JPH03219880A

JPH03219880A - 細菌コラゲナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH03219880A
Application number: JP2244562A
Authority: JP
Inventors: Yuji Shibano; 裕次柴野; Kazuyuki Morihara; 森原　和之; Kenji Okuda; 研爾奥田; Atsushi Fukushima; 淳福島
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1989-11-28
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1991-09-27
Anticipated expiration: 2015-03-21
Also published as: EP0430635A1; DE69023101T2; AU629430B2; DE69023101D1; CA2030929A1; AU6698090A; EP0430635B1; US5453371A; ATE129287T1; JP3022984B2; DK0430635T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ビブリオ・アルギノリティカス由来のコラゲ
ナーゼ遺伝子、該遺伝子が組み込まれた組換えベクター
、該ベクターにより形質転換された宿主細胞およびその
利用に関する。

（従来の技術）動物の結合組織を構成するコラーゲンは、基本単位とし
てそれぞれ約９　５．０　０　０の分子量をもつ３本の
ポリペブチド鎖からなり、左回りの三重らせん構造を有
する。コラーゲン分子を構成する各ペプチドのアミノ酸
配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ　　ＸＧｌｙ（Ｘは種々のアミノ
酸残基を示す）の繰返しであり、各ペブチドは分子内ま
たは分子間で架僑されている。このようなコラーゲン特
有のらせん構造は、強靭な機械的性質と化学的安定性を
もたらし、それ故、コラーゲンは通常のプロテアゼに対
して抵抗性を示し、コラゲナーゼによってのみ分解され
る。

コラゲナーゼは通常のタンパク質には作用せず、上記コ
ラーゲンあるいはその変性物であるゼラチンに対しての
み作用する。微生物の生産する数種のコラゲナーゼの内
、最も研究が進んでいるのは、アクロモバクタ−・コラ
ゲナーゼとして知られているビブリオ・アルギノリティ
カス・ケモバル・イオファガス（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｌｇ
ｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｃｈｅｍｏｖａｒｉｏｐｈａｇ
ｕｓ）由来のコラゲナーゼで、他起源のコラゲナーゼに
比較して特異的活性の高いことが知られている［ブイ・
カイルードロウハおよびビイ・カイル、バイオケミ力・
バイオフィジカ・アクタ（Ｖ、　Ｋｅｉｌ−Ｄｌｏｕｈ
ａ　ａｎｄ　Ｂ、Ｋｅｉｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）　、　５２２．２１８−２２８　（１９７８
）］　。］アクロモバクターコラゲナーゼは分子量１１
０．０００、至適ｐＨ７，４、安定ｐＨ６〜７で、ＥＤ
ＴＡ。

０−７エナンスロリンによって活性が消失する亜鉛を含
む金属プロテアーゼであり　［ブイ・カイルドロウハ、
バイオケミ力・バイオフィジカ・アクタ（Ｖ、　Ｋｅｉ
ｌ−Ｄｌｏｕｈａ、　　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ａｃｔａ）、４２９．２３９−２５１　（１９
７６）］　、合成基質ＰＺ−Ｐｒ。

Ｌｅｕ−Ｇａｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｒｇをＬｅｕ−、Ｇａ
ｙの間で切断する［ビイ・カイルら、ＦＥＢＳレター（
Ｂ、　Ｋｅｉｌ、　Ａ、Ｍ、　Ｇ１１ｌｅｓ、　Ａ。

Ｌｅｃｒｏｉｓｅｙ、Ｎ、　Ｈｕｒｉｏｎ、　Ｎ、Ｔ、
　Ｔｏｎｇ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）。

５６、２９２−２９６　（１９７５）　；　　エイ・レ
コロイジーら、ＦＥＢＳレター（Ａ、　Ｌｅｃｒｏｉｓ
ｅｙ、　Ｖ、　Ｋｅｉｌ−ＤｌｏｕｈａＤ、Ｒ，Ｗｏｏ
ｄｓ　　Ｄ、　Ｐｅｒｒｉｎ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｋｅｉｌ
、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）５９．１６７−１７２　（
１９７５）；　エヌ・ティ・トンら、バイオケミ力・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｎ、Ｔ。

