KR20110015006A - 변이체 미생물 프로테아제를 포함하는 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변이체 서브틸리신 및 본원에서 설명하는 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라 이러한 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 세탁 세정 적용물에 적합한 변이체 서브틸리신을 제공한다.

Description

변이체 미생물 프로테아제를 포함하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING VARIANT MICROBIAL PROTEASES}

본 발명은 변이체 서브틸리신 (subtilisin) 및 본원에서 설명하는 바와 같은 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라 이러한 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 세탁 세정 적용물에 적합한 변이체 프로테아제를 제공한다.

세린 프로테아제는 광범위한 특이성 및 생물학적 기능을 갖는 효소의 다양한 부류를 포함하는 카르보닐 히드롤라아제의 소집단이다. 주로 세정 및 사료 적용물에서의 이의 유용성으로 인해, 서브틸리신에 대해 많은 연구가 수행되었다. 다양한 적용물에서의 이러한 효소의 기능성에 불리하게 영향을 줄 수 있는 해로운 환경 조건 (예를 들어 산화제, 킬레이트제, 극심한 온도 및/또는 pH 에 대한 노출) 에 대해 추가적인 작업이 집중되고 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 역조건에 저항하고 당업계에 현재 알려져 있는 것을 넘어서는 향상된 활성을 유지하거나 가질 수 있는 효소 시스템에 대한 필요성이 당업계에 남아있다.

발명의 요약

본 발명은 변이체 서브틸리신 및 본원에서 설명하는 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라 이러한 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 세탁 세정 적용물에 적합한 변이체 프로테아제를 제공한다.

본 발명은, SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기의 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체를 제공한다:

본 발명은 또한, SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체를 제공한다:

본 발명은 SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체를 추가로 제공한다:

본 발명은 또한, 치환 G97A/G128A/Y217Q 를 포함하며 상기 치환 세트 중 하나 이상을 추가로 포함하고, 그 위치가 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는 서브틸리신 변이체를 제공한다.

본 발명은 SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체를 추가로 제공한다:

본 발명은 또한, 치환 G97A/G128A/Y217Q 을 포함하며 상기 치환 세트 중 하나 이상을 추가로 포함하고, 그 위치가 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는 서브틸리신 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, 본원에서 설명하는 서브틸리신 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 뿐 아니라 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 본원에서 제공되는 서브틸리신 변이체 중 하나 이상을 포함하는 세정 조성물을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 세탁 세제이다. 일부 추가적인 구현예에서, 세탁 세제는 중질 (heavy duty) 액체 세탁 세제이다. 일부 추가적인 구현예에서, 세정 조성물은 식기 세제이다. 일부 보다 추가적인 구현예에서, 세정 조성물은 경질 표면 세정 조성물이다. 일부 추가적인 구현예에서, 세정 조성물은 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제 및 아밀라아제, 또는 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함한다. 일부 추가적인 구현예에서, 세정 조성물은 본원에서 제공되는 하나 이상의 서브틸리신 변이체의 0.0001 중량% 이상, 및 임의로는 적합한 보조 요소를 포함한다.

본 발명은 또한, 섬유를 포함하는 물품 및/또는 표면을 본원에서 제공되는 세정 조성물과 접촉시키는 단계; 및 임의로 물품 또는 표면을 세척 및/또는 헹구는 단계를 포함하는 세정 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에서 제공되는 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 동물 사료를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 본원에서 제공된 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 식품 가공 조성물을 제공한다.

발명의 설명

본 발명은 변이체 서브틸리신, 및 본원에서 설명하는 하나 이상의 변이체 서브틸리신을 포함하는 조성물 뿐 아니라 이러한 변이체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 세탁 세정 적용물에 적합한 변이체 프로테아제를 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 세정 조성물 뿐 아니라 사료 조성물, 직물 가공, 가죽 마감, 곡물 가공, 육류 가공, 식품 가공, 단백질 가수분해물의 제조, 소화 보조제, 살미생물 조성물, 제균 조성물, 진균억제 조성물 및 개인 케어 제품 (예를 들어 구강 케어, 모발 케어 및/또는 피부 케어) 을 포함하는, 폴리펩티드의 분해 또는 합성이 필요한 다양한 상업적 적용을 갖는 변이체 서브틸리신을 생성하기 위한 수단을 제공한다.

본 발명은 현재 사용되는 서브틸리신 프로테아제와 비교하여 필적할만하거나 향상된 세척 성능을 갖는 효소 조성물을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 세탁 세제이다. 일부 구현예에서, 세탁 세제는 냉수용 세제, 저-pH 세제 또는 고밀도 세제이다. 추가적인 구현예에서, 본 발명은 섬유를 포함하는 물품 및/또는 표면을 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세정 방법을 제공한다.

세정 조성물

본 발명의 세정 조성물은 예를 들어 세탁 적용물에서 유리하게 사용된다. 실제로, 저온 용액에서 증가된 효율성의 고유한 이점으로 인해, 본 발명의 효소는 세탁 적용물에 이상적으로 적합하다. 또한, 본 발명의 효소는 과립 및 액체 조성물 모두에서 사용될 수 있다.

본 발명의 변이체 프로테아제는 또한 세탁 세정 부가제 제품에서 사용된다. 일부 구현예에서, 저온 용액 세정 적용물이 사용된다. 부가제 제품은, 가장 단순한 형태로, 하나 이상의 프로테아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 부가제는 세정 과정에 추가하기 위한 투약 형태로 포장된다. 임의 적합한 단일 투약 형태가 또한 본 발명으로 사용되는데, 이는 알약, 정제, 젤리캡슐 (gelcap), 또는 사전측정된 분말 또는 액체와 같은 다른 단일 투약 단위를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물의 부피가 증가되도록 충전재(들) 또는 담체 물질(들) 이 포함된다. 적합한 충전재 또는 담체 물질에는 술페이트, 카르보네이트 및 실리케이트의 다양한 염 뿐 아니라 탈크, 점토 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 액체 조성물에 적합한 충전재 또는 담체 물질에는 물 또는 저분자량 1 차 및 2 차 알코올 (폴리올 및 디올 포함) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 알코올의 예에는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 5% 내지 약 90% 의 상기 물질을 함유한다. 산성 충전재가 pH 를 감소시키는데 사용된다. 대안적으로, 세정 부가제는 하기에 보다 충분히 기재되는 바와 같은 보조 요소를 포함한다.

본 세정 조성물 및 세정 부가제는 단독 또는 다른 프로테아제 및/또는 추가적 효소와 함께, 본원에 제공된 프로테아제 변이체 중 하나 이상의 유효량을 필요로 한다. 효소의 필요 수준은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제의 첨가에 의해 달성된다. 전형적으로 본 세정 조성물은 약 0.0001 중량% 이상, 약 0.0001 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 심지어 약 0.01 중량% 내지 약 0.1 중량% 의, 본 발명의 변이체 프로테아제 중 하나 이상을 포함한다.

본원의 세정 조성물은 전형적으로, 수성 세정 공정에서 사용하는 동안 세척수가 pH 약 5.0 내지 약 11.5, 또는 심지어 약 7.5 내지 약 10.5 를 갖도록 제형화된다. 액체 생성물 제형은 전형적으로, 순수 pH 약 3.0 내지 약 9.0, 또는 심지어 약 3 내지 약 5 를 갖도록 제형화된다. 과립 세탁 생성물은 전형적으로 pH 약 9 내지 약 11 을 갖도록 제형화된다. 권고되는 이용 수준에서 pH 를 조절하는 기술은 완충액, 알칼리, 산 등의 사용을 포함하며, 당업자에게 널리 알려져 있다.

적합한 저-pH 세정 조성물은 전형적으로 약 3 내지 약 5 의 순수 pH 를 가지며, 전형적으로 이러한 pH 환경에서 가수분해하는 계면활성제를 갖지 않는다. 상기 계면활성제는 하나 이상의 에틸렌 산화물 부분 또는 심지어 약 1 내지 약 16 mol 의 에틸렌 산화물을 포함하는 나트륨 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한다. 이러한 세정 조성물은 전형적으로, 순수 pH 약 3 내지 약 5 의 세정 조성물이 제공되도록 수산화나트륨, 모노에탄올아민 또는 염산과 같은 충분량의 pH 개질제를 포함한다. 이러한 조성물은 전형적으로 하나 이상의 산 안정 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체인 한편, 다른 구현예에는 고체이다. 상기 액체 조성물의 pH 는 전형적으로 순수 pH 로서 측정된다. 상기 고체 조성물의 pH 는 용매가 증류수인 상기 조성물의 10% 고체 용액으로서 측정된다. 이러한 구현예에서, 모든 pH 측정은 20℃ 에서 수행된다.

일부 구현예에서, 변이체 프로테아제(들) 가 과립 조성물 또는 액체로 사용되며, 변이체 프로테아제가, 보관하는 동안 과립 조성물의 다른 성분으로부터 상기 변이체 프로테아제가 보호되도록 캡슐화된 입자의 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 추가로, 캡슐화는 또한 세정 방법 동안 변이체 프로테아제의 이용성을 제어하기 위한 수단이다. 일부 구현예에서, 캡슐화는 변이체 프로테아제(들) 및/또는 추가적 효소의 성능을 증강시킨다. 이와 관련하여, 본 발명의 변이체 프로테아제는 당업계에 알려져 있는 임의 적합한 캡슐화 물질로 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로 본 발명의 변이체 프로테아제(들) 에 대한 촉매의 일부 이상을 캡슐화한다. 전형적으로, 캡슐화 물질은 수용성 및/또는 수분산성이다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 0℃ 이상의 유리 전이 온도 (Tg) 를 갖는다. 유리 전이 온도는 WO 97/11151 에서 보다 상세히 기재되어 있다. 캡슐화 물질은 탄수화물, 천연 또는 합성 고무, 키틴, 키토산, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 실리케이트, 포스페이트, 보레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀 왁스 및 이의 조합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 캡슐화 물질이 탄수화물인 경우, 이는 전형적으로 단당류, 올리고당류, 다당류 및 이의 조합물에서 선택된다. 전형적으로, 캡슐화 물질은 전분이다. 적합한 전분은 EP 0 922 499; US 4,977,252; US 5,354,559 및 US 5,935,826 에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 열가소물, 아세토니트릴, 메타크릴로니트릴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴로니트릴 및 이의 혼합물과 같은 플라스틱으로 생성되는 마이크로스피어이고; 사용되는 시판 마이크로스피어는 EXPANCEL

(Stockviksverken, Sweden), 및 PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES

, LUXSIL

, Q-CEL

및 SPHERICEL

(PQ Corp., Valley Forge, PA) 에 의해 공급되는 것들을 포함한다.

본원에서 기재한 바와 같이, 본 발명의 변이체 프로테아제가 세탁 세제에 특히 사용된다. 이러한 적용은 효소가 다양한 환경적 스트레스 하에 있게 한다. 본 발명의 변이체 프로테아제는 다양한 조건 하 이의 안정성으로 인해, 많은 현재 사용되는 효소에 대한 이점을 제공한다.

실제로, 세척에 포함되는 프로테아제가 노출되는 다양한 세제 제형, 세척수 부피, 세척수 온도 및 세척 시간 길이를 포함하는 다양한 세척 조건이 존재한다. 또한, 상이한 지리적 부위에서 사용되는 세제 조성물은 세척수에 존재하는 이의 관련 성분의 상이한 농도를 갖는다. 예를 들어, 유럽 세제는 전형적으로 세척수에 약 4500-5000 ppm 의 세제 성분을 갖는 한편, 일본 세제는 전형적으로 세척수에 대략 667 ppm 의 세제 성분을 갖는다. 북미, 특히 미국에서 세제는 세척수에 대략 975 ppm 의 세제 성분을 갖는다.

저 세제 농도 시스템에는 약 800 ppm 미만의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 일본 세제는 대략 667 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하므로, 전형적으로 저 세제 농도 시스템으로 간주된다.

중간 세제 농도 시스템에는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 북미 세제는 대략 975 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하므로 일반적으로 중간 세제 농도 시스템으로 간주된다. 브라질 세제에는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재한다.

고 세제 농도 시스템에는 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세척수에 존재하는 세제가 포함된다. 유럽 세제는 대략 4500-5000 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재하므로 일반적으로 고 세제 농도 시스템으로 간주된다.

남미 세제는 일반적으로 고 비누 인산염 세척강화제 (suds phosphate builder) 세제이며, 남미에서 사용되는 세제의 범위는 1500 내지 6000 ppm 범위의 세제 성분이 세척수에 존재하므로 중간 및 고 세제 농도 모두라고 볼 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 브라질 세제에는 전형적으로 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세척수에 존재한다. 그러나, 기타 남미 국가에 제한되지 않는 기타 고 비누 인산염 세척강화제 세제 지역은, 약 6000 ppm 이하의 세제 성분이 세척수에 존재하는 고 세제 농도 시스템을 가질 수 있다.

이에 비추어 보아, 세계적으로 전형적인 세척액 중의 세제 조성물의 농도가 약 800 ppm 미만의 세제 조성물 ("저 세제 농도 지역"), 예를 들어 일본에서는 약 667 ppm, 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm ("중간 세제 농도 지역"), 예를 들어 미국에서는 약 975 ppm, 그리고 브라질에서는 약 1500 ppm, 약 2000 ppm 초과 ("고 세제 농도 지역"), 예를 들어 유럽에서는 약 4500 ppm 내지 약 5000 ppm 및 고 비누 인산염 세척강화제 지역에서는 약 6000 ppm 으로 다양하다는 것이 명백하다.

전형적인 세척액의 농도는 경험적으로 측정된다. 예를 들어, 미국에서는 전형적인 세탁기는 약 64.4 L 부피의 세척액을 담는다. 따라서, 세척액 중에 약 975 ppm 의 세제 농도를 수득하기 위해서는, 약 62.79 g 의 세제 조성물을 64.4 L 의 세척액에 첨가해야만 한다. 이 양은 세제와 함께 제공되는 계량컵을 사용하여 소비자가 세척수로 측정한 전형적인 양이다.

추가적인 예로서, 상이한 지역은 상이한 세척 온도를 사용한다. 일본에서의 세척수의 온도는 전형적으로 유럽에서 사용되는 온도보다 낮다. 예를 들어, 북미 및 일본에서의 세척수의 온도는 전형적으로 10℃ 내지 30℃ (예를 들어, 약 20℃) 인 반면, 유럽에서의 세척수의 온도는 전형적으로 30℃ 내지 60℃ (예를 들어, 약 40℃) 이다.

추가적인 예로서, 상이한 지역은 전형적으로 물 경도가 상이하다. 물 경도는 일반적으로 혼합된 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} 갤론 당 그레인 (grain) 으로 기재된다. 경도는 물 중의 칼슘 (Ca^{2 +}) 및 마그네슘 (Mg^{2 +}) 의 양의 측정이다. 미국의 대부분의 물은 경질이지만, 경도 값은 다양하다. 중간 경질 (60-120 ppm) 에서 경질 (121-181 ppm) 인 물은 백만 당 60 내지 181 부 (미국 갤론 당 그레인으로 전환된 백만 당 부는 갤론 당 17.1 에 동일한 그레인으로 나누어진 ppm # 임) 의 경질 광물 (표 13-1 참조) 을 갖는다.

