DE4231726A1 - Mutierte subtilisinartige Serinproteasen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Mutationen des Strukturgens von Subtilisin-Prote­ asen, die zu neuen Enzymen mit geänderter Aminosäuresequenz führen.

Subtilisin-Proteasen sind in der Natur verbreitet und werden in großem Umfang für zahlreiche technische Anwendungen eingesetzt. So beispielsweise als Waschmittelenzyme. Für viele dieser Anwendungen ist es gewünscht, die Stabilitätseigenschaften der Enzyme in bezug auf die jeweils geforderten Anwendungen zu verbessern. Eine Zusammenfassung derartiger Überlegungen geben J. A. Wells und D. A. Estell in TIBS (Trends in Biochemical Sciences), 13, Seite 291 ff (1988). Ein weiterer Übersichtsartikel, der praktisch alle bekannten Sequenzen und Strukturen von subtilisinähnlichen Serinproteasen zitiert, wurde von R. R. Siezen et al. in Protein Engineering, Vol. 4 (7), Seite 719 bis 737 (1991), veröffentlicht. Für den Anwendungsbereich Waschmittel spielt bei den Proteasen insbesondere die Stabilität gegen die irreversible Inaktivierung bei erhöhten Temperaturen eine Rolle. Wie in dem obengenannten Übersichtsartikel von J. A. Wells et al. ausgeführt, sind jedoch keine verläßlichen theoretischen Aussagen dar­ über möglich, durch welche Schritte sich die Temperaturstabilität verbes­ sern läßt. Wells et al beschreiben die Einführung von Disulfidbrücken, betonen aber, daß dadurch das Problem nicht gelöst werden konnte. Zur Ver­ besserung der Temperaturstabilität ist der Fachmann daher in erster Linie auf das Experiment angewiesen.

In der internationalen Anmeldung WO87/5050 werden clonierte Subtilisin Mutanten-Gene beansprucht, die für Subtilisinproteasen codieren sollen, welche bei höherer Temperatur aktiver als die entsprechenden Wildtypen sind. Die genannte internationale Anmeldung macht zahlreiche Vorschläge für Mutationen. So soll insbesondere in der Position 218 Asparagin durch eine andere Aminosäure ausgetauscht sein. Auch wird vorgeschlagen, in Position 188 Serin durch Prolin auszutauschen. Die internationale Anmel­ dung gibt jedoch keinen Hinweis darauf, ob dieser Serin durch Prolin-Aus­ tausch oder eine der vielen anderen dort genannten Maßnahmen tatsächlich mit dem Erfolg einer erhöhten Temperaturstabilität zu verknüpfen ist. In dem aus der genannten internationalen Anmeldung hervorgehenden Europapa­ tent EP 260 299 wird daher eine Mutation S188P nicht mehr beansprucht.

Die internationale Anmeldung WO89/6279 schlägt ebenfalls vor, die Eigen­ schaften von Subtilisin-Proteasen durch Austausch einzelner Aminosäuren zu verbessern. Es werden dort Änderungen an ca. 60 Aminosäuren des insgesamt ca. 275 Aminosäuren enthaltenen Moleküls vorgeschlagen. Eine der Vor­ schläge lautet dabei; in Position 194 irgendeinen Austausch durchzuführen. Außer in den genannten Anmeldungen werden auch noch in den folgenden An­ meldungen Vorschläge zur Änderung einzelner Aminosäure in Subtilisin- Proteasen gemacht: EP 130 756, EP 246 678, EP 247 667 und EP 251 446.

Vor dem Hintergrund dieses Standes der Technik war es Aufgabe der Erfin­ dung, einen Weg zu finden, die Aminosäuresequenz von Subtilisin-Proteasen so zu verändern, daß die Temperaturstabilität erhöht wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher eine subtilisinartige Serinprotease, hergestellt durch Mutation des Strukturgens eines Wildstammes und Expres­ sion des mutierten Strukturgens in einem Produktionsstamm, dadurch ge­ kennzeichnet, daß nach der BPN′-Zählung in Position 194 der Protease ein Glutaminsäurerest und gewünschtenfalls in Position 188 ein Prolinrest vorhanden ist.

