DE69023101T2

DE69023101T2 - Bakterielles Kollagenase-Gen.

Info

Publication number: DE69023101T2
Application number: DE69023101T
Authority: DE
Inventors: Jun Fukushima; Kazuyuki Morihara; Kenji Okuda; Yuji Shibano
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1989-11-28
Filing date: 1990-11-27
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2010-11-28
Also published as: JPH03219880A; JP3022984B2; US5453371A; AU6698090A; DE69023101D1; CA2030929A1; DK0430635T3; EP0430635B1; ATE129287T1; AU629430B2; EP0430635A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein von Vibrio alginolyticus abgeleitetes Collagenase-Gen, einen rekombinanten Vektor, der das Gen beinhaltet, eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle und deren Verwendung.

Hintergrund der Erfindung

Collagen, das Bindegewebe von Tieren bildet, besteht aus drei Polypeptidketten, von denen jede Grundeinheit ein Molekulargewicht von etwa 95 000 hat. Diese Polypeptidketten bilden eine entgegen dem Uhrzeigersinn gewundene Triplexspiralstruktur. Die Amino- Säuresequenz jeder Polypeptidkette des Collagenmoleküls ist eine Wiederholung von Gly-Pro-X-Gly (wobei der hier verwendete Dreibuchstabencode zur Darstellung von Aminosäureresten den IUPAC- IUB-Standards entspricht und X verschiedene Aminosäurereste darstellt), und die Polypeptide sind intramolekular oder intermolekular miteinander vernetzt. Diese spezifische Spiralstruktur von Collagen führt zu zähen mechanischen Eigenschaften und chemischer Stabilität, und daher widersteht Collagen gewöhnlichen Proteasen, und nur eine Collagenase kann Collagen abbauen.
Eine Collagenase wirkt nicht auf gewöhnliche Proteine, sondern nur auf obiges Collagen oder sein modifiziertes Produkt Gelatine. Collagenasen werden von Mikroorganismen erzeugt, und von diesen Collagenasen ist die Untersuchung der Collagenase, die als Achromobacter-Collagenase bekannt ist und die von Vibrio alginolyticus cheinovar. iophagus abgeleitet ist, am meisten fortgeschritten. Es ist bekannt, daß diese Collagenase im Vergleich zu Collagenasen aus anderen Quellen eine höhere spezifische Aktivität hat [V. Keil-Dlouha und B. Keil, Biochim. Biophys. Acta, 522, 218-228 (1978)]. Achromobacter-Collagenase hat ein Molekulargewicht von 110 000 und ist bei pH 6 bis 7 stabil. Das pH-Optimum beträgt etwa pH 7,4. Die Collagenase, die durch EDTA und o-Phenanthrolin inaktiviert wird [V. Keil-Dlouha, Biochim. Biophys. Acta, 429, 239-251 (1976)], ist eine zinkhaltige Metalloprotease und spaltet das synthetische Substrat PZ-Pro- Leu-Gly-Pro-D-Arg zwischen Leu und Gly [B. Keil, A.M. Gilles, A. Lecroisey, N. Hurion und N.T. Tong, FEBS Lett., 56, 292-296 (1975); A. Lecroisey, V. Keil-Dlouha, D.R. Woods, D. Perrin und B. Keil, FEBS Lett., 59, 167-172 (1975); N.T. Tong, A. Tsugita und V. Keil-Dlouha, Biochim. Biophys. Acta, 874, 296-304 (1986)]. Ein Präparat mit Collagenase-Aktivität ist in EP-A-0 115 974 offenbart.
