JP2916206B2 - 生理活性ペプチド - Google Patents
生理活性ペプチドInfo
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- JP2916206B2 JP2916206B2 JP11416790A JP11416790A JP2916206B2 JP 2916206 B2 JP2916206 B2 JP 2916206B2 JP 11416790 A JP11416790 A JP 11416790A JP 11416790 A JP11416790 A JP 11416790A JP 2916206 B2 JP2916206 B2 JP 2916206B2
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- chymotrypsin
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- inhibitory activity
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はキモトリプシン阻害作用等を示す家蚕Bombyx
morik03の血漿由来の生理活性ペプチドに関するもので
ある。
morik03の血漿由来の生理活性ペプチドに関するもので
ある。
［従来の技術］ 微生物、各種臓器或は培養基等よりペプチド結合を有
する種々の物質を分離・精製する場合、或は微生物を培
養してタンパク質等を作らせる場合、更に生体に対して
各種生理活性ペプチドを作用させる場合等において、プ
ロテアーゼが存在することによってタンパク質の収率が
低下したり、或は目的タンパク質が全く得られなかった
りといったことはしばしば経験することろである。そこ
でこのような場合には温度を上げる・下げる、或は塩を
加える等の手段によってプロテアーゼ活性を抑制した
り、若しくは失活させるというようなことが行なわれて
いる。しかしこれらの方法ではプロテアーゼと同様にペ
プチド結合を有するタンパク質である目的物質も何らか
の影響を受けることは避けられず、例えば微生物にタン
パク質を作らせる場合などでは微生物の生育が阻害され
ることも多い。
する種々の物質を分離・精製する場合、或は微生物を培
養してタンパク質等を作らせる場合、更に生体に対して
各種生理活性ペプチドを作用させる場合等において、プ
ロテアーゼが存在することによってタンパク質の収率が
低下したり、或は目的タンパク質が全く得られなかった
りといったことはしばしば経験することろである。そこ
でこのような場合には温度を上げる・下げる、或は塩を
加える等の手段によってプロテアーゼ活性を抑制した
り、若しくは失活させるというようなことが行なわれて
いる。しかしこれらの方法ではプロテアーゼと同様にペ
プチド結合を有するタンパク質である目的物質も何らか
の影響を受けることは避けられず、例えば微生物にタン
パク質を作らせる場合などでは微生物の生育が阻害され
ることも多い。
［発明が解決しようとする課題］ 上記の問題を解決するにはプロテアーゼだけに働く阻
害剤、即ちプロテアーゼインヒビターを利用することが
考えられる ［課題を解決するための手段］ 本発明に係る家蚕Bombyx morik03の血漿由来の生理活
性ペプチドは次に示す理化学的特性を有するものである
ところに要旨を有する。
害剤、即ちプロテアーゼインヒビターを利用することが
考えられる ［課題を解決するための手段］ 本発明に係る家蚕Bombyx morik03の血漿由来の生理活
性ペプチドは次に示す理化学的特性を有するものである
ところに要旨を有する。
分子量:SDS電気泳動による測定で約7,900 HPLCによる測定で約8,500 等電点:7.00 Ｎ末端からの20アミノ酸の推定１次構造： 生理活性：キモトリプシン阻害活性を有する ［作用及び実施例］ 本発明の生理活性物質は九州大学家蚕遺伝子資源セン
ターが系統保存している家蚕Bombyx morik03の血漿より
精製することができたもので、次のような理化学的物性
により特定することができる。
ターが系統保存している家蚕Bombyx morik03の血漿より
精製することができたもので、次のような理化学的物性
により特定することができる。
１）分子量:SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る測定で約7,900。HPLCによる測定で約8,500。