Die Numerierung der auszutauschenden Positionen in den erfindungsgemäß mutierten Proteasen bezieht sich in jedem Falle auf die Protease BPN′-. Um von einer beliebigen anderen Serinprotease vom Subtilisintyp auf diese Numerierung zu kommen, wird der Fachmann die Aminosäuresequenz dieser Protease so unter die durchnumerierte Sequenz der Protease BPN′- legen, daß eine maximale Übereinstimmung erzielt wird. Dazu werden im Einzelfalle teilweise Auslassungen oder Einfügungen einzelner oder mehrerer Aminosäu­ ren nötig sein. Die Art der Numerierung ist in der bereits zitierten WO89/6279 beschrieben.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen mutierten Proteasen kann der Fach­ mann von einer großen Vielzahl von subtilisinartigen Serinproteasen aus­ gehen. So beispielsweise von den in den eingangs genannten Übersichtsar­ tikeln genannten oder aber auch von bereits mutierten Enzymen. Gängige subtilisinartige Serinproteasen sind beispielsweise Subtilisin BPN′-, Subtilisin Carlsberg oder auch die Subtilisine aus Bacillus lentus. Dem Fachmann ist klar, daß er zur Erzeugung von Clonen, die neue, mutierte Enzyme herstellen, nicht von dem Enzym selber ausgeht, sondern von dem dafür codierenden Strukturgen und dieses einer Mutagenese unterwirft und dann wieder in einen Produktionsstamm einsetzt.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist es besonders bevorzugt, von solchen Proteasen auszugehen, die in der Position 194 (alle Positionen nach BPN′-Zählung) die Aminosäure Alanin tragen, die dann erfindungsgemäß gegen Glutaminsäure ausgetauscht wird. Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird von solchen Proteasen ausgegangen, die in 194 die Ami­ nosäure Alanin und in 188 die Aminosäure Serin tragen, wobei ein Austausch A194E und S188P durchgeführt wird. Geeignete Ausgangsmaterialien für eine Mutation dieser Art sind beispielsweise Proteasen vom Typ Subtilisin Carlsberg und dessen Varianten. Unter diesen Varianten besonders bevorzugt ist eine Subtilisin Carlsberg-Variante mit einer Mutation N158S und S161N (BPN′-Zählung). Das Strukturgen einer derartigen Protease ist in der eu­ ropäischen Patentanmeldung EP 214 435 beschrieben.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung geht man von einer Protease aus Bacillus lentus aus. Geeignet sind neben Proteasen, die in der WO89/6279 beschrieben sind, auch insbesondere eine Protease, die in der WO91/02792, Fig. 29, beschrieben ist. In der Zählung, wie sie in der WO91/02792 vorgenommen wird, entspricht Aminosäure Serin in der Position 182 dem Serin 188 nach BPN′-Zählung. Dabei ist der Unterschied darauf zu­ rückzuführen, daß das dort beschriebene Protein einige Deletionen gegen­ über BPN′ enthält.

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Proteasemutanten hergestellt, die nach Subtilisin BPN′-Zählung die fol­ gende Aminosäuresequenz enthalten:
188P-189F-190S-191S-192V-193G-194E-195E-196L-197E-198V-199M. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung ist, daß diese Sequenz in eine Protease, wie sie in der WO91/02792 beschrieben ist, zwischen Position 181 und 194 eingefügt wird.

Die erfindungsgemäßen neue Proteasemutanten zeigen verbesserte Stabili­ täten. So werden die Halbwertszeiten der autoproteolytischen Degradation über einen weiten Temperaturbereich verlängert, wodurch zugleich Hitze und Lagerstabilität ansteigen. Die Verlängerung der Halbwertszeit wird dabei auch unter nicht physiologischen Bedingungen, das heißt zum Beispiel in Gegenwart von Komplexbildnern erreicht. Die erfindungsgemäßen Proteasen können mit Hilfe zahlreicher Methoden hergestellt werden. Bevorzugt sind die Methoden der Random-in vitro-Mutagenese (RIM) sowie der gerichteten Mutagenese. Die auf diesem Wege hergestellten geänderten Strukturgene können in üblicher Weise in bekannten Expressionssystemen exprimiert und produziert werden. Verwiesen sei hier beispielsweise auf die WO91/02792. Für die Expression in einem Produktionsstamm und auf die zuvor genannten Anmeldungen WO89/06279, EP 260 299, EP 130 756, EP 246 678, EP 247 647, EP 251 446.