Im Hinblick auf die spezifische Eigenschaft einer Collagenase wurden verschiedene Verwendungen erwartet und verwirklicht. Zum Beispiel wird eine Collagenase zur Behandlung verschiedener Verletzungen von Substraten mit einer collagenreichen Struktur verwendet. Beispiele für solche Verletzungen sind Verbrennungen, Geschwüre, Schorf, weißer harter Schorf auf Collagenbasis, Keloid, Nekrose, insbesondere Nekrose durch Dekubitus oder Geschwüre, und dergleichen.
Eine Collagenase wird auch zur Behandlung von Zahnkaries verwendet. Das Zahnmark besteht hauptsächlich aus einem dichten kalkartigen Material und Collagen. Im Falle von Zahnkaries bekommt ein Zahn Risse, oder es entsteht ein Loch, und Calcium wird daraus ausgewaschen. Entsprechend geht das kalkartige Material verloren, und das verbleibende Gerüst wird porös und neigt dazu, eine Brutstätte für bakterielle Infektionen zu werden. Da eine Collagenase jedoch das poröse Collagen auflöst, kann die Brutstätte durch Waschen mit Wasser entfernt werden. Eine Collagenase wirkt nicht auf gesundes kalkhaltiges Collagen.
Außerdem kann eine Collagenase als Mittel zum Zartmachen von Fleisch verwendet werden. Die Zähigkeit von Fleisch wird hauptsächlich durch Sehnen verursacht, deren Hauptbestandteil Collagen ist. Proteasen, wie Papain und dergleichen, werden verwendet, um Fleisch durch Abbau der Sehnen zart zu machen. Collagen wird jedoch von normalen Proteasen kaum abgebaut. Andererseits bauen nichtspezifische Proteasen, wie Papain, auch Proteine wie Actin, Myosin und dergleichen ab, die einen großen Einfluß auf die Struktur des Fleisches haben. Daher wird die Struktur von Fleisch durch Behandlung mit Papain zerstört. Da Collagenase nur Collagen abbaut, das das Fleisch zäh macht, andere Proteine, die einen großen Einfluß auf die Struktur des Fleisches haben, jedoch nicht abbaut, ist das Enzym in dieser Hinsicht eine Protease, die als Mittel zum Zartmachen von Fleisch am besten geeignet ist.
Bei der Verwendung einer Collagenase für die obigen Zwecke besteht das Problem, daß es sehr schwierig ist, eine Collagenase kostengünstig zu erhalten. Um Achromobacter-Collagenase zu erhalten, wird nämlich ihr Erzeuger Vibrio alginolyticus kultiviert, und die Collagenase wird aus der Kulturlösung gewonnen und gereinigt. Dabei gibt es jedoch das Problem, daß die Erzeugerausbeute an Collagenase sehr gering ist, wie 10 mg/Liter. Weiterhin gibt es noch das Problem, daß der Erzeuger nur dann Collagenase erzeugt, wenn eine bestimmte spezifische induzierende Substanz zu dem Kulturmedium gegeben wird. Es ist also sehr schwierig, die Collagenase kostengünstig in großer Menge zu erhalten.
Zwar ist es möglich, diese Probleme mit Hilfe der Gentechnik zu lösen, es steht jedoch noch kein Gen für die Achromobacter- Collagenase zur Verfügung. Daher kann keine Gentechnik eingesetzt werden, um das Enzym in großer Menge zu erzeugen.

