MX2010013121A - Composiciones y metodos que comprenden proteasas microbianas variantes. - Google Patents
Composiciones y metodos que comprenden proteasas microbianas variantes.Info
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Abstract
La presente invención proporciona métodos para preparar por ingeniería la proteína. Específicamente, la invención proporciona métodos que utilizan bibliotecas de evaluación del sitio para diseñar bibliotecas que optimizan dos o más propiedades de una proteína. La presente invención también proporciona variantes de subtilisina adecuadas para varios usos.
Description
OSICIONES Y METODOS QUE COMPRENDEN PROTEASAS MIC
VARIANTES
Campo de la Invención
La presente invención proporciona métodos para ingeniería proteínas y proteasas va cíficamente, la invención proporciona méto izan colecciones de evaluación del sitio. La ción también proporciona variantes de sub adas para varios usos .
Antecedentes de la Invención
Las serina proteasas son un subgrupo de olasas que comprende una clase diversa de enz en un intervalo amplio de especificidades y f ógicas. Mucha de la investigación se ha conducid
ada sobre aquellos actualmente conocidos en la t Se conocen varios métodos para preparar por in roteína por aquellos en la técnica. En gene ínas se modifican con objeto de obtener propie ína deseadas. En la mayoría de los métodos, la s cleótido de un gen clonado que codifica una pro -y el gen modificado se expresa para producir m e seleccionan para actividades de interés. A men edades mutantes se comparan con las propied ína de tipo natural.
Históricamente, el proceso de diseño de proteí iesto como equivalente al problema de encontrar spacio de la proteína la mejor secuencia ación deseada. Este problema es extremadamente d duro NP" . En teoría de complejidad, los problema en como que están en la clase P, se co
diversifica aleatoriamente a través de la s eta* o en forma aleatoria controlada en po idas dentro de la proteína. Estas col aímente tienen un número grande de miembros tivos" con respecto a la propiedad primaria de quieren que grandes números se separen por exclu o de encontrar números relativamente pequ iones positivas. Generalmente, las mutaciones n gnoran, y la información de secuencia sólo se los miembros positivos.
La mutagénesis de saturación (Estell et al., ch Report 1984, vol . 2: EUA, Publicaciones e es
[1984], páginas 181-187; y Wells et al., Gene
[1985] ) es una técnica que puede usarse para b ÍO de proteína para mutaciones que optimizan iedades en una proteína. Diversos grupos han desa
aímente separación por exclusión de un gran n ntes para producir una propiedad de proteina aímente, la separación por exclusión se repit vez para producir una variante benéfica. De esta ayoría de los métodos son laboriosos y consumen e una necesidad continua en la técnica para mé rar por ingeniería proteína que sean efici zean los resultados deseados .
Breve Descripción de la Invención
La presente invención proporciona métodos para ingeniería la proteína. Específicamente, la i rciona métodos que utilizan colecciones de ev sitio. En particular, la presente invención pro s para usar la información obtenida alrededo o de propiedades deseadas, con objeto de
s para determinar cuáles mutaciones son desea o de producir proteínas con estas propiedades d como propiedades mejoradas. En algunas mod icularmente preferidas adicionales, la presente i rciona medios para identificar posiciones y mu tninoácido que tienen mejoras de un porcentaje pa que la proteína de tipo natural (por ejemplo, m del tipo natural para una propiedad) . En mod ía preferidas adicionales, la presente i rciona medios para identificar mutacion rcionan al menos una propiedad muy mejorada y ropiedad adicional que no es significativamente roteína de tipo natural (por ejemplo, mejor que natural para una propiedad, aún no peor que 90% ral para otra propiedad) . En modalidades aún pr ionales, las colecciones se construyen con base
rcionar una biblioteca de variantes de proteína iblioteca de variantes de proteína para al m edad de interés en una prueba de interés; identi valo de valores para al menos una propiedad de ificar un mínimo dentro del intervalo de valore ia con un resultado favorable en la prueba de in rcionar una pluralidad de variantes de prote al menos una mutación arriba del mínimo en el i 1 menos una propiedad de interés, por ello se pro biblioteca de variantes de proteína que comp s una mutación, y en donde la biblioteca se enri ros que tienen un resultado favorable en la p rés. En algunas modalidades, el resultado f sponde a un valor de mayor que alrededor edor de 60%, alrededor de 70%, alrededor dedor de 90%, o alrededor de 95% de un valo
rar por ingeniería la proteína que comprenden la proporcionar una biblioteca de variantes de p r la biblioteca de variantes de proteína para propiedades de interés en una prueba de ificar un intervalo de valores para al me edades de interés; identificar un mínimo de valo de valores que se asocia con un resultado f a prueba de interés; y proporcionar una plura antes de proteína arriba del mínimo del interva s dos propiedades de interés, por ello se proporc ioteca de variantes de proteína enriquecida en tienen el resultado favorable en la prueba de int as modalidades preferidas, el resultado f esponde a un valor de mayor que alrededor dedor de 60%, alrededor de 70%, alrededor dedor de 90%, o alrededor de 95% de un valo
ariantes de proteína de la proteína de tipo r la biblioteca de variantes de proteína y la ipo natural para al menos una propiedad de interé a de interés; identificar un intervalo de valo enos una propiedad de interés; identificar u o del intervalo de valores que se asocia itado favorable en la prueba de interés; identif antes de proteína que tienen un resultado favo ración con los resultados obtenidos para ral, en donde el resultado favorable es una prop rés mejorada; y proporcionar una pluralidad de roteína arriba del mínimo del intervalo de al m iedad de interés, por ello se proporciona una bi ariantes de proteína mejoradas enriquecidas en tienen el resultado favorable en la prueba de int as modalidades preferidas, los métodos comprende
onales, la proteína es una enzima. En idades particularmente preferidas, la enz ciona de proteasas, transferasas , metalopr asas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutin as . En algunas modalidades alternativas, la pro ciona de anticuerpos y factores de crecimiento, odalidades adicionales preferidas, la proteína ral es una forma madura de una enzima selecci easas, transferasas , metaloproteasas, es sas, celulasas, oxidasas, cutinasas, y lipa as modalidades preferidas, la propiedad de in cciona de carga, desempeño de lavado, desem ieza en superficie dura, solubilidad, est ica, estabilidad al almacenamiento, estabil rgente, enlace de sustrato, inhibición de enzim expresión, velocidad de reacción, y degrada
ntes múltiples de una proteína de prueba de ue de proteína que complementan un intervalo edad de interés en un ensayo de interés; identi o dentro del intervalo de la propiedad de interé a con un resultado favorable en el ensayo de ar una proteína precursora del pliegue de la pro sayo de interés; y producir una variante mejora ína precursora al introducir una sustitu ácido en la proteína precursora de tal manera nte mejorada está arriba del mínimo del interva edad de interés. En algunas modalidades prefer ína precursora y la proteína de prueba son dif lgunas modalidades, los métodos comprenden a de determinar el índice de desempeño, en e de desempeño se determina al dividir el valor la variante de proteína mejorada y el valor
a de una enzima seleccionada de proteasas, trans loproteasas, esterasas, amilasas, celulasas, o asas, y lipasas. En algunas modalidades prefer iedad de interés se selecciona de carga, dese o, desempeño de limpieza en superficie dura, est ea, solubilidad, estabilidad al almacen ilidad al detergente, ^enlace de sustrato, inhib a, nivel de expresión, velocidad de reac dación al sustrato. En algunas modalidad ínas de prueba y precursoras son componentes de composición detergente. En alguna modalidad alte ariante de proteína mejorada es un componente sición detergente. En algunas modalidades prefer peño de lavado se prueba en una composición de ilada en un detergente en polvo o líquido que t e entre alrededor de 5 y alrededor de 12.0.
77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 104, 1
109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 1
123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 1
135, 136, 137, 139, 141, 143, 144, 145, 146, 1
150, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 159, 160, 1
165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 1
178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 1
190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 2
204, 206, 207, 209, 210, 212, 213, 214, 215, 2
219, 220, 222, 223, 224, 225, 228, 229, 230, 2
234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 2
246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 2
258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 2
271, 272, 273 y 274, en donde las posiciones se correspondencia con la secuencia de aminoá
118, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 1
134, 135, 136, 137, 139, 141, 143, 144, 145, 1
149, 150, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 159, 1
164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 1
177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 1
189, 190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 1
203, 204, 206, 207, 212, 213, 214, 215, 216, 2
220, 222, 223, 224, 225, 228, 229, 230, 231, 2
235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 2
247, 248, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 256, 2
260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 2
273 Y 274, y en donde las posiciones se nu spondencia con la secuencia de aminoácido de sub de B. amyloliquefaciens establecida como SEQ ID as modalidades adicionales, una o más posici ccionadas de: 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
186, 187, 189, 190, 191, 192 , 194, 195,
200, 201, 203, 204, 206, 207 , 212, 214,
220, 222, 223, 224, 225, 228 , 229, 230,
235, 236, 237, 238, 239, 240 , 241, 242,
247, 249, 250, 251, 253, 254 , 255, 257,
262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270,
y en donde las posicione;s se numeran en
la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN oliquefaciens establecida como SEQ ID NO : 2. En lidades, la variante de subtilisina comprende ad itución en una o más posiciones seleccionada de
117, 119, 127, 144, 185, 209 y 213, y en d ciones se numeran en correspondencia con la secu ácido de subtilisina BPN' de . amyloliqu lecida como SEQ ID NO: 2. En algunas mod eridas, la sustitución comprende una o más
, Q010A, QO10C, Q010E, Q010F, Q010G, Q010H, , QOIOL, QO 10M, Q010R, Q010S, Q010T, Q010V, , 1011L, 10 11T, 1011V, 1011Y, 012A, K012C,
·*
, K012F, KO 12G, K012H, K012I, K012N, K012Q, , K012V, KO 12W, K012Y, A013C, A013F, A013G, , A013R, AO 13S, A013T, A013V, P014A, P014C, , P014F, PO 14G, P014I, P014K, P014L, P014M, , P014R, PO 14S, P014T, P014V, P014W, P014Y, , A015E, AO 15F, A015G, A015H, A015I, A015K, , A015P, AO 15Q, A015R, A015T, A015V, A015Y, C, L016I, LO 16M, L016Q, L016S, L016T, H017F, L, H017M, HO 17V, H017W, H017Y, S018A, S018E, G, S018H, SO 181, S018K, S018L, S018M, S018N, Q, S018R, SO 18T, S018V, S018W, S018Y, Q019A, D, Q019E, QO 19G, Q019I, Q019K, Q019M, Q019R, V, G020A, GO 20C, G020D, G020E, G020F, G020H,
, K027M, K027P, K027R, K027S, K027W, K027Y, , S033G, S033H, S033P, S033T, S033W, I035A, , I035R, I035S, I035T, I035V, D036A, D036C, , D036S, D036W, S037A, S037C, S037E, S037F, , S037K, S037L, S037M, S037P# S037Q, S037R, , H039C, H039Q, H039T, H039V, P040A, P040C, , P040G, P040G, P040H, P040I, P040K, P040L, , P040Q, P040R, P040S, P040T, P040V, P040W, , L042M, L042V, K043A, K043C, K043D, K043E, , K043I, K043L, K043 , K043N, K043R, K043S,
K043W, K043Y, V044A, V044C, V044I, V044L, , V044S, V044T, A045C, A045E, A045F, A045H,
A045L, A045M, A045N, A045P, A045Q, A045S,
A045Y, G046A, G046C, G046E, G046H, G046K, , G046Q, G046T, G046W, G046Y, A048C, A048D, , A048H, A048I, A048K, A048L, A048M, A048Q,
T055S T055V, T055W, T055Y, N056D N056M,
N056S N056T N056V, P057N P057Q P057T,
F058C F058E F058G, F058H F058L F058M,
F058S F058V F058Y, Q059A Q059C Q059D,
Q059G Q059H Q059K, Q059L Q059M Q059N,
Q059S Q059T Q059V, Q059W Q059Y D060E,
N062C N062D N062E, N062F N062G N062H,
N062L N062M N062Q, N062R N062S N062T,
N062Y T066S T066W, T066Y H067A H067C,
H067L H067M H067N, H067P H067R H067S,
T071Y N077S S078A, S078C S078D S078F,
S078K S078L S078M, S078N S078P S078Q,
S078V S078W S078Y, 1079A 1079C 1079E,
1079H 1079K 1079L, 1079N 1079Q 1079R,
1079V 1079W 1079Y, V081F V081I V081L,
G083F G083P Q084A, Q084C Q084H Q084I,
A098D, A098F, A098G, A098H, A098I A098L,
A098R A098S A098T A098V A098Y D099C,
D099K D099L D099N D099P D099Q D099R,
S101A S101C S101E S101F S101G S101I,
S101M S101N S101P S101Q S101R S101T,
G102A G102C G102E G102F G1021 G102N,
G102Y Q103A Q103C Q103E Q103F Q103G,
Q103L Q103M Q103N Q103R Q103S Q103T,
S105A S105C S105D S105E S105F S105G,
S105L S105M S105N S105P S105R S105V,
W106C W106E W106F W106G W106H W1061,
W106N W106R W106S W106T W106V W106Y,
N109E N109F N109G N109H N109L N109M,
N109R N109S N109T N109V N109W N109Y,
I111L I111M I111N I111P I111T I111V,
E112C E112D E112F E112G E112I E112L,
, N123G, N123I, N123L, N123M, N123Q, N123S,
M124C, 124D, M124I, M124L, M124S, M124T, , S125A, S125C, S125E, S125F, S1251, S125K, , S125P, S125Q, S125R, S125T, S125W, L126A, / L126K, L126N, L126R, L126S, L126T, L126V, , G127A, G127C, G127E, G127F, G127I, G127K, , G127P, G127Q, G127S, G127T, G127V# G127W, , G128D, G128F, G128H, G128L, G128N, G128P, , G128V, G128W, G128Y, P129A# P129C, P129D, , P129G, P129I, P129K, P129L, P129M, P129N, , P129T, P129V, P129Y, G131A, G131C, G131E, , G131L, G131M, G131N, G131P, G131Q, G131R, , G131V, G131W, G131Y, A133C, A133D, A133E, , A133I, A133K, A133L, A133M, A133P, A133R, , A133V, A133W, A133Y, A134D, A134E, A134F,
A134K, A134L, A134M, A134P, A134Q, A134R,
V143W, A144C, A144D, A144E, A144G, A144I,
A144M A144R A144S A144T, A144V A144W, S145D S145E S145F S145G, S145H S145I, S145Q S145R S145T S145V, S145W S145Y, G146D G146E G146M G146Q, G146R G146S, A153S G154L G154P G154T, E156A E156C, E156L E156N E156Q E156R, El E156T, E156Y T158A T158D T158E, T158G T158H, T158L T158M T158N T158Q, T158S T158V, S159C S159D S159E S159G, S159H S159I, S159Q S159R S159T G160D, G160E G160K, G160Q G160S G160T S162A, S162C S162E, S162L S162 S162N S162Q, S162R S162T, S163P Y167A Y167F Y167H, Y167I P168D, P168M P168S P168Y G169A, G169E G169F, G169M G169N G169R G169T, G169V G169Y,
S182P S182Q, S182R, S182V, S182Y S183A,
S183F S183G, S183H, S183I, S183K S183L,
S183Q S183R, S183T, S183V, S183W S183Y,
N184E N184G, N184H, N184K, N184L N184 ,
N184T N184V, N184W, Q185A, Q185C Q185E,
Q185H Q185I, Q185K, Q185L, Q185M Q185N,
Q185V Q185W, R186I, R186L, R186W A187C,
A187F A187G, A187P, A187S, A187W A187Y,
S188D S188E, S188F, S188G, S188H S188I,
S188M S188P, S188Q, S188T, S188V S188W,
S190H S190I, S190K, S191A, S191G S191N,
V192S V192T, V192Y, G193F, G193H G193I,
G193R G193T, P194C, P194E, P194H P194I,
P194 P194Q, P194T P194V P194W L196A,
A200C A200G, A200K A200Y G202D G202E,
G202P G202V, G202Y Q206A Q206C Q206D,
A216N, A216P, A216Q, A216R, A216S, A216V,
Y217C Y217D, Y217E, Y217F, Y217G, Y217H,
Y217L Y217M, Y217N, Y217Q, Y217R, Y217S,
Y217W N218A, N218C, N218E, N218F, N218G,
N218M N218R, N218S, N218T, N218W, N218Y,
G219D G219H, G219I, G219M, G219P, G219Q, , G219T G219V, G219W, T220D, T220E, T220F,
T220M T220S, T220Y, A223E, A223F, A223L, , A223S A223V, A223W, A223Y, S224A, S224C, , S224H S224M, S224N, S224Q, S224R, S224T, , P225F P225G, P225H, P225I, P225K, P225L, , P225S P225T, P225V, P225Y, A228P, A228R,
A228W G229A, G229H, G229I, G229S, A230C,
A230Q A230R, A230S, A230T, A230V, A231C, , A231R I234A, I234C, I234L, I234M, I234N, , I234S I234T, I234V, L235A, L235C, L235G,
, W241A, W241F, W241G, W241H, W241I, W241K, , W241T, W241V, T242A, T242C, T242E, T242F, , T242M, T242N, T242P, T242R, T242S, T242W, , N243E, N243F, N243G, N243I, N243Q, N243S,
N243W, N243Y, T244A, T244D, T244F, T244G, , T244L, T244M, T244N, T244P, T244Q, T244R,
T244W, T244Y, Q245A, Q245C, Q245D, Q245E,
Q245K, Q245L, Q245M, Q245R, Q245T, Q245V, , S248A, S248E, S248F, S248G, S248H, S248I,
S248N, S248Q, S248R, S248T, S248V, S248W, , S249D, S249H, S249I, S249K, S249L, S249M, , S249R, S249T, S249V, S249W, S249Y, L250D, , L250I, L250M, L250T, L250V, E251A, E251T, , N252C, N252E, N252G, N252H, N252I, N252L, , N252R, N252S, N252T, N252V, N252Y, T253A, , T253G, T253H, T253K, T253M, T253S, T253V,
, S260G, S260H, S260L, S260M, S260N, S260P, , S260W, S260Y, F261H, F261W, Y262A, Y262C, , Y262H, Y262L, Y262M, Y262N, Y263F, Y263M, , G264I, G264L, K265A, K265C, K265E, K265G, , K265M, K265N, K265Q, K265R, K265S, K265W, , G266F, G266L, G266 , G266P, G266R, G266V, , L267A, L267C, L267E, L267G, L267H, L267I,
L267Q, L267S, L267T, L267V, I268A, I268C, ; I268M, I268P, I268R, I268V, N269D, N269E, , N269P# N269Q, N269S, Q271A, Q271C, Q271D, , Q271G, Q271H, Q271I, Q271K, Q271L, Q271M, , Q271R, Q271S, Q271T, Q271V, Q271W, Q271Y, , A272G, A272H, A272K, A272L, A272M, A272N, / A272S, A272T, A272V, A272W, A272Y, A274C, , A274G, A274H, A274I , A274K, A274L, A274Q, , y A274V.
-Y217L, Y021H-S101E-Y217E, M119F-K213K-Y217Q, -Y217E, Y021W-A045I-Y217E, M119F-K213I-Y217Q, -N212S, 119F-K213L-Y217E, K213I-Y217Q, A045 -A045V-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-S101E-Y217L, -K213I-Y217Q, K213N-Y217Q, M119F-Y217Q, S024 , S101N- 119F-K213I-Y217Q, S101N-K213L-Y217Q, -K213K-Y217L, S101N-M119F-K213I -Y217L, ?021 , S101N-K213L-Y217E, A045V-Y217L, S101N-K213 S-M119 -K213K-Y217L, Y021H-Y217L, S101E-K213 I-Y217E, S101N-M119F-Y217E, Y021W-A045V-Y217L, , S024H-A092G-Q103E, Y021W-S101E, V26Q-K213I, , S101E-K213N-Y217E. En algunas modalida itución comprende una combinación seleccionada de -M050M-A092A-Q103E-A114G-V246V, S024S -V028V-M05C Q-A114A-V246V, S024S-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114 H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114A-V246T, S024H-V028
, K213N-Y217Q, M119H-K213N, S101N-K213L-Y217Q, , S101E-K213N-Y217E, S101E-M119H-K213I-Y217Q, -K213N, K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217Q, M119 -M119N-K213N-Y217Q, M119H-K213 I -Y217Q, K213 -M119N-Y217L, M119F-K213L, M119H-K213N-Y217E , -K213N-Y217Q, S101N-M119H-K213N-Y217Q, M119 , Y217Q, M119H-K213N-Y217Q, S101N-M119F-Y217E, , S101N-M119F-K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217L, -K213N-Y217L, S101E-K213L-Y217L, S101N-K213 -M119H-K213L, S101N-M119H-K213I , S101P-K213 -K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217Q, S101E-M119 _ S101N-M119H-K213I-Y217Q, M119H-K213N-Y217E , -K213N-Y217L, A048E-K213L, A048H-K213L, V026 # K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N , V026Q-A048E-K213L, A048H-K213N, V026Q-A048 -K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, V026
-S101E-Y217Q, Y021H-S101E-Y217E , Y021W-S101 -V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114A-V246T, ?021?-?045 -A045V-S101E-Y217L, S101N-M119H-K213K-Y217Q, -K213N-Y217Q, Y021H-A045V-S101P-Y217L, S024 -A092A-Q103Q-A114G-V246T, S101S-M119F-K213 -M119M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, -S101E-Y217E, ?021H-A045V-S101E , Y021H-Y217L, I-Y217E, Y021W-A045I-S101E-Y217E, S101N-M119 , S101E-M119H-K213N-Y217E, Y021H-A045I-Y217E, -K213L- Y217L, Y021H-Y217E, S101S-M119F-K213K- -A045I-S101E-Y217L. En algunas modalidad itución comprende una combinación seleccionada de -M050V-A092G-Q103E-A114G-V246T, S101N-M119H, -Y217L, Y217L, M119N-K213N, K213N, K213N-Y217Q -Y217E, S101E-M119N-Y217L, Y217Q, S101N-M119 , S101N- 119N-K213N-Y217L, Y021H-A045I -S101
parte la presente invención proporciona composic eza que comprenden la variante de subtilis as modalidades, la composición de limpieza gente de lavandería. En algunas modalida gente de lavandería es un detergente para agua gente de pH bajo, o un detergente compacto. la presente invención proporciona métodos para variante de subtilisina de una subtilisina de B omprende: transformar una célula hospedera con u presión que comprende un ácido nucleico que cod nte de subtilisina; y cultivar la célula h formada bajo condiciones apropiadas para la pr a variante de subtilisina. En algunas modalida os comprenden además la etapa de cosechar la var lisina producida. En algunas modalidades, la dera es una especie Bacillus, y en un subcon
ación del sitio (SELs) cada una comprende una pl ariantes de proteasa que tienen sustituciones d na posición de aminoácido idéntica de la prot r las variantes de proteasa de las SELs y una dar en una prueba de una propiedad de inte minar un índice de desempeño (PI) para cada un ntes de proteasa para la prueba; d) identifica de las posiciones de aminoácido como posici ictivas, en donde al menos una de la plural ntes de proteasa en cada una de dos de las SELs ayor que 0.5; y f) proporcionar una biblio ión múltiple que comprende una pluralidad de v roteasa sustituidas múltiples veces cada una c tuciones en las dos o más posiciones no restrict as modalidades, la prueba comprende dos o más entes seleccionados del grupo que consiste de
comprende: probar una pluralidad de varía lisina sustituidas una sola vez en una primera p primera propiedad y una segunda prueba de una edad, en donde la propiedad de la subtilisina pr r un valor de 1.0 en cada prueba, una primera o edad favorable tiene un valor mayor que 1.0 ra o segunda propiedad demasiado desfavorable de menos de alrededor de 0.80 o en algunas mod ridas, de menos de alrededor de 0.60; identif tución en al menos una de las variantes de sub ituidas una sola vez que se asocia con una edad favorable y que no se asocia con una iedad demasiado desfavorable; identificar una sus l menos una de las variantes de subtilisina sus sola vez que se asocia con una segunda p rable y que no se asocia con una primera p
egunda prueba. En algunas modalidades, los enden además producir las variantes de sub adas. En algunas modalidades, la primera y edades se correlacionan negativamente. En idades, una primera o segunda propiedad favorab alor mayor que alrededor de 1.2. En algunas moda primera o segunda propiedad demasiado desfavorab valor de menos de alrededor de 0.40. En idades, la primera propiedad es estabilidad da propiedad es desempeño de lavado. En un sub stas la estabilidad comprende estabilidad en dete peño de lavado comprende desempeño de la rgente de tinta leche sangre (BMI, por sus s s) . En algunas modalidades, la subtilisina ba rsora es una forma madura tipo natural ilisina BPN' de B. amyloliquefaciens que tie
las etapas se limiten al orden exacto enlistado e cualquier orden apropiado encuentra uso en la ción. Sin embargo en algunas modalidades preferi ituciones están en posiciones en una sub rsora que tienen una superficie accesible al , por sus siglas en inglés) de mayor que alrededo or que alrededor de 65%.
Breve Descripción de las Figuras
La FIG. 1A proporciona un mapa de pHPLT-VAAcl, IG. IB proporciona un mapa de pHPLT-BPN1.
La FIG. 2A describe el desempeño de limpieza BM -Y217L CCL en detergente de lavandería de Amé e como una función del cambio de carga. Similar 2B describe el desempeño de limpieza BMI de una etergente de lavandería de América del Norte
una función de cambio de carga. Similarmente la ibe el desempeño de limpieza BMI de una GG36 gente de lavandería en polvo japonés como una fu o de carga.
La FIG. 5A describe desempeño de limpieza de cocida de una BPN'-Y217L CCL en deterg latos automático como una función de cambio d larmente la FIG. 5B describe el desempeño de lir de huevo cocida de una GG36 CCL en deter latos automático como una función de cambio de c
La FIG. 6 describe la estabilidad LAS/EDTA ión del cambio de carga neto con relación a BP rsor, para una biblioteca que contiene 80 varian
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención proporciona métodos para
rido para un número de propiedades. Esto cimiento de mutaciones que sean buenas para una p icular, así como conocimiento de aquellas mutaci malas para cualquiera de las propiedades dese ente invención proporciona medios para cubrir el tificar aquellas posiciones en la proteína qu rarse para mejorar la propiedad primaria y mant res para otras propiedades dentro de los límites
La presente invención proporciona medios para S las posiciones en una proteína para to iedades de interés al construir "colecci uación del sitio" en cada sitio. En mo eridas, estas colecciones contienen 9-19 mutac posición, y se usan para evaluar cada posición roducir por ingeniería la proteína y colecc trucción. Cada propiedad se mide con relación a l
ía libre con relación a la enzima precursora (? rno sigue;
?? G = -RT In ( Invariante/ ^precursor )
kvar ante sis la constante de velocidad para l nte, y kpreCursor es la constante de velocidad a precursora, R es la constante de ley Gas y ratura absoluta. La mayoría de los ensayos ruyen para permitir la determinación de las s reales, de manera que se ha utilizado una cant
?? G app = -RT ln ( Pvariante/ ^precursor )
Pvariante es el valor de desempeño para la va rsor es el valor de desempeño para la enzima pr las mismas condiciones. Los valores ?? G a rarse que se comporten en una manera similar c G para distribución de datos y capacidad adit rgo, ya que ?? G es la cantidad máxima de tra
uier proteína de interés para producir por ing colecciones de evaluación del sitio (SE ruyeron como se describe en la presente al in 12 hasta 1 sustituciones en cada una iones. Las mutaciones resultantes se analizaro os de actividad y estabilidad. El aminoácido al se enlista como un punto de referencia p ión. Para cadá propiedad, se usaron medició minar la desviación media y estándar de ?? Gapp a precursora. La media de precursor ( precu lizó hasta 0, y la desviación estándar ((Tprecur Gapp se determinó. Estos valores se usaron rencia para cada propiedad en cada posición cula. Los sitios de evaluación de datos se proba encia de correlación entre propiedades. Los val para cada propiedad se agruparon contra cada otr
r el número de sitios Productivos dividido por e 1 de sitios. Aunque la probabilidad de que c ión será mejor que la enzima precursora es ba 6%-28%) la probabilidad de que un sitio dado t s una mutación hacia arriba es completamente alta
Fue de interés determinar cómo los sitios Produ ductivos se distribuyeron con respecto a caracte ucturales (por ejemplo, aminoácidos esc oácidos que interactúan, posiciones cerca de o, etc.) en la proteasa, así como sitios de s son conservadores o cambiables en evolución. Pa determinación, se examina la estructura y la s linea con homólogos no redundantes.
Como se indica en los Ejemplos, las mu udiciales para cualquier propiedad se correlaci ciones per udiciales para cada otra propiedad, a
ína producida por ingeniería simplificada es c y seleccionarlos usando un tamiz de activi ilidad sencillo. Las mutaciones perjudici ifican y aquellas posiciones que tienen iones per udiciales se usan para construir* eolec iones de combinación para mejorar las pro ples. También, los sitios de atrapado que est ficie de la proteína, tienen algunas interaccion bles en alineaciones de secuencia proporcion proporción de sitios productivos. Los sitios q interior de la molécula, tienen muchos contact fuertemente conservadores en evolución tendrán bilidad de mutaciones perjudiciales y deberán e ontempla que cualquier método apropiado para ncia y/o información estructural encontrará us nte invención, incluye pero no se limita una com
de bibliotecas de sitios de evaluación se u ar la biblioteca de combinación. Las col orias construidas por evolución directa tradici ción de grandes números de bibliotecas para pro llas, combinan estas y repiten el proceso. Com tigadores han encontrado (Ver por ejemplo, Bloo Opin. Struct. Biol . , 15:447-452
[2005]; Bloom Nati. Acad. Sci . USA 103:5869-5874
[2006]; y Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101:9205-9210 [20 lación de mutaciones positivas para una p mente lleva una reducción en otras propieda bilidad de que cualquier mutación será hacia arr uiera de las propiedades es pequeña, y la prob e cualquier mutación será hacia abajo es alta (> robabilidad de que se acumule más de tres (3) mu incrementan la actividad que resultará en una r
a ventajosamente por ejemplo, en aplicaci dería, limpieza de superficies duras, aplicac latos automáticos, así como aplicaciones eo S como dentaduras, dientes, cabello y piel. Sin do a las ventajas únicas de la efectividad incr oluciones a temperatura más baja, las enzima ente invención son idealmente apropiada caciones de lavandería. Adicionalmente, las enzim enté invención pueden emplearse en composicion idas como en gránulos .
Las proteasas variantes de la presente invención entran uso como productos aditivos de limpi as modalidades, encuentran uso en aplicaci ieza de solución a temperatura baja. El producto e ser, en su forma más sencilla, una o más prote as modalidades, el aditivo se empaca en f
to, carbonato y silicato así como talco, ar ares. Los rellenadores o materiales po iados para composiciones líquidas incluyen, pe an a agua o alcoholes primarios y secundarios molecular que incluyen polioles y dioles. Los ales alcoholes incluyen, pero no se limitan a, I , propanol e isopropanol. En algunas modalida siciones contienen desde alrededor de 5% hasta a
90% de tales materiales. Los rellenadores ntran uso para reducir el pH. Alternativame ivos de limpieza incluyen ingredientes adjuntos ibe más completamente enseguida.
Las composiciones de limpieza y aditivos de les requieren una cantidad efectiva de al meno ariantes de proteasa proporcionadas en la presen combinación con otras proteasas y/o enzimas adic
Las composiciones de limpieza en la presente se amente de tal manera que, durante su uso en ope impieza acuosas, el agua de lavado tendrá un edor de 5.0 hasta alrededor de 11.5 o aú edor de 7.5 hasta alrededor de 10.5. Las formu roducto líquido se formulan típicamente para teñ desde alrededor de 3.0 hasta alrededor de 9. alrededor de 3 hasta alrededor de 5. Los prod dería granulados se formulan típicamente para esde alrededor de 9 hasta alrededor de 11. Las controlar el pH a niveles de uso recomendados O de soluciones amortiguadoras, alcalinas, ácido bien conocidos por aquellos expertos en la técn
Las composiciones de limpieza de pH bajo ap amente tienen un pH puro desde alrededor de edor de 5 , y típicamente están libres de tensi
composiciones comprenden típicamente al me a estable al ácido. En algunas modalidad siciones sin líquidas, aunque en otras modalida as. El pH de tales composiciones líquidas amente como un pH puro. El pH de tales compo as se mide como una solución con 10% de sólid sición en donde el solvente es agua destilada. idades, todas las mediciones de pH se toman en 2 En algunas modalidades, cuando las proteasas v mplean en una composición en gránulos o líq ble para la proteasa variante estar en la form ícula encapsulada para proteger la proteasa var s componentes de la composición en gránulos du enamiento. Además, la encapsulación tambi inada a controlar la disponibilidad de la nte durante el proceso de limpieza. En
ial encapsulante tiene una temperatura de trans o (Tg) de 0°C o superior. La temperatura de tr idrio se describe en más detalle en WO 97/11 ial encapsulante se selecciona del que cons hidratos, gomas naturales o sintéticas, sán, celulosa y derivados de celulosa, si tos, boratos, alcohol polivinílico, polietilen de parafina, y combinaciones de los mismos. C ial encapsulante es un carbohidrato, típicam cionado de monosacáridos , oligosacáridos , polisa mbinaciones de los mismos. Típicamente, el sulante es un almidón. Los almidones apropi iben en EP 0 922 499; US 4,977,252; US 5,354,5 ,826. En algunas modalidades, el material enca a microesfera hecha de plástico tal como termopl nitrilo, metacrilonitrilo, poliacrilo
gentes de lavandería y platos. Estas apli an enzimas bajo varias tensiones ambiéntal asas variantes de la presente invención prop jas sobre muchas enzimas actualmente usadas, deb ilidad bajo varias condiciones.
En efecto, hay una variedad de condiciones de la yen formulaciones de detergente variadas, volú de lavado, temperaturas de agua de lavado, y du iempo de lavado, a las cuales las proteasas invo l lavado se exponen. Además, las formulaci gente usadas en diferentes áreas geográficas ntraciones diferentes de sus componentes re ntes en el agua de lavado. Por ejemplo, un de eo típicamente tiene alrededor de 4500-5000 nentes de detergente en el agua de lavado, mien etergente Japonés típicamente tiene aproximadam
ma de baja concentración de detergente ya q n aproximadamente 667 ppm de componentes de de ntes en el agua de lavado.
Una concentración media de detergente gentes donde entre alrededor de 800 ppm y alre pm de componentes de detergente están presente de lavado. Los detergentes de América de aímente se consideran que son sistemas de conce de detergente ya que estos tienen aproximadam de componentes de detergente presentes en el o. Brasil típicamente tiene aproximadamente 150 nentes de detergente presentes en el agua de la ema de alta concentración de detergente rgentes donde mayor que alrededor de 2000 onentes de detergente están presentes en el do. Los detergentes Europeos generalmente se co
ona arriba, Brasil típicamente tiene aproxim ppm de componentes de detergente presentes en el o. Sin embargo, otras geografías de deterg ructor de fosfato de alta espuma, no limitadas s de América Latinan, pueden tener sistemas ntración de detergente de hasta alrededor de 600 nentes de detergente presentes en el agua de lav A la luz de lo anterior, es evidente ntración de composición de detergente en soluc o típicas a través del mundo varían desde edor de 800 ppm de composición detergente ( "ge oncentración baja de detergente"), por ejemplo a 67 ppm en Japón, hasta entre alrededor de 800 edor de 2000 ppm ("geografías de concentración rgente"), por ejemplo alrededor de 975 ppm en dedor de 1500 ppm en Brasil, hasta mayor que aire
gente dentro de la solución de lavado alrededor composición detergente deberá agregarse a los 6 ión de lavado. Esta cantidad es la cantida a en el agua de lavado por el consumidor usando dida proporcionada con el detergente.
Como un ejemplo adicional, geografías diferen raturas de agua diferentes. La temperatura del o en Japón es típicamente menor que la que se a . Por ejemplo, la temperatura del agua de l ca del Norte y Japón es típicamente entre 10 y 3 lo, alrededor de 20°C) , mientras que la tempera de lavado en Europa es típicamente entre 30 y 6 lo, alrededor de 40 °C) .
Como un ejemplo adicional, geografías di amente tienen durezas de agua diferentes. La du se describe usualmente en términos de los gr
Agua Granos por galón Partes por
Suave Menos de 1.0 Menos d geramente dura 1.0 hasta 3.5 17 hast eradamente dura 3.5 hasta 7.0 60 hast
Dura 7.0 hasta 10.5 120 hast
Muy dura Mayor a 10.5 Mayor a
La dureza del agua de Europa es típicamente m (por ejemplo 10.5-20.0) granos por galón m Mg2+ (por ejemplo, alrededor de 15 granos po ados Ca2+/Mg2+) . La dureza del agua de América d ípicamente mayor que la dureza del agua Japone que la dureza del agua Europea. Por ejemplo, l agua de América del Norte puede estar entre 3 s, 3-8 granos o alrededor de 6 granos. La du Japonesa es típicamente más baja que la dureza érica del Norte, usualmente de menos de 4, por e
resente invención exhiben desempeño de lavado a comparación con subtilisina proteasas act cialmente disponibles. De esta manera, en idades preferidas de la presente invenci asas variantes proporcionadas en la presente ilidad oxidante aumentada, estabilidad tada, y/o estabilidad al quelador aumentada. Ade asas variantes de la presente invención encuen omposiciones de limpieza que no incluyen dete mente ya sea sola o en combinación con constru ilizantes .
En algunas modalidades de la presente invenc siciones de limpieza comprenden al menos una nte de la presente invención a un nivel desde a .00001 % hasta alrededor de 10% en peso de la com l. balance (por ejemplo, alrededor de 99.999
999% hasta alrededor de 90.0%, alrededor de
alrededor de 98%, alrededor de 99.995% hasta a 9.5% en peso) comprende materiales adjuntos de li
En algunas modalidades, las composiciones de ridas comprenden una o más enzimas o derivados d ionales que proporcionan desempeño de limpi ficios de cuidado de telas, además de una o má easas variantes proporcionadas en la presente as incluyen, pero no se limitan a otras pr sas, cutinasas, amilasas, celulasas, pero asas (por ejemplo, lacasas) , y/o mananasas .
Cualquier otra proteasa apropiada encuentra us osiciones de la presente invención. Las p iadas incluyen aquellas de origen animal, v obiano. En algunas modalidades particu eridas, se usan proteasas microbianas. En
tes descritas en la Pat . E.U.A. Nos. RE ,340, 5,700,676, 6,312,936, y 6,482,628, to s se incorporan en la presente para referenc íos de proteasas adicionales incluyen, pero an una tripsina (por ejemplo, de origen po o), y la proteasa Fusarium descrita en WO 89/06 as proteasa comercialmente disponibles pr yen MAXAT ASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPT ASE®, PROPERASE®, PURAFECT® y PURAFECT® OXP (Ge ASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, RELASE® y E zymes) ; y BLAP™ (Henkel Kommanditgesellsch n, Duesseldorf, Alemania. Varias proteasas se d 095/23221, WO 92/21760, y Pat. E.U.A. Nos. 5, ,735, 5,500,364, 5,855,625, US RE 34,606, 5, ,676, 6,312,936, y 6,482,628, y varias otras pat Además, cualquier lipasa apropiada encuentra u
a P. alcaligenes y P. pseudoalcaligenes ( lo, EP 218 272) , lipasa P. cepacia (Ver por eje 76), lipasa P. stutzeri (Ver por ejemplo, GB 1,3 a P. fluorescens, Lipasa Bacillus (por ejemplo ubtilis [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1
[1993] ) ; lipasa B . stearothermophilus [Ver por 4/744992] ; y lipasa B. pumilus [Ver por eje 6422] ) .
Adicionalmente , un número de lipasas clonadas en en algunas modalidades de la presente invenc ye pero no se limita a lipasa Penicillium carn
Yamaguchi et al., Gene 103:61-67
[1991]), ricum candidum (Ver, Schimada et al., J. B 383-388
[1989] ) , y varias lipasas Rhizopus t sa R. delemar (Ver, Hass et al., Gene 109 1] ) , lipasa R, niveus (Kugimiya et al., Biosci .
zymes) ; y LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceut , Japón) .
En algunas modalidades de la presente invenc siciones de limpieza de la presente invención c s lipasas a un nivel desde alrededor de 0.00001 edor de 10% de lipasa adicional en peso sición y el balance de materiales adjuntos de eso de la composición. En otros aspectos de la ción, las composiciones de limpieza de la ción también comprenden, lipasas a un nivel de a .0001 % hasta alrededor de 10%, alrededor de alrededor de 5%, alrededor de 0.001 % hasta a %, alrededor de 0.005% hasta alrededor de 0.5% d eso de la composición.
Cualquier amilasa (alfa y/o beta) apropiada par ciones alcalinas también encuentran uso como en
™ (Novozymes) y RAPIDASE® y MAXAMYL® P (Genencor) En algunas modalidades de la presente invenci siciones de limpieza de la presente invención co s amilasas a un nivel desde alrededor de 0.00001 edor de 10% de amilasa adicional en peso sición y el balance de materiales adjuntos de so de la composición. En otros aspectos de la ción, las composiciones de limpieza de la ción también comprenden, amilasas a un n edor de 0.0001 % hasta alrededor de 10%, alre % hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.001 edor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor sa en peso de la composición.
En algunas modalidades adicionales, cualquier iada encuentra uso en las composiciones de lim resente invención. Las celulasas apropiadas i
zymes) , y KAC-500(B)™ (Kao Corporation). En idades, las celulasas se incorporan como por entos de celulasas tipo natural o variante mad una porción de N-terminal se elimina (Ver por E.U.A. No. 5,874,276). En algunas modalidad siciones de limpieza de la presente invención co ás celulasas a un nivel desde alrededor de 0. a alrededor de 10% de celulasa adicional en pe osición y el balance de materiales adjuntos de eso de la composición. En otros aspectos de la ción, las composiciones de limpieza de la ción también comprenden celulasas a un n dedor de 0.0001 % hasta alrededor de 10%, alre 1 % hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.00 dedor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor elulasa en peso de la composición.
as modalidades, las composiciones de limpiez nte invención comprenden además mananasas a alrededor de 0.00001 % hasta alrededor de asa adicional en peso de la composición y el ba ríales adjuntos de limpieza en peso de la composi s aspectos de la presente invención, las composic ieza de la presente invención también COI asas a un nivel de alrededor de 0.0001 % hasta a 0%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 5%, a .001% hasta alrededor de 2%, alrededor de 0.00 edor de 0.5% mananasa en peso de la composición.
En algunas modalidades, las peroxidasas se inación con peróxido de hidrógeno o una fuente d ejemplo, un percarbonato, perborato o persulfato osiciones de la presente invención. En lidades alternativas, las oxidasas se usan en com
lgunas modalidades, las composiciones de limpiez nte invención comprenden además enzimas de pe oxidasa a un nivel desde alrededor de 0.00001 edor de 10% de peroxidasa y/u oxidasa adicional a composición y el balance de materiales adj eza en peso de la composición. En otros aspect nte invención, las composiciones de limpieza nte invención también comprenden, enzimas de pe oxidasa a un nivel de alrededor de 0.0001 edor de 10%, alrededor de 0.001% hasta alrededo edor de 0.001% hasta alrededor de 2%, alred % hasta alrededor de 0.5% de enzimas de peroxi sa en peso de la composición.
En algunas modalidades, las enzimas adi ntran uso, incluye pero no se limita a perhi por ejemplo, O 05/056782). Además, en
sición de limpieza siendo materiales adju eza. La selección específica de materiales adj eza se hace fácilmente al considerar la sup ulo, o tela a limpiarse, y la forma desead sición para las condiciones de limpieza durant ejemplo, a través del uso del detergente de lava Los ejemplos de materiales adjuntos de iados incluyen, pero no se limitan a, tensio
I
ructores, blanqueadores, activadores de bla izadores de blanqueado, otras enzimas, ilizantes de enzima, quelantes, abrillantadores eros liberadores de suciedad, agentes de trans tinte, dispersantes, supresores de espuma, mes, colorantes, sales rellenadoras , hidr ctivadores , agentes de fluorescencia, acondici ela, tensioactivos hidrolizables , conservadore
ateriales de composición de limpieza específ lifican en detalle enseguida. En modalidades s los materiales adjuntos de limpieza no son coi las proteasas variantes de la presente invenció siciones de limpieza, entonces se usan iados para mantener los materiales adjuntos de S proteasas separados (esto es, no en contacto un ) hasta que la combinación de los dos compone iada. Tales métodos de separación incluyen c o apropiado conocido en la técnica (por las de gel, encapsulación, tabletas, separación
) .
En algunas modalidades preferidas, una cantidad una o más proteasas variantes proporcionadas ente se incluyen en composiciones útiles para lim edad de superficies que necesitan de remoción de
fricos, pastas de dientes, lavados bucales, e composiciones de limpieza de dentadura) , compo impieza de piel y cabello. Se pretende que la ción abarque composiciones detergentes en c (esto es, líquido, gránulos, barra, semi-sólida iones, tabletas, cápsulas, etc.) .
A modo de ejemplo, varias composiciones de lim las proteasas variantes de la presente i ntran uso se describen en mayor detalle enseg idades en las cuales las composiciones de limpie nte invención se formulan como composiciones ap uso en métodos de lavado en lavadora, las compo a presente invención preferiblemente contienen ensioactivo y al menos un compuesto constructor, o más materiales adjuntos de limpieza preferi cionados de compuestos poliméricos orgánicos,
esempeño de composiciones detergentes convenci n agregarse en cualquier etapa del proceso de l lgunas modalidades, la densidad de las composic gente de lavandería en la presente está en el i alrededor de 400 hasta alrededor de 1200 e en otras modalidades, está en el interval edor de 500 hasta alrededor de 950 g/l sición medida a 20°C.
En modalidades formuladas como composiciones par os de lavaplatos manuales, las composiciones ción preferiblemente contienen al menos un tens eferiblemente al menos un material adjunto de ional seleccionado de compuestos poliméricos or tes potenciadores de espuma, iones de metal del g entes, hidrótropos y enzimas adicionales.
En algunas modalidades, varias composiciones de
eza de tela en gránulos que proporciona suav s de la capacidad de lavado, en modalidades adic omposición es una composición de limpieza de do de trabajo pesado. En algunas modalidad siciones que comprenden al menos una proteasa a presente invención son composiciones de lim tales como aquellas descritas en la Pat . E.U. ,642 y 6,376,450. Además, las proteasas variant nte invención encuentran uso en composici gente de lavandería en gránulos de utilidad pa Condiciones de lavado Europeas o Japonesas lo, Pat. E.U. A. No. 6,610,642) .
En algunas modalidades alternativas, la ción proporciona composiciones de limpieza de su que comprenden al menos una proteasa rcionada en la presente. De esta manera, en
ción es una composición de limpieza de superfi como aquellas en la Pat . E.U.A. Nos. 6,61 ,450. Todavía en modalidades adicionales, la ción proporciona composiciones de lavaplat enden al menos una proteasa variante proporció presente. En algunas modalidades adiciónal siciones comprenden al menos una. proteasa varian nte invención que comprende composicione de tal como aquellas en la Pat. E.U.A. No. 6,37 ,450. Las formulaciones y descripciones estos y materiales adjuntos de limpieza conte Pat. E.U.A. Nos. 6,376,450, 6,605,458, 6,605 ,642 antes mencionadas, encuentran uso con las p ntes proporcionadas en la presente.
Las composiciones de limpieza de la presente i formuladas en cualquier forma apropiada y prepar
ción, se ilustra de aquí en adelante una 1 tos no limitantes que son apropiados para uso siciones de limpieza actuales. En algunas moda adjuntos se incorporan por ejemplo, para ayu tar el desempeño de limpieza, para tratamie ato a limpiarse, o para modificar .la estétic sición de limpieza como es el caso con p antes, tintes o similares. Se entiende qu tos están además de las proteasas variante nte invención. La naturaleza precisa de nentes adicionales, y niveles de incorporació os, dependerá de la forma física de la composic raleza de la operación de limpieza para la cual materiales adjuntos apropiados incluyen, per tan a, tensioactivos , constructores, agentes qu tes que inhiben la transferencia de tinte, auxil
pigmentos. Además de la descripción ensegui íos apropiados de tales otros adjuntos y nivele ncuentran en la Patente de E.U.A. Nos. 5, ,812, y 6,326,348, que se incorpora para referen dientes adjuntos anteriormente mencionados ituir el balance de las composiciones de limpie nte invención .
En algunas modalidades, las composiciones de lim do con la presente invención comprenden un tens tema tensioactivo en donde el tensioactivo se se tensioactivos no iónicos, tensioactivos an oactivos catiónicos, tensioactivos anfo ioactivos zwitteriónicos , tensioactivos no ionic es y mezclas de los mismos.
En algunas modalidades adicionales, las composic ieza de la presente invención comprenden un
ino, amonio y amonio sustituido de ácidos poli como ácido etilendiamina tetraacético lotriacético, así como policarboxilatos tales co ico, ácido succínico, ácido cítrico, isuccínico, ácido polimaleico, ácido benceno rboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico, les de los mismos.
En algunas modalidades adicionales, las composic ieza en la presente contienen un agente quela tes quelantes apropiados . incluyen agentes q e, hierro y/o manganeso y mezclas de los mismos.
Todavía en algunas modalidades adiciónale Osiciones de limpieza proporcionadas en la ienen un auxiliar de deposición. Los auxili sición apropiados incluyen, polietilen propilen glicol, policarboxilato, polímeros lib
imeros de N- vinilpirrolidona y N-vinili iniloxazolidones y polivinilimidazoles o mezcla s .
Todavía en algunas modalidades adicionale siciones de limpieza de la presente invención enen dispersantes. Los materiales orgánicos sol apropiados incluyen los ácidos homo o co-polim sales, en los cuales el ácido policarboxílico c eños dos radicales carboxilo separados uno del s de dos átomos de .carbono.
En algunas modalidades particularmente preferi siciones de limpieza comprenden una o más en gente que proporcionan desempeño de limpi icios de cuidado de telas. Los ejemplos de iadas incluyen, pero no se limitan a, hemice idasas, proteasas, celulasas, xilanasas,
En algunas modalidades adicionales, las enzima s composiciones de limpieza se estabilizan por c ca apropiada. En algunas modalidades, las adas en la presente se estabilizan por la pres es de calcio solubles en agua e/o iones de mag omposiciones terminadas lo que proporciona tales nzimas .
Todavía en algunas modalidades adicionale siciones de limpieza de la presente invención ejos de metal catalítico. Un tipo de cat ueador que contiene metal es un sistema cataliz ende un catión de metal de transición de a ítica de blanqueador definida, tal como cati , hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molib neso, un catión de metal auxiliar que tiene poc ctividad catalítica de blanqueador, tal como cat
cluyen, por ejemplo, los catalizadores bas neso descritos en la Pat . E.U.A. No. 5,576,282. nocen los catalizadores de blanqueado de cobalt a presente, y se describen, por ejemplo, en
. Nos. 5,597,936, y 5,595,967. Tales cataliza to se preparan fácilmente por procedimientos co como se enseña por ejemplo en las Pat. E.U. ,936, y 5,595,967. En algunas modalidad siciones proporcionadas en la presente también iadamente un complejo de metal de transició do rígido macropolicíclico (esto es, "MRL" ) . ia práctica, y no a manera de limitaci siciones y procesos de limpieza en la pres table, para proporcionar en el orden de al m e por cien millones de la especie MRL activa en lavado acuoso, y pre eriblemente proporcionar
azabiciclo [6.6.2] hexadecano . Los MRLs de m ición apropiados se preparan ' fácilmen dimientos conocidos, tal como el que se ens lo en WO 00/332601, y Pat . E.U.A. No. 6,225,464.
Como se indica arriba, las composiciones de lim resente invención son formuladas en cualquie iada y preparadas ' por cualquier proceso elegid lador, los ejemplos no limitantes de los c iben en las Pat. E.U.A. Nos. 5,879,584, S, ,005, 5,569,645, 5,516,448, 5,489,392, y S, las cuales se incorporan en la presen encia .
Las composiciones de limpieza descritas en la entran uso limpiando un sitio (por ejemp rficie, lavaplatos, o tela) . Típicamente, al m ión del sitio está en contacto con una modal id
edor de 5°C hasta alrededor de 90 °C y, cuando ende una tela, el agua para la relación en masa ípicamente desde alrededor de 1:1 hasta alre
En modalidades adicionales, la presente i én proporciona composiciones y métodos que s tensioactivos y mezclas de tensioactivos para orar el desempeño de las proteasas en compo gentes. Al usar un software de diseño experime o una mezcla de entramado sencilla para ev idad de la proteasa en la presencia de los tensi comúnmente usados en líquido detergente de lava ialmente sulfonato de alquilbenceno lineal to de alquiletoxi (AES) , y alcohol etoxilado (AE son tensioactivos aniónicos, mientras AE ioactivo no iónico.
asa .
Por ejemplo, se determinó que en algunas modalid asa es capaz de funcionar mejor en la presenci r tensioactivo cuando un segundo
nte pero menos bien si un tercer tensioacti nte. En modalidades adicionales, la proteasa es mucho más altos de un primer tensio diendo de la relación de un segundo y ioactivo. La observación de que las enzimas puede presencia de tensioactivos diferentes si las re los tensioactivos se seleccionan cuidadosam rario a la creencia convencional de que las enzi rán usarse en combinación con tensioactivos ten adversamente su actividad, limitando el as a ciertas composiciones detergentes.
Con base, en parte, en las observaciones descrit
njunto de los tensioactivos pero en ausencia de e los tensioactivos en la mezcla. En algunos c asa se inactiva o exhibe actividad reducida ncia de cualquiera de los tensioactivos, en aus tensioactivo presente en la mezcla. Similarme os casos, la presencia de un primer tensioactivo uso de una cantidad incrementada de un oactivo, en donde la misma cantidad del oactivo en ausencia del primer tensioactivo ina uciría la actividad de la proteasa.