Die erfindungsgemäßen Mutanten zeigen erhöhte Stabilität der Protease nicht nur bei ihrem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln, sondern sie können auch bei der Aufreinigung ohne zusätzlich Kühlung des Prozeßmediums großtechnisch hergestellt werden.

Beispiele Beispiel 1 1. Random-in-vitro-Mutagenese

Ausgegangen wurde von dem Strukturgen gemäß der europäischen Patentanmel­ dung EP 214 435 und dem dort genannten Expressionsvektor pC51. Diese Se­ quenz wurde zunächst durch gerichtet Mutation, die keinen Aminosäureaus­ tausch zur Folge hatte, an der Position 597 der Gensequenz von pC51 durch T nach G-Austausch mit der Restriktionsschnittstelle Narl versehen, das neue Plasmid heißt pAS1. Die Position 597 entspricht der Aminosäure Alanin in Position 200 nach BPN′-Zählung. Die Restriktion von pAS1 mit Narl und Pstl ergibt ein 142 bp langes Genfragment, das den Bereich der Subtili­ sin-Sequenz enthält, der für die schwache Calcium-Bindungsstelle des Moleküls codiert. Dieses doppelsträngige Genfragment wurde in vitro aus synthetischen Oligonukleotiden zusammengesetzt und als Genkassette be­ zeichnet.

Dargestellt ist die Gensequenz der stabileren S188P, A194E-Protease im Bereich des mutagenen Oligonukleotids III. Die Nukleotidsequenz ist den Konventionen entsprechend in 5′-3′-Richtung des Gens angegeben. Die ur­ sprünglichen Wildtyp-Nukleotide sind für jeden gefundenen Austausch über der Nukleotid-Sequenz angegeben. Für die Oligonukleotid-Synthese wurden dotierte (=verunreinigte) Phosporamidit-Lösungen verwendet. Die stabilere Protease geht auf ein Molekül des Oligonukleotids III des oberen Stranges (Fig. 1) zurück. Fig. 1 zeigt die Darstellung der synthetischen Kassette mit Unterteilung in die Oligonukleotide. Das mutagene Oligonukleotid III ist markiert. Die Aminosäuresequenz ist im Einbuchstabencode angegeben, ausgewählte Positionen sind numeriert. An mutierten Positionen außerhalb des Oligonukleotids III wurde das ursprüngliche Wildtypnukleotid oberhalb oder unterhalb des Austausches angegeben.