る測定で約7,900。HPLCによる測定で約8,500。
２）等電点:7.00 ３）Ｎ末端からの20アミノ酸の推定１次構造： 生理活性：キモトリプシン阻害活性を有する。
（カゼインを基質に用いてKi＝0.77μＭ） 更に実施例において示す様に優れた熱安定性及びpH安
定性も有している。また生理活性においてもキモトリプ
シン阻害活性以外の生理活性も有することが期待されて
いる。
定性も有している。また生理活性においてもキモトリプ
シン阻害活性以外の生理活性も有することが期待されて
いる。
本発明の生理活性ペプチド（以下CI−２と略す）は家
蚕血漿を原料とし、常法により精製して得ることができ
る。例えば、硫安塩析後、DEAE或はCM−イオン交換クロ
マトグラフィー及びキモトリプシンを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを組み合せることによって高純
度に精製できる。更にアミノ酸のＮ−末端からの一次構
造が決定されたので、遺伝子を取り出すこと（単離する
こと）が出来るようになり遺伝子組み換え技術を応用し
て大量生産することも可能である。
蚕血漿を原料とし、常法により精製して得ることができ
る。例えば、硫安塩析後、DEAE或はCM−イオン交換クロ
マトグラフィー及びキモトリプシンを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを組み合せることによって高純
度に精製できる。更にアミノ酸のＮ−末端からの一次構
造が決定されたので、遺伝子を取り出すこと（単離する
こと）が出来るようになり遺伝子組み換え技術を応用し
て大量生産することも可能である。
以下、実施例に基づいて具体的に説明する。
実施例１ ＜精製方法＞ 原料 Bombyx mori k03の幼虫５齢３日に血漿を採取し、遠
心分離によって血液細胞を取り除いたもの。
心分離によって血液細胞を取り除いたもの。
硫安塩析 上記家蚕血漿20mlに硫酸アンモニウムを加え30〜70％
飽和で沈澱した沈澱物を遠心分離した。得られた沈澱物
に少量の0.05Mトリスー塩酸緩衝液（pH6.8）を加え溶解
させた後、同緩衝液に対して透析した。
飽和で沈澱した沈澱物を遠心分離した。得られた沈澱物
に少量の0.05Mトリスー塩酸緩衝液（pH6.8）を加え溶解
させた後、同緩衝液に対して透析した。
イオン交換カラムクロマトグラフィー 前記トリス−塩酸緩衝液で平衡化させたDEAESephadex
A50カラム（Pharmacia社製）（２×40cm）に、硫安分
画によって得た活性画分を通し、同緩衝液で洗浄し、非
吸着（又は素通り）画分CI−２の活性画分を得た。溶出
パターンを第１図に示す。活性画分を合わせて濃縮した
後、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で透析し、
遠心分離により上清を得た。
A50カラム（Pharmacia社製）（２×40cm）に、硫安分
画によって得た活性画分を通し、同緩衝液で洗浄し、非
吸着（又は素通り）画分CI−２の活性画分を得た。溶出
パターンを第１図に示す。活性画分を合わせて濃縮した
後、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で透析し、
遠心分離により上清を得た。
アフィニティーカラムクロマトグラフィー 前記リン酸ナトリウム緩衝液で平衡化させたキモトリ
プシン結合Sepharose 4B（Pharmacia社製）カラム（１
×10cm）に前記上清を通し、同緩衝液で洗浄した。0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液（HClでpH1.0に調整。0.5M NaCl
及び4M Urea含有）で溶出し、精製CI−２を得た。溶出
パターンを第２図に示す。
プシン結合Sepharose 4B（Pharmacia社製）カラム（１
×10cm）に前記上清を通し、同緩衝液で洗浄した。0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液（HClでpH1.0に調整。0.5M NaCl
及び4M Urea含有）で溶出し、精製CI−２を得た。溶出
パターンを第２図に示す。
第１表に各精製段階での体積、総タンパク質量、比活