유럽의 물 경도는 전형적으로 혼합된 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} 갤론 당 10.5 초과 (예를 들어, 10.5-20.0) 의 그레인 (예를 들어, 혼합된 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} 갤론 당 약 15 그레인) 이다. 북미의 물 경도는 전형적으로 일본의 물 경도보다 크나, 유럽의 물 경도보다는 적다. 예를 들어, 북미의 물 경도는 3 내지 10 그레인, 3-8 그레인 또는 약 6 그레인일 수 있다. 일본의 물 경도는 전형적으로 북미의 물 경도보다 낮으며, 혼합된 Ca^{2 +}/Mg^{2 +} 갤론 당 통상적으로 4 미만, 예를 들어 3 그레인이다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 세척 조건 설정 (예를 들어 물 온도, 물 경도 및/또는 세제 농도) 에서 놀라운 세척 성능을 보여주는 변이체 프로테아제를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 세척 성능에 있어서 다른 서브틸리신 프로테아제와 필적할만하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 현재 시판되는 서브틸리신 프로테아제와 비교하여 증강된 세척 성능을 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 변이체 프로테아제는 증강된 산화 안정성, 증강된 열 안정성 및/또는 증강된 킬레이터 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 변이체 프로테아제는 세제를 포함하지 않는 세정 조성물에, 다시금 단독 또는 세척강화제 및 안정화제와 함께 사용된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 세정 조성물은 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 조성물 수준으로 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하고, 조성물의 나머지 (예를 들어, 약 99.999 중량% 내지 약 90.0 중량%) 는 세정 보조 물질을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 조성물 수준에서의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하고, 세정 조성물의 나머지 (예를 들어, 약 99.9999 중량% 내지 약 90.0 중량%, 약 99.999 중량% 내지 약 98 중량%, 약 99.995 중량% 내지 약 99.5 중량%) 는 세정 보조 물질을 포함한다.

일부 구현예에서, 바람직한 세정 조성물은 본원에 제공된 하나 이상의 변이체 프로테아제에 추가로, 세정 성능 및/또는 섬유 케어 이득을 제공하는 하나 이상의 추가적 효소 또는 효소 유도체를 포함한다. 이러한 효소에는 다른 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제 (예를 들어 락카아제) 및/또는 만난아제가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

임의의 다른 적합한 프로테아제가 본 발명의 조성물에 사용된다. 적합한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것들을 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 미생물 프로테아제가 사용된다. 일부 구현예에서, 화학적으로 또는 유전학적으로 변형된 돌연변이체가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 바람직하게는 알칼리 미생물 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제이다. 알칼리 프로테아제의 예에는 서브틸리신, 특히 바실러스 (Bacillus) (예를 들어, 서브틸리신, 렌투스, 아밀로리쿠에파시엔스, 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168) 로부터 유래된 것들이 포함된다. 추가적인 예에는 모두 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 RE 34,606 호, 5,955,340 호, 5,700,676 호, 6,312,936 호 및 6,482,628 호에 기재된 돌연변이체 프로테아제가 포함된다. 추가적인 프로테아제의 예에는 트립신 (예를 들어, 돼지 또는 소 기원의 것), 및 WO 89/06270 에 기재된 푸사리움 (Fusarium) 프로테아제가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 시판 프로테아제 효소에는 상표명 MAXATASE

, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN

, OPTIMASE

, PROPERASE

, PURAFECT

및 PURAFECT

OXP (Genencor); ALCALASE

, SAVINASE

, PRIMASE

, DURAZYM™, RELASE

및 ESPERASE

(Novozymes); 및 BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany) 가 포함된다. 다양한 프로테아제는 WO 95/23221, WO 92/21760 및 미국 특허 제 5,801,039 호, 5,340,735 호, 5,500,364 호, 5,855,625 호, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, 및 6,482,628, 및 다양한 다른 특허에 기재되어 있다.

또한, 임의의 적합한 리파아제가 본 발명에서 사용된다. 적합한 리파아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 변형된 돌연변이체가 본 발명에 포함된다. 유용한 리파아제의 예에는 휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa) 리파아제 (예를 들어, EP 258 068 및 EP 305 216 참조), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제 (예를 들어, EP 238 023 참조), 칸디다 (Candida) 리파아제, 예컨대 C. 안타르크티카 (C. antarctica) 리파아제 (예를 들어, C. 안타르크티카 리파아제 A 또는 B; 예를 들어 EP 214 761 참조), 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파아제, 예컨대 P. 알칼리제네스 (P. alcaligenes) 및 P. 슈도알칼리제네스 (P. pseudoalcaligenes) 리파아제 (예를 들어, EP 218 272 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) 리파아제 (예를 들어, EP 331 376 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) 리파아제 (예를 들어, GB 1,372,034 참조), P. 플루오레세인 (P. fluoresceins) 리파아제, 바실러스 리파아제 (예를 들어, B. 서브틸리스 (B. subtilis) 리파아제 [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus) 리파아제 [예를 들어, JP 64/744992 참조]; 및 B. 푸밀루스 (B. pumilus) 리파아제 [예를 들어, WO 91/16422 참조]) 가 포함된다.

게다가, 페니실리움 카멤베르티 (Penicillium camembertii) 리파아제 (Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991] 참조), 제오트리쿰 칸디둠 (Geotricum candidum) 리파아제 (Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989] 참조), 및 다양한 리조푸스 (Rhizopus) 리파아제, 예컨대 R. 델레마르 (R. delemar) 리파아제 (Hass et al., Gene 109:117-113 [1991] 참조), R. 니베우스 (R. niveus) 리파아제 (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) 및 R. 오리자에 (R. oryzae) 리파아제를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 클로닝된 리파아제가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

또한 슈도모나스 멘도시나 (Pseudomonas mendocina) 유래의 큐티나아제 (WO 88/09367 참조), 또는 푸사리움 솔라니피시 (Fusarium solanipisi) 유래의 큐티나아제 (WO 90/09446 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 큐티나아제와 같은 다른 유형의 지방분해 효소가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

추가적인 적합한 리파아제에는 시판 리파아제, 예컨대 M1 LIPASE™, LUMA FAST™ 및 LIPOMAX™ (Genencor); LIPOLASE

및 LIPOLASE

ULTRA (Novozymes); 및 LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co; Ltd., Japan) 가 포함된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 리파아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 추가적인 리파아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 리파아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 리파아제 수준으로 포함한다.

알칼리 용액에서 사용하기에 적합한 임의의 아밀라아제 (알파 및/또는 베타) 는 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 적합한 아밀라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 변형된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 본 발명에 사용되는 아밀라아제에는 B. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 로부터 수득된 α-아밀라아제 (예를 들어, GB 1,296,839 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용되는 시판 아밀라아제에는 DURAMYL

, TERMAMYL

, FUNGAMYL

및 BAN™ (Novozymes) 및 RAPIDASE

및 MAXAMYL

P (Genencor International) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 아밀라아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 추가적인 아밀라아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 아밀라아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 아밀라아제 수준으로 포함한다.

일부 추가적인 구현예에서, 임의의 적합한 셀룰라아제가 본 발명의 세정 조성물에 사용된다. 적합한 셀룰라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 변형된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 적합한 셀룰라아제에는 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens) 셀룰라아제 (예를 들어, 미국 특허 제 4,435,307 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특히 적합한 셀룰라아제는 색조 케어 이득을 갖는 셀룰라아제 (예를 들어, EP 0 495 257 참조) 이다. 본 발명에 사용되는 시판 셀룰라아제에는 CELLUZYME

(Novozymes) 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 셀룰라아제는 N-말단 부분이 결실된, 변이체 셀룰라아제 또는 성숙 야생형의 일부 또는 절편으로서 혼입된다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,874,276 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 셀룰라아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 추가적인 셀룰라아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 셀룰라아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 셀룰라아제 수준으로 포함한다.

세제 조성물에서 사용하기에 적합한 임의의 만난아제가 또한 본 발명에서 사용된다. 적합한 만난아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 변형된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 본 발명에서 사용되는 다양한 만난아제가 알려져 있다 (예를 들어, 모두 참고문헌으로 본원에 포함되는 미국 특허 제 6,566,114 호, 미국 특허 제 6,602,842 호 및 미국 특허 제 6,440,991 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 만난아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 추가적인 만난아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 만난아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 만난아제 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼옥시다아제는 과산화수소 또는 그의 공급원 (예를 들어, 퍼카르보네이트, 퍼보레이트 또는 퍼술페이트) 과 함께 본 발명의 조성물에서 사용된다. 일부 대안적인 구현예에서, 옥시다아제는 산소와 조합으로 사용된다. 양쪽 유형의 효소는 바람직하게는 강화제 (예를 들어, WO 94/12621 및 WO 95/01426 참조) 와 함께, "용액 표백" (즉, 세척액에서 섬유를 함께 세척할 때, 염색된 섬유에서 또 다른 섬유로 직물 염료가 물드는 것을 방지하기 위함) 에 사용된다. 적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제에는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적으로 또는 유전학적으로 변형된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 추가적인 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 수준으로, 조성물의 나머지 중량% 는 세정 보조 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 퍼옥시다아제 및/또는 옥시다아제 효소 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼하이드롤라아제를 포함하나 이에 제한되지 않는 추가적인 효소가 사용된다 (예를 들어, WO 05/056782 참조). 또한, 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 언급된 효소들, 특히 하나 이상의 추가적인 프로테아제, 아밀라아제, 리파아제, 만난아제 및/또는 하나 이상의 셀룰라아제의 혼합물이 본원에 포함된다. 실제로, 이러한 효소의 다양한 화합물이 본 발명에서 사용될 것으로 계획된다. 변이체 프로테아제(들) 및 하나 이상의 추가적 효소의 가변적 수준은 모두 독립적으로 약 10% 범위일 수 있으며, 세정 조성물의 나머지는 세정 보조 물질인 것으로 또한 계획된다. 세정 보조 물질의 특이적 선택은 세정될 표면, 품목 또는 섬유, 및 사용 동안의 세정 조건 동안 (예를 들어, 세척 세제 사용 동안) 조성물의 원하는 형태를 고려하여 쉽게 이루어진다.

적합한 세정 보조 물질의 예에는 계면활성제, 세척강화제, 표백제, 표백 활성화제, 표백 촉매, 기타 효소, 효소 안정화 시스템, 킬레이트물질 (chelant), 형광 증백제, 오염 방출 중합체, 염료 전이제, 분산제, 비누 (suds) 억제제, 염료, 향수, 착색제, 충전재 염, 히드로트롭 (hydrotrope), 광활성화제, 형광물질, 섬유 컨디셔너, 가수분해가능 계면활성제, 방부제, 항산화제, 항수축제, 항구김제, 살균제, 살진균제, 색조 얼룩, 실버케어 (silvercare), 항변색제 및/또는 항부식제, 알칼리성 공급원, 가용화제, 담체, 가공 보조제, 안료 및 pH 조절제 (예를 들어, 모두 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 6,610,642 호, 6,605,458 호, 5,705,464 호, 5,710,115 호, 5,698,504 호, 5,695,679 호, 5,686,014 호 및 5,646,101 호 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특이적 세정 조성물 물질의 구현예는 하기에 상세히 예시된다. 세정 보조 물질이 세정 조성물 중에서 본 발명의 변이체 프로테아제와 비상용성인 구현예에서는, 세정 보조 물질과 프로테아제(들) 를 상기 두 성분의 조합이 적절할 때까지 분리된 채로 유지하는 (즉, 서로 접촉되지 않음) 적합한 방법이 사용된다. 이러한 분리 방법에는 당업계에 알려져 있는 임의의 적합한 방법이 포함된다 (예를 들어, 젤리캡슐, 캡슐화, 정제, 물리적 분리 등).

예를 들어, 본 발명의 변이체 프로테아제가 사용되는 여러 세정 조성물이 하기에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 세정 조성물이 세탁기 세척법(들) 에서 사용하기에 적합한 조성물로서 제형화되는 구현예에서는, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 계면활성제 및 하나 이상의 세척강화제 화합물 뿐 아니라, 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 표백제, 추가적 효소, 비누 억제제, 분산제, 석회-비누 (soap) 분산제, 오물 현탁 및 항-재침전제 및 부식 저해제로부터 선택되는 하나 이상의 세정 보조 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 세탁 조성물은 또한 연화제 (즉, 추가적인 세정 보조 물질로서) 를 함유한다. 또한 본 발명의 조성물은 고체 또는 액체 형태의 세제 부가제 생성물을 사용한다. 이러한 부가제 생성물은 통상의 세제 조성물의 성능을 보충 및/또는 강화시키는 것으로 의도되고, 세정 과정의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 세탁 세제 조성물의 밀도는 약 400 내지 약 1200 g/리터의 범위이고, 다른 구현예에서, 밀도는 20℃ 에서 측정된 조성물의 약 500 내지 약 950 g/리터 범위이다.

일부 구현예에서, 다양한 세정 조성물, 예컨대 미국 특허 제 6,605,458 호에 제시된 조성물이 본 발명의 변이체 프로테아제와 사용된다. 그러므로 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 압축 과립 섬유 세정 조성물이고, 다른 구현예에서, 상기 조성물은 색조 섬유의 세탁에 유용한 과립 섬유 세정 조성물이며, 추가의 구현예에서, 상기 조성물은 세척 용량을 통해 연화시키는 과립 섬유 세정 조성물이고, 추가적인 구현예에서, 상기 조성물은 중질 액체 섬유 세정 조성물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 제 6,610,642 호 및 6,376,450 호에 기재된 것과 같은 섬유 세정 조성물이다. 추가적으로, 본 발명의 변이체 프로테아제는 유럽 또는 일본 세척 조건 하에서 특정 유용성의 과립 세탁 세제 조성물 (예를 들어, 미국 특허 제 6,610,642 호 참조) 에 사용된다.

본 발명의 세정 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택되는 임의의 방법으로 제조되며, 이의 비제한적인 예는 모두 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,879,584 호, 5,691,297 호, 5,574,005 호, 5,569,645 호, 5,565,422 호, 5,516,448 호 5,489,392 호 및 5,486,303 호에 기재되어있다. 낮은 pH 의 세정 조성물이 필요한 경우, 이러한 조성물의 pH 는 모노에탄올아민과 같은 물질 또는 HCl 과 같은 산성 물질의 첨가를 통해 조정된다.

