JP3022984B2

JP3022984B2 - 細菌コラゲナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP3022984B2
Application number: JP02244562A
Authority: JP
Inventors: 裕次柴野; 和之森原; 研爾奥田; 淳福島
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1989-11-28
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 2000-03-21
Anticipated expiration: 2015-03-21
Also published as: AU6698090A; EP0430635B1; AU629430B2; DK0430635T3; CA2030929A1; US5453371A; EP0430635A1; JPH03219880A; ATE129287T1; DE69023101T2; DE69023101D1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ビブリオ・アルギノリティカス由来のコラ
ゲナーゼ遺伝子、該遺伝子が組み込まれた組換えベクタ
ー、該ベクターにより形質転換された宿主細胞およびそ
の利用に関する。

（従来の技術）動物の結合組織を構成するコラーゲンは、基本単位と
してそれぞれ約95,000の分子量をもつ３本のポリペプチ
ド鎖からなり、左回りの三重らせん構造を有する。コラ
ーゲン分子を構成する各ペプチドのアミノ酸配列はGly
−Pro−Ｘ−Gly（Ｘは種々のアミノ酸残基を示す）の繰
返しであり、各ペプチドは分子内または分子間で架橋さ
れている。このようなコラーゲン特有のラセン構造は、
強靭な機械的性質と化学的安定性をもたらし、それ故、
コラーゲンは通常のプロテアーゼに対して抵抗性を示
し、コラゲナーゼによってのみ分解される。

コラゲナーゼは通常のタンパク質には作用せず、上記
コラーゲンあるいはその変性物であるゼラチンに対して
のみ作用する。微生物の生産する数種のコラゲナーゼの
内、最も研究が進んでいるのは、アクロモバクター・コ
ラゲナーゼとして知られているビブリオ・アルギノティ
カス・ケモバル・イオファガス（Vibrio alginolyticus
chemovar.iophagus）由来のコラゲナーゼで、他起源の
コラゲナーゼに比較して特異的活性の高いことが知られ
ている［ブイ・カイル−ドロウハおよびビイ・カイル、
バイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ（V.Keil−Dlou
ha and B.Keil,Biochim.Biophys.Acta）,522,218−228
（1978）］。アクロモバクター・コラゲナーゼは分子量
110,000、至適pH7.4、安定pH6〜７で、EDTA、ｏ−フェ
ナンスロリンによって活性が消失する亜鉛を含む金属プ
ロテアーゼであり［ブイ・カイル−ドロウハ、バイオケ
ミカ・バイオフィジカ・アクタ（V.Keil−Dlouha,Bioch
im.Biophys.Acta）,429,239−251（1976）］、合成基質
PZ−Pro−Leu−Gly−Pro−Ｄ−ArgをLeu−Glyの間で切
断する［ビイ・カイルら、FEBSレター（B.Keil,A.M.Gil
les,A.Lecroisey,N.Hurion,N.T.Tong,FEBS Lett.）,56,
292−296（1975）；エイ・レコロイジーら、FEBSレター
（A.Lecroisey,V.Keil−Dlouha,D.R.Woods,D.Perrin an
d B.Keil,FEBS Lett.）,59,167−172（1975）；エヌ・
テイ・トンら、バイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ
（N.T.Tong,A.Tsugita.V.Keil−Dlouha,Biochim.Biophy
s.Acta）,874,296−304（1986）］。

かかるコラゲナーゼの特異的な性質を利用して種々の
用途が期待され、実際に使用されている。たとえば、コ
ラーゲンに富む構造の無制限な基質が生じる種々の傷に
使用される。治療できる傷の例として、火傷、潰瘍、痂
皮、コラーゲンベースの白色硬痂、ケロイド、壊死とく
に臥位または潰瘍による壊死がある。

虫歯の治療にも使用される。すなわち死髄は主として
緻密な石灰質とコラーゲンから成り、虫歯では歯にヒビ
が入るかまたは穴が開き、そこからカルシウムが漏出す
る。このため、石灰質が除去されて残ったフレームは多
孔性になり細菌感染等の温床になり易いが、コラゲナー
ゼは多孔性コラーゲンを溶解するので、水洗により除去
できる。健康な石灰質コラーゲンにはコラゲナーゼは作
用しない。

その他、肉質軟化剤としても使用できる。食肉の硬さ
の原因は、コラーゲンを主成分とする腱による。この腱
を分解することによって肉質を軟化するために、パパイ
ンなどのプロテアーゼが使用される。しかし、コラーゲ
ンは通常のプロテアーゼではほとんど分解されないし、
パパイン等の非特異的プロテアーゼは食肉のテクスチュ
アーに重要なアクチン、ミオシン等のタンパク質も分解
するので、パパイン処理によって食肉のテクスチュアー
も消失してしまう。この点で、コラゲナーゼは食肉中の
硬さの原因であるコラーゲンだけを特異的に分解し、そ
の他食肉のテクスチュアーに重要なタンパク質は分解し
ないので食肉軟化剤として最も適したプロテアーゼであ
る。