性、総キモトリプシン阻害活性及び回収率を示す。尚、
キモトリプシン阻害活性の測定、CI−２であることを確
認するための電気泳動及び活性染色は下記の方法で行っ
た。
性、総キモトリプシン阻害活性及び回収率を示す。尚、
キモトリプシン阻害活性の測定、CI−２であることを確
認するための電気泳動及び活性染色は下記の方法で行っ
た。
＜実験方法＞ キモトリプシン阻害活性の測定 Kunitzらの方法（J.Gen.Physiol.30,291−310,1947）
に基づいて行なった。
に基づいて行なった。
試料溶液0.1mlを0.22mlのキモトリプシン溶液（200pm
ole）に加え37℃で10分間インキュベーションした後、
あらがじめ緩衝液に溶解したHammarstenカゼインを、終
濃度で30mg/mlになるように加えた。この時の反応液量
は0.32mlとした。37℃で10分間反応させた後、トリクロ
ロ酢酸を最終で５％になるように加え、反応を停止し、
反応液を遠心分離した後、上清の280nmにおける吸光度
（A280）を測定した。試料溶液を加えないものについて
も同様の測定を行ない、試料溶液を加えないもののA280
をＡ、加えたもののA280をＢとした場合、阻害活性は
（Ａ−Ｂ）/A×100で表わされる。即ち、上述した反応
条件で40pmoleのキモトプリシンを50％阻害する活性量
をキモトリプシンインヒビター１単位（ｕ）とした。
ole）に加え37℃で10分間インキュベーションした後、
あらがじめ緩衝液に溶解したHammarstenカゼインを、終
濃度で30mg/mlになるように加えた。この時の反応液量
は0.32mlとした。37℃で10分間反応させた後、トリクロ
ロ酢酸を最終で５％になるように加え、反応を停止し、
反応液を遠心分離した後、上清の280nmにおける吸光度
（A280）を測定した。試料溶液を加えないものについて
も同様の測定を行ない、試料溶液を加えないもののA280
をＡ、加えたもののA280をＢとした場合、阻害活性は
（Ａ−Ｂ）/A×100で表わされる。即ち、上述した反応
条件で40pmoleのキモトプリシンを50％阻害する活性量
をキモトリプシンインヒビター１単位（ｕ）とした。
アクリルアミドゲル電気泳動 Davis,B.J.and Ornstein,L.らの方法（Ann.N.Y.Acad.
Sci.121,Art 2,321−349,404−427,1964）に準じて行な
った。
Sci.121,Art 2,321−349,404−427,1964）に準じて行な
った。
活性染色 UrielとBergesの方法（Nature 218,578−580,1968）
により実施した。
により実施した。
この方法ではキモトリプシンの活性を示す部位が染色
されるので、染色されない部位、すなわちキモトリプシ
ンインヒビターの存在する部位は活性染色されずに白く
抜けることから、キモトリプシンインヒビターの存在部
位が明らかとなる。
されるので、染色されない部位、すなわちキモトリプシ
ンインヒビターの存在する部位は活性染色されずに白く
抜けることから、キモトリプシンインヒビターの存在部
位が明らかとなる。
第１表に示したように、原料より約５％の回収率で、
比活性が約407倍に精製された。尚、精製品の比活性は1
1,070u/mg proteinであった。
比活性が約407倍に精製された。尚、精製品の比活性は1
1,070u/mg proteinであった。
実施例２ ＜理化学的性質＞ 実施例１で得た精製品を用いて次の分析及び試験を行
なった。
なった。
分子量 １）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定 Laemmliの方法（Nature,227;680,1970）により12.5％
gel SDS電気泳動を行なった結果を第３図に示す。還元
状態での分子量が約7,900であることがわかった。
gel SDS電気泳動を行なった結果を第３図に示す。還元
状態での分子量が約7,900であることがわかった。
２）HPLC（非還元状態）による測定 TSKgel G 3000 SW［東ソー（株）製、カラム（８×30
0mm）］を用いて実施した結果を第４図に示す。非還元
状態（自然な状態）での分子量が約8,500であることが
わかった。
0mm）］を用いて実施した結果を第４図に示す。非還元
状態（自然な状態）での分子量が約8,500であることが
わかった。