본 발명의 목적을 위해 필수적이지는 않지만, 이하 설명한 보조물의 비제한적인 목록은 본 세정 조성물에서 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 이러한 보조물은 예를 들어, 세정될 기질의 처리를 위해 세정 성능을 조력 또는 증강시키거나, 향수, 착색제, 염료 등의 경우에서와 같이 세정 조성물의 심미감을 변화시키기 위해 혼입된다. 이러한 보조물이 본 발명의 변이체 프로테아제에 추가된다는 것이 이해된다. 이러한 추가적인 성분의 명확한 성질, 및 이의 혼입 수준은 조성물의 물리적 형태 및 사용될 세정 공정의 성질에 의존적일 것이다. 적합한 보조 물질에는 계면활성제, 세척강화제, 킬레이트제, 염료 전이 저해제, 침착 보조제, 분산제, 추가적 효소 및 효소 안정화제, 촉매적 물질, 표백 활성화제, 표백 촉진제 (bleach booster), 과산화수소, 과산화수소 공급원, 기성 과산 (preformed peracid), 중합체성 분산제, 흙 오염 제거제/재침착 방지제, 증백제, 비누 억제제, 염료, 향수, 구조 탄성화제, 섬유 유연제, 담체, 히드로트롭, 가공 보조제 및/또는 안료가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 하기 개시에 추가적으로, 이러한 다른 보조물의 적합한 예 및 사용 수준은 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,576,282 호, 6,306,812 호 및 6,326,348 호에서 발견된다. 상술한 보조 요소는 본 발명의 세정 조성물의 나머지를 구성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세정 조성물은 계면활성제 또는 계면활성제 시스템을 포함하며, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 쌍극이온성 계면활성제, 반극성 비이온성 계면활성제 및 이의 혼합물에서 선택된다.

일부 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 하나 이상의 세제 세척강화제 또는 세척강화제 시스템을 포함한다. 세척강화제에는 알칼리 금속, 폴리포스테이트의 암모늄 및 알칸올암모늄 염, 알칼리 금속 실리케이트, 알칼리 토금속 및 알칼리 금속 카르보네이트, 알루미노실리케이트 세척강화제 폴리카르복실레이트 화합물, 에테르 히드록시폴리카르복실레이트, 말레산 무수물과 에틸렌 또는 비닐 메틸 에테르와의 공중합체, 1,3,5-트리히드록시 벤젠-2,4,6-트리술폰산, 및 카르복시메틸옥시숙신산, 다양한 알칼리 금속, 폴리아세트산의 암모늄 및 치환 암모늄 염 예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 니트릴로트리아세트산 뿐 아니라 폴리카르복실레이트 예컨대 멜리트산, 숙신산, 시트르산, 옥시디숙신산, 폴리말레산, 벤젠 1,3,5-트리카르복실산, 카르복시메틸옥시숙신산, 및 이의 가용성 염이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부 추가적인 구현예에서, 본원의 세정 조성물은 킬레이트제를 함유한다. 적합한 킬레이트제에는 구리, 철 및/또는 망간 킬레이트제 및 이의 혼합물이 포함된다.

일부 더욱 추가적인 구현예에서, 본원에 제공된 세정 조성물은 침착 보조제를 함유한다. 적합한 침착 보조제에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리카르복실레이트, 오염 방출 중합체 예컨대 폴리테레프탈산, 점토 예컨대 카올리나이트, 몬트모릴로나이트, 아타풀가이트, 일라이트, 벤토나이트, 할로이사이트 및 이의 혼합물이 포함된다.

일부 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 하나 이상의 염료 전이 저해제를 포함한다. 적합한 중합체성 염료 전이 저해제에는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-산화물 중합체, N-비닐피롤리돈 및 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부 더욱 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 분산제를 함유한다. 적합한 수용성 유기 물질에는 폴리카르복실산이 2 개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리된 2 개 이상의 카르복실 라디칼을 포함하는, 단일중합체성 또는 공중합체성 산 또는 이의 염이 포함된다.

일부 특히 바람직한 구현예에서, 세정 조성물은 세정 성능 및/또는 섬유 케어 이득을 제공하는 하나 이상의 세제 효소를 포함한다. 적합한 효소의 예에는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제 및 아밀라아제, 또는 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 전형적인 조합은 하나 이상의 프로테아제, 하나 이상의 리파아제, 하나 이상의 큐티나아제 및/또는 하나 이상의 셀룰라아제를 하나 이상의 아밀라아제와 함께 포함하는, 통상적으로 이용가능한 효소의 칵테일이다.

일부 추가적인 구현예에서, 세정 조성물에서 사용되는 효소는 임의의 적합한 기술로 안정화된다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 효소는 칼슘 및/또는 마그네슘 이온을 효소에 제공하는 완료 조성물 중 상기 칼슘 및/또는 마그네슘 이온의 수용성 공급원의 존재 하에 안정화된다.

일부 더욱 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 촉매적 금속 착물을 포함한다. 금속-함유 표백 촉매의 한 유형은 정의된 표백 촉매 활성의 전이 금속 양이온 예컨대 구리, 철, 티타늄, 루테늄, 텅스텐, 몰리브덴 또는 망간 양이온, 표백 촉매 활성이 없거나 거의 없는 보조 금속 양이온 예컨대 아연 또는 알루미늄 양이온, 및 촉매적 및 보조 금속 양이온에 대해 정의된 안정성 상수를 갖는 압류물 (sequestrate), 특히 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라 (메틸렌포스폰산) 및 이의 수용성 염을 포함하는 촉매계이다. 이러한 촉매는 미국 특허 제 4,430,243 호에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 본원의 조성물은 망간 화합물에 의해 촉매화된다. 이러한 화합물 및 사용 수준은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,576,282 호에 개시된 망간-기재 촉매를 포함한다. 또한, 본원에서 유용한 코발트 표백 촉매는 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,597,936 호 및 5,595,967 호에 기재되어 있다. 이러한 코발트 촉매는 미국 특허 제 5,597,936 호 및 5,595,967 호에서 교시된 바와 같은 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 마크로폴리시클릭 강성 리간드 (즉, "MRL") 의 전이 금속 착물을 적합하게 포함한다. 제한하고자 하는 것이 아닌, 실제적인 것으로서, 본원의 조성물 및 세정 절차는 수성 세척 매질 중 활성 MRL 종류의 일억 당 약 1 부 이상이 제공되도록 조정가능하며, 바람직하게는 세척액 중 MRL 의 약 0.005 ppm 내지 약 25 ppm, 보다 바람직하게는 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 가장 바람직하게는 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm 이 제공될 것이다. 본 전이-금속 표백 촉매에서의 바람직한 전이-금속은 망간, 철 및 크롬을 포함한다. 본원에서 바람직한 MRL 은 가교된 초-강성 리간드의 특이적 유형 예컨대 5,12-디에틸-1,5,8,12-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸이다. 적합한 전이 금속 MRL 은, 예를 들어 WO 00/332601 및 미국 특허 제 6,225,464 호에서 교시된 바와 같은 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 세정 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택된 임의의 방법에 의해 제조되며, 이의 비제한적 예는 모두 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,879,584 호, 5,691,297 호, 5,574,005 호, 5,569,645 호, 5,516,448 호, 5,489,392 호 및 5,486,303 호에 기재되어 있다.

본원에 개시된 세정 조성물은 위치 (situs) (예를 들어 표면, 접시류 또는 섬유) 를 세정하는데 사용된다. 전형적으로, 위치 중 일부 이상은 세척액 중 희석된 또는 순수 형태인 본 세정 조성물의 구현예와 접촉되며, 이후 상기 위치는 임의로 세척 및/또는 헹구어진다. 본 발명의 목적을 위해서, "세척" 에는 문질러 닦는 것, 및 기계적 교반이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 전형적으로 용액 중 약 500 ppm 내지 약 15,000 ppm 의 농도로 사용된다. 세척 용매가 물인 경우, 물 온도는 전형적으로 약 5℃ 내지 약 90℃ 의 범위이고, 위치가 섬유를 포함하는 경우, 물 대 섬유 질량비는 전형적으로 약 1:1 내지 약 30:1 이다.

정의

다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 당업계 내에 있는 분자 생물학, 단백질 공학, 미생물학 및 재조합 DNA 에서 흔히 사용되는 통상적 기술을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 알려져 있으며 수많은 문헌 및 참고문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor), [1989]; 및 Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" [1987] 참조). 본원에서 상기와 하기 모두에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 발행물은 참고문헌으로 본원에 명백하게 포함된다.

본원에서 다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계에서의 통상의 지식 중 하나에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 용어의 정의를 제공하는, 당업자에게 알려져 있으며 이용가능한 다양한 사전적 의미가 존재한다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행에서 사용되지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재된다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 본 명세서를 전체로서 참조로 하여 더욱 상세히 기재된다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 문맥에 명백히 표현되지 않는 한 단수형에는 복수형 참조가 포함된다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 다르게 나타내지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 각각 표기한다. 본 발명은, 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다.

다르게 나타내지 않는 한 본 발명의 실시는 모두 당업계 내에 있는 단백질 정제, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술 및 단백질 서열분석의 통상의 기술을 사용한다.

추가로, 본원에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서를 참조할 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 본 명세서를 참조로 하여 더욱 상세히 정의된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로테아제" 및 "단백질분해 활성" 은 펩티드 연결을 갖는 펩티드 또는 기질을 가수분해하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 말한다. 많은 잘 공지된 절차가 단백질분해 활성의 측정을 위해 존재한다 (Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, [1988]). 예를 들어, 단백질분해 활성은 통상의 기질을 가수분해하는 각각의 프로테아제 능력을 분석하는 비교 검정법에 의해 확인될 수 있다. 프로테아제 또는 단백질분해 활성의 분석에 유용한 예시적 기질에는, 디-메틸 카세인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625), 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기질을 사용하는 비색 검정법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, WO 99/34011; 및 미국 특허 제 6,376,450 호 참조, 둘다 본원에 참고문헌으로 포함됨). pNA 검정법 (예를 들어, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979] 참조) 은 또한 구배 용리 동안 수집된 분획에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용된다. 상기 검정법은 p-니트로아닐린이 가용성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (sAAPF-pNA) 를 가수분해하는 효소로서 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로부터의 황색조의 생성 속도는 분광광도계로 410 nm 에서 측정되고, 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 총 단백질 농도를 측정하기 위해 사용할 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비율은 효소 순도를 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "바실러스 (Bacillus) 속" 에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리쿠에파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 서큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus) 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 가 포함되나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 바와 같이 "바실러스 (Bacillus)" 속명 내의 모든 종이 포함된다. 바실러스 (Bacillus) 속명에 대한 지속적인 분류학적 개편이 있다는 것으로 인지된다. 그러므로, 속명에는 이제는 "제오바실러스 스테아로테르모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)" 라고 불리는 B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus) 와 같은 이러한 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 재분류된 종명이 포함되는 것으로 의도된다. 산소의 존재 하에서의 내성 내생포자의 생성은, 상기 특성이 또한 현재 명칭 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아네우리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 테르모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus) 및 비르지바실러스 (Virgibacillus) 에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 (Bacillus) 속명의 특징을 정의하는 것으로 간주된다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드) 를 말한다. 상기 용어에는 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 잡종, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 천연, 화학적으로, 생화학적으로 변형된 비-천연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자, 유전자 절편, 염색체 절편, EST, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 및 프라이머. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 다른 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티오에이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 방해된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 구성물" 및 "DNA 형질전환" 은 숙주 세포 또는 유기체에 서열을 도입하는데 사용되는 DNA 를 나타내도록 상호교환적으로 사용된다. DNA는 PCR 또는 당업자에게 공지된 임의 다른 적합한 기술(들) 에 의해 체외 생성될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, DNA 구성물은 관심 서열 (예를 들어 후임 서열 (incoming sequence)) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 추가적 요소 예컨대 제어 요소 (예를 들어 프로모터 등) 에 작동적으로 연결된다. DNA 구성물은 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상동 박스 (homology box) 의 측면에 위치한 후임 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 구현예에서, 형질전환 DNA 는 말단 (예를 들어 스터퍼 (stuffer) 서열 또는 플랭크 (flank)) 에 첨가된 다른 비-상동 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 후임 서열의 말단은 형질전환 DNA 가 폐환을 형성하도록 닫힌다. 형질전환 서열은 야생형, 돌연변이체이거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 구성물은 숙주 세포 염색체와 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 구성물은 비상동 서열을 포함한다. DNA 구성물이 체외에서 어셈블링되고나면, 이는 1) 이종 서열을 숙주 세포의 원하는 표적 서열에 삽입하고/하거나, 2) 숙주 세포 염색체의 부위를 돌연변이화 (즉, 내인성 서열을 이종 서열로 대체) 하고, 3) 표적 유전자를 결실시키고/시키거나, 4) 복제 플라스미드를 숙주에 도입하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "발현 카세트" 또는 "발현 벡터" 는 표적 세포 내 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특이적 핵산 요소로 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구성물을 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스 또는 핵산 절편에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열 중, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 숙주 세포에 혼입되고 이종 DNA 절편을 발현하는 능력을 갖는다. 많은 원핵생물 및 진행생물 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 내에 있다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구성물" 및 이의 문법적 동등물과 상호교환적으로 사용된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 내에 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 하나 이상의 세포 유형에 핵산이 도입되도록 설계된 폴리뉴클레오티드 구성물을 말한다. 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성물은 적합한 숙주 내 DNA 의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 전구서열 (예를 들어 분비 등) 에 작동적으로 연결된 프로테아제를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다 (예를 들어, 전구체 또는 성숙 프로테아제).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로서 사용된 환형 이중-나선 (ds) DNA 구성물을 말하며, 이는 일부 진핵생물 또는 원핵생물에서 염색체외 자가복제 유전적 요소를 형성하거나, 숙주 염색체에 통합된다.

세포에 핵산 서열을 도입하는 문맥 중 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "도입된" 은 세포에 핵산 서열을 이동시키기에 적합한 임의의 방법을 말한다. 이러한 도입 방법에는 원형질체 융합, 트랜스펙션, 형질전환, 접합 및 형질도입이 포함되나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어 Ferrari et al., "Genetics," in Hardwood et al., (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72, [1989] 참조).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환된" 및 "안정적으로 형질전환된"은 이의 게놈에 통합된 비-선천적 (이종) 폴리뉴클레오티드 서열을 갖거나 또는 두 세대 이상 동안 유지되는 에피솜 플라스미드를 갖는 세포를 말한다.

핵산은, 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 경우 "작동적으로 연결된다". 예를 들어, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로 발현된다면 분비 리더 (즉, 신호 펩티드) 를 코딩하는 DNA 는 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동적으로 연결되고; 서열의 전사에 영향을 미친다면 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에 작동적으로 연결되고; 또는 번역을 촉진하도록 위치된다면 리보솜 결합 위치는 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된" 은 연결된 DNA 서열이 인접하며, 분비 리더의 경우 인접하고 판독 상에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 이루어진다. 이러한 위치가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적 실행에 따라 사용한다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자" 는 폴리펩티드를 코딩하고, 코딩 부위 전 후 부위 뿐 아니라, 개별 코딩 분절 (엑손) 사이의 중단 서열 (인트론) 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 분절) 를 말한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "상동 유전자" 는 서로에게 상응하고 서로 일치하거나 매우 유사한, 상이하나 일반적으로는 관련된 종으로부터의 유전자 쌍을 말한다. 상기 용어는 종분화 (즉, 신규 종의 개발) 에 의해 분리된 유전자 (예를 들어 오르소로그 (orthologous) 유전자) 뿐 아니라 유전적 복제에 의해 분리된 유전자 (예를 들어 파라로그 (paralogous) 유전자) 를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질은 이들이 동일한 정렬에서, 동일한 위상 결합을 갖는 동일한 주요 2 차 구조를 갖는 경우 통상 "접힘" 을 갖는 것으로서 정의된다. 동일한 접힘을 갖는 상이한 단백질은 종종, 크기 및 형태가 상이한 우회 부위 (turn region) 및 2 차 구조의 주변 요소를 갖는다. 일부 경우, 이러한 상이한 주변 부위는 절반의 구조를 포함할 수 있다. 동일한 접힘 분류에 함께 놓이는 단백질은 공통적 진화 기원 (예를 들어, 단백질 선호 특정 충전 배열 (packing arrangement) 및 사슬 위상 기하학의 화학 및 물리학에서 야기되는 구조적 유사성) 을 반드시 가지지는 않는다.

