂组合物不简单的是选择其中蛋白酶最稳定的表面活性剂。而是，选择最佳表面活性剂组合物是基于以提供最好的总体清洁结果的比例组合不同的表面活性剂，其中混合物包括的表面活性剂(其如果在其他表面活性剂不存在下使用)将稳定化该蛋白酶。
例如，确定了在一些实施方案中，在第一种表面活性剂存在下，当存在第二种表面活性剂时，蛋白酶能够更好地发挥功能，但是如果存在第三种表面活性剂，那么功能稍差。在额外实施方案中，蛋白酶耐受更高水平的第一种表面活性剂，取决于第二种和第三种表面活性剂的比例。观察到如果各种表面活性剂的比例经小心选择，那么可以在不同表面活性剂存在下使用酶，这一观察结果与常规的观念相反，常规观念即酶必须只与不会不利地影响它们活性的表面活性剂组合使用，限制了酶在某些表面活性剂组合物中的使用。
部分基于本文所述的观察结果，本组合物和方法提供了洗涤剂组合物，其包含至少一种蛋白酶和经预选以促进蛋白酶活性的比例的表面活性剂混合物，其中表面活性剂不是简单地通过测量蛋白酶在每种表面活性剂中的稳定性进行选择的。在一些情况下，在不同比例的相同表面活性剂存在下，或者在混合物中在任何亚组的表面活性剂存在下但是不存在至少一种所述表面活性剂的情况下，蛋白酶被失活或者显示出降低的活性。在一些情况下，在混合物中任一种表面活性剂存在下，或者不存在其他表面活性剂的情况下，蛋白酶被失活或者显示出降低的活性。类似地，在一些情况下，第一种表面活性剂的存在允许使用增加量的第二种表面活性剂，其中不存在第一种表面活性剂时，相同量的第二种表面活性剂将失活或者降低蛋白酶的活性。
此外，第一种类型的表面活性剂(即，非离子或阴离子洗涤剂)的存在允许使用第二种类型的洗涤剂，其中不存在第一种类型表面活性剂时第二种类型的洗涤剂将失活或者降低蛋白酶的活性。
在这些实验中，使用解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L(“FNA”；Genencor)，以及该酶的变体。在低温(即16℃)下，蛋白酶在包含相对少量AE和较大量AES或者LAS或者两者的组合物中是有活性的。相比，在仅包含AES、仅LAS，尤其仅AE的组合物中蛋白酶活性较低。因此，优选的组合物不是这样的组合物，其仅包括单一表面活性剂，蛋白酶在其中最具活性，而是这样的组合物，其包括至少两种，优选所有三种表面活性剂，如果单独在足够水平下使用，任一种表面活性剂将使蛋白酶失活或者降低蛋白酶的活性。AES＞LAS＞AE的特定比例似乎在低温下对于该蛋白酶产生最佳结果。
相比，在高温(如32℃)下，蛋白酶在包含仅仅AES、或者AES与LAS的组合和相对少量AE的组合物中有活性。从而，AES的耐受性在更高温度下增加，使得包括其他表面活性剂的重要性降低。
还进行了一些额外的测试。使用AAPF-pNA底物温育后测定蛋白酶活性。测量每种洗涤剂制剂中酶的解链温度Tm。最后，选择四种制剂并在Terg-O-Tometer中测试与96孔测定结果的相关性(见实施例22)。
定义
除非另外提及，本发明的实施涉及在分子生物学、蛋白质工程、微生物学和重组DNA技术中普遍使用的常规技术，属于本领域技术人员的范畴。此类技术是本领域技术人员已知的，描述在多个文本和参考文献中(见例如，Sambrook et al.，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，Second Edition(Cold Spring Harbor)，[1989])；and Ausubel et al.，″Current Protocols in Molecular Biology″[1987])。本文上下文中提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，都通过引用明确地合并到本文中。
除非本文中另外提及，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普遍技术人员常规理解的相同含义。本领域中可利用并且已知多种词典可提供这些术语的定义。虽然与本文所述相似或等价的方法和材料也可用于本发明的实施，但仍描述了优选的方法和材料。因此，通过整体参考说明书，可以更全面的描述下文定义的术语。此外，除非文中明确地另外指出，本文中使用的单数形式“一个”和“这个”包含了复数含义。数值范围包含了定义范围的数。除非另外指出，核酸以从5’至3’方向由左至右的书写；氨基酸序列以从氨基至羧基方向由左至右的书写。可以理解，发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，本领域技术人员可以根据所使用的情况而进行变动。
除非另外指出，本发明的实施使用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和蛋白质测序的常规技术，其均属于本领域技术人员的知识范围内。
此外，本文提供的标题并不限制本发明的多个方面或实施方案，其可参照说明书整体。因此，通过整体参照说明书可以更完整的定义下文定义的术语。尽管如此，为了便于理解发明，下文仍定义了多个术语。
如本文中使用的，术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指这样的蛋白质或肽，其显示出具有水解肽或具有肽键的底物的能力。有多种用于测量蛋白水解活性的已知方法(Kalisz，″Microbial Proteinases，″In：Fiechter(ed.)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，[1988])。例如，可以通过比较测定来证实蛋白酶解的活性，所述测定分析各蛋白酶水解商品底物的能力。可用于蛋白酶或蛋白水解活性分析的示例性底物包含但不限于，二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如，WO 99/34011；和美国专利号6,376,450，均引入本文作为参考)。pNA测定(参见例如，Del Mar等人，Anal.Biochem.，99：316-320[1979])也可用于确定在梯度洗脱中收集的组分中的活性酶浓度。上述测定测量了当酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(sAAPE-pNA)时，对硝基苯胺的释放速率。在分光光度计上，410nm处测量水解反应中产生黄色的速率，其与活性酶浓度成比例。此外，在280nm处的吸光度测量值可用于确定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比例给出了酶的纯度。
如本文中使用的，“芽孢杆菌(Bacillus)属”包含所有属于“芽孢杆菌(Bacillus)”属中的物种，本领域技术人员已知，包含但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。公认芽孢杆菌属不断经历着分类重组。因此，该属意在包含已重新分类的物种，包含但不限于生物体例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，现名为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。在氧存在的条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的决定性特征，但该特征也可用于最近命名的环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、Aneurinibacillus、Anoxybacillus、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Filobacillus、Gracilibacillus、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、Salibacillus、热杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换的使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包含但不限于，单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的多聚体。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因、基因片段、染色体片段、EST、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。在一些实施方案中，多核苷酸包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团，例如氟代核糖(fluororibose)和硫代酸酯(thioate)，以及核苷酸支链。在替代性实施方案中，核苷酸序列被非核苷酸组分中断。
如本文中使用的，术语“DNA构建体”和“转化DNA”是可互换使用的，指用于向宿主细胞或生物体中引入序列的DNA。可以通过PCR或本领域已知的其他合适技术在体外产生DNA。在尤其优选的实施方案中，DNA构建体包含目的序列(例如，输入的(incoming)序列)。在一些实施方案中，序列与其他元件是有效连接的，例如调控元件(如，启动子等)。DNA构建体还可以包含选择性标记物。还包含侧接同源盒的输入序列。在其他实施方案中，转化DNA包含添加在末端的其他非同源序列(例如，填充序列(stuffer sequences)或侧翼)。在一些实施方案中，输入序列的末端是封闭的，从而使转化DNA形成封闭环状。转化序列可以是野生型、变体或修饰的。在一些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，DNA构建体包含非同源的序列。一旦DNA构建体在体外装配，则可用于：1)将异源序列插入到宿主细胞的期望靶序列中，和/或2)突变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替代内源性序列)，3)缺失靶基因；和/或4)向宿主引入复制性质粒。
如本文中使用的，术语“表达盒”和“表达载体”指重组地或合成地产生的核酸构建体，具有一系列特殊的核酸元件，允许特定核酸在靶细胞内的转录。重组表达盒可以整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除其他序列外，表达载体的重组表达盒部分包含待转录的核酸序列和启动子。在优选的实施方案中，表达载体具有在宿主细胞内掺入和表达异源DNA片段的能力。多种原核和真核表达载体是市售的。选择合适的表达载体属于本领域技术人员的知识范围。术语“表达盒”与“DNA构建体”及其语法等价体可互换的使用。选择合适的表达载体属于本领域技术人员的知识范围。
如本文中使用的，术语“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸构建体。载体包含克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒式结构(cassette)等。在一些实施方案中，多核苷酸构建体包含编码蛋白酶(例如，前体或成熟蛋白酶)的DNA序列，有效连接了能够影响DNA在合适宿主中的表达的合适的原序列(例如，分泌性的等)。
如本文中使用的，术语“质粒”指作为克隆载体使用的环状双链(ds)DNA构建体，其在一些真核细胞或原核细胞中形成染色体外自我复制的遗传元件，或整合到宿主染色体中。
如本文中使用的，在向细胞内引入核酸序列的情况下，术语“引入”指适合将核酸序列转移到细胞内的任何方法。此类引入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导(参见例如，Ferrari等人，“Genetics，”在Hardwood等人(编著)，Bacillus，Plenum Publishing Corp.，第57-72页，[1989]中)。
如本文中使用的，术语“转化的”和“稳定转化的”指这样的细胞，所述细胞具有非天然(异源)多核苷酸序列整合在其基因组中，或作为附加型质粒维持至少2代。
当其置于与另一核酸序列的功能性关联中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果作为参与多肽分泌的前蛋白质表达，则编码分泌前导区(即，信号肽)的DNA与多肽DNA是有效连接的；如果影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列是有效连接的；如果其位置有利于翻译，则核糖体结合位点与编码序列是有效连接的。通常，“有效连接的”意指连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导区的情况下，是以阅读相(in reading phase)连续的。然而，增强子不需要是连续的。通过在常规的限制性酶切位点连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规操作使用合成的寡核苷酸衔接头(adaptor)或接头。
如本文中使用的，术语“基因”指多核苷酸(例如，DNA片段)，所述多核苷酸编码多肽，并包含位于编码区前后的区域，以及在各编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文中使用的，术语“同源基因”指来自不同但通常相关的物种的成对基因，所述基因相互对应，且彼此相同或高度相似。该术语涵盖了由于物种形成(即，新物种产生)而不同的基因(例如，直系同源基因)，和由于基因复制而不同的基因(例如，旁系同源基因)。
如本文所用，如果几种蛋白质在相同的排列中具有相同的主要二级结构并且具有相同的拓扑学连接，那么这些蛋白质被定义为具有共同的“折叠”。具有相同折叠的不同蛋白质通常具有大小和构象不同的二级结构外周元件和转角区。在一些情况下，这些不同的外周区可以占结构的一半。置于相同的折叠类别中的蛋白质不一定具有共同的进化来源(例如，结构相似性来源于蛋白质的物理和化学作用，其有利于某些堆积排列和链拓扑学)。
如本文中使用的，“同源性”指序列相似性或同一性，同一性是优选的。该同源性是使用本领域已知的标准技术确定的(参见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444[1988]；程序，例如Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group，Madison，WI)；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12：387-395[1984])。
如本文所用，“类似序列”是其中基因的功能与基于BPN’蛋白酶的基因基本上相同的序列。通过序列比对的已知方法来确定类似序列。常用的比对方法是BLAST，但如上下文中指出的，其他方法也可用于比对序列。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP利用渐进的、成对比对，从一组相关序列中创建多重序列比对。也可以绘制树状图来显示用于创建比对的簇状关系。PILEUP使用了Feng和Doolittle(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360[1987])的渐进比对方法的简化版。该方法与Higgins和Sharp(Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153[1989])所述的相似。有用的PILEUP参数包含缺省的空位权重3.00，缺省的空位长度权重0.10，和加权的末端空位。
有用的算法的另一个实例是BLAST算法，由Altschul等人所述(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410，[1990]；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787[1993])。特别有效的BLAST算法是WU-BLAST-2程序(参见，Altschul等人，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用若干检索参数，大部分设定为缺省值。可调节的参数设定为下列值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字符阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序本身根据特定序列的组成和检索目的序列的特定数据库的组成来确定。然而，可以调整值来增加灵敏度。通过匹配的相同残基数除以比对区域中“较长”序列的总残基数，来确定％氨基酸序列同一性值。“较长”序列是在比对区域中具有最多的实际残基的序列(忽略由WU-BLAST-2为了使比对分数最大化而引入的空位)。
因此，“百分比(％)核酸序列同一性”定义为在候选序列中与起始序列(即，目的序列)的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。优选的方法使用WU-BLAST-2的BLASTN模块设定缺省参数，重叠跨度和重叠分数分别设定为1和0.125。
本文使用的“重组”包括指细胞或载体，其通过引入异源核酸序列而进行了修饰或者该细胞来源于这样修饰的细胞。因此，例如，由于有意的人为干预，重组细胞表达在天然(非重组)形式细胞中不以相同形式存在的基因，或者表达本来异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。“重组”和产生“重组”核酸通常是组装两个或更多个核酸片段，其中这种组装产生嵌合基因。
在一些优选实施方案中，用位点饱和诱变在至少一个密码子中产生突变DNA序列。在另一优选实施方案中，为两个或更多密码子进行位点饱和诱变。在进一步的实施方案中，突变DNA序列与野生型序列有约50％以上、约55％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、或约98％以上的同源性。在备选实施方案中，使用任一已知的诱变方法，例如放射、亚硝基胍等等在体内产生突变DNA。然后分离所希望的DNA序列并用于本文提供的方法中。
如本文所用，术语“扩增”和“基因扩增”指一种方法，通过该方法特定DNA序列不成比例地复制使得扩增的基因变得以比在基因组最初存在的更高拷贝数存在。在一些实施方案中，在药物(例如可抑制酶的抑制剂)存在下细胞的选择导致扩增了在该药物存在下编码生长所需的基因产物的内源基因，或者扩增了编码该基因产物的外源(即输入)序列，或者它们两者。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特定实例。其与非特异性模板复制(即，为模板依赖性的但是不依赖于特定模板的复制)相反。模板特异性在本文区别于复制保真性(即，正确多核苷酸序列的合成)和(核糖或脱氧核糖)核苷酸特异性。模板特异性经常按着“靶标”特异性描述。靶序列在它们从其他核酸序列被挑选出来的意义上是“靶标”。主要为了该挑选设计了扩增技术。
如本文所用，术语“引物”指如在纯化的限制酶消化中天然产生的或者合成产生的寡核苷酸，其当置于一定条件下时能够作为合成起点，在所述条件下与核酸链互补的引物延伸产物的合成被诱导(即，存在核苷酸和诱导剂，如DNA聚合酶，并且在合适的温度和pH下)。引物优选为单链的，以便在扩增中有最大效率，但是也可以备选为双链的。如果为双链的，那么在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以便在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