Ｔｏｎｇ、Ａ、　Ｔｓｕｇｉｔａ、　Ｖ、Ｋｅｉｌ−Ｄ
ｌｏｕｈａ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、　８７４．２９６−３０
４　（１９８６）］。

かかるコラゲナーゼの特異的な性質を利用して種々の用
途が期待され、実際に使用されている。

たとえば、コラーゲンに富む構造の無制限な基質が生し
る種々の傷に使用される。治療できる傷の例として、火
傷、潰瘍、痴皮、コラーゲンベースの白色硬痴、ケロイ
ド、壊死とくに臥位または潰瘍による壊死がある。

虫歯の治療にも使用される。すなわち元軸は主として緻
密な石灰質とコラーゲンから成り、虫歯では歯にヒビが
入るかまたは穴が開き、そこからカルノウムが漏出する
。このため、石灰質が除去されて残ったフレームは多孔
性になり細菌感染等の温床になり易いが、コラゲナーゼ
は多孔性コラーゲンを溶解するので、水洗により除去で
きる。

健康な石灰質コラーゲンにはコラゲナーゼは作用しない
。

その他、肉質軟化剤としても使用できる。食肉の硬さの
原因は、コラーゲンを主成分とする鍵による。この牌を
分解することによって肉質を軟化するために、パパイン
などのプロテアーゼが使用される。しかし、コラーゲン
は通常のプロテアーゼではほとんど分解されないし、パ
パイン等の非特異的プロテアーゼは食肉のテクスチュア
ーに重要なアクチン、ミオシン等のタンパク質も分解す
るので、パパイン処理によって食肉のテクスチュアーも
消失してしまう。この点で、コラゲナーゼは食肉中の硬
さの原因であるコラーゲンだけを特異的に分解し、その
他食肉のテクスチュアーに重要なタンパク質は分解しな
いので食肉軟化剤として最も適したプロテアーゼである
。

（発明が解決しようとする課題）上記のような目的にコラゲナーゼを使用するにあたって
は、コラゲナーゼの安価な取得が困難であるという問題
がある。アクロモバクタ−・コラゲナーゼを取得するた
めには、その生産菌であるビブリオ・アルギノリティカ
スを培養し、その培養液よりコラゲナーゼを回収・精製
するが、当該細菌のコラゲナーゼ生産量が１０ｍｇ／ｆ
ｆと著しく低いことが問題である。また、当該細菌を培
養するに際して、特別な誘導物質を培養液に添加しなけ
れば当該細菌はコラゲナーゼを生産しないという問題も
ある。このような理由から、コラゲナゼを大量に安価に
取得することが困難となっている。

これらの問題を解決するために、遺伝子工学技術を利用
することができるが、当該アクロモバクタ−・コラゲナ
ーゼの遺伝子は取得されておらず、当該酵素を大量に生
産すべき、遺伝子工学的手段を講じることができない状
況にあった。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、これらの問題を解決すべく鋭意研究を重
ねた結果、ビブリオ・アルギノリティカス出来のアクロ
モバクタ−・コラゲナーゼの遺伝子を取得し、そのアミ
ノ酸配列を明らかにすることに成功し、本発明を完成す
るに至った。これより、アクロモバクタ−・コラゲナー
ゼを、例えば適当な宿主で大量に生産することや、コラ
ゲナーゼを遺伝子工学的手法により改良することなどの
手段が講じられるようになった。

すなわち、本発明は、ビブリオ・アルギノリティカス（
Ｖ　１ｂｒｉｏ　ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）に属す
る細菌由来のコラゲナーゼ遺伝子、該遺伝子またはそれ
と生物学的に実質的に同等な遺伝子を含有する組換えベ
クター、該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た宿主細胞、該細胞を培養して得られるコラゲナーゼの
製造法を提供するものである。