본원에 사용되는 바와 같은, "상동" 은 서열 유사성 또는 동일성을 말하며, 동일성이 바람직하다. 상기 상동은 당업계에 알려져 있는 표준 기술을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; 프로그램, 예컨대 GAP, BESTFlT, FASTA 및 TFASTA {Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)}; 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).

본원에 사용되는 바와 같은, "유사 서열" 은 유전자의 기능이 야생형 서브틸리신 프로테아제에 기재한 유전자와 본질적으로 동일한 서열이다. 추가적으로는, 유사 유전자는 야생형 서브틸리신 프로테아제의 서열과 적어도 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 의 서열 동일성을 포함한다. 대안적으로는, 유사 서열은 B. 아밀로리쿠에파시엔스 서브틸리신 프로테아제 부위에서 발견되는 유전자의 약 70 내지 약 100% 의 정렬을 갖는다. 추가적인 구현예에서, 상기 특성 중 하나 초과가 서열에 적용된다. 유사 서열은 공지된 서열 정렬 방법에 의해 측정된다. 통상 사용되는 정렬 방법은 BLAST 이나, 상기 및 하기에 나타나있듯이, 서열 정렬에 또한 사용되는 다른 방법도 있다.

유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP 이다. PILEUP 은 진행성, 쌍비교 (pair-wise) 정렬을 사용하여 관련 서열의 군으로부터의 다중 서열 정렬을 생성한다. 이는 또한 정렬을 생성하는데 사용된 군집화 관계를 나타내는 트리를 작성할 수 있다. PILEUP 은 Feng 와 Doolittle 의 진행성 정렬법 (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]) 의 간소화된 방법을 사용한다. 상기 방법은 Higgins 와 Sharp 에 의해 기술된 방법과 유사하다 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). 유용한 PILEUP 매개변수는 디폴트 갭 (gap) 중량 3.00, 디폴트 갭 길이 중량 0.10, 및 칭량된 말단 갭을 포함한다.

유용한 알고리즘의 또 다른 예는 Altschul 등에 의해 기술된 BLAST 알고리즘이다 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996] 참조). WU-BLAST-2 는 대부분이 디폴트 값으로 설정되는 여러 검색 매개변수를 사용한다. 조정가능한 매개변수는 하기의 값으로 설정된다: 오버랩 범위 (overlap span) = 1, 오버랩 분획 (overlap fraction) = 0.125, 단어 역치 (word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 매개변수는 동적 값이며 관심 서열을 검색하는 것에 대한 특정 데이터베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 의존적인 프로그램 자체에 의해 확립된다. 그러나, 값은 감수성이 증가되도록 조정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성 % 값은 정렬된 부위에서의 "더 긴" 서열의 잔기 총 수로, 매칭되는 동일 잔기의 수를 나눔으로써 측정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 부위에서의 가장 실제적 잔기를 갖는 것이다 (정렬 스코어를 최대화하기 위해 WU-Blast-2 에 의해 도입된 갭은 무시함).

따라서, "핵산 서열 동일성 퍼센트 (%)" 는 출발 서열 (즉, 관심 서열) 의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열에서의 뉴클레오티드 잔기 % 로서 정의된다. 바람직한 방법은 오버랩 범위 및 오버랩 분획이 각각 1 및 0.125 인, 디폴트 매개변수로 설정된 WU-BLAST-2 의 BLASTN 모듈을 이용한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "재조합" 에는 이종 핵산 서열의 도입에 의해 변형된 세포 또는 벡터 또는 그렇게 변형된 세포로부터 유래한 세포에 대한 참조가 포함된다. 그러므로, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 선천적 (비-재조합) 형태 내에서 동일한 형태로 발견되지 않은 유전자를 발현하거나, 고의의 인간의 개입의 결과로서 하향 발현된 또는 전혀 발현되지 않은, 다르게는 비정상적으로 발현되는 선천적 유전자를 발현한다. "재조합", "재조합화" 및 "재조합된" 핵산의 생성은 일반적으로 2 개 이상의 핵산 절편의 어셈블리로, 상기 어셈블리는 키메라 유전자를 산출한다.

일부 바람직한 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 하나 이상의 코돈에서의 위치 포화 돌연변이유발로 생성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 위치 포화 돌연변이유발은 2 개 이상의 코돈에 대해 수행된다. 추가적인 구현예에서, 돌연변이체 DNA 서열은 야생형 서열과 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 98% 초과의 상동성을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 돌연변이체 DNA 는 임의의 공지된 돌연변이유발 절차 예컨대, 예를 들어, 방사, 니트로소구아니딘 등을 사용하여 생체 내에서 생성된다. 그 다음 바람직한 DNA 서열을 단리하고 본원에 제공된 방법에 사용한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은 증폭된 유전자가 게놈에 초기에 존재했던 것보다 더 높은 카피 수로 존재하게 되도록 특정 DNA 서열이 불균형하게 복제되는 과정을 말한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어 저해가능 효소의 저해제) 의 존재 하 성장에 의한 세포의 선별은 약물의 존재 하 성장에 필요한 유전자 산물을 코딩하는 내인성 유전자의 증폭, 또는 이러한 유전자 산물을 코딩하는 외인성 (즉, 투입) 서열의 증폭, 또는 둘 모두를 야기한다.

"증폭" 은 주형 특이성이 관여되는 핵산 복제의 특이적 경우이다. 이는 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이지만 특이적 주형에는 의존적이 아닌 복제) 와 대조된다. 주형 특이성은 복제의 충실도 (즉, 적당한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성) 및 뉴클레오티드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성으로 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성으로 기재된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 분류하고자 하는 관점에서의 "표적" 이다. 증폭 기술은 주로 이러한 분류를 위해 설계되었다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하 (즉, 뉴클레오티드 및 유도제 예컨대 DNA 중합효소의 존재 하, 및 적합한 온도 및 pH 에서) 에 두었을 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는, 정제된 제한 소화에서 자연적으로 발생하거나 합성적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위해 단일 가닥이지만, 대안적으로는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 연장 산물을 제조하기 위해 사용하기 전 그 가닥을 분리하기 위해 1 차 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재 하 연장 산물의 합성을 준비하기에 충분하게 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 공급원 및 방법의 사용을 포함하는 많은 인자에 의존적일 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "탐침" 은 또다른 관심 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는, 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되거나 정제된 제한 소화물에서와 같이 자연 발생되는지의 여부에 관계없는 올리고뉴클레오티드 (즉, 일련의 뉴클레오티드) 를 말한다. 탐침은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 탐침은 특정 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 탐침은 효소 (예를 들어, ELISA 뿐만 아니라, 효소-기반 면역화학적 검정법), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템으로 검출가능하도록, 임의의 "리포터 분자" 로 표지될 것이 계획된다. 본 발명이 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응과 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적" 은, 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산의 부위를 말한다. 그러므로, "표적" 은 다른 핵산 서열로부터 색출된다. "분절" 은 표적 서열 내의 핵산의 부위로서 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중합효소 연쇄 반응" ("PCR") 은 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호의 방법을 말하고, 여기에는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA 의 혼합물 중의 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키기 위한 방법이 포함된다. 표적 서열을 증폭하기 위한 상기 과정은 많은 과량의 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 도입한 후, DNA 중합효소의 존재 하에서 정확한 순서의 열 사이클을 진행하는 것으로 이루어진다. 2 개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 각 가닥에 상보적이다. 증폭을 위해, 혼합물을 변성시킨 다음 프라이머를 표적 분자 내 상보적 서열에 대해 어닐링하였다. 어닐링 후, 새로운 쌍의 상보적 가닥을 형성하도록 프라이머를 중합효소로 신장시킨다. 변성, 프라이머 어닐링 및 중합효소 확장 단계는 고농도의, 원하는 표적 서열의 증폭된 분절을 수득하기 위해 수 회 반복될 수 있다 (즉, 변성, 어닐링 및 확장이 하나의 "사이클" 을 구성하며; 다수의 "사이클" 이 있을 수 있다). 원하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대적인 위치에 의해 결정되므로, 상기 길이는 조절가능한 매개변수이다. 본 과정의 반복 양상으로 인해, 방법을 "중합효소 연쇄 반응" (이하 "PCR") 이라고 부른다. 표적 서열의 원하는 증폭된 분절이 혼합물 중의 주된 서열이 되기 때문에 (농도에 있어서), 이들을 "PCR 증폭됨" 이라고 부른다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭 시약" 은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액 등) 을 말한다. 전형적으로는, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 넣고 포함시킨다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "RT-PCR" 은 RNA 서열의 복제 및 증폭을 말한다. 이 방법에서는, 역전사가 PCR 에 커플링되어 있는데, 가장 흔히는 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,322,770 호에 기재된 바와 같은 열안정 중합효소를 이용하는 1 가지 효소 방법을 사용한다. RT-PCR 에서, RNA 주형은 상기 중합효소의 역전사효소 활성에 기인하여 cDNA 로 변환되며, 그 후, 상기 중합효소의 중합활성을 사용하여 증폭된다 (즉, 기타 PCR 방법들에서와 같음).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA 를 각각 절단하는 박테리아 효소를 말한다.

"제한 위치" 는 주어진 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인지 및 절단되는 뉴클레오티드 서열을 말하며, 흔히 DNA 절편의 삽입 위치이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 제한 위치는 선별 마커 및 상기 DNA 구축물의 5' 및 3' 말단 내로 조작된다.

"상동 재조합" 은 동일한 또는 거의 동일한 뉴클레오티드 서열의 위치에서의 2 개의 DNA 분자 또는 쌍을 이룬 염색체들 사이의 DNA 절편의 교환을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 염색체 통합은 상동 재조합이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산" 은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이들의 일부를 말한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드" 는 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 단백질" 및 "관심 폴리펩티드" 는 목적하는 및/또는 평가되는 단백질/폴리펩티드를 말한다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 세포내부에서 발현되는 반면, 다른 구현예에서, 이것은 분비된 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 효소에는 본 발명의 세린 프로테아제가 포함된다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 신호 펩티드와 융합된 분비된 폴리펩티드 (즉, 분비되는 단백질 상 아미노-말단 확장) 이다. 거의 모든 분비된 단백질은 아미노-말단 단백질 확장을 사용하며, 이는 막을 가로지르는 전구체 단백질의 위치이전에, 및 상기 단백질에 표적하는데 중요한 역할을 한다. 상기 확장은 막 이동 동안 또는 그 즉시 신호 펩티다아제에 의해 단백질분해로 제거된다.

폴리뉴클레오티드는 고유의 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우, 전사 및/또는 번역되어 RNA, 폴리펩티드 또는 그의 절편을 생산할 수 있는 경우 RNA 또는 폴리펩티드를 "코딩한다" 라고 언급된다. 이러한 핵산의 안티-센스 가닥도 또한 서열을 코딩하는 것으로 언급된다. 당업계에 공지된 바와 같이, DNA 는 RNA 중합효소에 의해 전사되어 RNA 를 생산할 수 있으나, RNA 는 역전사효소에 의해 역전사되어 DNA 를 생산할 수 있다. 그러므로 DNA 는 RNA 를 코딩할 수 있으며 역도 성립한다.

"숙주 균주" 또는 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 대한 적합한 숙주를 말한다.

효소가 상응하는 야생형 세포에서 발현되는 수준보다 높은 수준으로 세포에서 발현되는 경우 효소는 숙주 세포에서 "과발현" 된다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)] 에 따라 정의된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 개시물 전체에 걸쳐 사용된다. 또한 유전적 코드의 퇴행으로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것이 이해된다.

"전구서열" 은, 신호 서열과 성숙 프로테아제 사이에 존재하는, 프로테아제의 분비에 필요한 아미노산 서열이다. 상기 전구서열의 절단으로 성숙 활성 프로테아제가 생성된다.

용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 는 단백질의 성숙 또는 전구체 형태의 분비에 참여할 수 있는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산의 임의 서열을 말한다. 신호 서열에 대한 이 정의는 기능상의 것으로서, 단백질 분비의 유효화에 참여하는, 상기 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 코딩되는 모든 이러한 아미노산 서열들을 포함하는 것으로 의도된다. 이들은, 보편적인 것은 아니나 종종, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합한다. 상기 신호 서열은 내인성일 수도 있고 외인성일 수도 있다. 상기 신호 서열은 상기 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것일 수 있고, 또는 또 다른 분비 단백질을 코딩하는 유전자로부터일 수도 있다. 한 가지 예시적인 외인성 신호 서열은 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) (ATCC 21536) 로부터의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합되는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 서브틸리신으로부터의 신호 서열의 최초 7 개의 아미노산 잔기를 포함한다.

용어 "잡종 신호 서열" 은, 서열 일부가 발현될 유전자의 신호 서열에 융합되는 발현 숙주로부터 수득되는 신호 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 합성 서열이 이용된다.

단백질 또는 펩티드의 "성숙" 형태라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 말한다. 예를 들어, 본 발명의 BPN' 서브틸리신 프로테아제의 성숙 형태에는 하기에서 나타내는 바와 같은 SEQ ID NO:1 의 잔기 위치 1-275 와 동일한 아미노산 서열이 적어도 포함된다:

단백질 또는 펩티드의 "전구체" 형태라는 용어는, 상기 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 작동가능하게 연결된 전구서열을 가진 단백질의 성숙한 형태를 말한다. 전구체는 또한 상기 전구서열의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 상기 전구체는 또한 번역후 활성에 관련된 부가적인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙한 형태를 남기는 폴리뉴클레오티드) 를 가질 수 있다.

"자연 발생적 효소" 는 자연에서 발견된 서열과 동일한 변형되지 않은 아미노산 서열을 갖는 효소를 말한다. 자연 발생적 효소에는 특정 미생물에서 자연적으로 발현되거나 발견된 효소인 고유의 효소가 포함된다.

용어 "~ 로부터 유래된" 및 "~ 로부터 수득된" 은 문제의 유기체의 균주에 의해 생성되거나 생성가능한 프로테아제 뿐만 아니라, 또한 그러한 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 코딩되고 그러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생성된 프로테아제를 말한다. 추가적으로는, 상기 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 코딩되고 문제의 프로테아제의 확인된 특성을 갖는 프로테아제를 말한다.