Ziele der Erfindung

Die Erfinder haben eingehende Untersuchungen vorgenommen, um diese Probleme zu lösen. Als Ergebnis haben die Erfinder erfolgreich ein Gen von Achromobacter-Collagenase erhalten und ihre Aminosäuresequenz aufgeklärt, wodurch es möglich ist, Achromobacter-Collagenase in einem geeigneten Wirt in großer Menge zu erzeugen und eine Collagenase gentechnisch zu verbessern.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Gen von Achromobacter-Collagenase bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen rekombinanten Vektor bereitzustellen, der das Gen der Achromobacter-Collagenase enthält.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Achromobacter-Collagenase unter Verwendung der Wirtszelle bereitzustellen.
Diese Ziele sowie weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung kann der Fachmann der folgenden Beschreibung entnehmen, die auf die Begleitzeichnungen Bezug nimmt.

Kurze Erklärung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Restriktionskarte eines DNA-Fragments von 7,0 kb, das das Collagenase-Gen der vorliegenden Erfindung enthält und das Plasmid pLCO-1 aufbaut. In Fig. 1 stellt der Pfeil am unteren Teil den Collagenase-Strukturgenbereich sowie die Transcriptionsrichtung dar. Die Zahl in Klammern ist die Nummer der Base. Eine gestrichelte Linie bedeutet, daß die Restriktionsspaltungsstelle zwischen den beiden Stellen nicht genauer angegeben werden kann.
Fig. 2 ist die gesamte DNA-Basensequenz eines DNA-Fragments, das das Collagenase-Gen enthält, und eine aus der Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz der Collagenase. In Fig. 2 stellen die mit der durchgezogenen Linie unterstrichenen Bereiche die Teile dar, die der partiellen Aminosäuresequenz (siehe Beispiel 3 unten) der gereinigten Collagenase entsprechen.
Fig. 3 zeigt ein analytisches Ergebnis vom Western-Blotting eines in Escherichia coli erzeugten Collagenase-Gen-Produkts. In Fig. 3 stellen die Pfeile die Wanderungspositionen von Markern mit verschiedenen Molekulargewichten dar, die gleichzeitig dem Western-Blotting unterworfen worden waren.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Collagenase-Gen bereitgestellt, das von Bakterien der Spezies Vibrio alginolyticus abgeleitet ist und durch die in Figur 1 gezeigte Restriktionskarte dargestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinanten Vektor, der das obige Gen der vorliegenden Erfindung enthält, und eine mit einem Plasmid, das das Gen der vorliegenden Erfindung enthält, transformierte Wirtszelle bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Collagenase bereit, das das Kultivieren der Wirtszellen unter Bildungg der Collagenase und die Gewinnung der so gebildeten Collagenase aus den Zellen oder der Kulturlösung umfaßt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Bakterien der Species Vibrio alginolyticus, die zum Erhalten des Collagenase-Gens der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, sind nicht spezifisch eingeschränkt, und jeder bekannte Erzeuger von Achromobacter-Collagenase kann verwendet werden, zum Beispiel Vibrio alginolyticus, das von I. Emonto et al. in Int. J. Syst. Bacteriol., 33, 451-459, 1983, offenbart ist. Weiterhin können die Isolierung einer bakteriellen DNA, die Herstellung einer Genbank und deren Durchmusterung nach den herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, wie es in den Beispielen unten gezeigt ist.
Als Wirtszellen können Escherichia coli, Bacillus subtilis und dergleichen verwendet werden. Als Vektoren können pUC18, pUC19, pBR322, pGEM3, pGEM4 und dergleichen, die sich in Escherichia coli replizieren lassen, sowie pUB110, pE194, pC194 und dergleichen, die sich in Bacillus subtilis replizieren lassen, verwendet werden.
Um unter Verwendung der mit dem Plasmid, das das so erhaltene Collagenase-Gen enthält, transformierten Wirtszelle eine Collagenase zu erzeugen, werden die Zellen zum Beispiel nach dem von A. Lecroisey et al. in FEBS Lett., 59, 167-172, 1975, beschriebenen Verfahren in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert, das geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Spuren metallischer Elemente enthält. Die resultierende Kultur wird nach dem herkömmlichen Verfahren gewonnen, und der Überstand der Kultur wird einer Ammoniumsulfatfällung unterzogen (60% gesättigt). Dann wird das Enzym durch Chromatographie, zum Beispiel DEAE-Säulenchromatographie, Sephadex-G-100-Säulenchromatographie und dergleichen, gereinigt, um die gewünschte Collagenase zu erhalten.
Die so erhaltene Collagenase kann in derselben Weise wie bekannte Collagenasen verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung im Einzelnen weiter, sollen jedoch nicht als deren Umfang einschränkend angesehen werden.

Beispiel 1

Herstellung einer Genbank

Nach dem herkömmlichen Verfahren [z.B. Saito-Miura-Verfahren (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963) usw.] wurde die gesamte DNA aus einem Erzeuger von Achromobacter- Collagenase isoliert, und zwar Vibrio alginolyticus, das von der National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) erhalten wurde [VIBRIO ALGINOLYTICUS SUBSP. IOPHAGUS AL, 11038 R.L. Welton/South African cured hides/(62SC)]. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3Al partiell gespalten und durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ein DNA-Fragment von 5 kb oder mehr zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde mit T4-Ligase an den mit BamH1 behandelten Vektor pUC18 ligasiert. Escherichia coli JM101 wurde nach dem herkömmlichen Verfahren (z.B. M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 154, 1970) mit dem resultierenden Ligasierungsgemisch transformiert, um eine Genbank von Vibrio alginolyticus als ampicillinresistente Transformante zu erhalten.