如本文所用，术语“探针”指如在纯化的限制酶消化产物中天然发生的或者合成产生的、重组或通过PCR扩增的寡核苷酸(即，核苷酸序列)，其能够与另一目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定基因序列。预期用于本发明的任何探针将用任一“报告分子”标记，使得可以在任一检测系统中被检测到，所述检测系统包括但不限于，酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定法)、荧光、放射性和发光系统。本发明不意在局限于任何具体的检测系统或标记。
如本文所用，术语“靶标”当关于聚合酶链式反应使用时，指用于聚合酶链式反应的引物所结合的核苷酸区域。从而，设法将“靶标”从其他核酸序列中挑选出来。“区段”被定义为靶序列内的核苷酸区域。
如本文所用，术语“聚合酶链式反应”(″PCR″)指引入本文作为参考的美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，其包括不用克隆或纯化，增加基因组DNA混合物中靶序列的区段浓度的方法。该用于扩增靶序列的方法组成如下：向含有希望的靶序列的DNA混合物中引入大量过量的两种寡核苷酸引物，接着在DNA聚合酶存在下精确顺序的热循环。这两种引物与双链靶序列的各自链互补。为了实现扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的它们的互补序列退火。退火后，用聚合物延伸引物以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复许多次(即，变性、退火和延伸组成一个“循环”；可以有许多“循环”)以得到高浓度的希望的靶序列的扩增区段。希望的靶序列的扩增区段的长度通过引物相互的相对位置决定，并且因此该长度是可控的参数。由于该方法的重复方面，该方法被称作“聚合酶链式反应”(下文中称作“PCR”)。因为靶序列的希望的扩增区段在混合物中变成主要序列(按照浓度而言)，所以将它们称作“PCR扩增的”。
如本文所用，术语“扩增试剂”指除了引物、核酸模板和扩增酶之外，扩增所需的那些试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液等等)。通常，将扩增试剂以及其他反应组分放置并包含在一个反应容器(试管、微孔等等)中。
如本文所用，术语“RT-PCR”指RNA序列的复制和扩增。在该方法中，逆转录与PCR偶联，最通常使用一种酶步骤，其中使用热稳定的聚合酶，如美国专利号5,322,770(并入本文作为参考)中所述。在RT-PCR中，由于聚合酶的逆转录酶活性，RNA模板被转化为cDNA，然后使用该聚合酶的聚合活性扩增(即如在其他PCR方法中)。
如本文所用，术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”指细菌酶，其每一种在特定核苷酸序列上或附近切割双链DNA。
“限制位点”指被给定限制性内切核酸酶识别并切割并且经常是DNA片段插入位点的核苷酸序列。在本发明的一些实施方案中，将限制性位点工程化到选择标记中和DNA构建体的5’和3’末端。
“同源重组”指两个DNA分子或配对DNA之间的DNA片段在相同或几乎相同的核苷酸序列位点处的交换。在优选实施方案中，染色体整合是同源重组。
如本文中使用的，“氨基酸”指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”是可互换使用的。
如本文中使用的，“目的蛋白”和“目的多肽”指期望的和/或待评估的蛋白质/多肽。在一些实施方案中，目的蛋白在胞内表达，而在其他实施方案中，其是分泌多肽。在尤其优选的实施方案中，这些酶包括本发明的丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，目的蛋白是与信号肽融合的分泌多肽(即，待分泌蛋白质的氨基端延伸)。几乎所有的分泌蛋白都使用氨基端的蛋白质延伸，其在跨膜定位和前体蛋白质转运中发挥关键作用。该延伸是在膜转运过程中或之后立即被信号肽酶通过蛋白酶解切除的。
如果多核苷酸在其天然状态或者通过本领域技术人员已知的方法操作时，可以被转录和/或翻译以产生RNA、多肽或其片段，那么说该多核苷酸“编码”RNA或多肽。此类核酸的反义链也称作编码所述序列。如本领域已知，DNA可以被RNA聚合酶转录以产生RNA，但是RNA可以被反转录酶反转录以产生DNA。从而，DNA可以编码RNA并且反之亦然。
“宿主菌株”或“宿主细胞”指用于表达载体的合适的宿主，所述载体包含本发明的DNA。
如果酶在细胞中表达的水平高于其在相应野生型细胞中表达的水平，则酶在宿主细胞中是“过表达的”。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。本公开内容中全篇均使用与IUPAC-IUB生物化学命名委员会(JCBN)一致的3字母氨基酸代码。应该理解，多肽可由于遗传密码的简并性而由多于一种核苷酸序列编码。
“原序列”是在信号序列和成熟蛋白酶之间，对蛋白酶分泌所必需的氨基酸序列。切除原序列导致成熟活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”指参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。该信号序列的定义是功能性的，意在包含由蛋白质基因N末端部分编码的所有氨基酸序列，所述序列参与蛋白质分泌的实施。它们通常，但不是总是连接到蛋白质的N端部分或连接到前体蛋白质的N端部分。信号序列可以是内源的或外源的。信号序列通常可以与蛋白质(例如蛋白酶)连接，或可以来自编码另一分泌蛋白质的基因，一个示例性外源信号序列包含来自枯草芽孢杆菌的信号序列的前七个氨基酸残基，与来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus，ATCC 21536)的枯草杆菌蛋白酶的剩余的信号序列融合。
术语“杂合信号序列”指信号序列，其中从表达宿主得到的序列的部分与待表达的基因的信号序列融合。在一些实施方案中，利用合成的序列。
术语“成熟”形态的蛋白质或肽指最终功能形态的蛋白质或肽。例如，成熟形态的本发明蛋白酶至少包括与SEQ ID NO：2的残基位置1-275相同的氨基酸序列。
术语“前体”形态的蛋白质或肽指具有与蛋白质氨基或羧基端有效连接的原序列的成熟形态的蛋白质。前体也可以具有与原序列氨基端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有参与翻译后活性的其他多核苷酸(例如，切除多核苷酸产生成熟形态的蛋白质或肽)。
“天然存在的酶”指具有与天然发现的酶相同的、未修饰的氨基酸序列的酶。天然存在的酶包含天然的酶、在特定微生物体中天然表达或发现的酶。
术语“源自”和“获得自”不仅指由或可由所讨论的生物菌株产生的蛋白酶，还指由分离自此类菌株的DNA序列编码、且在含有此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。此外，该术语指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的蛋白酶，所述蛋白酶具有所讨论的蛋白酶已鉴定的特征。
该定义范围内的“衍生物”通常保留了在野生型、天然或亲本形式中观察到的特征性蛋白水解活性至下述程度：使该衍生物可用于与所述野生型、天然或亲本形式相似的目的。丝氨酸蛋白酶的功能性衍生物涵盖了天然存在的、合成的或重组产生的肽或肽片段，其具有本发明丝氨酸蛋白酶的一般特征。
术语“功能性衍生物”指这样的核酸衍生物，其具有编码丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性特征。编码本发明丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性衍生物涵盖了天然存在的、合成的或重组产生的核酸或核酸片段，并编码本发明的特征性丝氨酸蛋白酶。编码本发明丝氨酸蛋白酶的野生型核酸包含天然存在的等位基因，以及基于本领域已知的遗传密码简并性的同源物。
在两个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”指当以最高对应性比对时，两条序列中相同的残基，使用下列序列比较或分析算法之一进行测量。
术语“最优比对”指产生最高百分比同一性分数的比对。
就两个氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(适当地)而言，“百分比同一性”、“百分比氨基酸序列同一性”、“百分比基因序列同一性”和/或“百分比核酸/多核苷酸序列同一性”指当两条序列最优比对时，两条序列中相同残基的百分比。因此，80％氨基酸序列同一性意指在两条最优比对的多肽序列中，80％的氨基酸是相同的。
因此，在两个核酸或多肽的情况下，短语“基本相同”指与使用标准参数的程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)的参照序列相比，多核苷酸或多肽包含至少约70％序列同一性，优选至少约75％、优选至少约80％、优选至少约85％、优选至少约90％、优选至少约95％、优选至少约97％、优选至少约98％和优选至少约99％序列同一性。两条多肽基本相同的一个指标是第一条多肽与第二条是免疫交叉反应的。一般地，由于保守氨基酸取代而相异的多肽是免疫交叉反应的。因此，例如当两条多肽仅由于保守取代而不同时，多肽与第二多肽是基本相同的。两条核酸序列基本相同的另一指标是两个分子在严格条件下彼此杂交(例如，在中度至高度严格度的范围)。
术语“等同的”在本文中指由在中至高严格条件下能够与具有SEQ IDNO：1所示序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的丝氨酸蛋白酶。例如，等同的表示等同的成熟丝氨酸蛋白酶与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟BPN的丝氨酸蛋白酶包含至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和/或至少约99％序列同一性。
术语“分离的”或“纯化的”指从其原始环境中移出的材料(例如，如果是天然存在的，则指天然环境)。例如，如果材料在特定组合物中存在的浓度高于或低于其在天然存在的或在野生型生物中存在的浓度，或者与在天然存在的或野生型生物中表达后通常不存在的组分组合，则认为所述材料是“纯化的”。例如，在活动物中存在的天然存在的多核苷酸活多肽不是分离的，但与天然系统中共存的部分或全部材料分离的相同多核苷酸或多肽则是分离的。在一些实施方案中，此类多核苷酸是载体的一部分，和/或此类多核苷酸或多肽是组合物的一部分，只要此类载体或组合物不是其天然环境的一部分，则仍然是分离的。在优选实施方案中，例如，如果核酸或蛋白质在凝胶电泳或印迹中基本产生一条带，则认为所述核酸或蛋白质是纯化的。
当用于指代DNA序列时，术语“分离的”指已经从天然遗传环境中移出的DNA序列，并因此不含其他外来的或不期望的编码序列，其存在形式适合在遗传工程改造的蛋白质产生系统中使用。此类分离的分子是与其天然环境分离的分子，包含cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含其常规相关的其他基因，但可以包含天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域技术人员是显而易见的(参见例如，Dynan和Tijan，Nature 316：774-78[1985])。术语“分离的DNA序列”也称为“克隆的DNA序列”。
当用于指代蛋白质时，术语“分离的”指在其天然环境以外的条件下存在的蛋白质。在一种优选形式中，分离的蛋白质基本不含其他蛋白质，特别是其他同源蛋白质。通过SDS-PAGE确定时，分离的蛋白质纯度高于约10％，优选高于约20％，和甚至更优选高于约30％。通过SDS-PAGE确定时，发明的其他方面涵盖了更高纯度形式的蛋白质(即，纯度高于约40％，高于约60％，高于约80％，高于约90％，高于约95％，高于约97％，甚至高于约99％)。
本文使用的术语“组合诱变”指产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体含有选自预定突变组的一个或多个突变。此外，该方法提供了引入不在预定突变组中的随机突变的方法。在一些实施方案中，该方法包括2000年10月26日提交的美国专利申请序列号09/699.250中公开的方法，该申请并入本文作为参考。在备选实施方案中，组合诱变方法包括市售的试剂盒(例如QuikChangeMultisite，Stratagen e，San Diego，CA)。
本文使用的术语“突变体文库”指基因组大部分相同但包含一个或多个基因的不同同源物的细胞群。这样的文库可用于例如鉴定具有改进性状的基因或操纵子。
本文使用的术语“起始基因”指编码待使用本发明进行改进和/或改变的目的蛋白的目的基因。
本文使用的术语“多重序列比对(multiple sequence alignment，MSA)”指使用算法(如Clustal W)比对的起始基因的多种同源物的序列。
本文使用的术语“共有序列”和“范例序列”指将特定蛋白质或目的序列的所有变体与其进行比较的原型序列。该术语还指显示目的DNA序列中最常存在的核苷酸的序列。对基因的每个位置而言，共有序列给出在MSA中该位置上丰度最高的氨基酸。
本文使用的术语“共有突变”指起始基因与共有序列之间的序列差异。共有突变通过将起始基因的序列与从MSA所得共有序列进行比较来鉴定。在一些实施方案中，将共有突变引入起始基因中，以使其与共有序列更为相似。共有突变还包括这样的氨基酸改变：该改变将起始基因中的氨基酸改变成MSA中发现的在该位置上频率高于起始基因中氨基酸的频率的氨基酸。因此，术语“共有突变”包括将起始基因中的氨基酸替换为比MSA中氨基酸更丰富的氨基酸的所有单个氨基酸改变。
本文使用的术语“初始命中”指通过筛选组合共有诱变文库而鉴定的变体。在优选的实施方案中，初始命中与起始基因相比具有改进的性能特征。
本文使用的术语“改进命中”指通过筛选增强的组合共有诱变文库而鉴定的变体。
本文使用的术语“改进突变”和“性能增强突变”指在引入起始基因时导致性能提高的突变。在一些优选的实施方案中，这些突变通过对该方法的筛选步骤中所鉴定的命中进行测序来鉴定。在多数实施方案中，在命中中更频繁出现的突变与未筛选的组合共有诱变文库相比很可能是改进突变。
本文使用的术语“增强的组合共有诱变文库”指基于之前轮次的CCM诱变和筛选的筛选和/或测序结果而设计和构建的CCM文库。在一些实施方案中，增强的CCM文库是基于之前轮次的CCM所得初始命中的序列。在另一些实施方案中，设计增强的CCM以有利于在之前轮次的诱变和筛选中的初始命中中更常见的突变。在一些优选的实施方案中，这通过省略编码性能降低突变的引物来实现，或者通过相对于之前的CCM文库中所使用其他引物提高编码性能增强突变的引物的浓度来实现。
本文使用的术语“性能降低突变”指在组合共有诱变文库中的突变，其在筛选所得命中中的频率与未筛选的组合共有诱变文库相比更低。在优选的实施方案中，筛选方法除去和/或降低含有“性能降低突变”的变体的丰度。
本文使用的术语“功能性测定”指提供蛋白质活性的指标的测定。在特别优选的实施方案中，该术语指分析蛋白质以其通常的能力发挥功能的测定系统。例如，对于酶的情况，功能性测定包括测定该酶在催化反应方面的有效性。
本文使用的术语“靶性质”指待改变的起始基因的性质。本发明并不意在仅限于任何特定的靶性质。然而，在一些优选的实施方案中，靶性质为基因产物的稳定性(例如对变性、蛋白水解或其他降解因素的抗性)，而在另一些实施方案中，改变了在生产宿主中的生产水平。事实上，起始基因的任何性质均可用于本发明。
本文使用的术语“性质”或其语法等同语在核酸的情况下指核酸的任何可以选择或检测的性质或属性。这些性质包括但不仅限于影响与多肽结合的性质、赋予包含特定核酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(如启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强子功能)、影响RNA加工的性质(如RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的性质(例如水平、调节、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点，以产生期望的特征或鉴定不期望的特征。
本文使用的术语“性质”或其语法等同语在多肽(包括蛋白质)的情况下指多肽的任何可选择或检测的特征或属性。这些性质包括但不仅限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、KM、kcat、kcat/kM比、蛋白质折叠、诱导免疫应答、结合配体的能力、结合受体的能力、分泌能力、展示于细胞表面的能力、寡聚化能力、信号能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的能力、通过磷酸化或糖基化进行修饰的能力、和/或治疗疾病的能力，等。
本文使用的术语“筛选”具有本领域的通常含义，一般为多步骤过程。在第一步中，提供突变核酸或其变体多肽。在第二步中，测定该突变核酸或变体多肽的性质。在第三步中，将所测性质与相应的前体核酸的性质、相应天然多肽的性质或产生该突变核酸的起始材料(如初始序列)的性质进行比较。
对于本领域技术人员而言很明显的是，用于获得具有改变性质的核酸或蛋白质的筛选方法取决于起始材料的性质，将通过产生该突变核酸来促进其修饰。因此，本领域技术人员会理解，本发明不受限于任何待筛选的具体性质，以下性质描述仅列出了说明性的实例。用于筛选任何特定性质的方法已在本领域中有一般性描述。例如，可以在突变前后测量结合、pH、特异性等，其中的变化表明产生了改变。优选地，以高通量方式进行筛选，包括同时筛选多个样品，包括但不仅限于使用芯片、噬菌体展示和多种底物和/或指示剂进行的测定。
在一些实施方案中，本文使用的筛选包括选择步骤，其中从变体群中富集目的变体。这些实施方案的实例包括选择赋予宿主生物生长优势的变体，以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中变体可基于其结合或催化性质而从变体群中被捕获。在优选的实施方案中，使变体文库暴露于胁迫(热、蛋白酶、变性)，其后在筛选中鉴定仍完整的变体或通过选择来富集它们。该术语旨在包括任何合适的选择方法。事实上，本发明不旨在限于任何特定的筛选方法。
本文使用的术语“靶向随机化”指产生其中一个或多个位置已被随机化的多种序列的方法。在一些实施方案中，随机化是完全随机化(即，所有的四种碱基A、T、G和C都可出现在随机化位置)。在备选实施方案中，核苷酸的随机化仅限于这四种核苷酸的一个亚组。靶向随机化可应用于序列的一个或多个密码子，编码一种或多种目的蛋白。表达时，所得的文库产生蛋白质群，其中一个或多个氨基酸位置可含有所有20种氨基酸或氨基酸亚组的混合物，这由随机化密码子的随机化方案决定。在一些实施方案中，靶向随机化所得群体中的个体成员由于密码子的靶向或随机插入或缺失而存在氨基酸数目的差异。在另一些实施方案中，所产生的蛋白质群中包括合成的氨基酸。在一些优选的实施方案中，靶向随机化所得群体中的多数成员与起始基因相比与共有序列显示更高的序列同源性。在一些实施方案中，所述序列编码一种或多种目的蛋白。在备选实施方案中，所述蛋白质具有不同的生物功能。在一些优选的实施方案中，进入序列包含至少一个选择标记。该序列可以编码一种或多种目的蛋白。它可以具有其他生物功能。在许多情况下，进入序列将包括选择标记，如赋予抗生素抗性的基因。
术语“修饰序列”和“修饰基因”在本文中可互换使用，指包含天然核酸序列的缺失、插入或中断的序列。在一些优选的实施方案中，修饰序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰是序列的缺失或中断的话)。在一些特别优选的实施方案中，所述截短的蛋白质保留生物活性。在备选实施方案中，修饰序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，包含核酸序列中的插入的修饰)。在一些实施方案中，插入导致截短的蛋白质(例如，当插入导致形成终止密码子时)。因此，插入可产生截短蛋白或延长的蛋白作为表达产物。