Además, la presencia de un primer tipo de tens ejemplo, un detergente no iónico o aniónico) pe de un segundo tipo de detergente, donde el segú etergente en ausencia del primer tipo de tens ivaría o reduciría la actividad de la proteasa.
En estos experimentos, se usó subtilisina
al contrario uno que incluye al menos riblemente tres tensioactivos , cualquiera de lo ivaría o reduciría la actividad de la proteasa s idualmente en un nivel suficiente. La cular de AES>LAS>AE parece producir el mejor r esta proteasa en la temperatura baja.
En contraste, a altas temperaturas (esto es, asa fue activa en una composición que compre o AES en combinación con LAS y una ivamente pequeña de AE . De esta manera, la to AES se incrementa en la temperatura más alta, la inclusión de otros tensioactivos menos import
También se condujeron varias pruebas adicion idad de proteasa después de la incubación se d o sustrato AAPF-pNA. El punto de fusión, Tm, se nzima en cada formulación de detergente. Finalm
o de la experiencia de la técnica. Tales téc en por aquellos de experiencia en la técni iben en numerosos textos y trabajos de referen ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Clo ratory Manual", Segunda Edición (Cold Spring 9]); y Ausubel et al., "Current Protocols in M gy"
[1987] ) . Todas las patentes, solicitudes de culos y publicaciones mencionadas en la present a como abajo, se incorporan expresamente en la referencia.
A menos que se define de otra manera en la p s los términos técnicos y científicos usados ente tienen el mismo significado como se mente por alguien de experiencia ordinaria en la ual esta invención pertenece. Hay varios dice nibles y conocidos por aquellos en la técn
encia en plural a menos que el contexto menté lo contrario. Los intervalos numéri yentes de los números que definen el intervalo. se indique de otra manera, los ácidos nucle iben en orientación de izquierda a derecha 5' h secuencias de aminoácidos se escriben en orient erda a derecha en amino a carboxi, respectivam nde que esta invención no se limita a la meto colos y reactivos particulares descritos, ya q n variar, dependiendo del contexto en el que se los expertos en la técnica .
La práctica de la presente invención emplea, a m indique de otra manera, técnicas convencion ficación de proteína, biología molecular, microb Ícas de ADN recombinante y procesado en secu ína, todos los cuales están dentro de la experi
Como se usa en la presente, los términos "prot vidad proteolítica" se refieren a una proteína o xhibe la capacidad para hidrolizar péptidos o s tienen ligaduras de péptido. Existen dimientos bien conocidos para medir la a olítica (Kalisz, "Microbial Proteinases , " En: ) , Advances in Biochemical Engineering/Biotec ]). Por ejemplo, la actividad proteolític inarse por ensayos comparativos que anal idad de la proteasa respectiva para hidrol ato comercial. Los sustratos ejemplares útile isis de proteasa o actividad proteolítica, incluy e limitan a di-metil caseína (Sigma C-9801) , col o (Sigma C-9879) , elastina de bovino (Sigma E- tina de bovino (ICN Biomedical 902111) . Los rimétricos que utilizan estos sustratos s
anilida (sAAPF-pNA) . La velocidad de producción llo desde la reacción de hidrólisis se mide a 4 spectrofotómetro y es proporcional a la concentr a activa. Además, la absorbancia medida a 280 e para determinar la concentración de proteína t ión enzima activa/proteína total da la purez a .
Como se usa en la presente, "el género Bacillus" S las especies dentro del género "Bacillus" e por aquellos de experiencia en la técnica, no se limita a B. subtilis , B. licheniformis, B. brevis, B. stearothermophílus, B. alkalophi oliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. meg oagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringie oce que el género Bacillus continúa experi ganización taxonómica. De esta manera, se pretend
obacillus, Ureibacillus, y Virgibacillus .
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" cambiablemente en la presente, se refieren a u érica de nucleótidos de cualquier longitud, ucleótidos o desoxirribonucleótidos . Estos yen, pero no se limitan a, un ADN de hebra s o triple, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido AD olímero que comprende bases dé purina y pirim S bases de nucleótido no naturales o de ficadas bioquímicamente, químicamente o natura Íentes ejemplos no limitantes de polinucleotidos entos de genes, fragmentos cromosomales , ESTs, nes, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinuc binantes, polinucleotidos ramificados, pi ores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN ai uier secuencia, sondas de ácido nucleico, y ce
a hospedera u organismo. El ADN puede generarse PCR o cualquiera de otras técnicas apropiadas c a técnica. En modalidades particularmente prefer ructo de ADN comprende una secuencia de ínte lo, como una secuencia de entrada) . En idades, la secuencia se liga operablemente a e ónales tales como elementos de control (por tores, etc.) . El constructo de ADN puede co s un marcador seleccionable . Puede comprende ad ncia de entrada flanqueada por cajas de homol odalidad adicional, el ADN transformante compren ncias no homologas, agregadas a los extrem lo, secuencias o flancos insertados) . En lidades, los extremos de la secuencia de ent an de tal manera que el ADN transformante lo cerrado. Las secuencias transformantes puede
óloga) , 3) eliminar genes objetivo, y/o 4) intro ido de replicación en el hospedero.
Como se usa en la presente, los términos "c sión" y "vector de expresión" se refieren a con ácido nucleico generados recombinanteme ticamente, con una serie de elementos de ácido cificados que permiten la transcripción de u ico particular en una célula objetivo. El c sión recombinante puede incorporarse en un p soma, ADN mitocondrial , ADN plástico, virus, o f cido nucleico. Típicamente, la porción del c esión recombinante de un vector de expresión e otras secuencias, una secuencia de ácido nu scribirse y un promotor. En modalidades preferi ores de expresión tienen la capacidad para inco esar fragmentos de ADN heterólogos en una
Como se usa en la presente, el término "vec re a un constructo de polinucleótido diseña ducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de cél res incluyen vectores de clonación, vect sión, vectores de transportación, plásmidos, c ares. En algunas modalidades, el co ucleótido comprende una secuencia de ADN que cod asa (por ejemplo, proteasa precursora o madura) operablemente a una prosecuencia apropiada (por toria, etc.) capaz de efectuar la expresión de spedero apropiado.
Como se usa en la presente, el término "plás re a un constructo de ADN de hebra doble (ds) como un vector de clonación, y que forma un ico auto-replicante extracromosomal en iotas o procariotas, o se integra en el c
shing Corp., páginas 57-72,
[1989]) .
Como se usa en la presente, los términos "trans ransformado establemente" se refiere a una cé una secuencia de polinucleótido no nativa (het rada en su genoma o como un plásmido episomal ene por al menos dos generaciones.
Un ácido nucleico se "liga operablemente", C
a en una relación funcional con otra secuencia ico. Por ejemplo, el ADN que codifica un líder es, un péptido de señal) , se liga operablement un polipéptido si se expresa como una preprot icipa en la secreción del polipéptido; el pr ciador se liga operablemente a una secue ficación si se afecta la transcripción de la secu itio enlazado a la ribosoma se liga operablemen encia de codificación si se coloca de manera que
olinucleótido (por ejemplo, un segmento de A fica un polipéptido e incluye regiones que pr n a las regiones de codificación así como secue rvención (introñes) entre segmentos de codi iduales (exones) .
Como se usa en la presente, "genes homólogos" se par de genes de especie diferente, pero us cionada, que corresponde una con la otra y ticas o muy similares una con la otra. El térmi barcado que se separan por especificación (est rrollo de especies nuevas) (por ejemplo, logos) , así como genes que se han separ icación genética (por ejemplo, genes parálogos) .
Como se usa en la presente, las proteínas se que tienen un "plegado" común si tienen la ucturas ^secundarias principales en la misma confi
ecen ciertas configuraciones de empacada y topól a) .
Como se usa en la presente, "homología" se r itud o identidad de secuencia, con identida rida. Esta homología se determina usando dar conocidas en la técnica (Ver por ejemplo, marr, Adv. Appl . Math . , 2 : 482
[1981]; Needleman y ol . Biol . , 48:443
[1970]; Pearson y Lipman, Pro Sci. USA 85:2444
[1988]; programas tales c ??, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Soft nsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison reux et al., Nucí. Acid Res., 12:387-395
[1984]).
Como se usa en la presente, una "secuencia aná donde la función del gen es esencialmente la mi en basado en la proteasa BPN'. Las secuencias aná rminan por métodos conocidos de alineado de secue
y Doolittle (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol . , 35 7] ) . El método es similar al que se describe por arp (Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 [198 etros PILEUP útiles incluyen un peso de eterminado de 3.00, un peso de longitud de eterminado de 0.10, y espacio terminales pesados.
Otro ejemplo de un algoritmo útil es el ^algoritm rito por Altschul et al., (Altschul et al., ., 215:403-410,
[1990]; y Karlin et al., Pro . Sci. USA 90:5873-5787
[1993]). Un program icularmente útil es el programa WU-BLAST-2 (Ver, l., Meth. Enzymol . , 266:460-480
[1996]). El WU varios parámetros de búsqueda, la mayoría de lo establecen para los valores predeterminad etros ajustables se establecen con los si res : empalme traslapado =1, fracción traslapada
" en la región alineada. La secuencia "más larg iene los residuos más actuales en la región aliñ an los espacios introducidos por WU-Blast izar el registro de alineado) .
De esta manera, "porcentaje {%) de ident ncia de ácido nucleico" se define como el porce úos de nucleótido en una secuencia candidato icos con los residuos de nucleótido de la secu ida (esto es, la secuencia de interés) . Un rido utiliza el módulo BLASTN del conjunto WU los parámetros predeterminados, con empalme tras ión traslapada establecido a 1 y 0.125, respecti
Como se usa en la presente, "recombinante" in rencia a una célula o vector, que se ha modificad oducción de una secuencia de ácido nucleico hete la célula es derivada de una célula así modifi
rico .
En algunas modalidades preferidas, las secuencia tes se generan con mutagénesis de saturación de menos un codón. En otra modalidad prefer énesis de saturación al sitio se realiza por d es. En una modalidad adicional, las secuencias tes tienen más de alrededor de 50%, más de alre más de alrededor de 60%, más de alrededor de 65% edor de 70%, más de alrededor de 75%, más de a %, más de alrededor de 85%, más de alrededor de lrededor de 95%, o más de alrededor de 98% de h la secuencia de tipo natural. En mod nativas, el ADN mutante se genera in vivo uier procedimiento mutagénico conocido tal c lo, radiación, nitrosoguanidina y similar ncía de ADN deseada se aisla entonces y se us
e) resulta en la amplificación de cualquiera eno que codifica el producto de gen requerido miento en presencia del fármaco o por la ampli ecuencia exógenas (esto es, de entrada) que c producto de gen, o ambos.
"Amplificación" es un caso especial de replic nucleico que involucra especificidad de plantil en contraste con la replicación de plant cífica (esto es, replicación que depende de la p no depende de una plantilla específic cificidad de plantilla se distingue aquí de la f replicación (esto es, síntesis de la secue ucleótido apropiada) y especificidad de nucleoti soxirribo) . La especificidad de plantilla se uentemente en términos de especificidad "objeti encias objetivo son "objetivos" en el sentido d
om lementario a una hebra de ácido nucleico se es, en la presencia de nucleótidos y un agente como polimerasa de ADN y a una temperatura ad
El cebador es de hebra preferiblemente senci encia ^ máxima en amplificación, pero nativamente es de hebra doble. Si es de hebra d or se trata primero para separar sus hebras e para preparar los productos de ex riblemente, el cebador es un oligodesoxirribonuc ebador debe ser suficientemente largo para c sis de productos de extensión en la presencia de tor. Las longitudes exactas de los cebadores de chos factores, incluyendo temperatura, fuente de uso del método.
Como se usa en la presente, el término "s ere a un oligonucleótido (esto es, una secu
tectable en cualquier sistema de detección, inc no limitado a enzima (por ejemplo, ELISA, a os histoquímicos con base en enzima) , escentes, radioactivos, y luminiscentes. No se la presente invención se limite a cualquier si ción particular o etiqueta.
Como se usa en la presente, el término "ob ? se usa en referencia a la reacción de ca erasa, se refiere a la región de ácido nucleico los cebadores usados para la reacción de ca erasa. De esta manera, el "objetivo" se busca e de otras secuencias de ácido nucleico. Un us efine como una región de ácido nucleico dentr ncia objetivo.
Como se usa en la presente, el término "rea a de polimerasa" ("PCR", por sus siglas en in
ación térmica en la presencia de una polimerasa dos cebadores son complementarios a sus ctivas de la secuencia objetivo de hebra dob o de amplificación, la mezcla se desnaturaliz ores luego alineados en sus pares base p ncías complementarias dentro de la molécula o és de la alineación en sus pares base, los ceba nden con una polimerasa como para formar un nuev s complementarias. Las etapas de desnatural ación en sus pares base del cebador y exte erasa pueden repetirse muchas veces (esto aturalización, alineación en sus pares base y é tituyen un wciclo" ; que puede ser numerosos
obtener una concentración alta de un ificado de la secuencia objetivo deseada. La long ento amplificado de la secuencia objetivo de
Como se usa en la presente, el término "reac ficación" se refiere a aquellos reactivos (tri desoxirribonucleótido, solución amortiguadora, arios para amplificación excepto para ce illa de ácido nucleico y la enzima de amplif amente, los reactivos de amplificación junto c nentes de reacción se colocan y están contenid íente de reacción (tubo de prueba, micropozo, et Como se usa en la presente, el término "RT- re a la replicación y amplificación de secue En este método, la transcripción inversa se más a menudo . usando un procedimiento de una enzi la polimerasa termoestable se emplea, como se a Patente de E.U.A. No. 5,322,770, incorporad nte como referencia. En RT-PCR, la plantilla d erte a ADNc debido a la actividad de trans
ótido reconocida y desdoblada por una endonuc icción dada y es frecuentemente el sitio para i os fragmentos de ADN. En ciertas modalidade ción los sitios de restricción se prepa iería en el marcador selectivo y en los extremos onstructo de ADN.
"Recombinación homologa" significa el interca entos de ADN entre dos moléculas de ADN o cromo s en el sitio de secuencias de nucleótido idé idénticas. En una modalidad preferida, la int somal es recombinación homologa.
Como se usa en la presente "aminoácido" se r ncias de péptido o proteína o porciones de las términos "proteína," "péptido," y "polipéptido" rcambiablemente .
Como se usa en la presente, "proteína de in
proteína a secretarse) . Casi todas las p tadas usan una extensión de proteína de termin juega un papel crucial en el direccionamiento subicación de proteínas precursoras a través rana . Esta extensión se remueve proteolít icamente idasa de señal durante o inmediatamente despué sferencia de membrana.
Un polinucleótido se dice que "codifica" un éptido sí, en su estado nativo o cuando se mani dos conocidos para aquellos de experiencia en la e transcribirse y/o traducirse para producir el éptido o un fragmento del mismo. La hebra anti al ácido nucleico también se dice que codi encias. Como se conoce en la técnica, un A scribirse por una polimerasa de ARN para produ un AR puede transcribirse inverso por trans
Los términos "proteína" y polipéptido" cambiablemente en la presente. El código de aminoácidos como se define de conformidad clatura IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemica sa a través de esta descripción. También se enti olipéptido puede codificarse por más de una secu ótido debido a la degeneración del código genéti
Una "prosecuencia" es una secuencia de aminoáci ecuencia de señal y la proteasa madura que es n la secreción de la proteasa. El desdoblamient cuencia resulta en una proteasa activa madura.
El término "secuencia de señal" o "péptido de s re a cualquier secuencia de nucleótidos y/o ami puede participar en la secreción de las formas m rsoras de la proteína. Esta definición de secu 1 es una funcional, significa que incluye todas
eñal exógena ejemplar comprende los primero úos de aminoácido de la secuencia de s lisina Bacillus subtilis enfocada al resto ncia de señal de la subtilisina de Bacillus lent ) .
El término "secuencia de señal híbrida" se r ncias de señal en la cual parte de la secu ne del hospedero de expresión enfocado a la secu del gen a expresarse. En algunas moda ncías sintéticas se utilizan.
El término forma "madura" de una proteína o pé re a la forma funcional final de la proteína o ejemplo, una forma madura de la proteasa de la ción incluye al menos la secuencia de am tica a las posiciones de residuo 1-275 de SEQ ID 1
El término forma "precursora" de una proteína o
"Enzima que se presenta naturalmente" se refie a que tiene la secuencia de aminoácido no mo tica a aquella encontrada en la naturaleza. Las se presentan naturalmente incluyen enzimas llas enzimas naturalmente expresadas o encontrad oorganismo particular.
Los términos "derivado de" y "obtenido de" se re olo una proteasa producida o producible por una nismo en cuestión, sino también una proteasa co una secuencia de ADN aislada de tal cepa y prod rganismo hospedero que contiene tal secuencia ionalmente, -el término se refiere a una proteas fica por una secuencia de ADN de origen sinté y que tiene las características identificada easa en cuestión.
Un "derivado" dentro del alcance de esta de
El término "derivado funcional" se refiere a un un "ácido nucleico que tiene las caracte ionales de un ácido nucleico que codifica l asa. Los derivados funcionales de un ácido nucl fica la serina proteasa de la presente invención s nucleicos que se presentan natur éticamente o recombinantemente producidos o fragi fica la característica de la serina proteas nte invención. El ácido nucleico de tipo nat fica las serina proteasas de acuerdo con la i ye alelos que se presentan naturalmente y homol en la degeneración del código genético conoci ica.
El término "idéntico" en el contexto de do eicos o secuencias de polipéptido se refier dúos en las dos secuencias que son las mismas c
eído nucleico/secuencia de polinucleótido," con s secuencias de aminoácido, polinucleótido y/o g propiado) , se refieren al porcentaje de residuos icos en las dos secuencias cuando las secuenci ámente alineadas en sus pares base. De esta man dentidad de secuencia de aminoácido significa qu aminoácidos en dos secuencias de polipéptido ópt adas en sus pares base son idénticas.
La frase "sustancialmente idéntica" en el con cidos nucleicos o polipéptidos de esta manera se polinucleótido o polipéptido que comprende edor de 70% de identidad de secuencia, preferi eños alrededor de 75%, preferiblemente al menos a
80%, preferiblemente al menos alrededor eriblemente al menos alrededor de 90%, preferible s alrededor de 95%, preferiblemente al menos aire
ológicamente reactivos cruzados. De esta man éptido es sustancialmente idéntico a un éptido, por ejemplo, donde los dos péptidos por una sustitución conservadora. Otro indicio secuencias de ácido nucleico son sustanc icas es que las dos moléculas hibridan a cada s bajo condiciones estrictas (por ejemplo, dent valo de severidad media a alta) .
La frase "equivalente," en este contexto, se r enzimas de serina proteasas que se codifican ucleótido capaz de hibridar al polinucleótido q ecuencia como se muestra en la SEQ ID NO: iciones de severidad media a máxima. Por ejem alente significa que una serina proteasa alente comprende al menos alrededor de 70%, dedor de 75%, al menos alrededor de 80%, a
ial que se remueve de su ambiente original (por mbiente natural si se presenta naturalment ío, el material se dice que está "purificado" c nta en una composición particular en una conce ior o inferior que existe en un organismo nta naturalmente o de tipo natural o en combina nentes normalmente no presentes durante la expr rganismo que se presenta naturalmente o de tipo jemplo, un polinucleótido o polipéptido que se aímente presente en un animal vivo no se aisla, polinucleótido o polipéptido, separado de al de los materiales coexistentes en el sistema isia. En algunas modalidades, tales polinucleót de un vector, y/o tales polinucleótidos o poli parte de una composición, y todavía se aislará r o la composición no es parte de su ambiente
sistemas de producción de proteína genét rada por ingeniería. Tales moléculas aisla ias que se separan de su ambiente natural e y clones genómicos . Las moléculas de ADN aislad nte invención están libres de otros genes con lo socian ordinariamente, pero pueden incluir reg cidas 5' y 3' que se presentan naturalmente tores y terminadores . La identificación de iadas será evidente para alguien de experiencia o a técnica (ver por ejemplo, Dynan and Tijan, 774-78
[1985]) . El término "una secuencia de ADN rnativamente se refiere como "una secuencia ada" .
El término "aislado," cuando se usa en refere proteína, se refiere a una proteína que se encu condición diferente a su ambiente nativo. En u
I
que alrededor de 90% pura, mayor que alrededo , mayor que alrededor de 97% pura, y aún m edor de 99% pura) , como se determina por SDS-PAG Como se usa en la presente, el término, "mut inatoria" se refiere a métodos en los cua ciones de variantes de una secuencia de pa rán. En estas colecciones, las variantes contien rsas mutaciones elegidas de un conjunto predef ciones. Además, los métodos proporcionan medi ducir mutaciones aleatorias que no fueron miem nto predefinido de mutaciones. En algunas moda étodos incluyen aquellos establecidos en la Soli te de E.U.A. No. de Serie 09/699.250, presenta octubre de 2000, incorporada en la presen rencia. En modalidades alternativas, los mét génesis combinatorios abarcan kits comerc
efiere a un gen de interés que abarca una pro és que es para mejorarse y/o cambiarse US nte invención.
Como se usa en la presente, el término "aline ncia múltiple" ( "MSA" , por sus siglas en in re a las secuencias de homólogos múltiples de u ida que se alinean en sus pares base usando el a ejemplo, Clustal W) .
Como se usa en la presente, los términos "secu enso" y "secuencia canónica" se refieren a una S minoácido arquetípico contra la cual todas las V una proteína particular o secuencia de int aran. Los términos también se refieren a una s establece los nucleótidos que están a men entes en una secuencia de ADN de interés. P ción de un gen, la secuencia de consenso da el am
yen cambios de aminoácido que cambian un amino en de partida a un aminoácido que se encue entemente en una MSA en tal posición con relac encia de tal aminoácido en el gen de partida, a, el término mutación de consenso comprende t ios de aminoácido sencillos que reemplazan un ara en de partida con un aminoácido que es más abund inoácido en la MSA.
Como se usa en la presente, el término "acierto efiere a una variante que se identificó al sep sión una biblioteca de mutagénesis de inatoria. En modalidades preferidas, los iales tienen características de desempeño mejorad ompara con el gen de partida.
Como se usa en la presente, el término rado" se refiere a una variante que se ident
idades, las mutaciones que se encuentr entemente en los aciertos son probablemen iones mejoradas, como se compara con una bibli énesis de consenso combinatoria no separ sión .
Como se usa en la presente, el término "bibli énesis de consenso combinatoria potenciada" se r iblioteca CCM que se diseña y construye con bas itados de separación por exclusión y/o proces ncia de " una ronda anterior de mutagénesis ación por exclusión. En algunas modalida ioteca CCM potenciada es con base en la secuenc rto inicial resultando de una ronda anterior de Üdades adicionales, el CCM potenciado está dis ra que las mutaciones que se observaron frecuente rtos iniciales de rondas anteriores de mutag
ntran menos frecuentemente en aciertos que res separación por exclusión como se compara oteca de mutagénesis de consenso combinat ada por exclusión. En modalidades preferidas, el eparacion por exclusión remueve y/o reduce la ab variantes que contienen "mutaciones que red perio . "
Como se usa en la presente, el término ional" se refiere a un ensayo que proporciona un na actividad de proteína. En modalidades particu ridas, el término se refiere a sistemas de ensay s una proteína se analiza por su capacid ionar en su capacidad usual. Por ejemplo, en el as, un ensayo funcional involucra determ tividad de la enzima al catalizar una reacción.
Como se usa en la presente, el término "p
trará uso en la presente invención.
El término "propiedad" o equivalentes gramátic en el contexto de un ácido nucleico, como se u nte, se refieren a cualquier característica o ? ácido nucleico que puede seleccionarse o dét propiedades incluyen, pero no se limitan iedad que afecta el enlace a un polipépti iedad conferida en una célula que comprende ico particular, una propiedad que afe scripción del gen (por ejemplo, resistencia del p ocimiento del promotor, regulación del promotor, ciadora) , una propiedad que afecta el procesami (por ejemplo, empalme de ARN, estabilidad ormación de ARN, y modificación post-transcrip propiedad que afecta la traducción (por ejemplo lación, enlace de AR m a proteínas ribo
seleccionarse o detectarse. Estas propiedades i no se limitan a estabilidad oxidante, especific ato, actividad catalítica, estabilidad ilidad alcalina, perfil de actividad del pH, res radación proteolítica, relación KM, kcat, kcat/kM/ roteína, inducir una respuesta inmunitaria, c enlazar a un ligando, capacidad para enlaz tor, capacidad para secretarse, capacidad para m a superficie de una célula, capacidad para oligo idad para señalar, capacidad para estim iferación celular, capacidad para inhi iferación celular, capacidad para inducir ap idad para modificarse por fosforilación o glicos apacidad para tratar la enfermedad, etc.
Como se usa en la presente, el término "separa sión" tiene su significado usual en la técnica
nucleico mutante.
Será evidente para el técnico experimentado dimiento de separación por exclusión para ob nucleico o proteína con una propiedad alterada propiedad del material de partida la modificaci la generación del ácido nucleico mutante se facilitarse. El técnico experimentado por 1 ciará que la invención no se limita a ninguna p cífica para separarse por exclusión para y íente descripción de propiedades enlista sólo trativos. Los métodos para separación por exclus quier propiedad particular se describen generali écnica. Por ejemplo, una puede medir el enl cificidad, etc., antes y después de la mutación, cambio indica una alteración. Preferiblemen raciones por exclusión se realizan en una m
ecimiento al organismo hospedero, así como exhib o cualquier otro método de exhibición, do ntes pueden capturase de una población de varia en su enlace o propiedades catalíticas. En una m rida, una biblioteca de variantes se expone a r, proteasa, desnaturalización) y posteriorme antes que todavía están intactas se identifica ración por exclusión o enriquecidas por selec nde que el término abarque cualquier medio adecu cción. De hecho, no se pretende que la presente i imite a ningún método particular de separac sión.
Como se usa en la presente, el término "aleato tivo" se refiere a un proceso que produce una pl secuencias donde una o diversas posiciones torizado. En algunas modalidades, la aleatorizac
0 aminoácidos o un subconjunto de aminoácidos, mina por el esquema de aleatorización de orizado. En algunas modalidades, los t iduales de una población resultan de aleato ivo diferida en el número de aminoácidos, d ción o eliminación objetiva o aleatoria de cod idades adicionales, los aminoácidos sintéti yen en las poblaciones de proteína produci as modalidades preferidas, la mayoría de los mier oblación resultan de aleatorización objetivo que homología de secuencia para la secuencia de l gen de partida. En algunas modalidades, la s ica una o más proteínas de interés. En mod nativas, las proteínas tienen diferentes i gicas. En algunas modalidades preferidas, la s nte comprende al menos un marcador seleccionab
roducto de expresión de la secuencia modificada ína truncada (por ejemplo, si la modificación nación o interrupción de la secuencia) . En idades particularmente preferidas, la proteína ne la actividad biológica. En modalidades alter roducto de expresión de la secuencia modificad ína alargada (por ejemplo, modificaciones que co inserción en la secuencia de ácido nucleico) . En Üdades, una inserción lleva a una proteína trunc lo, cuando la inserción resulta en la formaci de paro) . De esta manera, una inserción puede a sea una proteína truncada o una proteína alarg roducto de expresión.
Como se usa en la presente, los términos "s te" y "gen mutante" se usan intercambiablemen eren a una secuencia que tiene una alteración en
sponden a una porción de la secuencia de plantil capaces de hibridarlas . Con respecto a c énicos, el cebador no precisamente igualará ico de plantilla, el no emparejado o no empare ebador se usan para introducir la mutación desea ioteca de ácido nucleico. Como se usa en la p dor no mutagénico" u "oligonucleótido no mutagé re a composiciones de oligonucleótidcT que emp isamente al ácido nucleico de plantilla. En una m a invención, solo se usan cebadores mutagénicos. lidad preferida de la invención, los cebadores se anera que para al menos una región en la cual un énico se ha incluido, existe también el ce génico incluido en la mezcla de oligonucleót gar una mezcla de cebadores mutagénicos y ceba énicos correspondientes a al menos uno de los
úo dado. Los métodos de la invención nucleótidos mutagénicos y no mutagénicos qu aímente entre 10-50 bases de longitu riblemente alrededor de 15-45 bases de longit go, puede ser necesario usar cebadores que son cortos que 10 bases o más largos que .50 bas er el resultado de mutagénesis deseado. Con re ores mutagénicos y no mutagénicos correspondient ario que los oligonucleótidos correspondientes tud idéntica, pero solo que existe traslape en l spondiente a la mutación a agregarse. Los c n agregarse en una relación pre-definida de acue nte invención. Por ejemplo, si sé desea oteca resultante tenga un nivel importante de un ión específica y una cantidad menor de una ente en el mismo o diferente sitio, al aju
iones contiguas pueden estar adyacentes o cerc la otra, sin embargo, se introducirán en los icos de plantilla mutantes resultantes por e or .
Como se usa en la presente, la frase "mu ntiguas" se refiere a mutaciones que se pres ores de oligonucleótido separados. Por ejemp iones discontiguas se introducirán en los icos de plantilla mutantes resultantes por ceba nucleótido separadamente preparados.
Los términos "secuencia de tipo natural," o "gen al" se usan intercambiablemente en la presen ir a una secuencia que es nativa o se raímente en una célula hospedera. En algunas moda ecuencia de tipo natural se refiere a una secu rés que es el punto de partida de un proyecto
ión de esta subtilisina particular pero se ex asas precursoras que contienen residuos de amino iones que son "equivalentes" ¦ a los ificados particulares en la subtilisina liquefaciens .
Como se usa en la presente, los términos "modif utación" se refieren a cualquier cambio o alter secuencia de aminoácido. Se pretende que el ue sustituciones, eliminaciones, insercion lazo de cadenas laterales de aminoácido en una s minoácido de interés (por ejemplo, una secu ilisina) . También se pretende, que el término ficación .química de una secuencia de aminoá rés (por ejemplo, una secuencia de subtilisina) .
Como se usa en la presente, el término wanticue ere a inmunoglobulinas . Los anticuerpos incluyen
nes que determinan la complementariedad (CDRs, s en inglés) , regiones variables de fragmento d lla (scFv, por sus siglas en inglés) , región var a pesada (VH, por sus siglas en inglés) , región cadena ligera (VL, por sus siglas en inglé uerpos policlonales y monoclonales también se la presente invención. Preferiblemente, los ant anticuerpos monoclonales.
El término "oxidación estable" se refiere a prot resente invención que mantienen una cantidad es ctividad enzimática durante un periodo de tie condiciones que predominan durante el eolítico, de hidrolización, limpieza u otro proce nción, por ejemplo mientras se exponen a o se acto con los agentes blanqueadores o agentes ox lgunas modalidades, las proteasas mantienen
minutos, alrededor de 20 minutos, etc. En lidades, la estabilidad se mide como se describ íos .
El término "quelador estable" se refiere a prot resente invención que mantienen una cantidad es ctividad enzimática durante un periodo de tie condiciones que predominan durante el eolítico, de hidrolización, limpieza u otro proce ción, por ejemplo mientras se exponen a o se acto con agentes quelantes. En algunas modalida easas mantienen al menos alrededor de 50%, aire alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor dedor de 85%, alrededor de 90%, alrededor dedor de 95%, alrededor de 96%, alrededor dedor de 98%, o alrededor de 99% de a eolítica después del contacto con un agente
? . dado bajo condiciones que predominan dur so proteolítico, de hidrolización, limpieza so de la invención, por ejemplo mientras se e raturas alteradas. Las temperaturas alteradas raturas incrementadas o disminuidas. En idades, las proteasas mantienen al menos alre alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor edor de 80%, alrededor de 85%, alrededor edor de 92%, alrededor de 95%, alrededor edor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de idad proteolítica después de la exposi raturas alteradas durante un periodo de tiempo d lo, al menos alrededor de 60 minutos, alrededo os, alrededor de 180 minutos, alrededor de 240 edor de 300 minutos, etc. En algunas modalid estabilidad se determina como se describe
e refiere a una actividad inferior proteolítica te el tiempo como se compara con otras serina p ejemplo, proteasas de subtilisina) y/o enzimas al .
El término "actividad de limpieza" se ref peño de limpieza alcanzado por la protea iciones que predominan durante el proceso prote Ídrolización, limpieza u otro proceso de la inven as modalidades, el desempeño de limpieza se d la aplicación de varios ensayos de limpieza con pas sensibles a la enzima, por ejemplo pasto, , o proteína de huevo como se determina po ologías cromatográficas , espectrofotométricas titativas después del sometimiento de las iciones de lavado estándares. Los ensayos ej yen, pero no se limitan a aquellos descrito
s factores, tal como la proteasa particular u ación de limpieza, la composición específica sición de limpieza, y si una composición líqui ejemplo, en gránulo, barra) se requiere, etc.
El término "materiales adjuntos de limpieza," en la presente, significa cualquier material o o gaseoso seleccionado para el tipo parti sición de limpieza deseada y la forma del produ lo, líquido, gránulo, polvo, barra, pasta, rimido, gel; o composición de espuma), cuyos ma ién son preferiblemente compatibles con la e easa usada en la composición. En algunas modalida siciones granulares están en forma - "compacta" , en otras modalidades, las composiciones líquidas forma "concentrada" .
El término "desempeño potenciado" en el con
rmina por evaluación usual después de un .c do e stándar .
El término "desempeño comparativo" en el con idad de limpieza se refiere a al menos alrededor ños alrededor de 70%, al menos alrededor de 80% edor de 90%, o al menos alrededor de 95% de la a impieza de una subtilisina proteasa compárat lo, proteasas comercialmente disponibles) , in no limitado a proteasa OPTIMASE™ (Genencor) , p proteasa PURAFECT™ (Genencor) , proteasa s zymes) , variantes de BPN' (Ver por ejemplo, Pa . No. Re 34,606), RELASE™, DURAZY E™, EV asa KANNASE™ (Novozymes) , MAXACAL™, MAXAPEM™ , p RASE™ (Genencor; Ver también, Patente de E.U.A. 6, y Patente de E.U.A. Nos. 5,700,676; 5, ,936; y 6,482,628), y productos de proteasa vari
cto a cepas sensibles a enzima tal como pasto, e como se determina por metodologías espectrofoto alíticas usuales después de las condiciones de do estándares.
Como se usa en la presente, composiciones de tela" incluyen composiciones de detergen ndería y para manos incluyendo composiciones adi dería y composiciones adecuadas para uso en el pretratamiento de telas teñidas (por ejemplo, elerías, y otros materiales textiles) .
Como se usa en la presente, "composiciones de no tela" incluyen composiciones de limp rficie no textil (esto es, tela) , incluyendo tadas a composiciones detergentes de la osiciones de limpieza bucales, composiciones de entadura, y composiciones de limpieza personales.
ctas, la sal rellenadora está presente en cantid er alrededor de 15% de la composición total. En idades, la sal rellenadora está presente en ca no exceden alrededor de 10%, o más preferib edor de 5%, en peso de la composición. En lidades, las sales rellenadoras inorgáni cionan de las sales de metal alcalino y alcali ulfatos y cloruros. Una sal rellenadora pref to de sodio.
Como se usa en la presente, el término "tensioac re a cualquier compuesto generalmente reconoci ea que tiene cualidades activas de la superfi ioactivos generalmente incluyen compuestos an nicos, no iónicos, y zwiteriónicos , que se d s, en la presente.
Como se usa en la presente, los términos "
I ENTAL
La presente invención se describe en detalle a s siguientes Ejemplos que de ninguna manera se p limiten el alcance de la invención como se rei"
Figuras anexas están destinadas para considera s integrales de la especificación y descripció ción. Los siguientes Ejemplos se ofrecen para i no para limitar la invención reivindicada.
En la descripción experimental que sigue, apl entes abreviaturas: ppm (partes por millón); M ilimolar) ; µ? (micromolar) ; nM (nanomolar) ; mol (milimoles) ; mol (micromoles) ; nmol (nanomol os) ; mg (miligramos) ; (microgramos) ; pg (pico itros) ; mi y mL (mililitros) ; µ? y ]ih (microlit ímetros) ; mm (milímetros) ; µt? (micrómetro metros) ; U (unidades) ; V (volts) ; PM (peso mol
irribonucleótido) ; AR (ácido ribonucleico) uro de magnesio) ; NaCl (cloruro de sodio) ; p volumen) ; v/v (volumen hasta volumen) ; g (grave idad óptica) ; PI (índice de desempeño) ; iguada en fosfato de Dulbecco (DPBS) ; SOC ona al 2%, Extracto de Levadura Bacto al 0.5%,
KC1 2.5 mM) ; Caldo Terrífico (TB; 12 g/l Bacto T
i /1 glicerol, 2.31 g/l KH2P04/ y 12.54 g/l K2HP0 idad óptica a 280 nm) ; OD60o (densidad óptica a (absorbancia a 405 nm) ; Vmax (la velocidad inicia a reacción catalizada por enzima) PAGE (electr el de poliacrilamida) ; PBS (solución salina amo osfato [NaCl 150 mM, solución amortiguadora de fo 10 mM, pH 7.2]); PBST (PBS+TWEEN® 20 al 0.2 ietilen glicol) ; PCR (reacción de cadena de poli CR (PCR de transcripción inversa) ; SDS (sulfato
o s, 5-dimetoxi-4-hidroxi cinámico); TCA oroacético) ; Glut y GSH (glutationa reducida ationa oxidada); TCEP (Tris [2 -carboxietil] fosfi es) ; mCi (miliCuries) ; xCi (microCuries) atografía líquida de alta presión) ;
atografía líquida de presión alta de fase inver atografía de capa delgada) ; M rción/ionización láser asistido por matiz- -ti ctoria) ; Ts (tosil) ; Bn (bencilo) ; Ph (feni lo) ; Et (etilo) , Me (metilo) ; Taq (polimerasa us aquaticus) ; Klenow (fragmento grande de polim I (Klenow)); EGTA (ácido de etilen glicol-bis (ét etilo) N, N, N' , ' -tetraacético) ; EDTA ndiamintetracético) ; bla (ß-lactamasa o stencia a ampicilina) ; HDL (líquido de alta densi arch (MJ Research, Reno, NV) ; Baseclear (Basec
wick (New Brunswick ScientifiC; Co. , Edison, er for Test Materials, Vlaardingen, Países Bajo cs (Test Fabrics, Inc., West Pittiston, PA) , P e (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, hcare (GE Healthcare, Chalfont St . Giles, om) ; 0X0ID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, RU) ; zyme International Ireland Ltd., Bray Busines , Co., Wicklow, Irlanda) ; Finnzymes (Finnzymes Oy ndia) ; Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE) ; ing Life Sciences, Corning, NY) ; (NEN (NEN Life cts, Boston, MA) ; Pharma- AS (Pharma AS, Oslo, N (Dynal, Oslo, Noruega) ; Bio-Synthesis (Bio-Sy ville, TX) ; ATCC (American Type Culture Col ille, MD) ; Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Islan (Sigma Chemical Co, St . Louis, M0) ; V rmacia Biotech, Piscataway, NJ) ; NCBI (Nationa
sburg, Y) ; Worthington (Worthington Biochemica old, NJ) ; GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Techn , Gaithersburg, MD) ; Millipore (Millipore, Bi Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) ; Invitrogen (In ., San Diego, CA) ; EB (New England Biolabs,
Sigma (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) ; ce Biotechnology, Rockford, IL) ; Takara (Takara , Japón) ; Roche (Hoffmann-La Roche, Basilea, Su ce (EM Science, Gibbstown, NJ) ; Qiagen (Qiage cia, CA) ; Biodesign (Biodesign Intl., Saco, en (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (marca endro Laboratory Products, Asheville, NC) ; Unite ing (United States Testing Co . , Hoboken, NJ) ; M ees (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, G ems (R&D Systems, Minneapolis, MN) ; St atagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ; Mars
Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA) ;
anto Co. , St . Louis, MO) ; Wintershall (Winters l, Alemania); BASF (BASF Co., Florham Par man (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake Ci em (Enichem Ibérica, Barcelona, España) ; Fluka C a Chemie AG, Buchs, Suiza) ; Gist-Brocades des, NV, Delft, Países Bajos) ; Dow Corning (Dow ., Midland, MI); y Microsoft (Microsoft, Inc.,
EJEMPLO 1
Ensayos
En los siguientes Ejemplos, varios ensayos s se establece a continuación para facilitar la quiera de las desviaciones de los pr orcionados a continuación se indica en los Ejempl
.25 N se colocó en cada pozo. Luego, 50 yL de vo filtrado se agregó. La dispersión/absorbanci 5 nm (usa modo de mezclado en 5 seg en el l ) luego se determinó, con objeto de proporci ra en "blanco". Para la prueba, 100 pL/pozo oroacético (TCA) al 15% (p/v) se colocó en las ó entre 5 y 30 min a temperatura ambie rsión/absorbancia de luz a 405 nm (usa modo de seg en el lector de placa) luego se determinó.
Para GG36 (por ejemplo, proteasa de refere ntes del mismo, este ensayo se realizó nadante de cultivo filtrado de placas de microti do aproximadamente en 3 días a 37°C con agitaci y aeración humidificada . En este ensayo 100 L ión HCl 0.25 M se agregó a cada pozo de una titulación de fondo plano de 96 pozos. Posteri
usando el modo de mezclado en 5 seg en el l ) se determinó.
El equipo usado fue un Lector MTP Biomek F man Coulter) y uno SpectraMAX (tipo 340; M es) ; los MTP fueron de Costar (tipo 9017) . E fue un Lector MTP Biomek FX Robot (Beckman Co pectraMAX tipo 340 (Molecular Devices) ; y los MT 9017 (Costar) .
Los cálculos se realizaron al sustraer el bla de la lectura de prueba con TCA para proporci ción relativa del contenido de proteína en las m e desea, una curva estándar puede crearse al cali ras TCA con ensayos AAPF de clones con fac ersión conocidos. Sin embargo, los resultados ales con respecto a concentración de proteína a 500 de proteína por mi (ppm) y puede de est
asas y variantes de la misma de la presente in hidrólisis de N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-p -p-nitroanilida ( suc-AAPF-pNA) se midió. Las so eactivo usadas fueron: Tris/HCl 100 mM, pH 8 ene TWEEN®-80 0.005% (solución amortiguadora de ) ; solución amortiguadora de Tris 100 mM, pH ene CaCl2 10 m y TWEEN®-80 al 0.005% ( iguadora de Tris/Ca) ; y suc-AAPF-pNA 160 mM ción madre de suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388 rar una solución de trabajo suc-AAPF-pNA, 1 ión madre de suc-AAPF-pNA se agregó a 100 mi de iguadora Tris/Ca y mezcló bien durante al dos . El ensayo se realizó al agregar 10 µ? de roteasa diluida a cada pozo, inmediatamente seg dición de 190 µ? 1 mg/ml de solución de trabajo -pN . Las soluciones se mezclaron durante 5 se
ual determinada usando en ensayo AAPF.
o de Estabilidad LAS
tivos :
cilbencensulfonato, sal de sodio (=LAS) : Sigma D- ®-80: Sigma P-8074
ción amortiguadora de TRIS (ácido libre) : Sigma g se disuelve en alrededor de 960 mi de agua ta hasta 8.2 con HCl 4 . Concentración final de mM.
ción madre LAS: Preparar una solución LAS al 1 MQ (=10.5 g por 100 mi MQ)
ción amortiguadora TRIS- 100 mM / pH 8.6 ( een®-80 al 0.005%)
ción amortiguadora TRIS-Ca, pH 8.6 (Tris 100 mM/ /Tween-®80 al 0.005%)
o:
Una solución LAS al 0.063% se preparó en iguadora Tris 52.5 mM pH 8.2. La solución de tr APF-pNA se preparó al agregar 1 mi de 100 ión madre suc-AAPF-pNA (en DMSO) hasta 100 mi olución amortiguadora TRIS, pH 8.6. Para dil nadantes, las placas de fondo redondo se rellen ión amortiguadora de dilución y una alícu nadante se agregó y mezcló bien. La relación de de de la concentración de los controles de pro placas de crecimiento (actividad AAPF) . La conce oteína deseada fue 80 ppm.
Diez µ? del sobrenadante diluido se agregaron olución amortiguadora LAS al 0.063%/pozo. El ió con cinta, agitó durante unos pocos segundos na incubadora (Innova 4230) a 45°C por BPN' te 60 minutos en agitación a 200 rpm. La a
minó como se describe arriba. La estabilidad ras se determinó al calcular la relación de la a residual e inicial como sigue:
Residual Actividad (%) = [valor t-60] *100/ [valor
o de estabilidad LAS/EDTA
La estabilidad de las variantes de proteasa ncia de un tensioactivo aniónico repres sulfonato de alquilbeno lineal, dodecilbencens odio-DOBS) y EDTA de di-sodio se midió despué ación bajo condiciones definidas y la actividad eterminó usando en ensayo AAPF. Los reactivo n sulfonato de dodecilbenceno, sal de sodio (DOB D-2525) , TWEEN®-80 (Sigma No. P-8074) , EDTA de fried Handel No. 164599-02) , HEPES (Sigma No. ción amortiguadora sin tensión: HEPES 50 mM (11.
tramax Plus 384 (Molecular D badora/Agitador iEMS (1 mra de amplitud) tron Corporation), cinta de sellado: Nunc (236 La incubadora/agitadora iEMS (Thermo/Labsyst tó a 29°C. Los sobrenadantes de cultivo se d placas que contienen solución amortiguad ión a una concentración de ~ 25 ppm (p ción principal) . 20 µ? de muestra de la p ción principal se agregó a placas que contie e solución amortiguadora sin tensión para entración de incubación final de 2.5 p enidos se mezclaron y mantuvieron a tem ente y un ensayo AAPF se realizó en esta plac uestra de la placa de dilución principal ta gó a placas que contienen 180 µ? tiguadora de tensión (HEPES 50 mM (11.9 g/1),
sayos de Desempeño de Limpieza
El desempeño de eliminación de tinción de las v proteasa se determinó en detergentes comerc nibles. La inactivación con calor de fórm gente comerciales sirve para destruir la a ática de cualquiera de los componentes de ras que mantiene las propiedades de los compon áticos. De esta manera este método fue adecú rar detergentes comercialmente adquiridos para r las variantes de enzima de la presente invenci
muestras:
Las micromuestras de 1/4" (0.635 cm) de lar se obtuvieron de CFT . Micromuestras sencill omuestras se colocaron verticalmente en cada po de 96 pozos para exponer el área de superficie
de superficie completa (esto es, sin ser plan del pozo) . La solución de detergente deseada se se describe en la presente. Después de equil mezclador a 25°C, 190 µ? de solución de deter ó a cada pozo del MTP, que contiene micromue mezcla, 10 µ? de la solución de enzima diluida s anera que la concentración de enzima final fue rminado del ensayo BCA) . El MTP se selló con ó en la incubadora durante 30 minutos, con agi rpm. Después de la incubación bajo las con iadas, 100 µ? de la solución de cada pozo se tr n MTP fresco. El MTP nuevo que contiene 10 ión/pozo se leyó a 405 nm usando un lec raMax. Los controles en blanco, así como un con iene dos micromuestras y detergente pero no ién se incluyeron.
ada pozo de una placa de fondo V de 96 pozos ) usando una pipeta de 8 canales. Las placas se C durante 1 hora y enfriaron a temperatura ambie s de sustrato de yema de huevo cocinado se almac ratura ambiente y usaron dentro de una se ración. Los detergentes para platos automát raron como se describe en cualquier lugar ento y pre- calentaron hasta 50°C. Una alícuota d etergente se agregó a cada pozo de la placa de o una pipeta de 8 canales. Diez ih de enzima di ó a cada pozo usando un dispositivo de pipet ies. La placa se selló cuidadosamente con un sel l aluminio adhesivo e incubó a 50°C con agitación in. Luego, 120 µL de la mezcla de reacción se tr a nueva placa de fondo plano de 96 pozos, y la di bsorbancia/luz se determinó a 405 nm. La dispe
da con muestras de pigmentos (CS-38) se obtuv r for Test Materials. Antes del corte muestras circulares de 0.25 pulgadas (0.635 cm) , avó con agua. Una micromuestra se colocó en cada placa de microtitulación de 96 pozos. El deter a se equilibró a 50°C. 190 µ? de solución de de gregó a cada pozo del MTP, que contiene micromue mezcla, 10 µ? de la solución de enzima dil ó. El MTP se selló con papel aluminio adhesivo a incubadora durante 30 minutos, con agitación, a incubación, 100 µ? de la solución de cada sfirió en un MTP fresco. Este MTP se leyó a 405 n ector MTP SpectraMax. Los controles en blanco, controles que contienen micromuestras y deterge zima también se incluyeron.
de 30 minutos, continuamente durante los primer os y ocasionalmente durante los 25 minutos re és del proceso de fijación, la solución se de muestras se enjuagaron 6 veces con aproximad s de agua destilada por enjuague. Después del uestras se colocaron en la parte superior de las pel para secarse. Las muestras secadas con aire raron usando una boquilla circular de ¼" (0.63 prensa de expulsión. Finalmente, una micr lla se colocó en cada pozo de un MTP de 9 calmente para exponer el área de superficie es sin ser planas en el fondo del pozo) .
ra wpre- lavada"
Este tipo de micromuestra se pre-lavó nizada durante 20 minutos a temperatura a
rgentes
Para detergentes de lavandería líquidos para do (HDL) de Europa Occidental (WE) y América d , la inactivación con calor se realizó al rgente líquido pre-pesado (en una botella de vi año de agua a 95°C durante 2 horas. El t bación para inactivación por calor de deterg dería granulares para trabajo pesado (HDG) ) y de América del Norte (NA) fue 8 horas rgente HDG de Europa Occidental (WE) fue 5 h po de incubación pa a inactivación por c rgentes de auto lavaplatos (ADW) NA y WE fue 8 ho rgentes se adquirieron de tiendas de supe les. Ambos detergentes calentados como no calen esaron por ensayo dentro de 5 minutos al dis rgente para determinar exactamente el p
otellas .
Tabla 1-1. Condiciones de Lavaplatos y lavandería
reviaturas : Procter & Gamble (P&G); y Reckitt B
El desempeño de eliminación de tinción de la asas de referencia y variantes de las mi muestras se determinó en una escala MTP en de rcialmente disponible (Calgonit 5 en 1) . Los r
Tabla 1-2. Soluciones de Detergente de Trabajo
La incubadora se ajustó a la temperatura deseada ) . 10 µ?. de muestras de la placa de dilución prin a -10 ppm se agregó a placas de BMI 2 -muestra co oluciones de detergente de trabajo enlistadas ar en se ajustó para dar concentración final de variantes en las placas de ensayo. Las pi firieron inmediatamente a incubadoras iEMS e i te 30 minutos con agitación 1400 rpm a temperatu és de la incubación, 100 L de sobrenad sfirió en una placa de 96 pozos nueva y la absorb en Lector MTP a 405nm y/o 600nm. Los pozos de
blanco (sustrato sin enzima) , proporciona ión de actividad hidrolítica. Para cada ante) el índice de desempeño se calculó. El í peño compara el desempeño de la variante (valor a enzima estándar (valor teórico) en l ntración de proteína. Además, los valores n calcularse, usando los parámetros de la uir de la enzima estándar.
as y Equipo
Las muestras de variantes de serina prote encia de las mismas se obtuvieron de caldo de rado de cultivos crecidos en placas MTP. El equi un Biomek FX Robot (Beckman Coulter) , un Le raMax (tipo 340; Molecular Devices) adora/agitador iEMS- (Thermo/Labsystems) ; MTP de
Ctividad Específica Relativa de Proteasas y Vari sma
Con objeto de discriminar las variantes de prot idad específica relativa aparente se calculó usa - NA como un sustrato, que permite la compa ificación de las variantes contra la proteasa al o estándar. La actividad específica en el APF-pNA se determinó al dividir la a olítica por los valores TCA medidos de cada o los ensayos descritos arriba. Usando estos val idad específica relativa se calculó (a cífica de actividad variante/específica de pro rencia) .
esempeño de Lavaplatos
El desempeño de las variantes de proteasa se pr
Tabla 1-3. Detergente Libre de Fosfato
IEC-60436 WFK tipo B (pH = 10.4 en 3 g/L)
Componente % en p hidrato de citrato de sodio 30.0
de sodio de copolímero de ácido 12.0
eico/ácido acrílico
ohidrato de perborato de sodio 5.0
D 2.0
ilicato de sodio: Protil A (Cognis) 25.0
xilato de alcohol de grasa lineal 2.0
idro carbonato de sodio Agregar has
Tabla 1-4. Detergente que Contiene Fosfato IEC-60436 WFK tipo C (pH = 10.5 en 3 g/L)
Componente % en polifosfato de sodio 23.0
hidrato citrato de sodio 22.3
de sodio de copolímero de ácido 4.0
eico/ácido acrílico
a, los platos se lavaron completamente. E cularmente necesario, ya que residuos de ones persistentes todavía pueden presentarse s de pruebas previas. Los nuevos platos ta ieron a tres lavados a fondo antes de usarse ra vez en una prueba.
aración de Tinciones de Yema de huevo en Acero In
Las láminas de acero inoxidable (10 x 15 cm; ce un lado) usadas en estos experimentos se letamente a 95 °C en un lavaplatos de laboratori rgente comercial de alta alcalinidad (por rgente ECOLAB®;, Henkel) para proporcionar lám ieron limpiezas y libres de grasa. Estas ieron sin rebabas antes de su primer uso. Las lá ron durante 30 minutos a 80 °C en un gabinete
) para remover las partículas de ásperas y cualq ragmentos de cáscara de huevo.