Beispiel 2

Durchmusterung der Genbank

Um eine Transformante auszuwählen, die die Collagenase erzeugt, wurde Achromobacter-Collagenase-Antikörper nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellt [z.B. Zoku-Seikagaku Zikken Ho (Methods of Biochemical Experiments Second Series), herausgegeben von der Biochemical Society of Japan, Vol. 5, S. 1 bis 25, 1986]. Eine gereinigte Collagenase (1 mg) wurde nämlich mit Freunds unvollständigem Adjuvans gemischt, und ein Kaninchen wurde durch subcutanes Injizieren des Gemischs immunisiert. Weiterhin wurde dieselbe Operation 3 Wochen lang einmal pro Woche wiederholt, um die Immunisierung aufzufrischen. In der vierten Woche wurde Vollblut entnommen, und eine IGG-Fraktion wurde durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat hergestellt. Der Antikörper wurde nach einem bekannten Verfahren, wie dem Natriumperiodatverfahren [Meneki Zikkensosa Ho (Methods for Immunological Experiments) VI, herausgegeben von der Immunological Society of Japan, S. 1835] mit Peroxidase markiert.
Der so erhaltene, mit dem Enzym markierte Anti-Collagenase-Antikörper wurde zur Auswahl von Klonen, die ein Antigen exprimierten, das mit dem Antikörper reagieren konnte, aus der oben hergestellten Genbank verwendet, um Plasmide pLCO-1, pLCO-2 und pLCO-3 zu erhalten.
In das Plasmid pLCO-1 ist ein DNA-Fragment mit etwa 7,0 kb eingefügt, das von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist. Die Restriktionskarte des in pLCO-1 eingefügten DNA-Fragments ist in Fig. 1 gezeigt.
Weiterhin wurde Escherichia coli JM101, das das Plasmid pLCO-1 enthält, als Escherichia coli SAM 1514 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRL), gemäß dem Budapester Abkommen vom 22. November 1989 unter der Zugriffsnummer FERM BP-3113 hinterlegt.

Beispiel 3

Bestimmung der Aminosäuresequenz

Partielle Aminosäuresequenzen von Achromobacter-Collagenase wurden wie folgt bestimmt:
Gereinigte Achromobacter-Collagenase wurde nach dem herkömmlichen Verfahren (z.B. Zoku-Seikagaku Zikken Ho, Vol. 2, S. 260-270, herausgegeben von der Biochemical Society of Japan) mit Trypsin bzw. Protease V8 partiell hydrolysiert. Die so erhaltenen Peptidfragmente wurden mit HPLC gereinigt, und dann wurden ihre Aminosäuresequenzen durch ein automatisches Edman-Abbauverfahren bestimmt.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Achromobacter-Collagenase der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenzen der folgenden 20 Peptidfragmente hat.
Dabei ist A Alanin, C Cystein, D Asparaginsäure, E Glutaminsäure, F Phenylalanin, G Glycin, H Histidin, I Isoleucin, K Lysin, L Leucin, M Methionin, N Asparagin, P Prolin, Q Glutamin, R Arginin, S Serin, T Threonin, V Valin, W Tryptophan und Y Tyrosin.

Beispiel 4

Bestimmung der DNA-Basensequenz

Die Basensequenz des 4,1-kb-Fragments in dem 7,0-kb-DNA-Fragment, das das Plasmid pLCO-1 bildet, wurde wie folgt bestimmt:
Das Plasmid pLCO-1 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, um DNA-Fragmente mit etwa 500 bp herzustellen. Die Fragmente wurden in Phage M13 einkloniert, und die DNA-Basensequenzen jeder rekombinanten Phagen-DNA wurden nach dem Didesoxyverfahren bestimmt (F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5963-5967, 1977). Eine DNA-Basensequenz von etwa 4 kb wurde bestimmt, indem nan die jeweiligen Sequenzen von DNA-Fragmenten zusammenfügte.
Die so bestimmte DNA-Basensequenz ist in Fig. 2 gezeigt. Die DNA- Basensequenz besteht aus 4054 Basenpaaren, und der gesamte Bereich des Achromobacter-Collagenase-Gens ist darin enthalten. Wie man aus Fig. 2 erkennt, gibt es ein der Collagenase entsprechendes offenes Leseraster, das aus 2442 Basenpaaren besteht und vom ATG der Basennummern 1337 bis 1339 gestartet wird und durch TAG der Basennummern 3779 bis 3781 in der DNA-Sequenz abgebrochen wird. Der Ribosomenbindung sbereich (GAAGAAA) befindet sich 5 bp vor dem ATG-Startcodon.
Als die von der so bestimmten DNA-Basensequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den in Beispiel 3 bestimmten partiellen Aminosäuresequenzen verglichen wurden, stimmten die folgenden 20 Aminosäuresequenzen miteinander überein.