本文使用的术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用，指在宿主细胞野生型序列的至少一个密码子处含有改变的序列。突变序列的表达产物是相对于野生型含有改变的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能能力(例如增强的酶活性)。
术语“诱变引物”或“诱变寡核苷酸”(在本文中可互换使用)旨在表示对应于模板序列的一部分并能与其杂交的寡核苷酸组合物。就诱变引物而言，该引物一般不与模板核酸精确匹配，引物中的错配用于将期望的突变引入核酸文库中。本文使用的“非诱变引物”或“非诱变寡核苷酸”指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方案中，仅使用诱变引物。在本发明的另一优选实施方案中，将引物设计成使得对于至少一个包含诱变引物的区域而言，寡核苷酸混合物中还包括了非诱变引物。通过加入诱变引物和对应于至少一个诱变引物的非诱变引物的混合物，有可能产生存在多种组合诱变模式的核酸文库。例如，如果期望突变核酸文库中的一些成员在某些位置保留其前体序列，而其他成员在这些位点处是突变的，则非诱变引物提供了在核酸文库中对于给定残基获得特定水平的非突变体成员的能力。本发明的方法利用诱变及非诱变寡核苷酸，它们一般长度为10至50个碱基，更优选长度为约15至45个碱基。然而，可能有必要使用小于10个碱基或大于50个碱基的引物来获得期望的诱变结果。对于相应的诱变及非诱变引物而言，相应的寡核苷酸不一定长度相同，而是在对应于待加入的突变的区域中有重叠。可以根据本发明以预定的比例加入引物。例如，如果期望所得的文库含有显著水平的某特定突变以及相同或不同位点处较少量的不同突变，则通过调节所添加引物的量，有可能产生期望的偏好文库。或者，通过加入更少或更多量的非诱变引物，有可能调整突变核酸文库中产生相应突变的频率。
本文使用的术语“连续突变”指存在于同一寡核苷酸引物中的突变。例如，连续突变可彼此毗邻或接近，然而它们将通过同一引物引入所得的突变体模板核酸中。
本文使用的术语“不连续突变”指存在于不同寡核苷酸引物中的突变。例如，不连续突变将通过分别制备的寡核苷酸引物引入所得的突变体模板核酸中。
术语“野生型序列”或“野生型基因”在本文中可互换使用，指宿主细胞中天然或天然存在的序列。在一些实施方案中，野生型序列指作为蛋白质工程计划的起点的目的序列。野生型序列可编码同源或异源的蛋白质。同源蛋白是宿主细胞无需干预即产生的蛋白质。异源蛋白是宿主细胞没有干预将不产生的蛋白质。
除非另外指出，氨基酸位置编号指分配给SEQ ID NO：2的成熟解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶序列的那些位置编号。然而，本发明不限于该具体枯草杆菌蛋白酶的突变，而是延及在等同于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中具体鉴定的残基的位置上含有氨基酸残基的前体蛋白酶。
本文使用的术语“修饰”和“突变”指氨基酸序列中的任何改变或者变化。该术语意在包括目的氨基酸序列(即，枯草杆菌蛋白酶序列)中氨基酸侧链的取代、缺失、插入和/或置换。该术语还意在包括目的氨基酸序列(例如，枯草杆菌蛋白酶序列)的化学修饰。
本文使用的术语“抗体”指免疫球蛋白。抗体包括但不仅限于直接得自期望产生抗体的任何物种的免疫球蛋白。此外，本发明包括修饰抗体。该术语还指保留与完整抗体所结合表位结合的能力的抗体片段，并包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗独特型(抗ID)抗体。抗体片段包括但不仅限于互补性决定区(CDR)、单链片段可变区(scFv)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。多克隆抗体和单克隆抗体也包括在本发明之内。优选地，所述抗体为单克隆抗体。
术语“氧化稳定的”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如暴露于或接触漂白剂或氧化剂)下保持一段时间后保留特定的酶活性量。在一些实施方案中，蛋白酶在接触漂白剂或氧化剂一段时间(例如至少1约分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。在一些实施方案中，如实施例所述测定稳定性。
术语“螯合剂稳定的”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如暴露于或接触螯合剂)下保持给定的一段时间后保留指定的酶活性量。在一些实施方案中，蛋白酶在暴露于螯合剂给定的一段时间(例如至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。在一些实施方案中，如实施例所述测定螯合剂稳定性。
术语“热稳定的”和“热稳定”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如暴露于改变的温度)下暴露于指定温度一段时间后保留指定的酶活性量。改变的温度包括升高或降低的温度。在一些实施方案中，蛋白酶在暴露于改变的温度一段时间(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。在一些实施方案中，如实施例所述测定热稳定性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的情况下，术语“增强的稳定性”指与其他的丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间流逝保留更高的蛋白水解活性。
在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的情况下，术语“降低的稳定性”指与其他的丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间流逝保留更低的蛋白水解活性。
术语“清洁活性”指蛋白酶在蛋白酶解、水解、清洁或本发明的其他过程中常见条件下获得的清洁性能。在一些实施方案中，通过使用多种涉及酶敏感性污渍(例如，草、血、奶、或卵蛋白)的清洁测定来确定清洁性能，通过将污渍置于标准洗涤条件后，进行多种层析、分光光度或其他定量方法来确定。示例性测定包含但不限于在WO 99/34011和U.S.Pat.6,605,458中描述的(均引入本文作为参考)，以及实施例中包含的那些方法。
术语蛋白酶的“清洁有效量”指在特定清洁组合物中实现预期酶活性水平的上述蛋白酶的量。此类有效量易于为本领域技术人员确定，并取决于多种因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁用途、清洁组合物的特定组成，以及需要液体组合物还是干燥组合物(例如，颗粒状、条形)。
如本文中使用的，术语“清洁辅助材料”意指为期望的特定类型的清洁组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、条形、糊状、片剂、凝胶或泡沫组合物)而选择的任何液体、固体或气体材料，所述材料也优选与组合物中使用的蛋白酶相容。在一些实施方案中，颗粒状组合物是“致密”形式的，而在其他实施方案中，液体组合物是“浓缩”形式的。
在清洁活性的情况下，术语“增强的性能”指通过标准洗涤循环和/或多个洗涤循环后的常规评估，确定对一些酶敏感性污渍(如卵、奶、草或血)提高的或增加的清洁活性。
在清洁活性的情况下，术语“降低的性能”指通过标准洗涤循环后的常规评估，确定对一些酶敏感性污渍(如卵、奶、草或血)降低的或减少的清洁活性。
在清洁活性的情况下，术语“相当的性能”指比较的枯草杆菌蛋白酶(如，市售蛋白酶)的至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％的清洁活性，所述枯草杆菌蛋白酶包含但不限于OPTIMASETM蛋白酶(Genencor)、PURAFECT TM蛋白酶产品(Genencor)、SAVINASE TM蛋白酶(Novozymes)、BPN’-变体(参见例如，美国专利号34,606)、RELASETM、DURAZYMETM、EVERLASETM、KANNASE TM蛋白酶(Novozymes)、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASE TM蛋白酶(Genencor；还参见，美国专利号34,606，美国专利号5,700,676；5,955,340；6,312,936；和6,482,628)，和迟缓芽孢杆菌变体蛋白酶产品(例如，在WO 92/21760、WO 95/23221和/或WO 97/07770中描述的)。示例性枯草杆菌蛋白酶变体包含但不限于在等价于BPN’的76、101、103、104、120、159、167、170、194、195、217、232、235、236、245、248和/或252位的残基位置上具有取代或缺失的对象。可以通过将本发明的蛋白酶与上述枯草杆菌蛋白酶在多个清洁测定中进行比较，来确定清洁性能，所述清洁测定涉及酶敏感性污渍(如，草、血或奶)，在标准洗涤循环条件后，通过常规的分光光度法或分析方法来测定。
如本文中使用的，“纺织品清洁组合物”包含手洗和机洗洗涤剂组合物，包含洗衣添加组合物和适用于浸泡和/或预处理污损纺织品(例如，衣物、亚麻和其他纺织材料)的组合物。
如本文中使用的，“非纺织品清洁组合物”包含非纺织(即，织物(fabric))表面清洁组合物，包含但不限于餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、洁齿组合物和个人清洁组合物。
本文中，清洁组合物的“致密”形式最好通过密度来反映，对组合物而言，通过无机填充盐的量来反映。无机填充盐是粉末形态的洗涤剂组合物的常规成分。在常规的洗涤剂组合物中，填充盐以显著的量存在，一般为总组合物重量的约17-约35％。相反，在致密组合物中，填充盐以不超过总组合物约15％的量存在。在一些实施方案中，填充盐存在的量不超过组合物重量的约10％或更优选约5％。在一些实施方案中，无机填充盐选自硫酸和盐酸的碱金属盐和碱土金属盐。优选的填充盐是硫酸钠。
本文使用的术语“表面活性剂”指本领域中公认的具有表面活性性质的任何化合物。表面活性剂一般包括阴离子、阳离子、非离子和两性离子化合物，它们在本文中进一步描述。
本文使用的术语“接触”和“暴露”指将表面活性剂和脂解酶置于与油性污渍或者油性污物足够近的地方以使得该酶和表面活性剂能够通过产生在表面活性剂中溶解的脂肪酸至少部分减少污渍或污物的量。接触可以发生在洗衣机、洗涤槽中、体表上，等等。
具体实施方式
以下的实施例更详细地描述了本发明，但其并非意在以任何方式限制本发明的范围。附图应认为是本发明说明书和描述的完整部分。提供以下实施例以用于说明而非限制本发明。
在下文公开的实验内容中使用以下缩写：ppm(百万分之一)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)；μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(微升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(有效量)；ND(未进行)；NA(不适用)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCI(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷酸三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积)；v/v(体积/体积)；g(重力)；OD(光密度)；PI(性能指数)；Dulbecco磷酸缓冲液(DPBS)；SOC(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl)；Terrific培养液(TB；12g/l细菌用胰蛋白胨、24g/l甘油、2.31g/l KH2PO4和12.54g/l K2HPO4)；OD280(280nm处的光密度)；OD600(600nm处的光密度)；A405(405nm处的吸光度)；Vmax(酶催化反应的最高起始速率)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.21])；PBST(PBS+0.25％TWEEN
Figure BPA00001263671500611
20)；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris-HCI(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸盐)；Tricine(N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)；TAPS(3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸)；CAPS(3-(环己基氨基)-丙磺酸；DMSO(二甲亚砜)；DTT(1，4-二硫代-DL-苏糖醇)；SA(芥子酸(s，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸))；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；HPLC(高压液相层析)；RP-HPLC(反向高压液相层析)；TLC(薄层层析)；MALDI-TOF(基质辅助的激光解吸/电离飞行时间)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)，Me(甲基)；Taq(栖热水生菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；HDL(高密度液体)；MJ Research(MJ Research，Reno，NV)；Baseclear(Baseclear BV，Inc.，Leiden，the Netherlands)；PerSeptive(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA)；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan，San Jose，CA)；Argo(Argo BioAnalytica，Morris Plains，NJ)；Seitz EKS(SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach，德国)；Pall(Pall Corp.，East Hills，NY)；Spectrum(Spectrum Laboratories，Dominguez Rancho，CA)；Molecular Structure (Molecular Structure Corp.，Woodlands，TX)；Accelrys(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；Chemical Computing(Chemical Computing Corp.，Montreal，加拿大)；New Brunswick(New Brunswick Scientific，Co.，Edison，NJ)；CFT(Center for Test Materials，Vlaardingen，the Netherlands)；Test Fabrics(Test Fabrics，Inc.，West Pittiston，PA)；Procter & Gamble (Procter & Gamble，Inc.，Cincinnati，OH)；GE Healthcare(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，United Kingdom)；OXOID(Oxoid，Basingstoke，Hampshire，UK)；Megazyme(Megazyme International Ireland Ltd.，Bray Business Park，Bray，Co.，Wicklow，爱尔兰)；Finnzymes(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)；Kelco(CP Kelco，Wilmington，DE)；Corning(Corning Life Sciences，Corning，NY)；(NEN(NEN Life Science Products，Boston，MA)；Pharma AS(Pharma AS，Oslo，挪威)；Dynal(Dynal，Oslo，挪威)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)；ATCC(American Type Culture Collection，Rockville，MD)；Gibco/BRL(Gibco/BRL，Grand Island，NY)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；NCBI(National Center forBiotechnology Information)；Applied Biosystems(Applied Biosystems，Foster City，CA)；BD Biosciences和/或Clontech(BD Biosciences CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)；Operon Technologies(Operon Technologies，Inc.，Alameda，CA)；MWG Biotech(MWG Biotech，High Point，NC)；Oligos Etc(Oligos Etc.Inc，Wilsonville，OR)；Bachem(Bachem Bioscience，Inc.，King of Prussia，PA)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Mediatech(Mediatech，Herndon，VA；Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)；Oxoid(Oxoid Inc.，Ogdensburg，NY)；Worthington(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；Millipore(Millipore，Billerica，MA)；Bio-Rad(Bio-Rad，Hercules，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)；NEB(New England Biolabs，Ipswich，MA)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Takara(Takara Bio Inc.Otsu，日本)；Roche(Hoffmann-La Roche，Basel，瑞士)；EM Science(EM Science，Gibbstown，NJ)；Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Biodesign(Biodesign Intl.，Saco，缅因州)；Aptagen(Aptagen，Inc.，Herndon，VA)；Sorvall(Sorvall brand，from Kendro Laboratory Products，Asheville，NC)；United States Testing(United States Testing Co.，Hoboken，NJ)；Molecular Devices(Molecular Devices，Corp.，Sunnyvale，CA)；R&D Systems(R&D Systems，Minneapolis，MN)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；Marsh(Marsh Biosciences，Rochester，NY)；Geneart(Geneart GmbH，Regensburg，Germany)；DNA2.0(DNA2.0，Menlo Park，CA)；Gene Oracle(Gene Oracle，Mountain View，CA)；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)；Biacore(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)；Bioké(Bioké，Leiden，The Netherlands)；PeproTech(PeproTech，Rocky Hill，NJ)；SynPep(SynPep，Dublin，CA)；New Objective(New Objective brand；Scientific Instrument Services，Inc.，Ringoes，NJ)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Matrix Science(Matrix Science，Boston，MA)；Dionex(Dionex，Corp.，Sunnyvale，CA)；Monsanto(Monsanto Co.，St.Louis，MO)；Wintershall(Wintershall AG，Kassel，德国)；BASF(BASF Co.，Florham Park，NJ)；Huntsman(Huntsman Petrochemical Corp.，Salt Lake City，UT)；Enichem(Enichem Iberica，Barcelona，西班牙)；Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG，Buchs，瑞士)；Gist-Brocades(Gist-Brocades，NV，Delft，荷兰)；Dow Corning(Dow Corning Corp.，Midland，MI)；和Microsoft(Microsoft，Inc.，Redmond，WA)。