以上の結果よりCI−２は単量体であると推定される。
等電点 Ampholine（ファルマシア社製）（２％V/V）を用いた
6.4％ポリアクリルアミドゲルによるpH3.5−10のpH勾配
を持つ等電点ゲル電気泳動を行ない（300V,5hr）、活性
染色により泳動位置を求めた。一方同様に泳動した別の
ゲルを5mmずつスライスしてpHを測定し、泳動位置から
キモトリプシンインヒビターの等電点を求めた。結果を
第５図に示す。等電点は7.0であることがわかった。
6.4％ポリアクリルアミドゲルによるpH3.5−10のpH勾配
を持つ等電点ゲル電気泳動を行ない（300V,5hr）、活性
染色により泳動位置を求めた。一方同様に泳動した別の
ゲルを5mmずつスライスしてpHを測定し、泳動位置から
キモトリプシンインヒビターの等電点を求めた。結果を
第５図に示す。等電点は7.0であることがわかった。
Ｎ末端からの20アミノ酸の１次構造 エドマン分解により１次構造を決定した。まず、アミ
ノアシド シークエンサー890M/E（ベックマン社製）を
使用してフェニルチオヒダントイン（PTH）誘導体を
得、該誘導体をODSカラム（4.6×250mm）［東ソー
（株）製、120T］を用いたHPLCにより同定し、Ｎ末端側
20残基のアミノ酸の１次構造を決定した。推定される１
次構造は下記の通りであった。
ノアシド シークエンサー890M/E（ベックマン社製）を
使用してフェニルチオヒダントイン（PTH）誘導体を
得、該誘導体をODSカラム（4.6×250mm）［東ソー
（株）製、120T］を用いたHPLCにより同定し、Ｎ末端側
20残基のアミノ酸の１次構造を決定した。推定される１
次構造は下記の通りであった。
アミノ酸分析 Moore and Steinらの方法（Methods in Enzymology
６;819,1963）に準じて行なった。即ち、精製された試
料に0.05％メルカプトエタノールを含むFe Freeの6N−H
Clを加え、110℃で24時間加水分解した後、アミノ酸自
動分析計［日立（株）製、アミノアシドアナライザー型
655A］を用いて構成アミノ酸比を求めた。HPLCによる分
子量の測定結果をもとに各アミノ酸数を推定した。結果
を第２表に示す。
６;819,1963）に準じて行なった。即ち、精製された試
料に0.05％メルカプトエタノールを含むFe Freeの6N−H
Clを加え、110℃で24時間加水分解した後、アミノ酸自
動分析計［日立（株）製、アミノアシドアナライザー型
655A］を用いて構成アミノ酸比を求めた。HPLCによる分
子量の測定結果をもとに各アミノ酸数を推定した。結果
を第２表に示す。
第２表より明らかなようにMetとHisを含有しないとい
う特徴を有している。
う特徴を有している。
［キモトリプシンに対する阻害活性］ キモトリプシン（200pmole）に種々の量のCI−２を加
え37℃で10分間インキュベーションした後、カゼインを
基質に用いてキモトリプシン活性を測定した。測定結果
をLineweaverBurkの逆数プロットにして第６図に示す。
図より求められたCI−２のKi値は0.77μＭであった。
え37℃で10分間インキュベーションした後、カゼインを
基質に用いてキモトリプシン活性を測定した。測定結果
をLineweaverBurkの逆数プロットにして第６図に示す。
図より求められたCI−２のKi値は0.77μＭであった。
［キモトリプシンに対する100％阻害比］ キモトリプシン（200pmole）に種々の量のCI−２を加
え37℃で10分間インキュベーションした後、カゼインを
基質に用いてキモトリプシン活性を測定した。第７図に
阻害されたキモトプリシン量とCI−２の量の関係を示
す。実験に使用したキモトリプシン（牛膵臓由来、EC3
4.21.1）の分子量が25,200であるので、HPLCにより推定
された分子量8,500のCI−２のキモトリプシンに対する1
00％阻害比［I/E］はモル比で2.24:1である。
え37℃で10分間インキュベーションした後、カゼインを
基質に用いてキモトリプシン活性を測定した。第７図に
阻害されたキモトプリシン量とCI−２の量の関係を示
す。実験に使用したキモトリプシン（牛膵臓由来、EC3
4.21.1）の分子量が25,200であるので、HPLCにより推定
された分子量8,500のCI−２のキモトリプシンに対する1
00％阻害比［I/E］はモル比で2.24:1である。