본 정의 범주 내의 "유도체" 는 일반적으로 유도체가 야생형, 고유형 또는 모체 형태로서 유사한 목적에 유용한 정도로 야생형, 고유형 또는 모체 형태에서 관찰된 특징적 단백질분해 활성을 보유한다. 세린 프로테아제의 기능성 유도체는 본 발명의 세린 프로테아제의 일반적 특성을 갖는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 펩티드 또는 펩티드 절편을 포함한다.

용어 "기능성 유도체" 는 세린 프로테아제를 코딩하는 핵산의 기능적 특성을 갖는 핵산의 유도체를 말한다. 본 발명의 세린 프로테아제를 코딩하는 핵산의 기능성 유도체는 자연 발생적, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된 핵산 또는 절편을 포함하고, 본 발명의 세린 프로테아제 특징을 코딩한다. 본 발명에 따른 세린 프로테아제를 코딩하는 야생형 핵산에는 자연 발생적 대립유전자 및 당업계에 공지된 유전적 코드의 퇴행에 근거한 상동체가 포함된다.

2 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥 중의 용어 "동일한" 은 하기 서열 비교 또는 분석 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이 최대 대응에 대해 정렬되었을 때 동일한 2 개 서열 중의 잔기를 말한다.

용어 "최적 정렬" 은 가장 높은 동일성 % 점수를 제공하는 정렬을 말한다.

2 개의 아미노산, 폴리뉴클레오티드 및/또는 유전자 서열 (적합하게는) 과 관련된 "서열 동일성 %", "아미노산 서열 동일성 %", "유전자 서열 동일성 %" 및/또는 "핵산/폴리뉴클레오티드 서열 동일성 %" 는, 서열이 최적으로 정렬된 경우 2 개의 서열 중 동일한 잔기의 % 를 말한다. 그러므로, 80% 아미노산 서열 동일성은 2 개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열 중의 아미노산의 80% 가 동일하다는 것을 의미한다.

그러므로 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 어구 "실질적으로 동일한" 은 표준 매개변수를 사용하는 프로그램 또는 알고리즘 (예를 들어, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) 을 사용하여 참조 서열과 비교하여 약 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 바람직하게는 약 97% 이상, 바람직하게는 약 98% 이상, 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 하나의 지표는 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응하는 것이다. 전형적으로는, 보존 아미노산 치환에 의해 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차 반응한다. 그러므로, 폴리펩티드는 예를 들어, 2 개의 펩티드가 보존 치환에 의해서만 상이한 경우 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 지표는 2 개의 분자가 엄격한 조건 (예를 들어, 중간 ~ 높은 엄격함 범위 내) 하에서 서로 혼성화되는 것이다.

본 문맥에서 "동등한" 이라는 어구는, 중간 ~ 최대 엄격함 조건 하에서, 관심 프로테아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 세린 프로테아제 효소를 말한다. 예를 들어, 동등하다라는 것은 동등한 성숙 세린 프로테아제가 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 갖는 성숙 서브틸리신 프로테아제에 대해 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 및/또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 것을 의미한다.

용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생되는 경우 자연 환경) 으로부터 제거된 물질을 말한다. 예를 들어, 상기 물질은 자연적으로 발생하는 또는 야생형 유기체에 존재하는 것보다 높은 또는 낮은 농도로 특정 조성물에 존재하거나 또는 자연 발생적 또는 야생형 유기체로부터 발현 시 정상적으로 존재하지 않는 성분과 함께 존재하는 경우 "정제된다" 라고 말한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계 중의 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부이고/이거나, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부이고, 또한, 이러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된다. 바람직한 구현예에서, 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 전기영동 젤 또는 블롯에서 본질적으로 하나의 밴드로 나타나는 경우 정제되었다고 말한다.

DNA 서열을 참조로 사용되는 경우 용어 "단리된" 은, 자연적인 유전 환경으로부터 제거되어 다른 외부적인 또는 원치않는 코딩 서열이 없으며, 유전공학적 단백질 제조 시스템에서 사용하기에 적합한 형태의 DNA 서열을 말한다. 이러한 단리된 분자는 자연 환경으로부터 단리된 것들이고, cDNA 및 게놈 클론이 포함된다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 보통 관련된 기타 유전자가 없으나, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 미번역 부위가 포함될 수 있다. 관련 영역의 확인은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 대안적으로는 "클로닝된 DNA 서열" 로 언급된다.

단백질을 참조로 하여 사용되는 경우, 용어 "단리된" 은, 고유의 환경 이외의 상태에서 발견된 단백질을 말한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동 단백질이 실질적으로 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 약 10% 초과의 순도, 바람직하게는 약 20% 초과의 순도, 심지어 더욱 바람직하게는 약 30% 초과의 순도를 갖는다. 발명의 추가 양상은 SDS-PAGE 에 의해 측정된 바와 같이 고도로 정제된 형태 (즉, 약 40% 초과의 순도, 약 60% 초과의 순도, 약 80% 초과의 순도, 약 90% 초과의 순도, 약 95% 초과의 순도, 약 97% 초과의 순도, 심지어 약 99% 초과의 순도) 의 단백질을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "조합 돌연변이유발" 은 출발 서열의 변이체의 라이브러리가 생성되는 방법을 말한다. 상기 라이브러리에서, 변이체는 미리 정의된 일련의 돌연변이로부터 선택된 하나 또는 여러 돌연변이를 함유한다. 또한, 상기 방법은 미리 정의된 일련의 돌연변이의 일원이 아닌 랜덤 돌연변이를 도입하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에는 본원에 참고문헌으로 포함되는, 2000 년 10 월 26 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 09/699,250 호에 언급된 것들이 포함된다. 대안적인 구현예에서, 조합 돌연변이유발 방법은 시판되는 키트 (예를 들어, QuikChange

Multisite, Stratagene, San Diego, CA) 를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "돌연변이체의 라이브러리" 는 게놈의 대부분이 동일하나, 하나 이상의 유전자의 상이한 상동체가 포함되는 세포의 집단을 말한다. 이러한 라이브러리는 예를 들어, 향상된 특색을 갖는 유전자 또는 오페론을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "출발 유전자" 는 본 발명을 사용하여 향상 및/또는 변화된 관심 단백질을 코딩하는 관심 유전자를 말한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "다중 서열 정렬" ("MSA") 은 알고리즘 (예를 들어, Clustal W) 을 사용하여 정렬된 출발 서열의 다중 상동체 서열을 말한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 서열" 및 "정준 서열" 은 관심 특정 단백질 또는 서열의 모든 변이체가 비교되는 것과는 대조되는 전형적인 아미노산 서열을 말한다. 상기 용어는 또한 관심 DNA 서열에 대부분 종종 존재하는 뉴클레오티드를 언급하는 서열을 말한다. 유전자의 각 위치에 대해, 보존 서열은 MSA 중의 위치에 가장 풍부한 아미노산을 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "보존 돌연변이" 는 출발 유전자 및 보존 서열의 서열 차이를 말한다. 보존 돌연변이는 MSA 로부터 수득된 출발 유전자 및 보존 서열의 서열을 비교하여 확인된다. 일부 구현예에서, 보존 돌연변이가 출발 유전자 내에 도입되어, 보존 서열과 더욱 유사하게 된다. 보존 돌연변이에는 또한 출발 유전자 중의 아미노산의 빈도와 관련된 위치에서 출발 유전자 중의 아미노산이 MSA 에서 더욱 종종 발견되는 아미노산으로 변경되는 아미노산 변경이 포함된다. 그러므로, 용어 보존 돌연변이는 출발 유전자의 아미노산을 MSA 중의 아미노산보다 더욱 풍부한 아미노산으로 대체하는 모든 단일 아미노산 변화를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "증강된 조합 보존 돌연변이유발 라이브러리" 는 CCM 돌연변이유발 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 스크리닝 및/또는 서열분석 결과에 근거해 설계 및 구축된 CCM 라이브러리를 말한다. 일부 구현예에서, 증강된 CCM 라이브러리는 CCM 의 초기 조사로부터 수득된 초기 적중의 서열을 근거로 한다. 추가적인 구현예에서, 증강된 CCM 은 돌연변이유발 및 스크리닝의 초기 조사로부터의 초기 적중에서 종종 발견된 돌연변이가 바람직하도록 설계된다. 일부 바람직한 구현예에서, 이것은 성능-감소 돌연변이를 코딩하는 프라이머를 생략하거나 초기 CCM 라이브러리에 사용된 다른 프라이머에 대해 성능-증강 돌연변이를 코딩하는 프라이머의 농도를 증가시켜 달성된다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "성능-감소 돌연변이" 는 비스크리닝된 조합 보존 돌연변이유발 라이브러리와 비교하여 스크리닝으로부터 수득된 적중에서 좀 덜 자주 발견된 조합 보존 돌연변이유발 라이브러리 중의 돌연변이를 말한다. 바람직한 구현예에서, 스크리닝 방법은 "성능-감소 돌연변이" 를 함유하는 변이체의 풍부함을 제거 및/또는 감소시킨다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "기능성 검정법" 은 단백질의 활성의 징후를 제공하는 검정법을 말한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 단백질을 통상의 역량으로 기능하는 능력에 대해 분석하는 검정법 시스템을 말한다. 예를 들어, 효소의 경우, 기능성 검정법에는 반응을 촉진하는 효소의 유효성을 측정하는 것이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "표적 특성" 은 변경되게 되는 출발 유전자의 특성을 말한다. 본 발명이 임의의 특정 표적 특성에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 표적 특성은 유전자 산물의 안정성 (예를 들어, 변성, 단백질분해 또는 다른 분해 인자에 대한 내성) 인 한편, 다른 구현예에서, 생성 숙주에서의 생성 수준은 변경된다. 실제로, 출발 유전자의 임의의 특성이 본 발명에서 사용될 것으로 고려된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 핵산의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 핵산의 임의의 특징 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 폴리펩티드에 대한 결합에 영향을 주는 특성, 특정 핵산을 포함하는 세포에 부여된 특성, 유전자 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 프로모터 세기, 프로모터 인지, 프로모터 조절, 인핸서 기능), RNA 가공에 영향을 주는 특성 (예를 들어, RNA 스플라이싱, RNA 안정성, RNA 형태, 및 전사 후 변형), 전사에 영향을 주는 특성 (예를 들어, 수준, 조절, 리보솜 단백질에 대한 mRNA 의 결합, 번역 후 변형) 이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 핵산의 전사 인자, 폴리머라아제, 조절 인자 등에 대한 결합 부위는 바람직한 특징을 생성하거나 바람직하지 않은 특징을 확인하기 위해 변경될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 폴리펩티드 (단백질 포함) 의 문맥에서 용어 "특성" 또는 그의 문법적인 동일어는, 선택되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특징 또는 속성을 말한다. 이러한 특성에는 산화 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리 안정성, pH 활성 프로파일, 단백질분해에 대한 내성, K_M, k_cat, k_cat/k_M 비, 단백질 접힘, 면역 반응 유도, 리간드에 결합하는 능력, 수용체에 결합하는 능력, 분비되는 능력, 세포의 표면에 전시되는 능력, 올리고머를 형성하는 능력, 신호를 보내는 능력, 세포 증식을 촉진하는 능력, 세포 증식을 억제하는 능력, 세포자멸사를 유도하는 능력, 인산화 또는 글리코실화에 의해 변형되는 능력 및/또는 질환을 치료하는 능력 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "변형된 서열" 및 "변형된 유전자" 는 자연 발생적 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 개입을 포함하는 서열을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 변형 서열의 발현 생성물은 절단된 단백질이다 (예를 들어, 변형이 서열의 결실 또는 개입인 경우). 일부 특히 바람직한 구현예에서, 절단된 단백질은 생물학적 활성을 보유한다. 대안적인 구현예에서, 변형 서열의 발현 생성물은 신장된 단백질이다 (예를 들어, 핵산 서열 내의 삽입을 포함하는 변형). 일부 구현예에서, 삽입은 절단된 단백질을 야기한다 (예를 들어, 삽입이 정지 코돈을 형성하는 경우). 그러므로, 삽입은 발현 생성물로서 절단된 단백질 또는 신장된 단백질을 야기할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이 서열" 및 "돌연변이 유전자" 는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 하나 이상의 코돈에서 변경이 이루어진 서열을 말한다. 돌연변이 서열의 발현 생성물은 야생형과 비교해 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 발현 생성물은 변경된 기능적 역량을 가질 수 있다 (예를 들어, 증강된 효소 활성).

용어 "돌연변이유발 프라이머" 또는 "돌연변이유발 올리고뉴클레오티드" (본원에서 상호교환적으로 사용됨) 는 주형 서열의 일부에 상응하고 그곳에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 조성물을 말하는 것으로 의도된다. 돌연변이유발 프라이머에 있어서, 프라이머는 주형 핵산에 정확하게 매치되지 않을 것이고, 프라이머에서의 미스매치(들) 는 핵산 라이브러리 내에 원하는 돌연변이를 도입하는데 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같은, "비-돌연변이유발 프라이머" 또는 "비-돌연변이유발 올리고뉴클레오티드" 는 주형 핵산에 정확하게 매치될 것인 올리고뉴클레오티드 조성물을 말한다. 본 발명의 한 구현예에서, 오직 돌연변이유발 프라이머만이 사용된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 프라이머는 하나 이상의 부위에 돌연변이유발 프라이머가 포함되고, 또한 올리고뉴클레오티드 혼합물에 포함된 또한 비-돌연변이유발 프라이머가 있도록 설계된다. 돌연변이유발 프라이머 중 하나 이상에 상응하는 돌연변이유발 프라이머 및 비-돌연변이유발 프라이머의 혼합물을 첨가하여, 다양한 조합 돌연변이 패턴이 제시된 수득되는 핵산 라이브러리를 생성할 수 있하다. 예를 들어, 돌연변이 핵산 라이브러리의 일원 중 일부는 특정 위치에서 그의 전구체 서열을 보존하는 반면, 다른 일원은 상기 위치에서 돌연변이되는 것이 바람직한 경우, 비-돌연변이유발 프라이머는 제시된 잔기에 대한 핵산 라이브러리 내 비-돌연변이 일원의 특정 수준을 수득하는 능력을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 길이가 10-50 개 염기인, 더욱 바람직하게는 길이가 약 15-45 개 염기인 돌연변이유발 및 비-돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 그러나, 원하는 돌연변이유발 결과를 얻기 위해 10 개 염기보다는 짧거나 50 개 염기보다는 긴 길이의 프라이머를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 상응하는 돌연변이유발 및 비-돌연변이유발 프라이머에 있어서, 상응하는 올리고뉴클레오티드의 길이가 동일해야할 필요는 없으나, 첨가되는 돌연변이에 상응하는 부위 중에 중복은 있다. 프라이머는 본 발명에 따른 미리 정의된 비율로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 수득되는 라이브러리가 특정의 특이적인 돌연변이의 수준이 유의하고, 동일 또는 상이한 위치에서 상이한 돌연변이의 양이 더 적은 것이 바람직한 경우, 첨가되는 프라이머의 양을 조정하여, 원하는 방향의 라이브러리를 생성할 수 있다. 대안적으로는, 비-돌연변이유발 프라이머를 더 적게 또는 더 많이 첨가함으로써, 상응하는 돌연변이(들) 가 돌연변이 핵산 라이브러리에서 생성되는 빈도를 조정할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 어구 "인접 돌연변이" 는 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머 내에 존재하는 돌연변이를 말한다. 예를 들어, 인접 돌연변이는 서로 인접하거나 근처에 있을 수 있으나, 이들은 동일한 프라이머에 의해 수득되는 돌연변이 주형 핵산 내에 도입될 것이다.