实施例1
测定法
在下面的实施例中，为了容易阅读，使用如下给出的多种测定法。在实施例中指出了与下面提供的方案的任何偏差。
A.用于96孔微量滴定板中蛋白质含量测定的TCA测定法
对于BPN’(例如，参考蛋白酶)和BPN’变体，使用在33℃下以230rpm摇动并且湿润通风的条件下生长3-4天的微量滴定板的经过滤培养物上清液开始该测定法。新的96孔平底微量滴定板(MTP)用于该测定法。首先，在每个孔中放置100μL/孔的0.25N HCl。然后，加入50μL过滤的培养液。然后测定405nm(在平板读出器中使用5秒混合模式)下的光散射/吸收以便提供“空白”读数。对于测试，将100μL/孔的15％(w/v)三氯乙酸(TCA)置于平板并在室温温育5到30分钟。然后测定405nm(在平板读出器中使用5秒混合模式)下的光散射/吸收。
对于GG36(例如，参考蛋白酶)和其变体，使用在37℃下以300rpm摇动并且湿润通风的条件下生长3天的微量滴定板的过滤培养物上清液开始该测定法。在该测定中，向96孔平底微量滴定板的每个孔加入100μL0.25M HCl溶液。随后，向孔中加入25μL等分试样的过滤培养物上清液(含有蛋白酶)。然后测定405nm(在平板读出器中使用5秒混合模式)下的光散射/吸收以便提供“空白”读数。该测量后，向每孔加入100μL 30％(w/v)TCA溶液并在室温温育微量滴定板5到15分钟。最后，测定405nm(在平板读出器中使用5秒混合模式)下所得的光散射/吸收。
使用的设备为Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX(340型；Molecular Devices)MTP读出器；MTP’s来自Costar(type 9017)。使用的设备为Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX type 340(Molecular Devices)MTP读出器；并且MTPs为9017型(Costar)。
通过从使用TCA的测试读数扣除空白(无TAC)进行计算以提供样品中蛋白质含量的相对测量。如果希望，通过用已知的转换系数用克隆的AAPF测定法校准TCA读数产生标准曲线。然而，TCA结果可以在从50到500蛋白质/ml(ppm)的蛋白质浓度方面是线性的并且可以为了选择好性能的变体的目的，针对酶性能直接作图。样品中浊度/光散射增加与培养物上清液中可沉淀的蛋白质的总量相关。
B.96孔微量滴定板中的AAPF蛋白酶测定法
为了测定本发明的蛋白酶及其变体的蛋白酶活性，测量N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-对-硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解。使用的试剂溶液为：100mM Tris/HCl，pH 8.6，含有0.005％ TWEEN
Figure BPA00001263671500651
-80(Tris稀释缓冲液)；100mM Tri缓冲液，pH 8.6，含有10mM CaCl2和0.005％ TWEEN
Figure BPA00001263671500652
-80(Tris/Ca缓冲液)；和DMSO中的160mMsuc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA贮存液)(Sigma：S-7388)。为了制备suc-AAPF-pNA工作液，向100ml Tris/Ca缓冲液中加入1mlsuc-AAPF-pNA贮存液并充分混合至少10秒。通过向每孔加入10μl稀释的蛋白酶溶液，接着立即加入190μl 1mg/ml suc-AAPF-pNA工作液进行测定法。溶液混合5秒，并在MTP读出器中25℃下以动力学模式(5分钟内20次读数)读出吸光度改变。将蛋白酶活性表达为AU(活性＝ΔOD.min-1ml-1)。
C.表面活性剂和螯合剂稳定性测定法
分别在LAS和LAS/EDTA存在下温育测试蛋白酶后测量LAS和LAS/EDTA稳定性，作为使用AAPF测定法测量的残留活性的函数。
LAS稳定性方法
试剂：
十二烷基苯磺酸钠盐(＝LAS)：Sigma D-2525
TWEEN
Figure BPA00001263671500661
-80：Sigma P-8074
TRIS缓冲液(无酸的)：Sigma T-1378)；将6.35g溶于约960ml水中，用4N HCl将pH调节至8.2。TRIS终浓度为52.5mM。
LAS贮存液：在MQ水中制备10.5％LAS溶液(＝10.5g/100ml MQ)
TRIS缓冲液-100mM/pH 8.6(100mM Tris/0.005％ Tween
Figure BPA00001263671500662
80)
TRIS-Ca缓冲液，pH 8.6(100mM Tris/10mM CaCl2/0.005％Tween
Figure BPA00001263671500663
80)
硬件：
平底MTP：Costar(#9017)
Biomek FX
ASYS多道移液器
Spectramax MTP读数器
iEMS培养箱/摇床
Innova 4330培养箱/摇床
Biohit多道移液器
BMG Thermostar摇床
在52.5mM Tris缓冲液pH 8.2中制备0.063％LAS溶液。通过将1ml100mg/ml suc-AAPF-pNA贮存液(DMSO中)加入100ml(100mM)TRIS缓冲液，pH 8.6中来制备suc-AAPF-pNA工作液。为了稀释上清液，将平底平板中装入稀释缓冲液，加入上清液等分试样并充分混合。稀释比取决于培养板中蛋白酶对照的浓度(AAPF活性)。期望的蛋白质浓度为80ppm。
将10μl稀释的上清液加入190μl 0.063％LAS缓冲液/孔中。用胶带盖上MTP，对于BPN’或GG36，摇动几秒并置于45℃的培养箱(Innova 4230)中60分钟，以200rpm摇动。在孵育10分钟后通过将每个孔中的10μl混合物转移至含有190μl suc-AAPF-pNA工作液的新MTP中来测定起始活性(t＝10分钟)。将这些溶液充分混合，并使用MTP读数器(在5分钟内和25℃下读出20个读数)测定AAPF活性。
通过在孵育60分钟后再将10μl溶液从孵育平板中取出来测定最终活性(t＝60分钟)。如上述测定AAPF活性。通过如下计算残留的和初始AAPF活性的比例测定样品的稳定性：
残留活性(％)＝[t-60值]*100/[t-10值]。
LAS/EDTA稳定性方法
在确定的条件下温育后测量代表性阴离子表面活性剂(LAS＝直链烷基苯磺酸盐，，十二烷基苯磺酸钠-DOBS)和EDTA二钠存在下蛋白酶变体的稳定性并使用AAPF测定法测量残留活性。使用的试剂为十二烷基磺酸钠盐(DOBS，Sigma No.D-2525)，TWEEN
Figure BPA00001263671500671
-80(Sigma No.P-8074)，EDTA二钠(Siegfried Handel No.164599-02)，HEPES(Sigma No.H-7523)，非胁迫缓冲液：50mM HEPES(11.9g/l)+0.005％ TWEEN
Figure BPA00001263671500672
-80，pH 8.0，胁迫缓冲液：50mM HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mMEDTA(3.36g/l)，pH 8.0，参考蛋白酶和蛋白酶变体培养物上清液，含有200-400μg/ml蛋白质。使用的设备为V-或U-底MTP作为稀释平板(分别为Greiner 651101和650161)，F-底MTP(Corning 9017)用于非胁迫和LAS/EDTA缓冲液以及用于suc-AAPF-pNA平板，Biomek FX(Beckman Coulter)，Spectramax Plus 384 MTP读出器(Molecular Devices)，iEMS培养箱/摇床(1mm振幅)(Thermo Electron Corporation)，密封带：Nunc(236366)。
iEMS培养箱/摇床(Thermo/Labsystems)设置在29℃。将培养物上清液稀释到含有无胁迫缓冲液的平板中至～25ppm(主稀释平板)的浓度。将来自主稀释平板的20μl样品加入含有180μl非胁迫缓冲液的平板中以得到2.5ppm的最终温育浓度。将内含物混合并保持在室温，在该平板上进行AAPF测定法。向含有180μl胁迫缓冲液(50mM HEPES(11.9g/l)，0.1％(w/v)DOBS(1g/l)，10mM EDTA(3.36g/l)，pH 8.0)的180μl胁迫缓冲液的平板加入来自主稀释平板的20μl样品。混合溶液并立即置于29℃iEMS摇床中400rpm下30分钟。温育30分钟后，在胁迫平板上进行AAPF测定法。如下通过计算残留的和最初AAPF活性的比例测定样品的稳定性：残留活性(％)＝[mOD.min-1胁迫的]*100/[mOD.min-1非胁迫的]。
D.清洁性能测定法
在可商购洗涤剂中测定蛋白酶变体的污物去除性能。商业洗涤剂配方产品的热失活用于破坏任何蛋白质组分的酶活性而保留非酶组分的性质。从而，该方法适于制备商购的洗涤剂用于测试本发明的酶变体。
微样品：
从CFT得到1/4”圆形直径的微样品。将单个微样品或两个微样品垂直置于96孔MTP的每孔中以暴露整个表面区域(即，在孔底部上不是平的)。
BMI微样品测定法
从CFT得到0.25英寸圆形直径的含有血、奶和墨(BMI)的微样品。在切割样品前，将织物(EMPA 116)用水洗涤。将一个微样品垂直置于96孔微量滴定板的每孔中以暴露整个表面区域(即，在孔底部上不是平的)。如本文所述的制备希望的洗涤剂溶液。在25℃平衡Thermomixer后，向含有微样品的MTP的每孔加入190μl洗涤剂溶液。向该混合物中加入10μl稀释的酶溶液，使得最终酶浓度为1μg/ml(从BCA测定法测定)。将MTP用胶带封闭并置于培养箱中30分钟，在1400rpm下搅拌。在合适条件下温育后，从每孔转移100μl溶液到新的MTP中。该含有100μl溶液/孔的新的MTP用MTP SpectraMax读出器在405nm下读数。也包括空白对照，以及含有两个微样品和洗涤剂但是没有酶的对照。
烘焙的蛋微样品测定法
从鸡蛋黄制备用于这些测定法的96孔烘焙蛋黄底物平板。从膜囊释放的鸡蛋黄与蛋清分离，并且用Milli-Q水稀释20％(体积/重量)。用磁力搅拌器室温下搅拌稀释的蛋黄15分钟。用8通道移液器将5μL小心移液到96孔V形底平板(Costar#3894)的每孔的中心。平板在90℃烘焙1小时并在室温冷却。将烘焙的蛋黄底物平板在室温下保存并在制备的1周内使用。如在本文献的别处所述的制备自动化碟洗涤剂并预热到50℃。用8通道移液器向96孔板的每孔加入190μL等分试样的洗涤剂。用96通道移液装置向每孔加入10μL稀释的酶。用粘合箔密封器小心封闭平板并在50℃摇动下温育30分钟。然后，将120μL反应混合物转移到新的96孔平底板，并在405nm测定吸光度/光散射。405nm下吸光度/光散射与蛋黄去除成比例。
蛋黄微样品测定法
如本文别处描述的制备自动碟洗涤剂。使用的设备包括New Brunswick Innova 4230摇床/培养箱和SpectraMAX(340型)MTP读出器。MTPs从Costar(9017型)得到。老化蛋黄色素样品(CS-38)从测试材料中心(Center for Test Materials)得到。在切成0.25英寸圆形微样品之前，用水洗涤该织物。将一个微样品置于96孔微量滴定板的每孔中。测试洗涤剂在50℃平衡。向含有微样品的MTP的每孔加入190μl洗涤剂溶液。向该混合物中加入10μl稀释的酶溶液。用粘合箔封闭MTP并将其置于培养箱中搅拌30分钟。温育后，从每孔转移100μl溶液到新的MTP中。用SpectraMax MTP读出器在405nm读出该MTP。也包括空白对照，以及含有微样品和洗涤剂但是没有酶的对照。
“3K”样品固定
使用下述的固定方法预处理该类型的微样品。在10升烧杯中，使用杓子将8升蒸馏水与80ml 30％过氧化氢充分混合。将40片EMPA 116样品以扇形分布放下后加入溶液中以确保均一固定。使用杓子将样品在溶液中涡旋共30分钟，前5分钟连续涡旋，剩下的25分钟偶尔涡旋。固定过程后，丢弃溶液并冲洗样品6次，每次冲洗用约6升蒸馏水。冲洗后，将样品置于纸巾上方干燥。然后将风干的样品用1/4”圆形模子在冲击式打孔器(expulsion press)上打孔。最后，将单个微样品垂直置于96孔MTP的每个孔中以暴露整个表面区域(即，在孔的底部上不是平的)。
“预洗的”样品
该类型的微样品在室温下在去离子水中预洗20分钟。预洗步骤后，将样品置于纸巾上方干燥。然后将风干的样品用1/4”圆形模子在冲击式打孔器(expulsion press)上打孔。最后，将两个微样品垂直置于96孔MTP的每个孔中以暴露整个表面区域(即，在孔的底部上不是平的)。
洗涤剂
对于北美(NA)和西欧(WE)重负荷液体洗衣(HDL)洗涤剂，通过将预先称重的液体洗涤剂(玻璃瓶中)置于水浴中95℃下2小时进行热失活。北美(NA)和日本(JPN)重负荷粒状洗衣(HDG)洗涤剂的热失活的温育时间为8小时，西欧(WE)HDG洗涤剂的为5小时。NA和WE自动洗碟(ADW)洗涤剂的热失活温育时间为8小时。洗涤剂购自当地超市商店。溶解洗涤剂5分钟内测定未加热和加热的洗涤剂以准确测定去活化的百分比。通过AAPF测定法测定酶活性。
洗涤剂的工作溶液由热失活的贮存液制备。所有洗涤剂都是可商购的洗涤剂。向洗涤剂溶液中加入合适量的水硬度(6gpg或12gpg)和缓冲剂以匹配希望的条件(表1-1)。通过涡旋或者倒置瓶子混合溶液。
*缩写：Procter & Gamble(P&G)；和Reckitt Benckiser(RB)。
在可商购洗涤剂(Calgonit 5合1)中在MTP规模上测定参考丝氨酸蛋白酶和其变体对微样品的污物去除性能。使用的试剂为5mM HEPES，pH 8.0或5mM MOPS，pH 7缓冲液，对于中等水硬度为3∶1 Ca∶Mg。(CaCl2∶MgCl2·6H2O)；15000格令/加仑(gpg)贮存液稀释到6gpg，2BMI(血/奶/墨)微样品/平板：通过CFT处理的EMPA-116BMI棉样品：每孔预冲洗并打孔的2个样品，热失活的TIDE
Figure BPA00001263671500712
2X Cold现货洗涤剂，其中证实了缺少蛋白酶活性。
Figure BPA00001263671500713
将培养箱设置在希望的温度(16℃或32℃)。将～10ppm酶的主稀释平板的10μL样品加入具有上面列出的190μL工作洗涤剂溶液的BMI 2-样品平板。调节体积到测定平板中变体的终浓度为0.5ppm。立即将平板转移到iEMS培养箱中并在给定温度下以1400rpm摇动温育30分钟。温育后，转移100μL上清液到新的96孔板并在MTP读出器中405nm和/或600nm下测量吸光度。在测试中也包括对照孔，其含有1或2个微样品和没有加入蛋白酶样品的洗涤剂。405nm下的测量提供了较高的值并且跟踪了色素去除，而600nm下的测量跟踪浊度和清洁。
为所有微样品测定方法计算污物去除活性：
为空白值(没有酶的底物)校正所得的吸光度值，提供了水解活性的度量。对于每种样品(变体)，计算性能指数。性能指数比较在相同蛋白质浓度下变体(实际值)和标准酶(理论值)的性能。此外，使用标准酶的朗缪尔方程的参数可以计算理论值。
酶和设备
从生长在MTP平板中的培养物的过滤培养液得到参考丝氨酸蛋白酶及其变体的样品。使用的设备为Biomek FX Robot(Beckman Coulter)，SpectraMAX MTP读出器(type 340；Molecular Devices)，iEMS培养箱/摇床(Thermo/Labsystems)；F-底MTPs(Costar 9017型，用于温育后对反应平板读数)；和V-底MTPs(Greiner 651101，用于上清液的预稀释)。在该测定法中，蛋白酶水解底物并从底物释放色素和不溶性颗粒。从而，浊度率为酶活性的度量。
E.蛋白酶及其变体的相对比活性
为了区分蛋白酶变体，使用suc-AAPF-pNA作为底物计算表观相对比活性，其使得能够比较并排序变体与野生型或标准蛋白酶。通过将蛋白水解活性除以使用上述测定法测量的每种样品的TCA值确定对suc-AAPF-pNA底物的比活性。使用这些值，计算相对比活性(变体的比活性/参考蛋白酶的比活性)。
F.洗碟性能
在多种自动洗碟条件下测试蛋白酶变体的性能。碟洗涤剂的组成在下表中显示。这些洗涤剂可以从wfk Testmaterials(www.testgewebe.de/en/products/detergents/)购买并且通过它们的wfk Testmaterials名称引用。这些洗涤剂得自不存在酶的来源，以允许分析蛋白酶变体。
Figure BPA00001263671500732
下面提供了制备每种污渍类型(蛋黄、肉末和蛋，和蛋与奶)的方案。在将各污物类型应用于测试碟时，充分洗涤碟子。这是尤其必须的，因为某些持久污物的残留可能仍然存在于来自以前测试的碟子上。新的碟子在首次用于测试前进行充分洗涤。