Während der Synthese der Oligonukleotid-Moleküle III wurden alle vier Phosphoramidit-Lösungen mit den jeweils drei übrigen Phosphoramiditen verunreinigt. Die Konzentration eines dotierenden Phosphoramidits in der Lösung betrug 2% der Konzentration des Wildtypnukleotids. Diese Dotierung war dazu geeignet, über die Oligonukleotid III-Sequenz durchschnittlich 1-2 Nukleotidaustausche pro synthetisiertem Molekül an beliebiger Position einzuführen. Alle übrigen Oligonukleotide (I, II, IV, V, VI) wurden größ­ tenteils mit Wildtypsequenz synthetisiert, an einigen wenigen Positionen wurden gerichtete Nukleotidaustausche eingefügt, durch die die Aminosäu­ resequenz nicht verändert wurde, aber geeignete Restriktionsschnittstellen eingefügt wurden. Diese Schnittstellen dienten nach Replikation der Kas­ sette als Reporterschnittstellen in folgenden Klonierungsschritten. In Abb. 1 sind die Nukleotide der Wildtypsequenz über oder unter der tatsächlich synthetisierten Sequenz angegeben. Aus Oligonukleotiden mit Wildtypsequenz und den mutierten Oligonukleotiden wurden der obere und untere Strang des Kassettenfragments zusammengesetzt und die Stränge hybridisiert. Für die Hybridisierung wurden 80pmol/Oligonukleotid einge­ setzt. Die entstandenen synthetischen Fragmente wurden mit Pstl und Narl nachgeschnitten, um eventuelle Multimere in die Monomere zu überführen. Die synthetischen Kassettenfragmente wurden durch Gelelution von den freien Oligonukleotiden gereinigt. 0,05 µg des eluierten Kassettenfrag­ ments wurden in 0,5 µg Pstl, Narl, Smal-geschnittenen, dephosphorylierten und aufgereinigten pUC19-Vektor einkloniert. Das gesamte Ligationsprodukt wurde in Escherichia coli XL-1 transformiert und die Transformanden in vier 250 ml-Kulturen amplifiziert. Aus den amplifizierten Escherichia coli-Kulturen wurden die Plasmide präpariert, die zu 50% Replikationsprodukte des oberen, mutagenen und zu 50% Replikationsprodukte des unteren Wildtypstranges waren. 40 µg der Plasmidpräparation wurden mit Xhol, Pstl und Narl geschnitten und die mu­ tagenen, amplifizierten Kassettenfragmente gelelektrophoretisch abge­ trennt. Wildtypfragmente wurden durch diese Behandlung zerschnitten und sind nicht mehr im Eluat enthalten. 0,08 µg der eluierten mutagenen Kas­ settenfragmente wurden in 1,7 µg des Expressionsvektors pAS1 einkloniert und in Aliquots von 0,25 µg/Ansatz in den Bacillus subtilis-Stamm DB104 transformiert. Dieser Stamm ist defizient in den genomischen und alka­ lischen Proteasen. Es exprimiert nur die plasmidcodierten Enzym-Varianten (Doi et al. (1986), Trends in Biotechnology 4, S. 232-235). Insgesamt wurden auf diese Weise 25 000 Klone pro Ansatz erzeugt. Die entstandene Mutantenbank wurde RIM2 genannt.

Die stabilisierten Protease-Varianten wurden durch Temperaturgradienten- Gelelektrophorese auf erhöhte Thermostabilität, i. e. erhöhte Autoproteo­ lyse-Stabilität und auf erhöhte Strukturstabilität, untersucht, für das Screening der Mutantenbank. Anwendbar ist auch die Methode der WO89/06279, Seite 24.

Die Pstl-Narl-Fragmente stabilisierter Protease-Varianten-Gene wurden zum Zwecke der leichteren Sequenzierung in den Escherichia coli-Vektor pUC19 kloniert. Aus der Mutantenbank werden 14 Klone selektioniert, die Proteasen mit erhöhter Temperaturstabilität exprimieren.

Dabei wurden typischerweise 2 µg des zu sequenzierenden Plasmids aus dem Bacillusklon der RIM2-Bank präpariert und mit Pstl und Narl geschnitten. Dabei wird das umzuklonierende Kassettenfragment herausgeschnitten. 0,006 µg des Kassettenfragments wurden in 0,055 µg des Escherichia coli-Vektors pUC19 ligiert und das Ligat in Escherichia coli XL-1 transformiert. Die Transformanden wurden amplifiziert und die Plasmide eines Klons aus einer 4 ml-Kultur präpariert. Diese Plasmide wurden für eine konventionelle Sequenzierungsreaktion eingesetzt, wobei die gesamte Pstl-Narl-Kassette sequenziert wurde. Dabei wurden der A194E und der S188P-Austausch festge­ stellt. Beispiel 1 zeigt die Nukleotid-Sequenz und die Aminosäuresequenz des A194E, S188P-Klons. Der A194E-Austausch wird für die erhöhte Thermo­ stabilität verantwortlich gemacht.

Beispiel 2

Für die Einführung des stabilisierenden Glutamatrestes an den entspre­ chenden Positionen verwandter Subtilisin-Gene, sowie für die Einführung der Sequenz gemäß Anspruch 3 stehen verschiedene Methoden der gerichteten Mutagenese zur Verfügung. Eine wegen ihrer hohen Effizienz bevorzugte Me­ thode ist die von Wells et al, Gene 34, 315-323, (1985) beschriebene Kassettenmutagenese analog Beispiel 1. Das zu mutierende Genfragment, das mit für die Klonierung geeigneten Restriktionsschnittstellen endet, wird in vitro aus synthetischen Oligonukleotiden zusammengesetzt. Im Falle ei­ ner gerichteten Mutagenese werden die gewünschten Nukleotid-Austausche während der Oligonukleotid-Synthese eingeführt. Bei jedem Austausch in Oligonukleotiden, die den oberen Strang bilden, werden die entsprechenden komplementären Austausche im unteren Strang ebenfalls eingeführt, so daß nach der Hybridisierung zum doppelsträngigen Fragment keine Fehlpaarungen entstehen.