生理活性 種々のプロテアーゼにCI−２を反応させた後のプロテ
アーゼの残存活性を測定した。尚夫々のプロテアーゼの
使用量及び活性測定法は下記第３表の通りである。
アーゼの残存活性を測定した。尚夫々のプロテアーゼの
使用量及び活性測定法は下記第３表の通りである。
結果を第４表に示す。
CI−２はキモトリプシンに対して阻害活性を示し、他
のプロテアーゼに対しては殆んど阻害活性を示さなかっ
た。
のプロテアーゼに対しては殆んど阻害活性を示さなかっ
た。
pH安定性 pH2〜12で室温に24時間放置した後、キモトリプシン
インヒビター活性がどのように変化するかを調べた結果
を第８図に示す。尚、本反応に用いた緩衝液は、pH2〜
３はグリシン−塩酸緩衝液を、pH4〜５は酢酸緩衝液
を、pH6〜７はリン酸緩衝液を、pH8〜９はトリス−塩酸
緩衝液を、pH10〜11はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液を、pH12はグリコール−水酸化ナトリウム緩衝液を使
用した。
インヒビター活性がどのように変化するかを調べた結果
を第８図に示す。尚、本反応に用いた緩衝液は、pH2〜
３はグリシン−塩酸緩衝液を、pH4〜５は酢酸緩衝液
を、pH6〜７はリン酸緩衝液を、pH8〜９はトリス−塩酸
緩衝液を、pH10〜11はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液を、pH12はグリコール−水酸化ナトリウム緩衝液を使
用した。
図より、安定性が最も悪いと考えられるpH2付近にお
いてもなお75％の阻害活性を維持しており、この生理活
性ペプチドが優れたpH安定性を示すことがわかる。
いてもなお75％の阻害活性を維持しており、この生理活
性ペプチドが優れたpH安定性を示すことがわかる。
熱安定性 本生理活性ペプチドをリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解
し、種々の温度で10分間加熱処理した後の残存活性を調
べた。結果を第８図に示す。図より、90℃で10分間処理
を行なってもなお75％のキモトリプシン阻害活性が維持
されており、本生理活性ペプチドが優れた耐熱性を有し
ていることがわかる。
し、種々の温度で10分間加熱処理した後の残存活性を調
べた。結果を第８図に示す。図より、90℃で10分間処理
を行なってもなお75％のキモトリプシン阻害活性が維持
されており、本生理活性ペプチドが優れた耐熱性を有し
ていることがわかる。
糖鎖 Shiff反応（Zaccharias,R.J.,Morisson,J.H.and Wood
lock,J.J.,Anal.Biochem.,31,148,1969）が陰性であ
り、またCI−２を電気泳動後、Western blotで膜に移
し、蛍光標識クレチン［Fluorescenin Lectin Kit I
（ベクター社製）］と反応させても蛍光バンドが無かっ
た（陰性であった）ことから、本生理活性ペプチドに糖
鎖の結合はないと考えられる。
lock,J.J.,Anal.Biochem.,31,148,1969）が陰性であ
り、またCI−２を電気泳動後、Western blotで膜に移
し、蛍光標識クレチン［Fluorescenin Lectin Kit I
（ベクター社製）］と反応させても蛍光バンドが無かっ
た（陰性であった）ことから、本生理活性ペプチドに糖
鎖の結合はないと考えられる。
［発明の効果］ 本発明のキモトリプシン阻害活性を有する生理活性ペ
プチドは上記のように優れたpH安定性及び熱安定性を有
しており、その活性を種々の分野に応用できる。例えば
ペプチド結合を有する物質の生産及び精製の際に加える
と収量を上げることができ、ペプチド結合を有する生理
活性物質と共存させることにより生理活性物質を経口投
与することができる可能性がある他、種々の分野に応用
することができる。
プチドは上記のように優れたpH安定性及び熱安定性を有
しており、その活性を種々の分野に応用できる。例えば
ペプチド結合を有する物質の生産及び精製の際に加える
と収量を上げることができ、ペプチド結合を有する生理
活性物質と共存させることにより生理活性物質を経口投
与することができる可能性がある他、種々の分野に応用
することができる。
第１図はDEAEカラムクロマトグラフィーの溶出パター
ン、第２図はアフィニティカラムクロマトグラフィーの