용어 "야생형 서열" 또는 "야생형 유전자" 는 숙주 세포에서 고유의 서열 또는 자연적으로 발생하는 서열을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 조작 계획의 출발점인 관심 서열을 말한다. 야생형 서열은 상동 또는 이종 단백질을 코딩할 수 있다. 상동 단백질은 숙주 세포가 개입 없이 생성할 단백질이다. 이종 단백질은 숙주 세포가 개입이 없다면 생성하지 않을 단백질이다. 다르게 나타내지 않는 한, 아미노산 위치 수는 SEQ ID NO:1 의 성숙 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 서브틸리신 서열에 배정된 수를 말한다. 그러나 본 발명은 상기 특정 서브틸리신의 돌연변이에 제한되는 것이 아니라, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 서브틸리신에서 특정 확인된 잔기와 "동등한" 위치에 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 프로테아제까지 확장된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로테아제 변이체", "서브틸리신 변이체", "서브틸리신 프로테아제 변이체" 는 단백질 공학에서의 출발점으로서 사용되는 야생형 서브틸리신 또는 모체 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신) 와 유사한 프로테아제에 관련하여 사용된다. 이러한 변이체는 야생형 또는 다른 모체와 그 기능에 있어서 유사하지만, 야생형 또는 모체 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신) 로부터의 서열에 있어서 이들을 상이하게 하는 아미노산 서열 내 돌연변이를 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형" 및 "돌연변이" 는 아미노산 서열 내의 임의의 변화 또는 변경을 말한다. 이 용어가 관심 아미노산 서열 (예를 들어, 서브틸리신 서열) 내 아미노산 측쇄의 치환, 결실, 삽입 및/또는 대체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한 관심 아미노산 서열 (예를 들어, 서브틸리신 서열) 의 화학적 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "산화에 안정한" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 표백제 또는 산화제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 1 분, 약 3 분, 약 5 분, 약 8 분, 약 12 분, 약 16 분, 약 20 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 표백제 또는 산화제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

용어 "킬레이트제에 안정한" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 킬레이트제에 노출되거나 이와 접촉하는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 프로테아제를 말한다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 10 분, 약 20 분, 약 40 분, 약 60 분, 약 100 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 킬레이트제와 접촉한 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 킬레이트제 안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

용어 "열적으로 안정한" 및 "열안정성" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 절차, 예를 들어 변경된 온도에 노출되는 동안 널리 행해지는 조건 하에서 제시된 시간에 걸쳐 확인된 온도에 노출 후 특이적 양의 효소 활성을 보유하는 본 발명의 효소를 말한다. 변경된 온도에는 증가 또는 감소된 온도가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 예를 들어, 적어도 약 60 분, 약 120 분, 약 180 분, 약 240 분, 약 300 분 등의 제시된 시간에 걸쳐 변형된 온도에 노출된 후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 의 단백질분해 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 열안정성은 실시예에 기재되는 바와 같이 측정된다.

산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "증강된 안정성" 은 기타 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 높은 단백질분해 활성을 보유하는 것을 말한다.

산화, 킬레이트제, 열 및/또는 pH 에 안정한 프로테아제의 문맥에서 용어 "감소된 안정성" 은 기타 세린 프로테아제 (예를 들어, 서브틸리신 프로테아제) 및/또는 야생형 효소와 비교하여 시간에 걸쳐 보다 낮은 단백질분해 활성을 보유하는 것을 말한다.

용어 "세정 활성" 은 단백질분해, 가수분해, 세정 또는 본 발명의 다른 방법 동안 널리 행해지는 조건 하에서 프로테아제에 의해 달성되는 세정 성능을 말한다. 일부 구현예에서, 세정 성능은 얼룩을 표준 세척 조건에 적용 후 다양한 크로마토그래피, 분광광도계 또는 다른 정량 방법론에 의해 측정된 바와 같이 예를 들어 잔디, 혈액, 우유, 또는 계란 단백질과 같은 효소 민감성 얼룩과 관련된 다양한 세정 검정법의 적용에 의해 측정된다. 예시적 검정법에는 WO 99/34011 및 미국 특허 제 6,605,458 호 (모두 본원에 참고문헌으로 포함됨) 에 기재된 것들 뿐 아니라, 실시예에 포함된 방법들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 바와 같이, "세정 조성물" 및 "세정 제형" 은 세정될 품목 예컨대 섬유, 식기, 콘택트 렌즈, 기타 고체 기질, 모발 (샴푸), 피부 (비누 및 크림), 치아 (구강세척액, 치약) 등으로부터 원치 않는 화합물을 제거하는데 사용되는 조성물을 말한다. 상기 용어는, 조성물에 사용되는 퍼하이드롤라아제 및 기타 효소(들) 과 조성물이 혼화가능한 한, 특정 유형의 원하는 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어 액체, 겔, 과립 또는 스프레이 조성물) 에 대해 선택된 임의의 물질/화합물을 포함한다. 세정 조성물 물질의 특이적 선택은 세정될 표면, 품목 또는 섬유, 및 사용하는 동안의 세정 조건에 대한 조성물의 원하는 형태를 고려하여 쉽게 이루어진다.

용어는 또한 임의의 대상 및/또는 표면을 세정, 표백, 살균 및/또는 멸균하는데 적합한 임의의 조성물을 말한다. 상기 용어에는 세제 조성물 (예를 들어 액체 및/또는 고체 세탁 세제 및 미세 섬유 세제; 예를 들어 유리, 목재, 세라믹 및 금속 카운터 상부 및 창문에 대한 경질 표면 세정 제형; 카페트 세정제; 오븐 세정제; 섬유 정화제; 섬유 유연제; 및 직물 및 세탁 얼룩 사전처리제 (pre-spotter) 뿐 아니라 식기 세제) 이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

실제로, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 조성물" 에는 다르게 나타내지 않는 한, 과립 또는 분말 형태 다목적 또는 중질 세척제, 특히 세정 세제; 액체, 겔 또는 페이스트 형태 다목적 세척제, 특히 이른바 중질 액체 (HDL) 유형; 액체 미세-섬유 세제; 손 식기세척제 또는 경질 (light duty) 식기세척제, 특히 고발포 유형의 것들; 가정 및 업체용 각종 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조제 유형을 포함하는 기계 식기세척제; 항박테리아 손세척제 유형, 세정 바, 구강세척액, 의치 세정제, 차량 또는 카페트 샴푸, 욕실 세정제를 포함하는 액체 세정 및 살균제; 모발 샴푸 및 모발 린스; 샤워젤 및 거품 목욕제 및 금속 세정제; 뿐 아니라 세정 보조제 예컨대 표백 부가제 및 "얼룩-막대 (stain-stick)" 또는 전처리 (pre-treat) 유형이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세제 조성물" 및 "세제 제형" 은 오염된 대상의 세정을 위한 세척 매질에서 사용하기 위해 의도되는 혼합물에 관련하여 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 섬유 및/또는 의류를 세탁하는데 관련하여 사용된다 (예를 들어, "세탁 세제"). 대안적인 구현예에서, 상기 용어는 식기, 수저 등을 세정하는데 사용되는 것들과 같은 기타 세제를 말한다 (예를 들어, "식기세척 세제"). 본 발명은 임의 특정한 세제 제형 또는 조성물에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 실제로, 퍼하이드롤라아제에 추가로, 용어가 계면활성제, 트랜스퍼라아제(들), 가수분해 효소, 옥시도리덕타아제, 세척강화제, 표백제, 표백 활성화제, 청색제 및 형광 염료, 케이킹 저해제, 차폐제, 효소 활성화제, 항산화제 및 가용화제를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 프로테아제의 "세정 유효량" 은 특정 세정 조성물에서 원하는 수준의 효소 활성을 달성하는 본원에서 이전에 기재된 프로테아제의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인되며, 사용되는 특정 프로테아제, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어 과립, 바) 조성물이 필요한지의 여부 등과 같은 많은 인자에 근거한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세정 보조 물질" 은, 특정 유형의 바람직한 세정 조성물 및 생성물 형태 (예를 들어 액체, 과립, 분말, 바, 페이스트, 스프레이, 정제, 겔; 또는 발포성 조성물) 에 대해 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하고, 상기 물질은 또한 바람직하게는 조성물에 사용되는 프로테아제 효소와 혼화가능하다. 일부 구현예에서, 과립 조성물은 "압축" 형태인 한편, 다른 구현예에서, 액체 조성물은 "농축" 형태이다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "증강된 성능" 은 표준 세척 사이클 및/또는 다중 세척 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 계란, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 얼룩의 증가된 또는 더 큰 세정 활성을 말한다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "감소된 성능" 은 표준 세척 사이클 후 통상의 평가에 의해 측정된 바와 같은 계란, 우유, 잔디 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 얼룩의 감소된 또는 더 적은 세정 활성을 말한다.

세정 활성의 문맥에서 용어 "비교 성능" 은 OPTIMASE™ 프로테아제 (Genencor), PURAFECT™ 프로테아제 제품 (Genencor), SAVINASE™ 프로테아제 (Novozymes), BPN'-변이체 (예를 들어 미국 특허 번호 Re 34,606 호 참조), RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ 프로테아제 (Novozymes), MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ 프로테아제 (Genencor; 또한 미국 특허 번호 Re 34,606 호 및 미국 특허 번호 5,700,676 호; 5,955,340 호; 6,312,936 호; 및 6,482,628 호 참조), 및 B. 렌투스 (B. lentus) 변이체 프로테아제 제품 (예를 들어, WO 92/21760, WO 95/23221 및/또는 WO 97/07770 에 기재되어 있는 것들) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 비교 서브틸리신 프로테아제 (예를 들어, 시판되는 프로테아제) 의 세정 활성의 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상을 말한다. 예시적인 서브틸리신 프로테아제 변이체에는 BPN' 의 위치 76, 101, 103, 104, 120, 159, 167, 170, 194, 195, 217, 232, 235, 236, 245, 248, 및/또는 252 와 동등한 잔기 위치에서의 치환 또는 결실을 갖는 변이체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 세정 성능은 표준 세척 사이클 조건 후 통상의 분광 광도적 또는 분석 방법론에 의해 측정된 바와 같은 잔디, 혈액 또는 우유와 같은 효소 민감성 얼룩에 관한 다양한 세정 검정법에서 본 발명의 프로테아제와 이러한 서브틸리신 프로테아제를 비교하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "섬유 세정 조성물" 에는 세탁 첨가 조성물 및 얼룩진 섬유 (예를 들어, 옷감, 린넨 및 기타 직물 물질) 의 담금 및/또는 전처리에 사용하기에 적합한 조성물을 포함하는 손세탁 및 기계 세탁 세제 조성물이 포함된다.

본원의 세정 조성물의 "압축" 형태는 밀도에 의해, 그리고 조성에 있어서 무기 충전재 염의 양에 의해 가장 잘 반영된다. 무기 충전재 염은 분말 형태의 세제 조성물의 통상적인 성분이다. 통상적인 세제 조성물에서, 충전재 염은 상당한 양으로, 전형적으로 총 조성의 약 17 내지 약 35 중량% 로 존재한다. 반대로, 압축 조성물에서, 충전재 염은 총 조성의 약 15% 를 넘지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 충전재 염은 조성의 약 10 중량% 를 넘지 않는 양으로, 또는 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 로 존재한다. 일부 구현예에서, 무기 충전재 염은 술페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로부터 선택된다. 바람직한 충전재 염은 나트륨 술페이트이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "계면활성제" 는 계면 활성 특성을 갖는 것으로 당업계에서 일반적으로 인지되는 임의의 화합물을 말한다. 계면활성제에는 일반적으로, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 및 쌍극이온성 화합물이 포함되며, 이들은 본원에서 추가로 설명된다.

실시예

본 발명은 어떤 식으로든 청구되는 본 발명의 범주를 제한하지 않도록 의도되는 이하 실시예에서 더욱 상세히 기재되고 있다. 하기 실시예는 청구된 본 발명을 설명하기 위해 제공되나 이를 제한하려는 것은 아니다.

하기 실험 설명에 있어서, 하기 약어가 적용된다: PI (프로테아제 저해제), ppm (백만 당 부); M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM (마이크로몰농도); nM (나노몰농도); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); gm (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); pg (피코그램); L (리터); ㎖ 및 mL (밀리리터); ㎕ 및 μL (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); U (단위); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min(s) (분(s)); h(s) 및 hr(s) (시간(s)); ℃ (섭씨온도); QS (충분량); ND (실행하지 않음); NA (해당사항 없음); rpm (분 당 회전수); H₂O (물); dH₂O (탈이온수); HCl (염산); aa (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로염기쌍); kD (킬로달톤); cDNA (카피 또는 상보성 DNA); DNA (데옥시리보핵산); ssDNA (단일 가닥 DNA); dsDNA (이중 가닥 DNA); dNTP (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트); RNA (리보핵산); MgCl₂ (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); w/v (부피에 대한 중량); v/v (부피에 대한 부피); g (중력); OD (광학 밀도); 둘베코 인산염 완충 용액 (DPBS); SOC (2% Bacto-Tryptone, 0.5% Bacto Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl); Terrific Broth (TB; 12 g/ℓ Bacto Tryptone, 24 g/ℓ 글리세롤, 2.31 g/ℓ KH₂PO₄, 및 12.54 g/ℓ K₂HPO₄); OD₂₈₀ (280 nm 에서의 광학 밀도); OD₆₀₀ (600 nm 에서의 광학 밀도); A₄₀₅ (405 nm 에서의 흡광도); V_최대 (효소 촉매 반응의 최대 초기 속도); PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동); PBS (인산염 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 나트륨 인산염 완충액, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25% TWEEN

20); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PCR (중합효소 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (나트륨 도데실 술페이트); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]); HBS (HEPES 완충 식염수); Tris-HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄-히드로클로라이드); Tricine (N-[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-글리신); CHES (2-(N-시클로-헥실아미노)에탄-술폰산); TAPS (3-{[트리스-(히드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판술폰산); CAPS (3-(시클로-헥실아미노)-프로판-술폰산; DMSO (디메틸 술폭시드); DTT (1,4-디티오-DL-트레이톨); SA (시나핀산 (s,5-디메톡시-4-히드록시 신남산); TCA (트리클로로아세트산); Glut 및 GSH (환원 글루타티온); GSSG (산화 글루타티온); TCEP (트리스[2-카르복시에틸]포스핀); Ci (큐리); mCi (밀리큐리); μCi (마이크로큐리); HPLC (고압 액체 크로마토그래피); RP-HPLC (역상 고압 액체 크로마토그래피); TLC (박층 크로마토그래피); MALDI-TOF (매트릭스 지원 레이저 이탈/이온화법-비행시간형); Ts (토실); Bn (벤질); Ph (페닐); Ms (메실); Et (에틸), Me (메틸); Taq (테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 중합효소); Klenow (DNA 중합효소 I 대형 (Klenow) 절편); EGTA (에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산); EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산); bla (β-락타마아제 또는 암피실린-내성 유전자); HDL (고밀도 액체); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, the Netherlands); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); Pall (Pall Corp., East Hills, NY); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, the Netherlands); Test Fabrics (Test Fabrics, Inc., West Pittiston, PA), Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Ireland); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY); Sigma (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences 및/또는 Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA); Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL 또는 Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Ipswich, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japan); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); United States Testing (United States Testing Co., Hoboken, NJ); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); Gene Oracle (Gene Oracle, Mountain View, CA); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Germany); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Spain); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, the Netherlands); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); 및 Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).