在不锈钢上制备蛋黄污物
用于这些实验的不锈钢片(10x 15cm；在一面刷过)在95℃下在实验室洗碗机中用高碱度商业洗涤剂(例如，ECOLAB
Figure BPA00001263671500741
洗涤剂；Henkel)充分洗涤以提供清洁并且无油脂的不锈钢片。将这些不锈钢片在首次使用前清理毛刺。将不锈钢片在热的柜子中80℃下干燥30分钟后用蛋黄弄脏。待刷的表面在弄脏前没有接触。而且，不允许表面上有水污物或软毛。冷却的不锈钢片在弄脏前称重。
通过分离约10-11枚蛋的蛋黄与蛋清制备蛋黄(200g蛋黄)。在玻璃烧杯中用叉子搅拌蛋黄来混匀蛋黄悬浮液。然后将蛋黄过滤(约0.5mm目)，除去粗颗粒和任何蛋壳碎片。
用扁平刷子(2.5”)将2.0±0.1g蛋黄悬浮液尽可能均匀地涂在不锈钢片每个刷过的面上140cm2的区域，留下约1cm宽未弄脏的边缘(如果需要，使用胶带)。弄脏的钢片在室温下水平(以防止在钢片边缘上形成小滴)干燥4小时(最长24小时)。
为了将蛋黄蛋白质变性，将钢片浸入沸腾的去矿物质水中30秒(如果必要，使用夹持装置)。然后，将钢片在80℃干燥30分钟。干燥并冷却后，对钢片称重。称重后，放置钢片至少24小时(20℃，40-60％相对湿度)后将它们进行洗涤测试。为了满足测试要求，仅仅具有1000±100mg/140cm2(变性后蛋黄)的钢片用于测试。进行洗涤测试后，在热柜中80℃下干燥钢片30分钟，并冷却后再次称重。通过将洗涤时释放的蛋黄mg数除以所涂的变性蛋黄mg数乘以100来确定清洁性能百分比。
在陶瓷盘上制备肉末和蛋污物
对于这些实验，使用符合EN 50242，1495型，号码0219的冷菜盘(Arzberg，19cm直径，白色，上釉陶瓷)。将共225g瘦猪肉和牛肉(50∶50比例)细细切碎并保持冷却。混合物两次通过碎肉器。避免高于35℃的温度。然后将225g肉末与75g蛋(蛋清和蛋黄混合在一起)混合。使用前，将制备物在-18℃冷却长达3个月。如果难以得到猪肉，那么使用100％牛肉，因为这些是可互换的。
将肉末和蛋混合物(300g)返回到室温并与80ml去矿质水混合。用厨房手动搅拌器将混合物混匀2分钟。用叉子将3g肉末/蛋/水混合物分散在每个白色的陶瓷盘上，在盘边的周围留下约2cm宽的未弄脏的边缘。应用的量为11.8±0.5mg/cm2。将盘子在预热的热柜中120℃下干燥2小时。一旦盘子冷却，它们就可使用。
进行洗碟试验后，用茚三酮溶液(用乙醇制备到1％)喷雾盘子以更好地鉴定肉末蛋白质残留物。为了促进颜色反应，将盘子在热柜中80℃下加热10分钟。通过参考IKW照像目录(IKW-The German Cosmetic，Toiletry，Perfumery and Detergent Association)视觉检查肉末残留物的颜色反应进行洗涤性能的评估。
在不锈钢上制备蛋/奶污物
用于这些实验的不锈钢片(10x 15cm；在一面上刷过)在实验室洗碗机中95℃下用高碱度商业洗涤剂充分洗涤以除去油脂和清洁钢片。将钢片用纤维素布擦干。待刷的表面在弄脏前不触摸。而且，不允许表面上的水污物或者软毛。弄脏前，将钢片置于热柜中80℃下30分钟。冷却的钢片在弄脏前称重。
将完整生蛋(3-4个蛋，约160g/蛋)的蛋黄和蛋清置于碗中并用搅蛋器打碎。然后，向混合物中加入50ml半脱脂乳(1.5％脂肪，超高温，混匀的)。混合奶和蛋，没有产生泡沫。用扁平刷子在不锈钢片的刷过的表面上均匀分布1.0±0.1g蛋/奶混合物，使用天平检查分布。在钢片的短边周围留下约1.0cm的边缘。弄脏的钢片在室温下水平(以防止在钢片边上形成小滴)干燥4小时(最长24小时)。
将钢片浸入沸腾的去矿物质水中30秒(如果必要，使用夹持装置)。然后，将钢片在80℃干燥30分钟。干燥并冷却后，对钢片称重。称重后，放置钢片至少24小时(20℃，40-60％相对湿度)后将它们进行洗涤测试。为了满足测试要求，仅仅使用具有190±10mg蛋黄/奶的钢片。
进行洗涤测试后，在热柜中80℃下干燥钢片30分钟，并冷却后再次称重。通过将洗涤时释放的蛋黄/奶mg数除以所涂的蛋/奶mg数乘以100来确定清洁性能百分比。
洗涤设备和条件
在装备如上述制备的弄脏的碟子和不锈钢片的自动洗碗机(Miele G690SC型)中进行洗涤测试。使用确定量的洗涤剂。测试的温度为50℃。水硬度为21°GH(德国硬度)。如上述，洗涤后，通过视觉评估肉末弄脏的盘子，使用0到10的照片评定量表，其中“0”表示完全脏的盘子，“10”表示清洁的盘子。这些值对应于含有酶的洗涤剂的污渍或污物去除(SR)能力。通过重量分析法分析用蛋黄或蛋黄/奶弄脏的经洗涤的不锈钢板以确定洗涤后残留污物的量。在每次洗涤0到30mg/活性蛋白质的水平上测试变体蛋白酶。
G.水蛭抑制剂C抑制测定法
如本文所述，通过用抑制剂滴定测定丝氨酸蛋白酶浓度和比活性。来自水蛭(Hirudo medicinalis)的水蛭抑制剂c是枯草杆菌蛋白酶和ASP蛋白酶的紧密结合蛋白质抑制剂(Heinz等人，Biochemistry，31：8755-66，1992)，并且因此可用于测量酶浓度，酶浓度又允许计算比活性。简言之，测量一些已知浓度的水蛭抑制剂c产生的酶抑制量。从该信息计算完全抑制所需的水蛭抑制剂c的浓度。这等同于样品中的酶浓度。
使用上述生色AAPF测定法测量蛋白酶活性。通过标准方法合成水蛭抑制剂c的基因并在大肠杆菌中表达。其性质和抑制效力与购自Sigma的水蛭抑制剂c相同。通过测量已知比活性的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶样品的抑制来确定水蛭抑制剂c贮存液的浓度。然后将校准的水蛭抑制剂c样品用于测定枯草杆菌蛋白酶变体的浓度和比活性。这些值用于产生归一化的96孔酶贮存液平板，其中将所有变体稀释到共同的浓度。
H.性能指数
性能指数比较相同蛋白质浓度下变体(实际值)和标准或参考蛋白酶(理论值)的性能。此外，使用标准蛋白酶的结合曲线(即朗缪尔方程)的参数可以计算理论值。大于1的性能指数(PI)(PI＞1)鉴定与标准品(例如野生型)相比更好的变体，而PI 1(PI＝1)将变体鉴定为性能与标准品相同，小于1的PI(PI＜1)鉴定比标准品更差的变体。从而，PI鉴定在某些条件下的成功者，以及较不希望使用的变体。
实施例2
在枯草芽孢杆菌中产生BPN’蛋白酶
在该实施例中，描述了为在枯草芽孢杆菌中产生BPN’蛋白酶所进行的实验。如本领域已知的进行质粒pHPLT-BPN’向枯草芽孢杆菌中的转化(见例如，WO 02/14490，并入本文作为参考)。下面提供的DNA序列(aprE-BPN’杂合前导序列，来自解淀粉芽孢杆菌的BPN’前和BPN’成熟DNA序列)编码BPN’前体蛋白：
Figure BPA00001263671500771
在上面的序列中，粗体指出编码成熟蛋白酶的DNA，标准字体指出前导序列(aprE-BPN’杂合前导序列)，加下划线的指出前序列(BPN’)。在下面提供了BPN’前体蛋白的氨基酸序列(aprE-BPN’杂合前导序列、BPN’前和BPN’成熟DNA序列)。在该序列中，粗体和加下划线的指出成熟的BPN’蛋白酶。
VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKG
GKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAY
Figure BPA00001263671500781
Figure BPA00001263671500782
构建BPN’表达载体(pHPLT-BPN’)
使用标准条件与TGO聚合酶(Roche Diagnostics)用pJH101term得到PCR片段。质粒pJH101对应于pJH101(Ferrari等人，J Bacteriol，154：1513-5[1983])，在EcoRI/BamHI位点插入了下面的片段：
GAATTCCTCCATTTTCTTCTGCTATCAAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGAGCTTTCA
AAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCCGATATTGGCTTAAA
CAGCGGCGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGCGAATGTTCATCTTATTTCTTCC
TCCCTCTCAATAATTTTTTCATTCTATCCCTTTTCTGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTA
TCATCATGCTTTGAAAAAATATCACGATAATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAGGT
CATTTGAACGAATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAG
CATGACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAAT
AGTTATTTCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGATAAAATCA
TCTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCACAGAATAGT
CTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAA
AATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACAT
CCTCTGCCCAGGCGGCAGGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACA
GACAATGAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGGCGGGAA
AGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACATTAAACGAAAAAGCTGTA
AAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCTTACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACATGCGT
ACGCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGC
TACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGATTCTTCTCATCCTGA
TTTAAAGGTAGCAGGCGGAGCCAGCATGGTTCCTTCTGAAACAAATCCTTTCCAAGACAAC
AACTCTCACGGAACTCACGTTGCCGGCACAGTTGCGGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTATT
AGGCGTTGCGCCAAGCGCATCACTTTACGCTGTAAAAGTTCTCGGTGCTGACGGTTCCGGCC
AATACAGCTGGATCATTAACGGAATCGAGTGGGCGATCGCAAACAATATGGACGTTATTAA
CATGAGCCTCGGCGGACCTTCTGGTTCTGCTGCTTTAAAAGCGGCAGTTGATAAAGCCGTTG
CATCCGGCGTCGTAGTCGTTGCGGCAGCCGGTAACGAAGGCACTTCCGGCAGCTCAAGCAC
AGTGGGCTACCCTGGTAAATACCCTTCTGTCATTGCAGTAGGCGCTGTTGACAGCAGCAACC
AAAGAGCATCTTTCTCAAGCGTAGGACCTGAGCTTGATGTCATGGCACCTGGCGTATCTATC
CAAAGCACGCTTCCTGGAAACAAATACGGGGCGTACAACGGTACGTCAATGGCATCTCCGC
ACGTTGCCGGAGCGGCTGCTTTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTC
CGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGGCT
GATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTT
TTTATTATTTTTCTTCCTCCGCATGTTCAATCCGCTCCATAATCGACGGATGGCTCCCTCTGA
AAATTTTAACGAGAAACGGCGGGTTGACCCGGCTCAGTCCCGTAACGGCCAAGTCCTGAAA
CGTCTCAATCGCCGCTTCCCGGTTTCCGGTCAGCTCAATGCCGTAACGGTCGGCGGCGTTTT
CCTGATACCGGGAGACGGCATTCGTAATCGGATCC(SEQ ID NO：3).
该片段含有具有融合信号序列(含有枯草芽孢杆菌的aprE信号序列的前8个氨基酸，接着是在第9个氨基酸开始的解淀粉芽孢杆菌的BPN’信号序列)的BPN’基因。该片段用作PCR反应的模板，使用下面的引物：AK04-14：GtcctctgttaacTTACTGAGCTGCCGCCTGTAC(SEQ ID NO：4)，其与BPN’成熟基因的3’末端退火，在翻译终止密码子的下游引入HpaI位点；和AK04-21.1：TTATGCGAGgctagcaaaaggagagggtaaagagtgagaagc(SEQ ID NO：5)，其在BPN’信号序列的5’末端退火，在5’末端引NheI位点。
从该反应得到的PCR片段用Qiagen PCR清洁试剂盒以标准条件进行清洁。在标准条件下用限制酶NheI和HpaI消化清洁的片段后，将其连接到含有LAT启动子的NheI/HpaI消化的载体(pHPLT-VAAc1，US2006/0014265中描述，见图3A)中。
随后，如引入本文作为参考的WO 02/14490中所述将pHPLT-BPN’连接混合物转化到枯草芽孢杆菌(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK)中。在含有25ml MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基)，与20mg/L新霉素的摇瓶中进行含有pHPLT-BPN’载体的枯草芽孢杆菌转化体的选择性生长(见图3B)。所转化细胞的培育导致产生分泌的具有蛋白水解活性的BPN’蛋白酶。使用NuPage Novex 10％ Bis-Tris凝胶(Invitrogen
Figure BPA00001263671500791
目录号NP0301BOX)进行凝胶分析。为了制备用于分析的样品，将2体积的上清液与1体积1M HCl，1体积4X LDS样品缓冲液(InvitrogenCatalog No.NP0007)，和1％PMSF(20mg/ml)混合，随后在70℃加热10分钟。然后，将25μL每种样品以及10μL SeeBlue plus 2预染色的蛋白质标准品(Invitrogen
Figure BPA00001263671500793
目录号LC5925)装载到凝胶上。结果清楚地表明该实施例中描述的BPN’克隆策略产生了枯草芽孢杆菌所产生的活性BPN’。
实施例3
产生BPN’位点评估文库和多突变文库
在该实施例中，描述了BPN’变体的构建。
BPN’位点评估文库(SEL)构建
含有BPN’表达盒的pHPLT-BPN’载体用作模板DNA。该载体含有独特的BglII限制酶位点，其用于SEL构建。Invitrogen
Figure BPA00001263671500801
合成(脱盐的，50nmol规模)并且列于表7-1的引物用于产生文库。
为了构建BPN’SEL，进行三次PCR扩增：两次诱变PCR以在成熟BPN’DNA序列中引入突变的目的密码子，第三次PCR融合两次诱变PCR以便构建在成熟BPN’序列中具有希望的突变密码子的pHPLT-BPN’表达载体。诱变方法基于密码子特异性突变方法。在该方法中，使用正向和反向寡核苷酸引物进行在特定DNA三联体中一次产生所有可能的突变，所述引物长度为25到45个核苷酸，包围对应于待突变的密码子序列的特别设计的三DNA序列(NNS，N＝A，C，T或G，S＝C或G)。这确保了在该特定BPN’成熟密码子处随机掺入核苷酸。引物名称(表3-1)中所列的数字对应于该特定BPN’成熟密码子位置。用于构建SEL的两个额外引物含有BglII限制酶位点以及BglII限制酶位点侧翼的一部分pHPLT-BPN’DNA序列。
每个SEL的构建以两个初次PCR扩增开始，使用HPLT-BglII-FW引物和特定BPN’反向诱变引物，对于第二次PCR扩增，使用pHPLT-BglII-RV引物和特异BPN’正向诱变引物(对于正向和反向诱变引物具有相等的BPN’成熟密码子位置)。用Finnzymes Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(目录号F-530L)进行成熟BPN’序列中诱变的引入。所有PCR扩增都根据随聚合酶提供的Finnzymes方案实施。PCR条件如下：对于初次PCR 1：
pHPLT-BglII-FW引物和特异BPN’反向诱变引物-均为1μL(10μM)；对于初次PCR 2：
pHPLT-BglII-RV引物和特异BPN’正向诱变引物-均为1μL(10μM)；置于
5X Phusion HF缓冲液    10μL
10mM dNTP混合物        1μL
Phusion DNA聚合酶      0.75μL(2单位/μL)
DMSO，100％            1μL
pHPLT-BPN’模板DNA     1μL(0.1-1ng/μL)
蒸馏的，高压灭菌水     至50μL。
用MJ Research(Location)PTC-200 Peltier热循环仪完成PCR，使用下面的PCR程序：30秒98℃，30X(10秒98℃，20秒55℃，1分钟72℃)和5分钟72℃。反应得到长为约2到3kB的两种片段，其具有在BPN’成熟目的密码子周围的约30个核苷酸碱基重叠。使用两种前述片段和正向和反向BglII引物在第三次反应中融合片段。融合PCR反应如下进行：pHPLT-BglII-FW引物和pHPLT-BglII-RV引物-均为1μL(10μM)
5X Phusion HF缓冲液    10μL
10mM dNTP混合物        1μL
Phusion DNA聚合酶      0.75μL(2单位/μL)
DMSO，100％            1μL
初次PCR 1反应混合物    1μL
初次PCR 2反应混合物    1μL
蒸馏的，高压灭菌水     至50μL
PCR融合程序如下：30秒98℃，30X(10秒98℃，20秒55℃，2:05分钟72℃)和5分钟72℃，使用MJ Research
Figure BPA00001263671500811
PTC-200 Peltier热循环仪。
扩增的线性4.8Kb片段用Qiagen
Figure BPA00001263671500812
Qiaquick PCR纯化试剂盒(目录号28106)纯化并用BglII限制酶消化以在融合片段的两边产生粘性末端。消化反应物含有：
-35μL纯化的线性DNA片段
-4μL React
Figure BPA00001263671500813
3缓冲液(Invitrogen
Figure BPA00001263671500814
)-1μL BglII，10单位/ml(Invitrogen
Figure BPA00001263671500821
)
反应条件：1小时，30℃。
BglII消化并纯化的片段的连接产生了含有希望的突变的多聚体DNA产物，其随后直接转化到感受态枯草芽孢杆菌中：
-30μL纯化的BglII消化的DNA片段