溶出パターン、第３図はSDS電気泳動による分子量測定
結果を示す図、第４図はHPLCによる分子量測定結果を示
す図、第５図は等電点電気泳動の結果を示すグラフ、第
６図はCI−２のカゼインを基質に用いた時のキモトリプ
シンの阻害活性を表わすグラフ、第７図は、キモトリプ
シン1Mに対するCI−２の阻害モル比［I/E］を表わすグ
ラフ、第８図はCI−２のpH安定性を示すグラフ、第９図
はCI−２の熱安定性を示すグラフである。
ン、第２図はアフィニティカラムクロマトグラフィーの
溶出パターン、第３図はSDS電気泳動による分子量測定
結果を示す図、第４図はHPLCによる分子量測定結果を示
す図、第５図は等電点電気泳動の結果を示すグラフ、第
６図はCI−２のカゼインを基質に用いた時のキモトリプ
シンの阻害活性を表わすグラフ、第７図は、キモトリプ
シン1Mに対するCI−２の阻害モル比［I/E］を表わすグ
ラフ、第８図はCI−２のpH安定性を示すグラフ、第９図
はCI−２の熱安定性を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】次に示す理化学的特性を有するものである
ことを特徴とする家蚕Bombyx morik03の血漿由来の生理
活性ペプチド。 分子量:SDS電気泳動による測定で約7,900 HPLCによる測定で約8,500 等電点:7.00 Ｎ末端からの20アミノ酸の推定１次構造： 生理活性：キモトリプシン阻害活性を有する
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11416790A JP2916206B2 (ja) | 1990-04-28 | 1990-04-28 | 生理活性ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11416790A JP2916206B2 (ja) | 1990-04-28 | 1990-04-28 | 生理活性ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0413698A JPH0413698A (ja) | 1992-01-17 |
| JP2916206B2 true JP2916206B2 (ja) | 1999-07-05 |
Family
ID=14630851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11416790A Expired - Lifetime JP2916206B2 (ja) | 1990-04-28 | 1990-04-28 | 生理活性ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2916206B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| PT2124884T (pt) | 2006-12-22 | 2019-09-17 | Ironwood Pharmaceuticals Inc | Composições compreendendo sequestradores de ácido biliar para tratar distúrbios esofágicos |
| US20130156720A1 (en) | 2010-08-27 | 2013-06-20 | Ironwood Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome and related diseases and disorders |
| AU2014207680B2 (en) | 2013-01-15 | 2018-09-06 | Ironwood Pharmaceuticals, Inc. | Gastro-retentive sustained-release oral dosage form of a bile acid sequestrant |
-
1990
- 1990-04-28 JP JP11416790A patent/JP2916206B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0413698A (ja) | 1992-01-17 |
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