Un cepillo plano (2.5" (6.35 cm) ) se usó para 0.1 g de suspensión de yema de huevo tan unifo sea posible sobre un área de 140 cm en IO iados de cada una de las láminas de acero ino do un borde no ensuciado de aproximadamente (cinta adhesiva se usó si es necesario) . Las s se secaron horizontalmente (para prevenir la f otas en los extremos de las láminas) , a tem nte durante 4 horas (max. 24 hr) .
Para desnaturalizar las proteínas de la yema d láminas se sumergieron durante 30 segundos iendo, desmineralizada (usando un disposit ción si es necesario) . Luego las láminas se se durante 30 min a 80°C. Después de secarse y en
mpieza se determinó al dividir el mg de la yema ada durante el lavado por el mg de yema d turalizada aplicada y multiplicada por 100.
racion de Tinciones en Carne Molida y Huevo en P lana
Para estos experimentos, las placas para erg, 19 cm de diámetro, blancas, de porcelana v rme a EN 50242, forma 1495, No. 0219, se us de 225 g de carne magra de cerdo y carne ción 50:50) se picó finamente y se mantuvo a se corrió dos veces a través de una picad raturas arriba de 35 °C se evitaron. Los 225 picada luego se mezclaron con 75 g de huevo mezclados juntos) . La preparación luego se te hasta tres meses a -r8°C, antes del uso. Si
g/cm2. Las placas se secaron durante 2 horas a abinete térmico precalentado . Tan pronto como la friaron, estuvieron listas para uso.
Después de realizar las pruebas del lavaplat s se rociaron con solución de ninhidrina (p 1% en etanol) para mejor identificación de los roteína de la carne picada. Para promover la rea r, las placas se calentaron durante 10 min a 80 ete térmico. La evaluación del desempeño de l al inspeccionar visualmente las reacciones de c úo de la carne picada con referencia al ráfico IKW (IKW - La Asociación Alemana de Cos culos de Tocador, Perfumería y Detergente) .
aración de Tinciones de Huevo/Leche en Acero Inox
Las láminas de acero inoxidable (10 x 15 cm; ce
Las claras y yemas de huevo de huevos crudos c huevos; aproximadamente 160 g/huevo) se colocar y sacudieron con un batidor de huevo. Luego, semi -descremada (1.5% de grasa, temperatura ult enizada) se agregaron- a la mezcla. La leche y aron sin generar espuma. Un cepillo plano se ibuir uniformemente 1.0 ± 0.1 g de la me /leche en el lado cepillado de las láminas dable, usando un balance para verificar la distr rgen de aproximadamente 1.0 cm se dejó alrededo cortos de las láminas. Las láminas sucias se ontalmente (para prevenir la formación de gota s de las láminas) , a temperatura ambiente d (max. 24 hr) .
Las láminas luego se sumergieron durante 30 seg hirviendo, desmineralizada (usando un disposi
ico, y pesaron de nuevo después de de enfria entaje del desempeño de limpieza se deter dir el mg de huevo/leche liberado durante el el mg de huevo/leche aplicado y multiplicado po
P° Y Condiciones de Lavado
Las pruebas de lavado se realizaron en un la mático (Miele model G690SC) , equipado con OS y láminas de acero inoxidable, preparadas ribe arriba. Una cantidad definida del deter
La temperatura probada fue 50 °C. La dureza 21° GH (dureza Alemana) . Como se describe ués, de lavar las placas sucias con carne pi uaron visualmente usando una escala de clasi oto de 0 hasta 10, en donde "0" designa u letamente sucia y "10" designa una placa limpi
sayo de Inhibición de Eglin C
Como se describe en la presente, la concentr a proteasa y actividad específica se determ ación con un inhibidor. La Eglin c de la san o medicinalis es un inhibidor de proteína tica de subtilisinas y proteasa ASP (Heinz emistry, 31: 8755-66, 1992), y por lo tanto pued medir la concentración de enzima, que a su vez ctividad específica para calcularse. Brevemente, la cantidad de inhibición de la enzima produ sas concentraciones conocidas de eglin c. mación, la concentración de eglin c requerida ición completa se calcula. Esto es equivalen ntración de enzima en la muestra.
La actividad de proteasa se midió usando el ens génico descrito arriba. El gen para eglin c se s
ntes se diluyeron a una concentración común.
dice de Desempeño
El índice de desempeño compara el desempeño nte (valor actual) y la proteasa de refer dar (valor teórico) en la misma concentra ína. Además, los valores teóricos pueden cal o los parámetros de la curva de enlace (e ión Langmuir) de la proteasa estándar. Un í peño (PI) que es mayor que 1 (PI>1) identifica u nte como se compara con la estándar (por ejemp ral) , mientras que un PI de 1 (PI=I) identi ante que realiza lo mismo como la estándar, y u ienor que 1 (PI<1) identifica una variante que que la estándar. De esta manera, el PI identi dores, así como variantes que son menos deseab
(líder de híbrido aprE-BPN' , BPN' pro y secuenci
a BPN1 de B. amyloliquefaciens) proporci
nuación, codifica la proteína precursora BPN' :
GAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTT GGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCAGGGAAA CAAACGGGGAAAAGA GGTTTAAACAGACAATGAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGT AGGCGGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCT AAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCTTACGTTGAAG CACATGCGTACGCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAA CACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGA ATTCTTCTCATCCTGATTTAAAGGTAGCAGGCGGAGCCAGCATGGTT AAATCCTTTCCAAGACAACAACTCTCACGGAACTCACGTTGCCGGCA TCTTAATAACTCAATCGGTGTATTAGGCGTTGCGCCAAGCGCATCACT AAGTTCTCGGTGCTGACGGTTCCGGCCAATACAGCTGGATCATTAAC GGCGATCGCAAACAATATGGACGTTATTAACATGAGCCTCGGCGGA GCTGCTTTAAAAGCGGCAGTTGATAAAGCCGTTGCATCCGGCGTCGT GCAGCCGGTAACGAAGGCACTTCCGGCAGCTCAAGCACAGTGGGCTA ACCCTTCTGTCATTGCAGTAGGCGCTGTTGACAGCAGCAACCAAAGA AAGCGTAGGACCTGAGCTTGATGTCATGGCACCTGGCGTATCTATCC CCTGGAAACAAATACGGGGCGTACAACGGTACGTCAATGGCATCTC GGAGCGGCTGCTTTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACT GCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATG GATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAA (SEQ ID NO l).
En la secuencia de arriba, las negritas indica
abarca la proteasa madura, la fuente estándar i
encia líder (líder de híbrido aprE-BP 1 ) ,
rucción del vector de expresión BPN1 (pHPLT-BPN1 )
Los fragmentos PCR se obtuvieron usando con dares con polimerasa TGO (Roche Diagnostics) Olterm. El pJHlOl plásmido corresponde a pJHlOl l., J Bacteriol, 154: 1513-5
[1983]) con el s entó insertado en el sitio EcoRI/BamHI:
TCCTCCATTTTCT CTCCTATCAAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGAGC AGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCCGATATTGGCT GGCGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGCGAATGTTCATCTTATTT TCTCAATAATTTTTTCAT CTATCCCT CATGCT lOAAAAAATATCACGATAAl rCCAl G rrCrCACGGAAGCACACGC TGAACGAATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAA ACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGA ALTTCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATA ACCTAAATAGAGATAAA AAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCACAGAA TAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGC GTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGT AATCTTTACGATGGCGTTCGGCAG TGCCCAGGCGGCAGGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTA ATGAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTC GAAAAAGGCG CAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACATTAAACGAAAAAGC AATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCTTACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACA GCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCA CTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGATTCTTCTCATC AAGGTAGCAGGCGGAGCCAGCATGGTTCCTTCTGAAACAAATCCTTTCCAAGA CTCACGGAAC RCACGL GCCGGCACAGLTGCGGCTCTTAATAACTCAATCGGT GTTGCGCCAAGCGCAIX ACTTTACGCTGTAAAAGTTCTCGGTGCTGACGGTTCC CAGCTGGATCATTAACGGAATCGAGTGGGCGATCGCAAACAATATGGACGTTA AGCCTCGGCGGACCTTCTGG'r C GC rGCT rAAAAGCGGCAG'iTGATAAAGC
° aminoácido) . Este fragmento se usó como una p una reacción PCR que emplea los siguientes ce -14: GtcctctgttaacTTACTGAGCTGCCGCCTGTAC (SEQ I ados en sus pares base al extremo 31 del ge , introduciendo un sitio Hpal cadena abajo del traduceional ; y AK04-21.1: agcaaaaggagagggtaaagagtgagaagc (SEQ ID NO: 5) ali pares base al extremo 5 ' de la secuencia de se duciendo un sitio Nhel en el extremo 5'.
El fragmento PCR obtenido de esta reacción s un kit de limpieza Qiagen PCR usando con dares. Después de digerir el fragmento limpio as de restricción Nhel y Hpal bajo con dares, se ligó en un vector digerido Nhel/H iene el promotor LAT (pHPLT-VAAcl , descr 6/0014265 y Ver FIG. 3A) .
asa ???' secretada que tiene actividad proteolí isis del gel se realizó usando geles NuPage N ris (Invitrogen®, Catalogo No. NP0301BOX) . Para muestras para análisis, 2 volúmenes de sobrena laron con 1 volumen de HC1 1 , 1 volumen de iguadora de muestra 4X LDS (Invitrogen®, Catá 07) , y PMSF al 1% (20 mg/ml) , y posteriormente ca te 10 minutos a 70 °C. Luego, 25 L de cada mu en el gel, junto con 10 \iL de SeeBlue más 2 es roteína pre-teñidos (Invitrogen®, Catalogo No. resultados claramente demuestran que la estra ación BPN ' descrita en este Ejemplo proporci o producido por B. subtilis .
EJEMPLO 3
neración de Colecciones de Evaluación del Sitio
rucción SEL. Los cebadores sintetizados por Inv lados, escala de 50 nmol) y enlistados en la Ta aron para generar las colecciones.
Para construir SEL de BPN',- tres amplificacione izaron: dos PCR de mutagénesis para introducir o de interés en la secuencia de ADN de BPN' mad r PCR para fusionar las dos PCR de mutagén to de construir el vector de expresión pHPLT-e el codón mutado deseado en la secuencia de BPN' étodo de mutagénesis fue con base en el en ción específica de codón. En este método, la cre S las posibles mutaciones en un tiempo en un tri específico se realiza usando cebadores de oligonu teros e inversos con una longitud de 25 h eótidos que encierran una secuencia de ADN ada especifica (NNS con N = A, C, T o G, y S
ificaciones PCR primarias usando el T-BglII-F y un cebador de mutagénesis específico, y para la segunda amplificac ebador pHPLT-Bgl I I -RV y un cebador de muta ntero BPN' especifico (posiciones de codón iguales para los cebadores de muta nteros e inversos) . La introducción ciones en la secuencia BPN' madura se do Polimerasa de ADN de Alta Fidelidad Fi Íon (No. de Catalogo F-530L) . Toda ificaciones PCR se ejecutaron de acue ocólo Finnzymes suministrado con la poli condiciones PCR fueron como sigue:
PCR 1 primario:
or pHPLT-BglII -FW y un cebador de mutagénesis específico - ambos 1 pL (10 µ?) ; y para PCR 2 pr
I
i
La PCR se completó usando un formador de ico MJ Research (Location) PTC-200 Peltier íente programa PCR: 30 segundos 98°C, 3 ndos 98°C, 20- segundos 55°C, 1 minuto 72° 72°C. Las reacciones resultan en dos fra aproximadamente 2 hasta 3 kB de longit en alrededor de 30 nucleótidos de trasla dedor del codón maduro BPN1 de interé entos se fusionaron en una tercera r do los dos fragmentos antes mencionados dores BglII delanteros e inversos. La r de fusión se llevó a cabo como sigue:
dor pHPLT-Bglll-FW y cebador pHPLT-Bglll -RV - am µ?)
ción amortiguadora de 5X Phusion HF 10 yL
1a de dNTP 10 m 1 L
) y 5 min 72 °C usando un formador de ciclos té ren® PTC-200 Peltier.
El fragmento 4.8 Kb lineal amplificado se do el kit de purificación PCR Qiagen® Q alogo No. 28106 ) y digirió con la enz ricción BglII para crear extremos cohesi S lados del fragmento de fusión. Las rea igestión contienen:
µ?? de fragmento de ADN lineal purificado
L de solución amortiguadora React® 3 (Invitrogen il¡ de BglII, 10 unidades/ml (Invitrogen®)
iciones de reacción: 1 hora, 30°C.
La ligación del fragmento purificado y digeri rciona productos de ADN multiméricos y circul ienen la mutación deseada, que posteriorm
La mezcla de ligación se usó para transfo ilis (AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, de E : : (xylR , pxylA- comK) como se describe en 4490, incorpora en la presente como refe cada biblioteca, 96 colonias sencil ccionaron e hicieron crecer en medio M iene neomicina y 1.25 g/L de extra dura, para propósitos de análisis de se eClear) y separación por exclusión. Los bibliotecas en el intervalo desde 1 has número representa el codón de la secuenc ra que se mutó aleatoriamente. Cada bib iene un máximo de 19 variantes BPN' .
Tabla 1-3. Cebadores BPN'
re del Secuencia de oligonucleótido
or
Tabla 3-1 Cebadores BPN'
PN7F GCGCAGTCCGTGCCTTACNNSGTATCACAAATTAAAGCC PN8F CAGTCCGTGCCTTACGGCNNSTCACAAATTAAAGCCCCT PN9F TCCGTGCCTTACGGCGTANNSCAAATTAAAGCCCCTGCT PN10F GTGCCTTACGGCGTATCANNSATTAAAGCCCCTGCTCTG
BPNl lF CCTTACGGCGTATCACAANNSAAAGCCCCTGCTCTGCAC
BPN12F TACGGCGTATCACAAATTNNSGCCCCTGCTCTGCACTCT
BPN13F GGCGTATCACAAATTAAANNSCCTGCTCTGCACTCTCAA
BPN14F GTATCACAAATTAAAGCCNNSGCTCTGCACTCTCAAGGC
BPN15F TCACAAATTAAAGGCCCTNNSCTGCACTCTCAAGGCTAC
BPN16F CAAATTAAAGCCCCTGCTNNSCACTCTCAAGGCTACACT
BPN17F ATTAAAGCCCCTGCTCTGNNSTCTCAAGGCTACACTGGA
BPN18F AAAGCCCCTGCTCTGCACNNSCAAGGCTACACTGGATCA
BPN19F GCCCCTGCTCTGCACTCTNNSGGCTACACTGGATCAAAT
BPN20F CCTGCTCTGCACTCTCAANNSTACACTGGATCAAATGTT
BPN21F GCTCTGCACTCTCAAGGCNNSACTGGATCAAATGTTAAA
BPN22F CTGCACTCTCAAGGCTACNNSGGATCAAATGTTAAAGTA
BPN23F CACTCTCAAGGCTACACTNNSTCAAATGTTAAAGTAGCG
BPN24F TC CAAGGCTACAC GGANNSAATGTTAAAGTAGCGGTT
BPN25F CAAGGCTACACTGGATCANNSGTTAAAGTAGCGGTTATC
BPN26F GGCTACACTGGATCAAATNNSAAAGTAGCGGTTATCGAC
BPN27F TAC ACTGG ATC AAATGTTNNSGTAGCGGTTATCG AC AGC
BPN28F ACTGGATCAAATGTTAAANNSGCGGTTATCGACAGCGGT
BPN29F GGATCAAATGTTAAAGTANNSG rATCGACAGCGGTATC
BPN30F TCAAATGTTAAAGTAGCGNNSATCGACAGCGGTATCGAT
BPN31F AATGTTAAAGTAGCGGTTNNSGACAGCGGTATCGATTCT
BPN32F GTTAAAGTAGCGGTTATCNNSAGCGGTATCGATTCTTCT
BPN33F AAAGTAGCGGTTATCGACNNSGGTATCGATTCTTCTCAT
BPN34F GTAGCGGTTATCGACAGCNNSATCGATTCTTGTCATCCT
BPN35F GCGGTTATCGACAGCGGTNNSGATTCTTCTCATCCTGAT
BPN36F GTTATCGACAGCGGTATCNNSTCTTCTCATCCTGAT TA
BPN37F ATCGACAGCGGTATCGATNNSTCTCATCCTGATTTAAAG
BPN38F . GACAGCGGTATCGATTCTNNSCATCCTGATTTAAAGGTA
BPN39F AGCGGTATCGATrCTTCTNNSCCTGAriTAAAGGTAGCA
7F GTTCCTTCTGAAACAAATNNSTTCCAAGACAACAACTCT 6 58F CCTTCTGAAACAAATCCTNNSCAAGACAACAACTCTCAC 65 59F TCTGAAACAAATCCTTTCNNSGACAACAACTCTCACGGA 6 60F GAAACAAATCCTTTCCAANNSAACAACTCTCACGGAACT 67 61F ACAAATCCTTTCCAAGACNNSAACTCTCACGGAACTCAC 68 62F AATCCTTTCCAAGACAACNNSTCTCACGGAACTCACGTT 6 63F CCTTTCCAAGACAACAACNNSCACGGAACTCACGTTGCC 7 64F TTCCAAGACAACAACTCTNNSGGAACTCACGTTGCCGGC 71 65F CAAGACAACAACTCTCACNNSACTCACGTTGCCGGCACA 7 66F GACAACAACTCTCACGGANNSCACGTTGCCGGCACAGTT 7 67F AACAACTCTCACGGAACTNNSGTTGCCGGCACAGTTGCG 7 68F AACTCTCACGGAACTCACNNSGCCGGCACAGTTGCGGCT 75 69F TCrrcACGGAACTCACGlTNNSGGCACAGTTGCGGCTCTT 7 70F CACGGAACTCACGTTGCCN SACAGTTGCGGCTCTTAAT 7 71F GGAACTCACGTTGCCGGCNNSGTTGCGGCTCTTAATAAC 7 72F ACTCACGTTGCCGGCACANNSGCGGCTCTTAATAACTCA 7 73F CACGTTGCCGGCACAGTTNNSGCTCTTAATAACTCAATC 8 74F GI GCCGGCACAGITGCGNNSCTTAATAACTCAATCGGT 81 75F GCCGGCACAGTTGCGGCTNNSAATAACTCAATCGGTGTA 8 76F GGCACAGTTGCGGCTCTTNNSAACTCAATCGGTGTATTA 8 77F ACAGTTGCGGCTCTTAATNNSTCAATCGGTGTATTAGGC 8 78F GTTGCGGCTCTTAATAACNNSATCGGTGTATTAGGCGTT 8 79F GCGGCTCTTAATAACTCANNSGGTGTATTAGGCGTTGCG 8 80F GCTCTTAATAACTCAATCNNSGTATTAGGCGTTGCGCCA 8 81F CTTAATAACTCAATCGGTNNSTTAGGCGTTGCGCCAAGC 8 82F AATAACTCAATCGGTGTANNSGGCGTTGCGCCAAGCGCA 8 83F AACTCAATCGGTGTATTANNSGTTGCGCCAAGCGCATCA 9 84F TCAATCGGTGTATTAGGCNNSGCGCCAAGCGCATCACTT 9 85F ATCGGTGTATTAGGCGTTNNSCCAAGCGCATCACTTTAC 9 86F GGTGTATTAGGCGTTGCGNNSAGCGCATCACTTTACGCT 9 87F GTATTAGGCGTTGCGCCANNSGCATCACTTTACGCTGTA 9 88F TTAGGCGTTGCGCCAAGCNNSTCACTTTACGCTGTAAAA 9 89F GGCGTTGCGCCAAGCGCA NSCTTTACGCTGTAAAAGTT 9
PN107F TCCGGCCAATACAGCTGGNNSATTAACGGAATCGAGTGG PN108F GGCCAATACAGCTGGATCNNSAACGGAATCGAGTGGGCG PN109F CAATACAGCTGGATCATTNNSGGAATCGAGTGGGCGATC PN110F TACAGCTGGATCATTAACNNSATCGAGTGGGCGATCGCA PN111 F AGCTGGATCATTAACGGANNSGAGTGGGCGATCGCAAAC PN112F TGGATCATTAACGGAATCNNSTGGGCGATCGCAAACAAT PN113F ATCAT AACGGAATCGAGNNSGCGATCGCAAACAATATG PN1 14F ATTAACGGAATCGAGTGGNNSATCGCAAACAATATGGAC PN115F AACGGAATCGAGTGGGCG NSGCAAACAATATGGACGTT PN116F GGAATCGAGTGGGCGATCNNSAACAATATGGACGTTATT PN117F ATCGAGTGGGCGÁTCGCANNSAATATGGACGTTATTAAC PN118F GAGTGGGCGATCGCAAACNNSATCGACGTTATTAACATG PN1 19F TGGGCGATCGCAAACAATNNSGACGTTATTAACATGAGC PN120F GCGATCGCAAACAATATGNNSGTTATTAACATGAGCCTC PN121F ATCGCAAACAATATGGAC NSATTAACATGAGCCTCGGC PN122F GCAAACAATATGGACGTTNNSAACATGAGCCTCGGCGGA PN123F AACAATATGGACGTTATTNNSATGAGCCTCGGCGGACCT PN124F AAT ATGG ACGTTATTA ACNNS AGCCTCGGCGG ACCTTCT PN125F ATGGACGTTATTAACATGNNSCTCGGCGGACCTTCTGGT PN126F GACGTTATTAACATGAGCNNSGGCGGACCTTCTGGTTCT PN127F GTTATTAACATGAGCCTCNNSGGACCTTCTGGTTCTGCT PN128F ATTAACATGAGCCTCGGCNNSCCTTCTGGTTCTGCTGCT PN129F AACATGAGCCTCGGCGGANNSTCTGGTTCTGCTGC ITA PN130F ATG AGCCTCGGCGG ACCTNNSGGTTCTGCTGCTTTAAAA PN131F AGCCTCGGCGGACCTTCTNNSTCTGCTGCTTTAAAAGCG PN132F CTCGGCGGACCTTCTGGTNNSGCTGCTTTAAAAGCGGCA PN133F GGCGGACCTTCTGGTTCTNNSGCTTTAAAAGCGGCAGTT PN134F GGACC I CTGGrrCTGCTNNSTTAAAAGCGGCAG lTGAT PN135F CCTTCTGGTTCTGCTGCTNNSAAAGCGGCAGTTGATAAA PN136F TCTGGTTCTGCTGCTTTANNSGCGGCAGTTGATAAAGCC PN137F GGTTCTGCTGCTTTAAAANNSGCAGTTGATAAAGCCGTT PN138F TCTGCTGCTTTAAAAGCGNNSGTTGATAAAGCCGTTGCA
BPN157F GCGGCAGCCGGTAACGAAN SACTTCCGGCAGCTCAAGC
BPN158F GCAGCCGGTAACGAAGGCNNSTCCGGCAGCTCAAGCACA
BPN159F GCCGGTAACGAAGGCACTNNSGGCAGCTCAAGCACAGTG
BPN100F GGTAACGAAGGCACTTCCNNSAGCTCAAGCACAGTGGGC
BPN161F AACGAAGGCAC1TCCGGCNNSTCAAGCACAGTGGGCTAC
BPN162F GAAGGCACTTCCGGCAGCNNSAGCACAG GGGCTACCCT
BPN163F GGCACTTCCGGCAGCTCANNSACAGTGGGCTACCCTGGT
BPN164F ACTTCCGGCAGCTCAAGCNNSGTGGGCTACCCTGGTAAA
BPN165F TCCGGCAGCTCAAGCACANNSGGCTACCCTGGTAAATAC
BPN166F GGCAGCTCAAGCACAGTG NSTACCCTGGTAAATACCCT
BPN167F AGCTCAAGCACAGTGGGCNNSCCTGGTAAATACCCTTCT
BPN168F TCAAGCACAGTGGGCTACNNSGGTAAATACCCTTCTGTC
BPN169F AGCACAGTGGGCTACCCTNNSAAATACCCTTCTGTCATT
BPN170F ACAGTGGGCTACCCTGGT NSTACCCTTCTGTCATTGCA
BPN171F GTGGGCTACCCTGGTAAANNSCCTTCTGTCATTGCAGTA
BPN172F GGCTACCCTGGTAAATACNNSTCTGTCATTGCAGTAGGC
BPN173F TACCCTGGTAAATACCCTNNSGTCAITGCAGTAGGCGCT
BPN174F CCTGGTAAATACCCTTCTNNSATTGCAGTAGGCGCTGTT
BPN175F GGTAAATACCCTTCTGTCNNSGCAGTAGGCGCTGTTGAC
BPN176F AAATACCCTTCTGTCATTNNSGTAGGCGCTGTTGACAGC
BPN177F TACCCTTCTGTCATTGCANNSGGCGCTGTTGACAGCAGC
BPN178F CC1TCTGTCATTGCAGTANNSGCTG1TGACAGCAGCAAC
BPN179F TCTGTCATTGCAGTAGGCNNSGTTGACAGCAGCAACCAA
BPN180F GTCATTGCAGTAGGCGCTNNSGACAGCAGCAACCAAAGA
BPN181F ATTGCAGTAGGCGCTGTTNNSAGCAGCAACCAAAGAGCA
BPN182F GCAGTAGGCGCTGTTGACNNSAGCAACCAAAGAGCATCT
BPN183F GTAGGCGCTGTTGACAGCNNSAACCAAAGAGCATCTTTC
BPN184F GGCGCTGTTGACAGCAGCNNSCAAAGAGCATCTTTCTCA
BPN185F GCTGTTGACAGCAGCAACNNSAGAGCATCTTTCTCAAGC
BPN186F GTTGACAGCAGCAACCAANNSGCATCTTTCTCAAGCGTA
BPN187F GACAGCAGCAACCAAAGANNSTCTTTCTCAAGCGTAGGA
BPN188F AGCAGCAACCAAAGAGCANNSTTCTCAAGCGTAGGACCT
PN207F CCTGGCGTATCTATCCAANNSACGCTTCCTGGAAACAAA PN208F GGCGTATCTATCCAAAGCNNSCTTCCTGGAAACAAATAC PN209F GTATCTATCCAAAGCACGNNSCCTGGAAACAAATACGGG PN210F TCTATCCAAAGCACGCTTNNSGGAAACAAATACGGGGCG PN211F ATCCAAAGCACGCTTCCTNNSAACAAATACGGGGCGTAC PN212F CAAAGCACGCTTCCTGGANNSAAATACGGGGCGTACAAC PN213F AGCACGCrrCCTGGAAACNNSTACGGGGCGTACAACGGT PN214F ACGCTTCCTGGAAACAAANNSGGGGCGTACAACGGTACG PN215F CTTCCTGGAAACAAATACNNSGCGTACAACGGTACGTCA PN216F CCTGGAAACAAATACGGGNNSTACAACGGTACGTCAATG PN217F GGAAACAAATACGGGGCGNNSAACGGTACGTCAATGGCA PN218F AACAAATACGGGGCGTACNNSGGTACGTCAATGGCATCT P 219F AAATACGGGGCGTACAACNNSACG!CAATGGCATCTCCG PN220F TACGGGGCGTACAACGGTNNSTCAATGGCATCTCCGCAC PN221 F GGGGCGTACAACGGTACGNNSA GGCATCTCCGCACGTT PN222F GCGTACAACGGTACGTCANNSGCATCTCCGCACG1TGCC PN223F TACAACGGTACGTCAATGNNSTCTCCGCACGTTGCCGGA PN224F AACGGTACGTCAATGGCANNSCCGCACGTTGCCGGAGCG PN225F GGTACGTCAATGGCATCTNNSCACGTTGCCGGAGCGGCT PN226F ACGTCAATGGCATCTCCGNNSGTTGCCGGAGCGGC GCT PN227F TCAATGGCATCTCCGCACNNSGCCGGAGCGGCTGCTTTG PN228F ATGGCATCTCCGCACGTTNNSGGAGCGGCTGCTTTGATT PN229F GCATCTCCGCACGTTGCCNNSGCGGCTGCTTTGATTCTT PN230F TCTCCGCACGTTGCCGGANNSGCTGCT TGATTCTTTCT PN231 F CCGCACGTTGCCGGAGCGNNSGCTTTGATTCTTTCTAAG PN232F CACGTTGCCGGAGCGGCT NSTTGATTCTTTCTAAGCAC PN233F GTTGCCGGAGCGGCTGCTNNSATTCTTTCTAAGCACCCG PN234F GCCGGAGCGGCTGCTTTGNNSCTTTCTAAGCACCCGAAC PN235F GGAGCGGCTGCTTTGAÍTNNSTCTAAGCACCCGAACTGG PN236F GCGGCTGCTTTGATTCTTNNSAAGCACCCGAACTGGACA PN237F GCTGCTTTGATTCTTTCTNNSCACCCGAACTGGACAAAC PN238F GCTTTGATTCTTTCTAAGNNSCCGAACTGGACAAACACT
PN257F GAAAACACCACTACAAAA NSGGTGATTCTTTCTACTAT PN258F AACACCACTACAAAACTTNNSGATTCTTTCTACTATGGA PN259F ACCACTACAAAACTTGGT1WSTCTTTCTACTATGGAAAA PN260F ACTACAAAACTTGGTGATNNSTTCTACTATGGAAAAGGG PN261F ACAAAACTTGGTGATTCTNNSTACTATGGAAAAGGGCTG PN262F AAACTTGGTGATTCTTTCNNSTATGGAAAAGGGCTGATC PN263F CTTGGTG ATTCTTTCTACN N S GG AAA AGGGCTG ATC AAC PN264F GGTGATTCTTTCTACTATNNSAAAGGGCTGATCAACGTA PN265F GATTCTTTCTACTATGGANNSGGGCTGATCAACGTACAG PN266F TCTTTCTACTATGGAAAANNSCTGAT€AACGTACAGGCG PN267F TTCTACTATGGAAAAGGGN SATCAACGTACAGGCGGCA PN268F TACTATGGAAAAGGGCTGNNSAACGTACAGGCGGCAGCT PN269F TATGGAAAAGGGCTGATCNNSGTACAGGCGGCAGCTCAG PN270F GGAAAAGGGCTGATCAACNNSCAGGCGGCAGCTCAGTAA PN271F AAAGGGCTGATCAACGTANNSGCGGCAGCTCAGTAAAGC PN272F GGGCTGATCAACGTACAGNNSGCAGCTCAGTAAAGCTTA PN273F CTGATCAACGTACAGGCGNNSGCTCAGTAAAGCTTACTG PN274F ATCAACGTACAGGCGGCANNSCAGTAAAGCTTACTGGCC PN275F AACGTACAGGCGGCAGCTNNSTAAAGCTTACTGGCCGTC PN1R GCCGTAAGGCACGGACTGSNNGTATGCATGTGCTACGTG PN2R TACGCCGTAAGGCACGGASNNCGCGTATGCATGTGCTAC PN3R TGATACGCCGTAAGGCACSNNCTGCGCGTATGCATGTGC PN4R TTGTGATACGCCGTAAGGSNNGGACTGCGCGTATGCATG PN5R AATTTGTGATACGCCGTASNNCACGGACTGCGCGTATGC PN6R TTTAATTTGTGATACGCCSNNAGGCACGGACTGCGCGTA PN7R GGCTTTAATTTGTGATACSNNGTAAGGCACGGACTGCGC PN8R AGGGGCTTTAATTTGTGASNNGCCGTAAGGCACGGACTG PN9R AGCAGGGGCTTTAATTTGSNNTACGCCGTAAGGCACGGA PN10R CAGAGCAGGGGCTTTAATSNNTGATACGCCGTAAGGCAC PN11R GTGCAGAGCAGGGGCTTTSNNTTGTGATACGCCGTAAGG PN12R AGAGTGCAGAGCAGGGGCSNNAATTTGTGATACGCCGTA PN13R TTGAGAGTGCAGAGCAGGSNNTTTAATTTGTGATACGCC PN14R GCCTTGAGAGTGCAGAGCSNNGGCTTTAATTTGTGATAC
PN32R AGAAGAATCGATACCGCTSNNGATAACCGCTACTTTAAC PN33R ATGAGAAGAATCGATACCSNNGTCGATAACCGCTACTTT PN34R AGGATGAGAAGAATCGATSNNGCTGTCGATAACCGCTAC PN35R ATCAGGATGAGAAGAATCSNNACCGCTGTCGATAACCGC
BPN36R TAAATCAGGATGAGAAGASN GATACCGCTGTCGATAAC PN37R CTTTAAATCAGGATGAGASNNATCGATACCGCTGTCGAT
BPN38R TACCTTTAAATCAGGATGSN AGAATCGATACCGCTGTC
BPN39R TGCTACC I AAATCAGGSNNAGAAGAATCGATACCGCT
BPN40R GCCTGCTACCTTTAAATCvS NATGAGAAGAATCGATACC
BPN41R TCCGCCTGCTACCTTTAASNNAGGATGAGAAGAATCGAT
BPN42R GGCTCCGCCTGCTACCTTSNNATCAGGATGAGAAGAATC
BPN43R GCTGGCTCCGCCTGCTACSNNTAAATCAGGATGAGAAGA
BPN44R CATGCTGGCTCCGCCTGCSNNCriTAAATCAGGATGAGA
BPN45R AACCATGCTGGCTCCGCCSNNTACCTTTAAATCAGGATG
BPN46R AGGAACCATGCTGGCTCCSNNTGCTACCTTTAAATCAGG
BPN47R AGAAGGAACCATGCTGGCSNNGCCTGCTACCTTTAAATC
BPN48R TTCAGAAGGAACCATGCTSNNTCCGCCTGCTACCTTTAA
BPN49R TGlTTCAGAAGGAACCA rSNNGGCTCCGCCTGCTACCTF
BPN50R ATTTGTTTCAGAAGGAACSNNGCTGGCTCCGCCTGCTAC
BPN51R AGGATTTGTTTCAGAAGGSNNCATGCTGGCTCCGCCTGC
BPN52R GAAAGGAT1TGTTTCAGASNNAACCATGCTGGCTCCGCC
BPN53R TTGGAAAGGAT TGTTTCSNNAGGAACCATGCTGGC CC
BPN54R GTClTGGAAAGGAI TC rSNNAGAAGGAACCATGCTGGC
BPN55R GTTGTCTTGGAAAGGATTS NTTCAGAAGGAACCATGCT
BPN56R GTTGTTGTCTTGGAAAGGS NTGTTTCAGAAGGAACCAT
BPN57R AGAGTTGTTGTCTTGGAASKNATTTGTTTCAGAAGGAAC
BPN58R GTGAGAGTTGTTGTCTTGvSNNAGGATTTGTTTCAGAAGG
BPN59R TCCGTGAGAGTTG rGTCSNNGAAAGGATITGITTCAGA
BPN60R AGTTCCGTGAGAGTTGTTSNNT GGAAAGGATTTGTTTC
BPN61R GTGAGTTCCGTGAGAGTTSN^GTCTTGGAAAGGATTTGT
BPN62R AACGTGAGTTCCGTGAGASNNGTTGTCTTGGAAAGGATT
BPN63R GGC A ACGTG AGTTCCGTGvS NNGTTGTTGTCTTGG A AAGG r
PN82R TGCGCTTGGCGCAACGCCSN TACACCGATTGAGTTATT PN83R TGATGCGCTTGGCGCAACSN TAATACACCGATTGAGTT PN84R AAGTGATGCGCTTGGCGCSNNGCCTAATACACCGATTGA PN85R GTA A AGTG ATGCGCTTGGS N A ACGCCTA ATAC ACCG AT PN86R AGCGTAAAGTGATGCGCTSNNCGCAACGCCTAATACACC PN87R TACAGCGTAAAGTGATGCS NTGGCGCAACGCCTAATAC PN88R TTTTACAGCGTAAAGTGASNNGCTTGGCGCAACGCCTAA PN89R AACTTTTACAGCGTAAAGSN TGCGCTTGGCGCAACGCC PN90R - GAGAACTTTTACAGCGTAS NTGATGCGCTTGGCGCAAC PN91R ACCGAGAACTTTTACAGCSNNAAGTGATGCGCTTGGCGC PN92R AGCACCGAGAACmTACSNNGTAAAGTGATGCGCrrGG PN93R GTCAGCACCGAGAACTTTSNNAGCGTAAAGTGATGCGCT PN94R ACCGTC AGC ACCG AG AAC S NNT AC AG CGT A A AGTG ATGC PN95R GGAACCGTCAGCACCGAGSNNTTTTACAGCGTAAAGTGA PN96R GCCGGAACCGTCAGCACCSNNAACTTTTACAGCGTAAAG PN97R TTGGCCGGAACCGTCAGCSNNGAGAACTTTTACAGCGTA PN98R GTATTGGCCGGAACCGTCSNTNACCGAGAACTTTTACAGC PN99R GCTGTATTGGCCGGAACCSNNAGCACCGAGAACTTTTAC PN100R CCAGCTGTATTGGCCGGASNNGTCAGCACCGAGAACTTT PN101R GATCCAGCTGTATTGGCCSNNACCGTCAGCACCGAGAAC PN102R AATGATCCAGCTGTATTGSNNGGAACCGTCAGCACCGAG PN103R GTT AATG ATCC AGCTGT AS NNGCCGG AACCGTCAGC ACC PN1Ü4R TCCGTTAATGATCCAGCTSNNTTGGCCGGAACCGTCAGC PN105R GATTCCGTTAATGATCCASNNGTAT GGCCGGAACCGTC PN106R CTCG ATTCCGTTA ATG ATS NG CTGT ATTGGCCG G AACC PN107R CCACTCGATTCCGTTAATS NCCAGCTGTATTGGCCGGA PN108R CGCCCACTCGATTCCGTTS NGATCCAGCTGTATTGGCC PN109R GATCGCCCACTCGATTCCSNNAATGATCCAGCTGTATTG PN110R TGCGATCGCCCACTCGATSNNGTTAATGATCCAGCTGTA PN1 1 1 R GTTTGCGATCGCCCACTCSNNTCCGTTAATGATCCAGCT PN112R ATTGTTTGCGATCGCCCASNNGATTCCGTTAATGATCCA PN113R CATATTGTTTGCGATCGCSNNCTCGATTCCGTTAATGAT
PN132R TGCCGCTTTTAAAGCAGCSN ACCAGAAGGTCCGCCGAG PN133R AACTGCCGCTTTTAAAGCSN AGAACCAGAAGGTCCGCC PN134R ATCAACTGCCGCn 1TAASNNAGCAGAACCAGAAGGTCC PN135R TTTATCAACTGCCGCTTTSNNAGCAGCAGAACCAGAAGG PN136R GGCTTTATCAACTGCCGCSNNTAAAGCAGCAGAACCAGA PN137R AACGGCTTTATCAACTGCSN TTTTAAAGCAGCAGAACC PN138R TGCAACGGCTTTATCAACSNNCGCTTTTAAAGCAGCAGA PN139R GGATGCAACGGCTTTATCSNNTGCCGCTTTTAAAGCAGC PN140R GCCGGATGCAACGGCTTTSNNAACTGCCGCTTTTAAAGC PN141R GACGCCGGATGCAACGGCSN ATCAACTGCCGCTTTTAA PN142R TACG ACGCCGG ATGC A ACS NTTT ATC A ACTGCCG CTTT PN143R GACTACGACGCCGGATGCSNNGGCTTTATCAACTGCCGC
BPN144R AACGACTACGACGCCGGASNNAACGGCTTTATCAACTGC
BPN145R CGCAACGACTACGACGCCSNNTGCAACGGCTTTATCAAC
BPN146R TGCCGCAACGACTACGACSNNGGATGCAACGGCTTTATC
BPN147R GGCTGCCGCAACGACTACSNNGCCGGATGCAACGGCTTT
BPN148R ACCGGCTGCCGCAACGACSNNGACGCCGGATGCAACGGC
BPN149R GTTACCGGCTGCCGCAACSNNTACGACGCCGGATGCAAC
BPN150R TTCGTTACCGGCTGCCGCSNNGACTACGACGCCGGATGC
BP 151R GCCTTCGTTACCGGCTGCSNNAACGACTACGACGCCGGA
BP 152R AGTGCCTTCGTTACCGGCSNNCGCAACGACTACGACGCC
BPN153R GGAAGTGCCTTCGTTACCSNNTGCCGCAACGACTACGAC
BPN154R GCCGGAAGTGCCTTCGTTSNNGGCTGCCGCAACGACTAC
BPN155R GCTGCCGGAAGTGCCTTCSNNACCGGCTGCCGCAACGAC
BPN156R TGAGCTGCCGGAAGTGCCSNNGTTACCGGCTGCCGCAAC
BPN157R GCTTGAGCTGCCGGAAGTSNNTTCGTTACCGGCTGCCGC
BPN158R TGTGCTTGAGCTGCCGGASNNGCCTTCGTTACCGGCTGC
BPN159R CACTGTGCTTGAGCTGCCSNNAGTGCCTTCGTTACCGGC
BPN160R GCCCACTGTGCTTGAGCTSNNGGAAG GCCT CGTTACC
BPN161R GTAGCCCACTGTGCTTGASNNGCCGGAAGTGCCTTCGTT
BPN162R AGGGTAGCCCACTGTGCTSNNGCTGCCGGAAGTGCCTTC
BPN163R ACCAGGGTAGCCCACTGTSNNTGAGCTGCCGGAAGTGCC
PN182R AGATGCTCTTTGGTTGCTSNNGTCAACAGCGCCTACTGC PN183R GAAAGATGCTCTTTGGTTSN GCTGTCAACAGCGCCTAC PN184R TGAGAAAGATGCTC iTGSNNGCTGCTGTCAACAGCGCC PN185R GCTTGAGAAAGATGCTCTSNNGTTGCTGCTGTCAACAGC PN186R TACGCTTGAGAAAGATGCS NTTGGTTGCTGCTGTCAAC PN187R TCCTACGCTTGAGAAAGASNNTCTTTGGTTGCTGCTGTC PN188R AGGTCCTACGCTTGAGAASNNTGCTCTTTGGTTGCTGCT PN189R CTCAGGTCCTACGCTTGASNNAGATGCTCTTTGGTTGCT PN190R AAGCTCAGGTCCTACGCTSNNGAAAGATGCTCTTTGGTT PN191R ATCAAGCTCAGGTCCTACSNNTGAGAAAGATGCTCTTTG PN192R GACATCAAGCTCAGGTCCSNNGCTTGAGAAAGATGCTCT PN193R CATGACATCAAGCTCAGGSN TACGCTTGAGAAAGATGC PN194R TGCCATGACATCAAGCTCSNNTCCTACGCTTGAGAAAGA PN195R AGGTGCC ATG AC ATC A AGS NN AGGTCCTACGCTTG AG A A PN196R GCCAGGTGCCATGACATCSNNCTCAGGTCCTACGCTTGA PN197R TACGCCAGGTGCCATGACSNNAAGCTCAGGTCCTACGCT PN198R AGATACGCCAGGTGCCATSNNATCAAGCTCAGGTCCTAC PN199R G ATAG ATACGCCAGGTGC S NNG AC ATC AAGCTC AGGTCC PN200R TTGG AT AG ATACGCC AGG SNNC ATG AC ATC AAGCTC AGG PN201R GCTTTGGATAGATACGCCSNNTGCCATGACATCAAGCTC PN202R CGTGCTTTGGATAGATACSNNAGGTGCCATGACATCAAG PN203R AAGCGTGCTTTGGATAGASNNGCCAGGTGCCATGACATC PN204R AGGAAGCGTGCTTTGGATSNNTACGCCAGGTGCCATGAC PN205R . TCCAGGAAGCGTGCTTTGSNNAGATACGCCAGGTGCCAT PN206R GTTTCCAGGAAGCGTGCTSNNGATAGATACGCCAGGTGC PN207R TTTGTTTCCAGGAAGCGTSNNTTGGATAGATACGCCAGG PN208R GTATTTGTTTCCAGGAAGSNNGCTTTGGATAGATACGCC PN209R CCCGTATTTGTITCC AGG SN NCGTGC rrrGG A'FAG AT AC PN210R CGCCCCGTATTTGTTTCCSNNAAGCGTGCTTTGGATAGA PN211R GTACGCCCCGTATTTGTTS NAGGAAGCGTGCTTTGGAT PN212R GTTGTACGCCCCGTATTTSNNTCCAGGAAGCGTGCTTTG PN213R ACCGTTGTACGCCCCGTASNNGTTTCCAGGAAGCGTGCT
N232R GTGCTTAGAAAGAATCAASNNAGCCGCTCCGGCAACGTG N233R CGGGTGCTTAGAAAGAATSNNAGCAGCCGCTCCGGCAAC N234R GTTCGGGTGCTTAGAAAGSNNCAAAGCAGCCGCTCCGGC N235R CCAGTTCGGGTGCTTAGAS AATCAAAGCAGCCGCTCC N236R TGTCCAGTTCGGGTGCTTSNNAAGAATCAAAGCAGCCGC N237R GTTTGTCCAGTTCGGGTGSNNAGAAAGAATCAAAGCAGC N238R AGTGTTTGTCCAGTTCGGSNNCTTAGAAAGAATCAAAGC N239R TTGAGTGTTTGTCCAGTTSNNGTGCTTAGAAAGAATCAA N240R GACTTGAGTGTTTGTCCASNNCGGGTGCTTAGAAAGAAT N241R GCGGACTTGAGTGTTTGTSNNGTTCGGGTGC ITAGAAAG N242R GCTGCGGACTTGAGTGTTSNNCCAGTTCGGGTGCTTAGA N243R ACTGCTGCGGACTTGAGTSNNTGTCCAGTTCGGGTGCTT N244R TAAACTGCTGCGGACTTGSNNGTTTGTCCAGTTCGGGTG N245R TTCTAAACTGCTGCGGACSNNAGTGTTTGTCCAGTTCGG N246R GTTTTCTAAACTGCTGCGSNNTTGAGTGTTTGTCCAGTT N247R - GGTGTTTTCTAAACTGCTSNNGACTTGAGTGTTTGTCCA N248R AGTGGTGTTTTCTAAACTSNNGCGGACTTGAGTGTTTGT N249R TGTAGTGGTGTTTTCTAASNNGCTGCGGACTTGAGTGTT N250R TTTTGTAGTGGTGTTTTCSNNACTGCTGCGGACTTGAGT N251R AAGTTTTGTAGTGGTGTTSNNTAAACTGCTGCGGACTTG N252R ACCAAGTTTTGTAGTGGTSNNTTCTAAACTGCTGCGGAC N253R ATCACCAAGTTTTGTAGTSNNGTTTTCTAAACTGCTGCG N254R AGAATCACCAAGTTTTGTSNNGGTGTTTTCTAAACTGCT N255R GAAAGAATCACCAAGTT SNNAGTGGTGTTTTCTAAACT N256R GTAGAAAGAATCACCAAGSNNTGTAGTGGTGTTTTCTAA N257R ATAGT AG AAAG AATC ACC SNNTTT GTAGTGGTGTTTTC N258R TCCATAGTAGAAAGAATCSNNAAGTTTTGTAGTGGTGTT N259R rITTTCCATAGTAGAAAGASNNACCAAGIT rGTAGTGGT N260R CCCTTTTCCATAGTAGAASNNATCACCAAGTTTTGTAGT N261R CAGCCCTTTTCCATAGTASNNAGAATCACCAAGTTTTGT N262R G ATC AGCCCTTTTCC AT AS NNG A A AG AATC ACC A AGTTT
trucción de Bibliotecas de Mutación múltiple BPN
Las bibliotecas de mutación múltiple BPN' sinté otecas combinatorias) se produjeron por clear, y Bioke. Cada biblioteca de mutación sintética contiene una mezcla de genes BPN1 en o más codones seleccionados de la secuencia m plazaron aleatoriamente por secuencias cíficas. Por ejemplo: una biblioteca combinato odría diseñar de tal forma que el codón 2 encia madura se podría sustituir aleatoriame s de ADN que codifica para Thr, Gln, Val o Ty ara Val, Gln, Asn o Tyr, codón 31 para He, His y codón 48 para Ala, Glu, His o Asp . En este iblioteca combinatoria podría contener un máxim antes combinatorias BPN' . Sin embargo, una bi utación múltiple BPN' típica podría contene
CCGAG CGTCGCTTAC GTTGAAGAAG ATCACGTAGC AC GTCCG TGCCTTACGG CGTATCACAA ATTAAAGCCC CT AAGGC TACACTGGAT CAAATGTTAA AGTAGCGGTT AT GATTC TTCTCATCCT GATTTAAAGG TAGCAGGCGG AG TTCTG AAACAAATCC TTTCCAAGAC AACAACTCTC AC CCGGC ACAGTTGCGG CTCTTAATAA CTCAATCGGT GT CCAAG CGCATCACTT TACGCTGTAA AAGTTCTCGG TG SCCAAT ACAGCTGGAT CATTAACGGA ATCGAGTGGG CG TGGAC GTTATTAACA TGAGCCTCGG CGGACCTTCT GG AAAGC GGCAGTTGAT AAAGCCGTTG CATCCGGCGT CG AGCCG GTAACGAAGG CACTTCCGGC AGCTCAAGCA CA GTAAA TACCCTTCTG TCATTGCAGT AGGCGCTGTT GA AGAGC ATCTTTCTCA AGCGTAGGAC CTGAGCTTGA TG CGTAT CTATCCAAAG CACGCTTCCT GGAAACAAAT AC GTACG TCAATGGCAT CTCCGCACGT TGCCGGAGCG GC TCTAA GCACCCGAAC TGGACAAACA CTCAAGTCCG CA
5 µ?. de solución amortiguadora de muestra liPhi y se calentó durante 3 minutos a 95 aturalizar el AD . La reacción se colocó e a enfriar durante 2 minutos y luego gir o brevemente. Después, 5 µ?. de s tiguadora de reacción y 0.2 de pol 9 del kit TempliPhi se agregaron, ciones se incubaron a 30°C en una máquina
Research durante 4 horas . La enzima ph tivó por calor por incubación a 65°C dur tos .
Para transformación de las bibliotecas 0.1 ucto de reacción de amplificación Templ ló con 500 L de células B. subtilis comp rE, AnprE, oppA, AspoIIE, de ? : : (xyIR , pxylA- comK) seguido por ag
Tabla 3-2. Tabla 3-2.
(continuación) (continuación) OS Variante POS Variante
116 A116H 123 N123S
116 A116T 123 N123V
117 N117C 124 M124G
1 17 N117G 124 M124I
117 N117H 124 M124L
117 NI 171 124 M124S
117 N117L 124 M124V
117 N117R 126 L126C
117 N117S 126 L126F
117 N117V 126 L126G
117 N117Y 126 L126H
117 N117Z 126 L126I
118 N118C 126 L126R
118 N118D 126 L126S
1 18 N118G 126 L126V
118 N118H 126 L126Y
118 N118R 127 G127C
118 N118S 127 G127D
119 M119C 127 G127H
119 M119H 127 G127L
119 MI 191 127 G127N
1 19 M119L 127 G127R
1 19 M119N 127 G127S
1 19 M119S 127 G127V
1 19 M119V 128 G128C
120 D120C 128 G128D
120 D120G 128 G128H
120 D120H 128 G128N
Tabla 3-2. Tabla 3-2. (continuación) (continuación)
POS Variante POS Variante
130 S130G 147 V147I
130 S130H 151 A151V
130 S130I 153 A153T
130 S130L 153 A153V
130 S130N 154 G154S
130 S130R 156 E156D
130 S130V 156 E156G
130 SI 30 Y 157 G157D
130 S130Z 157 G157S
131 G131C 160 G160D
131 G131D 160 G160S
131 G131H 161 S161N
131 G131N 166 G166D
131 G131R 166 G166S
131 G131S 169 G169A
131 G131V 175 I175T
131 G131Y 179 A179V
131 G131Z 180 VI 80 A
132 S132C 182 S182N
132 S132D 183 S183G
132 S132G 183 S183N
132 S1 2H 187 A187V
132 SI 321
192 V192A
132 S132L
192 V192I
132 S132N
194 P194L
132 S132R
200 A200T
132 S132T
200 A200V
132 S132V
204 S204P
, K2HP0 3 mM se usó, y el medio de base se com 60 mM urea, glucosa 75 g/L, y soytone al nutrientes se integraron como una solución ma contiene en un litro, 400 mg FeS04 7H20, 100 mg M g ZnS04 7H20, 50 mg CuCl2 2H20, 100 mg CoCl2 6H20 4 2H20, 100 mg Na2B407 10H2O, 10 mi de 1M CaCl2, .5 M citrato de sodio.