本発明のコラゲナーゼ遺伝子の取得に用いるビブリオ・
アルギノリティカスは特に限定するものではなく、アク
ロバクター・コラゲナーゼ生産菌として公知のものいず
れでもよく、例えば、アイ・エモントら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジ−（１゜ＥｍｏｎＬｏ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｉｎ
ｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、３
３．４５１−４５９．１９８３に記載されるビブリオ・
アルギノリティカスを用いることができる。また、細菌
ＤＮＡの単離、遺伝子ライブラリーの作製、スクリーニ
ングは公知の方法によって行なうことができる。

宿主細胞としては、エシェリヒア・コリ（Ｅ　ｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ−ｃｏｌ　ｉ）やバチルス−ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）を用いることがで
き、ベクターとしては、エシェリヒア・コリ内で複製で
きるｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ
３、ｐＧＥＭ４など、バチルス・ズブチリス内で複製で
きるｐＵＢｌｌｏＳ　ｐＥ１９４、ｐＣ１９４などが使
用できる。

得られたコラゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドで形
質転換された宿主細胞を用いてコラゲナーゼを製造する
には、例えば、エイ・レクロイジら、ＦＥＢＳレターズ
（Ａ、Ｌｅｃｒｏｉｓｅｙ　ｅｔ　ａｔ。

Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｌ　ｅｔｔ、）、５９．１６７−１７
２．１９７５に記載される方法に従って、適当な炭素源
、窒素源および微量の金属元素を含む培地中で、該細胞
を培養することにより行なえる。得られた培養物を回収
し、培養上清を硫安沈澱（６０％飽和）処理し、種々の
カラムクロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥセルロー
スカラムクロマトグラフィーおよびセファデンクスＧ−
１００カラムクロマトグラフィーなど）を用いて精製す
ることにより、所望のコラゲナーゼが得られる。

得られたコラゲナーゼは、従来のものと同様な用途に使
用できる。

（実施例）以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１遺伝子ライブラリーの作製アクロモバクタ−・コラゲナーゼ生産菌ビブリオ・アル
ギノリティカスから常法により全ＤＮＡを単離した。細
菌ＤＮＡの単離法としては、例えば、サイトウ・ミウラ
法［エイチ・サイトウおよびケイ・ミウラ、バイオシミ
力・バイオロジー・アクタ（ｌ（，５ａｉｔｏ　ａｎｄ
　Ｋ、Ｍｉｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
。

Ａｃｔａ、）、　７２．６１９．１９６３］等が挙げら
れる。このＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩで部分分解し
、アガロースゲル電気泳動法により分画し、５ｋｂ以上
のＤＮＡ断片をを集めた。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨ
Ｉ処理したベクターｐＴＪｃ　ｌ　８とＴ４リガーゼで
結合し、エシェリヒア・コリＪＭＩＯ１を形質転換して
、アンピシリン耐性形質転換体としてビブリオ・アルギ
ノリティカスの遺伝子ライブラリーを作製した。エシェ
リヒア・コリの形質転換は常法［例えば、エム・マンデ
ルおよびエイ・ヒガ、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｍ、Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄ　Ａ、Ｉ（
ｉｇａ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

５３、　ｔｓｌ、　１９７０）を用いた。

実施例２遺伝子ライブラリーのスクリーニング形質転換体を選択するために、アクロモバクタ−・コラ
ゲナーゼの抗体を常法（例えば、続生化学実験法、第５
巻、１−２５頁、日本生化学金偏、１９８６年、東京化
学同人）により作製した。即ち、ｌ　　ｍｇの精製コラ
ゲナーゼを不完全７０インドアジユバントと混和し、ウ
サギの皮下に注射して免疫した。さらに、１週間毎に３
回、同様の操作を行い、追加免疫した。４週間目に全血
を採取、硫安分画によりＩｇ（１，画分を調製し、この
抗体をパーオキシダーゼで酵素標識した。抗体の酵素標
識は、例えば、過よう素酸ナトリウムによる方法が利用
可能であるが、詳細は免疫実験操作法■、１８３５頁（
日本免疫学金偏）に記載されている。この酵素標識した
抗コラゲナーゼ抗体を用いて、上記遺伝子ライブラリー
の中から、抗コラゲナーゼ抗体と反応する抗原を発現し
ているクローンとして、プラスミドｐＬｃｏ−１、ｐＬ
ｃｏ−２、ｐＬｃ。