Beispiel 5

Analyse des Genprodukts

Ein rekombinantes Plasmid für die Massenproduktion des Collagenase-Gens in Escherichia coli wurde hergestellt.
BamHI-Linker wurde bei der Base Nummer 1213 des 7-kb-DNA- Fragments, das das Plasmid pLCO-1 bildet, in einen HpaI-Bereich eingesetzt, und SAlI-Linker wurde bei der Base Nummer 3936 des DNA-Fragments in einen EcoRV-Bereich eingesetzt. Das resultierende pLCO-1, das diese beiden Linker enthielt, wurde mit BamHI und SAlI gespalten, wobei man ein 2,7-kb-DNA-Fragment erhielt, das das gesamte Coliagenase-Gen enthielt. Das DNA-Fragment wurde gewonnen und in einen BamHI/SalI-Bereich des Vektors pUC18 eingesetzt, um ein rekombinantes plasmid pHUC14 zu erhalten. Escherichia coli JM109 wurde mit dem rekombinanten Plasmid pHUC14 transformiert, um ein rekombinantes Escherichia coli für die Massenerzeugung der Collagenase zu erhalten.
Das in dem rekombinanten Escherichia coli erzeugte Achromobacter- Collagenase-Genprodukt wurde durch Elektrophorese und Western- Blotting analysiert. Das Western-Blotting wurde nach einem modifizierten Burnette-Verfahren durchgeführt [Burnette, W.N., Anal. Biochem., 112, 680-685 (1981)].
Das rekombinante Escherichia coli, das das Collagenase-Gen enthielt, wurde 17 Stunden bei 37ºC in L-Nährlösung kultiviert, die 1 mM IPTG enthielt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und mit Ultraschall aufgebrochen. Die mit Ultraschall behandelte Zellsuspension wurde durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese fraktioniert. Das so fraktionierte Protein wurde durch Western-Blotting auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, und nur die Farbe der Banden der Collagenase wurden mit einem Anti- Collagenase-Antikörper von einem Kaninchen und einem Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, der in derselben Weise wie oben beschrieben mit Peroxidase markiert war, entwickelt. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurden in Escherichia coli JM109, das pHUC14 enthielt, viele Banden beobachtet, die mit dem Anti-Collagenase-Antikörper reagierten und hauptsächlich aus Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 85 kd bestanden. In Escherichia coli JM109, das pLCO-1 enthielt, wurde ebenfalls Protein beobachtet, das mit dem Anti-Collagenase-Antikörper reagierte, jedoch war seine Menge sehr klein. Andererseits wurde in Escherichia coli JM109, das kein rekombinantes Plasmid enthielt und als Kontrolle verwendet wurde, kein Protein beobachtet, das mit dem Anti-Collagenase- Antikörper reagierte.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Protein, das ein immunologisches Äquivalent zu Achromobacter-Collagenase darstellt, in Escherichia coli JM109, das das rekombinante Plasmid pLCO-1 oder pHUC14 enthält, erzeugt wird, und daß eine große Menge des Proteins in Escherichia coli erzeugt wird, das das rekombinante Plasmid pHUC14 enthält.

Beispiel 6

Collagenase-Aktivität der Transformante

Die Collagenase-Aktivität von Escherichia coli, das das Achromobacter-Collagenase-Gen enthält, wurde unter Verwendung des synthetischen Substrats 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-L-Pro-Leu- Gly-L-Pro-D-ArgHCl (PZ-PLGPR) gemessen.
Die Messung der Collagenase-Aktivität und die Definition der Aktivitätseinheit (E) sind in der Internationalen Veröffentlichung WO 84/02653 offenbart.
Die mit Ultraschall behandelte Zellösung wurde in derselben Weise wie in Beispiel 5 offenbart hergestellt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde in Escherichia coli JM109, das das Plasmid pHUC14 enthält, eine Collagenase-Aktivität beobachtet. Keine Aktivität wurde in Escherichia coli JM109 beobachtet, das das Plasmid pLCO-1 oder kein Plasmid enthält.
In Anbetracht dieser Ergebnisse ist es klar, daß das Genprodukt in dem rekombinanten Escherichia coli, das das Collagenase-Gen enthält, eine Collagenase-Aktivität besitzt. Obwohl in Escherichia coli, das das Plasmid pLCO-1 enthält, keine Collagenase-Aktivität beobachtet wurde, ist dies wohl auf ein niedriges Expressionsniveau zurückzuführen. Tabelle 1 Collagenase-Aktivität von rekombinantem Escherichia coli Plasmid keines Collagenase-Aktivität Anmerkung: "Plasmid" bedeutet Escherichia coli JM109, das das entsprechende Plasmid enthält.