Die synthetische Kassette wird über die endständigen Restriktionsschnitt­ stellen in den mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnittenen Ziel­ vektor einkloniert. Der geschnittene Zielvektor wird vom herausgeschnit­ tenen Wildtyp-Genfragment durch Gelelution abgetrennt. Für die gerichtete Mutagenese zur Einführung der Sequenz 188P-189F-190S-191S-192V-193G-194E-195E-196L-197E-198V-199M in das Gen der Protease gemäß internationaler Anmeldung WO91/02792 kann die in Beispiel 1 beschriebene Pstl-Narl-Kassette verwendet werden, die den gesamten Bereich der schwachen Calcium-Bindungsstelle umfaßt. Es müssen die folgenden Aus­ tausche vorgenommen werden: Q191S, Y192V, G195E, D197E, I198V, V199M. Zu­ gleich wird der stabilisierende Austausch A194E und der S188P-Austausch eingeführt. Da es sich um gerichtete Mutagenese handelt, kann das synthe­ tische Pstl-Narl-Fragment mit den eingeführten Mutationen direkt (d. h. ohne Amplifikation in Escherichia coli, wie für Random-Mutagenese notwen­ dig) in einen Bacillus-Vektor kloniert und in einen geeigneten Bacillus- Expressionsstamm transformiert werden.

Nachweis der Temperaturstabilität von Proteasemutanten 1. Methode

Angewandt wurde die senkrechte Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE). Diese Methode ist gekennzeichnet durch einen Temperaturgradienten der mittels einer Thermostatisierplatte senkrecht zur Auftrennungsrichtung der Probe an das Gel angelegt wird. Das 0,8 mm dicke 10%ige Polyacrylamidgel (20 cm × 20 cm) wurde auf Gelbond-Folie polymerisiert und auf die Thermostatisierplatte aus teflonbeschichtetem Aluminium aufgelegt.

Die Platte wurde mit Hilfe von kühlbaren Wasserthermostaten (Julabo) auf der einen Seite gekühlt, auf der anderen Seite erhitzt, so daß sich über die gesamte Breite ein linearer Temperaturgradient ausbilden konnte. Die Probe wurde in eine 13 cm lange, 0,3 cm breite Auftragstasche gegeben, die senkrecht zum Verlauf des Temperaturgradienten lag. Nach 90 min bei zu­ nächst gleichmäßiger Temperatur von 25°C wurde der Temperaturgradient angelegt (Ecktemperaturwahl je nach Anwendung, aber nicht höher als 80°C. Die Ecktemperaturen für diejenigen TGGEs, die die Stabilisierung durch den A194E-Austausch zeigen, betrugen 50°C und 70°C. Die Auftrennung bei an­ gelegtem Temperaturgradient erfolgte bei 350 V und limitierter Stromstärke von 110 mA für 30 min. Die Probe wanderte nunmehr an jeder Stelle des Gels gemäß der temperaturinduzierten Molekülkonformation. Als Standardgel und Elektrodenpuffer wurde 0,025 M KOH/Essigsäure, pH 5,0 benutzt. Ferner wurden 0,1 mMCaCl₂ im Gel und Elektrodenpuffer eingesetzt.

Für den direkten Vergleich zwischen zwei Proben (z. B. Wildtyp und Vari­ ante) in einer senkrechten TGGE wurden zwei Auftragstaschen untereinander (Abstand ca. 7 cm) benutzt. Der Nachweis der Protokonformationen erfolgte nach der Elektrophorese durch Aktivitäts- und Silberfärbung. Die Silber­ färbung wurde nach Blum et al (1987) durchgeführt, die Aktivitätsfärbung wurde durchgeführt, indem das Gel über Nacht in 0,2 µg/ml Alpha- Naphtylacetat, 0,5 µg/ml Fast-Red, 0,1 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 7,5 geschüttelt wurde. Die esterolytische Aktivität der nativen Protease- Konformation wird als roter Farbniederschlag sichtbar. Aktive Proben zei­ gen aufgrund der autoproteolytischen Reaktion, die während der thermischen Auffaltung der Moleküle auftritt, keine denaturierte Konformation. Nur die native und aktive Konformation ist bis zur Autoproteolyse-Temperatur im Gel nachweisbar. Der Strukturübergang von der nativen zur denaturierten Konformation kann nur nach Inhibition der Proteasen durch Inkubation in 1 mM Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid nachgewiesen werden. Der Verlauf des Temperaturgradienten wurde durch Anlegen eines Pt100-Meßwiderstandes an die Thermostatisierplatte nachgemessen.