-8μL T4 DNA连接酶缓冲液(Invitrogen
Figure BPA00001263671500822
目录号46300-018)
-1μL T4DNA连接酶，1单位/μL(Invitrogen目录号15224-017)
反应条件：16-20小时，16℃。
如WO 02/14490中所述(引入本文作为参考)将连接混合物用于转化枯草芽孢杆菌(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK)。对于每个文库，挑选96个单个菌落并生长在含有新霉素和1.25g/L酵母提取物的MOPS培养基中，用于序列分析(BaseClear)和筛选目的。文库数目为1到275个。每个数字代表随机突变的成熟bpn’序列的密码子。每个文库含有最大19个BPN’变体。
Figure BPA00001263671500824
Figure BPA00001263671500831
Figure BPA00001263671500841
Figure BPA00001263671500851
Figure BPA00001263671500861
Figure BPA00001263671500871
Figure BPA00001263671500881
Figure BPA00001263671500891
Figure BPA00001263671500901
Figure BPA00001263671500911
Figure BPA00001263671500921
Figure BPA00001263671500931
Figure BPA00001263671500941
Figure BPA00001263671500951
Figure BPA00001263671500961
Figure BPA00001263671500971
Figure BPA00001263671500981
Figure BPA00001263671501001
Figure BPA00001263671501011
Figure BPA00001263671501021
Figure BPA00001263671501031
Figure BPA00001263671501041
Figure BPA00001263671501051
Figure BPA00001263671501061
Figure BPA00001263671501081
Figure BPA00001263671501091
Figure BPA00001263671501101
Figure BPA00001263671501111
Figure BPA00001263671501121
Figure BPA00001263671501141
Figure BPA00001263671501161
Figure BPA00001263671501171
Figure BPA00001263671501181
BPN’多突变文库构建
合成的BPN’多突变文库(或者组合文库)由Geneart、Baseclear和Bioké产生。每个合成的BPN’多突变文库含有BPN’基因的混合物，其中成熟序列的两个或多个所选密码子由特定DNA序列随机替换。例如：可以以这样的方式设计BPN’组合文库，其中成熟序列的密码子22将随机取代编码Thr，Gln，Val或Tyr的DNA三联体、编码Val，Gln，Asn或Tyr的密码子26、编码Ile，His，Tyr，或Asn的密码子31，和编码Ala，Glu，His或Asp的密码子48。在该实例中，组合文库将含有最大256个BPN’组合变体。然而，典型的BPN’多突变文库可以含有高达数千独特的BPN’变体基因。将具有末端AvaI和HindIII位点(见例如，野生型BPN’)的多突变文库片段用AvaI和HindIII消化，凝胶纯化并通过连接酶反应使用Invitrogen
Figure BPA00001263671501201
T4 DNA连接酶(目录号15224-025)，按照生产商对于粘性末端的一般克隆所推荐的克隆到pHPLT载体中。野生型BPN’AvaI/HindIII片段：
AAGACCCGAG CGTCGCTTAC GTTGAAGAAG ATCACGTAGC ACATGCGTAC GCGCAGTCCG
TGCCTTACGG CGTATCACAA ATTAAAGCCC CTGCTCTGCA CTCTCAAGGC TACACTGGAT
CAAATGTTAA AGTAGCGGTT ATCGACAGCG GTATCGATTC TTCTCATCCT GATTTAAAGG
TAGCAGGCGG AGCCAGCATG GTTCCTTCTG AAACAAATCC TTTCCAAGAC AACAACTCTC
ACGGAACTCA CGTTGCCGGC ACAGTTGCGG CTCTTAATAA CTCAATCGGT GTATTAGGCG
TTGCGCCAAG CGCATCACTT TACGCTGTAA AAGTTCTCGG TGCTGACGGT TCCGGCCAAT
ACAGCTGGAT CATTAACGGA ATCGAGTGGG CGATCGCAAA CAATATGGAC GTTATTAACA
TGAGCCTCGG CGGACCTTCT GGTTCTGCTG CTTTAAAAGC GGCAGTTGAT AAAGCCGTTG
CATCCGGCGT CGTAGTCGTT GCGGCAGCCG GTAACGAAGG CACTTCCGGC AGCTCAAGCA
CAGTGGGCTA CCCTGGTAAA TACCCTTCTG TCATTGCAGT AGGCGCTGTT GACAGCAGCA
ACCAAAGAGC ATCTTTCTCA AGCGTAGGAC CTGAGCTTGA TGTCATGGCA CCTGGCGTAT
CTATCCAAAG CACGCTTCCT GGAAACAAAT ACGGGGCGTA CAACGGTACG TCAATGGCAT
CTCCGCACGT TGCCGGAGCG GCTGCTTTGA TTCTTTCTAA GCACCCGAAC TGGACAAACA
CTCAAGTCCG CAGCAGTTTA GAAAACACCA CTACAAAACT TGGTGATTCT TTCTACTATG
GAAAAGGGCT GATCAACGTA CAGGCGGCAG CTCAGTAAGT TAACAGAGGA GGATTTCCT
GAAGGAAATC CGTTTTTTTA TTTTAAGCTT GGAGA(SEQ ID NO.559)
为了转化连接反应混合物，使用TempliPhi试剂盒(Amersham目录号25-6400)扩增文库DNA(在pHPLT中克隆的BPN’文库片段混合物)。为此目的，将1μL连接反应混合物与5μL来自TempliPhi试剂盒的样品缓冲液混合并在95℃加热3分钟以变性DNA。将反应物置于冰上冷却2分钟然后快速离心。接着，加入来自TempliPhi试剂盒的5μL反应缓冲液和0.2μL phi29聚合酶，并将反应物在MJ Research PCR机器中30℃下温育4小时。通过在65℃温育10分钟将phi29酶失活。
为了转化文库，将0.1μL TempliPhi扩增反应产物与500μL感受态枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK)混合，接着在37℃剧烈摇动1小时。该时间后，在含有20ppm新霉素和0.5％脱脂乳的HI-琼脂板上接种100和500μL等分试样。
下表提供了用于本发明的一些单取代列表。
Figure BPA00001263671501211
Figure BPA00001263671501221
Figure BPA00001263671501231
Figure BPA00001263671501241
Figure BPA00001263671501251
Figure BPA00001263671501261
Figure BPA00001263671501271
Figure BPA00001263671501281
Figure BPA00001263671501291
Figure BPA00001263671501311
Figure BPA00001263671501321
Figure BPA00001263671501331
Figure BPA00001263671501341
制备含有BPN’变体的粗酶样品
通过在96孔MTP中在MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基)中37℃下培养枯草芽孢杆菌转化体68小时产生BPN’变体蛋白。基本上如本文公知的(见例如Neidhardt等人，J.Bacteriol.，119：736-747[1974])制备MBD培养基，只是从基本培养基省略NH4Cl2，FeSO4，和CaCl2，使用3mM K2HPO4，并且基本培养基补充60mM尿素、75g/L葡萄糖和1％大豆胨(soytone)。微量营养物制备为100X贮存液，其在1升中含有400mg FeSO4 7H2O，100mg MnSO4.H2O，100mg ZnSO4 7H2O，50mg CuCl2 2H2O，100mg CoCl2 6H2O，100mg NaMoO4 2H2O，100mg Na2B4O7 10H2O，10ml 1M CaCl2，和10ml 0.5M柠檬酸钠。
实施例4
BPN’变体的LAS稳定性
在该实施例中，描述了在LAS存在下为评估多种单取代BPN’变体和多取代BPN’变体的稳定性所进行的实验。使用实施例1中所述的方法，通过测定升高的温度(45℃)下存在LAS时温育前后AAPF的活性来测量LAS稳定性。下表的结果显示为相对稳定性值，其中将变体BPN’的稳定性与野生型BPN’酶比较。具体地，相对稳定性是变体残留活性与野生型残留活性的比。大于1的值表明在LAS存在下更大的稳定性。
表4-1含有与野生型BPN’相比BPN’变体的相对稳定性值。如在本发明开发期间所确定，许多BPN’变体与野生型BPN’相比在LAS存在下具有可论证的更高稳定性。具体地，在所检查的92个BPN’位点的LAS稳定性测定中，40个位点(43％)是差的(有害的)并且52个位点(57％)是好的(有益的)。此外，在所测试的1508个变体中，96个(6％)是优良的(向上)，196个(13％)是中性的(相同)，1216个(81％)是更差的(向下)。
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实施例5
BPN′-变体的比活性
在该实施例中，描述了为测定BPN’和BPN’变体的相对比活性所进行的实验。使用实施例1中提供的方法测量针对AAPF的比活性。在表5-1中，结果显示为相对比活性值，其中将BPN’变体的活性与野生型BPN’的活性比较。具体地，相对比活性是变体比活性与野生型比活性的比值。大于1(PI＞1)的值表明针对AAPF底物的更高的比活性。
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实施例6
BPN′-变体数据的比较评估
在该实施例中，描述了为了测定BPN’和BPN’变体的蛋白质表达、污物去除活性、LAS稳定性和AAPF活性(目的性质测试)而进行的实验的结果。使用实施例1所述的方法得到结果。如全文所述，将BPN’变体的功能性定量为性能指数(PI)，其是变体与亲本蛋白的性能的比值。本文使用的PI等级包括：向上突变(PI＞1.0)；中性突变(PI＞0.5)；非有害突变(PI＞0.05)；和有害突变(PI≤0.05)。“组合突变”是对于至少一种性质组合指数值＝0.5并且对于所有性质＞0.05的变体的那些突变。组合突变是这样的突变，其可以被组合以为蛋白质赋予一种或多种希望的性质的合适性能指数。发生突变的位置如下分类：非限制性位置对于至少一种性质具有≥20％中性突变，限制性位置对于活性和稳定性具有＜20％中性突变。
这些数据可用于工程化任何枯草杆菌蛋白酶。即使待工程化的枯草杆菌蛋白酶在特定位置具有不同于枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸，该数据也可以用于通过鉴定最佳选择取代，包括对BPN′野生型氨基酸的取代来鉴定将改变所希望性质的至少一个取代。
表6-1提供了枯草杆菌蛋白酶BPN′的5,004种变体在275个位置上的性能指数值(Pi)。将小于或等于0.05的性能指数固定为0.05并且在表中以粗斜体指出。而且，对于稳定性测量，如果稳定性测定法中活性的性能指数小于或等于0.05，那么将相关的稳定性性能指数固定为0.05。
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可组合突变：
表6-2列出了枯草杆菌蛋白酶BPN′变体，它们是275个位置的可组合突变(2,907)。这些变体对于至少一种性质具有≥0.5的性能指数值，并且对于两种性质具有＞0.05的性能指数值。
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实施例7
变体蛋白酶数据的比较评估
在该实施例中，比较了为确定BPN’，GG36(GCI-P036)和变体蛋白酶的清洁性能、LAS稳定性、AAPF活性和蛋白质含量(目的性质的测试)而进行的实验的结果。如全文所述，将变体蛋白酶的功能性定量为性能指数(PI)，其是变体与参考蛋白酶的性能的比值。本文使用的PI分类包括：向上突变(PI＞1.0)；中性突变(PI＞0.5)；非有害突变(PI＞0.05)；和有害突变(PI≤0.05)。
生产性位点为对于任一性质具有至少一个向上突变的那些位点。生产性、非限制性位点是对于任一测试的性质(除了蛋白质表达之外)具有≥20％中性突变(PI＞0.5)和至少一种向上突变(PI＞1.0)的那些位点。在下面的表7-1中，变体的满足生产性、非限制性位点定义的结果显示为所测试的变体的百分比(％)，其中所述变体满足向上突变(PI＞1)的定义。
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简言之，如在本发明的研发中测定的，两种参考枯草杆菌蛋白酶的成熟区中的10个位置是活性和稳定性的限制性位置。从而，两个参考枯草杆菌蛋白酶的成熟区中剩余的265个位置对于活性和稳定性是非限制性位置(≥20％中性突变)。
实施例8
枯草芽孢杆菌中的蛋白酶产生
在该实施例中，描述了为在枯草芽孢杆菌中产生多种蛋白酶所进行的实验。具体地，提供了用于GG36和BPN’-Y217L的表达载体转化枯草芽孢杆菌的方法。如本领域公知的进行转化(见例如，WO 02/14490)。
GG36蛋白酶产生
在该实施例中，提供了为了在枯草芽孢杆菌中产生GG36(在本文中也称作迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)所进行的实验。使用GG36密码子改进的基因装配表达质粒pAC-GG36ci，所述基因融合在aprE信号序列的第8个密码子处，处于共有的aprE启动子和BPN’转录终止子控制下。在下面提供的序列中，粗斜体字体指出共有aprE启动子，标准字体指出信号序列，加下划线字体指出前序列，粗体指出编码GG36成熟蛋白酶的DNA，加下划线斜体字体指出BPN’终止子。GG36成熟蛋白酶的编码区侧翼为用于克隆目的的KpnI和XhoI限制酶位点：
下面提供了GG36前体蛋白的氨基酸序列。在该序列中，粗体指出成熟GG36蛋白酶：
MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEE
VEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM
Figure BPA00001263671504891
Figure BPA00001263671504892
成熟GG36蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：562)用作制备本文所述的变体文库的基础：
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNG
HGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVAN
LSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRAS
FSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRN
HLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO：562).
质粒pAC-GG36ci的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110的DNA片段(McKenzie et al.，Plasmid 15：93-103[1986])，pBR322＝来自质粒pBR322的DNA片段(Bolivar et al.，Gene 2：95-113[1977])，pC194＝来自质粒pC194(Horinouchi et al.，J Bacteriol，150：815-825[1982])的DNA片段。质粒特征如下：枯草芽孢杆菌的Ori＝来自pUB110的复制起点，CAT＝来自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1原点＝来自pBR322的复制起点，bla＝来自pBR322的β内酰胺酶，短aprE启动子＝共有转录启动子，信号肽＝信号肽，前肽＝GG36前区，GG36ci成熟肽＝成熟GG36(被该研究中表达的每种变体的编码区替代)，BPN’终止子＝枯草杆菌蛋白酶BPN’的转录终止子。
BPN’-Y217L(PURAFECTPRIME枯草杆菌蛋白酶)蛋白酶生产
在该实施例中，描述了为在枯草芽孢杆菌中产生解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L(作为PURAFECT
Figure BPA00001263671504894
PRIME枯草杆菌蛋白酶商购；也称作“FNA”)所进行的实验。使用BPN’-Y217L基因装配表达质粒pAC-FNAre，该基因融合在aprE信号序列的第8个密码子处，处于共有的aprE启动子和BPN’转录终止子控制下。在下面提供的序列中，粗斜体字体指出共有aprE启动子，标准字体指出信号序列，加下划线的字体指出前序列，粗体字体指出编码BPN’-Y217L成熟蛋白酶的DNA，加下划线的斜体字体指出BPN’终止子。BPN’-Y217L成熟蛋白酶的编码区含有用于克隆目的的KpnI和XhoI限制酶位点：
Figure BPA00001263671504901
下面提供BPN’-Y217L前体蛋白的氨基酸序列。在该序列中，粗体指出成熟BPN’-Y217L蛋白酶：
MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKG
GKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAY
Figure BPA00001263671504902
Figure BPA00001263671504903
成熟BPN’-Y217L蛋白酶的氨基酸序列用作制备本文所述的变体文库的基础：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDN
NSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVI
NMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSS
NQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNT
QVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO：565).