３を持つクローンを選択した。プラスミドｐＬＣＯ−１
は、約７．０ｋｂのビブリオ・アルギノリティカス由来
のＤＮＡ挿入断片を持つ。ｐＬＣＯ−１の挿入ＤＮＡ断
片の制限酵素地図を添付の第、１図に示した。

なお、プラスミドｐＬｃｏ−１を持つエシェリヒア・コ
リＪＭＩ　Ｏ１はエシェリヒア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＳＡＭ１５１４と命名し、１９８
９年１１月２２日に工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１１１３１号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１１３１
）として寄託しである。

実施例３アミノ酸配列の決定アクロモバクタ−・コラゲナーゼの部分アミノ酸配列は
、以下のようにして決定した。精製したアクロモバクタ
−・コラゲナーゼを、常法（例えば、続生化学実験法、
第２巻、２６０−２７０頁、口本生化学金偏）によりト
リプシンおよびプロテアーゼｖ８で各々部分加水分解し
た。得られたペプチド断片を高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製した後、自動化ニドマン分解法によりアミ
ノ酸配列を決定した。その結果、本発明におけるアクロ
モバクタ−・コラゲナーゼは少なくとも以下の２０個の
ペプチド断片のアミノ酸配列を有していた。

式（ａ）　：　ＳＱＬＳＲ式（ｂ）　：　ＩＹＲ式（ｃ）：ＹＴＧＮＡＳＳＶＶＫ式（ｄ）　：ＡＳＳＩＧＡＥＤＥＦＭＡＡＮＡＧＲＥ式（ｅ）　：　ＥＳＶＤＡＦＶＮ式（ｆ）　：ＱＧＮＷＩＮＹＫ式（ｇ）　＋ＭＧＹＥＥＧＹＦＨＱＳＬ式（ｈ）：ＡＬ
ＧＤＦＡＬＲ式（ｉ）　：ＷＧＹＬＡＶＲ式（ｊ）　：ＡＧＹＹＡＥ式（ｋ）　：　ＶＷＷＳＥ式（＋）：ＷＶＴＰＡＶＫＥ式（ｍ）＋ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦＳＨＰＴＥ式（ｎ）
　：ＹＮＤＮＩＳＦ式（ｏ）　：　５ＳＴＤＹＧＫＹＡＧＰ　ＩＦＤ式（１
））　＋ＧＤＰＳＱＰＧＮＩＰＮＦＩＡＹＥ式（Ｑ）　
：　ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤ式（ｒ）　：　ＴＡＳＹＹＡＤＣ５Ｅ式（ｓ）　：ＷＮＤＱＹ式（ｔ）　：　ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬはなしか、または式（ａ）ないし（ｔ）中のアルファベ
ットは、以下のアミノ酸を示す。

Ａ：アラニン、Ｃニジスティン、Ｄ：アスパラギン酸、
Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇニゲリシ
ン、Ｈ：ヒスチジン、■＝インロイシン、Ｋ：リシン、
Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ
ニブロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、ｓ：セ
リン、Ｔ：スレオニン、ｖ：バリン、ｗニトリプトファ
ン、Ｙ：チロシン。

実施例４ＤＮＡ塩基配列の決定プラスミドｐＬｃｏ−１（７）７．０ｋｂＤＮＡ挿入断
片の内、４．１ｋｂについて塩基配列を以下の方法で決
定した。即ち、プラスミドｐＬｃｏ−１を各種制限酵素
で切断し、５００ｂｐ前後のＤＮＡ断片を調製した。こ
れらのＤＮＡ断片をファージＭ１３にクローニングし、
ジデオキシ法［エフ・サンガーら、プロシーデインダス
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス
・ニー・ニス・エイ（Ｆ。

Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）。

７４．５９６３−５９６７、１９７７１により塩基配列
を決定した。

決定された塩基配列は４０５４塩基対からなり、アクロ
モバクタ−・コラゲナーゼの全領域を含んでいる。塩基
配列（第２図）中には、１３３７〜１３３９番目のＡＴ
Ｇから始まり、３７７９〜３７８１番目のＴＡＧで終わ
る３７７８塩基対からなるコラゲナーゼに対応するオー
ブンリーディングフレームが存在する。ＡＴＧ開始コド
ンの５塩基対前にＧＡＡＧＡＡＡのリポソームパインデ
ィングサイトが存在する。