EJEMPLO 4
Estabilidad LAS de Variantes BPN»
En este ejemplo, se describen experimentos re evaluar la estabilidad de diversas variantes itución sencilla y variantes BPN7 de sustitución a presencia de LAS. La estabilidad LAS se rminar la actividad AAPF antes y después de la in a presencia de LAS a temperatura elevada (45 °C)
iva de variantes ???' como se compara con B al. Como se determina durante el desarrollo nte invención, numerosas variantes BPN' ilidad demostrablemente mayor en la presencia se compara con la BPN' tipo natural. En partícul o de estabilidad LAS de 92 sitios BPN f examin s (43%) fueron pobres (perjudicial) y 52 siti n buenos (benéfico) . Además de las 1508 v das, 96 (6%) fueron superiores (arriba) , 19 n neutrales (igual) , y 1216 (81%) fueron in
4-1 Resultados de Estabilidad LAS para Var ituidas Individualmente
ódigo Código Código
riante PI Variante PI Variante
1C 2.14 P14T 1.68 P40F
digo PI Código PI Código iante Variante Variante
digo PI Código PI Código íante Variante Variante
101E 1.4 N109V 1.56 A133W 101G 1.61 N109W 1.65 A134D 101P 1.19 N109Y 1.22 A134E 102A 1.42 E112A 2.9 A134G 102S 1.27 E112C 2.08 K136E 103C 1.39 E112F 2.75 136H 103F 1.42 E112G 2.84 A137C 103G 1.65 E112I 2.85 A137F 103I 1.4 E112L 2.68 A137H 103K 1.63 E112M 2.86 A137K 103M 1.22 E112N 1.98 A137L 103N 1.25 E112Q 2.53 A137M 103R 1.58 E1 12S 2.68 A137R 103T 1.5 E112T 2.56 A137W 103W 1.69 E112V 2.59 A137Y 105A 1.29 E112W 2.84 V139C 105G 1.27 E112Y 2.53 K141C 105D 1.46 W113N 1.22 K141D 105E 1.38 I115N 1.45 K141E 105K 1.89 1115R 1.7 K141F 105L 1.25 I115T 1.31 K141G 106A - 1.31 A116D 1.23 K141H 106C 1.53 A116K 1.55 K141I 106E 1.69 A116R 1.62 K141L 106F 1.43 N118C 1.23 K141N 141Q 1.39 S183C 1.92 Y217L
digo PI Código PI Código íante Variante Variante
digo PI Código PI Código
íante Variante Variante
22F 1.57 Q103A 1.18 K170E
22? 1.23 Q103C 1.67 V203C
022S 1.18 Q103E 1.48 S 101Q
22W 1.65 Q103F 1.47 S 101T
022? 1.69 Q103I 1.3 S 101V
026F 1.18 Q103L 1.2 G166N
026G 1.18 Q103S 1.2 G166Q
31E 1.25 Q103T 1.26 G 166R
31F 1.17 Q103V 1.18 S101I
31H 1.24 Q103W 1.34 S 101L
1N 1.23 Y104F 1.28 S101N
031S 1.2 Y104W 1.58 G 166H
31T 1.32 M124I 2.02 G 166K
045E 1.28 VI 47 A 1.17 G 166M
067P 1.32 V147E 1.26 G097E
072A 1.38 V147S 1.35 S 101C
072C 1.25 VI 49 A 1.82 S 101E
087D 1.32 V149C 1.43 V149S
092S 1.22 V149D 1.39 V149T
096I 1.39 V149E 2.06 G166C
96M 1.34 V149F 1.68 G097D
V149P
4-2 Resultados de Estabilidad LAS para Varían tuidas por Multiplicado
Código de Variante PI
N-K213N-Y217L 1.7 F-K213L-Y217E 1.6 P-K213N 1.6 -M119H-K213N 1.6 N-M119F-K213I-Y217L 1.4 L 1.3 N-K213N 1.7 N 1.5 I-Y217E 1.3 N-M119H-Y217Q 1.4 P-K213N-Y217L 1.6 N-K213I 1.2 N-Y217Q 1.6 H-K213N 1.6 N-K213L-Y217Q 1.4 P-K213N 1.6 E-K213N-Y217E 1.8 E- 119H-K213I-Y217Q 1.5 E- 119H-K213N 1.6 I-Y217Q 1.2 N-K213I-Y217Q 1.5 H-Y217Q 1.3 N-M 119N-K213N- Y217Q 1.8 H-K213I-Y217Q 1.4 I-Y217Q 12 E-M119N-Y217L 1.4 F-K213L 1 .3 9H-K213N-Y217E 1.9 N-M119N-K213N-Y217Q 1.7 N-M119H-K213N-Y217Q 1.7
Código de Variante PI
N-K213I-Y217Q 1.2 E-M119H- 213I-Y217L 1.9 N- 119H-K213I-Y217Q 1.5 II-K213N-Y217E 1.4 N-M1 19N-K213N-Y217L 1.4 E-K213L 1.2 H-K213L 1.2 Q-A048Y-K213L 1.1 N 1.3 N-K213L 1.2 N-K213L 1.2 Y-K213N 1.4 D-K213N 1.2 Q-A048E-K213L 1.2 H-K213N 1.3 Q-A048H-K213L 1.2 II-K213L 1.2 L 1.2 N 1.5 D-K213L 1.3 1 1.1 Q-A048E-K213N 1.2 N-A048E-K213N 1.4 E-K213L 1.9 Y-A048E-K213I 1.7 D-K213N 1.4 1 1.1 H-K213N 1.5 -
Código de Variante PI
E-Y217L 1.3 H-A045V-Y217Q 1.1 H-Y217E 1.4 W-Y217E-(N0212S) 1.2 I-Y217Q 1.1 H-A045V-Y217E 1.4 W-A045 V-S 101 E- Y217Q 1.2 H-S 101E-Y217E 1.4 W-S101N-Y217L 1.1 S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A1 14A-V246T 1.1 H-A045V-S101E 1.1 W-A045V-S101E-Y217L 1.2 N-M119H-K213K-Y217Q 1.3 S-M119N-K213N-Y217Q 1.6 H-A045V-S101P-Y217L 1.2 S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T 1.2 S-M119F-K213I-Y217Q 1.3 S-M119M-K213K-Y217L 1.3 H-A045I-S101E-Y217Q 1.3 H-A045V-S101E-Y217E L5 H-A045V-S101E 1.1 H-Y217L 1.1 H-A045I-Y217E 1.5 W-A045I-S101E-Y217E 1.4 N-M119F-K213 -Y217L 1.2 E-M119H-K213N-Y217E 1.3 H-A045I-Y217E 1.4 S-M119H-K213L-Y217L 1.5 1?-?217? 1.6
idad específica relativa en los cuales la acti ntes BPN1 se compara con actividad de BPN' tipo En particular la actividad específica relativ ión de la actividad específica variante a la a ífica tipo natural. Un valor mayor que uno (PI>1 idad específica mayor hacia el sustrato AAPF.
Tabla 5-1 Actividad Específica de Variantes BPN' Sustituidas Individualme
igo de Código de Código de
íante Variante Variante
ode PI uode PI oae
006N 1.25 I1 15R 1.30 I175V
006T 1.21 G131P 1.29 Y217C
019E 1.26 G131R 1.21 Y217L
35T 1.17 A137W 1.18 Y217M
42V 1.19 A 137 Y 1.18 Y217S
050K 1.32 V139C 1.23 N218S
050R 1.51 K141F 1.18 S236V
050T 1.35 K141I 1.39 H238R
59W 1.59 K141S 1.19 256F
86M 1.44 K141Y 1.25 K256P
86Y 1.22 V143D 1.21 K256Q
098I 1.26 V143N 1.35 K256W
)98T 1.34 V143Q 1.41 256Y
098V 1.49 S145 1.25
ibe en toda la presente, funcionalidad de las variante ifico como un índice de desempeño (PI) , que es la re peño de una variante a un proteína precursora. Las gr adas en la presente incluyen: Mutaciones superiores (P iones neutrales (PI > 0.5); Mutaciones no perjudicia ; y Mutaciones perjudiciales (PI < 0.05). "M nables" son aquellas mutaciones para las que la varía es de índice de desempeño = 0.5 por al menos una pro para todas las propiedades. Las mutaciones combin iones que se pueden combinar para suministrar prot es de Desempeño adecuados para una o más propiedades osiciones en las cuales las mutaciones ocurren se c sigue: Posiciones no restrictivas tienen > 20% m ales para al menos una propiedad; y Posiciones res n < 20% mutaciones neutrales para actividad y estábili
Estos datos encuentran uso para fabricar por i
aron en letras cursivas negritas en la tabla . También,
a de la estabilidad, si el índice de Desempeño de act
nsayos de estabilidad fue menor o igual a 0 . 05 , el
peño de estabilidad asociado se fij ó a 0 . 05 .
Tabla 6-1 Valores de Indice de Desempeño para Variantes BPN'
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
1 A001C 0.74 0.84 1.10 0.79 1.1
1 A001D 1.34 0.93 1.12 0.88 1.1
1 A001E 0.82 0.94 0.85 0.84 1.5
1 A001F 1.39 0.94 1.01 0.84 0.4
1 A001G 1.39 0.90 1.12 1.06 1.1
1 A001H 1.26 0.99 1.04 0.98 0.9
1 A001I 1.50 0.72 1.00 0.92 0.6
1 A001K 1.23 0.83 0.79 1.11 0.2
1 A001L 0.96 0.86 0.81 0.94 0.6
1 A001M 1.34 1.02 1.07 1.08 0.9
1 A001N 1.29 1.02 0.81 0.98 1.0
1 A001P 0.27 1.16 1.46 1.14 0.7
1 A001Q 0.88 1.00 0.97 0.98 1.2
1 A001R 1.00 0.89 0.72 0.91 0.1
1 A001S 1.09 0.89 1.00 1.05 0.9
1 A001T 1.13 1.00 1.16 1.02 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
Q002S 0.77 0.93 1.23 0.80 0.05
Q002T 0.38 0.93 0.95 0.93 0.05
Q002V 0.42 1.17 0.96 1.17 0.05
QQ02W 0.17 3.77 6.93 2.44 0.05
Q002Y 0.44 0.93 0.85 1.03 0.05
S003A 1.19 1.20 0.97 0.89 0.3
S003C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
S003D 1 .24 1.1 1 1.08 0.97 1.0
S003E 0,05 0.05 0.05 0.05 0.05
S003F 1.20 0.90 0.95 0.86 0.2
S003G 1.45 0.96 1.03 1.05 0.05
S003H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
S003I 1.24 0.80 0.90 1.05 1.0
S003K 1.28 0.97 0.80 0.95 0.1
S003L 1.13 0.90 0.84 1.06 0.6
S003M 1.35 0.83 1.04 0.92 1.1
S003N 1.18 0.98 1.15 0.85 0.5
S003P 1.01 1.08 1.09 0.89 0.05
S003Q 1.38 0.97 0.96 1.08 1.3
S003R 1.37 0.75 0.62 1.00 0.05
S003T 1.31 1.09 1.01 0.87 1.2
S003V 1.19 0.84 0.80 1.06 1.0
S003W 1.50 0.71 0.65 0.91 0.1
S003Y 1.25 0.76 0.72 0.92 0.2
VQQ4A 0.83 0.90 1.07 1.00 0.05 V004C 0.87 1.03 1.22 0.92 0.3
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI B I PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
4 V004Y 0.79 0.93 1.03 1.08 0.05
5 P005A 0.53 0.86 0.73 0.79 0.05
5 P005C 0.70 0.94 0.80 0.92 0.05
5 P005D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
5 P005E 0.79 1.02 0.79 0.94 0.05
5 P005F 0.22 0.55 0.44 0.61 0.1
5 P005G 0.98 1.09 1.10 0.98 0.3
5 P005H 0.38 0.96 0.88 1.09 0.05
5 P005I 0.21 0.49 0.96 1.02 0.1
5 P005 0.16 4.53 2.60 0.65 0.6
5 P005L 0.21 1.50 1.40 1.49 0.05
5 P005M 0.41 1.02 1.11 1.13 0.05
5 P005N 0.68 0.91 0.91 1.00 0.05
5 P005Q 0.70 1.08 0.84 0.97 0.05
5 P005R 0.16 0.05 0.05 1.56 0.3
5 P005S 0.74 0.98 1.09 1.01 0.05
5 P005T 0.73 1.16 0.91 0.97 0.05
5 P005V 0.27 0.72 1.30 1.14 0.05
5 P005W 0.43 0.79 0.82 0.76 0.05
5 P005Y 0.17 3.33 3.27 2.19 0.05
6 Y006A 1.02 1.14 1.03 1.01 0.8
6 Y006C 1.04 1.03 0.95 0.83 0.7
6 Y006D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
6 Y006E 1.49 1.13 0.76 LOO 1.1
6 Y006F 1.17 0.84 0.88 0.81 0.6
6 Y006G 1.00 1.20 1.09 0.78 0.7
Tabla 6-1 (continuación)
Variante TCA PT PI BMI PI BMI PI BMI LAS- BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
G007I 0.34 0.06 0.05 0.05 0.05
G007K 0.35 0.11 0.05 0.05 0.05
G007L 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
G007M 0.27 0.05 0.05 0.05 0M
G007N 0.95 0.85 0.85 0.95 0.05
G007Q 0.15 0.05 0.05 0.05 0.05
G007R 0.25 0.16 0.05 0.05 0.05
G007S 0.85 0.72 0.70 0.96 0.05
G007T 0.19 2.98 2.43 3.02 0.1
G007V 0.34 0.05 0.05 0.05 0.05
G007W 0.16 0.05 0.05 4.88 0.05
G007Y 0.20 039 0.05 0.05 0.05
V008A 0.57 1.02 0.78 0.98 0.05
V008C 0.81 0.87 0.93 1.10 0.1
V008D 0.27 0.05 0.05 0.05 0.05
V008F 0.46 0.77 0.76 1.07 0.05
V008G 0.26 1.38 0.49 1.41 0.05
V008H 0.39 0.88 0.66 1.25 0.05
V008I 0.91 1.06 0.87 1.01 1.0
V008K 0.19 3.07 3.04 3.06 0.2
V008L 0.83 0.91 0.98 1.03 0.2
V008M 0.85 0.95 0.98 0.92 0.05
V008P 0.19 2.71 3.00 2.94 0.05
V008Q 0.30 0.94 0.74 1.43 0.05
V008R 0.21 0.83 0.14 1.14 0.2 _ V008S 0.30 1.14 0.89 1.37 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
9 S009R 1.21 0.98 0.82 0.77 0.05
9 S009T 1.16 1.07 1.11 0.80 1.3
9 S009V 1.51 0.99 0.75 0.86 0.9
9 S009W 1.31 0.86 0.84 0.82 0.05
9 S009Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
10 Q010A 1.06 0.90 1.06 1.00 0.5
10 Q010C 1.25 0.92 0.94 0.93 0.7
10 Q010D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
10 Q010E 1.07 0.70 1.01 0.99 1.5
10 Q010F 1.18 0.89 0.84 0.98 0.05
10 Q010G 1.34 0.95 0.93 0.90 0.3
10 Q010H 1.20 1.04 1.07 0.92 0.9
10 Q010I 1.22 0.80 0.70 0.72 0.05
10 Q010K 1.16 0.83 0.49 0.89 0.1
10 Q010L 1.19 0.89 0.68 0.85 0.05
10 Q010M 1.26 0.82 0.97 1.07 0.5
10 Q010N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
10 Q010P 0.18 0.05 1.50 0.09 0.05
10 Q010R 1.15 0.82 0.60 0.73 0.05
10 Q010S 1.00 0.88 0.90 0.87 0.5
10 Q010T 1.25 1.04 1.00 0.85 0.8
10 Q010V 1.24 0.96 0.80 1.00 0.2
10 Q010W 1.04 0.97 0.81 1.00 0.05
10 Q010Y 0.44 0.97 0.79 0.99 0.4
11 1011 A 0.28 0.90 1.10 1.10 0.3
11 1011C 1.02 1.07 0.88 0.90 0.7
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
11 I011Y 0.21 0.05 0.11 0.05 0.05
12 K012A 1.48 0.85 0.82 1.02 1.2
12 K012C 1.24 0.73 0.94 0.93 1.4
12 K012D 1.26 0.49 1.06 0.89 1.4
12 K012E 1.35 0.62 0.71 0.85 1.4
12 K012F 1.04 0.60 0.80 0.68 1.3
12 K012G 1.50 0.94 0.88 0.90 1.4
12 K012H 1.24 0.94 1.03 0.92 1.3
12 KOI 21 1.24 0.68 0.65 0.96 1.2
12 K012L 0.17 3.09 4.59 1.99 0.6
12 K012M 0.34 0.05 0.05 0.06 0.05
12 K012N 1.13 0.86 0.93 0.85 1.3
12 K012P 0.31 0.05 0.05 0.05 0.05
12 K012Q 1.35 0.96 0.61 1.01 1.3
12 K012R 0.73 0.83 0.84 0.83 0.9
12 K012S 1.07 0.71 0.74 0.72 1.0
12 K012T 1.13 1.07 0.95 0.84 1.1
12 K012V 1.57 0.80 0.83 0.98 1.1
12 K012W 1.35 0.54 0.85 0.94 1.2
12 K012Y 1.38 0.52 0.90 0.67 1.3
13 A013C 1.05 0.99 0.77 0.83 0.6
13 A013D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
13 A013E 0.35 0.05 0.05 0.05 0.05
13 A013F 0.33 0.05 0.08 0.05 0.05
13 A013G 1.56 1.02 1.05 0.84 0.7
13 A013H 0.33 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
P014E 1.27 0.55 1.14 0.95 0.9
P014F 0.93 0.57 0.89 0.90 0.05
P014G 1.35 0.92 1.20 0.94 0.2
P014H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
P014I 0.89 0.85 1.19 0.94 0.7
P014K 1.36 0.51 0.90 0.95 0.05
P014L 0.43 0.74 1.58 1.02 0.6
P014M -1.50 0.77 1.17 0.93 0.3
P014N 1.10 0.80 0.98 0.91 0.1
P014Q 1.34 0.62 0.94 0.81 0.6
P014R 1.19 0.41 0.67 0.98 0.05
P014S 0.96 0.79 1.06 0.96 0.1
P014T 0.98 0.99 1.08 0.83 0.9
P014V 1.32 0.88 1.10 0.90 0.7
P014W 1.17 0.84 1.18 0.94 0.05
P014Y 1.16 0.92 0.95 1.01 0.05
A015C 1.72 0.83 0.87 0.90 1.3
A015D 1.60 0.66 0.77 0.75 1.3
A015E 1.68 0.62 0.77 1.11 1.5
A015F 1.39 0.78 0.68 0.85 0.9
A015G 1.63 0.77 0.66 0.76 0.9
A015H 0.90 0.64 0.77 0.93 1.0
A015I 1.52 0.46 0.88 0.86 1,1
A015K 1.50 0.74 0.59 0.69 0.3
A015L 1.52 0.89 0.77 0.88 1 .1
A015 0.96 0.95 0.62 1 01 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
LO 161 1.22 0.51 1.21 1.05 1.0
L016K 0.36 0.62 1.09 0.99 0:5
L016M 1.63 0.76 0.97 1.13 1.0
L016N 0.59 0.71 1.10 1.05 0.8
L016P 0.50 0.73 1.05 1.07 0.8
L016Q 0.90 0.88 1.02 1.04 0.9
L016R 0.15 0.05 0.05 0.05 0.05
L016S 0.92 0.81 1.09 0.96 0.7
L016T 1.30 0.63 1.02 1.07 0.9
L016V 0.17 0.05 1.28 0.30 0.05
L016W 0.17 3.37 6.22 3.16 0.1
L016Y 0.25 0.76 1.58 1.43 0.05
H017A 0.37 0.41 0.95 0.94 0.4
H017C 0.33 0.80 0.73 1.01 0.7
H017D 0.18 0.05 0.22 0.26 0.05
H017E 0.30 0.81 1.09 LOO 0.4
H017F 1.40 0.72 1.01 0.85 0.3
H017G 0.19 1.02 0.45 1.57 0.6
H017I 1.36 0.57 0.99 LIO 0.8
H017K 0.13 0.05 0.05 0.05 0.2
H017L 1.15 0.90 1.06 0.93 0.5
H017M 1.29 0.60 1.24 0.94 0.7
H017N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 H017P 0.14 0.05 0.05 0.05 0.05 H017Q 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 H017R 0.15 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
18 S018N 1.68 0.59 1.12 0.94 1.1
18 S018P 1.19 0.65 1.06 0.83 1.3
18 S018Q 1.68 0.80 1.12 0.99 1.0
18 S018R 1.61 0.71 0.99 1.02 0.05
18 S018T 1.64 0.67 1.25 0.99 1.1
18 S018V 1.67 0.57 1.17 1.14 0.8
18 S018W 1.59 0.73 1.06 1.00 0.4
18 S018Y 1.86 0.81 1.25 1.08 0.8
19 Q019A 1.82 1.07 0.99 1.05 0.8
19 Q019C 0.88 1 .08 ' 0.90 0.81 1.0
19 Q019D 0.87 0.98 0.95 0.67 1.1
19 Q019E 1.02 0.97 0.61 0.90 1.2
19 Q019F 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
19 Q019G 1.33 0.99 1.15 0.87 0.8
19 Q019H 0.82 1.05 0.98 0.72 0.9
19 Q019I 0.89 1.06 0.87 1.03 0.9
19 Q019K 0.86 0.87 0.78 0.77 0.6
19 QP19L 0.98 0.95 0.61 0.87 1.0
19 Q019M 0.90 1.02 1.01 0.90 0.7
19 Q019N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
19 Q019P 0.38 0.05 0.08 0.05 0.05
19 Q019R 1.09 1.03 0.64 0.74 0.4
19 Q019S 0.82 1.03 1.14 0.92 0.8
19 Q019T 0.93 0.94 1.00 0.84 0.8
19 Q019V 0.88 1.12 1.04 0.97 0.7
19 Q019W 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
20 G020T 0.54 0.82 1.24 1.08 0.9
20 G020V 0.22 0.97 1.37 1.53 0.8
20 G020W 0.63 0.88 1.15 1.05 0.8
20 G020Y 0.70 0.57 1.03 1.04 0.9
21 Y021A 1.15 0.8.5 0.77 0.94 0.9
21 Y021C 1.15 0.79 1.02 0.86 0.9
21 Y021D 0.84 0.83 0.76 1.02 0.9
21 Y021E 0.71 0.82 0.77 0.89 1.0
21 Y021F 1.13 0.59 0.77 0.97 1.0
21 Y021G 0.46 0.60 0.76 0.89 1.0
21 Y021H 1.22 0.78 0.69 0.98 1.1
21 Y021K 0.72 0.61 0.47 1.00 0.8
21 Y021L 0.92 0.78 0.75 0.99 1.0
21 Y021M 1.17 0.88 0.87 0.95 1.0
21 Y021P 0.47 0.50 0.88 1.08 1 ,2
21 Y021Q 0.74 0.88 0.87 1.02 0.9
21 Y021R 0.95 0.70 0.77 0.94 0.7
21 Y021S 0.98 0.71 0.84 0.93 0.9
21 Y021T 1.33 0.81 0.76 0.93 1.0
21 Y021V 1.15 0.70 0.99 1.00 1.1
21 Y021W 0.83 0.68 0.70 1.04 1.0
22 T022A 0.67 0.85 0.92 0.86 1.2
22 T022C 1.21 1.12 0.74 1.08 1.3
22 T022D 0.76 0.98 0.74 1.03 1.3
22 T022E 1.33 1.01 0.89 0.90 1.6
22 T022F 1.37 1.09 0.73 1.06 1.2
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN* pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
23 G023F 0.22 0.11 0.06 0.05 0.05
23 G023H 0.21 0.11 0.05 0.08 0.05
23 G023I 0.19 0.05 0.05 0.15 0.05
23 G023K 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
23 G023L 0.20 026 0.06 0.15 0.05
23 G023M 0.31 0.05 0.05 0.05 0.05
23 G023N 0.19 0.05 0.05 0.14 0.05
23 G023P 0.30 0.08 0.05 0.06 0.05
23 G023Q 0.26 0.08 0.05 0.10 0.05
23 G023R 0.22 0.14 0.05 0.05 0.05
23 G023S 0.17 10.83 4.09 2.61 1.1
23 G023T 0.21 0.16 0.05 0.05 0.05
23 G023V 0.14 0.05 0.26 0.05 0.05
23 G023W 0.25 0.10 0.05 0.05 0.05
23 G023Y 0.15 0.05 0.50 0.05 0.05
24 S024C 1.12 1.15 0.86 0.94 1.1
24 S024F 1.07 1.15 0.93 1.05 1.0
24 S024G 0.56 0.92 0.68 1.01 1.2
24 S024H 0.97 1.11 0.98 1.18 1.1
24 S024I 1.02 1.16 1.02 1.15 1.1
24 S024K 1.17 1.03 0.82 1.04 0.9
24 S024L 1.17 1.02 1.01 1.02 1.2
24 S024M 1.15 1.07 0.98 1.02 1.2
24 S024N 1.16 0.99 0.88 1.11 1.2
24 S024P 0.44 1.10 0.76 0.96 1.1
24 S024Q 0.90 0.96 0.94 1.11 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
25 N025P 0.71 0.53 1.10 0.81 .0.8
25 N025Q 1.10 0.61 . 1.21 1.09 1.0
25 N025R 1.34 0.68 1.02 1.12 1.0
25 N025S 0.85 0.60 1.18 1.01 1.0
25 N025T 1.06 0.73 1.21 1.12 0.8
25 N025V 0.59 0.45 1.27 1.11 0.9
25 N025W 1.42 0.53 1.30 1.00 0.9
25 N025Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
26 V026C 1.14 0.96 0.91 1.02 1.0
26 V026D 0.16 0.05 0.05 31.85 1.1
26 V026E 0.36 1.12 0.79 1.19 1.0
26 V026F 0.35 0.97 0.90 1.19 1.1
26 V026G 0.54 0.91 0.75 1.07 1.0
26 V026H 0.46 1.45 0.86 1.19 1.1
26 V026I 0.91 0.75 0.70 1.09 1.2
26 V026K 0.77 1.03 0.67 1.1 1 1.1
26 V026L 0.59 0.92 0.85 0.96 1.0
26 V026M 0.80 0.90 0.85 0.98 1.0
26 V026N 0.44 1.00 0.79 1.21 1.0
26 V026P 0.14 0.05 0.05 0.05 0.8
26 V026Q 0.61 0.96 0.78 1.02 1.0
26 V026S 0.82 0.82 0.85 0.95 0.9
26 V026T 0.92 0.98 0.98 1.02 0.9
26 V026W 0.25 2.33 1.16 2.13 1.1
26 V026Y 0.31 1.34 1.28 1.50 1.0
27 K027A 1.08 0.76 1.13 1.05 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
sición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- ??
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
27 K027W 0.36 0.69 1.47 1.33 0.9
27 K027Y 0.45 1.00 1.19 1.03 0.9
28 V028A 0.46 0.95 0.84 1.02 0.9
28 V028C 0.65 1.20 0.99 1.08 1.0
28 V028D 0.58 0.05 0.05 . 0.05 0.05
28 V028E 0.16 0.05 0.05 3.97 1.0
28 V028G 0.16 0.05 0.05 2.42 0.05
28 V028H 0.20 1.08 0.79 1.03 1.1
28 V028I 1.02 1.27 1.00 1.06 1.1
28 V028M 1.05 0.99 0.68 0.91 0.6
28 V028N 0.21 0.31 0.67 0.50 1.1
28 V028P 0.53 0.06 0.05 0.05 0.05
28 V028Q 0.18 2.79 1.99 1.43 1.6
28 V028R 0.40 0.05 0.05 0.05 0.05
28 V028S 0.18 5.70 5.17 3.40 1.1
28 V028T 0.58 1.31 1.18 1.13 1.0
28 V028W 0.31 0.07 0.05 0.05 0.05
28 V028Y 0.20 0.68 0.48 0.81 0.05
29 A029C 0.76 1.32 1.19 1.13 0.9
29 A029D 0.19 2.95 2.74 2.34 0.9
29 A029E 0.23 0.06 0.05 0.09 0.05
29 A029F 0.42 0.05 0.05 0.05 0.05
29 A029G 0.94 1.08 0.88 1.06 LO
29 A029H 0.47 0.05 0.05 0.05 0.05
29 A029K 0.47 0.06 0.05 0.05 0.05
29 A029L 0.24 0.35 0.12 0.26 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
30 V030I 1.15 1.16 1.03 1.07 1.1
30 V030L 1.24 1.09 0.86 0.87 1.0
30 V030M 0.89 0.66 0.80 0.79 0.8
30 V030N 0.25 1.06 1.30 1.50 1.1
30 V030P 0.27 0.13 0.13 0.09 0.05
30 V030Q 0.21 0.82 0.99 1.10 0.05
30 V030R 0.20 0.13 0.05 0.22 0.05
30 V030S 0.28 1.25 1.21 1.43 0.3
30 V030T 0.30 1.39 1.27 1.38 0.9
30 V030W 0.26 0.11 0.05 0.08 0.05
30 V030Y 0.21 0.43 0.05 0.21 0.05
31 1031 A 0.90 0.96 0.85 0.97 1.1
31 1031C 0.94 1.16 0.87 1.02 1.1
31 103 ID 0.20 1.18 1.43 1.13 1.2
31 10 1E 0.21 2.56 1.98 2.40 1.1
31 1031F 0.92 1.26 0.92 1.00 1.1
31 1031G 0.17 5.42 3.74 2.40 1.1
31 1031H 0.26 1.98 1.57 1.79 1.3
31 1031K 0.32 1.84 1.28 1.39 1.2
31 1031L 1.12 0.89 0.88 0.85 1.2
31 1031M 1.21 0.98 0.83 0.99 1.1
31 I031N 0.23 2.34 2.01 1.96 1.3
31 I031P 0.24 0.16 0.06 0.17 1.5
31 I031Q 0.19 5.38 3.51 3.08 1.1
31 103 IR 0.31 0.10 0.05 0.05 0.05
31 1031S 0.21 3.71 2.83 2.91 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
32 D032S 0.40 0.05 0.05 0.05 0.05
32 D032T 0.27 0.05 0.05 0.05 0.05
32 D032V 0.30 0.20 0.05 0.05 0.05
32 D032Y 0.28 0.13 0.11 0.05 0.05
33 S033A 0.82 0.84 0.84 0.83 0.7
33 S033C 0.73 0.66 0.55 0.71 1.0
33 S033E 0.44 1.21 0.81 0.92 0.8
33 S033F 0.53 1.38 0.59 0.95 0.05
33 S033G 0.96 1.14 0.80 1.01 0.9
33 S033H 0.48 1.65 0.82 1.17 0.05
33 S033K 0.25 1.24 0.81 0.77 0.05
33 S033L 0.25 1.02 0.56 0.39 0.05
33 S033N 0.45 1.14 0.90 1.03 0.6
33 S033P 0.27 0.18 0.05 0.05 0.05
33 S033Q 0.36 0.69 0.72 0.72 0.5
33 S033R 0.33 1.10 0.53 0.80 0.05
33 S033T 0.82 0.74 0.64 0.85 1.0
33 S033V 0.50 0.56 0.57 0.54 0.9
33 S033W 0.34 1.15 0.39 0.51 0.05
34 G034A 0.27 0.81 0.91 0.81 0.5
34 G034C 0.26 0.05 0.05 0.12 0.05
34 G034D 0.28 0.05 0.05 0.06 0.05
34 G034E 0.27 0.05 0.06 0.13 0.05
34 G034F 0.29 0.05 0.05 0.12 0.05
34 G034H 0.32 0.05 0.05 0.07 0.05
34 G034I 0.26 0.05 0.07 0.10 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
35 1035 F 0.17 0.05 1.52 0.33 0.05
35 1035 G 0.18 0.21 1.85 1.07 1.0
35 I035H 0.26 0.05 0.05 0.05 0.05
35 1035 K 0.16 0.05 0.05 2.01 0.05
35 1035 L 0.61 0.68 1.14 1.03 0.7
35 I035M 0.33 0.71 1.27 1.07 0.8
35 I035N 0.20 0.05 0.34 0.09 0.05
35 1035 P 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
35 I035Q 0.16 0.05 0.05 1.69 1.0
35 1035 R 0.31 0.05 0.06 0.05 0.05
35 1035 S 0.24 1.04 2.03 1.68 0.7
35 1035 T 0.42 0.89 1.31 1.15 0.8
35 I035V 0.83 0.85 1.17 1.03 0.9
35 I035W 0.17 0.05 0.61 0.05 0.05
35 I035Y 0.16 0.05 10.64 0.05 0.05
36 D036A 1.00 0.58 0.60 0.94 0.4
36 D036C 0.98 0.91 0.75 0.87 0.3
36 D036E 1.30 1.13 0.83 0.94 0.6
36 D036F 0.47 0.58 0.72 1.03 0.05
36 D036G 0.37 0.79 0.58 0.76 0.05
36 D036H 0.56 0.49 0.52 1.00 0.6
36 D036I 0.27 1.27 1.02 1.41 0.05
36 D036K 0.18 0.05 0.05 0.05 0.1
36 D036L 0.25 1.87 1.26 1.40 0.05
36 D036M 0.56 0.61 0.47 0.76 0.05
36 D036N 0.84 0.52 0.58 0.91 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
37 S037L 0.98 1.04 0.91 0.78 0.8
37 S037M 1.31 1.00 1.07 0.82 0.9
37 S037N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
37 S037P 0.48 1.48 0.90 1.13 0.4
37 S037Q 1.31 1.09 1.24 0.87 0.9
37 S037R 1.26 0.98 0.63 0.85 1.2
37 S037T 0.94 1.05 1.00 0.87 0.7
37 S037V 0.98 1.09 0.86 0.76 0.7
37 S037W 1.07 1.01 1.01 0.88 0.8
37 S037Y 0.19 0.21 0.16 0.13 0.05
38 S038A 1.17 1.14 1.06 1.03 0.9
38 S038C 1.27 0.96 1.02 1.03 1.2
38 S038D 0.67 1.26 1.19 1.07 1.2
38 S038E 1.31 1.02 1.11 0.97 1.3
38 S038F 0.97 0.99 0.97 1.07 1.0
38 S038G 1.43 1.01 1.04 1.13 0.9
38 S038H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
38 S038I 1.07 0.98 1.08 1.01 1.1
38 S038K 1.25 0.75 0.80 1.02 1.3
38 S038L 1.06 0.90 1.11 1.12 1.1
38 S038M 1.33 1.10 1.07 1.00 1.0
38 S038N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
38 S038P 1.16 1.12 0.93 0.99 0.5
38 S038Q 1.11 1.06 0.87 1.08 1.1
38 S038R 2.01 0.65 0.89 1.01 1.4
38 S038T 1.20 0.86 1.07 1.05 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
39 H039R 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
39 H039S 0.48 0.80 0.90 1.02 0.05
39 H039T 0.37 1.07 1.35 1.31 0.05
39 H039V 0.69 0.85 1.10 1.17 0.05
39 H039W 0.87 0.88 1.00 1.04 0.05
39 H039Y 0.14 0.50 0.05 0.05 0.05
40 P040A 1.01 1.23 1.09 1.08 0.8
40 P040C 0.99 1.04 1.19 1.15 1.1
40 P040D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
40 P040E 1.21 1.05 1.34 1.05 1.6
40 P040F 0.92 1.12 1.21 1.09 0.9
40 P040G 1.06 1.04 1.11 1.14 0.1
40 P040H 0.89 0.97 0.98 1.17 0.5
40 P040I 0.83 1.12 1.30 1.10 0.7
40 P040K 1.20 0.78 0.96 0.99 0.05
40 P040L 1.06 1.20 1.05 1.10 1.0
40 P040M 1.01 1.07 1.24 LIO 0.6
40 P040N 0.88 1.12 1.14 1.07 0.5
40 P040Q 1.01 1.16 1.13 1.11 1.1
40 P040R 1.10 0.76 0.84 1.11 0.05
40 P040S 0.84 1.15 1.06 0.81 0.3
40 P040T 0.81 1.29 1.68 1.22 0.1
40 P040V 0.91 1.04 1.07 1.09 0.7
40 P040W 1.09 0.87 0.90 1.13 1.0
40 P040Y 0.89 1.07 1.07 1.06 0.5
41 D041A 0.22 2.48 0.05 0.77 0.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A. A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