실시예 1

검정법

하기 실시예에서, 판독의 용이성을 위해 하기 언급되는 바와 같은 다양한 검정법을 사용하였다. 하기 제공되는 프로토콜의 임의의 편차는 실시예에 표시된다.

A. 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내 단백질 함량 측정을 위한 TCA 검정법

BPN' (예를 들어, 참조 프로테아제) 및 BPN' 변이체의 경우, 본 검정법은 가습 통기 및 230 rpm 에서 교반하면서 33℃ 로 3-4 일 성장시킨 마이크로타이터 플레이트로부터의 여과된 배양 상청액을 사용하여 시작하였다. 본 검정법을 위해 새로운 96-웰 평평 바닥 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 를 사용하였다. 먼저, 각 웰에 0.25 N HCl 을 100 ㎕/웰로 넣었다. 그 다음, 50 ㎕ 의 여과된 배양 브로스를 첨가하였다. 그 다음 "블랭크" 판독값을 제공하기 위해 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다. 시험을 위해, 플레이트에 100 ㎕/웰의 15% (w/v) 트리클로로아세트산 (TCA) 을 넣고, 실온에서 5 내지 30 분 인큐베이션시켰다. 그 다음 405 nm 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기 내 5 초 혼합 방식 사용) 를 측정하였다.

사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX (유형 340; Molecular Devices) MTP 판독기였고; MTP 는 Costar (유형 9017) 이었다. 사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX 유형 340 (Molecular Devices) MTP 판독기였고; MTP 는 유형 9017 (Costar) 이었다.

TCA 로의 시험 판독값에서 블랭크 (TCA 없음) 를 빼서 계산하여, 샘플 내 단백질 함량의 상대적인 측정값을 제공하였다. 원한다면, 클론의 AAPF 검정법으로의 TCA 판독값을 공지된 전환 인자로 교정함으로써 표준 곡선을 생성할 수 있다. 그러나, TCA 결과는 1 ㎖ 당 50 내지 500 단백질의 단백질 농도 (ppm) 에 대해 선형이고, 그러므로 양호한 성능 변이체를 선택하고자 하는 목적을 위해 효소 성능에 대해 직접적으로 작성될 수 있다. 샘플 내 탁도/광 산란 증가는 배양 상청액 내 침전가능한 단백질의 총량과 상관관계가 있다.

B. 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내 AAPF 프로테아제 검정법

본 발명의 프로테아제 및 이의 변이체의 프로테아제 활성을 측정하기 위해, N-숙시닐-L-알라닐-L-알라닐-L-프롤릴-L-페닐-p-니트로아닐리드 (suc-AAPF-pNA) 의 가수분해를 측정하였다. 사용된 시약 용액은 다음과 같았다: 0.005% TWEEN

-80 함유 100 mM Tris/HCl, pH 8.6 (Tris 희석 완충액); 10 mM CaCl₂ 및 0.005% TWEEN

-80 함유 100 mM Tris 완충액, pH 8.6 (Tris/Ca 완충액); 및 DMSO 내 160 mM suc-AAPF-pNA (suc-AAPF-pNA 저장액) (Sigma: S-7388). suc-AAPF-pNA 작업 용액을 제조하기 위해, 1 ㎖ suc-AAPF-pNA 저장액을 100 ㎖ Tris/Ca 완충액에 첨가하고, 10 초 이상 잘 혼합하였다. 각 웰에 10 ㎕ 의 희석된 프로테아제 용액을 첨가하고, 직후에 190 ㎕ 1 mg/㎖ suc-AAPF-pNA 작업 용액을 첨가함으로써 검정법을 수행하였다. 5 초 동안 용액을 혼합하고, 25℃ 에서, MTP 판독기로 410 nm 에서 동적 방식의 흡광도 변화 (5 분 내 20 회 판독) 를 판독하였다. 프로테아제 활성을 AU (활성 = ΔOD·분^-1 ㎖^-1) 로서 표현하였다.

C. 계면활성제 및 킬레이트제 안정성 검정법

AAPF 검정법을 사용하여 측정된 잔류 활성의 함수로서, LAS 및 LAS/EDTA 각각의 존재 하에서 시험 프로테아제의 인큐베이션 후 LAS 및 LAS/EDTA 안정성을 측정하였다.

LAS 안정성 방법

시약:

도데실벤젠술포네이트, 나트륨 염 (=LAS): Sigma D-2525

TWEEN

-80: Sigma P-8074

TRIS 완충액 (유리산): Sigma T-1378; 6.35 g 을 약 960 ㎖ 물에 용해시킴; 4N HCl 로 pH 를 8.2 로 조정함. TRIS 의 최종 농도는 52.5 mM 이다.

LAS 저장액: MQ 물 중 10.5% LAS 용액으로 제조함 (= 100 ㎖ MQ 당 10.5 g)

TRIS 완충액-100 mM / pH 8.6 (100 mM Tris/0.005% TWEEN

80)

TRIS-Ca 완충액, pH 8.6 (100 mM Tris/10 mM CaCl₂/0.005% TWEEN

80).

하드웨어:

평평 바닥 MTP (Costar No. 9017)

Biomek FX

ASYS 멀티피펫

Spectramax MTP 판독기

iEMS 인큐베이터/진탕기

Innova 4330 인큐베이터/진탕기

Biohit 멀티채널 피펫

BMG Thermostar 진탕기.

52.5 mM Tris 완충액 (pH 8.2) 내 0.063% LAS 용액을 제조하였다. 1 ㎖ 의 100 mg/㎖ suc-AAPF-pNA 저장액 (DMSO 중) 을 100 ㎖ (100 mM) TRIS 완충액 (pH 8.6) 에 첨가함으로써 suc-AAPF-pNA 작업 용액을 제조하였다. 상청액을 희석하기 위해, 평평 바닥 플레이트를 희석 완충액으로 채우고, 상청액의 분취물을 첨가하고 충분히 혼합하였다. 희석 비율은 성장 플레이트 (AAPF 활성) 내 프로테아제 대조군의 농도에 따라 다르다. 원하는 단백질 농도는 80 ppm 이었다.

10 ㎕ 의 희석된 상청액을 190 ㎕ 0.063% LAS 완충액/웰에 첨가하였다. 테이프로 MTP 를 덮고, 수 초 동안 진탕하여, 인큐베이터 (Innova 4230) 에 넣어 45℃ 에서 60 분 동안 200 rpm 로 교반하였다. 각 웰 내 혼합물 10 ㎕ 을 190 ㎕ suc-AAPF-pNA 작업 용액이 함유된 새로운 MTP 로 옮겨 인큐베이션 10 분 후 초기 활성 (t=10 분) 을 측정하였다. 상기 용액을 충분히 혼합하고, MTP 판독기 (5 분 내 25℃ 에서 20 회 판독) 를 사용하여 AAPF 활성을 측정하였다.

60 분 인큐베이션 후 인큐베이션 플레이트에서 또다른 10 ㎕ 의 용액을 제거하여 최종 활성 (t=60 분) 을 측정하였다. 그 다음 상기 기재한 바와 같이 AAPF 활성을 측정하였다. 샘플의 안정성을, 하기와 같이 잔류 및 초기 AAPF 활성의 비를 계산하여 측정하였다:

잔류 활성 (%) = [t-60 값]* 100 / [t-10 값].

LAS / EDTA 안정성 방법

정의된 조건 하에서의 인큐베이션 후 대표적인 음이온성 계면활성제 (LAS=선형 알킬벤 술포네이트, 나트륨 도데실벤젠술포네이트-DOBS) 및 디-나트륨 EDTA 의 존재 하에서의 프로테아제 변이체의 안정성을 측정하고, AAPF 검정법을 사용하여 잔류 활성을 측정하였다. 사용된 시약은 도데실벤젠 술포네이트, 나트륨 염 (DOBS, Sigma No. D-2525), TWEEN

-80 (Sigma No. P-8074), 디-나트륨 EDTA (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigma No. H-7523), 비-스트레스 완충액: 50 mM HEPES (11.9 g/ℓ) + 0.005% TWEEN

-80, pH 8.0, 스트레스 완충액: 50 mM HEPES (11.9 g/ℓ), 0.1% (w/v) DOBS (1 g/ℓ), 10 mM EDTA (3.36 g/ℓ), pH 8.0, 참조 프로테아제 및 프로테아제 변이체 배양 상청액 (200 - 400 ㎍/㎖ 단백질 함유) 였다. 사용된 기기는 희석 플레이트로서 V- 또는 U-바닥 MTP (각각 Greiner 651101 및 650161), 비-스트레스 및 LAS/EDTA 완충액 뿐 아니라, suc-AAPF-pNA 플레이트용의 F-바닥 MTP (Corning 9017), Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP 판독기 (Molecular Devices), iEMS 인큐베이터/진탕기 (1 mm 진폭) (Thermo Electron Corporation), 밀봉 테이프: Nunc (236366) 였다.

iEMS 인큐베이터/진탕기 (Thermo/Labsystems) 를 29℃ 로 설정하였다. 비-스트레스 완충액을 함유하는 플레이트에 배양 상청액을 약 25 ppm 의 농도로 희석하였다 (마스터 희석 플레이트). 마스터 희석 플레이트로부터 20 ㎕ 의 샘플을 180 ㎕ 비-스트레스 완충액을 함유하는 플레이트에 첨가하여 2.5 ppm 의 최종 인큐베이션 농도가 수득되게 하였다. 내용물을 혼합하고 실온에서 유지하고, 상기 플레이트 상에서 AAPF 검정법을 수행하였다. 또한 마스터 희석 플레이트로부터 20 ㎕ 의 샘플을 180 ㎕ 스트레스 완충액 (50 mM HEPES (11.9 g/ℓ), 0.1 % (w/v) DOBS (1 g/ℓ), 10 mM EDTA (3.36 g/ℓ), pH 8.0) 을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 즉시 29℃ iEMS 진탕기에 30 분 동안 400 rpm 으로 두었다. 30 분 인큐베이션 후, 스트레스 플레이트 상에서 AAPF 검정법을 수행하였다. 샘플의 안정성을, 하기와 같이 잔류 및 초기 AAPF 활성의 비를 계산하여 측정하였다:

잔류 활성 (%) = [mOD·분^-1 스트레스]*100 / [mOD·분^-1 비-스트레스].

D. 세정 성능 검정법

프로테아제 변이체의 얼룩 제거 성능을 시판 세제에서 측정하였다. 시판 세제 제형의 가열 불활성화는 비-효소적 성분의 특성을 유지하면서 임의의 단백질 성분의 효소 활성을 파괴시키는 작용을 한다. 그러므로, 본 방법은 본 발명의 효소 변이체의 시험에 사용하기 위해 시판 세제를 준비하는데 적합하였다.

미세견본:

CFT (Vlaardingen, The Netherlands) 에서 ¼" 원형 직경의 미세견본을 주문하고 배달받았다. 1 개의 미세견본 또는 2 개의 미세견본을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96-웰 MTP 의 각 웰에 놓았다.

BMI 미세견본 검정법

0.25 인치 원형 직경의 혈액 우유 및 잉크 (BMI) 를 함유하는 미세견본을 CFT 로부터 주문하였다. 견본을 자르기 전에, 섬유 (EMPA 116) 를 물로 세정하였다. 1 개의 미세견본을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 놓았다. 원하는 세제 용액을 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 25℃ 로 Thermomixer 의 평형을 맞춘 후, 190 ㎕ 의 세제 용액을 미세견본을 함유하는 MTP 의 각 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물에, 10 ㎕ 의 희석된 효소 용액을, 최종 효소 농도가 1 ㎍/㎖ (BCA 검정법으로 측정됨) 이 되도록 첨가하였다. MTP 를 테이프로 밀봉하고, 1400 rpm 에서 진탕하면서 인큐베이터에 30 분 동안 두었다. 적합한 조건하에서의 인큐베이션 후, 각 웰로부터 100 ㎕ 의 용액을 새로운 MTP 로 옮겼다. 100 ㎕ 의 용액/웰을 함유하는 새로운 MTP 를 MTP SpectraMax 판독기를 사용하여 405 nm 에서 판독하였다. 블랭크 대조군 뿐 아니라, 2 개의 미세견본 및 세제를 함유하나 효소는 함유하지 않는 대조군을 또한 포함시켰다.

"사전-세척된" 견본

이러한 유형의 미세견본을 실온에서 20 분 동안 탈이온수로 사전-세척하였다. 사전-세척 단계 후, 견본을 종이 타월의 위에 올려놓아 건조시켰다. 자연 건조된 견본을 이후 방출 프레스 (expulsion press) 상 ¼" 원형 다이를 사용하여 펀칭하였다. 최종적으로, 2 개의 미세견본을 전체 표면적이 노출되도록 수직으로 (즉, 웰의 바닥에 평평하지 않게) 96-웰 MTP 의 각 웰에 놓았다.

세제

북미 (NA) 및 서유럽 (WE) 중질 액체 세탁 (HDL) 세제에 대해, 사전-칭량된 액체 세제 (유리 병 내) 를 수조에 95℃ 에서 2 시간 동안 두어 열 불활성화를 수행하였다. 세제는 지역 슈퍼마켓 상점에서 구매하였다. 탈활성화 % 를 정확하게 측정하기 위해, 비-열처리 및 열처리 세제 모두를 세제 용해 5 분 내에 검정하였다. AAPF 검정법으로 효소 활성을 시험하였다.

열-불활성화된 세제에서의 효소 활성을 시험하기 위해서, 열 불활성화된 저장액으로부터 세제의 작업 용액을 제조하였다. 적절량의 물 경도 (6 gpg) 및 완충액을 세제 용액에 첨가하여 원하는 조건으로 맞추었다. 병을 볼텍싱하거나 인버팅하여 용액을 혼합하였다.