全塩基配列中において、決定された塩基配列から推測さ
れるアミノ酸配列と、実施例３において決定された部分
アミノ酸配列とを比較してみると、以下の２０個のアミ
ノ酸配列において一致してい（ａ）ＳＱＬＳＲＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＧＡＳｅｒＧｌｎＬｅｕＳｅｒＡｒｇ（ｂ）　ｌ　　Ｙ　　ＲＡＴＴＴＡＴＣＧＴ１１ｅＴｙｒＡｒｇ（ｃ）ＹＴＧＮＡＳＳＶＶＫＴＡＴＡＣＧＧＧＴＡＡＣＧＣＧＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧ
ＴＧＡＡＧＴｙｒＴｈｒＧｌｙＡｓｎＡｌａＳｅｒＳｅ
ｒＶａｌＶａｌＬｙｓ（ｄ）ＡＳＳＩＧＡＥＤＥＦＭＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＡＧＴＴＴＡＴＧＧＣＣＡｌａＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧＩ
ｙＡｌａＧＩｕＡｓｐＧＩｕＰｈｅＭｅｔＡｌａＮＡＧ
ＲＥＧＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡｌａＡｓｎＡ
ＩａＧＩｙＡｒｇＧｌｕ（ｅ）ＥＳＶＤＡＦＶＮＧＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＴＧＴＴＡＡＣＧ
ＩｕＳｅｒＶａｌＡｓｐＡＩａＰｈｅＶａｌＡｓｎ（ｆ
）ＱＧＮＷＩＮＹＫＣＡＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＧ
ｌｎＧＩｙＡｓｎＴｒｐｌ　ｌｅＡｓｎＴｙｒＬｙｓ（
ｇ）ＭＧＹＥＥＧＹＦｌｔＱＳＬＡＴＧＧＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣ
ＡＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＭａｔＧ　ｌ　ｙＴｙｒＧ　ｌ
ｕＧ　１　ｕＧ　１ｙＴｙｒＰｈｅＨｉｓＧ　１ｎｓｅ
ｒＬｅｕ（ｈ）ＡＬＧＤＦＡＬＩ？にＣＴＴＴＡＧＧＣＧＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＡＧＧＡ
ｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＰｈｅＡｌａＬｅｕＡｒｇ（ｉ
）ＷＧＹＬＡＶＲＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＣＧＴＴｒｐＧ
ｌｙＴｙｒＬｅｕＡｌａＶａｌＡｒｇ（ｊ）ＡＧＹＹＡ
ＥＧＣＧＧＧＴＴＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＩａＧｌｙＴ
ｙｒＴｙｒＡＩａＧｌｕ（ｋ）ＶＷＷＳＥＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡ（、ＴＧＡＡＶａｌＴｒｐＴｒｐＳｅｒＧｌｕ（１）ＷＶＴＰＡＶＫＥＴＧＧＧＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣ；ＴＧＡＡＡ（１；
ＡＡＴｒｐＶａｌＴｈｒＰｒｏＡｌａＶａｌＬｙｓＧｌ
ｕ（ｍ）ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧ
ＧＡＧＧＧＴＴＴＬｅｕＡｓｐＧｌｙＡｒｇＰｈｅＧＩ
ｕＬｅｕＴｙｒＧｌｙＧＩｙＰｈｅＨＰＴＥＫＡにＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＳｅｒＨｉｓＰ
ｒｏＴｈｒＧ１ｕＬｙｓ（ｎ）ＹＮＤＮＩＳＦＴＡＣＡＡＴＣ；ＡＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＴ丁ＴＴｙｒ
ＡｓｎＧｌｕＡｓｎｌｌｅＳｅｒＰｈｅ（ｏ）ＳＳＴＤ
ＹＧＫＹＡＧＰＴＣＡＡＧＴＡＣＣＧＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣ
ＣＡＧＧＧＣＣＡＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｕＴｙｒＧＩ
ｙＬｙｓＴｙｒＡｌａＧＩｙＰｒ。