Sequenzlisting

SEQ ID NO: 1
Sequenztyp: Nucleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge: 4054 Basenpaare
Strangform: einzel
Topologie: linear
Molekültyp: genomische DNA
Ursprüngliche Herkunft
Organismus: Vibrio alginolyticus
Merkmale: von bp 1337 bis 3781 (offenes Leseraster)
Eigenschaften: bakterielles Collagenase-Gen

Claims

1. Gen, das für eine Collagenase codiert, die von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist und durch die in Figur 1 gezeigte Restriktionskarte dargestellt wird.

2. Gen, das für eine Collagenase codiert, die von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist und durch das in der Restriktionskarte von Figur 1 gezeigte 2,7-kb-HpaI-EcoRV-Fragment erhältlich ist.

3. Gen, das für eine Collagenase codiert, die von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist, gemäß Anspruch 2, wobei das Gen eine DNA-Sequenz der Formel (III) umfaßt:

wobei Z fehlt oder eine DNA-Sequenz der Formel (IV) ist:

4. Rekombinanter Vektor, der ein Gen, das für eine Collagenase codiert, die von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist, gemäß Anspruch 2 umfaßt.

5. Wirtszelle, die mit einem Plasmid transformiert ist, das ein Gen, das für eine Collagenase codiert, die von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist, gemäß Anspruch 2 umfaßt.

6. Verfahren zur Herstellung einer Collagenase, die von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist, das das Kultivieren der Wirtszellen gemäß Anspruch 5, um die Collagenase zu exprimieren, sowie das Gewinnen und Reinigen der exprimierten Collagenase umfaßt.

7. Gen, das für eine Aminosäuresequenz einer Collagenase codiert, die eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch die Formel (I) dargestellt wird:

wobei X Wasserstoff oder ein Polypeptid der Formel (II) ist:

wobei A Alanin ist, C Cystein ist, D Asparaginsäure ist, E Glutaminsäure ist, F Phenylalanin ist, G Glycin ist, H Histidin ist, I Isoleucin ist, K Lysin ist, L Leucin ist, M Methionin ist, N Asparagin ist, P Prolin ist, Q Glutamin ist, R Arginin ist, S Serin ist, T Threonin ist, V Valin ist, W Tryptophan ist und Y Tyrosin ist.

8. Rekombinanter Vektor, der ein Collagenase-Gen, das von Vibrio algnolyticus abgeleitet ist, gemäß Anspruch 7 umfaßt.

9. Wirtszelle, die mit einem Plasmid transformiert ist, das ein Collagenase-Gen, das von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist, gemäß Anspruch 7 umfaßt.

10. Verfahren zur Herstellung einer Collagenase, das das Kultivieren der Wirtszellen gemäß Anspruch 9, um die Collagenase zu erzeugen, sowie das Gewinnen der so erzeugten Collagenase aus den Zellen oder der Kulturlösung umfaßt.

11. Verfahren zur Herstellung einer Collagenase, die von Vibrio alginolyticus abgeleitet ist, umfassend:

Insertieren von BamHI-Linker in die HpaI-Stelle bei der Base Nr. 1213 auf einem DNA-Fragment mit 7 kb, das das Plasmid pLCO-1 von Escherichia coli JM 101 (FERM BP-3113) bildet, und Insertieren von SAlI-Linker in die EcoRV-Stelle bei der Base Nr. 3936 auf dem DNA-Fragment;

Spalten des pLCO-1, das die beiden Linker enthält, mit BamHI und SalI, wobei man ein DNA-Fragment von 2,7 kb erhält, das ein gesamtes Collagenase-Gen enthält;

Insertieren des DNA-Fragments in den BamHI/SalI-Bereich eines Vektors, wobei man ein rekombinantes Plasmid erhält, und Transformieren von Escherichia coli mit dem rekombinanten Plasmid, um Wirtszellen zu erhalten;

Kultivieren der Wirtszellen, um die Collagenase zu erzeugen; sowie

Gewinnen der so erzeugten Collagenase aus den Zellen oder der Kulturlösung.