41 D041W 0.14 0.05 0.05 0.05 0.05
41 D041Y 0.19 0.05 0.05 11.39 0.05
42 L042A 0.18 0.05 0.58 0.48 0.4
42 L042C 0.41 0.71 0.95 1.06 0.2
42 L042D 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
42 L042E 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
42 L042F 0.32 0.81 0.79 0.99 0.05
42 L042G 0.16 0.05 12.92 0.05 0.05
42 L042H 0.23 0.98 1.26 1.11 0.3
42 L042I 1.15 0.87 0.56 0.92 0.8
42 L042K 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
42 L042M 0.80 1.20 0.99 1.00 0.7
42 L042N 0.23 0.80 0.86 1.21 0.6
42 L042P 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
42 L042Q 0.14 0.05 0.05 0.05 0.2
42 L042R 0.33 0.05 0.05 0.05 0.05
42 L042S 0.16 32.78 0.05 0.37 0.05
42 L042T 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
42 L042V 0.97 0.96 0.88 0.98 0.5
42 L042W 0.14 0.18 0.05 0.05 0.05
42 L042Y 0.17 3.62 4.35 1.94 0.05
43 K043A 0.87 0.67 1.08 0.90 1.2
43 K043C 0.83 0.60 1.17 0.89 1.4
43 K043D 0.88 0.70 1.16 0.71 13
43 043E 0.80 0.56 1.04 0.74 1.3
43 K043F 0.74 0.72 1.24 0.78 1.3
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
44 V044D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
44 V044E 0.18 0.71 2.18 1.98 0.5
44 V044F 0.22 0.77 ¦ 2.45 1.34 0.05
44 V044G 0.21 0.75 1.66 1.12 0.5
44 V044H 0.19 1.63 2.57 1.57 0.5
44 V044I 0.92 0.76 0.98 1.07 0.9
44 V044K 0.22 0.05 0.70 0.36 0.6
¦ 44 V044L 0.85 0.67 1.03 0.85 0.8
44 V044M 0.65 0.95 1.33 1.03 0.6
44 V044N 0.16 0.05 0.05 1.41 0.5
44 V044P 0.67 0.83 1.25 1.03 0.4
44 V044Q 0.20 1.48 2.85 1.49 0.6
44 V044R 0.19 0.79 1.62 0.69 0.2
44 V044S 0.33 1.03 L51 1.13 0.5
44 VÜ44T 0.30 1.32 1.94 1.30 0.7
44 V044W 0.13 0.05 0.05 0.05 0.4
44 V044Y 0.62 0.79 1.22 1.13 0.7
45 A045C 1.09 0.89 0.76 0.89 1.2
45 A045E 1.06 1.10 0.97 0.82 1.2
45 A045F 1.04 0.88 0.81 1.00 1.0
45 A045H 1.04 0.86 0.76 0.91 1.1
45 A045I 1.07 1.08 0.81 1.16 1.2
45 A045K 1.05 1.00 0.69 1.06 0.9
45 A045L 1.03 0.72 0.82 0.99 1.0
45 A045M 1.15 1.02 0.87 1.00 1.2
45 A045N 1.35 1.03 0.91 0.88 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
46 G046N 0.69 0.79 0.72 1.05 1.1
46 G046P 0.17 0.05 0.05 0.05 0.9
46 G046Q 0.15 0.05 0.05 0M5 1.5 .
46 G046S 0.74 0.86 0.78 0.94 0.9
46 G046T 0.39 1.21 0.96 0.79 0.8
46 G046V 0.23 4.92 3.26 2.09 0.8
46 G046W 0.44 1.08 0.66 0.90 1.0
46 G046Y 0.36 1.02 1.27 1.12 0.8
47 G047A 0.32 0.98 0.96 1.04 0.5
47 G047C 0.24 0.64 1.09 0.88 0.6
47 G047D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
47 G047E 0.23 0.72 0.99 1.02 0.6
47 G047F 0.25 0.96 0.86 1.15 0.5
47 G047H 0.23 1.04 1.17 1.20 1.1
47 G047I 0.17 1.25 1.59 1.31 0.05
47 G047K 0.16 0.05 0.05 2.16 0.05
47 G047L 0.17 0.05 2.78 0.82 0.05
47 G047M 0.22 0.63 0.89 0.87 0.5
47 G047N 0.16 0.05 0.05 2.54 0.5
47 G047P 0.39 0.05 0.05 0.05 0.05
47 G047Q 0.16 0.05 0.05 . 6.49 0.6
47 G047R 0.16 0.05 7.73 1.41 0.05
47 G047S 0.21 1.19 1.04 1.24 0.5
47 G047T 0.17 4.45 4.77 2.27 0.5
47 G047V 0.16 0.05 0.05 5.71 0.6
47 G047W 0.18 2.60 2.43 2.22 0.5
Tabla 6-1 (continuación)
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' 1)11 8 pH pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
51 V051G 0.22 3.43 4.27 1.35 0.05
51 V051H 0.86 0.59 1.06 0.98 1.2
51 V051I 0.69 0.79 1.23 1.12 1.1
51 V051K 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
51 V051L 0.48 0.73 1.21 0.87 1.0
51 V0 1M 0.60 0.97 1.07 1.10 1.0
51 V051N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
51 V0 1P 0.20 0.05 0.05 4.63 0.05
51 V051Q 0.28 1.26 1.81 1.14 0.9
51 V051R 0.18 0.05 0.05 0.05 1.3
51 V051S .32 1.84 1.95 1.43 0.9
51 V051T 0.46 0.98 1.16 1.03 0.9
51 V051W 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
51 V051Y 0.25 1.20 1.58 1.76 0.9
52 P052A 0.56 1.22 1.25 1.17 0.7
52 P052C 0.34 1.36 1.56 0.94 1.0
52 P052D 0.79 1.27 1.50 1.21 0.9
52 P052E 0.89 1.12 1.54 1.20 0.9
52 P052F 0.41 0.87 1.13 1.14 0.9
52 P052G 0.44 1.05 1.42 1.24 0.8
52 P052H 0.45 0.97 1.28 1.04 0.9
52 P052I 0.45 1.33 1.50 1.11 0.8
52 P052K 0.38 0.86 1.09 1.35 0.8
52 P052L 0.46 1.33 1.24 1.32 0.8
52 P052M 0.43 1.40 1.30 1.06 0.7
52 P052N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
53 S053L 1.18 0.92 0.97 1.00 1.1
53 S053M | 1.54 1.01 0.98 0.97 0.8
53 S053N 1.48 0.95 1.04 1.15 1.1
53 S053P 0.46 1.01 1.39 0.94 0.9
53 S053Q 0.76 0.85 1.30 1.09 1.1
53 S053R 1.06 0.68 0.82 0.87 1.1
53 S053T 1.33 1.05 1.23 0.85 1.0
53 S053V 1.13 1.11 1.20 1.10 1.1
53 S053W 1.49 0.86 1.02 0.80 0.9
53 S053Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
54 E054A 0.89 0.97 1.07 0.83 0.6
54 E054C 0.71 0.94 1.05 0.85 0.8
54 E054D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
54 E054F 0.51 0.86 0.97 0.93 0.7
54 E054G 0.38 1.27 0.59 1.04 0.5
54 E054H 0.73 0.69 0.80 0.96 0.8
54 E054I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
54 E054K 0.35 1.03 1.14 1.07 0.8
54 E054L 0.49 1.00 1.02 0.87 0.8
54 E054M 0.63 1.06 0.99 1.03 0.7
54 E054N 0.97 0.99 1.03 1.06 0.8
54 E054P 0.19 0.47 1.13 1.34 0.6
54 E054Q 0.97 1.00 0.99 1.04 0.8
54 E054R 0.24 1.47 1.83 1.68 0.6
54 E054S 0.98 0.97 0.97 0.96 0.8
54 E054T 0.52 1.02 1.11 0.93 0.6
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
55 T055Q 1.06 0.87 1.20 0.91 1.1
55 T055R 1.14 0.54 0.81 0.90 1.0
55 T055S 1.00 1.03 1.32 0.94 1.1
55 T055V 0.98 0.54 1.20 0.97 1.0
55 T055W 1.06 0.68 0.81 0.92 1.0
55 T055Y 0.97 0.90 0.97 0.91 1.0
56 N056A 0.31 1.18 1.27 1.14 0.4
56 N056C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
56 N056D 1.09 0.79 0.89 0.84 1.2
56 N056E 0.67 0.91 0.98 0.91 0.7
56 N056F 0.27 1.02 1.00 1.31 0.6
56 N056G 0.29 1.61 1.06 1.22 0.4
56 N056H 0.39 1.08 1.07 0.95 0.8
56 N056I 0.24 1.69 1.26 1.41 0.6
56 N056K 0.21 2.07 1.45 1.86 0.5
56 N056L 0.23 1.26 1.81 1.66 0.7
56 N056M 0.26 1.50 1.24 1.23 0.5
56 N056P 0.26 0.95 1.32 0.94 0.8
56 N056Q 0.29 1.74 1.29 1.22 0.8
56 N056R 0.17 4.90 3.96 2.20 0.5
56 N056S 0.99 0.78 0.97 0.92 0.9
56 N056T 0.58 0.90 1.08 1.04 0.6
56 N056V 0.27 1.36 1.29 0.99 0.5
56 N056W 0.36 1.28 1.33 1.16 0.6
56 N056Y 0.25 1.30 1.25 1.30 0.7
57 P057A 0.61 0.95 1.08 1.03 0.5
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pII 8 pH 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
57 P057W 1.03 0.61 1.05 0.94 0.7
57 P057Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
58 F058A 0.55 1.18 1.32 1.15 0.6
58 F058C 0.95 1.08 1.21 0.93 1.1
58 F058D 0.52 1.18 1.32 0.97 1.0
58 F058E 0.87 0.87 1.20 1.09 0.9
58 F058G 0.91 1.21 1.26 1.00 1.1
58 F058H 0.98 0.96 1.34 0.89 0.9
58 F058I 0.64 0.88 1.07 0.94 0.8
58 F058K 0.44 1.15 1.36 1.09 0.6
58 F058L 0.89 0.99 1.16 0.89 0.9
58 F058M 1.01 1.08 1.24 0.91 0.8
58 F058N 0.86 1.18 1.25 0.87 0.9
58 F058P 0.23 0.71 1.00 0.89 0.6
58 F058Q 0.60 1.22 1.20 0.93 0.6
58 F058R 0.49 0.75 1.06 0.95 1.0
58 F058S 0.61 1.21 1.10 1.03 0.6
58 F058T 0.36 1.36 1.76 1.16 0.7
58 F058V 0.73 1.01 1.09 1.05 0.7
58 F058W 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
58 F058Y 1.16 1.19 0.90 1.00 0.9
59 Q059A 1.27 0.91 1.18 0.96 0.9
59 Q059C 0.89 1.08 1.26 1.06 1.2
59 Q059D 1.42 1.09 1.31 0.88 1.2
59 Q059E 1.42 1.11 1.15 0.85 1.3
59 Q059F 1.18 0.97 1.13 0.85 0.9
Tabla 6-1 (continuación)
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
62 N062H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
62 N062I 0.95 0.81 0.87 0.69 1.3
62 N062K 1.23 1.05 0.97 1.02 0.9
62 N062L 1.79 0.87 0.80 1.07 1.4
62 N062M 1.76 1.30 1.12 1.07 1.1
62 N062P 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
62 N062Q 1.45 1.32 1.23 1.06 1.2
62 N062R 1.33 1.13 0.73 0.94 0.9
62 N062S 0.65 1.14 0.97 0.91 1.0
62 N062T 0.96 1.21 0.97 0.86 1.1
62 N062V 1.43 0.86 1.00 0.57 1.1
62 N062W 1.56 1.27 1.25 0.79 1.1
62 N062Y 1.70 0.92 0.79 1.09 1.2
63 S063A 1.12 0.94 1.12 0.98 1.1
63 S063C 1.56 1.31 0.97 0.69 1.3
63 S063D 1.42 0.90 0.86 0.84 1.4
63 S063E 1.50 1.13 1.03 0.93 1.3
63 S063F 1.26 0.91 0.73 0.88 1.0
63 S063G 1.46 0.67 0.79 0.83 0.9
63 S063H 1.41 0.92 0.95 0.80 1.0
63 S063I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
63 S063K 1.62 1.03 0.75 0.89 0.3
63 S063L 1.46 1.22 0.86 1.02 1.0
63 S063M 1.48 1.02 0.86 1.17 0.9
63 S063N 1.42 0.97 1.00 0.97 1.2
63 S063P 0.84 0.62 0.71 0.71 0.6
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI B I PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
64 H064T 0.70 0.05 0.05 0.05 0.05
64 H064V 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
64 H064Y 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065A 0.28 0.26 0.55 0.99 0.05
65 G065D 0.51 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065F 0.56 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065H 0.37 0.09 0.05 0.05 0.05
65 G065I 0.56 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065K 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065L 0.59 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065M 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065N 0.57 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065P 0.51 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065Q 0.23 1.74 2.07 2.34 1.2
65 G065R 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065S 0.38 0.07 0.05 0.24 0.05
65 G065T 0.52 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065V 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065W 0.53 0.05 0.05 0.05 0.05
65 G065Y 0.52 0.05 0.05 0.05 0.05
66 T066A 0.22 0.05 0.12 0.05 0.05
66 T066C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
66 T066D 0.26 0.05 0.05 0.05 0.05
66 T066E 0.31 0.05 0.05 0.05 0.05
66 T066F 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
66 T066G 0.27 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
67 H067F 1.13 0.64 0.50 0.81 0.1
67 H067I 1.55 0.51 0.20 0.47 0.2
67 H067K 0.54 0.17 0.05 0.24 0.05
67 H067L 1.31 0.37 0.14 0.47 0.3
67 H067M 1.34 0.56 0.31 0.66 0.6
67 H067N 1.12 0.76 0.31 0.65 0.1
67 H067P 1.01 0.43 0.18 0.50 0.8
67 H067R 1.33 0.22 0.06 0.30 0.05
67 H067S 1.26 0.55 0.28 0.55 0.1
67 H067T 1.23 0.57 0.36 0.69 0.1
67 H067W 0.24 0.76 0.08 0.51 0.05
68 V068A 1.00 1.79 1.11 1.30 1.0
68 V068C 1.05 1.11 1.10 1.07 0.8
68 V068D 0.26 0.49 0.55 0.55 0.05
68 V068E 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
68 V068F 0.46 0.05 0.05 0.05 0.05
68 V068G 0.52 1.83 1.33 1.36 0.05
68 V068H 0.78 0.05 0.05 0.05 0.05
68 V068I 1.19 1.15 0.96 0.82 1.2
68 V068K 0.34 0.05 0.06 0.05 0.05
68 V068L 0.62 1.22 0.81 0.95 0.05
68 V068M 1.17 1.31 0.92 1.16 0.05
68 V068N 0.77 0.45 0.48 0.55 0.05
68 V068P 0.28 0.06 0.19 0.10 0.05
68 V068Q 1.26 0.14 0.19 0.25 0.05
68 V068R 0.33 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
69 A069Q 0.22 5.22 0.06 0.05 0.05
69 A069R 0.35 2.01 0.05 0.05 0.05
69 A069S 0.85 0.61 0.70 1.17 0.9
69 A069T 0.48 1.58 0.96 1.02 1.0
69 A069V 0.15 0.31 0.05 0.05 0.05
69 A069W 0.15 0.05 0.05 5.05 1.0
69 A069Y 0.16 0.05 0.05 0.08 0.05
70 G070A 0.62 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070C 0.41 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070D 0.42 0.09 0.05 0.05 0.05
70 G070F 0.39 0.13 0.05 0.05 0.05
70 G070H 0.40 0.07 0.05 0.05 0.05
70 G070I 0.34 0.07 0.05 0.05 0.05
70 G070K 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070L 0.41 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070M 0.44 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070N 0.35 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070P 0.34 0.08 0.05 0.05 0.05
70 G070R 0.32 0.14 0.05 0.05 0.05
70 G070S 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070T 0.33 0.07 0.05 0.05 0.05
70 G070V 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
70 G070W 0.31 0.08 0.05 0.05 0.05
71 T071A 0.44 1.17 1.02 1.07 0.1
71 T071C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
71 T071D 0.21 41.12 34.56 1.45 0.2
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
72 V072A 0.84 0.95 1.00 0.94 0.8
72 V072C 0.71 1.13 1.02 1.10 0.8
72 V072D 0.19 2.54 1.66 1.93 0.7
72 V072E 0.50 1.14 1.08 1.13 0.8
72 V072F 0.71 0.96 1.06 0.96 0.7
72 V072G 0.35 1.52 1.06 1.36 0.8
72 V072H 0.35 1.05 1.01 1.17 0.8
72 V072I 1.16 1.12 1.03 0.97 1.0
72 V072K 0.19 2.81 2.06 2.76 1.7
72 V072L 1.00 1.16 1.07 0.97 0.9
72 V072P 0.21 0.33 0.05 0.08 0.05
72 V072Q 0.27 1.63 1.54 1.67 0.6
72 V072R 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
72 V072S 0.36 1.36 1.41 1.34 0.8
72 V072T 0.63 1.37 1.01 1.09 0.9
72 V072W 0.21 0.20 0.05 0.13 0.05
72 V072Y 0.15 0.05 0.05 0.05 0.8
73 A073C 0.85 1.03 1.08 1.03 0.9
73 A073E 0.47 1.62 1.22 1.13 0.2
73 A073F 0.23 0.05 0.05 0.17 0.05
73 A073G 0.96 0.85 1.01 1.14 0.8
73 A073H 0.14 0.05 0.05 0.05 0.2
73 A073I 0.17 22.54 15.70 6.07 0.1
73 A073K 0.18 3.45 2.48 2.56 0.1
73 A073L 0.15 0.05 0.05 0.05 0.4
73 A073M 0.24 1.71 1.42 1.48 0.3
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
74 A074L 0.29 2.24 0.05 0.05 0.05
74 A074M 0.23 5.33 0.05 0.05 0.05
74 A074N 0.23 0.05 0.10 0.05 0.05
74 A074P 0.33 1.26 0.05 0.05 0.05
74 A074Q 0.26 2.88 0.06 0.05 0.05
74 A074R 0.29 1.85 0.05 0.05 0.05
74 A074S 1.11 0.77 0.91 1.14 0.05
74 A074T 0.15 0.05 0.05 0.05 0.1
74 A074V 0.26 3.59 0.06 0.05 0.05
74 A074W 0.29 2.54 0.05 0.05 0.05
74 A074Y 0.31 2.83 0.09 0.05 0.05
75 L075A 1.07 1.41 0.96 1.03 0.05
75 L075C 1.10 0.05 1.09 0.99 0.2
75 L075D 0.76 0.05 0.77 1.09 0.05
75 L075E 1.09 0.05 0.87 1.10 0.05
75 L075F 0.55 0.05 1.00 0.96 0.05
75 L075G 0.90 0.63 .0.86 1.02 0.05
75 L075H 0.75 0.05 0.82 0.95 0.05
75 L075I 0.97 0.05 0.70 1.08 0.1
75 L075K 0.93 0.05 0.61 0.95 0.1
75 L075M 1.03 0.67 0.71 1.06 0.05
75 L075N 0.82 0.05 0.61 0.91 0.05
75 L075P 0.38 0.05 0.82 1.09 0.05
75 L075Q 1.18 0.05 0.68 1.16 0.1
75 L075R 0.95 0.05 0.95 1.09 0.1
75 L075S 0.88 0.70 0.57 1.11 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C
76 N076Q 1.20 0.05 0.92 0.98 0.1
76 N076R 0.93 0.05 0.55 1.03 0.05
76 N076S 1.18 0.86 0.94 0.94 0.05
76 N076T ¾ 0.74 0.05 0.84 0.87 0.05
76 N076V 0.47 0.05 0.75 1.21 0.4
76 N076W 0.45 0.05 1.40 1.20 0.05
76 N076Y 0.91 0.40 0.68 0.93 0.05
77 N077A 0.21 1.14 0.05 0.27 0.2
77 NÜ77C 0.23 0.95 0.12 0.36 0.2
77 N077D 0.44 1.02 0.96 1.05 0.05
77 N077E 0.20 1.17 0.13 0.35 0.2
77 N077F 0.20 0.90 0.05 0.20 0.05
77 N077G 0.21 1.52 0.75 0.97 0.05
77 N077H 0.20 1.16 0.05 0.38 0.2
77 N077I 0.23 0.63 0.09 0.28 0.2
77 N077K 0.18 1.28 0.06 0.36 0.2
77 N077L 0.19 2.18 0.24 0.77 0.1
77 N077M 0.21 0.94 0.11 0.32 0.3
77 N077P 0.19 2.17 0.05 0.63 0.3
77 N077Q 0.20 2.11 0.83 1.17 0.05
77 N077R 0.18 2.49 0.10 0.93 0.1
77 N077S 0.26 1.67 1.31 1.20 0.05
77 N077T 0.18 4.17 1.33 1.47 0.05
77 N077V 0.13 0.05 0.05 0.05 0.4
77 N077W 0.12 0.05 0.05 0.05 0.05
77 N077Y 0.13 0.05 0.05 0.05 0.2
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
78 S078V 1.13 1.16 0.97 0.91 0.5
78 S078W LOO 1.31 0.67 1.02 0.3
78 S078Y LOÓ 0.97 0.68 1.12 0.6
79 I079A 1.26 0.63 1.14 0.93 0.05
79 I079C 1.22 0.73 1.12 1.02 02
79 I079D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
79 I079E 1.28 0.71 1.02 0.98 0.1
79 I079F 1.23 0.93 1.22 1.03 0.9
79 I079G 0.90 0.83 1 .18 0.90 0.05
79 I079H 1.21 0.60 1.11 1.10 0.05
79 I079K 1.14 0.25 0.87 0.88 0.05
79 I079L 1.20 0.84 1.14 1.08 0.05
79 I079M 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
79 I079N 0.92 0.76 1.03 1.17 0.05
79 I079P 0.17 0.05 1.05 0.47 0.05
79 I079Q 1.11 0.39 1.22 0.89 0.05
79 I079R 1.15 0.58 0.92 0.95 0.05
79 I079S 1.03 0.68 LOO 1.00 0.05
79 I079T 1.10 0.63 1.22 1.11 0.05
79 I079V L IO 0.68 1.15 1.02 0.1
79 T079W 1.13 0.81 1.15 1.18 0.1
79 I079Y 1.19 0.76 1.26 0.92 LO
80 G080A 0.16 0.78 0.05 2.12 0.1
80 G080C 0.19 0.60 1.75 1.16 0.1
80 G080D 0.18 0.05 0.40 0.10 0.05
80 G080E 0.18 0.05 0.39 0.08 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
81 V081C 1.10 . 1.23 0.92 0.95 0.05
81 V081D 0.24 1.35 0.77 0.60 0.1
81 V081 E 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
81 V081F 0.91 1.32 0.89 1.08 0.05
81 V081G 0.63 1.17 0.82 1.09 0.05
81 V081H 0.72 1.45 0.96 1.04 0.05
81 V081I 1.15 1.09 0.82 1.05 0.3
81 V081K 0.45 0.86 0.60 1.19 0.05
81 V081L 1.09 1.16 0.84 1.18 0.05
81 V081M 0.94 1.16 0,75 0.99 0.05
81 V081N 0.41 1.33 0.87 1.24 0.05
81 V081P 0.20 0.05 0.05 3.63 0.1
81 V081Q 0.61 1.30 0.77 1.08 0.05
81 V081R 0.24 2.02 1.48 1.77 0.05
81 V081S 0.24 0.14 0.05 0.05 0.05
81 V081T 0.94 1.17 0.79 1.00 0.2
81 V081W 0.63 1.36 0.81 1.19 0.05
81 V081Y 0.88 1.22 0.77 1.08 0.1
82 L082A 0.63 1.22 1.02 1.09 0.05
82 L082C 0.85 1.17 0.99 0.99 0.05
82 L082D 0.25 0.06 0.05 0.05 0.05
82 L082E 0.45 1.27 1.13 1.03 0.05
82 L082F 0.56 1.12 1.13 1.15 0.05
82 L082G 0.21 2.20 1.71 1.50 0.1
82 L082H 0.67 1.17 1.07 1.12 0.05
82 L082K 0.80 0.89 0.89 1.02 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
83 G083I 0.39 0.05 0.05 0.05 0.05
83 G083K 0.34 0.05 0.08 0.05 0.05
83 G083L 0.21 0.05 0.20 0.07 0.05
83 G083M 0.37 0.05 0.10 0.05 0.05
83 G083N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
83 G083P 0.39 0.05 0.07 0.05 0.05
83 G083Q 0.34 0.05 0.05 0.05 0.05
83 G083R 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
83 G083S 0.26 0.96 1.61 1.24 0.05
83 G083T 0.29 0.05 0.15 0.05 0.05
83 G083V 0.30 0.05 0.06 0.05 0.05
83 G083W 0.29 0.05 0.08 0.05 0.05
83 G083Y 0.14 0.05 0.05 0.05 1.1
84 V084A 1.27 0.84 0.96 0.82 0.7
84 V084C 1.15 0.77 0.75 0.79 0.8
84 V084D 0.17 0.05 0.88 0.05 0.05
84 V084E 0.19 0.05 0.05 0.05 0.05
84 V084F 0.17 0.05 0.56 0.05 0.05
84 V084G 0.29 0.75 ' 0.84 0.86 0.5
84 V084H 0.24 0.05 0.05 0.05 0.05
84 V084I 1.08 0.96 0.99 0.68 0.5
84 V084K 0.28 0.05 0.07 0.07 0.05
84 V084L 0.51 0.66 0.91 1.00 0.3
84 V084M 0.89 0.91 0.68 0.87 0.3
84 V084N 0.67 0.75 0.98 0.88 0.8
84 V084P 0.14 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
85 A085R 0.39 0.05 0.05 0.05 0.05
85 A085S 0.90 0.94 0.94 0.97 0.9
85 A085T 0.43 1.35 1.11 0.88 0.6
85 A085V 0.20 2.50 2.45 2.31 0,7
85 A085Y 0.24 0.12 0.05 0.05 0.05
86 P086A 0.45 1.30 1.13 1.29 0.7
86 P086D 0.52 1.20 0.80 1.21 0.5
86 P086E 0.46 0.88 1.20 1.02 0.4
86 P086G 0.37 1.41 0.91 1.28 0.1
86 P086K 0.25 0.05 0.05 0.05 0.05
86 P086M 0.27 1.95 1.84 1.83 0.1
86 P086N 0.54 1.25 1.13 1.14 . 0.7
86 P086Q 0.25 1.54 1.60 1.99 0.1
86 P086R 0.19 3.54 3.82 2.73 0.7
86 P086S 0.53 1.15 1.15 1.06 0.7
86 P086T 0.28 1.73 1.80 1.87 0.2
86 P086V 0.16 0.05 0.05 36.35 0.1
86 P086W 0.42 1.35 1.52 1.25 0.4
86 P086Y 0.39 1.46 1.19 1.70 0.9
87 S087A 1.11 1.20 1.08 1.01 0.9
87 S087C 1.16 1.11 0.98 0.86 1.1
87 S087D 1.12 1.29 1.05 0.95 1.5
87 S087E 1.19 1.03 1.04 1.00 1.4
87 S087F 0.92 1.36 0.88 1.06 0.5
87 S087G 1.16 1.16 0.91 1.03 0.8
87 S087I 0.56 1.40 0.81 1.01 0.4
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
88 A088N 0.67 0.97 1.11 1.08 0.6
88 A088P 0.21 2.19 3.40 2.03 0.9
88 A088Q 0.22 1.86 1.99 1.23 0.5
88 A088R 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
88 A088S 0.84 0.94 1.31 0.91 0.9
88 A088T 0.86 1.28 1.29 0.94 1.0
88 A088V 0.87 1.22 1.41 0.94 0.9
88 A088W 0.49 0.05 0.06 0.05 0.05
88 A088Y 0.18 0.66 2.48 0.40 0.05
89 S089A 0.22 0.73 0.05 0.05 0.05
89 S089C 0.91 1.14 1.14 0.99- 0.9
89 S089D 1.20 1.35 1.04 1.09 0.8
89 S089E 0.92 1.07 1.17 0.95 0.8
89 S089F 0.65 1.14 1.27 0.90 0.8
89 S089G 0.88 1.13 1.10 1.13 0.8
89 S089H 0.99 0.86 1.23 1.09 0.6
89 S089I 0.26 0.29 0.05 0.11 0.05
89 S089K 0.98 0.99 1.06 1.01 0.8
89 S089L 0.41 1.08 1.52 1.40 1.3
89 S089M 0.43 1.28 1.34 1.17 1.4
89 S089N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
89 S089P 0.20 0.05 0.05 0.13 0.05
89 S089Q 0.21 108.13 37.15 0.22 0.05
89 S089R 0.71 0.67 1.08 1.06 0.8
89 S089T 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
89 S089V 0.66 1.31 1.27 1.17 0.7
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
91 Y091A 0.25 0.60 1.29 1.22 0.9
91 Y091C 0.23 0.99 2.01 1.14 1.1
91 Y091D 0.31 0.90 1.51 1.27 1.1
91 Y091E 0.16 0.05 3.30 0.67 1.3
91 Y091F 1.07 0.60 1.21 1.23 1.1
91 Y091G 0.19 0.05 0.32 0.11 0.9
91 Y091H 0.80 0.71 1.16 1.04 1.0
91 Y091I 0.22 1.01 2.17 1.25 1.2
91 Y091K 0.22 0.05 0.06 0.05 0.05
91 Y091L 0.18 1.59 2.82 1.67 1.0
91 Y091M 0.27 1.09 1.56 1.13 1.1
91 Y091N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
91 Y091P 0.31 0.05 0.09 0.48 0.05
91 Y091Q 0.16 7.64 26.89 1.98 1.2
91 Y091R 0.16 0.05 11.79 0.51 1.1
91 Y091 S 0.25 0.90 1.68 1.44 0.8
91 Y091T 0.17 3.68 8.06 2.67 0.9
91 Y091V 0.23 0.89 1.92 1.46 LO
91 Y091W 0.14 0.33 0.05 0.05 0.05
92 A092C 0.29 2.61 2.00 1.71 0.6
92 A092E 0.50 0.05 0.05 0.08 0.05
92 A092F 0.36 0.05 0.05 0.08 0.05
92 A092G 0.55 1.16 1.46 1.30 0.8
92 A092I 0.33 1.73 1.53 1.55 0.7
92 A092K 0.17 0.05 0,05 4.27 0.1
92 A092M 0.21 2.49 2.62 2.92 0.6
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
93 V093L 0.58 1.39 1.12 1.01 0.8
93 V093N 0.32 0.09 0.20 0.11 0.05
93 V093P 0.34 0.05 0.19 0.05 0.05
93 V093Q 0.42 0.06 0.05 0.05 0.05
93 V093R 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
93 V093S 0.29 0.17 0.35 0.27 0.9
93 V093T 0.33 1.46 1.70 1.37 1.1
94 K094C 0.22 1.33 1.37 1.05 1.0
94 K094D 0.32 0.10 0.11 0.15 0.05
94 K094E 0.21 0.66 0.92 0.67 0.8
94 K094F 0.29 0.18 0.10 0.14 0.05
94 K094G 0.27 0.30 14.09 0.31 0.05
94 K094H 0.33 0.16 0.05 0.10 0.05
94 K094I 0.33 0.05 0.12 0.07 0.05
94 K094L 0.30 0.26 0.32 0.28 1.1
94 K094N 0.28 0.69 3.31 0.56 0.8
94 K094Q 0.42 1.19 1.22 0.90 1.0
94 K094R 0.41 1.36 1.48 1.32 0.8
94 K094S 0.19 4.15 3.79 2.53 1.0
94 K094T 0.14 0.05 0.05 0.05 0.8
94 K094V 0.21 0.75 1.10 0.67 0.8
94 K094W 0.44 0.05 0.05 0.05 0.05
94 094Y 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
95 V095A 0.44 0.85 0.53 0.71 1.0
95 V095C 1.03 0.96 0.64 0.87 1.0
95 V095D 0.25 0.08 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
96 L096D 0.26 0.13 0.05 0.05 0.05
96 L096E 0.22 0.56 0.05 0.05 0.05
96 L096F 0.45 2.00 0.80 1.35 0.9
96 L096H 0.20 1.89 0.18 0.37- 0.05
96 L096I 0.76 1.64 0.85 1.02 1.2
96 L096K 0.19 0.54 0.05 0.10 0.05
96 L096M 0.91 1.53 1.09 1.23 0.9
96 L096N 0.17 6.10 0.90 0.69 0.05
96 L096P 0.22 0.38 0.05 0.05 0.05 '
96 L096Q 0.17 31.69 6.84 3.85 0.05
96 L096R 0.14 0.05 0.20 0.05 0.05
96 L096S 0.23 3.81 1.03 1.50 0.05
96 L096T 0.44 2.29 1.26 1.38 0.05
96 L096V 0.95 1.42 0.85 1.31 1.1
96 L096W 0.20 5.01 1.57 2.17 1.0
96 L096Y 0.30 2.01 0.73 1.18 0.05
97 G097A 0.91 1.55 0.95 1.33 1.0
97 G097C 1.01 1.66 1.07 1.08 1.0
97 G097D 1.55 1.43 0.79 1.20 1.0
97 G097E 1.14 1.38 0.78 1.06 1.1
97 G097F 0.29 1.93 1.01 1.36 0.9
97 G097H 0.85 1.26 1.10 1.01 1.0
97 G097K 1.23 1.17 0.63 1.00 1.1
97 G097L 0.77 1.43 1.11 1.24 1.1
97 G097M 0.84 1.32 1.04 1.18 1.1
97 G097P 0.39 2.35 1.56 1.34 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
98 A098M 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
98 A098N 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
98 A098P 1.13 0.87 1.19 1.09 1.0
98 A098Q 0.89 0.76 1.13 1.05 1.0
98 A098R 1.22 0.70 1.00 1.11 1.0
98 A098S 1.20 0.85 1.12 1.12 0.8
98 A098T 0.98 0.74 1.09 0.99 1.0
98 A098V 0.99 0.91 1.17 0.97 0.9
98 A098W 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
98 A098Y 0.89 0.75 1.20 1.01 0.8
99 D099A 0.81 1.07 0.65 1.04 0.8
99 D099C 0.71 1.49 0.78 1.08 1.1
99 D099E 1.04 1.37 0.80 1.03 1.0
99 D099F 0.50 1.14 0.53 1.08 1.0
99 D099H 0.79 1.17 0.53 0.98 0.9
99 D099I 0.44 1.59 0.64 1.10 1.0
99 D099K 0.94 0.72 0.43 1.00 1.0
99 D099L 0.34 1.20 0.47 0.93 1.1
99 D099M 0.59 1.38 0.65 1.18 0.9
99 D099N 1.06 1.09 0.74 0.99 1.1
99 D099P 0.39 1.98 0.89 1.21 1.0
99 D099Q 0.98 1.08 0.77 1.15 1.0
99 D099R 0.87 0.54 0.42 0.86 1.1
99 D099S 0.87 1.00 0.60 0.97 0.9
99 D099T 0.70 1.08 0.70 1.10 0.9
99 D099V 0.43 1.71 0.75 1.08 0.9
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMl LAS- AA
???' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
100 G100S 0.79 1.28 1.35 1.15 0.9
100 G100T 0.34 2.17 1.64 1.46 1.0
100 G100V 0.31 1.98 1.55 1.39 1.0
100 G100W 0.50 0.92 0.90 1.04 0.05
100 G100Y 0.49 1.58 1.27 1.05 1.0
101 S101A 1.27 1.38 1.00 1.09 1.1
101 S101C 1.24 1.14 0.67 0.90 1.2
101 S101E 1.35 1.52 1.19 1.14 1.1
101 S101F 0.96 1.02 0.73 0.97 1.0
101 S101G 0.38 1.30 0.46 0.67 1.1
101 S101I 1.01 1.22 0.75 0.86 1.2
101 S101K 1.28 1.15 0.62 1.00 1.1
101 S101L 1.10 1.21 0.80 1.00 1.0
101 S101M 1.01 1.22 0.79 1.08 1.1
101 S101N L24 1.46 0.99 1.10 1.1
101 S101P 0.25 3.64 1.39 1.83 1.1
101 S101Q 0.59 1.56 0.79 1.05 1.0
101 S101R 1.20 1.04 0.65 0.90 1.0.
101 S101T 0.94 1.34 0.68 1.16 1.0
101 S101V 0.92 1.39 0.74 1.18 0.9
101 S101Y 0.72 1.04 0.48 0.92 1.0
102 G102A 1.12 1.46 1.31 1.19 1.0
102 G102C 0.82 0.99 0.39 0.74 0.05
102 G102E 0.25 0.05 0.05 0.05 0.05
102 G102F 0.21 0.30 0.05 0.07 0.05
102 G102I 0.23 1.13 0.16 0.09 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
103 Q103K 0.17 2.63 1.36 1.25 1.0
103 Q103L 0.44 0.87 0.68 0.81 1.1
103 Q103M 0.89 1.06 0.76 0.99 0.9
103 Q103N 1.44 1.44 1.23 0.88 1.0
1 3 Q103R 1.09 0.47 0.57 0.88 1.1
103 Q103S 1.21 1.03 0.96 0.91 1.0
103 Q103T 0.84 1.01 0.94 0.95 1.0
103 Q103V 0.94 1.13 1.03 0.97 1.0
103 Q103W 0.98 0.65 0.63 0.73 1.1
104 Y104A 0.37 0.90 1.00 1.03 0.05
104 Y104C 0.34 1.24 1.33 1.31 1.1
104 Y104F 0.90 0.88 0.78 1.03 1.0
104 Y104G 0.27 0.18 0.09 0.33 0.05
104 Y104H 0.75 0.95 1.78 0.95 1.1
104 Y104I 0.30 1.10 1.10 1.48 1.3
104 Y104K 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
104 Y104L 0.24 1.45 1.48 1.17 0.05
104 Y104M 0.31 1.53 1.50 1.27 1.2
104 Y104N 0.46 1.42 1.78 1.04 1.1
104 Y104P 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
104 Y104Q 0.41 0.05 0.34 0.05 0.05
104 Y104R 0.34 0.11 0.05 0.07 0.05
104 Y104S 0.27 1.29 1.46 1.08 0.05
104 Y104T 0.42 1.33 1.69 1.35 2.0
104 Y104V 0.30 1.73 1.19 1.43 0.05
104 Y104W 0.62 0.82 0.89 1.17 1.2
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPIST pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
105 S105V 0.18 2.82 3.06 2.81 1.0
105 S105W 0.14 0.05 0.05 0.05 1.0
105 S105Y 0.18 0.07 0.43 0.06 0.05
106 W106A 0.38 1.42 1.15 1.06 0.9
106 W106C 0.37 1.38 1.10 0.99 0.9
106 W106D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
106 W106E 0.39 1.73 1.34 1.15 1.1
106 W106F 0.81 1.33 0.80 1.29 1.0
106 W106G 0.24 1.40 1.28 1.21 0.9
106 W106H 0.78 1.02 0.97 1.16 0.9
106 W106I 0.30 1.51 1.13 1.34 1.1
106 W106K 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
106 W106L 0.31 1.56 1.11 1.40 1.1
106 W106M 0.41 1.36 1.11 1.13 0.9
106 W106N 0.51 1.16 1.02 1.23 1.0
106 W106P 0.36 0.05 0.06 0.05 0.05
106 W106Q 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
106 W106R 0.34 0.94 1.24 1.26 1.0
106 W106S 0.37 1.41 0.93 1.19 2.0
106 W106T 0.39 1.41 1.15 1.25 0.9
106 W106V 0.33 1.48 1.20 1.19 0.9
106 W106Y 0.90 1.19 1.05 1.22 0.9
107 I107E 0.47 1.07 1.99 1.00 1.0
107 I107F 0.54 0.87 0.79 1.16 1.0
107 I107G 0.27 : 0.82 0.43 0.72 0.05
107 I107H 0.52 0.11 0.15 0.07 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
108 I108G 0.21 0.05 0.36 0.11 0.05
108 I108H 0.29 0.05 0.07 0.05 0.05
108 I108K 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
108 I108L 0.73 1.29 1.29 1.05 1.0
108 I108M 0.80 1.10 1.21 1.10 0.7
108 I108N 0.20 0.34 0.24 0.14 0.05
108 I108P 0.22 0.05 0.29 0.05 0.05
108 I108Q 0.20 0.33 0.24 0.07 0.7
108. I108R 0.29 0.05 0.05 0.06 0.05
108 I108S 0.16 2.38 8.60 1.30 0.9
108 I108T 0.30 1.75 1.66 1.51 0.9
108 I108V 1.11 1.29 1.09 1.16 1.0
108 I108W 0.28 0.05 0.07 0.05 0.05
108 I108Y 0.22 0.32 0.15 0.05 0.05
109 N109A 0.62 1.05 1.01 1.09 1.1
109 N109C 0.90 0.82 0.73 0.89 1.1
109 N109D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
109 N109E 0.66 0.94 1.01 1.05 1.1
109 N109F 0.52 1.17 0.79 1.20 1.1
109 N109G 0.66 1.13 0.93 1.01 1.1
109 N109II 0.93 1.01 0.64 1.04 1.1
109 NI 091 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
109 N109K 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
109 N109L 0.81 0.80 0.99 1.18 1.1
109 N109M 0.20 0.05 0.36 0.24 1.0
109 N109P 0.59 1.13 0.94 1.20 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' |)H S pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
110 G110M 0.49 0.06 0.53 0.05 0.05
110 G110N 0.51 0.05 0.05 0.05 0.05
110 G110P 0.48 0.05 0.08 0.05 0.05
110 G110R 0.50 0.05 0.94 0.05 0.05
110 G110S 0.25 2.17 1.37 1.69 0.9
110 G110T 0.20 4.57 3.95 2.82 0.9
110 G110Y 0.44 0.05 0.05 0.05 0.05
111 I111A 0.24 3.80 2.39 1.92 0.9
111 I111C 0.36 1.88 1.45 1.48 0.9
111 I111D 0.24 0.38 0.07 0.05 0.05
1 11 I111E 0.22 0.52 0.21 0.06 0.05
111 I111F 0.46 1.68 1.11 1.24 0.05
1 11 T1 11G 0.29 0.19 0.05 0.05 0.05
111 I111H 0.25 0.36 0.05 0.06 0.05
111 I111K 0.22 0.60 0.29 0.10 0.05
1 11 I1 1 1 L 1.00 1.30 0.96 1.10 1.0
111 I111M 0.80 1.37 0.98 1.04 1.1
1 11 I111N 0.21 0.05 0.05 0.18 0.05
111 I111P 0.25 0.24 0.18 0.07 0.05
1 11 I111Q 0.19 0.05 0.05 0.05 0.05
111 I111R 0.25 0.17 0.12 0.12 0.05
111 I111S 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
111 1111T 0.31 3.10 1.56 1.67 1.0
111 I111V 0.73 1.59 0.98 1.32 1.0
111 I111W 0.21 0.05 0.05 0.13 0.05
1 11 I111Y 0.20 0.05 0.05 1.39 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
112 E112V 0.21 0.05 0.05 2.81 1.1
112 E112W 0.15 0.05 0.05 0.05 LO
112 E112Y 0.19 0.05 0.05 0.05 1.0
113 W1 3A 0.23 0.05 0.24 0.17 1.0
113 W1 13C 0.19 0.36 1.25 1.25 1.0
113 W113D 0.18 0.52 1.67 0.60 0.9
113 W113E 0.19 0.26 1.58 0.31 0.9
113 W113F 0.50 0.97 1.02 1.03 0.9
113 W1 13G 0.31 0.05 0.07 0.05 0.05
113 W113H 0.22 1.45 1.69 L49 1.1
113 W113I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
113 W113K 0.22 0.05 0.05 0.05 0.05
113 W113L 0.19 0.05 0.35 0.17 1.1
113 W113M 0.19 0.40 1.19 0.61 0.9
113 W113N 0.17 0.74 2.31 0.88 0.9
113 W113P 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
113 W113Q 0.19 0.05 0.38 0.07 0.05
113 W113R 0.22 0.05 0.08 0.05 0.05
1 13 W1 13S 0.19 0.05 0.30 0.24 1.0
113 W1 13T 0.17 0.12 1.00 0.51 1.1
113 W1 13V 0.15 0.34 0.05 0.05 1.0
113 W113Y 0.91 0.82 L25 1.02 1.1
114 A114C 0.87 1.18 1.38 1.17 1.0
114 A114D 0.39 0.05 0.05 0.05 0.05
114 A114E 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
114 A114F 0.63 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
115 I115D 0.20 0.05 0.05 9.72 1.1
115 I115E 0.28 2.29 1.67 1.56 0.9
115 I115F 0.30 1.99 1.22 1.37 0.9
115 I115G 0.17 0.05 0.05 0.05 1.1
115 I115H 0.24 4.85 2.46 2.39 0.9
115 I115K 0.18 0.05 0.05 0.05 0.1
115 I115L 0.83 1.04 0.96 1.08 1.1
115 I115M 0.89 1.46 1.03 1.09 1.0
115 I115N 0.21 8.31 8.40 2.63 1.0
115 I115P 0.21 1.81 0.08 0.17 0.05
115 I115Q 0.58 1.30 0.80 1.24 1.0
115 I115R 0.38 1.37 1.00 1.21 1.0
115 I115S 0.24 4.20 2.44 2.22 0.9
115 I115T 0.59 1.46 0.89 1.08 0.9
115 I115V 0.84 1.44 0.99 1.25 0.9
115 I115W 0.16 0.05 0.05 0.05 0.9
115 I115Y 0.24 4.81 4.07 2.48 0.9
116 A116C 1.15 0.85 1.06 0.90 1.0
1 16 A1 16D 1.24 1.02 0.81 1.03 1.0
116 A116E 1.16 1.21 1.09 0.89 1.0
116 A116F 0.95 1.06 0.92 0.94 LO
116 A116G 0.66 0.94 1.01 0.97 1.0
116 A116II 1.07 1.09 0.92 1.13 1.0
116 Al 161 0.95 0.82 1.04 1.13 1.0
116 A116K 1.18 0.74 0.79 1.13 1.0
116 A116L 0.82 1.05 0.89 0.83 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pII 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
117 N117H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
117 N117I 0.15 0.05 0.05 5.36 1.0
117 N117K 0.22 1.91 1.91 1.80 1.0
117 N117L 0.30 1.13 1.22 1.39 1.0
117 N117M 0.57 1.09 1.21 1.12 1.0
117 N117P 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
117 N117Q 1.04 0.69 ~ 0.95 0.99 1.1
117 N117R 0.80 0.98 0.78 0.98 1.0
117 N117S 0.53 1.18 1.24 1.06 1.3
117 N117T 0.80 1.05 1.07 1.15 1.0
1 17 N1 17V 0.17 5.36 4.1 1 2.10 1.0
117 N117W 0.25 2.09 1.77 1.63 1.0
117 N117Y 0.45 0.99 0.89 1.22 1.0
118 N118A 0.71 0.58 0.84 0.95 1.0
118 N118C 0.74 0.61 1.01 0.63 1.1
118 N118D 1.12 0.67 1.05 0.86 1.2
118 N118E 0.88 0.71 0.70 0.69 1.1
118 N118F 0.34 1.02 1.31 0.93 1.0
118 N118G 1.07 0.83 0.50 0.79 0.9
118 N118H 1.18 0.75 0.88 0.92 1.0
118 N118I 0.17 4.85 5.90 1.96 1.1
118 N118K 1.17 0.80 0.81 0.81 1.1
1 18 N118L 0.23 1.45 1.85 1.32 1.0
118 N118M 0.49 0.87 0.99 1.06 1.0
118 N118P 0.18 0.05 0.13 0.06 0.05
118 N118Q 1.03 0.62 1.12 0.90 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
I 16C 16C 32C PI
1 19 M119N 0.23 1.95 2.59 1.79 1.1
119 M119P 0.31 0.13 0.18 0.09 0.05
119 M119R 0.43 0.05 0.07 0.05 0.05
119 M119S 0.53 1.19 1.30 0.87 0.8
119 M119T 0.46 1.25 1.32 1.03 1.0
119 M119V 0.75 0.95 1.13 0.91 0.7
119 M119W 0.22 0.16 0.13 0.11 0.05
119 M119Y 0.15 0.05 0.05 0.05 1.0
120 DI 20 A 1.01 1.1 1 0.84 0.80 1.0
120 D120C 0.67 0.84 0.95 0.76 1.0
120 D120E 1.04 0.60 0.87 1.04 1.1
120 D120F 0.24 0.50 1.07 0.78 1.0
120 D120G 1.00 0.99 1.04 0.97 0.8
120 D120H 1.13 1.07 1.16 0.88 1.1
120 D120I 0.20 0.92 1.69 1.26 1.0
120 D120K 1.15 0.88 1.01 0.95 1.1
120 D120L 0.33 0.65 1.25 1.12 1.1
120 D120M 0.73 0.87 0.97 0.95 0.7
120 D120N 1.11 1.01 1.00 0.92 1.1
120 D120P 0.22 1.12 1.61 1.14 1.1
120 D120Q 1.05 1.21 1.09 0.96 1.1
120 D120R 1.03 0.86 0.97 1.10 0.9
120 D120S 1.01 0.94 1.16 0.86 1.0
120 D120T 0.77 1.08 1.09 1.00 1.0
120 D120V 0.32 1.13 1.21 0.64 1.1
120 D120W 0.32 1.10 1.44 1.19 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pll 8 pH 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
121 V121 S 0.15 0.05 0.05 0.05 1.1
121 V121T 0.26 1.28 1.66 1.24 1.1
121 V121W 0.26 0.05 0.05 0.05 0.05
121 V121Y 0.30 0.05 0.05 0.05 0.05
122 1122 A 0.92 LOÓ 1.04 1.00 0.8
122 I122C 0.78 1.17 1.22 1.09 0.8
122 T122D 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
122 I122E 0.17 0.05 0.05 0.05 0.05
122 I122F 0.37 1.16 1.45 1.19 1.4
122 I122G 0.20 0.05 0.05 4.05 2.3
122 I122H 0.16 0.05 0.05 0.05 0.05
122 I122K 0.23 0.86 0.47 0.12 0.05
122 I122L 0.73 0.99 1.28 1.09 0.8
122 I122M 0.93 1.17 1.05 1.23 0.8
122 I122N 0.17 0.05 0.05 0.05 0.05
122 I122P 0.25 0.15 0.25 0.05 0.05
122 Í122Q 0.15 0.05 0.05 0.05 2.3
122 T122R 0.21 2.78 0.05 0.05 0.05
122 I122S 0.22 6.46 6.12 2.56 1.9
122 I122T 0.34 1.78 1.79 1.13 1.4
122 I122V 0.80 1.14 1.39 1.13 0.7
122 I122W 0.16 0.05 0.05 0.05 0.05
122 I122Y 0.16 0.05 0.05 0.05 1.9
123 N123A 0.75 1.71 1.36 1.06 0.05
123 N123C 0.95 1.53 1.35 1.43 0.5
123 N123D 0.53 1.03 1.07 1.04 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMl P1 BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
124 MI 24 A 0.61 1.44 1.02 0.97 1.0
124 M124C 0.26 0.86 0.54 0.63 1.3
124 M124D 0.22 0.22 0.05 0.05 0.05
124 M124E 0.23 0.59 0.08 0.13 0.05
124 M124F 1.13 1.02 0.86 1.06 0.9
124 M124H 0.20 1.36 0.26 0.31 0.05
124 M124I 1.36 1.12 1.08 1.12 1.0
124 M124K 0.18 0.15 0.05 0.05 0.05
124 M124L 0.86 0.69 1.01 1.03 1.2
124 M124N 0.18 2.98 0.78 0.79 0.05
124 M124P 0.20 0.36 0.22 0.08 0.05
124 M124Q 0.18 5.22 2.64 1.40 0.05
124 M124R 0.19 0.51 0.05 0.05 0.05
124 M124S 0.28 2.79 1.44 1.52 0.9
124 M124T 0.49 1.82 1.32 1.35 0.9
124 M124V 1.07 1.37 1.15 1.06 0.9
124 M124W 0.20 0.28 0.05 0.05 0.05
124 MI 24 Y 0.20 0.71 1.12 0.13 0.05
125 S125A 0.92 1.90 1.40 1.17 1.1
125 S125C 1.04 0.19 0.05 0.11 0.05
125 S125D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
125 S125E 0.25 0.23 0.05 0.05 0.05
125 S125F 0.22 0.96 0.05 0.08 0.05
125 S125G 0.33 0.23 0.05 0.18 0.05
125 S 125H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
125 S 125I 0.36 0.08 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 ' EDTA
16C 16C 32C PI
126 L126N 0.37 1.14 0.23 0.67 0.05
126 L126P 0.28 0.07 0.05 0.05 0.05
126 L126Q 0.25 3.05 0.91 1.13 0.05
126 L126R 0.20 0.28 0.05 0.05 0.05
126 L126S 0.73 1.56 0.93 0.86 0.05
126 L126T 0.53 2.41 1.47 1.40 0.05
126 L126V 1.09 1.26 1.34 1.32 1.0
126 L126W 0.89 0.71 0.79 0.78 0.9
126 L126Y 0.58 1.47 1.10 1.27 0.05
127 G127A 1.44 0.91 .93 0.94 0.05
127 G127C 1.06 1.00 0.57 0.87 0.05
127 G127E 0.91 0.80 0.90 0.93 0.05
127 G127F 1.20 0.60 0.31 0.68 0.05
127 G127I 1.33 0.78 0.54 0.60 0.05
127 G127K 0.58 0.70 0.47 0.88 0.05
127 G127L 0.91 0.99 0.64 0.56 0.05
127 G127M 0.93 0.84 0.57 0.83 0.05
127 G127N 1.06 1.03 0.81 0.82 0.05
127 G127P 0.41 0.05 0.05 0.05 0.05
127 G127Q 1.00 1.02 0.87 0.85 0.05
127 G127R 0.62 0.55 0.34 0.71 0.05
127 G127S 1.06 1.10 0.80 0.93 0.05
127 G127T 0.80 1.07 0.89 0.88 0.05
127 G127V 1.07 0.81 0.68 0.75 0.05
127 G127W 1.48 0.55 0.27 0.50 0.05
127 G127Y 1.00 0.68 0.54 0.60 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' píI 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
128 G128Y 0.39 0.24 0.16 0.36 0.05
129 P129A 1.04 1.02 0.98 0.99 0.7
129 P129C 1.37 1.09 1.11 0.91 0.9
129 P129D 1.48 1.03 1.08 0.84 1.1
129 P129E 1.42 1.24 1.04 1.10 1.0
129 P129F 0.65 1.10 0.71 1.00 0.7
129 P129G 0.78 0.82 0.60 0.81 0.8
129 P129H 0.66 0.92 0.73 0.84 0.9
129 P129I 1.14 0.95 0.99 1.11 0.9
129 P129K 1.13 0.72 0.64 1.01 0.9
129 P129L 1.12 1.13 1.21 1.06 0.9
129 P129M 1.20 1.08 0.92 1.20 0.9
129 P129N 0.90 1.00 1.04 0.98 0.9
129 P129Q 1.10 1.22 0.90 1.01 1.0
129 P129R 0.74 0.73 0.75 0.87 0.9
129 P129S 1.07 0.99 0.87 0.98 0.9
129 P129T 1.13 1.29 1.17 1.09 0.9
129 P12 V 0.72 1.41 1.26 1.09 0.8
129 P129W 0.38 0.97 0.79 1.18 0.4
129 P129Y 0.71 1.01 0.90 1.04 0.8
130 SI 30 A 1.14 0.92 0.76 0.86 1.0
130 S130C 1.24 0.75 0.95 0.66 1.1
130 S130D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
130 S130E 1.36 0.73 1.29 1.03 1.1
130 S130F 1.17 0.89 0.79 0.84 1.0
130 S 130G 0.93 0.95 0.99 0.98 0.9
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
• 131 G131 E 0.35 0.05 0.34 0.64 0.9
131 G131F 0.23 0.42 0.55 0.67 0.2
131 G131H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
131 G131I 0.17 0.05 0.52 0.29 1.1
131 G131K 1.00 0.48 1.00 0.89 1.0
131 G131 L 0.27 0.05 0.20 0.05 0.05
131 G131M 0.53 0.47 0.89 0.75 0.6
131 G131N 0.46 0.23 0.49 0.54 0.8
131 G131P 0.22 0.77 1.29 1.21 0.1
131 G131Q 0.28 0.49 1.15 0.95 0.3
131 G131R 0.19 0.97 2.04 1.64 0.1
131 G131S 0.21 0.12 0.47 0.83 0.2
131 G131T 0.86 0.52 1.16 0.89 1.0
131 G131V 0.51 0.50 0.83 0.94 0.7
131 G131W 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
131 G131Y 0.30 0.26 0.40 0.71 0.9
132 SI 32 A 0.60 1.01 1.03 1.03 0.5
132 S132C 1.25 1.06 1.10 0.83 1.0
132 S132D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
132 S132E 0.33 1.04 1.40 1.01 0.9
132 S132F 0.30 0.05 0.10 0.08 0.05
132 S132G 0.83 0.83 0.14 0.94 1.0
132 S132H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
132 SI 321 0.25 1.62 1.82 1.25 0.8
132 S132K 0.19 0.09 0.60 0.16 0.7
132 S 132L 0.25 1.27 1.65 1.22 0.8
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
133 A133K 1.11 0.75 0.65 0.72 1.1
133 A133L 0.93 0.78 0.83 0.88 1.0
133 A133M 0.95 0.99 0.71 0.85 1.0
133 A133N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
133 A133P 1.10 1.21 0.74 0.83 . 1.2
133 A133Q' 0.85 1.25 0.98 0.79 1.1
133 A133R 0.93 0.51 0.41 0.65 1.1
133 A133S 1.05 1.00 0.94 0.82 1.0
133 A133T 0.96 1.03 0.78 0.82 1.1
133 A133V 0.98 0.95 0.89 0.87 1.1
133 A133W 0.73 0.86 0.42 0.73 1.1
133 A 133 Y 0.84 0.71 0.75 0.65 1.1
134 A134C 0.78 0.83 1.13 0.80 1.0
134 A134D 0.19 0.05 0.68 0.35 1.1
134 A134E 0.23 0.05 0.34 0.23 0.05
134 A1 4F 0.26 0.99 0.97 0.88 0.9
134 A134G 0.63 1.14 0.59 0.93 1.2
134 A134H 0.12 0.05 0.05 0.05 1.1
134 A 1341 0.26 1.60 1.22 1.29 0.9
134 A134K 0.16 0.05 0.05 4.71 1.2
134 A134L 0.19 1.85 2.41 1.75 1.1
134 A134M 0.21 1.40 1.20 1.29 1.1
134 A134N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
134 A134P 0.78 1.06 0.86 0.95 ¦ 1.0
134 A134Q 0.19 0.12 0.36 0.32 1.1
134 A134R 0.25 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
135 L135W 0.27 2.14 1.96 1.47 0.8
135 L135Y 0.34 1.91 2.03 1.66 0.05
136 K136A 0.57 0.80 1.04 0.83 0.9
136 K136C 0.51 1.02 1.04 0.74 0.9
136 K136D 0.21 1.62 1.47 0.92 0.4
136 K136E 1.03 0.92 0.73 0.82 1.2
136 136F 0.27 1.35 1.57 1.15 0.6
136 K136G 0.44 1.09 1.12 0.91 0.7
136 K136H 0.89 0.99 1.00 0.68 1.1
136 136I 0.20 2.18 2.48 1.44 0.4
136 K136L 0.65 1.05 0.71 0.90 1.0
136 136M 0.69 1.02 0.87 0.87 0.9
136 K136N 0.60 1.08 0.88 0.81 1.0
136 K136P 0.20 0.23 0.74 0.27 0.05
136 K136Q 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
136 K136R 0.82 1.02 0.82 0.69 1.1
136 K136S 0.39 1.08 0.87 0.92 0.7
136 K136T 0.16 0.05 0.05 9.54 0.5
136 K136V 0.21 2.18 2.41 1.96 0.5
136 K136W 0.44 1.03 0.93 0.80 0.6
136 136Y 0.25 1.78 1.41 1.21 0.4
137 A137C LOO 0.91 0.95 0.71 1.1
137 A137D 1.14 1.04 1.00 0.81 1.0
137 A137E 0.75 0.91 1.10 0.88 1.1
137 A137F 0.59 1.01 0.78 0.90 1.0
137 A137G 0.72 1.01 0.91 0.78 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C I
138 A138E 0.36 1.44 0.96 1.13 0.9
138 A138F 0.18 2.55 2.71 1.96 0.8
138 A138G 0.52 1.27 1.35 1.07 0.9
138 A138H 0.20 2.04 2.24 1.84 0.7