ＦＤＡＴＴＴＴＣＧＡＴ１１ｅＰｈｅＧＩｕ（ｐ）ＧＤＰＳＱＰＧＮ　　ＪＰＮＧＧＣＧＡＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＡＡＴＡ
ＴＴＣＣＣＡＡＣＧｌｙＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＰｒ
ｏＧｌｙＡｓｎｌ　ＩｅＰｒｏＡｓｎＩＡＹＥＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡＰｈｅｌｌｅＡｌａＴｙｒＧｌｕ（Ｑ）ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤＴＡＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴ
ＴＴＧＡＴＴｙｒＶａ　ＩＩ　ｉｓＴｙｒＬｅｕＡｓｐ
ＧＩｙＡｒｇＰｈｅＡｓｐ（ｒ）ＴＡＳＹＹＡＤＣ５ＥＡＣＣＧＣＣＴＣＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡ
ＧＴＧＡにＴｈｒＡｌａＳｅｒＴｙｒＴｙｒＡｌａＡｓ
ｐＣｙｓＳｅｒＧｌｕ（ｓ）ＷＮＤＱＹＴＧＧＡＡＴＧＡＴＣＡＡＴＡＣＴｒｐＡｓｎＡｓｐＧ　ＩｎＴｙｒ（ｔ）ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬＧＧＧＴＡＴＡＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＡＴＧ
ＡＡＣＴＡＧｌｙＴｙｒＴｈｒＧＩｙＧＩｙＧｌｙＳｅ
ｒＡｓｐＧｌｕＬｅｕ実施例５遺伝子産物の解析まず、コラゲナーゼ遺伝子を大腸菌で大量に生産させる
ための組換えプラスミドを作成した。プラスミドｐＬｃ
ｏ−１の７ｋｂ挿入挿入ＤＮＡ上、第１２１３番目のＨ
ｐａｌルミｌサイトｍＨＩリンカ−を、３９３６番目の
ＥｃｏＲＶサイトに５ａ１１リンカ−を挿入した。この
ように２つのリンカ−を挿入したｐＬｃｏ−１をＢａｍ
ＨＩおよび５ａｌｒで切断することにより、コラゲナー
ゼ遺伝子の全長を含む２．７　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を調
製することができる。回収した当該ＤＮＡ断片をベクタ
ーｐｏｃ　ｌ　８のＢａｍＨＩ／５ａｉｌサイトに挿入
してｐＨＵｃ１４を作成した。組換えプラスミドｐＨＵ
ｃ１４を大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して、コラゲナー
ゼを大量に生産する大腸菌組換え体を作成した。

組換え体大腸菌内でのアクロモバクタ−・コラゲナーゼ
遺伝子産物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法およびウェスターンプロット法によって解析した。ウ
ェスターンプロット法はバーネットの方法［バーネット
・ダブリユウ・エヌ、アナリティカル・バイオケミスト
リー（ＢｕｒｎｅｔｔｅＷ、Ｎ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）、１１２．６８（ｈ６８５．　（１９８１）
］を改良して行った。コラゲナーゼ遺伝子を含有する犬
腸菌組換え体を、Ｔ　ＰＴＧを１ｍＨになるように添加
したしグロス中で、３７℃で１７時間培養した。遠心に
より菌体を集めた後、超音波処理により菌体を破砕した
。この菌体破砕液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により分画した。ウェスターンプロット法により
分画されたタンパク質をニトロセルロース膜に移したの
ち、ウサギより調製した抗コラゲナーゼ抗体およびパー
オキンダーゼ標識した抗つサギＩｇＧ抗体を用いて、コ
ラゲナーゼのバンドだけを発色させた。第３図に示すよ
うに、ｐ　ＨＵＣ１４を持つ大腸菌５Ｍ１０９中には、
分子量約８５ｋｄのタンパク質を主成分とする抗コラゲ
ナーゼ抗体と反応する数多くのバンドが認められた。ｐ
Ｌｃｏ−１を持つ大腸菌５Ｍ１０９中にあ、抗コラゲナ
ーゼ抗体と反応するタンパク質がわずかであるが認めら
れた。