质粒pAC-FNAre的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110(McKenzie et al.，Plasmid 15：93-103，[1986])的DNA片段，pBR322＝来自质粒pBR322(Bolivar et al.，Gene 2：95-113[1977])的DNA片段，pC194＝来自质粒pC194(Horinouchi et al.，J.Bacteriol 150：815-825[1982])的DNA片段。质粒特征如下：枯草芽孢杆菌的Ori＝来自pUB110的复制起点，CAT＝来自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1原点＝来自pBR322的复制起点，bla＝来自pBR322的β内酰胺酶，短aprE启动子＝共有转录启动子，信号肽＝信号肽，前肽＝BPN’-Y217L前区，BPN’-Y217L成熟肽＝成熟BPN’-Y217L(被该研究中表达的每种变体的编码区替代)，BPN’终止子＝枯草杆菌蛋白酶BPN’的转录终止子。
实施例9
酶变体的表达
该实施例描述了用于表达转化的枯草芽孢杆菌的多种重组酶的方法。
枯草杆菌蛋白酶-2ml规模
含有BPN’-Y217L或GG36表达载体的枯草芽孢杆菌克隆用钢制96孔复制器从甘油原种复制到含有LB培养基+25μg/ml氯霉素的96孔培养板(BD，353075)中，在37℃、220rpm湿润的封闭空间内过夜生长。来自过夜培养物的200μl等分试样用于接种5ml塑料培养管中2000μl确定成分培养基+25μg/ml氯霉素。培养基是基于MOPS缓冲液的富集的半确定成分培养基，尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，补充1％大豆胨用于稳健的细胞生长。培养管在37℃，220rpm，培育60小时。该培育后，以大于8000x RCF离心培养液。将上清液倒入15ml聚丙烯锥形管中用于保存。不进行进一步纯化或浓缩。将上清液储液配制到40％丙二醇终浓度用于长期稳定性并在4℃保存。
实施例10
酶变体的产生
该实施例描述了产生酶电荷梯和组合电荷文库。
酶电荷梯
覆盖一系列目的物理性质的多种蛋白酶变体从现有的文库中选择或者通过本领域已知的位点定向诱变技术产生(见例如，美国专利申请序号10/576,331，11/581,102和11/583,334)。然后在目的测试中测试该确定组的探针蛋白质。
示例性蛋白酶电荷梯变体在下面的表中显示并且如本文所述的测定。在这些表中，电荷改变是相对于野生型酶。
Figure BPA00001263671504921
Figure BPA00001263671504922
酶组合电荷文库
产生迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(＝GG36)组合电荷文库
将含有密码子改进的GG36基因的pAC-GG36ci质粒送到DNA 2.0，用于产生组合电荷文库(CCL)。也为它们提供用于转化的枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。此外，要求DNA 2.0公司在GG36蛋白酶的四个位点的每个位点产生位置文库(表10-3中显示)。变体作为96孔板中的甘油原种提供。
通过鉴定活性位点外的四个良好分布的、表面暴露的不带电极性氨基酸残基设计GG36CCL。这些残基为Ser-85，Gln-107，Ser-182，和Asn-242(BPN’编号中的残基87，109，188和248)。通过在每个位点产生三种可能性：野生型、精氨酸或天冬氨酸的所有组合产生81个成员的组合文库(G-1到G-81)。
Figure BPA00001263671504931
Figure BPA00001263671504941
Figure BPA00001263671504951
Figure BPA00001263671504961
产生解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L CCL
将含有BPN’-Y217L基因的pAC-FNAre质粒送到DNA 2.0 Inc.(Menlo Park，CA)用于产生CCL。也为它们提供用于转化的枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE，ΔnprE，ΔspoIIE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。要求DNA 2.0公司在四个BPN’-Y217L蛋白酶位点的每个位点产生位置文库(表10-4中显示)。变体作为96孔板中的甘油原种提供。
通过鉴定活性位点外的四个良好分布的、表面暴露的不带电极性氨基酸残基设计枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L组合电荷文库。这些残基为Ser-87，Asn-109，Ser-188和Ser-248。通过在每个位点产生三种可能性：野生型、精氨酸或天冬氨酸的所有组合产生81个成员的组合文库(F-1到F-81)。
Figure BPA00001263671504971
Figure BPA00001263671504981
Figure BPA00001263671504991
实施例11
变体BPN’-Y217L和GG36枯草杆菌蛋白酶性能
该实施例描述了在洗衣和自动细碟应用中，在代表多种市场地理位置(例如，不同的pH、T和/或水硬度)的洗涤剂中，在BMI微样品和烘焙的蛋测定法中测试BPN’-Y217L和GG36变体，如实施例1所述。
上面的观察结果适用于其他丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L和GG36。例如，图2A和2B显示了在北美洗衣条件下，使用现成的热失活的TIDE
Figure BPA00001263671504992
2X洗涤剂，BPN’-Y217L和GG36分别在清洁性能中的最适电荷。左边的Y轴显示了微样品清洁性能，其中较高的数字表示优良的BMI污物去除。右边的Y轴显示了定义为变体(实心符号)相对于亲本分子(空心符号)的清洁性能的性能指数。水平线表示高于测定法噪音2或3个标准差的性能指数。BPN’-Y217L电荷组合文库(CCL)显示了相对于亲本BPN’-Y217L在0电荷改变时的电荷最适值，而GG36CCL显示了相对于GG36亲本在-2电荷时的最适值。
图3A，3B，4A，4B，5A和5B阐明电荷最适值的位置是溶液环境的函数，溶液环境由洗涤剂制剂、pH、温度和归因于水硬度的离子强度和洗涤剂浓度决定。例如，BPN’-Y217L CCL的电荷最适值从北美洗衣条件下的0显著转移到在西欧和日本条件下更正的电荷。而且，为液体和粒状(粉状)洗衣洗涤剂制剂观察到电荷最适值。类似地，在针对作为酶底物的烘焙蛋的自动细碟(ADW)洗涤剂(例如，Reckitt Benckiser Calgonit 40℃，12gpg，pH 10)中为BPN’-Y217L和GG36CCL均观察到电荷最适值。
如在本发明的研发中阐明的，蛋白酶电荷变体(例如，GG36，BPN’-Y217L，等)在不同洗涤剂中的清洁性能主要由工作溶液pH和电导率决定。最终电导率是离子强度的度量并且归因于水硬度、洗涤剂浓度和组成。例如，当在pH 10.6和3.0mS/cm的电导率下进行时，在欧洲和北美ADW洗涤剂条件下，GG36和BPN’-Y217L变体针对烘焙的蛋污物的清洁性能之间存在相关性。具体地，如果pH和电导率相同，那么电荷变体的清洁性能良好相关。该发现使得可能使用给定洗涤剂筛选酶性能，用于将这些结果外推到匹配pH和电导率的另一种洗涤剂。同样地，可能在匹配pH和电导率的缓冲液中筛选酶性能，用于将那些结果外推到显示出相似的工作pH和电导率的洗涤剂。
Figure BPA00001263671505001
Figure BPA00001263671505011
Figure BPA00001263671505021
Figure BPA00001263671505031
Figure BPA00001263671505032
Figure BPA00001263671505041
Figure BPA00001263671505051
实施例12
LAS和螯合剂稳定性
该实施例描述了在含有阴离子表面活性剂和螯合剂的一种或两者的反应介质中测定蛋白质电荷和稳定性之间的关系。为了测定受胁迫和不受胁迫样品的蛋白酶活性，使用suc-AAPF-pNA测定法。为了测定受胁迫和不受胁迫样品的α淀粉酶活性，使用BODIPY-淀粉测定法。来自胁迫平板的残留LAS和EDTA不影响suc-AAPF-pNA或BODIPY-淀粉测定法。
LAS/EDTA稳定性
使用的试剂包括：对照缓冲液：50mM HEPES，0.005％ Tween-80，pH8.0；和胁迫缓冲液50mM HEPES，0.1％(w/v)LAS(十二烷基苯磺酸，钠盐，Sigma D-2525)，10mM EDTA，pH 8.0。将酶变体(20ppm)以1∶20稀释到含有对照或者胁迫缓冲液的96孔非结合平底板中并混合。对照平板在室温下温育而胁迫平板立即置于37℃下30-60分钟(取决于被测试的酶的稳定性)。温育后，对于蛋白酶使用suc-AAPF-pNA测定法测量酶活性。剩余或残留活性的分数等于胁迫样品的反应速率除以对照样品的反应速率。发现亲本酶和变体在对照缓冲液中稳定60分钟。
图6描述了对于含有80种变体的文库，作为相对于亲本BPN’-Y217L的净电荷改变的函数的LAS/EDTA稳定性。该文库根据实施例2中所述的方法设计和构建，以覆盖相对于亲本BPN’-Y217L分子的一些净电荷。如从图中显而易见的，相对于亲本BPN’-Y217L的负电荷(高达-4)积累对于组合的LAS/螯合剂稳定性是有益的。这是优化蛋白质物理性质(在该情况下为净电荷)以提高蛋白质在复杂液体洗衣环境中的稳定性的实例。
实施例13
BPN’多突变文库(MML)变体的污物去除性能
BPN’多突变文库(或者组合文库)由Geneart或DNA 2.0(如本文前述)使用BPN’作为亲本蛋白产生。也如前面所述的产生BPN’变体蛋白。如实施例1所述通过TCA沉淀测定培养上清液的蛋白质浓度。使用实施例1描述的方法，使用下面的修饰，在洗衣应用中pH 8/16℃，pH 7/16℃和pH 8/32℃下测试变体对EMPA 116样品(BMI污物，CFT)的污物去除性能。使用的测试洗涤剂为热失活的TIDE2X Cold洗涤剂(Procter & Gamble)。商业洗涤剂配方产品的热失活用于破坏任何蛋白质组分的内源酶活性而保留非酶组分的性质。通过将预称重量的液体洗涤剂(玻璃瓶中)置于水浴中95℃下2小时进行洗涤剂的热失活。洗涤剂购自当地超市商店。在溶解洗涤剂的5分钟内测定未加热和加热的洗涤剂，以便准确测定失活百分比。通过AAPF测定法测试酶活性。将BPN’变体的功能性定量为性能指数(Pi)(即变体相对于亲本BPN’的性能比例)。结果在表13-1中显示。对于一种或多种BMI污物去除性能测试和/或TCA沉淀显示出大于或等于0.5的Pi值的BPN’变体显示出提高的清洁益处和/或表达。小于或等于0.05的性能指数被固定为0.05并且在表中以粗斜体标出。对于TCA蛋白质性能指数小于或等于0.05的每种变体，将所有值固定为0.05。在该表中，“ND”表示“未测定”。
Figure BPA00001263671505081
Figure BPA00001263671505091
Figure BPA00001263671505101
Figure BPA00001263671505121
Figure BPA00001263671505131
Figure BPA00001263671505141
实施例14
BPN’两位点变体的污物去除性能
使用BPN’作为亲本蛋白，使用融合PCR在位置217和222(BPN’编号)产生两位点变体。如以前所述产生BPN’变体蛋白。如实施例1所述通过TCA沉淀测定培养上清液的蛋白质浓度。在洗衣应用中，使用实施例1所述的方法在pH 8/16℃下在热失活的TIDE
Figure BPA00001263671505142
2X Cold(Procter & Gamble)中测试变体对EMPA 116样品(BMI污物，CFT)的污物去除性能。将BPN’变体的功能性定量为性能指数(Pi)(即变体相对于BPN’-Y217L的性能比例)。结果在表14-1中显示。对于BMI污物去除性能测试和/或TCA沉淀显示出大于或等于0.5的Pi值的BPN’变体显示出改善的清洁益处和/或表达。
Figure BPA00001263671505151
实施例15
枯草芽孢杆菌中ASP蛋白酶生产
如美国专利申请序列号10/576,331(完整并入本文作为参考)中所述的进行在枯草芽孢杆菌中产生69B4蛋白酶(在本文中也称作“ASP，”“Asp，”和“ASP蛋白酶，”和“Asp蛋白酶”)的实验。简言之，下面提供的具有适应芽孢杆菌物种的密码子选择的DNA序列(合成的ASP DNA序列)编码野生型ASP前体蛋白：
Figure BPA00001263671505152
在上面的序列中，粗斜体标出编码成熟蛋白酶的DNA，标准字体标出前导序列，下划线标出N末端和C末端前序列。来自纤维单胞菌(Cellulomonas)菌株69B4(DSM 983316035)的成熟丝氨酸蛋白酶长为189个氨基酸，催化三联体由His32，Asp56和Ser137组成，如下面所示(催化三联体用粗体加下划线标出)：
FDVIGGNAYT IGGRSRCSIG FAVNGGFITA GCGRTGATT ANPTGTFAGS
SFPGN
Figure BPA00001263671505162
YAFV RTGAGVNLLA QVNNYSGGRV QVAGHTAAPV GSAVCRSGST
TGWHCGTITA LNSSVTYPEG TVRGLIRTTV CAEPGDGGS LLAGNQAQGV
TSGGSGNCRT GGTTFFQPVN PILQAYGLRM ITTDSGSSP(SEQ ID NO：567)
实施例16
产生ASP组合突变体和多突变文库
在该实施例中，描述了用于构建ASP的组合突变体和多突变文库的方法。美国专利申请序列号10/576,331中描述了ASP的组合突变体的构建。多突变文库构建
如Stratagene QCMS试剂盒中概述的构建多突变文库，只是在反应中使用的引物浓度除外。具体地，将1μL甲基化的纯化的pUC18-ASP质粒(约70ng)与15μL无菌蒸馏水、1.5μL dNTP、2.5μL 10x缓冲液、1μL酶混合物和1.0μL突变体引物混合物(总共100pmol引物)混合。使用18种突变体引物的每一种10μL(100pmol/μL)制备引物混合物；如Stratagene推荐的加入文库的每种引物50ng，导致在前面轮的诱变中较少的突变。从而，在该轮诱变中修改了该方案以在每次反应中包括总共100pmol引物。循环条件为95℃ 1分钟，接着是30个循环的95℃ 1分钟，55℃ 1分钟，和65℃ 12分钟，在MJ Research PTC2-200热循环仪中使用薄壁0.2mL PCR管进行。反应产物用1μL来自QCMS试剂盒的DpnI通过在37℃下过夜温育进行消化。加入额外的0.5μL DpnI，并将反应物温育1小时。
随后，将文库DNA(诱变的单链pUC18-ASP产物)电穿孔到感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen
Figure BPA00001263671505164
目录号C4040-52，One Shot
Figure BPA00001263671505165
TOP10ElectrocompTM大肠杆菌dam+)中，并在含有100mg/L氨苄青霉素的琼脂板上选择转化细胞的生长，在大肠杆菌细胞中得到ASP多突变文库。收获菌落(数万)并且Qiagen spin miniprep DNA试剂盒(目录号27106)用于通过生产商概述的步骤制备质粒DNA。将miniprep DNA用试剂盒中提供的Qiagen缓冲液EB稀释。
用PstI和HindIII DNA限制酶消化Miniprep DNA。将ASP文库片段混合物(PstI x HindIII)凝胶纯化并使用Invitrogen
Figure BPA00001263671505171
T4 DNA连接酶(目录号15224-025)，如生产商关于克隆粘性末端所推荐的，通过连接酶反应克隆在4154碱基对HindIII x PstI pHPLT载体片段中。在另一方法中，由GeneArt生产合成的ASP文库片段。将这些ASP文库片段也用PstI和HindIII消化，纯化并通过连接酶反应克隆在4154碱基对HindIII x PstI pHPLT载体片段中。
为了将连接反应混合物直接转化到芽孢杆菌细胞中，使用TempliPhi试剂盒(Amersham目录号25-6400)扩增文库DNA(在pHPLT中克隆的ASP文库片段)。为此目的，将1μL连接反应混合物与5μL来自TempliPhi试剂盒的样品缓冲液混合并在95℃加热3分钟以变性DNA。将反应物置于冰上冷却2分钟，然后快速离心沉降。接着，加入来自TempliPhi试剂盒的5μL反应缓冲液和0.2μL phi29聚合酶，并在MJ Research PCR机器中30℃下温育反应物4小时。通过在PCR机器中65℃温育10分钟将反应物中的phi29酶热失活。
为了将文库转化到芽孢杆菌中，将0.1μL TempliPhi扩增反应产物与500μL感受态枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE，ΔnprE，oppA，ΔspoIIE，degUHy32，ΔamyE::(xylR，pxylA-comK)混合，接着在37℃剧烈摇动1小时并将100和500μL接种于含有20ppm硫酸新霉素(Sigma，目录号N-1876；每mg含有732μg新霉素)和0.5％脱脂乳的HI-琼脂板上。从文库挑选95个克隆用于测序。
诱变良好地进行，因为仅仅14％的克隆等于骨架(亲本)序列(具有R014I-A064K-T086K-T116E-R123F的ASP)，并且约3％的克隆具有额外的突变。剩余的测序克隆(72％)都是突变体并且其中约94％的为独特突变体。文库的测序结果在下面的表16-1中提供。
Figure BPA00001263671505181
Figure BPA00001263671505191
Figure BPA00001263671505201
实施例17
多种性质的有害突变的相关性
在该实施例中，示例了如下原理，即不管性质的相关性如何，任一性质的有害突变与每个其他性质的有害突变相关。如本文指出，仅仅少数位置(5-10％)具有对所有性质有害的突变。这些位置确定了蛋白质折叠并且在进化中是保守的。其含意是尽管鉴定任一性质的有益突变需要该性质的真实预测性筛选，但是使用任一筛选，包括但不限于本文提供的方法，可以完成可能对任一性质有害的突变的鉴定。
变体酶如本文所述的产生并且在美国专利申请序号10/576,331，10/581,014，11/581,102和11/583,334内，将它们都完整并入本文作为参考。下表提供了对于两种性质的每一种具有大于5％野生型活性和小于5％活性的变体数目的逐对比较以及所述两种性质的相关系数。用于该实施例的测定系统在上面引用的申请中提供。本文使用的性质对于ASP为酪蛋白活性(CAS)、角蛋白活性(KER)、AAPF活性(AAPF)、LAS稳定性(LAS)和热稳定性；对于ACT为过酸形成(PAF)和过酸降解(PAD)。
角蛋白水解测定法
在该测定系统中，使用的化学品和试剂溶液为：
角蛋白    ICN 902111
洗涤剂    将1.6g洗涤剂溶解于1000ml水中(pH＝8.2)
也加入0.6ml.CaCl2/MgCl2 10,000gpg以及1190mg HEPES，得到硬度和缓冲液强度分别为6gpg和5mM。用NaOH调节pH到8.2。
苦基磺酸(TNBS)
Sigma P-2297(5％水溶液)
试剂A 45.4g Na2B4O7.10H2O(Merck 6308)和15ml 4N NaOH一起溶解，终体积1000ml(如果需要，通过加热)
试剂B 35.2g NaH2PO4.1H2O(Merck 6346)和0.6g Na2SO3(Merck 6657)一起溶解至终体积1000ml。
方法：
温育前，将角蛋白在100μm筛上每次以小部分过滤。然后，在室温下在洗涤剂溶液中搅拌10g＜100μm的角蛋白，定期调节pH到8.2。最后，将悬浮液在室温下离心20分钟(Sorvall，GSA转子，13,000rpm)。然后重复该步骤。最后，将湿润沉淀物悬浮在洗涤剂中至终体积200ml，并在移液期间保持搅拌悬浮液。温育前，用Biohit多通道移液器和1200μl尖头将MTP每孔填充200μl底物(6次分配200μl并且尽快分配以避免角蛋白在尖头中的沉降)。然后，向含有底物的MTP加入10μl经过滤的培养物。用胶带封住平板，置于培养箱中并在20℃以350rpm(New Brunswick Innova 4330)培养3小时。培养后，将平板以3000rpm(Sigma 6K 15离心机)离心3分钟。从培养箱去除第一个平板前约15分钟，通过每50ml试剂A混合1ml TNBS溶液制备TNBS试剂。
将MTPs装入每孔60μl TNBS试剂A。从经培养的平板向具有TNBS试剂A的MTP转移10μl。将平板用胶带封闭并在台式摇动器(BMG Thermostar)上室温下和500rpm摇动20分钟。最后，向孔中加入200μl试剂B，在摇动器上混合1分钟，用MTP读出器测量405nm下的吸光度。
计算角蛋白水解活性
为空白值(没有酶的底物)校正所得的吸光度值。所得的吸光度提供了水解活性的度量。为每个样品(变体)计算性能指数。性能指数比较在相同蛋白质浓度下变体(实际值)和标准酶(理论值)的性能。此外，使用标准酶的朗缪尔方程的参数可以计算理论值。大于1的性能指数(PI)(PI＞1)鉴定了与标准品(即野生型)相比更好的变体，而为1的PI(PI＝1)鉴定了与标准品相同性能的变体，小于1的PI(PI＜1)鉴定了性能比标准品更差的变体。从而，PI鉴定了在某些情况下胜利者的以及较不适合使用的变体。
二甲基酪蛋白水解测定法(96孔)
在该测定系统中，使用的化学品和试剂溶液为：
二甲基酪蛋白(DMC)：Sigma C-9801
TWEEN
Figure BPA00001263671505221
-80：Sigma P-8074
PIPES缓冲液(游离酸)：Sigma P-1851；15.1g溶于约960ml水中；用4N NaOH调节pH到7.0，加入1ml 5％TWEEN
Figure BPA00001263671505222
-80并将体积加到1000ml。PIPES和TWEEN
Figure BPA00001263671505223
-80的终浓度分别为50mM和0.005％。
苦基磺酸(TNBS)：Sigma P-2297(5％水溶液)
试剂A 45.4g Na2B4O7.10H2O(Merck 6308)和15ml 4N NaOH一起溶解至终体积1000ml(如果需要，通过加热)
试剂B 35.2g NaH2PO4.1H2O(Merck 6346)和0.6g Na2SO3(Merck 6657)一起溶解至终体积1000ml。
方法：
为了制备底物，将4g DMC溶解在400ml PIPES缓冲液中。用PIPES缓冲液稀释过滤的培养物上清液；生长板中对照的终浓度为20ppm。然后，向MTP的孔中200μl底物加入10μl每种稀释的上清液。用胶带封住MTP板，摇动几秒，并置于烘箱中无搅拌下37℃ 2小时。
从烘箱去除第一个平板前约15分钟，通过每50ml试剂A混合1mlTNBS溶液制备TNBS试剂。向MTPs装入每孔60μl TNBS试剂A。经温育的平板摇动几秒，然后向具有TNBS试剂A的MTP转移10μl。将平板用胶带覆盖并在台式摇动器(BMG Thermostar)中室温下和500rpm摇动20分钟。最后，向孔中加入200μl试剂B，在摇动器上混合1分钟，用MTP读出器测量405nm下的吸光度。