138 A138I 0.78 0.93 0.98 ~ 1.11 0.9
138 A138K 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
138 A138L 0.27 1.23 1.19 1.42 0.9
138 A138M 0.71 0.88 0.89 1.00 1.0
138 A138N 0.16 0.05 0.05 4.25 0.9
138 A138P 0.32 0.05 0.09 0.05 0.05
138 A138Q 0.17 11.86 16.19 4.99 0.9
138 A138R 0.40 0.05 0.07 0.05 0.05
138 A138S 0.86 1.05 0.99 1.02 0.7
138 A138T 0.51 1.17 1.27 1.18 0.9
138 A138V 0.76 1.08 1.11 1.05 0.9
138 A138W 0.18 0.05 0.40 0.11 0.05
138 A 138 Y 0.17 5.98 9.05 3.30 0.6
139 VI 39 A 0.69 1.06 1.06 0.97 0.8
139 V139C 1.19 1.03 1.09 0.95 1.0
139 V139D 0.23 0.05 0.07 0.05 0.05
139 V 39E 0.23 0.05 0.05 0.05 0.05
139 V139F 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
139 V139G 0.21 0.40 0.60 0.65 0.5
139 V139H 0.25 0.75 0.74 0.73 0.8
139 VI 391 0.85 0.84 0.73 1.02 1.0
139 V139K 1 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
140 D140I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
140 D140K 0.48 0.25 0.53 0.47 0.8
140 D140L 0.42 0.54 0.78 0.84 0.1
140 D140M 0.48 0.77 0.81 0.82 0.3
140 D140N 0.88 0.86 0.84 0.83 0.9
140 D140P 0.30 0.06 0.09 0.05 0.05
140 D140Q 0.61 0.87 0.80 0.96 0.7
140 D140R 0.41 0.22 0.28 0.50 0.7
140 D140S 0.55 0.81 0.77 0.92 0.4
140 D140T 0.60 0.85 0.80 0.89 0.5
140 D140V 0.42 0.98 1.00 0.96 0.2
140 D140W 0.23 0.74 0.78 0.85 0.4
140 DI 40 Y 0.50 0.79 0.74 0.83 0.6
141 K141A 0.87 0.87 1.11 0.93 1.0
141 K141C 0.78 0.73 1.11 1.04 1.0
141 K141D 0.82 0.95 1.23 1.04 1.0
141 K141E 1.18 0.80 1.10 1.00 1.0
141 K141 F 0.70 0.84 1.27 1.04 1.0
141 K141G 0.94 0.84 1.15 1.07 1.1
141 K141H LOO 1.03 1.09 1.04 1.2
141 K141I 0.60 0.94 1.23 1.00 1.1
141 K141L 0.66 0.87 1.29 1.01 1.1
141 141M 0.79 1.00 1.17 1.02 1.0
141 K141N 1.05 0.90 1.30 1.03 1.1
141 K141P 0.28 0.05 0.09 0.05 0.05
141 K141Q 1.06 0.96 1.26 1.09 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 plI 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
142 A142N 0.31 0.05 0.05 0.05 0.05
142 A142P 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
142 A142Q 0.31 0.05 0.05 0.05 0.05
142 A142R 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
142 A142S 0.68 1.01 0.98 1.23 1.0
142 A142T 0.31 1.32 1.55 1.46 0.8
142 A142V 0.37 1.49 1.19 1.23 0.8
142 A142W 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
142 A142Y 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
143 V143A 1.05 0.81 1.04 0.90 0.9
143 V143C 0.87 1.00 1.14 0.89 1.0
143 V143D 0.95 0.95 1.03 0.97 1.0
143 V143E 1.12 0.87 1.05 1.02 1.0
143 V143F 0.88 0.76 1.00 0.81 0.9
143 V143G 0.71 0.90 1.16 1.15 0.9
143 V143H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
143 V143I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
143 V143K 0.84 0.61 0.72 0.96 1.1
143 V143L 0.78 0.78 1.13 0.83 0.9
143 V143M 0.83 0.94 1.05 1.11 0.9
143 V143N 0.91 0.90 1.00 1.20 1.0
143 V143P 0.20 0.05 0.05 5.50 0.7
143 V143Q 0.88 0.82 1.11 1.04 1.1
143 V143R 0.77 0.64 0.70 0.92 1.0
143 V143S 1.03 0.94 0.97 0.93 1.0
143 V143T 0.83 0.90 0.93 0.99 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMl Pl BMl PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
144 A144S 1.04 1.24 0.93 0.85 1.0
144 A144T 1.08 1.16 0.89 1.04 1.1
144 A144V 0.80 1.11 1.13 0.86 1.0
144 A144W 0.87 1.23 0.64 0.88 1.0
144 A144Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
145 S 145A 1.09 0.97 1.13 0.94 1.0
145 S145C 1.10 0.72 1.03 1.00 1.1
145 S145D 1.24 1.03 1.06 1.08 1.1
145 S145E 1.24 0.90 1.20 0.90 1.1
145 S145F 0.84 0.81 1.15 1.12 1.1
145 S145G 1.06 0.77 1.13 1.06 1.0
145 S145H 1.21 0.93 1.04 1.05 1.1
145 SI 451 0.79 0.42 1.24 1.03 1.1
145 S 145K 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
145 S145L 0.87 1.02 1.25 1.08 1.1
145 S 145M 1.00 0.86 1.06 1.04 1.0
145 S 145N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
145 S 145P 0.34 0.05 0.07 0.05 0.05
145 S 145Q 1.10 0.74 1.18 1.08 1.0
145 S145R 1.21 0.78 1.01 1.13 1.1
145 S145T 1.04 0.92 1.17 1.04 1.0
145 S14 V 0.83 0.87 1.25 1.06 1.0
145 S145W 0.81 1.15 1.10 1.01 0.9
145 S145Y 0.48 0.88 1.28 1.13 0.9
146 G14 A 0.48 1.04 1.18 1.08 1.0
146 G146C 0.50 1.01 1.15 0.98 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
146 G146Y 0.21 1.66 2.23 1.62 0.9
147 V147A 1.13 1.04 1.09 0.92 1.1
147 V147C 0.87 1.19 1.25 0.99 1.1
147 V147D 0.21 2.29 3.05 2.09 1.2
147 V147E 0.53 0.98 1.17 0.93 1.0
147 V147G 0.64 1.25 1.42 1.04 1.0
147 V147H 0.70 1.23 1.30 0.94 1.2
147 VI 471 0.98 1.25 0.94 0.94 1.1
147 V147L 0.70 1.16 1.29 1.15 1.0
147 V147M 0.97 1.00 1.07 0.90 1.0
147 V147P 0.31 1.71 2.12 1.52 0.8
147 V147Q 0.84 1.23 1.09 1.03 1.2
147 V147R 0.71 1.16 1.07 0.88 1.0
147 V147S 0.87 1.06 1.22 0.87 1.0
147 V147T 0.80 1.24 1.06 1.02 0.9
147 V147W 0.25 1.97 2.16 1.32 0.9
147 VI 47 Y 0.26 2.34 2.31 1.50 0.9
148 V148A 0.56 1.06 0.76 1.03 0.8
148 V148D 0.29 0.07 0.29 0.21 0,05
148 V148E 0.21 0.62 0.99 0.67 0.9
148 V148F 0.73 0.96 1.18 1.06 0.9
148 V148G 0.23 0.70 1.12 0.98 0.9
148 V148H 0.30 1.07 1.68 1.39 0.8
148 V148I 0.70 0.98 1.20 1.02 1.1
148 V148 0.31 0.05 0.09 0.05 0.05
148 V148L 0.98 1.05 1.11 1.07 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
149 V149L 0.69 1.02 1.11 1.11 1.1
149 V149M 0.82 1.09 1.11 1.07 1.1
149 V149P 0.46 0.94 1.23 1.04 1.2
149 V149R 0.50 0.05 0.05 0.05 0.05
149 V149S 0.37 1.12 1.42 1.31 1.1
149 V149T 0.66 0.88 1.16 1.09 1.1 149 V149W 0.25 0.44 0.50 0.59 1.3
149 V149Y 0.33 1.18 1.52 1.33 1.0
150 V150A 0.54 0.85 1.21 1.04 0.9
150 V150C 0.80 0.86 1.07 1.06 1.0
150 . V150E 0.45 0.05 0.06 0.05 0.05
150 V150F 0.47 0.89 1.07 1.07 0.8
150 V150G 0.30 0.05 0.15 0.18 0.05
150 V1 0H 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
150 V150I 0.83 1.14 1.05 1.07 1.0
150 V150K 0.31 0.11 0.05 0.06 0.05
150 V150L 0.75 0.97 0.96 1.02 0.9
150 V150M 0.39 0.97 1.26 1.27 0.9
150 V150N 0.28 0.27 0.26 0.21 1.1
150 V150P 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
150 V150Q 0.31 1.25 1.67 1.46 1.0
150 V1 0R 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
150 V150S 0.33 1.08 1.22 1.17 0.8
150 V150T 0.61 0.71 1.28 1.09 1.0
150 V150W 0.43 0.06 0.05 0.05 0.05
150 VI 50 Y 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
sición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
151 A151W 0.56 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152C 1.40 0.76 0.77 0.94 0.05
152 A152E 1.63 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152F 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152H 0.46 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152K 0.64 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152L 0.46 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152M 1.47 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152N 0.67 0.11 0.05 0.14 0.05
152 A152P 2.05 0.91 0.91 0.95 0.05
152 A152Q 1.99 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A152S l.U 0.74 1.00 0.85 0.9
152 A152T 0.75 0.80 0.81 1.05 0.05
152 A152V 0.44 1.24 1.09 1.35 0.05
152 A152W 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
152 A 152 Y 0.45 0.05 0.05 0.05 0.05
153 A153C 0.54 1.02 1.03 0.96 0.5
153 A153D 0.20 0.05 0.16 0.06 0.05
153 A153E 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
153 A153F 0.50 0.05 0.05 0.05 0.05
153 A153G 0.51 1.03 1.06 1.03 0.5
153 A153H 0.35 0.05 0.05 0.05 0.05
153 A153I 0.14 0.56 0.05 0.05 0.05
153 A153K 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
153 A153L 0.22 0.05 0.10 0.05 0.05
153 A153M 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
154 G154K 0.35 0.05 0.05 0.07 0.05
154 G154L 0.28 0.38 0.51 0.49 0.05
154 G154M 0.27 0.24 0.66 0.49 0.05
154 G154N 0.21 0.55 0.54 0.59 0.05
154 G154P 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
154 G154Q 0.25 0.34 0.38 0.56 0.05
154 G154R 0.24 0.05 0.05 0.10 0.05
1 4 G154S 0.22 0.58 0.78 0.76 0.2
154 G154T 0.26 0.48 0.65 0.93 0.05
154 G154V 0.28 0.05 0.07 0.18 0.05
154 G154W 0.28 0.05 0.05 0.11 0.05
154 G154Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
155 N155A 1.36 0.08 0.05 0.13 0.05
155 N155C 0.94 0.05 0.05 0.06 0.05
155 N155D 2.13 0.05 0.05 0.05 0.05
155 N155F 0.86 0.07 0.05 0.13 0.05
155 N155G 1.90 0.25 0.05 0.49 0.05
155 N155H 1.16 0.14 0.09 0.22 0.05
155 N155I 0.64 0.05 0.05 0.05 0.05
155 N155K 0.73 0.09 0.08 0.18 0.05
155 N155L 0.61 0.05 0.05 0.08 0.05
155 N155M 0.75 0.05 0.05 0.05 0.05
155 N155Q 0.94 0.05 0.05 0.06 0.05
155 N155R 0.58 0.08 0.06 0.16 0.05
155 N155S 1.50 0.10 0.07 0.21 0.05
155 N155T 0.81 0.05 0.05 0.10 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
156 E156V 0.54 0.60 0.60 0.98 0.6
156 E156W 0.79 0.24 0.21 0.60 0.7
156 E156Y 1.10 0.35 0.43 0.72 0.9
157 G157A 0.48 0.83 0.87 0.92 0.6
157 G157C 0.60 0.63 0.79 0.95 0.4
157 G157D 0.49 0.68 0.87 0.79 0.4
157 G157E 0.58 0:62 0.82 0.69 0.2
157 G157F 0.34 0.38 0.60 0.68 0.2
157 G157H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
157 G157I 0.34 0.34 0.53 0.54 0.1
157 G157K 0.33 0.33 0.68 0.62 0.05
157 G157L 0.40 0.33 0.54 0.60 0.1
157 G157M 0.43 0.58 0.72 0.66 0.2
157 G157N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
157 G157P 0.45 0.32 0.42 0.58 0.1
157 G157Q 0.41 0.55 0.80 0.71 0.2
157 G157R 0.31 0.28 0.52 0.43 0.1
157 G157S 0.53 1.03 0.96 0.88 0.8
157 G157T 0.37 0.51 0.81 0.97 0.2
157 G157V 0.33 0.43 0.74 0.63 0.1
157 G157W 0.40 0.59 0.70 0.88 0.2
157 G157Y 0.29 0.74 0.80 0.80 0.3
158 T158A 0.94 0.98 0.98 0.92 0.8
158 T158C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
158 T158D 0.68 1.09 1.09 1.04 1.1
158 T158E 1.10 1.09 1.03 0.98 1.2
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pII 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
159 S1 9C 1.16 1.08 1.18 0.87 1.1
159 S1 9D 1.41 1.26 1.15 1.05 1.1
159 S159E 1.07 1.04 1.13 1.07 1.0
159 S159F 0.73 1.14 0.93 1.06 0.4
159 S159G 0.88 1.14 1.13 0.91 0.6
159 S1 9H 1.10 0.95 0.85 0.88 1.0
159 SI 591 0.90 1.03 1.02 0.92 0.4
159 S159K 1.24 1.37 0.92 1.00 1.0
159 S1 9L 0.77 1.09 1.15 1.25 0.4
159 S159M 0.81 1.02 1.22 0.92 0.5
159 S1 9N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
159 S1 9P 0.72 1.20 0.94 1.05 0.3
159 S1 9Q 1.10 1.06 1.16 1.11 1.1
159 S159R 1.09 0.78 0.87 0.93 0.9
159 S159T 0.65 1.02 1.05 1.03 0.8
159 S159V 0.70 1.14 1.14 • 1.05 0.5
159 S159W 0.43 0.93 1.04 1.06 0.2
159 SI 59 Y 0.37 1.07 1.11 1.27 0.5
160 G160A 0.51 0.83 0.96 0.81 0.6
160 G160C 0.85 0.75 1.06 0.83 0.9
160 G160D 1.17 0.71 1.28 0.88 1.0
160 G160E 1.05 0.85 1.31 0.92 1.0
160 G160F 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
160 G160H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
160 G160I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
160 G160K 0.79 0.75 0.79 0.88 0.4
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
161 S161G 1.37 1.13 1.14 0.96 1.1
161 S 161H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
161 S161I 1.01 1.18 1.10 0.94 0.9
161 S161K 0.97 0.88 1.00 1.02 0.9
161 S161L 1.12 1.25 0.96 0.87 1.0
161 S161M 1.07 1.08 1.03 0.99 1.0
161 S161N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
161 S161P 1.30 1.26 1.19 1.07 1.0
161 S161Q 1.10 1.16 1.13 0.98 1.1
161 S161R 0.84 0.94 0.84 0.88 0.8
161 S161T 1.13 1.09 1.21 1.00 1.0
161 S161V 0.93 1.29 1.07 1.05 0.9
161 S 161W 0.43 0.96 1.12 1.05 0.7
161 S 161Y 0.70 1.05 1.05 0.95 0.8
162 S I 62 A 0.75 1.09 1.00 0.96 1.0
162 S 162C 1.24 0.94 0.95 0.89 1.1
162 S 162D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
162 S 162E 1.41 1.16 0.93 0.89 1.1
162 S162F 0.45 0.94 0.96 0.82 0.9
162 S162G 0.76 1.16 0.94 0.91 1.0
162 S162H 1.29 0.95 0.71 1.02 1.0
162 SI 621 0.53 1.06 0.84 0.89 1.0
162 S162K 1.38 1.05 0.81 0.94 1.0
162 S162L 0.66 1.25 0.55 0.91 1.0
162 S162M 0.73 1.09 0.64 1.03 0.9
162 S162N 1.39 0.89 0.87 1.00 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
163 S163L 0.34 0.76 0.53 0.79 0.05
163 S163M 0.33 0.71 0.71 0.76 0.05
163 S163N 0.34 0.81 0.91 0.71 0.05
163 S163P 0.99 1.05 0.78 0.95 0.4
163 S 163Q 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
163 S163R 0.27 0.67 0.55 0.77 0.1
163 S163T 0.45 0.95 1.01 1.06 0.7 - 163 S163V 0.27 1.02 1.00 0.97 0.05
163 S163W 0.21 1.05 0.96 0.95 0.1
163 S163Y 0.31 0.81 0.66 0.63 0.05
164 T164A 0.38 0.40 0.53 0.76 0.1
164 T164C 0.29 0.51 0.70 0.74 0.1
164 T164D 0.51 0.82 0.98 0.98 0.05
164 T164E 0.39 0.79 1.27 1.14 0.8
164 T164F 0.27 0.33 0.34 0.72 0.05
164 T164G 0.40 0.51 0.76 0.70 0.1
- 164 T164I 0.19 0.44 0.67 0.86 0.3
164 T164K 0.28 0.41 0.64 0.74 0.05
164 T164L 0.22 0.90 1.06 1.33 0.1
164 T164M 0.30 0.40 0.66 0.81 0.4
164 T164N 0.36 0.71 0.78 0.92 0.4
164 T164Q 0.24 0.63 1.02 1.06 0.05
164 T164R 030 0.45 0.58 0.70 0.05
164 T164S 0.32 0.80 0.98 0.87 0.4
164 T164V 0.26 0.55 0.80 0.88 0.1
164 T164W 0.18 1.58 2.34 1.67 0.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
166 G166A 0.27 0.47 0.77 0.97 1.1
166 G166C 0.86 0.61 0.78 0.79 1.1
1 6 G166F 1.09 0.54 0.46 0.82 1.3
166 G166H 1.04 0.80 0.77 0.78 1.2
166 G166K 0.82 0.32 0.33 0.58 0.9
166 G166L 1.36 0.41 0.48 0.61 1.2
166 G166M 1.13 0.56 0.59 0.66 1.1
166 G166N 1.08 0.90 0.94 1.10 1.1
166 G166P 0.37 0.79 0.83 0.88 0.1
166 G166Q 1.21 0.66 0.81 0.96 1.1
166 G166R 0.87 0.41 0.43 0.88 0.9
166 G166S 1.09 0.80 1.04 0.75 1.0
166 G166T 1.16 0.68 0.65 0.77 0.05
166 G166V 1.01 0.44 0.85 0.75 0.05
166 G166W 1.10 0.65 0.95 0.99 1.1
166 G166Y 0.99 0.69 0.45 0.92 1.0
167 Y 167 A 0.68 1.35 1.13 1.28 0.7
167 Y167C 0.42 1.20 1.06 1.31 0.6
167 Y167D 0.27 1.36 1.64 1.29 0.1
167 Y167E 0.37 1.46 1.71 1.31 0.5
167 Y167F 1.01 0.96 1.11 0.99 0.9
167 Y167G 0.27 0.47 0.90 0.76 0.05
167 Y167H 0.33 0.93 1.06 1.15 0.5
167 Y167I 0.66 0.98 1.15 1.14 0.9
167 Y167K 0.16 0.05 1.11 0.23 0.05
167 Y167L 0.23 1.16 1.53 1.29 0.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
168 P168I 0.19 0.05 0.05 0.05 0.05
168 P168K 0.24 0.14 0.09 0.05 0.05
168 P168L 0.21 1.99 0.85 0.34 0.05
168 P168M 0.26 0.08 0.21 0.05 0.05
168 P168N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
168 P168Q 0.24 0.06 0.11 0.05 0.05
168 P168R 0.23 0.05 0.20 0.09 0.05
168 P168S 0.25 0.30 0.12 0.05 0.05
168 P168T 0.21 2.95 0.29 0.05 0.05
168 P168V 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
168 P168W 0.22 0.27 0.05 0.07 0.05
168 P168Y 0.24 0.05 0.10 0.05 0.05
169 G169A 1.32 0.86 0.90 0.89 1.0
169 G169C 0.19 3.00 2.18 2.35 1.0
169 G169E 0.44 0.08 0.05 0.05 0.05
169 G169F 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G169H 0.59 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G 69I 0.75 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G169K 0.52 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G169L 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G169M 0.61 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G169N 0.41 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G169P 0.21 0.16 0.05 0.10 0.05
169 G169Q 0.30 0.20 0.05 0.11 0.05
169 G169R 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
169 G169S 0.38 1.02 0.83 1.03 0.9
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
170 K170R 1.13 1.12 1.08 1.05 1.1
170 K170S 0.51 1.30 1.13 0.90 0.9
170 K170T 0.29 1.48 1.50 1.06 0.5
170 K170V 0.62 1.13 1.17 1.08 0.8
170 K170W 0.30 1.08 1.13 0.97 0.8
170 K170Y 0.38 1.39 1.22 1.04 0.9
171 Y171A 0.22 0.15 0.05 0.15 0.05
171 Y171C 0.17 12.33 8.58 1.82 0.8
171 Y171D 0.17 4.55 3.45 1.13 0.05
171 Y171F 0.47 1.24 0.88 0.93 0.7
171 Y171G 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
171 Y171H 0.16 0.05 0.05 9.98 0.1
171 Y171I 0.20 0.18 0.05 0.05 0.05
171 Y171K 0.57 0.06 0.05 0.05 0.05
171 Y171L 0.18 4.11 3.35 2.44 0.3
171 Y171M 0.16 0.05 0.18 7.20 0.05
171 Y171N 0.17 2.21 0.05 0.47 0.05
171 Y171P 0.45 0.05 0.05 0.05 0.05
171 Y171Q 0.23 0.32 0.05 0.17 0.05
171 Y171R 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
171 Y171S 0.20 0.05 0.05 0.06 0.05
171 Y171T 0.18 0.37 0.05 0.05 0.05
171 Y171V 0.11 0.05 0.05 0.05 0.05
171 Y171W 0.49 1.37 1.02 1.02 0.6
172 P172A 0.83 1.13 1.08 1.09 1.0
172 P172C 0.69 1.22 1.17 0.77 0.9
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPÍST pH 8 pH 7 pH EDTA
16C 16C 32C PI
173 S173C 0.81 1.19 0.89 1.05 0.9
173 S173D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
173 S173E 0.96 0.90 0.78 0.98 1.0
173 S173F 0.51 1.07 1.17 0.87 0.6
173 S173G 0.64 0.93 0.65 0.91 0.8
173 S173H 0.49 1.35 0.88 1.18 0.8
173 S173I 0.44 1.16 1.05 1.30 0.8
173 S173K 0.70 0.66 0.57 1.03 0.7
173 S173L 0.56 1.10 L02 1.35 0.9
173 S173M 0.69 1.11 1.16 1.00 0.8
173 S173N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
173 S173P 0.45 1.14 1.02 1.22 0.9
173 S173Q 0.67 1.28 0.84 1.21 0.9
173 S173R 0.45 0.98 0.65 1.14 0.6
173 S173T 0.82 1.08 0.81 1.15 1.0
173 S173V 0.79 1.09 0.79 1.10 LO
173 S173W 0.33 1.89 1.29 1.50 0.6
173 S173Y 0.39 1.71 1.01 1.38 0.7
174 VI 74 A 0.45 1.44 1.21 1.10 0.8
174 V174C 0.80 1.14 1.08 1.21 0.9
174 V174D 0.20 0.05 0.05 0.65 0.05
174 V174E 0.22 0.36 0.05 0.08 0.05
174 V174F 0.22 0.58 0.18 0.16 0.05
174 V174G 0.19 0.05 0.05 0.05 02
174 V174H 0.23 0.50 0.12 0.05 0.05
174 VI 741 0.37 1.48 0.86 1.14 0.6
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
175 I175G 0.25 0.39 0.13 0.05 0.05
175 I175H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
175 I175K 0.24 0.18 0.05 0.05 0.05
175 I175L 0.90 1.27 0.89 1.04 0.8
175 I175M 0.92 1.17 0.82 1.05 1.0
175 I175N 0.22 0.16 0.05 0.15 0.05
175 I175P 0.23 0.09 0.06 0.05 0.05
175 I175Q 0.19 0.05 0.05 0.05 0.7
175 I175R 0.22 1.47 0.05 0.11 0.05
175 I175S 0.17 0.05 0.05 0.05 0.5
175 I175T 0.31 1.96 1.59 1.44 0.5
175 I175V 0.33 1.96 1.32 1.36 0.9
175 1175W 0.16 0.05 0.05 0.05 0.1
175 I175Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176C 1.04 0.99 0.79 1.00 1.1
176 A176D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176E 0.31 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176F 0.34 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176G 0.24 0.55 0.86 1.10 0.5
176 A176H 0.34 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176K 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176L 0.28 0.05 0.07 0.10 0.05
176 A176M 0.57 0.05 0.05 0.05 0.05
176 A176N 0.19 0.05 0.41 0.53 0.05
176 A176P 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pll 8 EDTA
16C 16C 32C PI
177 V177L ' 0.42 0.05 0.05 0.05 0.05
177 V177M 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
177 V177N 0.46 0.05 0.05 0.05 0.05
177 V177P 0.43 0.05 0.07 0.05 0.05
177 V177Q 0.45 0.05 0.05 0.05 0.05
177 V177R 0.41 0.05 0.05 0.05 0.05
177 V177S 0.34 0.87 0.97 1.16 0.1
177 V177T 0.56 0.75 0.73 1.09 0.8
. 177 V177W 0.18 3.77 5.40 4.51 0.2
177 V177Y 0.40 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178C 0.26 0.06 0.05 0.05 0.05
178 G178D 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178E 0.49 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178F 0.46 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178H 0.47 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178I 0.50 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178K 0.68 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178L 0.48 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178M 0.51 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178N 0.47 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178P 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178Q 0.21 0.89 1.34 1.25 0.05
178 G178R 0.44 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178S 0.31 0.68 0.85 1.28 0.05
178 G178T 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
178 G178V 0.40 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
179 A179T 0.22 0.60 0.59 1.21 0.05
179 A179V 0.23 0.64 1.06 1.00 0.05
179 A179W 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
179 A179Y 0.20 0.17 0.49 0.62 0.05
180 VI 80 A 0.70 0.98 0.76 1.05 0.1
180 V180C 0.99 1.03 0.73 1.08 1.0
180 V180D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
180 V180E 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
180 V180F 0.16 1.66 0.05 1.51 0.05
180 V180G 0.21 1.11 1.49 1.28 0.05
180 V180H 0.17 2.27 2.90 1.90 0.1
180 VI 801 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
180 V180K 0.14 0.43 0.06 0.05 0.05
180 V180L 1.08 0.98 0.64 1.06 0.9
180 V180M 0.58 0.77 0.80 1.00 0.05
180 V180N 036 1.12 0.91 1.09 0.05
180 V180P 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
180 V180Q 0.17 4.63 4.63 2.08 0.05
180 V180R 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
180 V180S 0.90 0.96 0.94 1.04 0.3
180 V180T 1.07 0.93 0.87 1.01 0.9
180 V180W 0.11 0.05 0.05 0.05 0.05
180 VI 80 Y 0.13 0.14 0.09 0.05 0.05
181 D181A 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
181 D181C 0.80 0.88 0.79 0.89 0.5
181 D181E 0.86 1.01 0.71 1.22 0.3
Tabla 6-1 (continuación)
sición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pII 8 pH 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
182 SI 82 A 0.96 0.97 1.09 1.02 0.9
182 S182C 1.10 1.03 1.06 0.85 1.1
182 S182D 0.92 1.22 1.07 1.01 1.1
182 S182E 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
182 S182F 0.88 1.14 1.07 1.00 0.4
182 S 182G 1.16 1.09 1.03 1.00 0.9
182 S182H 1.09 1.13 1.04 0.93 0.8
182 SI 821 0.87 1.13 1.17 1.15 0.7
182 S182K 1.14 0.50 0.66 1.08 0.05
182 S182L 0.88 0.88 1.07 0.98 0.4
182 S182M t.00 0.96 1.22 0.95 0.8
182 S182N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
182 S182P 1.26 0.77 1.17 1.00 0.9
182 S182Q 0.94 1.28 1.04 0.98 1.0
182 S182R 1.08 0.69 0.57 1.02 0.05
182 S 182T 0.95 0.82 1.19 0.92 0.8
182 S182V 0.79 1.02 1.31 1.07 0.8
182 S182W 0.32 1.48 1.36 1.36 0.3
182 SI 82 Y 0.86 1.07 1.05 0.98 0.5
183 SI 83 A 1.09 0.88 1.12 1.03 0.9
183 S 183C 1.09 1.22 1.01 0.91 1.1
183 S 183D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
183 S183E 1.06 0.84 1.01 0.93 1.2
183 S183F 0.97 0.91 1.35 0.83 0.9
183 S183G 0.98 0.77 0.97 1.04 1.0
183 S183H 1.10 1.10 0.84 1.00 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pII 8 pH 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
184 N184F 0.84 0.86 0.99 1.14 0.5
184 N184G 0.99 0.91 1.19 0.93 0.8
184 N184H 0.94 1.06 1.11 1.02 0.6
184 N184I 0.75 1.04 1.07 0.98 0.2
184 N184K 0.92 0.90 0.79 0.91 0.05
184 N184L 0.95 1.36 0.87 1.09 0.7
184 N184M 1.05 0.99 1.06 0.97 0.7
184 N184P 0.78 0.78 1.02 0.79 0.1
184 N184Q 0.82 0.78 1.10 1.10 0.6
184 N184R 0.93 0.69 0.89 0.93 0.05
184 N184S 0.88 1.02 0.97 1.06 0.7
184 N184T 0.80 1.16 1.14 0.90 0.4
184 N184V 0.72 1.30 1.07 1.02 0.3
184 N184W 0.80 0.92 1.28 0.99 0.4
184 NI 84 Y 0.80 0.93 1.06 1.16 0.6
185 Q185A 1.01 0.84 1.15 1.06 0.9
185 Q185C 0.95 1.15 1.09 0.92 1.1
185 Q185D 0.29 2.02 1.65 1.42 0.6
185 Q185E 0.77 1.37 1.07 0.91 1.2
185 Q185F 0.84 1.05 1.09 0.94 0.6
185 Q185G 0.74 0.79 1.29 1.00 0.7
185 Q185H 1.00 0.88 0.91 1.02 0.9
185 Q185I 0.87 1.46 0.98 0.95 0.9
185 Q185K 0.98 0.68 0.73 0.85 0.7
185 Q185L 0.87 0.99 0.96 1.04 0.7
185 Q185M 0.93 0.91 1.09 1.05 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C I6C 32C PI
186 R186K 0.62 0.95 ' 1.19 1.00 0.6
186 R186L 0.54 1.58 1.44 1.20 0.9
186 R186M 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
186 R186N 0.25 2.46 3.74 1.52 0.3
186 R186P 0.24 2.96 2.29 0.95 0.1
186 R186Q 0.37 1.48 2.05 1.32 0.8
186 R186S 0.27 2.44 1.91 1.39 0.3
186 R186T 0.22 8.56 6.97 2.69 0.4
186 R18 V 0.42 2.00 2.04 1.42 0.9
186 R186W 0.63 1.54 1.71 1.12 1.1
186 R186Y 0.38 1.50 1.98 1.37 0.8
187 A187C 0.77 0.75 1.06 0.84 0.2
187 A187D 0.93 1.51 0.99 1.03 0.4
187 A187E 0.72 1.41 1.49 1.00 0.2
187 A187F 0.73 1.02 1.07 0.93 0.1
187 A187G 0.90 1.04 1.12 0.93 0.6
187 A187H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
187 A187I 0.34 1.14 1.55 0.93 0.05
187 A187K 0.23 1.21 1.45 1.18 0.05
187 A187L 0.55 0.77 1.15 0.90 0.05
187 A187M 0.40 1.03 1.34 0.93 0.05
187 A187N 0.74 1.11 1.39 1.03 0.5
187 A187P 1.08 1.15 1.12 0.92 0.7
187 A187Q 0.48 1.32 1.24 0.92 0.05
187 A187R 0.24 0.48 0.81 0.70 0.05
187 A187S 0.68 1.14 1.13 1.06 0.4
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pll 8 pII 7 pll 8 EDTA
16C 16C 32C PI
188 S188P 1.05 1.05 1.23 1.01 1.0
188 S188Q 0.97 1.01 1.17 1.00 0.9
188 S188R 0.48 0.91 1.28 1.13 0.5
188 S188T 0.82 0.95 1.37 1.01 0.9
188 S188V 0.84 0.97 1.25 0.96 0.8
188 S1 8W 0.80 0.63 1.04 0.70 0.8
188 SI 88 Y 0.77 0.90 1.11 0.86 0.9
189 F189A 0.79 0.82 0.85 0.96 0.05
189 F189C 1.16 0.82 0.77 0.86 0.3
189 F189D 2.06 1.03 0.88 0.94 0.4
189 F189H 0.65 0.76 0.73 0.98 0.05
189 F189I 0.78 0.98 0.99 1.05 0.05
189 F189K 0.47 0.65 0.62 1.01 0.05
189 F189L 1.02 0.90 0.73 0.89 0.05
189 F189M 1.67 1.01 0.89 1.02 0.1
189 F189N 1.31 0.83 0.77 0.82 0.1
189 F189P 0.43 0.87 0.81 1.03 0.05
189 F189Q 0.80 0.68 0.75 0.78 0,05
189 F189R 0.60 0.61 0.52 0.98 0.05
189 F189S 0.93 0.91 1.08 1.06 0.1
189 F189T 0.74 1.01 LIO 0.99 0.1
189 F189V 0.70 1.07 0.83 0.93 0.05
189 F189W 0.59 0.57 0.71 0.81 1.0
189 F189Y 0.66 0.62 0.86 0.96 0.5
190 S190A 0.35 1.19 1.27 0.80 0.1
190 S190C 0.62 0.82 1.11 0.69 0.6
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA Pl PI BMl Pl BMI Pl BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C Pl
190 SI 90 Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
191 Q191A 0.93 0.67 1.11 0.98 0.9
191 Q191C 0.44 0.72 0.91 0.96 0.3
191 Q191D 0.24 0.14 0.24 0.10 0.05
191 Q191 E 0.24 0.49 0.20 0.20 0.05
191 Q191 F 0.25 0.05 0.05 0.05 0.05
191 Q191G 0.77 0.75 0.73 0.74 0.7
191 Q191H 0.20 0.05 0.46 1.53 0.05
191 Q191I 0.18 0.05 0.13 0.05 0.05
191 Q191K 0.17 0.05 0.05 0.05 0.05
191 Q191L 0.19 0.05 0.05 0.05 0.05
191 Q191M 0.20 0.05 0.15 0.41 0.05
191 Q191 N 0.72 0.70 1.34 1.14 0.1
191 Q191P 1.19 0.60 0.59 0.62 0.05
191 Q191R 0.20 0.05 0.25 0.37 0.05
191 Q191S 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
191 Q191T 0.32 1.03 0.92 0.82 0.1
191 Q191V 0.33 0.98 0.62 0.74 0.1
191 Q191W 0.21 0.05 0.05 0.08 0.05
191 Q191Y 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
192 Y 192 A 0.86 0.94 1.08 0.97 0.8
192 Y192C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
192 Y192D 0.24 1.91 2.19 1.17 0.1
192 Y192E 0.35 1.44 1.58 1.09 0.05
192 Y192F 0.51 0.70 0.98 0.87 0.4
192 Y192G 0.43 0.66 0.98 0.99 0.2
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
193 G193E 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
193 G193F 0.22 0.05 0.05 0.05 0.05
193 G193H 0.21 2.68 0.05 0.05 0.05
193 G193I 0.23 0.05 0.05 0.05 0.05
193 G193K 0.24 0.09 0.10 0.05 0.05
193 G193L 0.23 0.22 0.05 0.05 0.05
193 G193M 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
193 G193N 0.21 0.05 23.24 0.16 0.05
193 G193P 0.22 0.56 0.24 0.09 0.05
193 G193Q 0.21 2.43 0.05 0.09 0.05
193 G193R 0.19 0.05 0.05 0.05 0.05
193 G193S 0.20 0.05 0.84 0.05 0.05
193 G193T 0.22 4.84 0.51 0.10 0.05
193 G193V 0.21 2.28 1.17 0.05 0.05
193 G193W 0.21 0.05 0.05 0.27 0.05
193 G193Y 0.38 0.05 0.05 0.05 0.05
194 P194A 0.69 1.09 0.94 0.95 0.8
194 P194C 0.75 1.19 1.18 1.19 1.0
194 P194D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
194 P194E 0.70 1.52 1.09 1.03 1.0
194 P194F 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
194 P194G 0.48 1.23 0.92 1.12 0.7 194 P194H 0.76 1.13 1.00 1.15 1.0
194 P194I 0.48 1.63 1.09 1.21 0.9
194 P194K 0.72 0.79 0.90 0.90 0.6
194 P194L 0.58 1.58 0.87 1.29 0.9
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
195 E195K 0.22 3.69 2.57 2.17 0.3
195 E195L 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
195 E195M 0.20 0.05 0.05 2.57 0.1
195 E195N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
195 E195P 0.18 0.05 0.05 0.05 0.2
195 E195Q 0.30 1.29 0.69 1.02 0.2
195 E195R 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
195 E195S 0.25 1.14 0.72 0.80 0.05
195 E195T 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
195 E195V 0.16 0.05 0.05 0.05 0.05
195 E195W 0.22 4.29 1.26 1.32 0.1
195 E195Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
196 L196A 0.19 0.05 0.05 0.05 0.05
196 L196C 0.20 0.05 0.05 7.45 0.1
196 L196D 0.24 0.43 0.07 0.10 0.05
196 L196E 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
196 L196F 0.17 0.05 0.05 0.05 0.05
196 L196G 0.17 0.05 0.05 0.05 0.1
196 L196H 0.30 0.29 0.05 0.05 0.05
196 L196I 0.38 1.68 1.15 1.17 0.8
196 L196K 0.16 0.05 0.09 0.05 0.05
196 L196M 0.37 1.52 1.04 1.06 0.2
196 L196N 0.16 0.05 0.05 0.05 0.2
196 L196P 0.24 0.54 0.05 0.13 0.05
196 L196Q 0.16 0.05 0.05 0.05 0.05
196 L196R 0.16 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pII 8 pII 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
197 D197R 0.13 0.05 0.05 0.05 0.05
197 D197S 0.28 0.18 0.28 0.35 0.9
197 D197T 0.53 0.94 1.20 1.14 0.5
197 D197Y 0.24 0.05 0.05 0.05 0.05
198 V198A 0.58 0.88 0.86 1.11 0.2
198 V198C 0.84 0.78 1.11 1.00 0.8
198 V198D 0.20 1.23 1.82 1.45 1.1
198 V198E 0.22 0.05 0.06 0.10 0.05
198 V198F 0.76 0.78 0.72 1.00 0.9
198 V198H 0.20 0.57 1.01 0.96 0.2
198 VI 981 0.83 0.41 0.94 0.98 1.0
198 V198K 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
198 V198L 0.90 0.67 0.73 0.94 1.0
198 V198M 0.75 0.78 1.03 1.08 0.8
198 V198N 0.23 0.08 0.09 0.26 0.05
198 V198P 0.45 0.05 0.05 0.05 0.05
198 V198Q 0.16 0.05 0.05 12.00 0.1
198 V198R 0.46 0.05 0.05 0.05 0.05
198 V198S 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
198 V198T 0.42 0.99 1.05 1.06 0.2
198 V198W 0.13 0.05 0.05 0.05 0.2
198 V198Y 0.53 0.67 1.19 1.12 0.8
199 M199A 0.49 1.04 0.94 1.10 0.1
199 M199C 0.64 0.88 0.85 0.80 0.7
199 M199D 0.16 0.05 0.05 0.88 0.05
199 M199E 0.17 0.05 8.86 0.21 0.05
"
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
200 A200E 0.32 0M 0.05 0.05 0.05
200 A200F 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
200 A200G 0.83 1.19 1.05 1.08 0.6
200 A200II 0.21 4.98 0.05 0.16 0.05
200 A200I 0.26 0.23 0.05 0.09 0.05
200 A200K 0.25 0.12 0.05 0.05 0.05
200 A200L 0.18 0.05 0.05 0.05 1.0
200 A200M 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
200 A200N 0.47 1.33 1.20 1.17 0.7
200 A200P 0.23 0.61 0.05 0.07 0.05
200 A200Q 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
200 A200 0.20 0.05 0.05 0.24 0.05
200 A200S 0.72 1.23 0.80 1.07 0.5
200 A200T 0.35 1.73 0.95 1.35 0.2
200 A200V 0.24 5.13 2.34 2.54 0.05
200 A200W 0.22 0.87 0.41 0.13 0.05
200 A200Y 0.21 2.63 0.05 0.10 0.05
201 P201A 0.65 0.61 0.87 1.08 0.9
201 P201C 0.47 1.07 0.95 1.30 0.2
201 P201D 0.15 0.05 0.05 0.05 0.05
201 P201E 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
201 P201F 0.44 1.13 0.94 1.21 0.05
201 P201G 0.54 0.42 1.08 1.21 0.6
201 P201H 0.40 0.65 1.21 1.15 0.1
201 P201I 0.18 1.05 0.64 1.28 0.1
201 P201K 0.16 0.05 0.05 10.07 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA Pl PI BMI PI BMI Pl BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C Pl
202 G202K 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202L 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202M 0.33 0.05 0.06 0.05 0.05
202 G202N 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202P 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202Q 0.34 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202R 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202S 0.16 0.05 0.05 1.08 0.05
- 202 G202T • 0.35 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202V 0.35 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202W 0.33 0.05 0.05 0.05 0.05
202 G202Y 0.36 0.05 0.05 0.05 0.05
203 V203A 0.51 1.07 1.26 1.24 0.3
203 V203C 0.93 LIO 1.10 0.83 1.0
203 V203D 0.54 1.12 1.62 1.23 1.1
203 V203E 0.57 0.88 1.05 1.13 1.1
203 V203F 0.46 1.06 1.28 1.11 0.05
203 V203G 0.17 8.72 7.71 4.86 0.1
203 V203H 0.59 0.87 0.81 0.89 0.1
203 V203I 0.81 0.63 1.05 0.93 0.8
203 V203K 0.62 0.60 0.73 0.87 0.05
203 V203M 0.77 0.98 1.14 1.00 0.6
203 V203N 0.47 1.05 1.38 L22 0.1
203 V203P 0.23 0.05 0.05 0.05 0.05
203 V203Q 0.62 0.90 1.18 1.13 0.5
203 V203R 0.45 0.75 0.59 0.85 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pII 8 pH 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
204 S204T 0.92 0.78 0.86 0.80 0.9
204 S204V 0.82 0.71 0.79 0.85 0.7
204 S204W 0.74 0.39 0.67 0.79 0.6
204 S204Y 0.75 0.52 1.04 0.87 0.7
205 G205? 0.40 0.78 0.92 0.93 0.05
205 I205C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
205 I205D 0.27 0.35 0.05 0.05 0.05
205 I205E 0.23 0.46 0.05 0.05 0.05
205 I205F 0.27 0.27 0.05 0.05 0.05
205 I205G 0.19 0.05 0.15 0.05 0.1
205 I205H 0.20 0.05 0.05 4.55 0.2
205 I205K 0.20 0.05 0.99 0.30 0.05
205 I205L 0.30 1.37 1.00 0.86 0.05
205 1205 M 0.20 0.05 0.05 4.69 0.1
205 I205N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
205 1205 P 0.23 0.79 0.05 0.05 0.05
205 I205Q 0.20 0.05 0.05 3.32 0.05
205 1205 R 0.18 0.05 0.12 0.05 0.05
205 1205 S 0.20 0.05 0.05 5.15 0.05
205 I205T 0.77 1.60 1.20 1.11 0.8
205 I205V 0.95 1.25 1.08 1.11 1.3
205 I205W 0.20 0.05 0.05 0.13 0.05
205 G205? 0.19 0.05 0.05 0.05 0.05
206 Q206A 1.09 0.84 1.24 1.05 0.7
206 Q206C 1.10 1.13 1.03 1.12 1.4
206 Q206D 1.02 1.23 1.04 1.01 1.3
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
207 S207A 0.64 0.84 0.97 0.93 0.05
207 S207C 0.27 0.16 0.05 0.49 0.05
207 S207D 0.28 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207E 0.32 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207F 0.29 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207G 0.86 0.64 0.62 0.92 0.05
207 S207H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207K 0.37 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207L 0.35 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207M 0.33 0.21 0.07 0.38 0.05
207 S207N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207P 0.44 0.06 0.05 0.05 0.05
207 S207Q 0.19 0.21 0.05 0.05 0.05
207 S207R 0.43 0.05 0.05 0.05 0.05
207 S207T 0.65 0.20 0.14 0.42 0.05
207 S207V 0.21 1.19 2.46 0.17 0.05
207 S207W 0.25 0.05 0.15 0.05 0.05
207 S207Y 0.25 0.18 0.05 0.09 0.05
208 T208A 0.89 1.28 1.15 1.12 0.1
208 T208C 0.82 1.48 1.13 1.24 0.8
208 T208D 0.27 0.78 0.73 0.35 0.2
208 T208E 0.25 0.42 0.05 0.05 0.05
208 T208F 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
208 T208G 0.19 0.05 0.05 0.05 0.2
208 T208H 0.18 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pII 8 pII 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
209 L209F 0.72 1.26 1.05 1.15 0.2
209 L209G 1.00 0.51 0.33 0.60 0.3
209 L209H 0.64 0.45 0.25 0.62 0.6
209 L209I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
209 L209K 0.88 0.81 0.69 1.05 0.3
209 L209M 0.71 1.26 1.09 1.16 0.8
209 L209N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
209 L209P 0.22 1.24 0.26 0.05 0.05
209 L209Q 0.84 0.97 0.44 0.89 0.7
209 L209R 0.81 0.63 0.31 0.90 0.05
209 L209S 0.99 0.52 0.27 0.63 0.5
209 L209T 0.81 0.77 0.35 0.82 0.5
209 L209V 0.83 1.20 1.01 1.00 0.6
209 L209W 0.78 1.43 0.96 1.11 0.3
209 L209Y 0.62 0.95 0.64 1.01 0.1
210 P210A 0.66 1.12 0.81 0.89 0.3
210 P210C 0.42 1.52 0.90 0.96 0.2
210 P210D 0.32 1.40 0.78 1.18 0.1
210 P210E 0.37 1.67 1.08 1.31 0.4
210 P210F 0.21 10.28 3.47 2.00 0.1
210 P210G 0.32 1.78 1.00 1.26 0.05
210 P210H 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
210 P210I 0.46 1.04 0.88 1.19 0.05
210 P210K 0.33 1.08 0.84 1.28 0.05
210 P210L 0.20 0.05 0.05 15.17 0.05
210 P210M 0.29 1.15 1.11 1.48 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
211 G211L 0.67 1.22 1.18 1.12 0.7
211 G211M 0.88 1.22 1.21 0.99 0.9
211 G211N 0.92 1.29 1.12 1.00 1.0
211 G211P 0.86 1.32 1.66 1.01 0.6
211 G211Q 0.77 1.26 1.01 1.18 1.0
211 G211R 0.76 0.67 0.81 0.96 0.2
211 G211 S 0.95 1.25 1.18 1.01 0.9
211 G211T 0.78 1.37 1.35 1.15 0.7
211 G211V 0.76 1.33 1.20 0.92 0.5
211 G211W 0.80 1.33 1.08 1.18 0.2
211 G211Y 0.86 1.01 1.27 1.16 0.8
212 N212A 1.18 0.98 1.29 0.99 0.8
212 N212C 1.06 1.04 1.20 0.92 0.9
212 N212D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
212 N212E 0.97 1.44 1.12 0.93 1.2
212 N212F 1.08 0.91 1.01 0.95 0.5
212 N212G 0.80 1.14 1.32 0.98 0.9
212 N212H 0.95 1.22 1.11 0.94 0.6
212 N212I 0.49 0.41 0.41 0.24 0.5
212 N212K 0.79 0.82 0.75 0.99 0.1
212 N212L 0.83 0.63 0.69 0.76 0.2
212 N212M 1.06 1.08 1.04 1.09 0.5
212 N212P 0.99 0.96 0.85 1.00 0.3
212 N212Q 0.95 0.97 0.80 0.89 0.9
212 N212R 0.83 0.74 0.79 1.06 0.2
212 N212S 1.09 1.12 0.96 1.03 0.8
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
213 K213S 0.82 1.17 1.07 0.96 1.5
213 K213T 0.91 1.35 1.21 0.85 1.5
213 K213V 0.85 1.16 1.16 1.06 1.1
213 K213W 0.80 1.11 1.10 0.98 0.9
213 K213Y 0.85 1.15 1.01 0.97 1.3
214 Y214A 0.17 2.41 1.57 0.71 0.2
214 Y214C 0.54 0.95 0.82 0.84 0.05
214 Y214D 0.18 3.22 3.18 1.71 0.2
214 Y214F 0.97 1.15 1.14 0.95 0.05
214 Y214G 0.20 0.38 0.05 0.07 0.05
214 Y214H 0.36 1.23 1.03 1.28 0.05
214 Y214I 0.86 1.04 1.05 1.01 0.05
214 Y214K 0.15 0.05 0.05 0.05 0.3
214 Y214L 0.73 1.10 0.92 0.97 0.05
214 Y214M 0.41 0.85 0.74 1.02 0.05
214 Y214N 0.19 1.65 1.59 1.29 0.7
214 Y214P 0.22 2.06 2.29 1.41 0.05
214 Y214Q 0.36 1.27 0.76 0.95 0.05
214 Y214R 0.18 0.80 0.28 0.12 0.05
214 Y214S 0.18 2.22 1.06 1.50 0.2
214 Y214T 0.50 1.03 0.90 0.98 0.05
214 Y214V 0.65 1.01 0.94 0.97 0.05
214 Y214W 0.69 1.24 1.01 1.15 0.05
215 G215A 0.99 1.16 0.99 0.98 0.6
215 G215C 1.00 1.03 1.06 0.82 0.8
215 G215D 0.89 1.33 1.10 1.06 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
sición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
216 A216C 0.97 1.21 1.11 0.92 1.2
216 A216D 0.76 1.22 1.28 1.19 1.2
216 A216E 1.20 1.36 0.92 1.03 1.4
216 A216F 1.22 1.20 1.21 0.87 1.2
216 A216G 1.00 0.99 0.78 0.88 0.8
216 A216H 1.03 0.86 1.01 0.93 0.9
216 A216I 1.17 0.92 0.94 1.01 1.0
216 A216K 0.94 0.78 0.98 0.87 1.0
216 A216L 0.96 0.90 0.78 0.83 0.9
216 A216M 0.82 0.85 1.07 0.90 1.1
216 A216N 1.03 0.97 1.11 1.07 1.1
216 A216P 0.90 1.09 0.94 1.11 1.2
216 A216Q 1.03 0.96 1.14 1.09 0.9
216 A216R 1.12 0.54 0.62 0.92 0.1
216 A216S 0.73 1.00 1.09 1.22 0.9
216 A216T 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
216 A216V 0.92 1.13 0.93 0.94 0.9
216 A216W 0.96 0.55 0.86 0.77 0.9
216 A216Y 0.81 0.76 0.90 0.96 1.1
217 Y217A 0.38 0.16 0.08 0.14 0.05
217 Y217C 1.03 0.98 0.86 0.95 1.6
217 Y217D 1.01 1.13 1.07 1.21 1.1
217 Y217E 1.00 1.40 0.99 1.18 1.3
217 Y217F 1.04 0.99 1.03 0.97 1.0
217 Y217G 0.85 0.81 0.72 0.95 1.0
217 Y217H 0.96 0.97 0.90 1.15 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
218 N218F 0.77 0.62 0.55 0.78 0.2
218 N218G 0.88 1.06 1.07 1.01 0.5
218 N218H 0.94 1.02 0.93 0.91 0.9
218 N218I 0.52 0.45 0.43 0.57 0.1
218 N218K 0.76 0.55 0.59 0.93 0.05
218 N218L 0.46 0.66 0.69 0.64 0.05
218 N218M 0.76 0.95 0.74 0.75 0.4
218 N218P 0.29 1.56 0.82 1.19 0.2
218 N218Q 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
218 N218R 0.65 0.54 0.45 0.69 0.05
218 N218S 1.00 1.00 0.99 1.07 1.2
218 N218T 0.93 0.62 0.73 0.73 0.9
218 N218V 0.48 0.51 0.64 0.50 0.2
218 N218W 0.70 0.65 0.59 0.65 0.3
218 N218Y 0.70 0.62 0.75 0.70 0.2
219 G219A 0.82 0.14 0.05 0.08 0.3
219 G219C 0.53 0.83 0.71 0.65 1.0
219 G219D 0.46 0.05 0.05 0.05 0.4
219 G219E 0.33 0.09 0.05 0.05 3.4
219 G219F 0.35 0.05 0.07 0.05 0.1
219 G219H 0.46 0.05 0.07 0.05 0.7
219 G219I 0.24 0.10 0.31 0.05 0.4
219 G219K 0.27 0.27 0.05 0.08 0.05
219 G219L 0.54 0.68 0.70 0.70 0.2
219 G219M 0.32 0.21 0.05 0.06 0.7
219 G219N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPIST pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
241 W241K 0.83 LOO 0.88 1.22 1.0
241 W24ÍL 0.85 0.78 1.00 1.03 1.0
241 W241M 0.91 1.01 0.82 1.04 1.1
241 W241N 0.35 1.14 0.92 1.07 1.2
241 W241P 0.18 0.05 0.05 0.05 0.9
241 W241Q 0.65 1.40 1.00 1.14 1.1
241 W24|1R 0.59 0.93 0.88 1.12 0.9
241 W24¡1S 0.66 1.14 0.68 1.04 0.9
241 W24¡1T 0.61 1.06 0.86 1.16 1.0
241 W24|1V 0.61 1.20 1.01 1.09 1.0
241 W24¡1Y 0.81 1.17 0.84 L08 1.0
242 T242A 1.24 0.92 1.10 0.95 1.1
242 T242C 1.10 0.89 1.21 0.84 1.1
242 T242D 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
242 T242E 1.03 1.08 1.32 0.87 1.0
242 T242F 0.71 0.86 0.97 0.81 0.9
242 T242G 0.88 0.74 1.02 1.03 1.0
242 T242H 0.95 1.14 0.98 0.90 1.1
242 T242I 0.84 0.82 1.26 1.11 1.1
242 T242K 0.99 0.77 1.07 0.93 1.1
242 T242L 0.97 0.99 1.12 1.01 1.1
242 T242M 1.00 0.83 1.03 0.97 1.0
242 T242N 1.02 0.65 1.14 0.96 1.1
242 T242P 0.93 0.83 1.22 1.06 1.1
242 T242Q 0.91 0.87 1.34 0.95 1.1
242 T242R 0.91 1.04 1.18 0.91 1.1
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPIST pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