一方、対照とした組換えプラスミドを含まない大腸菌Ｊ
ＭＩ　０９中には、抗コラゲナーゼ抗体と反応するタン
パク質は全く認められなかった。以上の結−果は、コラ
ゲナーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＬＣＯ−１
およびｐＨＵｃ１４を持つ大腸菌中では、アクロモバク
タ−・コラゲナーゼと免疫学的に同等のタンパク質が生
産されていることを示しており、しかもｐＨＵｃ１４を
含む大腸菌中では大量に生産されていることを示してい
る。

実施例６形質転換体のコラゲナーゼ活性アクロモバクタ−・コラゲナーゼ遺伝子を含有する大腸
菌組換体中のコラゲナーゼ活性を、合成基質４−フェニ
ルアゾーベンジオキシー力ルポニルーＬ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＨＣｆｆ（ＰＺ
−ＰＬＧＰＲ）を用いて測定した。コラゲナーゼ活性の
測定法および活性単位（Ｕ）の定義は、特表昭６０−５
００４１３号に詳細に開示されている。大腸菌の超音波
処理菌体破砕液の調製法は、実施例５に示した。

第１表に示すように、コラゲナーゼ遺伝子ｐＨＵＣｌ４
を含む大腸菌ＪＭＩ　Ｏ９中には、高いコラゲナーゼ活
性が認められた。プラスミドｐＬＣＯ−１を含む大腸菌
ＪＭ１０９およびプラスミドを含まない大腸菌ＪＭＩ　
０９中には、コラゲナーゼ活性は認められなかった。以
上の結果からコラゲナーゼ遺伝子を含む大腸菌組換体中
で発現している遺伝子産物は、コラゲナーゼ活性を有し
ていることが明らかになった。なお、プラスミドｐＬＣ
Ｏ−１を含む大腸菌中にコラゲナーゼ活性を検出できな
いのは、発現量が低いためと考えられる。

第１表　大腸菌組換体のコラゲナーゼ活性プラスミド　
　　　コラゲナーゼ活性なし　　　　　　　　〈５ｐＬＣ○−１〈５ｐＵｃ１４　　　　　　１８９プラスミド：表記したプラスミドを含有する大腸菌ＪＭ
１０９のコラゲナーゼ活性を示した。