（発明が解決しようとする課題）上記のような目的にコラゲナーゼを使用するにあたっ
ては、コラゲナーゼの安価な取得が困難であるという問
題がある。アクロモバクター・コラゲナーゼを取得する
ためには、その生産菌であるビブリオ・アルギノリティ
カスを培養し、その培養液よりコラゲナーゼを回収・精
製するが、当該細菌のコラゲナーゼ生産量が10mg/と
著しく低いことが問題である。また、当該細菌を培養す
るに際して、特別な誘導物質を培養液に添加しなければ
当該細菌はコラゲナーゼを生産しないという問題もあ
る。このような理由から、コラゲナーゼを大量に安価に
取得することが困難となっている。

これらの問題を解決するために、遺伝子光学技術を利
用することができるが、当該アクロモバクター・コラゲ
ナーゼの遺伝子は取得されておらず、当該酵素を大量に
生産すべき、遺伝子工学的手段を講じることができない
状況にあった。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、これらの問題を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、ビブリオ・アルギノリティカス由来のアク
ロモバクター・コラゲナーゼの遺伝子を取得し、そのア
ミノ酸配列を明らかにすることに成功し、本発明を完成
するに至った。これより、アクロモバクター・コラゲナ
ーゼを、例えば適当な宿主で大量に生産することや、コ
ラゲナーゼを遺伝子工学的手法により改良することなど
の手段が講じられるようになった。

すなわち、本発明は、ビブリオ・アルギノリティカス
（Vibrio alginolyticus）に属する細菌由来のコラゲナ
ーゼ遺伝子、該遺伝子またはそれと生物学的に実質的に
同等な遺伝子を含有する組換えベクター、該遺伝子を含
有するプラスミドで形質転換された宿主細胞、該細胞を
培養して得られるコラゲナーゼの製造法を提供するもの
である。

ペプチドないしはタンパク質は、そのアミノ酸配列中
の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
されていても同じ活性を有することが知られており、ま
た、同じペプチドないしはタンパク質をコードする遺伝
子でもコドンの縮重により塩基配列が相違することが知
られている。本明細書においては、これらの欠失、置換
もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列
や、コドンの縮重により相違する塩基配列も含めて、
「生物学的に同等な」と称する。

本発明のコラゲナーゼ遺伝子の取得に用いるビブリオ
・アルギノリティカスは特に限定するものではなく、ア
クロバクター・コラゲナーゼ生産菌として公知のものい
ずれでもよく、例えば、アイ・エモントら、インターナ
ショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー（I.Emonto et al.,Int.J.Syst.Bacterio
l.）、33、451−459、1983に記載されるビブリオ・アル
ギノリティカスを用いることができる。また、細菌DNA
の単離、遺伝子ライブラリーの作製、スクリーニングは
公知の方法によって行なうことができる。

宿主細胞としては、エシェリヒア・コリ（Echerichia
・coli）やバチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s）を用いることができ、ベクターとしては、エシェリ
ヒア・コリ内で複製できるpUC18、pUC19、pBR322、pGEM
3、pGEM4など、バチルス・ズブチリス内で複製できるpU
C110、pE194、pC194などが使用できる。

得られたコラゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドで
形質転換された宿主細胞を用いてコラゲナーゼを製造す
るには、例えば、エイ・レクロイジーら、FEBSレターズ
（A.Lecroisey et al.,FEBS Lett.）、59、167−172、1
975に記載される方法に従って、適当な炭素源、窒素源
および微量の金属元素を含む培地中で、該細胞を培養す
ることにより行なえる。得られた培養物を回収し、培養
上清を硫安沈澱（60％飽和）処理し、種々のカラムクロ
マドグラフィー（例えば、DEAEセルロースカラムクロマ
ドグラフィーおよびセファデックスＧ−100カラムクロ
マトグラフィーなど）を用いて精製することにより、所
望のコラゲナーゼが得られる。

得られたコラゲナーゼは、従来のものと同様な用途に
使用できる。

（実施例）以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１遺伝子ライブラリーの作製アクロモバクター・コラゲナーゼ生産菌ビブリオ・ア
ルギノリティカスから常法により全DNAを単離した。細
菌DNAの単離法としては、例えば、サイトウ・ミウラ法
［エイチ・サイトウおよびケイ・ミウラ、バイオシミカ
・バイオフィジカ・アフタ（H.Saito and K.Miura,Bioc
hem.Biophys.Acta.）72,619,1963］等が挙げられる。こ
のDNAを制限酵素Sau3A1で部分分解し、アガロースゲル
電気泳動法により分画し、5kb以上のDNA断片をを集め
た。このDNA断片を、BamH I処理したベクターpUC18とT4
リガーゼで結合し、エシェリヒア・コリJM101を形質転
換して、アンピシリン耐性形質転換体としてビブリオ・
アルギノリティカスの遺伝子ライブラリーを作製した。
エシェリヒア・コリの形質転換は常法［例えば、エム・
マンデルおよびエイ・ヒガ、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（M.Mandel and A.Higa,J.Mol.Bi
ol.,53,154,1970）を用いた。