计算二甲基酪蛋白水解活性：
为空白值(没有酶的底物)校正所得的吸光度值。所得的吸光度是水解活性的度量。通过将吸光度除以测定的蛋白质浓度来计算样品的(任意)比活性。
热稳定性测定法
该测定法是基于加热缓冲的培养物上清液前后二甲基酪蛋白(DMC)水解。使用与DMC水解测定法所述相同的化学品和试剂溶液。
方法：
将过滤的培养物上清液在PIPES缓冲液中稀释到20ppm(基于生长板中对照的浓度)。然后，将50μl每种稀释的上清液置于MTP的空孔中。MTP板在iEMS培养箱/摇床HT(Thermo Labsystems)中60℃和400rpm下温育90分钟。该平板在冰上冷却5分钟。然后，向含有200μl DMC底物/孔的新的MTP加入10μl溶液。该MTP用胶带覆盖，摇动几秒并置于烘箱中没有搅拌下37℃ 2小时。使用与DMC水解测定法相同的检测方法。
热稳定性计算：
样品的残留活性表示为最终吸光度和最初吸光度(都进行空白校正)的比值。
如下面的表中指出，对于ASP，发现相关(相关系数＞0.5)的唯一性质是CAS、KER和AAPF。所有其他的是不相关的(相关系数＜0.3)。尽管这些性质不相关，但是突变将对于两种性质有害的概率比由于偶然性所期望的概率大得多。表17-1提供了变体的观察数目的计算比率，和所期望的基于偶然性的变体数目。大于1的数字表示正相关性，小于1的数字表示负相关性。
Figure BPA00001263671505241
Figure BPA00001263671505242
 一个＞5％   574   20％   1435   50％   0.40
 两个都＜＝5％   884   31％   454   16％   1.95
 至少一个＞5％   1967   69％   2397   84％   0.82
Figure BPA00001263671505251
Figure BPA00001263671505252
 两个都＞5％   2187   77％   2069   73％   1.06
 一个＞5％   488   17％   639   22％   0.76
 两个都＜＝5％   402   14％   143   5％   2.82
 至少一个＞5％   2675   94％   2708   95％   0.99

Claims (34)

1.芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是成熟形式，具有蛋白水解活性并且包含在一个或多个位置上的取代，所述位置选自：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273和274，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述一个或多个位置选自：1，2，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，122，124，125，126，127，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273和274，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
3.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述一个或多个位置选自：2，3，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21，22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54，55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91，92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112，113，114，115，116，122，124，125，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，249，250，251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，和274，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
4.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体还包含在选自：18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一个或多个位置上的取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
5.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含如下的一个或多个：A001C，A001D，A001E，A001F，A001G，A001H，A001I，A001K，A001L，A001M，A001N，A001Q，A001R，A001S，A001V，A001W，Q002A，Q002D，Q002E，Q002G，Q002S，S003A，S003D，S003F，S003G，S003I，S003K，S003L，S003M，S003N，S003P，S003Q，S003R，S003T，S003V，S003W，S003Y，P005C，P005E，P005G，P005N，P005Q，P005T，Y006A，Y006C，Y006E，Y006F，Y006G，Y006K，Y006M，Y006N，Y006P，Y006Q，Y006R，Y006T，Y006V，Y006W，S009A，S009C，S009E，S009F，S009G，S009H，S009K，S009L，S009M，S009P，S009Q，S009R，S009T，S009V，S009W，Q010A，Q010C，Q010E，Q010F，Q010G，Q010H，Q010I，Q010K，Q010L，Q010M，Q010R，Q010S，Q010T，Q010V，Q010W，I011C，I011L，I011T，I011V，I011Y，K012A，K012C，K012D，K012E，K012F，K012G，K012H，K012I，K012N，K012Q，K012S，K012T，K012V，K012W，K012Y，A013C，A013F，A013G，A013H，A013L，A013R，A013S，A013T，A013V，P014A，P014C，P014D，P014E，P014F，P014G，P014I，P014K，P014L，P014M，P014N，P014Q，P014R，P014S，P014T，P014V，P014W，P014Y，A015C，A015D，A015E，A015F，A015G，A015H，A015I，A015K，A015L，A015M，A015P，A015Q，A015R，A015T，A015V，A015Y，L016A，L016C，L016I，L016M，L016Q，L016S，L016T，H017F，H017I，H017L，H017M，H017V，H017W，H017Y，S018A，S018E，S018F，S018G，S018H，S018I，S018K，S018L，S018M，S018N，S018P，S018Q，S018R，S018T，S018V，S018W，S018Y，Q019A，Q019C，Q019D，Q019E，Q019G，Q019I，Q019K，Q019M，Q019R，Q019T，Q019V，G020A，G020C，G020D，G020E，G020F，G020H，G020K，G020M，G020N，G020P，G020Q，G020R，G020S，G020W，Y021A，Y021C，Y021D，Y021E，Y021F，Y021G，Y021H，Y021K，Y021M，Y021R，Y021S，Y021T，Y021V，Y021W，T022A，T022C，T022E，T022F，T022G，T022H，T022I，T022K，T022L，T022M，T022N，T022Q，T022S，T022V，T022W，T022Y，S024C，S024F，S024G，S024H，S024I，S024K ，S024L，S024M，S024N，S024Q，S024R，S024T，S024W，S024Y，N025C，N025E，N025F，N025G，N025H，N025I，N025K，N025L，N025M，N025P，N025R，N025S，N025T，N025V，N025W，K027A，K027D，K027E，K027F，K027G，K027H，K027L，K027M，K027P，K027R，K027S，K027W，K027Y，D032A，D032C，D032E，D032G，D032I，D032K，D032L，D032M，D032N，D032R，D032S，D032T，D032V，D032Y，S033A，S033F，S033G，S033H，S033P，S033T，S033W，I035A，I035C，I035D，I035R，I035S，I035T，I035V，D036A，D036C，D036E，D036Q，D036S，D036W，S037A，S037C，S037E，S037F，S037G ，S037H，S037K，S037L，S037M，S037P，S037Q，S037R，S037T，S037W，H039C，H039Q，H039T，H039V，P040A，P040C，P040E，P040F，P040G，P040G，P040H，P040I，P040K，P040L ，P040M，P040N，P040Q，P040R，P040S，P040T，P040V，P040W，D041E，L042I，L042M，L042V，K043A，K043C，K043D，K043E，K043F，K043G，K043I，K043L，K043M，K043N，K043R，K043S，K043T，K043V，K043W，K043Y，V044A，V044C，V044I，V044L，V044M，V044P，V044S，V044T，A045C，A045E，A045F，A045H，A045I，A045K，A045L，A045M，A045N，A045P，A045Q，A045S，A045T，A045V，A045Y，G046A，G046C，G046E，G046H，G046K，G046M，G046N，G046Q，G046T，G046W，G046Y，A048C，A048D，A048E，A048F，A048H，A048I，A048K，A048L，A048M，A048Q，A048R，A048S，A048T，A048V，A048W，A048Y，M050A，M050C，M050F，M050H，M050I，M050K，M050L，M050Q，M050R，M050S，M050T，M050V，M050W，M050Y，V051A，V051C，V051D，V051E，V051H，V051I ，V051L，V051P，V051Q，P052C，P052D，P052E，P052F，P052H，P052I，P052K，P052L，P052Q，P052R，P052S，P052T，P052V，P052W，P052Y，S053E，S053F，S053G，S053H，S053I，S053K，S053L，S053M，S053N，S053Q，S053R，S053T，S053V，S053W，E054A，E054N，E054Q，E054S，T055A，T055C，T055D，T055F，T055G，T055H，T055I，T055K，T055M，T055P，T055Q，T055R，T055S，T055V，T055W，T055Y，N056D，N056M，N056P，N056Q，N056S，N056T，N056V，P057N，P057Q，P057T，P057V，P057W，F058C，F058E，F058G，F058H，F058L，F058M，F058N，F058Q，F058S，F058V，F058Y，Q059A，Q059C，Q059D，Q059E，Q059F，Q059G，Q059H，Q059K，Q059L，Q059M，Q059N，Q059P，Q059R，Q059S，Q059T，Q059V，Q059W，Q059Y，D060E，D060G，H064C，H064D，H064F，H064I，H064L，H064M，H064Q，H064R，H064S，H064T，H064V，H064Y，T066S，T066W，T066Y，H067A，H067C，H067F，H067I，H067L，H067M，H067N，H067P，H067R，H067S，H067T，T071I，T071Y，N077S，S078A，S078C，S078D，S078F，S078G，S078I，S078K，S078L，S078M，S078N，S078P，S078Q，S078R，S078T，S078V，S078W，S078Y，I079A，I079C，I079E，I079F，I079G，I079H，I079K，I079L，I079N，I079Q，I079R，I079S，I079T，I079V，I079W，I079Y，V081F，V081I，V081L，V081M，V081T，G083F，G083P，Q084A，Q084C，Q084H，Q084I，Q084N，Q084T，A085C，A085F，A085G，A085R，A085S，P086A，P086D，P086E，P086G，P086M，P086N，P086Q，P086R，P086S，P086T，P086W，P086Y，S089C，S089D，S089E，S089F，S089G，S089H，S089K，S089L，S089V，S089W，S089Y，L090A，L090D，L090E，L090G，L090H，L090M，L090Q，L090T，L090V，Y091A，Y091C，Y091D，Y091E，Y091F，Y091H，Y091I，Y091L，Y091M，Y091Q，Y091S，Y091T，Y091V，L096F，L096H，L096I，L096K，L096M，L096T，L096V，G097A，G097C，G097D，G097E，G097H，G097K，G097L，G097M，G097P，G097Q，G097R，G097S，G097T，G097V，A098C，A098D，A098F，A098G，A098H，A098I，A098L，A098P，A098Q，A098R，A098S，A098T，A098V，A098Y，D099C，D099E，D099I，D099K，D099L，D099N，D099P，D099Q，D099R，D099S，D099T，S101A，S101C，S101E，S101F，S101G，S101I，S101K，S101L，S101M，S101N，S101P，S101Q，S101R，S101T，S101V，S101Y，G102A，G102C，G102E，G102F，G102I，G102N，G102S，G102V，G102Y，Q103A，Q103C，Q103E，Q103F，Q103G，Q103I，Q103K，Q103L，Q103M，Q103N，Q103R，Q103S，Q103T，Q103V，Q103W，S105A，S105C，S105D，S105E，S105F，S105G，S105I，S105K，S105L，S105M，S105N，S105P，S105R，S105V，S105W，W106A，W106C，W106E，W106F，W106G，W106H，W106I，W106L，W106M，W106N，W106R，W106S，W106T，W106V，W106Y，N109A，N109C，N109E，N109F，N109G，N109H，N109L，N109M，N109P，N109Q，N109R，N109S，N109T，N109V，N109W，N109Y，I111C，I111F，I111L，I111M，I111N，I111P，I111T，I111V，I111W，E112A，E112C，E112D，E112F，E112G，E112I，E112L，E112M，E112N，E112Q，E112R，E112S，E112T，E112V，E112W，E112Y，W113D，W113E，W113F，W113N，W113P，W113Q，W113S，W113V，W113Y，I115E，I115H，I115N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6.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含选自：Y021H-Y217E，Y021H-Y217Q，S101E-Y217L，Y021H-Y217L，K213I-Y217Q，A045I-Y217Q，M119F-Y217Q，A045V-Y217L，Y021H-Y217L，K213I-Y217E，A092G-A114G，Y021W-S101E，V26Q-K213I，和Y021H-S101N的取代组合，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
7.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含选自：S101N-K213I，S101N-M119H，K213L，M119N-K213N，K213N，K213I-Y217E，M119N-K213I，K213N-Y217Q，M119H-K213N，S101P-K213N，M119H-Y217Q，K213I-Y217Q，M119F-K213L，Y217Q，M119F-Y217Q，A048E-K213L，A048H-K213L，K213N，V026N-K213L，V026N-K213L，V026Y-K213N，A048D-K213N，A048H-K213N，A048H-K213L，K213L，K213N，V147D-K213L，K213I，A048E-K213L，A048D-K213N，K213I，A048H-K213N，V147D-K213N，Y021H-Y217L，Y021H-Y217Q，A045V-Y217L，S101E-Y217L，Y021H-Y217E，A045I-Y217Q，Y021H-Y217L，Y021H-Y217E的组合，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
8.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述取代包含选自：S101N-M119H，Y217L，M119N-K213N，S101E-Y217L，A045I-Y217Q的组合，其中所述位置对应于SEQ ID NO：2给出的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
9.编码权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体的分离的核酸。
10.包含权利要求9的核酸的表达载体。
11.包含权利要求10的表达载体的宿主细胞。
12.包含权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。
13.其中所述清洁组合物是洗衣洗涤剂。
14.其中所述洗衣洗涤剂是冷水洗涤剂、低pH洗涤剂，或者浓缩洗涤剂。
15.产生芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括步骤：
a)用包含编码权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和
b)在适于产生枯草杆菌蛋白酶变体的条件下培养转化的宿主细胞，以产生枯草杆菌蛋白酶变体。
16.权利要求15的方法，还包括收获所产生的枯草杆菌蛋白酶变体的步骤。
17.权利要求15的方法，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属物种。
18.权利要求17的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是枯草芽孢杆菌。
19.清洁方法，包括将表面和/或包含织物的物品与包含权利要求1-8任一项的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。
20.蛋白酶工程化方法，包括：
a)提供多个位点评估文库(SEL)，每个文库包含在所述蛋白酶的相同氨基酸位置具有不同取代的多个蛋白酶变体；
b)在目的性质测试中测试所述SEL的所述蛋白酶变体和标准蛋白酶；
c)为所述测试确定所述蛋白酶变体的每一种的性能指数(PI)；
d)鉴定两个或更多所述氨基酸位置为非限制性位置，其中两个所述SEL的每一个中所述多个蛋白酶变体的至少一个具有大于0.5的PI；和
f)提供多突变文库，其包含多个多取代的蛋白酶变体，每个变体在所述两个或更多非限制性位置中包含取代。
21.权利要求20的方法，其中所述测试包括选自污物去除测定法(微样品)、LAS稳定性、EDTA稳定性、洗涤剂稳定性测定法和比活性测定法的两种或多种不同的测定法。
22.权利要求20和21任一项的方法，其中所述蛋白酶是细菌枯草杆菌蛋白酶。
23.产生芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的多取代的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，包括：
a)在第一种性质的第一种测试和第二种性质的第二种测试中测试多个单取代的枯草杆菌蛋白酶变体，其中在每个测试中给予亲本枯草杆菌蛋白酶的性质1.0的值，有利的第一种或第二种性质具有大于1.0的值，并且过度不利的第一种或第二种性质具有小于约0.80或在一些优选实施方案中小于约0.60的值；
b)鉴定至少一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第一种性质相关并且不与过度不利的第二种性质相关的取代；
c)鉴定至少一种单取代的枯草杆菌蛋白酶变体中与有利的第二种性质相关并且不与过度不利的第一种性质相关的取代；
d)将来自前面步骤的取代引入枯草杆菌蛋白酶以产生多取代的枯草杆菌蛋白酶变体。
24.权利要求23的方法，还包括在第一种测试和第二种测试中测试所述多取代的枯草杆菌蛋白酶变体，其中改进的枯草杆菌蛋白酶变体在所述第一种和第二种测试中实现大于1.0的值，或者在第一种测试中大于1.0的值并且在第二种测试中0.80到1.0的值。
25.权利要求24的方法，还包括产生所述改进的枯草杆菌蛋白酶变体。
26.权利要求25的方法，其中所述第一种和第二种性质负相关。
27.权利要求26的方法，其中有利的第一种或第二种性质具有大于约1.2的值。
28.权利要求24的方法，其中过度不利的第一种或第二种性质具有小于约0.40的值。
29.权利要求24的方法，其中所述第一种性质是稳定性，并且第二种性质是洗涤性能。
30.权利要求29的方法，其中所述稳定性包括在洗涤剂中的稳定性并且所述洗涤性能包括在洗涤剂中的血奶墨(BMI)洗涤性能。
31.权利要求24的方法，其中在具有5到12.0的pH的粉末或液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。
32.权利要求24的方法，其中所述亲本细菌枯草杆菌蛋白酶是具有如SEQ ID NO：2给出氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。
33.权利要求24的方法，其中所述位置在亲本枯草杆菌蛋白酶中具有大于约50％的溶剂可及表面(SAS)。
34.权利要求33的方法，其中所述亲本枯草杆菌蛋白酶中所述一个或多个位置是具有大于约65％的溶剂可及表面(SAS)的位置。
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