（発明の効果）本発明によりビブリオ・アルギノリティカス由来のアク
ロモバクタ−・コラゲナーゼの遺伝子が取得され、その
アミノ酸配列が明らかになった。

これにより、アクロモバクタ−・コラゲナーゼを遺伝子
工学技術を利用することで例えば適当な宿主で大量に生
産することや、コラゲナーゼを遺伝子工学的手法により
改良することなどの手段が講じられるようになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、コラゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＬｃ
ｏ−１中の７．Ｏｋｂ挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
示す図面である。図中、下部矢印は、コラゲナーゼ構造
遺伝子の領域および転写の方向を示す。０内の数字は、
塩基番号を示す。点線は、制限酵素による切断点が２者のうちで特定でき
ないことを示している。第２図は、コラゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の全塩
基配列および当該塩基配列より推定され線のアンダーラ
インを付した領域は、精製コラゲナーゼの部分アミノ酸
配列（実施例３参照）と−致する部分を示している。第３図は、ウェスターンプロット法による大腸菌内での
コラゲナーゼ遺伝子産物の解析を行った結果を示す模式
図であり、図中、矢印は同時に泳動を行った分子量マー
カーの泳動位置を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ビブリオ・アルギノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏａ
ｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）に属する細菌由来のコラゲ
ナーゼ遺伝子。
（２）添付の第１図に示す制限酵素地図を有するビブリ
オ・アルギノリティカス由来のコラゲナーゼをコードす
る遺伝子。
（３）少なくとも下記式（ａ）ないし（ｔ）で示される
ペプチド断片を有するビブリオ・アルギノリティカス由
来のコラゲナーゼをコードする請求項第２項記載の遺伝
子。式（ａ）：ＳＱＬＳＲ式（ｂ）：ＩＹＲ式（ｃ）：ＹＴＧＮＡＳＳＶＶＫ式（ｄ）：ＡＳＳＩＧＡＥＤＥＦＭＡＡＮＡＧＲＥ式（ｅ）：ＥＳＶＤＡＦＶＮ式（ｆ）：ＱＧＮＷＩＮＹＫ式（ｇ）：ＭＧＹＥＥＧＹＦＨＱＳＬ式（ｈ）：ＡＬＧＤＦＡＬＲ式（ｉ）：ＷＧＹＬＡＶＲ式（ｊ）：ＡＧＹＹＡＥ式（ｋ）：ＶＷＷＳＥ式（ｌ）：ＷＶＴＰＡＶＫＥ式（ｍ）：ＬＤＧＲＦＤＬＹＧＧＦＳＨＰＴＥＫ式（ｎ）：ＹＮＤＮＩＳＦ式（ｏ）：ＳＳＴＤＹＧＫＹＡＧＰＩＦＤ式（ｐ）：ＧＤＰＳＱＰＧＮＩＰＮＦＩＡＹＥ式（ｑ）
：ＹＶＨＹＬＤＧＲＦＤ式（ｒ）：ＴＡＳＹＹＡＤＣＳＥ式（ｓ）：ＷＮＤＱＹ式（ｔ）：ＧＹＴＧＧＧＳＤＥＬ但し、式（ａ）ないし（ｔ）中のアルファベットは、以
下のアミノ酸を示す。Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、
Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシ
ン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リシン、
Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ
：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セ
リン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファ
ン、Ｙ：チロシン。
（４）請求項第２項記載のビブリオ・アルギノリティカ
ス由来のコラゲナーゼ遺伝子または当該遺伝子と生物学
的に実質的に同等な遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）請求項第２項記載のビブリオ・アルギノリティカ
ス由来のコラゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドによ
り形質転換された宿主細胞。
（６）ビブリオ・アルギノリティカス由来のコラゲナー
ゼの製造法において、請求項第５項記載の宿主細胞を培
養することにより該酵素を発現させ、培養物より該酵素
を回収・精製することを特徴とする該コラゲナーゼの製
造法。
（７）下記式（ I ）で表されるアミノ酸配列を有する
ビブリオ・アルギノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のコラ
ゲナーゼ。式（ I ）：【遺伝子配列があります】但し、式（ I ）中、Ｘは、水素原子または次式（II）
で表されるポリペプチドを示す。式（II）：【遺伝子配列があります】また、式（ I ）、（II）中のアルファベットは、以下
のアミノ酸を示す。Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシ
ン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リシン、
Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ
；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｔ；スレオニン、Ｖ；バリン、Ｗ；トリプトファ
ン、Ｙ；チロシン。
（８）請求項第１項記載の式（ I ）で表されるアミノ
酸配列を有するコラゲナーゼのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子。
（９）下記式（III）で表される塩基配列または式（II
I）と実質的に生物学的に同等な塩基配列を有する生物
学的に順化されたビブリオ・アルギノリティカス由来の
コラゲナーゼ遺伝子。式（III）：【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】但し、式（III）中、Ｚはなしか、または式（IV）で表
される塩基配列を示す。式（IV）：【遺伝子配列があります】
（１０）特許請求の範囲第８項に記載のビブリオ・アル
ギノリティカス由来のコラゲナーゼ遺伝子、または当該
遺伝子と実質的に生物学的に同等な遺伝子を有する組換
えベクター。
（１１）特許請求の範囲第８項に記載のビブリオ・アル
ギノリティカス由来のコラゲナーゼ遺伝子を含有するプ
ラスミドにより形質転換された宿主細胞。
（１２）特許請求の範囲第１１項に記載の組換え体宿主
細胞を培養し、その菌体ないしは培養液から酵素を回収
することを特徴とするビブリオ・アルギノリティカス由
来コラゲナーゼの製造法。