효소 및 기기

MTP 플레이트에서 성장한 배양물의 여과된 배양 브로스로부터 이의 참조 세린 프로테아제 변이체의 샘플을 수득하였다. 사용한 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter), SpectraMAX MTP 판독기 (유형 340; Molecular Devices), iEMS 인큐베이터/진탕기 (Thermo/Labsystems); F-bottom MTP (인큐베이션 후 반응 플레이트를 판독하는데 사용하는 Costar 유형 9017); 및 V-bottom MTP (상청액의 사전-희석에 사용하는 Greiner 651101) 였다. 상기 검정법에서, 프로테아제는 기질을 가수분해하고 기질로부터 안료 및 불용성 입자를 유리시킨다. 따라서 탁도 속도는 효소 활성의 측정이다.

참조 세린 프로테아제 및 그로부터의 변이체의 미세견본에서의 얼룩 제거 성능을 시판되는 열-불활성화된 세제로 MTP 규모에서 측정하였다. 사용한 세제는 다음과 같았다: 5 mM HEPES, pH 8.0 또는 5 mM MOPS, pH 7 완충액, 3:1 Ca: Mg (중간 물 경도에 대해) (CaCl₂:MgC1₂ㆍ6H₂O); 6 gpg (gpg: 갤론 당 그레인) 로 희석된 15000 gpg 저장액, 플레이트 당 2 BMI (혈액/우유/잉크) 견본: CFT 에 의해 가공된 EMPA-116 BMI 면 견본: 사전-헹궈지고 펀칭된 웰 당 2 개 견본, 및 프로테아제 활성의 결여가 확증된, 열 불활성화된 TIDE

2X Cold 기성품 세제.

[표 1-2]

인큐베이터를 원하는 온도 (16℃ 또는 32℃) 로 설정하였다. 약 10 ppm 효소의 마스터 희석 플레이트로부터의 10 ㎕ 샘플을 상기 열거한 190 ㎕ 작업 세제 용액과 함께 BMI 2-견본 플레이트에 첨가하였다. 변이체에 대한 최종 농도 0.5 ppm 이 수득되도록 검정 플레이트 내 부피를 조정하였다. 플레이트를 iEMS 인큐베이터에 즉시 옮기고 주어진 온도에서 1400 rpm 으로 진탕하면서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 ㎕ 의 상청액을 새로운 96-웰 플레이트에 옮기고, 405 nm 및/또는 600 nm 에서 MTP 판독기로 흡광도를 측정하였다. 프로테아제 샘플을 첨가하지 않은 세제 및 1 또는 2 개 미세견본을 함유하는 대조군 웰을 또한 시험에 포함시켰다. 405 nm 에서의 측정으로 높은 값이 제공되며 안료 제거가 추적되는 한편, 600 nm 에서의 측정으로 탁도 및 세정이 추적된다.

모든 미세견본 검정법에 대한 얼룩 제거 활성의 계산:

수득한 흡광도 값을 블랭크 값 (효소가 없는 기질) 에 대해 보정하여 가수분해 활성의 측정을 제공하였다. 각각의 샘플 (변이체) 에 대해 성능 지표를 계산하였다. 성능 지표는 동일한 단백질 농도에서의 변이체 (실제값) 및 표준 효소 (이론값) 의 성능을 비교한다. 또한, 표준 효소의 랭뮤어 식의 매개변수를 사용하여 이론값을 계산할 수 있다.

E. 프로테아제 및 이의 변이체의 상대 특이적 활성

프로테아제 변이체를 구별하기 위해, suc-AAPF-pNA 를 기질로서 사용하여 상대 특이적 활성을 계산하였고, 이로써 변이체 대 야생형 또는 표준 프로테아제의 비교 및 등급화가 가능하였다. 상기 기재된 검정법을 사용하여, 단백질분해 활성을 각 샘플의 측정된 TCA-값으로 나누어 suc-AAPF-pNA 기질에 대한 특이적 활성을 측정하였다. 이러한 값을 사용하여, 상대 특이적 활성을 계산하였다 (변이체의 특이적 활성/참조 프로테아제의 특이적 활성).

F. 성능 지표

성능 지표는 동일한 단백질 농도에서의 변이체 (실제값) 및 표준 또는 참조 프로테아제 (이론값) 의 성능을 비교한다. 또한, 표준 프로테아제의 결합 곡선의 매개변수 (즉, 랭뮤어 식) 를 사용하여 이론값을 계산할 수 있다. 1 초과의 성능 지표 (PI) (PI>1) 로는 표준 (예를 들어 야생형) 에 비해 양호한 변이체가 확인되는 한편, 1 의 PI (PI=1) 로는 표준과 동일하게 수행하는 변이체가 확인되고, 1 미만의 PI (PI<1) 로는 표준보다 불량하게 수행하는 변이체가 확인된다. 따라서, PI 로는 성공물 뿐 아니라 특정 환경 하 사용하기에 덜 바람직한 변이체가 확인된다.

실시예 2

BPN' 다중 돌연변이 라이브러리 ( MML ) 변이체의 얼룩 제거 성능

BPN' 을 모체 단백질로서 사용하여, Geneart 또는 DNA 2.0 에 의해 BPN' 다중 돌연변이 라이브러리 (또는 조합적 라이브러리) 를 생성하였다. 배양 상청액의 단백질 농도를 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 TCA 침전으로 측정하였다. 하기의 변형을 갖는, 실시예 1 에서 기재된 방법을 사용하여 pH 8/16℃, pH 7/16℃ 및 pH 8/32℃ 에서 EMPA 116 견본 (BMI 얼룩, CFT) 에 대한 세탁 적용으로 변이체의 얼룩 제거 성능을 시험하였다. 사용된 시험 세제는 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 제조된 열 불활성화된 TIDE

2X Cold 세제 (Procter & Gamble) 였다. 상업적 세제 제형의 열 불활성화는 임의의 단백질 성분의 내인성 효소 활성을 파괴하면서 비-효소 성분의 특성을 유지시키는 작용을 한다.

사전 칭량된 양의 액체 세제 (유리 병 내) 를 95℃ 에서 2 시간 동안 수조에 두어 세제의 열 불활성화를 수행하였다. 세제는 지역 슈퍼마켓 상점에서 구매하였다. 탈활성화 % 를 정확히 측정하기 위해, 비-열처리 및 열처리 세제 모두를 세제 용해 5 분 내에 검정하였다. AAPF 검정법으로 효소 활성을 시험하였다. BPN' 변이체의 기능성을 성능 지표 (Pi) (즉, 모체 BPN' 에 대한 변이체의 성능비) 로서 정량화하였다. 결과를 표 2-1 에 나타내었다. TCA 침전 및/또는 하나 이상의 BMI 얼룩 제거 성능 시험에 대해 0.5 이상의 Pi 값을 나타내는 BPN' 변이체는 향상된 세정 이득 및/또는 발현을 나타내었다. 0.05 이하의 성능 지표를 0.05 로 고정하고 표에서 굵은 이탤릭체로 표시하였다. 0.05 이하의 TCA 단백질 성능 지표를 갖는 모든 변이체에 대해, 모든 값을 0.05 로 고정하였다.

[표 2-1]

실시예 3

97-128- 217 에서의 포화 라이브러리 및 추가적인 돌연변이

DNA 2.0 에 의해 BPN' (모체) 내 위치 97-128-217 에서의 포화 라이브러리를 생성하였다. 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 TCA 침전에 의해 배양 상청액의 단백질 농도를 측정하였다. 실시예 2 에서 기재한 바와 같이 실시예 1 에서 기재된 방법을 사용하여, pH8/16℃ 에서 EMPA 116 견본 (BMI 얼룩, CFT) 에 대한 세탁 적용에서 변이체의 얼룩 제거 성능을 시험하였다. 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 AAPF 검정법에 의해 효소 활성을 시험하였다. BPN' 변이체의 기능성을 성능 지표 (Pi) (즉, FNA 에 대한 변이체의 성능비) 로서 정량화하였다. 결과를 표 3-1 에 나타내었다. TCA 침전 및/또는 BMI 얼룩 제거 성능 시험에 대해 0.5 이상의 Pi 값을 나타내는 BPN' 변이체는 향상된 세정 이득 및/또는 발현을 나타내었다.

[표 3-1]

실시예 4

변이체의 추가적 라이브러리 설계 및 얼룩 제거 성능

모체 분자로서 BPN': G97A-G128A-Y217Q 단백질을 사용하여, Geneart 또는 Gene Oracle 에 의해 추가적인 BPN' 다중 돌연변이 라이브러리를 생성하였다. BPN' 변이체의 오염 제거 활성을 측정하기 위해 수행한 실험 (EMPA 116 견본 (BMI 얼룩, CFT Vlaardingen) (BMI pH8, BMI pH7, BMI 32℃) 을 사용하여 세탁 적용에서의 얼룩 제거 성능을 측정하기 위한 미세견본 검정법), TCA 침전에 의한 단백질 측정, 및 LAS/EDTA 안정성 (관심 특성 시험) 의 결과를 표 4-1, 4-2, 4-3 및 4-4 에 나타내었다.

얼룩 제거 성능 검정법에 대한 하기 변형과 함께, 실시예 1 에서 기재된 방법을 사용하여 결과를 수득하였다. 사용된 시험 세제는 열 불활성화된 TIDE

2X Cold 세제 (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA) 였다.

상업적 세제 제형의 열 불활성화는 임의의 단백질 성분의 내인성 효소 활성을 파괴하면서 비효소 성분의 특성을 유지시키는 작용을 한다. 사전 칭량된 양의 액체 세제 (유리 병 내) 를 95℃ 에서 2 시간 동안 수조에 두어 세제의 열 불활성화를 수행하였다. 세제는 지역 슈퍼마켓 상점에서 구매하였다. 탈활성화 % 를 정확히 측정하기 위해, 비-열처리 및 열처리 세제 모두를 세제 용해 5 분 내에 검정하였다. AAPF 검정법으로 효소 활성을 시험하였다. 본원을 통해 기재한 바와 같이, 모체 단백질 BPN': G97A-G128A-Y217Q 에 대한 변이체의 성능비인 성능 지표 (Pi) 로서 BPN' 변이체의 기능성을 정량화하였다. TCA 침전 및/또는 BMI 얼룩 제거 성능에 대해 0.5 이상의 Pi 값을 나타내는 BPN: G97A-G128A-Y217Q 변이체는 향상된 세정 이득 및/또는 발현을 나타내었다. 0.05 이하의 성능 지표를 0.05 로 고정하고 표에서 굵은 이탤릭체로 표시하였다.

[표 4-1]

BPN' 다중 돌연변이 라이브러리의 LAS/EDTA 안정성을 시험하고 BPN': G97A-G128A-Y217Q 에 대해 비교하였다. 스트레스 완충액이 0.1% LAS + 1O mM EDTA 를 함유하고 스트레스 플레이트를 40℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션한 것을 제외하고는, 실시예 1 에서의 LAS 안정성 검정법에서 기재한 바와 같이 LAS/EDTA 검정법을 수행하였다. 모체 단백질 BPN': G97A-G128A-Y217Q 에 대한 변이체의 성능비인 성능 지표 (Pi) 로서 BPN' 변이체의 기능성을 정량화하였다. 결과를 표 4-2 에 나타내었다.

[표 4-2]

BPN' 삼중 변이체의 LAS/EDTA 안정성을 시험하고 BPN'-Y217L 에 대해 비교하였다. 스트레스 완충액이 0.1% LAS + 1O mM EDTA 를 함유하고 스트레스 플레이트를 35℃ 에서 25 분 동안 인큐베이션한 것을 제외하고는, 실시예 1 에서의 "LAS 안정성 검정법" 부분에서 기재한 바와 같이 LAS/EDTA 검정법을 수행하였다. 모체 단백질 BPN'-Y217L 에 대한 변이체의 성능비인 성능 지표 (Pi) 로서 BPN' 변이체의 기능성을 정량화하였다. 결과를 표 4-3 에 나타내었다.

[표 4-3]

명세서에 언급된 모든 특허 및 발행물은 본 발명이 속하는 당업자의 수준의 것이다. 당업자는 본 발명이 목적을 실행하고 언급된 목표 및 장점, 뿐 아니라 발명 고유의 것을 수득하기 위해 잘 조정된다는 것을 쉽게 인지한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 바람직한 구현예를 대표하는 것이고, 예시적이며, 본 발명의 범주에 대한 제한으로 의도되는 것은 아니다. 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 본원에 개시된 본 발명에 대한 다양한 교환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

본원에 설명적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한(들) 없이도 적합하게 실행될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명을 위해 사용되며, 나타내고 기재된 특징 또는 이의 일부의 임의의 동등물을 제외하여 이러한 용어 및 표현을 사용하는 것으로는 의도되지 않으나, 청구된 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본원에 기재된 개념의 변형 및 변화가 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변화가 본원에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 본원에 광범위하고 일반적으로 기재되어 있다. 속명 기재 내에 포함되는 좀더 좁은 종명 및 하부 속명 그룹 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 여기에는 종으로부터 임의의 대상을 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 종명 기재가, 삭제된 부분이 본원에 구체적으로 언급되었는지의 여부와 관계없이 포함된다.

<110> Danisco US Inc., Genencor Division Basler, Joshua R. Cascao-Pereira, Luis G. Estell, David A. Kellis Jr., James T. <120> Compositions and Methods Comprising Variant Microbial Proteases <130> 31178WO-2B <140> PCT/US09/46066 <141> 2009-06-03 <150> US 61/059,695 <151> 2008-06-06 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reagent <400> 2 Ala Ala Pro Phe 1

Claims (19)

1. SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기의 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체:
   

   
2. SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기의 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체:
   

   
3. SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기의 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체:
   

   
4. 치환 G97A/G128A/Y217Q 를 포함하며 제 3 항의 하나 이상의 변형을 추가로 포함하고, 그 위치가 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는 서브틸리신 변이체.
5. SEQ ID NO:1 에서 설명하는 BPN' 서브틸리신의 위치와 동등한 위치에서의 치환인 하기 치환 세트 중 하나 이상의 세트를 포함하는 단리된 서브틸리신 변이체:
   

   
6. 치환 G97A/G128A/Y217Q 를 포함하며 제 5 항의 하나 이상의 변형을 추가로 포함하고, 그 위치가 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는 서브틸리신 변이체.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 서브틸리신 변이체를 코딩하는 단리된 핵산.
8. 제 7 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
9. 제 6 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세정 조성물.
11. 제 10 항에 있어서, 세탁 세제인 세정 조성물.
12. 제 11 항에 있어서, 중질 액체 세탁 세제인 세탁 세제.
13. 제 10 항에 있어서, 식기 세제인 세정 조성물.
14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, β-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제 및 아밀라아제, 또는 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함하는 세정 조성물.
15. 제 10 항에 있어서, 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함하는 세정 조성물.
16. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 서브틸리신 변이체 0.0001 중량% 이상, 및 임의로 하나 이상의 적합한 보조 요소를 포함하는 세정 조성물.
17. 하기 단계를 포함하는 세정 방법:
    a) 섬유를 포함하는 물품 및/또는 표면을 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 세정 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 임의로 상기 물품 또는 표면을 세척 및/또는 헹구는 단계.
18. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 동물 사료.
19. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 식품 가공 조성물.