243 N243Q 0.93 0.74 1.28 1.03 1.0
243 N243R 0.73 0.79 0.92 0.90 0.8
243 N243S 0.97 1.05 1.13 0.86 1.0
243 N24¾T 0.92 0.97 1.01 0.92 1.0
243 N24;3V 0.89 0.87 1.13 1.13 1.0
243 N24;3W 0.59 0.90 1.02 1.01 0.6
243 N243Y · 0.81 0.82 1.20 0.82 0.9
244 T24|4A 1.53 0.66 0.97 1.07 1.0
244 T24,4C 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
244 T24|4D 1.13 0.97 1.23 1.13 1.0
244 T24|4E 0.69 0.89 1.12 0.90 1.0
244 T244F 0.83 0.97 0.97 1.01 1.0
244 T244G 1.05 0.83 1.06 1.01 1.0
244 T244H 1.06 0.90 1.29 1.01 1.1
244 T244I 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
244 T244K 1 .09 0.76 0.95 1.00 1.0
244 T244L 0.99 1.07 1.13 0.92 1.1
244 T244M 1.15 0.94 1.05 1.07 1.0
244 T244N L03 1.20 1.10 1.03 1.1
244 T244P 0.74 0.89 1.25 1.00 ? .?
244 T244Q 1.04 0.87 1.23 0.94 LO
244 T244R 0.96 0.54 1.04 " 0.91 0.9
244 T244S 1.04 1.02 1.23 1.07 1.0
244 T244V 0.90 0.69 1.07 1.04 1.0
244 T244W 0.88 0.70 1.29 0.94 1.0
244 T2f Y 0.87. 0.38 1.03 1.01 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
257 L25Í7A 0.72 1.00 1.27 0.91 0.6
257 L25Í7C 0.78 1.09 1.04 1.05 0.8
257 L25¡7D 037 1.17 1.22 0.83 0.4
257 L25f7E 0.50 1.05 1.27 0.92 0.6
257 L25(7F 0.67 0.60 1.05 0.91 0.2
257 L257G 0.67 1.01 0.64 1.20 0.7
257 L257H 0.56 0.83 1.00 1.01 0.4
257 L25,7I 0.83 0.89 1.04 0.97 0.9
257 L25/7K 0.59 0.62 0.75 0.85 0.05
257 L257M 0.84 1.06 0.93 0.86 0.8
257 L257N 0.52 1.16 1.00 1.00 0.5
257 L257P 0.45 0.69 0.96 0.91 0.3
257 L257Q 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
257 L257R 0.59 0.64 0.76 1.04 0.1
257 L257S 0.62 0.93 1.10 0.97 0.5
257 L257T 0.62 1.05 1.29 1.00 0.7
257 L257V 0.76 0.91 0.90 0.97 0.9
257 L257W 0.44 1.26 1.03 1.18 0.05
257 L257Y 0.62 1.17 1.00 0.98 0.4
258 G258A 0.59 1.05 1.13 1.14 0.1
258 G258C 0.53 0.87 1.15 1.03 0.4
258 G258E 0.57 0.98 1.11 1.12 0.9
258 G258F 0.48 0.99 1.09 1.05 0.05
258 G258H 0.50 1.00 1.07 1.09 0.05
258 G2$8I 0.29 1.26 1.39 1.41 0.3
258 G2¾8K 0.50 0.99 0.92 1.15 0.05
I
3 17
Tabla 6-1 (continuación)
sición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
272 A27 R 0.99 0.47 0.99 0.81 0.8
272 A272S 1.00 1.04 1.19 1.09 1.0
272 A272T 0.88 0.97 0.99 1.04 1.0
272 A272V 0.80 1.01 1.14 0.99 1.0
272 A272W 0.91 0.52 1.04 1.07 0.9
272 A27¡2Y 0.95 0.95 1.28 1.00 1.0
273 A273E 0.59 0.92 0.99 1.05 0.2
273 A2 3G 0.87 0.93 1.21 1.22 0.8
273 A2 3H 0.73 1.05 0.98 1.09 0.4
273 A2 3K 0.23 1.63 1.61 1.93 0.05
273 A273L 0.70 0.88 1.13 1.08 0.3
273 A273N 0.41 1.13 1.13 1.15 0.1
273 A273P 0.29 1.50 1.73 1.83 0.05
273 A273Q 0.44 1.09 1.19 1.42 0.1
273 A273R 0.24 1.43 1.20 2.03 0.05
273 A273S 0.87 1.06 1.35 1.15 0.7
273 A273T 0.53 0.79 1.23 1.29 0.2
273 A273V 0.53 1.41 1.24 1.15 0.3
273 A273W 0.26 2.08 1.97 1.53 0.05
274 A274C 0.94 1.10 0.99 0.96 1.0
274 A274D 0.94 0.92 0.87 0.89 0.7
274 A274E 0.45 0.05 0.05 0.05 0.05
274 A274F 0.80 0.82 0.84 0.96 0.6
274 A274G 0.85 0.94 0.88 0.92 0.9
274 A274H 0.79 1 17 0.89 0.95 0.5
274 A274I 0.98 0.99 0.92 1.07 1.0
Tabla 6-1 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BM1 PI BMI PI BMI LAS- AAPF PI
BPN' pI1 8 plI 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
275 Q275F[ 0.70 0.86 0.97 0.89 0.9 1.01
275 Q275G 0.90 0.90 0.81 1.05 1.1 0.77
275 Q275H 1.06 0.79 0.96 1.01 1.1 0.88
275 Q275I ¡ 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
275 Q275 1.02 0.70 0.80 1.06 0.9 0.92
275 Q275U 0.86 0.78 1.01 0.97 1.0 LOO
275 Q275M 0.96 1.16 0.96 0.97 1.0 0.81
275 Q275N 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
275 Q275fl 0.74 1.10 1.00 1.00 1.1 0.96
275 Q275R 1.05 0.81 0.80 1.03 0.9 0.97
275 Q275S 0.91 1.12 1.13 1.01 1.0 0.97
275 Q275T 0.85 1.06 1.01 1.05 1.0 0.98
275 Q275V 0.70 1.06 1.09 0.97 1.1 1.07
275 Q275W 0.96 1.02 1.08 1.20 1.0 1.09
275 Q275Y 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
ione s combinab les :
La Tabla 6-2 enlista variantes BPN' de subtili Mutaciones Combinables para las 275 posiciones s variantes tienen valores de índice de Desemp al menos una propiedad, y >0.05 para ambas propi
Tabla 6-2 Mutaciones Combinables de BPN'
Tabla 6-2 (continuación)
I
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
1
t 16C 16C 32C PI
1 AOOl'R 1.00 0.89 0.72 0.91 0.1
1 AOOUS 1.09 0.89 LOO 1.05 0.9
1 AOOÜT 1.13 1.00 1.16 1.02 1.0
1 A00ÍV 1.32 0.83 0.68 0.96 0.8
1 AOOÍW 1.19 0.76 0.67 0.88 0.2
2 Q002C 0.55 0.81 1.26 0.92 0.1
3 S003 1.19 1.20 0.97 0.89 0.3
3 SOO¾D 1.24 1.1 1 1.08 0.97 1.0
3 S003F 1.20 0.90 0.95 0.86 0.2
3 S003ÍI 1.24 0.80 0.90 1.05 1.0
3 S003K 1.28 0.97 0.80 0.95 0.1
3 S003L 1.13 0.90 0.84 1.06 0.6
3 S003M 1.35 0.83 1.04 0.92 1.1
3 S003N 1.18 0.98 1.15 0.85 0.5
3 S003Q 1.38 0.97 0.96 1.08 1.3
3 S003T 1.31 1.09 1.01 0.87 1.2
3 S003V 1.19 0.84 0.80 1.06 1.0
3 S003W 1.50 0.71 0.65 0.91 0.1
3 S003Y 1.25 0.76 0.72 0.92 0.2
4 VO 4C 0.87 1.03 1.22 0.92 0.3
4 V004E 1.00 1.04 1.22 0.92 0.1
4 V004T 1.02 0.92 1.27 0.97 1.2
5 P005F 0.22 0.55 0.44 0.61 0.1
5 P005G 0.98 1.09 1.10 0.98 0.3
5 P005I 0.21 0.49 0.96 1.02 0.1
5 P005K 0.16 4.53 2.60 0.65 0.6
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C I
8 vooSi 0.91 1.06 0.87 1.01 1.0
8 VO08K 0.19 3.07 3.04 3.06 0.2
8 V0Q8L 0.83 0.91 0.98 1.03 0.2
8 V008R 0.21 - 0.83 0.14 1.14 0.2
9 S009A 1.22 0.84 1.00 0.98 0.8
9 S009C 1.32 0.94 0.80 0.79 1.2
9 S009E 1.89 0.91 0.76 0.92 1.5
9 S009G 1.19 0.88 0.92 0.88 0.7
9 S009H 1.35 0.70 1.08 1.00 0.8
9 S009L 1.30 0.99 0.76 0.86 0.6
9 S0Q9M 1.32 0.98 0.95 0.99 0.8
9 S009P 1.38 1.00 0.87 0.94 0.7
9 S009Q 1.02 0.92 0.77 0.83 0.8
9 S009T 1.16 1.07 1.11 0.80 1.3
9 S009V 1.51 0.99 0.75 0.86 0.9
10 Q0Í0A 1.06 0.90 1.06 1.00 0.5
10 Q010C 1.25 0.92 0.94 0.93 0.7
10 Q010E 1.07 0.70 1.01 0.99 1.5
10 Q010G 1.34 0.95 0.93 0.90 0.3
10 Q010H 1.20 1.04 1.07 0.92 0.9
10 Q010K 1.16 0.83 0.49 0.89 0.1
10 QOjlOM 1.26 0.82 0.97 1.07 0.5
10 Q0Í10S 1.00 0.88 0.90 0.87 0.5
10 QOllOT 1.25 1.04 1.00 0.85 0.8
10 QO OV 1.24 0.96 0.80 1.00 0.2
10 QO;IOY 0.44 0.97 0.79 0.99 0.4
Tabla 6-2 (continuación)
ición Var ¡ante TCA PI PI BMl PI BMI PI BMI LAS- AA
B pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
12 K012L 0.17 3.09 4.59 1.99 0.6
12 K012N 1.13 0.86 0.93 0.85 1.3
12 K01Í2Q 1.35 0.96 0.61 1.01 1.3
12 012R 0.73 0.83 0.84 0.83 0.9
12 KOlkS 1.07 0.71 0.74 0.72 1.0
12 K01Í2T 1.13 1 .07 0.95 0.84 1.1
12 K0Ü2V 1.57 0.80 0.83 0.98 1.1
12 K01|2W 1.35 0.54 0.85 0.94 1.2
12 0Ü2Y 1.38 0.52 0.90 0.67 1.3
13 A0Í3C 1.05 0.99 0.77 0.83 0.6
13 A0Í3G 1.56 1.02 1.05 0.84 0.7
13 A013L 0.26 1.12 1.04 1.19 1.1
13 A0Í3S 0.91 1.05 1.10 1.05 1.1
13 A013T 0.51 1.12 0.91 0.96 0.6
13 A013V 0.82 1.01 0.74 0.97 0.1
14 P01¡4A 1.21 0.97 1.13 1.04 0.1
14 P01|4C 1.05 0.78 1.22 0.84 0.7
14 P01'4D 1.07 0.70 1.21 0.92 0.4
14 P01|4E 1.27 0.55 1.14 0.95 0.9
14 P01¡4G 1.35 0.92 1.20 0.94 0.2
14 P0Ü4I 0.89 0.85 1.19 0.94 0.7
14 P0Í4L 0.43 0.74 1.58 1.02 0.6
14 P014M 1.50 0.77 1.17 0.93 0.3
14 P014N 1.10 0.80 0.98 0.91 0.1
14 P014Q 1.34 0.62 0.94 0.81 0.6
14 P014S 0.96 0.79 1.06 0.96 0.1
Tabla 6-2 (continuación)
ición Vari ante TCA Pl PI BMI PI MI PI BMI LAS- AA
BF >N' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
15 AO ¡T 1.53 0.85 0.68 0.93 1.0
15 AOlí iV 1.50 0.77 0.73 0.89 1.0
15 AOlí sw 0.45 0.59 0.88 1.18 0.8
15 AOlí SY 1.43 0.63 0.70 0.90 1.0
16 L016 ?? 1.14 0.79 1.22 0.96 0.8
16 L016 ¡C 1.01 0.71 1.15 1.08 1.0
16 LOlí iE 1.02 0.57 1.18 1.09 0.9
16 LOlí ÍF 0.45 0.63 0.93 0.89 0.5
16 LOlí >G 0.29 0.54 1.19 0.97 0.8
16 LOlí ÍH ' 0.29 0.70 1.11 1.12 0.5
16 LOlí il 1.22 0.51 1.21 1.05 1.0
16 LOlí ÍK 0.36 0.62 1.09 0.99 0.5
16 LOlí íM 1.63 0.76 0.97 1.13 1.0
16 LOlí |N 0.59 0.71 1.10 1.05 0.8
16 LOlí )P 0.50 0.73 1.05 1.07 0.8
16 LOie ÍQ 0.90 0.88 1.02 1.04 0.9
16 LOU )S 0.92 0.81 1.09 0.96 0.7
16 LOlí 1.30 0.63 1.02 1.07 0.9
16 LOlí 5w 0.17 - 3.37 6.22 3.16 0.1
17 Hor 7A 0.37 0.41 0.95 0.94 0.4
17 Hor je 0.33 0.80 0.73 1.01 0.7
17 Hor 0.30 0.81 1.09 1.00 0.4
17 ??G 7F 1.40 0.72 1.01 0.85 0.3
17 H017G 0.19 1.02 0.45 1.57 0.6
17 H017I 1.36 0.57 0.99 1.10 0.8
17 H017L 1.15 0.90 1.06 0.93 0.5
Tabla 6-2 (continuación)
ición Varí ante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BF N' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
31 1031 H 0.26 1.98 1.57 1.79 1.3
31 1031 0.32 1.84 1.28 1.39 1.2
31 1031 L 1.12 0.89 0.88 0.85 1.2
31 1031 1.21 0.98 0.83 0.99 1.1
31 1031 N 0.23 2.34 2.01 1.96 1.3
31 1031 P 0.24 0.16 0.06 0.17 1.5
31 103 I;Q 0.19 5.38 3.51 3.08 1.1
31 1031|S 0.21 3.71 2.83 2.91 1.1
31 10 1|T 0.38 1.21 1.04 0.91 1.1
31 103 líV 0.83 1.03 1.09 1.03 0.9
31 1031| Y 0.21 4.14 3.02 3.08 0.9
33 S033A 0.82 0.84 0.84 0.83 0.7
33 S033C 0.73 0.66 0.55 0.71 1.0
33 S033E 0.44 1.21 0.81 0.92 0.8
33 S033G 0.96 1.14 0.80 1.01 0.9
33 S033N 0.45 1.14 0.90 1.03 0.6
33 S033Q 0.36 0.69 0.72 0.72 0.5
33 S033T 0.82 0.74 0.64 0.85 1.0
33 S033V 0.50 0.56 0.57 0.54 0.9
34 G034A 0.27 0.81 0.91 0.81 0.5
35 1035 A 0.59 0.82 1.14 0.92 0.9
35 I035C 0.95 0.65 1.41 1.06 1.0
35 I035G 0.18 0.21 1.85 1.07 1.0
35 I035L 0.61 0.68 1.14 1.03 0.7
35 I035M 0.33 0.71 1.27 1.07 0.8
35 1035S 0.24 1.04 2.03 1.68 0.7
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
42 L042C 0.41 0.71 0.95 1.06 0.2
42 L04 H 0.23 0.98 1.26 1.11 0.3
42 L042I 1.15 0.87 0.56 0.92 0.8
42 L042M 0.80 1.20 0.99 1.00 0.7
42 L042N 0.23 0.80 0.86 1.21 0.6
42 L042V 0.97 0.96 0.88 0.98 0.5
43 K043A 0.87 0.67 1.08 0.90 1.2
43 K043C 0.83 0.60 1.17 0.89 1.4
43 K043D 0.88 0.70 1.16 0.71 1.3
43 K043E 0.80 0.56 1.04 0.74 1.3
43 K043F 0.74 0.72 1.24 0.78 1.3
43 K043G 0.96 0.88 0.82 0.93 1.3
43 K043I 0.72 0.57 1.12 0.95 0.7
43 K043L 0.96 0.58 0.88 0.84 1.3
43 K043M 1.02 0.79 1.19 0.97 1.1
43 K043N 0.80 0.85 1.31 0.81 1.2
43 K04¾Q 0.95 0.61 1 .09 0.90 1.3
43 K043R 1.14 0.56 1.30 0.87 0.9
43 K04¾S 0.98 0.77 1.14 0.92 1.3
43 K043T 0.93 0.92 1.06 0.96 1.1
43 K043V 1,10 0.59 0.98 0.93 0.6
43 K04¾W 0.85 0.67 0.98 0.90 13
43 K04:3Y 0.87 0.67 1.12 0.82 1.1
44 V04|4A 0.71 0.91 1.16 1.01 0.7
44 V04¡4C 0.93 0.94 1.26 0.79 0.8
44 V04J4E 0.18 0.71 2.18 1.98 0.5
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
45 A04'5K 1.05 1.00 0.69 1.06 0.9
4 A04Í5L 1.03 0.72 0.82 0.99 1.0
45 A04|5M 1.15 1.02 0.87 1.00 1.2
45 A04;5N 1.35 1.03 0.91 0.88 1.1
45 A04|5P 0.87 0.82 0.90 0.96 0.7
, 45 A045Q 1.07 0.84 0.95 1.09 1.1
45 A045S 1.08 0.93 0.87 0.86 1.2
45 A045T 0.99 1.04 1.31 0.90 1.2
45 A045V 1.28 0.85 0.81 1.03 1.1
45 A045Y 1.03 0.81 0.67 0.73 1.1
46 G046A 0.92 1.09 0.97 1.00 1.0
46 G046C 0.39 1.28 0.81 0.90 1.1
46 G046E 0.57 1.10 0.70 0.95 1.0
46 G046F 0.39 1.40 0.95 1.03 1.0
46 G046H 0.48 0.98 0.99 1.25 1.0
46 G046K 0.44 0.88 0.72 1.09 0.8
46 G046L 0.27 1.57 1.44 1.42 0.8
46 G046M 0.42 1.30 0.84 1.14 0.9
46 G046N 0.69 0.79 0.72 1.05 1.1
46 G046S 0.74 0.86 0.78 0.94 0.9
46 G046T 0.39 1.21 0.96 0.79 0.8
46 G046V 0.23 4.92 3.26 2.09 0.8
46 G046W 0.44 1.08 0.66 0.90 1.0
46 G046Y 0.36 1.02 1.27 1.12 0.8
47 G0 7A 0.32 0.98 0.96 1.04 0.5
47 G047C 0.24 0.64 1.09 0.88 0.6
Tabla 6-2 (continuación)
ición Vari ante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
Bl =»N' [)H 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
51 V05;iY 0.25 1.20 1.58 1.76 0.9
52 P052A 0.56 1.22 1.25 1.17 0.7
52 P05 C 0.34 1.36 1.56 0.94 1.0
52 P052D 0.79 1.27 1.50 1.21 0.9
52 P05 E 0.89 1.12 1.54 1.20 0.9
52 P052F - 0.41 0.87 1.13 1.14 0.9
52 P05;2G 0.44 1.05 1.42 1.24 0.8
52 PQ52H 0.45 0.97 1.28 1.04 0.9
52 P052I 0.45 1.33 1.50 1.11 0.8
52 P052K 0.38 0.86 1.09 1.35 0.8
52 P052L 0.46 1.33 1.24 1.32 0.8
52 P052M 0.43 1.40 1.30 1.06 0.7
52 P05;2Q 0.43 0.83 1.48 1.20 0.8
52 P052R 0.33 1.02 1.31 1.26 0.7
52 P052S 0.51 1.02 1.55 1.26 0.8
52 P052T 0.47 1.23 1.73 1.09 0.8
. 52 P052V 0.31 1.79 1.63 1.03 1.0
52 P052W 0.36 1.49 1.34 1.43 1.0
52 P052Y 0.35 1.55 1.42 1.32 1.0
53 S053A 1 .37 1 .07 1 .15 1.03 1.0
53 S053E 1.52 1.05 1.16 1.12 1.0
53 S053F 1.19 0.91 1.05 0.87 1.0
53 S053G 1.72 1.15 1.19 0.94 1.0
53 S053H 1.35 0.96 1.02 0.96 1.1
53 S053I 1.22 0.97 1.10 0.80 1.0
53 S053K 1.36 0.89 0.93 0.76 1.1
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
???' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
1
1 16C 16C 32C PI
56 N056V 0.27 1.36 1.29 0.99 0.5
56 N05 W 0.36 1.28 1.33 1.16 0.6
56 N05£Y 0.25 1.30 1.25 1.30 0.7
57 P05 A 0.61 0.95 1.08 1.03 0.5
57 P057C 0.50 1.04 1.18 0.95 0.8
57 P057D 0.52 1.11 1.42 1.14 0.9
57 P057E 0.38 1.23 1.53 1.23 0.8
57 P057F 0.59 0.93 0.98 0.92 0.3
57 P05Í7G 0.42 1.29 1.19 1.12 0.3
57 P05Í7I 0.25 2.20 2.00 1.60 0.4
57 P05Í7K 0.24 1.51 1.84 1.09 0.3
57 P05Í7L 0.24 2.59 2.00 1.46 0.4
57 P05Í7M 0.36 1.08 1.11 0.97 0.4
57 P05Í7N 0.35 1.17 1.67 1.11 0.7
57 P05|7Q 0.35 1.25 1.38 1.04 0.5
57 P05|7R 0.23 2.31 3.14 1.52 0.4
57 P057S 0.39 0.91 1.10 0.97 0.5
57 P057T 0.25 2.53 1.97 2.27 0.5
57 P057V 0.22 3.61 5.95 3.50 0.3
57 P057W 1.03 0.61 1.05 0.94 0.7
58 F058A 0.55 1.18 1.32 1.15 0.6
58 F058C 0.95 1.08 1.21 0.93 1.1
58 F058D 0.52 1.18 1.32 0.97 1.0
58 F058E 0.87 0.87 1.20 1.09 0.9
58 F058G 0.91 1.21 1.26 1.00 1.1
58 F058H 0.98 0.96 1.34 , 0.89 0.9
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN'
1 pII S pH 7 pH 8 EDTA
1 16C 16C 32C Pl
59 Q059F 1.18 0.97 1.13 0.85 0.9
59 Q059G 0.92 1.06 1.05 1.00 0.7
59 Q059H 1.24 0.91 1.00 1.14 1.0
59 Q059K 1.31 0.83 0.87 0.87 0.9
59 Q059L 1.21 1.10 1.12 1.04 1.1
59 Q059M 1.26 1.18 1.08 0.95 1.1
59 Q059N 1.15 1.12 1.16 1.01 1.0
59 Q059P 0.27 1.86 2.01 1.47 0.8
59 Q059 0.82 0.78 0.71 0.81 1.0
59 Q059S 1.25 1.13 1.15 0.94 0.8
59 Q059T 1.37 1.10 1.04 1.02 0.9
59 Q059V 1.38 1.14 1.14 1.14 1.0
59 Q059W 0.24 1.36 1.62 1.16 1.0
59 Q059Y 1.12 1.08 1.21 1.08 0.9
60 D060A 0.43 1.01 1.21 0.99 0.2
60 D060C 0.49 0.81 0.94 0.89 0.5
60 D060E 0.32 0.89 1.23 0.94 0.5
60 D060F 0.25 0.35 1.00 0.71 0.1
60 D060G 1.09 0.80 0.93 0.89 0.4
60 D060H 0.31 0.66 1.29 0.95 0.2
60 D060I 0.33 0.50 1.15 0.83 0.1
60 D060L 0.27 0.54 1.07 0.88 0.1
60 D060M 0.27 0.87 1.26 1.16 0.2
60 D060N 0.32 0.77 1.19 1.11 0.2
60 D060P 0.85 0.64 0.83 0.73 0.1
60 D060Q 0.26 0.97 1.35 1.03 0.2
Tabla 6-2 (continuación)
ición Var iante TGA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
B PN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
61 N061M 1.28 0.98 1.01 1.04 1.0
61 N061P 1.42 1.47 1.04 0.78 1.0
61 N061Q 1.27 0.90 1.08 0.88 1.0
61 N061R 1.42 0.67 0.71 0.86 0.8
61 N061S 1.06 1.00 0.98 0.88 0.9
61 N061T 1.14 0.98 0.98 0.99 1.1
61 N061V 1.43 1.02 1.03 0.77 1.0
61 N061W 1.42 1.12 0.80 0.83 1.1
61 N061Y 1.31 1.04 0.97 0.98 1.2
62 N062A 1.20 0.77 0.76 0.88 1.1
62 N062C 1.57 1.18 1.16 0.82 0.3
62 N062D 1.48 1.40 1.18 0.91 1.1
62 N062E 1.42 1.19 1.19 0.92 1.1
62 N062F 2.06 0.75 1.07 0.87 1.1
62 N062G 1.41 1.03 0.83 0.84 1.3
62 N062I 0.95 0.81 0.87 0.69 1.3
62 N062K 1.23 1 .05 0.97 1.02 0.9
62 N062L 1.79 0.87 0.80 1.07 1.4
62 N062M 1 .76 1 .30 1.12 1.07 1.1
62 N062Q 1.45 1.32 1.23 1.06 1.2
62 N062R 1.33 1.13 0.73 0.94 0.9
62 N062S 0.65 1.14 0.97 0.91 1.0
62 N062T 0.96 1.21 0.97 0.86 1.1
62 N062V 1.43 0.86 1.00 0.57 1.1
62 N062W 1.56 1.27 1.25 0.79 1.1
62 N062Y 1.70 0.92 0.79 1.09 1.2
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPIST pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
72 V072S 0.36 1.36 1.41 1.34 0.8
72 V072T 0.63 1.37 1.01 1.09 0.9
73 A073C 0.85 1.03 1.08 1.03 0.9
73 A073E 0.47 1.62 1.22 1.13 0.2
73 A073G 0.96 0.85 1.01 1.14 0.8
73 A073I 0.17 22.54 15.70 6.07 0.1
73 A073K 0.18 3.45 2.48 2.56 0.1
73 A073 0.24 1.71 1.42 1.48 0.3
73 A073Q 0.55 1.31 1.33 1.14 0.5
73 A073S 1.02 1.35 0.94 1.00 0.8
73 A073T 0.71 1.27 1.06 1.15 0.6
73 A073V 0.38 1.42 1.19 1.46 0.1
74 A07¡4G 1.04 0.89 0.85 1.06 0.2
77 N07Í7C 0.23 0.95 0.12 0.36 0.2
77 N07Í7E 0.20 1.17 0.13 0.35 0.2
77 N07¡71 0.23 0.63 0.09 0.28 0.2
77 N07[7K 0.18 1.28 0.06 0.36 0.2
77 N07|7L 0.19 2.18 0.24 0.77 0.1
77 N07|7M 0.21 0.94 0.11 0.32 0.3
77 N07¡7R 0.18 2.49 0.10 0.93 0.1
78 S078A 1.21 1.08 1.10 1.03 1.1
78 S078C 1.23 1.03 0.77 0.88 1.5
78 S078D 1.33 1.10 0.83 0.88 1.7
78 S078E 1.04 1.05 0.87 0.96 1.1
78 S078F 1.11 0.95 0.64 0.98 0.5
78 S078G 1.28 1.14 0.83 0.92 0.6
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
79 I079Y 1.19 0.76 1.26 0.92 1-0
80 G080C 0.19 0.60 1.75 1.16 0.1
81 V081D 0.24 1.35 0.77 0.60 0.1
81 V081I 1.15 1.09 0.82 1.05 0.3
81 V081T 0.94 1.17 0.79 1.00 0.2
81 V081Y 0.88 1.22 0.77 1.08 0.1
82 L082G 0.21 2.20 1.71 1.50 0.1
82 L082V 0.78 1.21 1.19 1.10 0.2
82 L082W 0.17 10.29 8.50 4.18 0.7
84 V084A 1.27 0.84 0.96 0.82 0.7
84 V084C 1.15 0.77 0.75 0.79 0.8
84 V084G 0.29 0.75 0.84 0.86 0.5
84 V084I 1.08 0.96 0.99 0.68 0.5
84 V084L 0.51 0.66 0.91 1.00 0.3
84 V084M 0.89 0.91 0.68 0.87 0.3
84 V084N 0.67 0.75 0.98 0.88 0.8
84 V084S 0.81 0.79 0.64 0.85 0.5
84 V084T 1.06 0.95 0.42 0.70 0.7
85 A085C 0.64 0.84 0.85 0.99 0.8
85 A085G 0.77 0.93 0.92 0.97 0.9
85 A085S 0.90 0.94 0.94 0.97 0.9
85 A0!85T 0.43 1.35 1.11 0.88 0.6
85 A¾85V 0.20 2.50 2.45 2.31 0.7
86 P086A 0.45 1.30 1.13 1.29 0.7
86 P086D 0.52 1.20 0.80 1.21 0.5
86 P086E 0.46 0.88 1.20 1.02 0.4
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMl PI BMI P1 BMI LAS- AA
BPN'
1 pH 8 pH 7 pll 8 EDTA
1
i 16C 16C 32C PI
90 L09QP 0.27 1.56 1.73 1.61 0.9
90 L090Q 0.44 1.22 1.21 1.20 1.1
90 L090S 0.24 1.57 1.85 1.57 0.7
90 L090T 0.21 3.87 3.31 2.49 0.8
90 L090V 0.77 1.20 1.08 1.18 0.8
91 Y091 A 0.25 0.60 1.29 1.22 0.9
91 Y091C 0.23 0.99 2.01 1.14 1.1
91 Y0¾1D 0.31 0.90 1.51 1.27 1.1
91 Y091F 1.07 0.60 1.21 1.23 1.1
91 Y091H 0.80 0.71 1.16 1.04 1.0
91 Y091I 0.22 1.01 2.17 1.25 1.2
91 Y091L 0.18 Í.59 2.82 1.67 1.0
91 Y091M 0.27 1.09 1.56 1.13 1.1
91 Y091Q 0.16 7.64 26.89 1.98 1.2
91 Y091 S 0.25 0.90 1.68 • 1.44 0.8
91 Y091T 0.17 3.68 8.06 2.67 0.9
91 Y091V 0.23 0.89 1.92 1.46 1.0
92 A092C 0.29 2.61 2.00 1.71 0.6
92 A092G 0.55 1.16 1.46 1.30 0.8
92 A092I 0.33 1.73 1.53 1.5 0.7
92 A092M 0.21 2.49 2.62 2.92 0.6
92 A092N 0.18 6.44 7.31 5.48 0.7
92 A092P 0.26 1.62 2.34 2.13 0.9
92 A092S 1.04 0.85 0.94 1.22 1.1
92 A092T 0.73 1.10 1.14 0.98 0.9
92 A092V 0.30 1.40 1.31 1.73 0.6
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
???' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
95 VO¾A 0.44 0.85 0.53 0.71 1.0
95 V095C 1.03 0.96 0.64 0.87 1.0
95 V095G 0.43 0.97 0.34 0.83 1.0
95 V09Í5S 0.91 1.07 0.82 0.96 1.1
95 V095T 0.90 1.23 0.95 1.04 1.1
96 L09!6F 0.45 2.00 0.80 1.35 0.9
96 L09 l 0.76 1.64 0.85 1.02 1.2
96 L09|6M 0.91 1.53 1.09 1.23 0.9
96 L09Í6V 0.95 1.42 0.85 1.31 1.1
96 L096W 0.20 5.01 1.57 2.17 1.0
97 G097A 0.91 1.55 0.95 1.33 1.0
97 G097C 1.01 1.66 1.07 1.08 1.0
97 G097D 1.55 1.43 0.79 1.20 1.0
97 G097E 1.14 1.38 0.78 1.06 1.1
97 G097F 0.29 1.93 1.01 1.36 0.9
97 G097H 0.85 1.26 1.10 1.01 1.0
97 G097K 1.23 1.17 0.63 1.00 1.1
97 G097L 0.77 1.43 1.11 1.24 1.1
97 G097M 0.84 1.32 1.04 1.18 1.1
97 G097P 0.39 2.35 1.56 1.34 1.1
97 G097Q 0.97 1.36 0.77 1.03 1.2
97 G097R 1.22 0.97 0.64 1.02 1.0
97 G097S 0.98 1.45 1.12 1.07 0.9
97 G097T 1.02 1.23 0.93 1.10 1.0
97 G097V 0.54 1.56 1.09 1.22 1.0
97 G097W 0.23 2.95 1.54 1.49 1.0
Tabla 6-2 (continuación)
ición Vari ante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
Bl pIT 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
101 S101P 0.25 3.64 1.39 1.83 1.1
101 S101Q 0.59 1.56 0.79 1.05 1.0
101 S101R 1.20 1.04 0.65 0.90 1.0
101 S101T 0.94 1.34 0.68 1.16 1.0
101 S 101V 0.92 1.39 0.74 1.18 0.9
101 S 101Y 0.72 1.04 0.48 0.92 1.0
102 G 10j2 A 1.12 1.46 1.31 1.19 1.0
102 G102S 0.77 1.61 1.10 1.04 1.1
103 Q103A 1.09 0.93 0.93 0.89 1.0
103 Q103C 1.19 1.10 1.05 0.97 1.0
103 Q103E 1.21 1.38 1.15 1.05 1.0
103 Q103F 1.02 0.82 0.57 0.83 0.9
103 Q103G 0.39 1.48 1.06 1.34 1.1
103 Q103H 0.89 1.35 0.89 0.93 0.9
103 Q103I 1.06 0.88 0.89 0.87 1.1
103 Q103K 0.17 2.63 1.36 1.25 1.0
103 Q103L 0.44 0.87 0.68 0.81 1.1
103 Q103M 0.89 1.06 0.76 0.99 0.9
103 Q103N 1.44 1.44 1.23 0.88 1.0
103 Q103R 1.09 0.47 0.57 0.88 1.1
103 Q1Q3S 1.21 1.03 0.96 0.91 1.0
103 Q103T 0.84 1.01 0.94 0.95 1.0
103 Q103V 0.94 1.13 1.03 0.97 1.0
103 Q103W 0.98 0.65 0.63 0.73 1.1
104 Y104C 0.34 1.24 1.33 1.31 1.1
104 Y104F 0.90 0.88 0.78 1.03 1.0
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pII 8 pII 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
105 S105Q 0.24 0.70 0.76 0.72 1.0
105 S105R 0.16 3.02 3.37 0.95 1.2
105 S105T 0.87 1.19 1.11 1.21 1.0
105 S105V 0.18 2.82 3.06 2.81 1.0
,106 W106A 038 1.42 1.15 1.06 0.9
106 W106C 0.37 1.38 1.10 0.99 0.9
106 W106E 0.39 1.73 1.34 1.15 1.1
106 W106F 0.81 1.33 0.80 1.29 1.0
106 W106G 0.24 1.40 1.28 1.21 0.9
106 W106H 0.78 1.02 0.97 1.16 0.9
106 W106I 0.30 1.51 1.13 1.34 1.1
106 W106L 0.31 1.56 1.11 1.40 1.1
106 W106M 0.41 1.36 1.11 1.13 0.9
106 W106N 0.51 1.16 1.02 1.23 1.0
106 W106R 0.34 0.94 1.24 1.26 1.0
106 W106S 0.37 1.41 0.93 1.19 2.0
106 W106T 0.39 1.41 1.15 1.25 0.9
106 W106V 0.33 1.48 1.20 1.19 0.9
106 W106Y 0.90 1.19 1.05 1.22 0.9
107 I107E 0.47 1.07 1.99 1.00 1.0
107 I107F 0.54 0.87 0.79 1.16 1.0
107 I107L 0.84 0.57 0.33 0.48 1.0
107 I107M 0.86 1.18 2.50 0.93 1.0
107 I107R 0.23 2.33 2.34 1.86 1.2
107 I107S 0.46 1.41 0.88 1.22 1.0
107 I107T 0.70 1.35 2.33 0.93 1.0
t
I
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCAPI PIBMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH8 pH7 pH8 EDTA
16C 16C 32C PI
109 N109L 0.81 0.80 0.99 1.18 1.1
109 N109P 0.59 1.13 0.94 1.20 1.0
109 N109Q 1.04 0.63 0.55 0.99 1.2
109 N109R 0.71 0.58 0.57 1.03 LO
109 NIO^S 1.03 0.93 0.90 1.13 1.0
109 NIO^T 0.94 1.26 0.82 1.02 0.9
109 N1 9V 0.59 0.91 0.91 1.17 1.0
109 N109W 0.63 0.92 0.76 1.15 0.9
109 N109Y 0.54 0.88 0.89 1.08 0.9
110 Gll!OA 0.79 1.28 0.75 1.05 0.9
110 GlliOS 0.25 2.17 1.37 1.69 0.9
10 GlliOT 0.20 4.57 3.95 2.82 0.9
111 ni 0.24 3.80 2.39 1.92 0.9
111 11 He 0.36 1.88 1.45 1.48 0.9
111 IlllL 1.00 1.30 0.96 1.10 1.0
111 ?11?? 0.80 1.37 0.98 1.04 1.1
111 ?11?? 0.31 3.10 1.56 1.67 1.0
111 111 IV 0.73 1.59 0.98 1.32 1.0
112 E112A 0.33 1.05 0.84 1.31 1.1
112 E112C 0.49 0.40 0.28 0.28 1.1
112 E11 D 0.97 1.20 0.97 1.11 1.0
112 E112G 0.37 0.87 0.64 0.90 1.0
112 .El 121 0.22 7.24 2.74 2.71 1.1
112 E112L 0.21 19.65 11.59 3.83 1.1
112 E112M 0.35 - 0.98 0.74 1.07 1.0
112 ??2? 0.38 1.24 0.85 1.19 1.0
1
I
34 7
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
114 Al lHT 0.59 1.03 1.49 1.53 0.9
114 Al ljW 0.31 1.57 2.18 1.56 0.9
115 I115A 0.40 1.58 0.99 1.09 0.9
115 I115C 0.69 1.23 0.81 1.25 1.0
115 I115jE 0.28 2.29 1.67 1.56 0.9
115 I115¡F 0.30 1.99 1.22 1.37 0.9
115 I115H 0.24 4.85 2.46 2.39 0.9
115 I115L 0.83 1.04 0.96 1.08 1.1
115 I115 0.89 1.46 1.03 1.09 1.0
115 I115N 0.21 8.31 8.40 2.63 1.0
115 11150 0.58 1.30 0.80 1.24 1.0
115 I115R 0.38 1.37 1.00 1.21 1.0
115 1115$ 0.24 4.20 2.44 2.22 0.9
1 15 ?115|G 0.59 1.46 0.89 1.08 0.9
115 I115V 0.84 1.44 0.99 1.25 0.9
115 111 ^ 0.24 4.81 4.07 2.48 0.9
116 A116C 1.15 0.85 1.06 0.90 1.0
116 Al lí ÍD 1.24 1.02 0.81 1.03 1.0
116 Al lí ÍE 1.16 1.21 1.09 0.89 1.0
116 Al lí )F 0.95 1.06 0.92 0.94 1.0
116 Al lí G 0.66 0.94 1.01 0.97 1.0
116 Al lí )H 1.07 1.09 0.92 1.13 1.0
116 Al lí 31 0.95 0.82 1.04 1.13 1.0
116 Al lí K 1.18 0.74 0.79 1.13 1.0
116 Al ie )L 0.82 1.05 0.89 0.83 1.0
116 Al lí ?M 1.11 0.86 1.14 0.85 1.0
I
I
348
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMl LAS- AA
BPN'
1 pH 8 pH 7 pH 8 EDTA i 16C 16C 32C PI
117 N117R 0.80 0.98 0.78 0.98 1.0
117 N117S 0.53 1.18 1.24 1.06 1.3
117 ?1 ?? 0.80 1.05 1.07 1.15 1.0
117 N117V 0.17 536 4.11 2.10 1.0
117 N117W 0.25 2.09 1.77 1.63 1.0
117 ?1 ?? 0.45 0.99 0.89 1.22 1.0
118 N118A 0.71 0.58 0.84 0.95 1.0
118 N118C 0.74 0.61 1.01 0.63 1.1
118 N118D 1.12 0.67 1.05 0.86 1.2
118 N118E 0.88 0.71 0.70 0.69 1.1
118 N118F 0.34 1.02 1.31 0.93 1.0
118 N118G 1.07 0.83 0.50 0.79 0.9
1 18 N1 18H 1.18 0.75 0.88 0.92 1.0
118 NI 181 0.17 4.85 5.90 1.96 1.1
118 N118K 1.17 0.80 0.81 0.81 1.1
118 N118L 0.23 1.45 1.85 1.32 1.0
118 N118M 0.49 0.87 0.99 1.06 1.0
118 N118Q 1.03 0.62 1.12 0.90 1.1
118 N118R 1.35 0.82 0.62 0.80 1.0
118 N118S 0.89 0.77 0.81 0.76 0.9
118 N118T 0.64 0.72 0.86 1.08 0.9
118 N118V 0.23 1.35 1.92 1.53 1.0
118 N118W 0.27 1.16 1.36 1.41 1.1
118 N118Y 0.84 0.98 0.72 0.70 1.0
119 M119A 0.75 1.01 1.16 1.01 0.8
119 M119C 0.86 1.01 1.16 0.95 1.0
I Tabla 6-2 (continuación)
I
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
120 D120K 1.15 0.88 1.01 0.95 1.1
120 D12ÓL 0.33 0.65 1.25 1.12 1.1
120 D120M 0.73 0.87 0.97 0.95 0.7
120 D120N 1.11 1.01 1.00 0.92 1.1
120 D120P 0.22 1.12 1.61 1.14 1.1
120 D120Q 1.05 1.21 1.09 0.96 1.1
120 D120R 1.03 0.86 0.97 1.10 0.9
120 D120S 1.01 0.94 1.16 0.86 1.0
120 D120T 0.77 1.08 1.09 1.00 1.0
120 Di2;ov 0.32 1.13 1.21 0.64 1.1
120 D120W 0.32 1.10 1.44 1.19 1.1
120 DI 20 Y 0.22 1.30 1.73 1.29 1.0
121 V121C 0.76 0.98 0.99 0.78 1.1
121 Vl2l E 0.19 0.45 1.16 0.85 0.7
121 V121 F 0.18 0.12 1.14 0.47 0.7
121 V121 I 1.15 0.83 0.88 0.81 1.0
121 V121L 0.81 0.95 0.91 0.88 0.8
121 V121T 0.26 1.28 1.66 1.24 1.1
122 1122 A 0.92 1.06 1.04 1.00 0.8
122 I122C 0.78 1.17 1.22 1.09 0.8
122 I122F 0.37 1.16 1.45 1.19 1.4
122 I122L 0.73 0.99 1.28 1.09 0.8
122 I122M 0.93 1.17 1.05 1.23 0.8
122 I122S 0.22 6.46 6.12 2.56 1.9
122 I122T 0.34 1.78 1.79 1.13 1.4
122 I122V 0.80 1.14 1.39 1.13 0.7
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C I
L126W 0.89 0.71 0.79 0.78 0.9
128 G128A 1.21 1.24 1.28 1.21 1 0 128 G128S 1.35 1.17 1.12 1.09 1.2 129 P129A 1.04 1.02 o:98 0.99 0.7 129 P129C 1.37 1.09 1.11 0.91 0.9 129 P129D 1.48 1.03 1.08 0.84 1.1 129 P129E 1.42 1.24 1.04 1.10 1.0 129 P129F 0.65 1.10 0.71 1.00 0.7 129 P129G 0.78 0.82 0.60 0.81 08 129 P129H 0.66 0.92 0.73 0.84 0.9 129 P129I 1.14 0.95 0.99 1.11 0.9 129 P129K 1.13 0.72 0.64 1.01 0.9 129 P129L 1.12 1.13 1.21 1.06 0.9 129 P129M 1.20 1.08. 0.92 1.20 09 129 P129N 0.90 1.00 1.04 0.98 0.9 129 P129Q 1.10 1.22 0.90 1.01 _L0 129 P129R 0.74 0.73 0.75 0.87 0.9 129 P129S 1.07 0.99 0.87 0.98 0.9 129 P129T 1.13 1.29 1.17 1.09 09 129 P129V 0.72 1.41 1.26 1.09 0.8 129 P129W 0.38 0.97 0.79 1.18 04 129 P129Y 0.71 1.01 0.90 1.04 0.8 130 S I 30 A 1.14 0.92 0.76 0.86 1.0 130 S 130C 1.24 0.75 0.95 0.66 1.1 130 S 130E 1.36 0.73 1.29 1.03 1.1 130 S130F 1.17 0.89 0.79 0.84 1.0
Tabla 6-2 (continuación)
ición Vari ante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BF »N' pII 8 pII 7 pII S EDTA
16C 16C 32C PI
131 G131F 0,23 0.42 0.55 0.67 0.2
-131 G131K 1.00 0.48 1.00 0.89 1.0
131 G13ÍM 0.53 0.47 0.89 0.75 0.6
131 G13ÍN 0.46 0.23 0.49 0.54 0.8
131 G131P 0.22 0.77 1.29 1.21 0.1
131 G131Q 0.28 0.49 1.15 0.95 0.3
131 G131 R 0.19 0.97 2.04 1 .64 0.1
131 G131 S 0.21 0.12 0.47 0.83 0.2
131 G131T 0.86 0.52 1.16 0.89 1.0
131 G131V 0.51 0.50 0.83 0.94 0.7
131 G131Y 0.30 0.26 0.40 0.71 0.9
132 S I 32 A 0.60 1.01 1.03 1.03 0.5
132 S 132C 1.25 1.06 1.10 0.83 1.0
132 S 132E 0.33 1.04 1.40 1.01 0.9
132 S 132G 0.83 0.83 0.14 0.94 1.0
132 S132I 0.25 1.62 1.82 1.25 0.8
132 S 132K 0.19 0.09 0.60 0.16 0.7
132 S132L 0.25 1.27 1.65 1 .22 0.8
132 S132M 0.35 1.01 1.05 1.05 0.6
132 S 132N 0.88 1.38 1.35 1.17 1.0
132 S 132P 0.17 9.36 1 1.70 2.50 1.0
132 S132Q 0.34 1.35 1.28 1.18 0.7
132 S 132V 0.23 3.29 2.39 2.07 0.8
133 A133C 0.98 0.87 1.06 0.79 1.1
133 A133D 0.91 0.90 0.79 0.81 1.0
133 A13;3E 1.07 0.93 0.96 0.84 1.0
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA Pl Pl BMl Pl BMl Pl BMl LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C Pl
134 A134G 0.63 1.14 0.59 0.93 1.2
134 A134I . 0.26 1.60 1.22 1.29 0.9
134 A13 L 0.19 1.85 2.41 1.75 1.1
134 A134M 0.21 1.40 1.20 1.29 1.1
134 A13 P 0.78 1.06 0.86 0.95 1.0
134 A134Q 0.19 0.12 0.36 0.32 1.1
134 A134S 0.97 1.04 0.91 0.92 1.1
134 A134T 0.94 1.03 0.86 1.04 1.0
134 A134V 0.39 1.27 1.04 0.84 0.9
135 L135A 0.23 1.24 0.90 1.12 1.0
135 L135E 0.43 1.19 1.03 0.88 1.1
135 L135I 0.34 1.41 0.97 1.06 0.7
135 L135M 1.03 1.01 1.19 0.96 1.1
135 L135T 0.19 3.36 2.29 2.06 0.6
135 L135V 0.34 2.12 1.12 1.33 0.6
135 L135W 0.27 2.14 1.96 1.47 0.8
136 K136A 0.57 0.80 1.04 0.83 0.9
136 K136C 0.51 1.02 1.04 0.74 0.9
136 K13ÓD 0.21 1.62 1.47 0.92 0.4
136 K136E 1.03 0.92 0.73 0.82 1.2
136 K13ÓF 0.27 1.35 1.57 1.15 0.6
136 K136G 0.44 1.09 1.12 0.91 0.7
136 K13Í5H 0.89 0.99 1.00 0.68 1.1
136 K13Í5I 0.20 2.18 2.48 1.44 0.4
136 K13Í5L 0.65 1.05 0.71 0.90 1.0
136 136M 0.69 1.02 0.87 0.87 0.9
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI M1 PI BM1 PI BMI LAS- AA
BRN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
1
1 16C 16C 32C I
137 A137P 0.18 3.85 3.42 1.76 0.2
137 A137Q 1.05 1.05 0.60 0.92 1.0
137 A137R 0.65 0.65 0.49 0.70 1.0
137 A137S 0.98 0.91 0.92 1.08 0.9
137 A137T 0.96 0.94 0.77 0.96 1.0
137 A137V 0.62 1.27 0.85 1.06 0.8 137 A137W 0.69 0.8 0.55 0.62 0.9
137 A 137 Y 0.83 1.05 0.73 0.66 0.9
138 A138C 0.85 1.04 1.10 1.14 0.9
138 A138D 0.17 1.47 4.55 2.27 0.3
138 A138E 0.36 1.44 0.96 1.13 0.9
138 A138F 0.18 2.55 2.71 1.96 0.8
138 A138G 0.52 1.27 1.35 1.07 0.9
138 A138H 0.20 2.04 2.24 1.84 0.7
138 A138I 0.78 0.93 0.98 1.11 0.9
138 A138L 0.27 1.23 1.19 1.42 0.9
138 A1 8M 0.71 0.88 0.89 1.00 1.0
138 A138Q 0.17 11.86 16.19 4.99 0.9
138 A138S 0.86 1.05 0.99 1.02 0.7
138 A138T 0.51 1.17 1.27 1.18 0.9
138 A138V 0.76 1.08 1.11 1.05 0.9
138 Al 38 Y 0.17 5.98 9.05 3.30 0.6
139 VI 39 A 0.69 1.06 1.06 0.97 0.8
139 V139C 1.19 1.03 1.09 0.95 1.0
139 V139G 0.21 0.40 0.60 0.65 0.5
139 V139H 0.25 0.75 0.74 0.73 0.8
Tabla 6-2 (continuación)
ición Vari ante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
Bf »N' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
143 V143R 0.77 0.64 0.70 0.92 1.0
143 V143S 1.03 0.94 0.97 0.93 1.0
143 V143T 0.83 0.90 0.93 0.99 1.0
143 V143W 0.65 1.36 0.84 1.02 0.9
144 A144C 1.17 0.98 0.85 0.88 1.0
144 A14#D 1.29 1.18 1.11 0.99 1.0
144 A14#E 1.17 1.08 0.76 1.00 1.0
144 A14^F 0.96 1.20 0.73 0.94 1.0
144 A144G 1.09 1.08 0.98 1.02 1.0
144 A14 I 0.97 1.29 0.79 0.97 1.1
144 A144K 1.28 1.00 0.57 0.77 1.1
144 A14 ^L 1.11 1.18 0.79 1.08 1.0
144 A14 M 1.06 1.08 0.84 1.07 1.0
144 A14^P 0.18 1.75 2.60 1.24 0.4
144 A144R 1.23 0.96 0.45 0.90 1.1
144 A14flS 1.04 1.24 0.93 0.85 1.0
144 A14^T 1.08 1.16 0.89 1.04 1 .1
144 A14f4V 0.80 1.11 1.13 0.86 1.0
144 A14|4W 0.87 1 .23 0.64 0.88 1.0
145 S14 A 1.09 0.97 1.13 0.94 1.0
145 S145C 1.10 0.72 1.03 1.00 1.1
145 S145D 1.24 1.03 1.06 1.08 1.1
145 S145E 1.24 0.90 1.20 0.90 1.1
145 S145F 0.84 0.81 1.15 1.12 1.1
145 S 145G 1.06 0.77 1.13 1.06 1.0
145 S 145H 1.21 0.93 1.04 1.05 1.1
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
149 V149F 0.92 1.15 1.31 1.07 1.0
149 V149G 0.24 0.90 0.72 1.05 1.0
149 V149H 0.25 0.54 0.75 0.70 1.2
149 V149I 0.84 0,96 1.08 0.85 1.1
149 V149L 0.69 1.02 1.11 1.11 1.1
149 V149M 0.82 1.09 1.11 1.07 1.1
149 V149P 0.46 0.94 1.23 1.04 1.2
149 V149S 0.37 1.12 1.42 1.31 1.1
149 V149T 0.66 0.88 1.16 1.09 1.1
149 V149W 0.25 0.44 0.50 0.59 1.3
149 V149Y 033 1.18 1.52 1.33 1.0
150 VI 0 A 0.54 0.85 1.21 1.04 0.9
150 V15QC 0.80 0.86 1.07 1.06 1.0
150 V150F 0.47 0.89 1.07 1.07 0.8
150 vi5;oi 0.83 1.14 1.05 1.07 1.0
150 V150L 0.75 0.97 0.96 1.02 0.9
150 V150M 0.39 0.97 1.26 1.27 0.9
150 Vl^ON 0.28 0.27 0.26 0.21 1.1
150 V150Q 0.31 1.25 1.67 1.46 1.0
150 V1 0S 0.33 1.08 1.22 1.17 0.8
150 V150T 0.61 0.71 1.28 1.09 1.0
151 Alí Í1C 0.74 1.20 0.94 0.98 0.9
151 Al ilG 0.49 0.85 1.24 1.16 0.8
151 A í )1M 0.24 1.15 1.42 1.13 1.0
151 Alf SIN 0.21 0.93 1.88 1.11 0.7
151 Alí SIS 0.79 0.96 1.26 1.08 1.0
I
Tabla 6-2 (continuación)
1
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pII 8 pII 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
156 E156Q 0.93 0. 1 0.51 0.75 0.9
156 E156R 1.10 0.23 0.41 0.66 0.4
156 E156S 0.93 0.62 0.52 0.91 0.8
156 E156T 0.72 0.73 0.65 LOO 0.7
156 E156V 0.54 0.60 0.60 0.98 0.6
156 E156W 0.79 0.24 0.21 0.60 0.7
156 E156Y 1.10 0.35 0.43 0.72 0.9
157 G157A 0.48 0.83 0.87 0.92 0.6
157 G15 C 0.60 0.63 0.79 0.95 0.4
157 G157D 0.49 0.68 0.87 0.79 0.4
157 G157E 0.58 0.62 0.82 0.69 0.2
157 G157F 0.34 0.38 0.60 0.68 0.2
157 G157I 0.34 0.34 0.53 0.54 0.1
157 G157L 0.40 0.33 0.54 0.60 0.1
157 G157M 0.43 0.58 0.72 0.66 0.2
157 G157P 0.45 0.32 0.42 0.58 0.1
157 G157Q 0.41 0.55 0.80 0.71 0.2
157 G157R 0.31 0.28 0.52 0.43 0.1
157 G157S 0.53 1.03 0.96 0.88 0.8
157 G157T 0.37 0.51 0.81 0.97 0.2
157 G1 7V 0.33 0.43 0.74 0.63 0.1
157 G157W 0.40 0.59 0.70 0.88 0.2
157 G157Y 0.29 0.74 0.80 0.80 0.3
158 T158A 0.94 0.98 0.98 0.92 0.8
158 T158D 0.68 1.09 1.09 1.04 1.1
158 T158E 1.10 1.09 1.03 0.98 1.2
I Tabla 6-2 (continuación)
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variánte TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
???' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
164 T164V 0.26 0.55 0.80 0.88 0.1
164 T164W 0.18 1.58 2.34 1.67 0.1
164 T164Y 0.20 1.10 1.76 1.62 0.1
165 V165C 0.22 0.53 0.65 0.92 0.4
165 V165I 0.37 0.89 1.17 1.15 1.1
165 V165L 0.28 0.62 0.66 1.12 0.8
165 V165M 0.30 0.61 0.84 1.10 0.7
165 V165P 0.46 0.87 0.80 0.84 0.8
165 V165T 0.19 1.50 1.95 1.86 0.1
166 G16 A 0.27 0.47 0.77 0.97 1.1
166 G166C 0.86 0.61 0.78 0.79 1.1
166 G166F 1.09 0.54 0.46 0.82 1.3
166 G166H 1.04 0.80 0.77 0.78 1.2
166 G166K 0.82 0.32 0.33 0.58 0.9
166 G166L 1.36 0.41 0.48 0.61 1.2
166 G166M 1.13 0.56 0.59 0.66 1.1
166 G166N 1.08 0.90 0.94 1.10 1.1
166 G16&P 0.37 0.79 0.83 0.88 0.1
166 G166Q 1.21 0.66 0.81 0.96 1.1
166 G166R 0.87 0.41 0.43 0.88 0.9
166 G166S 1.09 0.80 1.04 0.75 1.0
166 G166W 1.10 0.65 0.95 0.99 1.1
166 G166Y 0.99 0.69 0.45 0.92 1.0
167 Y 167 A 0.68 1.35 1.13 1.28 0.7
167 Y16?C 0.42 1.20 1.06 1.31 0.6
167 Y167D 0.27 1.36 1.64 1.29 0.1
i
I
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN'
1 pII 8 pH 7 1 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
173 S173 0.70 0.66 0.57 1.03 0.7
173 S 173L 0.56 1.10 1.02 1.35 0.9
173 S 173M 0.69 1.11 1.16 1.00 0.8
173 S173P 0.45 1.14 1.02 1.22 0.9
173 S173Q 0.67 1.28 0.84 1.21 0.9
173 S173 0.45 0.98 0.65 1.14 0.6
173 S173;T 0.82 1.08 0.81 1.15 1.0
173 S173;V 0.79 1.09 0.79 1.10 1.0
173 S173W 0-33 1.89 1.29 1.50 0.6
173 S173Y 0.39 1.71 1.01 1.38 0.7
174 VI 74 A 0.45 1.44 1.21 1.10 0.8
174 vi 74c 0.80 1.14 1.08 1.21 0.9
174 vi 741 0.37 1.48 0.86 1.14 0.6
174 V174L 0.21 92.96 66.79 4.24 0.5
174 V174S 0.41 1.38 1.04 1.21 0.9
174 V174T 0.78 1.29 0.82 1.13 0.9
175 I175A 0.21 6.10 9.32 1.84 0.4
175 I175C 0.61 1.10 1.06 1.16 0.9
175 1175F 0.32 1.69 1.23 1.30 0.6
175 I175L 0.90 1.27 0.89 1.04 0.8
175 I175M 0.92 1.17 0.82 1.05 1.0
175 I175|T 0.31 1.96 1.59 1.44 0.5
175 I175|V 0.33 1.96 1.32 1.36 0.9
176 A176C 1.04 0.99 0.79 1.00 1.1
176 A17éG 0.24 0.55 0.86 1.10 0.5
176 A17Í5S 0.78 0.89 1.00 1.12 1.0
1
I 365
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN' pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
184 N184I 0.75 1.04 1.07 0.98 0.2
184 N184L 0.95 1.36 0.87 1.09 0.7
184 N184M 1.05 0.99 1.06 0.97 0.7
184 N184P 0.78 0.78 1.02 0.79 0.1
184 N184Q 0.82 0.78 1.10 1.10 0.6
184 N184S 0.88 1.02 0.97 1.06 0.7
184 N184T 0.80 1.16 1.14 0.90 0.4
184 N184V 0.72 1.30 1.07 1.02 0.3
184 N184W 0.80 0.92 1.28 0.99 0.4
184 NI 84 Y 0.80 0.93 1.06 1.16 0.6
185 Q185A 1.01 0.84 1.15 1.06 0.9
185 Q185C 0.95 1.15 1.09 0.92 1.1
185 Q185D 0.29 2.02 1.65 1.42 0.6
185 Q185E 0.77 1.37 1.07 0.91 1.2
185 Q185F 0.84 1.05 1.09 0.94 0.6
185 Q185G 0.74 0.79 1.29 1.00 0.7
185 Q185H 1.00 0.88 0.91 1.02 0.9
185 Q185I 0.87 1.46 0.98 0.95 0.9
185 Q185K 0.98 0.68 0.73 0.85 0.7
185 Q185L 0.87 0.99 0.96 1.04 0.7
185 Q18Í5M 0.93 0.91 1.09 1.05 1.0
185 Q18 N 0.97 1.14 1.11 1.08 1.1
185 Q185R 0.91 0.75 0.80 0.99 0.4
185 Q18SS 0.83 1.38 1.04 1.06 0.8
185 Q185T 0.82 1.36 1.28 1.13 1.0
185 Q185V 0.94 1.04 1.30 0.99 0.8
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- A A
BPN' |)1I 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
186 R186V 0.42 2.00 2.04 1.42 0.9
186 R186W 0.63 1.54 1.71 1.12 1.1
186 R186Y 0.38 1.50 1.98 1.37 0.8
187 A187C 0.77 0.75 1.06 0.84 0.2
187 A187D 0.93 1.51 0.99 1.03 0.4
187 A187E 0.72 1.41 1.49 LOO 0.2
187 A187F 0.73 1.02 1.07 0.93 0.1
187 A187G 0.90 1.04 1.12 0.93 0.6
187 A187N 0.74 1.11 1.39 1.03 0.5
187 A187P 1.08 1.15 1.12 0.92 0.7
187 A187S 0.68 1.14 1.13 1.06 0.4
187 A187W 0.93 0.95 0.99 1.07 0.7
187 A187Y 1.02 1.05 1.25 0.79 0.5
188 S188A 1.14 0.93 1.08 0.96 0.9
188 S188C 1.24 1.07 1.27 0.81 1.0
188 S188D 1.08 1.03 1.33 0.94 1.2
188 S 188E 1.03 1.18 1.29 0.98 1.1
188 S188F 0.91 0.98 1.08 0.86 0.8
188 S188G 1.06 0.99 1.09 0.94 0.9
188 S188H 1.01 0.92 1.00 0.91 0.9
188 S188I 0.94 0.79 1.24 1.01 0.9
188 S188K 1.14 0.64 0.89 1.00 0.5
188 S188L 1.01 1.07 1.16 0.82 0.8
188 S188M 0.98 0.73 1.28 0.90 0.8
188 S188P 1.05 1.05 1.23 1.01 1.0
188 S188Q 0.97 1.01 1.17 1.00 0.9
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
BPN'
) 1 pH 8 pH 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
203 V203A 0.51 1.07 1.26 1.24 0.3
203 V203C 0.93 1.10 1.10 0.83 1.0
203 V203D 0.54 1.12 1.62 1.23 1.1
203 V203E 0.57 0.88 1.05 1.13 1.1
203 V203G 0.17 8.72 7.71 4.86 0.1
203 V203H 0.59 0.87 0.81 0.89 0.1
203 V203I 0.81 0.63 1.05 0.93 0.8
203 V203M 0.77 0.98 1.14 1.00 0.6
203 V203N 0.47 1.05 1.38 1.22 0.1
203 V203Q 0.62 0.90 1.18 1.13 0.5
203 V203S 0.55 0.93 1.10 1.04 0.2
203 V203T 0.65 0.90 1.31 1.07 0.6
203 V203Y 0.43 0.94 1.21 1.05 0.1
204 S204A 0.97 0.86 1.00 0.81 1.2
204 S204C 0.90 1.00 1.05 0.89 1.4
204 S204F 0.86 0.39 0.60 0.82 0.7
204 S204G 0.88 1.01 1.19 0.75 1.1
204 S204H 0.68 0.72 0.81 0.95 1.0
204 S204I 0.66 0.79 0.99 0.83 0.7
204 S204K 0.90 0.74 0.64 0.87 0.1
204 S20 L 0.77 0.85 0.82 0.93 0.9
204 S204M 0.90 0.75 1.10 0.95 0.8
204 S204Q 0.87 0.84 1.06 0.94 1.3
204 S20 T 0.92 0.78 0.86 0.80 0.9
204 S204V 0.82 0.71 0.79 0.85 0.7
204 S204W 0.74 0.39 0.67 0.79 0.6
370
Tabla 6-2 (continuación)
Tabla 6-2 (continuación)
Tabla 6-2 (continuación)
ición Variante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AAP
BPN' pII S pH 7 pII 8 EDTA
16C 16C 32C PI
257 L25Í7C 0.78 1.09 1.04 1.05 0.8
257 L25Í7D 0.37 1.17 1.22 0.83 0.4
257 L25|7E 0.50 1.05 1.27 0.92 0.6
257 L25Í7F 0.67 0.60 1.05 0.91 0.2
257 L25|7G 0.67 1.01 0.64 1.20 0.7
257 L25Í7H 0.56 0.83 1.00 1.01 0.4
257 L257I 0.83 0.89 1.04 0.97 0.9
257 L¾7M 0.84 1.06 0.93 0.86 0.8
257 L257N 0.52 1.16 1.00 1.00 0.5
257 L257P 0.45 0.69 0.96 0.91 0.3
257 L257R 0.59 0.64 0.76 1 .04 0.1
257 L257S 0.62 0.93 1.10 0.97 0.5
257 L257T 0.62 1.05 1.29 1.00 0.7
257 L257V 0.76 0.91 0.90 0.97 0.9
257 L2^7Y 0.62 1.17 1.00 0.98 0.4
258 G258A 0.59 1.05 1.13 1.14 0.1
258 G258C 0.53 0.87 1.15 1.03 0.4
258 G258E 0.57 0.98 1.1 1 1.12 0.9
258 G258I 0.29 1.26 1.39 1.41 0.3
258 G258M 0.43 1.02 1.05 1.29 0.1
258 G258Q 0.52 1.05 1.26 1.12 0.4
258 G258V 0.38 1.26 1.57 1.45 0.6
261 F261A 0.55 0.82 0.95 0.91 0.5
261 F261C 0.57 0.80 1.08 0.95 0.7
261 F261E 0.65 0.65 1.05 0.94 0.7
261 F261G 0.46 0.75 0.82 0.80 0.2
Tabla 6-2 (continuación)
ición Va ríante TCA PI PI BMI PI BMI PI BMI LAS- AA
E PN' pII 8 pII 7 pH 8 EDTA
16C 16C 32C PI
270 V2¡70P 0.50 0.91 1.08 0.93 0.8
270 V2j70S 1.08 0.99 0.95 0.78 1.0
270 V2(70T 0.94 0.96 1.07 1.01 0.8
271 Q2Í71A 1.18 0.94 1.12 1.04 1.1
271 Q2f71C 0.99 1.02 0.98 1.08 1.2
271 Q271D 1.00 1.03 0.84 1.00 1.1
271 Q271 E 1.01 0.93 1.16 0.95 1.2
271 Q271F 1.09 1.04 0.80 1.05 1.0
271 Q271G 0.92 0.97 0.86 1.06 0.7
271 Q271 H 0.92 1 .01 0.85 1.09 1 .0
271 Q271 I 1.07 1.04 0.88 0.96 1.0
271 Q¾71K 1.03 0.60 0.57 1.09 0.5
271 Q¿71L 1.16 0.90 0.94 1.01 1.0
271 Q271M 1.15 0.89 1.19 1.11 1.0
271 Q271N 0.99 0.91 0.91 1.09 0.9
271 Q2Í71 P 1.03 0.75 1.12 1.06 1.1
271 Q271R 1.23 0.63 1.09 1.05 0.2
271 Q271 S 0.97 0.85 1.02 0.98 1.0
271 Q271T 0.88 0.97 0.91 1.1 1 0.8
271 Q271V 0.92 1.06 0.84 1.1 1 0.9
271 Q271W 1.00 0.90 0.94 1.14 0.9
271 Q271Y 0.96 0.94 0.95 0.98 0.9
272 A272E 1.08 0.82 1.09 0.96 1.1
272 A272F 0.88 1.02 1.08 0.99 0.9
272 A272G 1.07 0.79 1.23 1.03 . 0.8
272 A272H ? .12 0.90 1.19 1 .00 0.9
EJEMPLO 7
luación comparativa de Datos de Proteasa Va
En este ejemplo, se comparan los result rimentos realizados para determinar el de limpieza, estabilidad LAS, actividad enido de proteína (pruebas de propieda rés) BP 1 , GG36 (GCI-P036) pr ant es . Como se describe en toda la ional i dad de las proteasas vari ant tif ica como un índice de desempeño (PI) , relación de desempeño de una variante easa de referencia. Las clasificaciones PI a presente incluyen: Mutaciones superiore ; Mutaciones neutrales (PI > 0.5); Mutaci udiciales (PI > 0.05) ; y Mutaciones perjud
< 0.05) .