Nach der genannten Methode wurden miteinander verglichen die Subtilisin Carlsberg-Variante gemäß EP 214 435 mit einer S188P-Mutation des Enzyms sowie mit einer S188P- und A194E-Mutation des Enzyms. Die beiden Mutanten sind durch gerichtete oder durch Zufalls-in-vitro-Mutagenese herstellbar. Die Strukturgene wurden nach allgemein bekannten Methoden in Expressions­ vektoren kloniert und in einem proteasefreien, allgemein zugänglichen Stamm exprimiert. Es wurden Kulturen des clonierten proteasefreien Stammes herangezogen und nach einer Fermentationsdauer von 24 Stunden 20 ml Kul­ turüberstand gewonnen und aufkonzentriert. Für die Temperaturgradienten­ gelelektrophorese wurden insgesamt 8 ml Kulturüberstand pro Protease-Typ in Centricon-10-Filtrationsröhrchen der Firma Amicon auf 300 µl eingeengt, mit 2 ml einer 0,1 mM CaCl₂-Lösung vermischt und erneut mit Centricon-10- Röhrchen auf 200 µl eingeengt. Dieser letzte Schritt ist ein Dialyse- Schritt, der für die Verringerung des Salzgehaltes der Probe essentiell ist, da diese nur dann einer Geelektrophorese unterzogen werden kann. Der Dialyse-Schritt wurde unmittelbar vor der Elektrophorese durchgeführt werden, da die dialysierte Probe nur wenige Stunden stabil ist. Die 300 µl der dialysierten Probe wurden mit 300 µl Elektrodenpuffer (siehe oben) verdünnt und in der TGGE analysiert.

Die Temperaturgradientengelelektrophorese hat das folgende Ergebnis ge­ bracht:

Die autoproteolytische Degradation der nachgewiesenen nativen Konformation setzte für den Subtilisin Carlsberg-Wildtyp (Variante N158S, S161N) und eine Protease, die nur den S188P-Austausch enthielt, bei der gleichen Temperatur (60,5°C) ein, während diese Degradationstemperatur für die S188P, A194E-Mutante um 1,5°C erhöht war. Anmerkung: Die Bestimmung der absoluten Degradationstemperatur gilt nur für die bereits angegebenen Lösungsbedingungen (d. h. pH 5 und 0,1 mM Calciumchlorid) der TGGE. Tabelle 1 faßt die Degradationstemperaturen zusammen:

Protease-Typ
Degradationstemperatur
Subtilisin Carlsberg|60,5°C
S188P-Variante des Wildtyps	60,5°C
S188P; A194E-Variante des Wildtyps	62,0°C

Claims (5)

1. Subtilisinartige Serinprotease, hergestellt durch Mutation des Struk­ turgens eines Wildstammes und Expression des mutierten Strukturgens in einem Produktionsstamm, dadurch gekennzeichnet, daß nach der BPN′- Zählung in Position 194 der Protease ein Glutaminsäurerest und gewünschtenfalls in Position 188 ein Prolinrest vorhanden ist.

2. Serinprotease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Mutation A194E, gewünschtenfalls in Kombination mit der Mutation S188P enthält.

3. Serinprotease nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Strukturelement 188P-189F-190S-191S-192V-193G-194E-195E-196L-197E-198V-199M enthält.

4. Serinprotease nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in den übrigen Resten mit Subtilisin Carlsberg oder einer Variante N158S und S161N von Subtilisin Carlsberg identisch ist.

5. Serinprotease nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in den übrigen Resten mit einer alkalischen Bacillus lentus Protease übereinstimmt.