-Os. oo ~o SO ? so O SC so OS SO so SO SO so # BPN' Variante
-J 4^ l—i oo Os
os oo I—· os SO oc 1— k VO 0\ ^ ^ o o O ^ 1—» > BPN'TCA
-f^ O -Pi> l os ^
to O o o 1—» oo > Os BPN' BMI pH7/1
O Os oo 4^ Os ^
^ OS ^ so o Os Os l • O BPN'BMI pH8/1
-o ^ ^ Líi
oo -J OS Os Os os N) Os BPN'BMI pH8/3
oo oo t— >
O 4^
oo O OS o *—* O I— * O Os BPN* LAS
^ 1—» -O 1—* ^
? OS SO Os OS O o es o BPN' AAPF
r » z > > o «í < C GG36 Residuo T
o oo so os OS O Os # GG36 Variante
1—· oo 4^ C\ Os \ 1— ' 4^
SO so SO -J os O O oo SO KJ Os O GG36 BMI pH8/
<-l -P» \ OS ^ OS í -O
> oo OS >— * O >
c )—* O O os ) '¦>-> GG36 Huevo
i f-/i
> t O so 4. c •j\ O so SO o O O O Os GG36 LAS/EDT
1— '
SO so SO o os 4^ Os oo >
4^. 4^. h— « o V SO
oo o ^ GG36 AAPF o SD oo o o o
[Tabla 7-2 (continuación)
I
Tabla 7-2 (continuación)
S 19 | 5 58 74 53 16 32 E 17 71 76 12 71
L 14 ! 0 79 71 71 7 14 L 16 56 31 13 3
Y 19 | 5 26 74 63 58 5 Y 15 93 67 47 4
A 15 7 53 53 60 7 0 A 17 94 35 12 1
V 15 1 0 40 40 40 20 7 V 16 38 19 56 1
K 16 , 0 25 44 19 13 0 K 18 67 11 0 0
V 18 ! 6 17 6 11 17 11 V 18 56 11 22 11
L 171 0 71 29 53 12 0 L 16 13 25 31 1
G 17 | 35 94 53 94 59 6 G 18 50 50 67 61
A 19! 42 0 63 63 32 47 A 15 60 53 60 9
D 18! 11 83 0 61 50 0 S 14 50 36 50 71
G 19 16 79 68 79 21 0 G 16 19 25 56 1
S 16! 56 100 19 50 75 56 S 17 47 76 88 7
G 14| 7 29 14 14 14 0 G 16 50 19 19 0
Q 16 50 63 38 19 69 19 S 16 50 50 56 5
Y 17 0 47 59 65 47 6 V 15 40 47 60 5
S 19| 0 47 42 32 53 11 s 19 53 26 37 6 w 19| 0 74 63 74 26 0 s 14 64 57 71 71
I 15 0 40 33 27 13 7 I 18 11 61 6 11
I 19| 5 37 42 32 5 0 A 16 19 38 0 1
N 19| 11 32 11 68 58 42 Q 18 50 78 39 7
G 16! 0 19 25 19 0 0 G 17 6 6 0 6
T 19 5 37 21 42 11 0 L 16 44 25 6 0
E 19! 0 42 21 53 63 0 E 17 76 29 24 1
W 19! 0 5 42 21 26 0 W 13 0 0 46 0
A 18! 0 33 33 33 1 1 17 A 1 1 18 18 9 9
I 19! 0 79 42 79 26 16 G 17 53 76 18 9
A 19! 53 47 42 47 26 74 N 14 86 43 29 10
N 19! 5 53 47 68 58 47 N 11 64 73 73 7
N 19! 32 26 42 32 58 68 G 17 76 88 76 4
M 1 0 50 56 28 33 17 M 13 46 23 69 2
I Tabla 7-2 (continuación)
K 19 5 68 42 26 21 26 E 17 12 47 0 41
A 19 21 47 16 16 53 89 0 13 62 69 38 77
? 19 ¡ 0 63 53 74 0 32 A 14 43 29 14 0
V 19! 5 16 16 32 11 11 V 15 73 27 0 13
D 19 5 5 11 0 0 21 N 17 82 53 6 76
K 19 21 21 89 79 74 79 S 13 54 54 46 69
? 19¡ 0 42 32 32 5 26 A 19 58 37 0 21
V 19 16 1 1 47 37 26 47 T 15 73 33 7 80
A 19 53 68 16 26 42 58 S 18 50 39 33 78
S 19| 47 16 84 74 53 74 R 17 82 65 53 41
G 19| 5 32 74 47 21 58 G 17 88 29 6 12
V 16! 6 88 94 50 56 38 V 12 42 8 8 33
V 17! 0 47 65 65 18 6 L 18 56 39 0 56
V 16! 0 44 69 63 88 19 V 17 71 18 24 24
V 18 0 17 44 50 28 11 V 14 64 29 0 29
A 17! 0 18 35 35 6 0 A 13 15 8 0 8
A 15¡ 40 7 7 13 0 0 A 13 8 8 0 0
A 1 ; 0 26 26 21 0 0 S 13 23 0 0 15
N 17| 35 0 0 0 0 0 N 14 0 0 0 0
E 16 44 0 0 6 13 56 S 18 33 11 0 11
T 1 ; 16 74 16 16 16 11 A 14 29 21 36 86
S 19! 37 74 63 63 32 21 - - - - - - G 19! 11 11 53 11 5 5 - - - - - - S 1 ; 53 58 74 32 37 47 - - - - - - S 9 32 63 11 16 37 37 - - - - - -s 10 5 21 5 5 0 0 G 17 35 29 18 47
T 17 0 12 29 29 0 0 S 15 27 27 53 87
V 15 0 7 13 33 7 0 I 17 6 12 6 6
G 16 63 0 6 6 69 0 s 16 38 38 19 6
Y 1 5 58 84 74 0 0 Y 19 32 0 0 11
18 11 100 83 50 11 11 R 14 93 21 29 21
1 Tabla 7-2 (continuación)
P 19| 0 58 16 47 84 53 P 17 71 82 65 10
N 19 42 68 11 47 79 42 s 14 71 93 14 9
W 19! 0 68 21 79 63 58 w 19 42 63 63 9
T 19! 32 16 74 32 89 21 s 15 33 33 47 10
N 19! 1 1 11 63 37 21 16 N 18 39 50 39 9
T 19! 47 16 74 53 68 37 V 16 56 75 63 9
Q 19! 16 11 79 26 84 32 Q 13 62 77 46 10
V 17i 6 18 35 18 18 12 1 17 76 24 29 3
R 19! 0 53 74 42 0 0 R 19 53 68 21 8
S 19! 47 37 79 42 32 58 N 16 69 56 31 9
S 19! 42 5 68 37 5 42 H 18 17 28 39 9
L 19, 0 26 32 26 0 16 L 17 65 12 0 2
E 1 ! 0 37 11 63 0 0 K 14 64 50 50 8
N 19" 21 58 37 74 53 42 N 16 38 81 63 8
T 19 16 53 58 68 11 16 T 14 36 29 7 9
T 19 16 53 47 63 11 5 A 18 39 22 0 2
T .19, 26 58 53 37 0 42 T 17 18 29 35 9
K 19 1 1 89 95 58 0 68 S 17 47 82 35 10
L 19 0 47 53 32 0 16 L 15 < 87 40 0 4
G 1 0 47 82 94 0 0 G 17 82 59 0 8
D 19 21 5 0 1 1 0 89 S 12 83 100 8 10
S 19 26 63 63 37 0 47 T 14 64 86 21 10
F 1 ? 0 32 1 1 5 0 N 16 56 88 63 10
Y 19 1 1 26 26 37 0 0 L 17 71 71 35 9
Y 19 5 37 32 26 0 5 Y 15 93 33 0 1
G 19 0 5 5 16 0 0 G 14 79 7 0 7
K 19 21 84 84 58 47 11 S 18 83 83 6 7
L 18 0 61 83 89 11 56 L 17 76 41 0 4
I 19 0 26 37 37 0 5 V 15 53 13 0 5
N 19 5 32 26 63 11 5 N 13 85 85 8 10
V 18 17 1 1 50 33 17 6 A 17 88 71 0 6
403
Tabla 7-3 Sitios Restrictivos para BPN* y GG36
En resumen como se determina durante el desarrol f
nte invención, 10 posiciones en la región madur
ilisinas de referencia son posiciones restricti
I
idad y estabilidad. De esta manera las 265 po
ntes jen la región madura de dos subtilis
, y BPN'-Y217L. La transformación se realizó
I
e en la técnica (Ver por ejemplo, O 02/14490) .
i
I I I I I I
I
Producción de Proteasa
I
producir GG36 (también referidos en la prese
I
)
lisina IB. lentus) en B. subtilis. El plásmido de
G36ci se reunió usando el gen mejorado de codón GG3 i
octavo; codón de la secuencia de señal aprE bajo e
promot r aprE de consenso y el terminador de tran
i
En la' secuencia proporcionada abajo, negrita y
a el promotor aprE de consenso, fuente estándar i i
ncia de1 señal, fuente subrayada indica la secuen
e negrita indica ADN que codifica la proteasa madur
e subrayada cursiva indica el exterminador BPN' .
odificación de la proteasa madura GG36 está flanq
La secu i encia de aminoácido de la proteína de p
se proporciona abajo. En esta secuencia, negrit
oteasa GG36 madura:
I KKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDE LLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQA SGVKVA\^LDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAAL SAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLE LVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAP STYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQÍRNHLKNTATSLGST AATR (SE¡Q ID NO:561).
j
La secuencia de aminoácido de la proteasa GG3
ID NO: 562) se usó como la base para ha otecas ¡de variante descritas en la presente:
i
!
VPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGE HVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAG GSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGAT YGAGLDi APGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPS NTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID N0 562).
Los elementos de pAC-GG36ci plásmido incluyen:
mento de ADN de plásmido pUBUO (Mc enzie et al., 3-103 ¡
[1986]) , pBR322 = fragmento de ADN de
o GG36ci = GG36 maduro (reemplazado por las reg icación para cada variante expresada en este e nador BPN' = terminador transcripcional de
I
I
lisinal
Proteasa BPN1 -Y217L (PURAFECT®
jemplo, se describen los expe izados para producir BPN' de subtilisina liquefa' ciens (comercialmente disponible como P subtilisina; también conocidas como "FNA") ilis. El plásmido de expresión pAC-FNAre se reuni en BPN'-Y217L, fusionado en el octavo codó ncia de señal aprE bajo el control del promotor nso y BPN1 terminador de transcripción. En la s rciona!da abajo, negrita y cursiva indica el
I
407
catctcamaaaatgggtctactmaatattattccatctattataataa
atccagcgcgcaggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatg gacgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagctagcgctacattaaacgaaaaa aaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcac tagcacacgcgtacgc^cagtccgtgccatatggcgtatcac ctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatccagatc agccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctggtaccgttgc cggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaataca atcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccggttctgctgctttaaaa ccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggcta tgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagctcgatgtca tccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagc taagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttcta atcaatgtacaggcggcagctcagtaaflflcfcgqgfltaflqflflgccgg (SEQ I
La secuencia de aminoácido de la proteína de p
Y217L se proporciona abajo. En esta secuencia,
I
a la proteasa BPN' -Y217L madura:
KLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKK QF YVlí)AASATLNEKAV ELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQI TGSNVKVÁVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGT VAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIE GIEWALANNMDVINMSLGGPSGS SGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGP QSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTT GLINVQAAAQ (SEQ ID NO:564).
La secuencia de aminoácido de la proteasa BP
entó de ADN de plásmido pC1 4 (Horinouchi et
riol 150: 815-825
[1982]) . Las característ
I
I
ido son como sigue: Orí para B . subtilis = o
I
i
I
icación j a partir de pUBUO, CAT = gen de resis
I
nfenicól de pC194, origen pMBl = origen de repli
I
ir de £BR322, bla = beta- lactamasa de pBR322,
I
corto = promotor de transcripción de consenso,
eñal - p I éptido de señal, Péptido Pro = región p
I
, Péptido Maduro BPN'-Y217L = ???·-?217?,
plazado por las regiones de codificación pa
I
nte expresada en este estudio) , terminador
inador de transcripción de BPN' de subtilisina.
EJEMPLO 9
I Expresión de Variantes de Enzima
Este ETjemplo describe los métodos usados para
lar 2000 µ? medios definidos + 25 yg/ml cloran
mi tubos de cultivo plástico. El medio de cultiv i
I
semi -definido enriquecido basado en
I
iguadora MOPS, con urea como fuente de n
tante, glucosa como la fuente de carbono prin
ementado con soytone al 1% para crecimiento
to. Los tubos de cultivo se incubaron a 37°C, i
I
te 60 horas. Después de esta incubación, los c i
ivo se centrifugaron en mayor que 8000 x RCF . La
obre„aaLe se d.c,„tS e„ Cubo3 caicos de polip
5 mi p ra almacenamiento. No se realizó concent
i
ficaciórii adicional. Las reservas de sobrenad
laron a 40% de concentración final de propile
estabilidad a largo plazo y almacenaron a 4°C.
I
EJEMPLO 10
6, 331, 11/581,102, y 11/583,334) . Este conjunto
1
roteínas de sonda se analiza luego en una p
es .
Las vaciantes de escala de carga de proteasa ej
uestran en las siguientes tablas y analizaron
I
ibe en ¡ la presente. En estas tablas, el cambio
I
i
lativo ia la enzima tipo natural.
Tabla 10-1 Variantes de Escala de Carga BPN'-Y217L
¡Variante BPN -Y217L (numeración BPN') Cambi -N109D-S188D-S248D -4
I
-N109D-S18;8D -3 -N109D ! -2
I D I -1 '-Y217L) ¡ 0
I
R +1 -N109R ! +2 -N109R-S188R +3 -N109R-S188R-S248R +4
otecas de Carga Combinatorias de Enzima
I
t
ación de Bibliotecas de Carga Combinatorias
I
lisina (=GG36)
I
El plásmido pAC-GG36ci que contiene gen GG36 mej
se envió a ADN 2.0, para la generación de bibli
combinatorias (CCL) . También se proporcionan con
!
lus subtilis (genotipo: AaprE, AnprE,
: :xylRPxylÁcomK-phleo) para transformaciones. Además
!
petición a DNA2.0 Inc. para la generación de bi
ionalesi
1 en cada uno de los cuatro sitios en prot I
i
e muestran en la Tabla 10-3. Las variantes se sumi
soluciones de reserva de glicerol en placas de 96 p
El GG36 CCL se diseñó al identificar cuatro res
ácido polar sin carga, expuestos a la superfic
ibuidosj fuera del sitio activo. Estos residuos so
07, Ser-182, y Asn-242 (residuos 87, 109, 188,
I
i .
s formaciones . Se hizo una petición a DNA 2
la generación de bibliotecas posiciona
uno dje los cuatro sitios de proteasa BPN
se muestran en la Tabla 10-4. Las varía
nistraron como soluciones de reserva
lacas de 96 pozos.
I
i
La bi lioteca de carga combinatoria BPN' - Y
ilisiná se diseñó al identificar cuatro r
aminoácido polar sin carga, expuestos
I
rficie', bien distribuidos fuera del sitio
S residuos son Ser-87, Asn-109, Ser-188,
I '
Una b Iiblioteca combinatoria de 81 miembr
a F-811) se creó haciendo todas las combin
I
tres posibilidades en cada sitio: tipo n
nina, b ácido aspártico.
raf ías ! de mercado (por ejemplo,
í
renciación, T, y/o dureza de agua) , en
I
I
cacionés de lavandería y lavaplatos auton
se describe en el Ejemplo 1.
I
anteriores mantienen
las subtilisinas BPN'- I
. Por ¡ejemplo, la FIG. 2A y 2B muestra un
ma para BPN'-Y217L y GG36 respec t ivamen
mpeño ! de limpieza bajo las condició
I
I
ndería! de América del Norte usando detergent
nactivado por calor, disponible para ven
i
t
Y de i la izquierda muestran desempeño de 1
IÍ cromu'est ra , donde un número mayor indica r
epa BMjl superior. Los ejes Y de la derecha n
índice! de desempeño definido como desem
!
ieza de variantes (símbolos llenados) relati
I
ación de la carga óptima es una funci
ente de solución determinado por formula
I I
I
rgente; pH, temperatura y fuerza iónica d
za de! I agua y conc 'entración de detergent
I
pio la carga óptima para BPN'-Y217L CCL
áticamente desde cero bajo condición
ndería de América del Norte hasta carg
tivas j bajo condiciones de Europa Occ
iciones Japonesas. Por otra parte la carga
I
i
observa para formulaciones de deterge
1
dería; tanto líquidas como en gránulo (
!
!
larmente, una carga óptima se observó par
I
I
-Y217L¡ como GG36 CCL en detergente de lava
máticoi (ADW) contra (por ejemplo, Reckitt Be
I
onit 4¡0°C, 12 gpg, pH 10) huevo en cocinado
rato d ie enzima.
i i
ieza de variantes GG36 y BPN'-Y217L contr
uevo en cocinado bajo detergente ADW Europ
I
ica del Norte cuando se lleva a cabo en pH
I
i
uctividad de 3.0 mS/cm. En particular, de
impiez! Ia de variantes de carga se proporció
elacionado pH y conductividad son el mismo
i
i
azgos ' hacen posible separar por ex
I
mpeño ¡de enzima usando un detergente deter t
I
extrapolación de estos resultados
rgentel de pH y conductividad p
I
larmenite es posible separa por ex
I
i
mpeño |de enzima en una solución amortigua
y conductividad parejos, para extrapolac i
S resultados a un detergente que exhibe
i
ajo y ¡conductividad similar.
¡
i
1
1
1 C Ntargaea
G-53 0 0.568 0.909
G-54 2 0.345 0.766
G-55 1 0.689 1.036 1
G-56 0 0.675 1.134
G-57 2 0.452 0.766
G-58 i 0 1.024 1.216 1
G-59 -1 1 1.131 1.306 1
G-60 1 0.699 0.946 1
G-61 2 0.457 0.886
G-62 1 0.759 1.059 1
G-63 3 0.327 0.669
G-64 0 0.847 1.119 Pl G? 1
G-65 -1 0.601 0.879 íd Laneraav 1
G-66 1 1.001 1.261 1
G-67 -1 1.196 1.411 1
G-68 -2 1.131 1.179 1
G-69 0 0.768 0.999 1
G-70 1 0.647 1.809
G-71 0 0.620 1.081
G-72 2 0.364 0.819
G-73 2 0.387 0.729
G-74 1 0.638 0.939 1
G-75 3 0.657 0.856 1
G-76 1 0.071 0.136 - G-77 0 0.866 0.969
G-78 2 0.434 0.789
G-79 3 0.327 0.789
G-80 2 0.355 0.781
G-81 4 0.229 0.466
F-58 ; 0 1.036 1.107 1.183
F-59 ! -l 1.117 Pl 1.077 0.898
d Leríaavan
F-60 1 i 0.928 NA 1.449 1.976
F-61 2 0.942 1.687 1.542
F-62 ; 1 1.017 1.494 1.651
F-63 ! 3 0.630 1.613 1.522
F-64 0 1.131 1.241 0.912
Pl
F-65 -1 0.994 0.958 íd Laneraav 1.136
F-66 ; i 1.216 1.464 O E 2.308
F-67 ! -i 1.126 0.854 0.485
F-68 .9 0.748 0.705 0.261
F-69 i o 1.249 1.479 1.041
F-70 ! 1 1.050 1.911 1.631
F-71 1 o 1.136 1.687 1.298 Pl íd Leraavan
F-72 : ' 2 0.871 2.893 1.949 JPN
F-73 i 2 0.998 1.717 1.990
F-74 : i 1.102 1.509 2.281
F-75 3 0.672 1.687 2.044
F-76 1 0.946 1.449 1.807
F-77 ! o 1.050 1.509 1.793
F-78 i 2 0.975 1.256 2.207
F-79 : 3 0.606 1.285 1.508
F-80 I 2 0.795 2.655 1.800
F-81 ! 4 0.611 1.419 1.759
I
EJEMPLO 12
rzo nó afectan los ensayos suc-AAPF-pNA o
on. ,
I
I
ilidad LAS/EDTA
j
Los reactivos usados incluyen: solución amortigu
ol: 50; mM HEPES, 0.005% Tween-80, pH 8.0; y i
iguadora de esfuerzo 50 mM HEPES, 0.1% (p
I
cilbenceno-sulfonato, sal de sodio, Sigma D-2525
/ pH 8.jo. Las variantes de enzima (20 ppm) se d
en placa de fondo plano sin enlace de 96 p
iene ya sea solución amortiguadora de contro
rzo yj mezclada. La placa de control se i
ratura' ambiente mientras que la placa de esf
ó inme ¡diatamente a 37°C durante 30-60 min (dep
a estabilidad de la enzima que se probó) . Despu
ación, I la actividad de enzima se midió usand
o y construyó de acuerdo a los métodos descrit i
ío 2, p Iara abarcar diversas cargas netas relati i
ula BPN'-Y217L precursora. Como se demuestra i
a, la acumulación de cargas negativas (superior
relativa a BPN'-Y217L precursor, son benéfic
ilidad LAS/quelante combinada. Este es un ej
izar una propiedad física de proteína, en este
neta,! para mejorar la estabilidad de proteín
nte de | lavandería líquido complejo.
i
EJEMPLO 13
t
I
empeño 'de Remoción de Mancha de Variantes de Bibl i
I de Mutación Múltiple BPN' (MML)
Las bib ! liotecas de mutación múltiple BPN! (o bib
I
inatorias) se produjeron por Geneart o AJDN 2.0, t
ribió previamente en la presente, usando BPN'
ivó por calor detergente Frío TIDE® 2X (Pr
I
le) . La; inactivación por calor de fórmulas de de
eíales ¡ sirve para destruir la actividad en
ena de cualquiera de los componentes de
I
ras que retención de las propiedades de compon
áticosL La inactivación por calor de los deterg
izó al colocar cantidades pre-pesadas de de
ido (enj una botella de vidrio) en un baño de agu
I
l
te 2 horas. El detergente se adquirió de ti
mercado locales. Ambos detergentes no calen
I
tados 'se ensayaron dentro de 5 minutos de dis
rgente,; con objeto de determinar con preci
I
entaje Jdesactivado . La actividad de enzima se p
o AAPF;. La funcionalidad de variantes BPN' se cu
un ínclice de desempeño (Pi) (esto es, la reí
I
peño de una variante relativa a BPN' precurs
I
' 427
Valores Pj de Variantes BPN' probad sión (TCA) y Desempeño de Remoción de Mancha '
I
i 428 i
la 13-1 (continuación)
I
BMI BMI BMI
digo de Variante TCA pH 8/16°C pH 7/16°C pH 8/32°C A-G97A 2.12 1.33 ND ND
A-I11 1V ; 2.06 1.31 ND ND
A-L126A ¡ 1.66 0.58 ND ND
A-L96T 0.68 0.86 ND ND
A-M124V : 1.25 0.96 ND ND *
A-N123G ¦ 0.92 0.69 ND ND
A-S89Y ! 1.65 1.37 ND ND
A-V227T [ 1 1.35 ND ND
A-W106F i 0.7 1.29 ND ND
8A-Y104N : 0.71 0.78 ND ND
8 A- Y 167 A 0.87 1.19 ND ND
8A-Y217Q ! 2.34 1.32 ND ND
06F ; 0.78 1.17 ND ND
06F-G 128A 0.68 0.86 ND ND
06F-I11 1V ! 0.61 1.06 ND ND
06F-L126A 0.67 0.82 ND ND
06F-M124V 0.56 0.96 ND ND
06F-N123G 0.47 0.29 ND ND
06F-V227T 0.45 0.76 ND ND
06F-Y167A 0.75 0.66 ND ND
06F-Y217Q 0.87 1.35 ND ND
ND ND
la 13-1 (continuación)
l
I
EJEMPLO 14
empeño de Remoción de mancha de Variantes de Dos
BPN1
Usando, BPN' como la proteína precursora, variante
I
s se generaron en las posiciones 217 y 222 (n ) usando PCR de fusión. Las proteínas de variante jeron I como se describió antes. La concentra ína de sobrenadante de cultivo se determ pitación TCA como se describe en el Ejempl peño de remoción de mancha de las variantes se aciones de lavandería en E PA 116 muestras (man
EJEMPLO 15
Producción de Proteasa ASP en B. subtilis
I
Los experimentos realizados para producir proteasa 69B4
I
i
idos en; la presente como "ASP," "Asp," y "proteasa
i
easa Asp") en B. subtilis se describen en Sol. de Pat.
I
e Serie 10/576,331, incorporado en la presente como ref
I
I
talidad. Brevemente, la secuencia de ADN (secuencia d
I
I
tico) proporcionada abajo, con codón de uso adaptado par
I
Ius, codifica la proteína precursora ASP tipo natural:
TGACACCACGAACTGTCACAAGAGCTCTGGCTGTGGCAACAGCAGCTGCTACACTC TGGGGGTATGGCAGCACAAGCTAACGAACCGGCTCCTCCAGGATCTGCA CAGCCC CGAT' AGClGAAAAAC lXjACCCTGAC^AC rGAAGCAA GGAACGCGA rCTGGG ATGCAGAGGAAGCAGCTGCAACGTTAGCTTTTCAGCATGACGCAGCTGAAACGGGA
En la secuencia de arriba, fuente en negritas i
I
que codifica la proteasa madura, fuente estánda
cuencia líder, y lo subrayado indica las pro-se
i
minal y C-terminal. La enzima de proteasa d
a derivada de cepa 69B4 de Cellulomonas (DSM 98
89 aminoácidos largos, con una triada catalít
ste de1 His32, Asp56, y Serl37, como se muest
la tríada catalítica indicada en negrita y subra
I DVIGGNAYTIGGRSRCSIG FAVNGGFITA GHCGRTGATT ANPTGTFAGS FPGNDYAF¡V RTGAGVNLLA QVNNYSGGRV QVAGHTAAPV GSAVCRSGST GWHCGTITA LNSSVTYPEG TVRGLIRTTV CAEPGDSGGS LLAGNQAQGV SGGSGNCRTGGTTFFQPVN PILQAYGLRM ITTDSGSSP (SEQ ID NO:567)
EJEMPLO 16
Producción de Mutantes Combinatorios ASP y Múlti
¡
Bibliotecas de Mutación
En este ejemplo, se describen los métodos usa
ruir mutantes combinatorios y múltiples biblio
lado (alrededor de 70 ng) se mezcló con 15yL ilada ¡estéril, 1. µ1^ de dNTP, 2.5µ?, de tiguadora lOx, lyL de la mezcla de enzima y 1.0 µ cebador, mutante (durante un total de 100 dores) . : La mezcla de cebador se preparó usando uno dé los dieciocho cebadores mutantes (100 p gando 50ng de cada cebador para la biblioteca mienda por Stratagene, resulta en pocas mutacione a previa de mutagénesis. De esta manera, el prot ficó en la ronda actual de mutagénesis para in l de 100 pmol de cebadores en cada reacci iciones de la formación en ciclos fueron 95°C d seguido por 30 ciclos de 95 °C durante 1 m nte 1 min, y 65 °C durante 12 min, en un termofor o MJ Research PTC2-200 usando tubos PCR de 0. d delgacla. El producto de reacción se digirió co
I
436
cilina resultando en la biblioteca de
iple ASP en células E.coli. Las colonias (dec
s) se cosecharon y el kit de ADN de minipre
iro Qiagen (Catálogo No. 27106) se usó para
ADN plásmido por las etapas resumidas
icante.; El ADN de minipreparacion se eluyó c
olución amortiguadora Qiagen EB proporcionad
i
I
El ADN de minipreparacion se digirió usa
tnas de I restricción de ADN PstI y HindIII . L
fragmento de biblioteca ASP (PstI x Hind
ficó en gel y clonó en el fragmento de vector
tl de 4154 pares base por una reacción de
do Ligása de T4 ADN Invitrogen® (Catálogo No.
como se recomienda por el fabricante para
sivos de clonación) . En otro enfoque, los fr
logo No . 25-6400) . Para este propósito, 1 p
1a de reacción de ligación se mezcló con
ción amortiguadora de muestra del kit Temp
ntó durante 3 minutos a 95°C para desnatural
La reacción se colocó en hielo para e
nte 2 minutos y luego se giró brevemente.
de solución amortiguadora de reacción y 0
merasa !phi29 del kit TempliPhi se agregaron
I
I
ciones ¡se incubaron a 30°C en una máquina MJ
i
durante 4 horas. La enzima phi29 se inact i
r en las reacciones por incubación a 65°C du
en la máquina PCR.
Para transformación de las bibliotecas en fí
pL del producto de reacción de ampli
liPhi se mezcló con 500 ]i ¡ de células B .
etentes (AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, d
cursor)' (ASP con R014I -A064K-T086K-T116E-R1 dedor de 3% de clones tienen mutaciones ext es procesados por secuencia restantes (72%) s mutantes y de estos alrededor de 94% tes únicos. Los resultados procesados por s
I
la biblioteca se proporcionan a continuació a 16-1:
íabla 16-1. Variantes de ASP con R014I-A064K-T086K-T116E.R123F
I
i
Tabla 16-1. (continuación)Variantes de ASP con
ro pequeño de posiciones (5-10%) tienen mu i
son imalas para todas las propiedades.
ciones I definen pliegue de proteína y se cons
ución. La implicación de esto es que au
tificación de mutaciones benéficas para c
iedad requiere una separación por e
aderamente predictiva para tal propied
tificación de mutaciones es probable pa
udicial para cualquier propiedad puede re
do cualquier separación por exclusión, in
no limitado a los métodos proporcionados
enté .
Las en izimas variantes se produjeron como se
a presente y dentro de la Solicitud de Pat
A. Nos, de Serie. 10/576,331, 10/581,014, 11/
I
/583,334, todas de las cuales se incorpor
?
atina ¡(KER) , actividad AAPF {AAPF) , estabili
I
I
) y estabilidad térmica para ASP; y forma
cido (PAF) y degradación de perácido (PAD) par
o de Hidrólisis de Queratina
En esté sistema de ensayo, las soluciones quími
tivo usadas fueron:
I
atina ' ICN 902111
rgente 1.6 g. de detergente se disolvió en 10
agua (pH = 8.2)
0.6 mi. de CaC12/MgC12 de 10, 000 gpg
I
, se agregó, así como 1190 mg de HEPE
!
I una dureza y resistencia de f
amortiguadora de 6 gpg y 5 mM respecti
El pH se ajustó hasta 8.2 con NaOH .
; Ácido picrilsulfónico (TNBS)
o : i
I
Previo| a las incubaciones, la queratina se ta
i
amiz de 100 µp? en porciones pequeñas a la vez.
de la queratina < 100 µt? se agitó en solu
¡
i
rgente i durante al menos 20 minutos a tem
ente cón ajuste regular del pH hasta 8.2. Fin i
suspensiión se centrifugó durante 20 min
eratura ambiente (Sorvall, GSA rotor, 13,00
I
procedimiento luego se repitió. Finalme
mentó ¡húmedo se suspendió en detergente h
men to/tal de 200 mi, y la suspensión se
ando ?µG3??ß el pipeteado. Antes de la inc
MTP se ; rellenaron con 200 µ? de sustrato por
I
pipeta ! de canal múltiple Biohit y 1200 µ? de
I
nist raciones 200 µ? y administradas tan rápi
posible para evitar la sedimentación de quera
tivo A.|
I
Los MTP se rellenaron con 60 µ? de reactivo, pozo. De las placas incubadas, 10 µ? se trans
MTP con reactivo A TNBS . Las placas se cubrie a y agitaron durante 20 minutos en un agit o (BMG Thermostar) a temperatura ambiente y 5 ímente, 200 µ? de reactivo B se agregó a los
I
lado durante 1 minuto en un agitador, rbancia a 405 nm se midió con el lector MTP.
I
I
ulo de la Actividad de Hidrolización de Querat
El valor de absorbancia obtenido se corrigió r blanco (sustrato sin enzima) . La abs ltante; proporciona una medición para la a olítica. Para cada muestra (variante) el ín mpeño ;se calculó. El índice de desempeño co
r que 1 (PI<1) identifica una variante que se
que el estándar. De esta manera, el PI id
ganadores, así como variantes que son menos d
uso bajo ciertas circunstancias.
En esté sistema de ensayo, las soluciones quími
tivo usadas fueron:
I
(
tilcaseína (DMC) : Sigma C-9801
®-80: Sigma P-8074
ión amortiguadora PIPES (ácido libre): Sigma P-1851
; se disolvió en alrededor de 96
agua; pH se ajusta: hasta 7.0
! 4N, 1 mi de TWEEN®-80 al 5% se
el volumen se lleva hasta 1000
concentración final de PIPES y ?
o:
Para preparar el sustrato, 4 g de DMC se dis
400 mi de solución amortiguadora PIPE enadant:es de cultivo filtrados se diluye ción amortiguadora PIPES; la concentración f controles en la placa de crecimiento fue o, 10 il de cada sobrenadante diluido se agre µ? de sustrato en los pozos de un MTP . La pl ubrió con cinta, agitó durante unos pocos se có en un horno a 37°C durante 2 horas sin agit Alrededor de 15 minutos antes de la elimina rimera ; placa del horno, el reactivo TNBS se ezclar 1 mi de solución TNBS por 50 mi de rea MTP se; rellenaron con 60 µ? de reactivo A T . Las placas incubadas se agitaron durante un ndos, después de lo cual 10 µ? se transf irier
r en blanco (sustato sin enzima) . La abso
itante es una medición para la ac
olítica . La actividad específica (arbitra
muestr,a se calculó al dividir la absorbanc
entración de proteína determinada.
yo de ;Termoes tabilidad
Este 'ensayo es con base en la hidróli
tilcas'eína (DMC) , antes y despué
ntamiento del sobrenadante de cultivo
ción amortiguadora. Las mismas sol
I
icas y de reactivo se usaron como se desc
nsayo ¡de hidrólisis DMC.
do :
Los sobrenadantes de cultivo filtra
yeron i hasta 20 ppm en solución amorti
a, agitó durante unos pocos segundos y co orno a 37°C durante 2 horas sin agitaci o método de detección como se usa para el idrólisis DMC se empleó.
ulo de Termoes tabi lidad :
La actividad residual de una muestra se la ¡relación de la absorbancia final rbancik inicial, ambas corregidas para blan Como ise indica en las siguientes Tabla as propiedades que se encontraron elacionarse (coeficientes de correlación on CAS , KER y AAPF para ASP. Todas de la se correlacionaron (coeficiente de corr ) . A pesar del hecho de que las propiedade elacionaron, la probabilidad que una m
Tabla 17-1 Resultados de Comparación CAS y KER para ASP
I
Tabla 17-2 Resultados de Comparación CAS y AAPF para ASP
Tabla 17-3 Resultados de Comparación CAS y LAS para ASP
Observado Esperado
Valor CAS LAS CAS LAS Observado/
<=5% I 892 1450 31% 51%
>5% ' 1959 1401 69% 49%
Tabla 17-4 Resultados de Comparación CAS y Estabilidad térmica par
Tabla 17-5 Resultados de Comparación CAS y Estabilidad térmica par
Tabla 17-6 Resultados de Comparación PAF y PED para ASP
Observado' Esperado'
Valor PAF PAD PA pad Observad
<=5% 541 751 19% 26%
>5% ; 2536 2326 89% 82%
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si indicaciones : 1. Una variante de subtilisina aislada ilisina Bacillus , caracterizada porque es un ra que ¡tiene actividad proteolítica y que compr itución÷ en una o más posiciones seleccionadas d , '5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 11, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 21, 28, 29, 30, 31, 37, 39, 40, 41, 42', 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 76, 77,; 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 1 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 1 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 2 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 2 271, 272, 273 y 274, en donde las po sponden a la secuencia de aminoácido de lisina B. amyloliquefaciens establecida como 2. La variante de subtilisina aislada de conform reivindicación 1, caracterizada porque una iones se selecciona de: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15,; 16, IV, 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65, 66, 67, 71, 72, 73, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 87, 88, ¡89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 112, 1 116, 118, 119, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 1 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 2 273 y 274, en donde las posiciones correspond ncía 'de aminoácido de BPN' de subtilis liquefaciens establecida como SEQ ID NO: 2. 3. La1 variante subtilisina de conformidad ndicación 1, caracterizada porque una o más po eleccionan de 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, :19, 20, 21, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 54, 55, , 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 71, 79, 81, , 82, 83, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 92, 96, 102, 105, 106, 110, 111, 112, 113, 114,-1 124, 125, 128, 129, 131, 133, 134, 135, 136, 1 143, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 1 158, 159, 160, 162, 165, 166, 167, 169, 170, 1 175, 176, 177, 178, .179, 180, 181, 182, 183, 1 I I 4. La variante subtilisina de conformidad ndicación 1, caracterizada porque la lisina ; además comprende una sustitución en un iones seleccionadas del grupo que consiste de: I 117, 119, 127, 144,. 185, 209 y 213, en do iones corresponden a la secuencia de aminoácido I ubtilisina B. amyloliquefaciens establecida com I 5. La' variante subtilisina de conformidad indicación 1, caracterizada porque la sus ende uno o más de : A001C, A001D, A001E , A001F , A001I, A001K, A001L, A001M, A001N, A001Q, , A001V, A001W, Q002A, Q002D, Q002E, Q002G, , S003D, S003F, S003G, S003I, S003K, S003L, , S003P, S003Q, S003R, S003T, S003V, S003W, C, P005E, P005G, P005N, P005Q, P005T, Y006A, I , P014D P014E, P014F, P014G, P014I, P014K, , P014N P014Q, P014R, P014S, P014T, P014V, A015C A015D, A015E, A015F, A015G, A015H, , A015L A015M, A015P, A015Q, A015R, A015T, # L016A L016C, L016I, L016M, L016Q, L016S, , H017I H017L, H017M, H017V, H017W, H017Y, S018F S018G, S018H, S018I, S018K, S018L, S018P S018Q, S018R, S018T, S018V, S018W, Q019C Q019D, Q019E, Q019G, Q019I, Q019K, , Q019T Q019V, G020A, G020C, G020D, G020E, , G020K G020M, G020N, G020P, G020Q, G020R, , Y021A Y021C, Y021D, Y021E, Y021F# Y021G, Y0.21M Y021R, Y021S, Y021T, Y021V, Y021W, , T022E T022F, T022G, T022H, T022I, T022K, T022N T022Q, T022S, T022V, T022W, T022Y, F, S024G S024H, S024I, S024K , S024L, S024M, S037K S037L S037M, S037P, S037Q, S037R, H039C H039Q H039T, H039V, P040A, P040C, P040G P040G P040H, P040I, P040K, P040L, P040Q P040R P040S, P040T, P040V, P040W, L042M L042V K043A, K043C, K043D, K043E, K043I K043L K043M, K043N, K043R, K043S, I K043W K043Y V044A, V044C, V044I, V044L, V044S V044T A045C, A045E, A045F, A045H, A045L A045M A045N, A045P, A045Q, A045S, A045Y G046A G046C, G046E, G046H, G046K, G046Q G046T G046W, G046Y, A048C, A048D, A048H A048I A048K, A048L, A048M, A048Q, A048T A048V A048W, A048Y, M050A, 050C, M050I M050K M050L, M050Q, M050R, 050S, 050W M050Y V051A, V051C, V051D, V051E, V051L V051P V051Q, P052C, P052D, P052E, , Q059G, Q059H, Q059K, Q059L, Q059M, Q059N, , Q059S, Q059T, Q059V, Q059W, Q059Y, D060E7 , H064D, H064F , H064I, H064L, H064M, H064Q, . H064T, H064V, H064Y, T066S, T066W, T066Y, , H067F, H067I, H067L, H067M, H067N, H067P, , H067T, T071I, T071Y, N077S, S078A, S078C, , S078G, S078I, S078K, S078L, S078 , S078N, # S078R, S078T, S078V, S078W, S078Y, I079A, , I079F, I079G, I079H, I079K, I079L, I079N, , I079S, I079T, I079V, I079W, I079Y, V081F, , V081M, V081T, G083F, G083P, Q084A, Q084C, , Q084N, Q084T, A085C, A085F, A085G, A085R, , P086D, P086E, P086G, P086 , P086N, P086Q, , P086T, P086W, P086Y, S089C, S089D, S089E, , S089H, S089K, S089L, S089V, S089W, S089Y, , L090E, L090G, L090H, L090M, L090Q, L090T, S101V, S101Y, G102A, G102C G102E G102F, G102S G102V G102Y Q103A Q103C Q103E, Q103I Q103K Q103L Q103M Q103N Q103R, Q103V Q103W S105A S105C S105D S105E, S105I S105K S105L S105M S105N S105P, S105W W106A W106C W106E W106F W106G, W106L W106M W106N W106R W106S W106T, N109A N109C N109E N109F N109G N109H, N109P N109Q N109R N109S N109T N109V, I111C I111F I111L I111M I111N I111P, I111W E112A E112C E112D E112F E112G, E112M E112N E112Q E112R E112S E112T, E112Y W113D W113E W113F W113N W113P, W113V W113Y I115E I115H I115N I115R, I115W I115Y A116C A116D A116E A116F, A116I A116K A116L A116M A116N A116P, , G127Q G127S G127T, G127V, G127W, G127Y, , G128F G128H G128L G128N G128P, G128S, G128W G128Y P129A P129C P129D, P129E, , P129I P129K P129L P129M P129N, P129Q, , P129V P129Y G131A G131C G131E, G131F, G131M G131N G131P G131Q G131R, G131S, , G131W G131Y A133C A133D A133E, A133F, I, A133K A133L A133M A133P A133R, A133S, , " A133W A133Y A134D A134E A134F, A134G, , A134L A134M A134P A134Q A134R, A134S, , A134W L135D L135E L135M L135R, L135W, , K136H K136L K136M K136N K136R, K136S, , K136 K136Y A137C A137E A137F, A137H, L , A137M A137N A137P A137Q A137R, A137S, , A137W A137Y V139C V139I V139L, V139N, T, K141A K141C K141D K141E K141F, K141G, E156N, E156Q, E156R, E156S E156T E156V, T158A T158D T158E T158G T158H T158I, T158M T158N T158Q T158S T158V T158Y, S159D S159E S159G S159H S159I S159K, S159R S159T G160D G160E G160K G160N, G160S G160T S162A S162C S162E S162H, S162M S162N S162Q S162R S162T S162V, Y167A Y167F Y167H Y167I P168D P168G, P168S P168Y G169A G169E G169F G169H, G169N G169R G169T G169V G169Y K170A, K170G K170H K170R 170V K170W K170Y, Y171P P172A P172C P172E P172K P172L, P172Q P172R P172S P172T P172V P172Y, S173E S173I S173T S173V V174C V174F, V174T I175G I175L I175M I175R I175T, A176E A176F A176K A176M A176S A176Y, Q185W, R186I R186L R186W, A187C, A187D, A187G A187P A187S A187 A187Y S188A, S188E S188F S188G S188H S188I S188K, S188P S188Q S188T S188V S188W S188Y, S190I S190K S191A S191G S191N S191Pf V192T V192Y G193F G193H G193I G193N, G193T P194C P194E P194H P194I P194K, P194Q P194T P194V P194W L196A M199P, A200G A200K A200Y G202D G202E G202F, G202V G202Y Q206A Q206C Q206D Q206E, Q206H Q206I Q206L Q206 Q206N Q206P, Q206T Q206V Q206W Q206Y S207D S207E, S207T S207V P210A P210C P210S P210T, N212E N212F N212G N212H N212K N212L, N212Q N212R N212S N212V K213 K213C, K213F K213H, K213I , K213L, K213M, K213Nr , G219V G219W T220D T220E T220F, T220G, I , T220S T220Y A223E A223F A223L, A223M, A223V A223 A223Y S224A S224C, S224F, I S224M S224N S224Q S224R S224T, P225A, P225G P225H P225I P225K P225L, P225M, ?225? P225V P225Y A228P A228R, A228S, , G229A G229H G229I G229S A230C, A230E, Q, A230 ?R A230S A230T A230V A231C, A231I, R, ?234? I234C I234L I234M I234N, I234P, S, I234T I234V L235A L235C L235G, L235I, , L235N L235Q L235R L235S L235T, L235V, , S236A S236C S236D S236E S236G, S236H, S236T S236V S236Y K237A K237E, K237F, K237I K237L K237M K237N K237Q, K237R, T, K237V K237W K237Y H238C H238D, H238E, ?, H23ÓR H238S P239C P239D P239E, P239F, 462 , T244Y, Q245A, Q245C, Q245D, Q245E, Q245H, , Q245L, Q245M, Q245R, Q245T, Q245V, Q245Y, , S248E, S248F, S248G, S248H, S248I, S248L, , S248Q, S248R, S248T, S248V, S248W, S248Y, , S249H, S249I, S249K, S249L, S249M, S249N, , S249T, S249V, S249W, S249Y, L250D, L250F, L250 , L250T, L250V, E251A, E251T, E251W, c, N252E, N252G, N252H, N252I, N252L, N252M, , N252S, N252T, N252V, N252Y, T253A, T253C, , T253H, T253K, T253M, T253S, T253V, T254A, T254M, T254R, T254S, T254V, T255A, T255C, T255F, T255G, T255H, T255I, T255K, T255L, , T255S, T255V, K256A, .K256G-,- K256D, K256E, K256I, K256L, K256M, K256N, K256P, K256Q, S, K256T, K256V, K256W, K256Y, L257A, L257C, , L257H, L257I, L257K, L257M, L257N, L257R, , L26 C L267E, L267G, L267H, L267I, L267M, , L267S, L267T, L267V, I268A, I268C, I268K, , I268P, I268R, I268V, N269D, N269E, N269K, , N269Q, N269S, Q271A, Q271C, Q271D, Q271E, , Q271H, Q271I, Q271 , Q271L, Q271M, Q271N, , Q271S, Q271T, Q271V, Q271W, Q271Y, A272E, , A272H, A272K, A272L, A272M, A272N, A272Q, A272T, A272V, A272W, A272Y, A274C, A274D, A274H, A274I, A274K, A274L, A274Q, . A274S, , en donde las posiciones corresponden a la secu ácido de BPN' de subtilisina B. amyloliqu lecida :como SEQ ID NO : 2. 6. La variante subtilisina de conformidad indicación 1, caracterizada porque la sus rende una combinación de sustituciones seleccion H-Y217E,. Y021H-Y217Q, S101E-Y217L, Y021H-Y217L, , K213N-Y217Q, M119H-K213N, S101P-K213N, M119 -Y217Q,' M119F-K213L, Y217Q, M119F-Y217Q, A048 -K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, ?026 -K213N,, A048H-K213N, A048H-K213L, K213L, K213N, , ?213?, A048E-K213L, A048D-K213N, K213I, A048 -K213N, Y021H-Y217L, Y021H-Y217Q, A045V-Y217L, , Y021H-Y217E, A045I-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021H-Y las i posiciones corresponden a la secue ácido ;de BPN' de subtilisina B. amyloliqu lecida como SEQ ID NO: 2. 8. La variante subtilisina de conformidad ndicación 1, caracterizada porque la sus rende una combinación seleccionada de: S101 , M119Ñ-K213N, S101E-Y217L, A045I-Y217Q, en d ciones corresponden a la secuencia de aminoácido ubtilisina B. amyloliquefacíens establecida com indicación 10. 12. Una composición de limpieza caracterizad ende la variante subtilisina de conformidad indicación 1. 13. La composición de limpieza de conformidad ndicación anterior, caracterizada porque rgente de lavandería. 14. La' composición de limpieza de conformidad ndicación anterior, caracterizada porque el de avandería es un detergente de agua fría, un deter pH, o un detergente compacto. 15. Métodos para producir una variante subtil subtilisina Bacillus, caracterizados porque co etapas : a) transformar un célula hospedera con un v esión que comprende un ácido nucleico que cod terizado porque la célula hospedera es una lus. 18. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la especie Bacillus es B. subtil 19. Un método de limpieza, caracterizado ende la etapa de poner en contacto una superfici ulo que comprende una tela con una composi I eza que comprende una variante de subtilisina ai rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 20. Un método para fabricar por ingeniería p terizado porque comprende: a) proporcionar una pluralidad de bibliot ación del sitio (SELs) cada una comprende una pl ariantes de proteasa que tiene sustituciones dist osición de aminoácido idéntica de la proteasa; b) probar las variantes de proteasa de los SE ultiplicado cada una comprende sustituciones en posiciones no restrictivas. 21. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la prueba comprende dos o más entes seleccionados del grupo que consiste de en ión de mancha (micromuestra) , estabilida ilidad EDTA, ensayos de estabilidad de deter I OS de actividad específica. 22. El' método de conformidad con cualesquiera ndicaciones 20 y 21, caracterizado porque la pro subtilisina bacteriana. 23. Un .método para producir una variante de sub ituida por multiplicado de una subtilisina ' B Cterizado porque comprende: a) probar una pluralidad de variantes de sub ituidas individualmente en una primera prueba ntes de subtilisina sustituidas individualmente ia con una primera propiedad favorable y que no s na segunda propiedad indebidamente desfavorable; c) identificar una sustitución en al menos un antes de subtilisina sustituidas individualment ia con una segunda propiedad favorable y que no s na primera propiedad indebidamente desfavorable ; d) introducir la sustitución de las etapas pr subtilisina para producir una variante de sub ituida por multiplicado. 24. El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque comprende probar la ilisina sustituida por multiplicado en la primer a segunda prueba, en donde una variante sub rada alcanza un valor de mayor que 1.0 en era como la segunda pruebas, o un valor de mayor terizado porque una primera o segunda p abie tiene un valor mayor que alrededor de 1.2. 28. El método de conformidad con la reivindica terizado porque una primera o segunda p idamente desfavorable tiene un valor de me edor de 0.40. 29. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la primera propiedad es estábi gunda propiedad es desempeño de lavado. 30. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la estabilidad comprende estábi gente y el desempeño de lavado comprende dese o de tinta, leche y sangre (BMI por sus si s) en detergente. 31. El método de conformidad con la reivindica terizado porque el desempeño de lavado se prueb rsora que tiene una superficie accesible de mayor que alrededor de 50%. 34. El método de conformidad con la reivindica terizado porque una o más posiciones en una sub rsora son posiciones que tienen una superficie a lvente (SAS) mayor que alrededor de 65%.
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