実施例２遺伝子ライブラリーのスクリーニング形質転換体を選択するために、アクロモバクター・コ
ラゲナーゼの抗体を常法（例えば、続生化学実験法、第
５巻、１−25頁、日本生化学会編、1986年、東京化学同
人）により作製した。即ち、1mgの精製コラゲナーゼを
不完全フロイントアジュバンドと混和し、ウサギの皮下
に注射して免疫した。さらに、１週間毎に３回、同様の
操作を行い、追加免疫した。４週間目に全血を採取、硫
安分画によりIgG画分を調製し、この抗体をパーオキシ
ダーゼで酵素標識した。抗体の酵素標識は、例えば、過
よう素酸ナトリウムによる方法が利用可能であるが、詳
細は免疫実験操作法VI、1835頁（日本免疫学会編）に記
載されている。この酵素標識した抗コラゲナーゼ抗体を
用いて、上記遺伝子ライブラリーの中から、抗コラゲナ
ーゼ抗体と反応する抗原を発現しているクローンとし
て、プラスミドpLCO−１、pLCO−２、pLCO−３を持つク
ローンを選択した。プラスミドpLCO−１は、約7.0kbの
ビブリオ・アルギノリティカス由来のDNA挿入断片を持
つ。pLCO−１の挿入DNA断片の制限酵素地図を添付の第
１図に示した。

なお、プラスミドpLCO−１を持つエシェリヒア・コリ
JM101はエシェリアヒア・コリ（Echerichia coli）SAM1
514と命名し、1989年11月22日に工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第11131号（FERM P−11131）と
して寄託し、さらに1990年９月25日にブダペスト条約に
基づき、微工研寄第3113号（FERM BP−3113）に移管し
てある。

実施例３アミノ酸配列の決定アクロモバクター・コラゲナーゼの部分アミノ酸配列
は、以下のようにして決定した。精製したアクロモバク
ター・コラゲナーゼを、常法（例えば、続生化学実験
法、第２巻、260−270頁、日本生化学会編）によりトリ
プシンまたはプロテアーゼV8で各々部分加水分解した。
得られたペプチド断片を高速液体クロマトグラフィーに
より精製した後、自動化エドマン分解法によりアミノ酸
配列を決定した。その結果、本発明におけるアクロモバ
クター・コラゲナーゼは少なくとも以下の20個のペプチ
ド断片のアミノ酸配列を有していた。

但し、式（ａ）ないし（ｔ）中のアルファベットは、
以下のアミノ酸を示す。

A:アラニン、C:システイン、D:アスパラギン酸、E:グル
タミン酸、F;フェニルアラニン、G;グリシン、H:ヒスチ
ジン、I:イソロイシン、K:リシン、L:ロイシン、M:メチ
オニン、N:アスパラギン、P:プロリン、Q:グルタミン、
R:アルギニン、S:セリン、T:スレオニン、V:バリン、W:
トリプトファン、Y:チロシン。

実施例４ DNA塩基配列の決定プラスミドpLCO−１の7.0kbDNA挿入断片の内、4.1kb
について塩基配列を以下の方法で決定した。即ち、プラ
スミドpLCO−１を各種制限酵素で切断し、500bp前後のD
NA断片を調製した。これらのDNA断片をファージM13にク
ローニングし、ジデオキシ法［エフ・サンガーら、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシス・ユー・エス・エイ（F.Sanger et al,P
roc.Nat,Acad,Sci,USA）,74,5963−5967,1977］により
塩基配列を決定した。決定された塩基配列は4054塩基対
からなり、アクロモバクター・コラゲナーゼの全領域を
含んでいる。塩基配列（第２図）中には、1337〜1339番
目のATGから始まり、3779〜3781番目のTAGで終わる2442
塩基対からなるコラゲナーゼに対応するオープンリーデ
ィングフレームが存在する。ATG開始コドンの５塩基対
前にGAAGAAAのリボソームバインディングサイトが存在
する。

全塩基配列中において、決定された塩基配列から推測
されるアミノ酸配列と、実施例３において決定された部
分アミノ酸配列とを比較してみると、以下の20個のアミ
ノ酸配列において一致していた。

実施例５遺伝子産物の解析まず、コラゲナーゼ遺伝子を大腸菌で大量に生産させ
るための組換えプラスミドを作成した。プラスミドpLCO
−１の7kb挿入DNA断片上、第1213番目のHpa IサイトにB
amH Iリンカーを、3936番目のEcoR VサイトにSal Iリン
カーを挿入した。このように２つのリンカーを挿入した
pLCO−１をBamH IおよびSal Iで切断することにより、
コラゲナーゼ遺伝子の全長を含む2.7kbのDNA断片を調製
することができる。回収した当該DNA断片をベクターpUC
18のBamH I/Sal Iサイトに挿入してpHUC14を作成した。
組換プラスミドpHUC14を大腸菌JM109に形質転換して、
コラゲナーゼを大量に生産する大腸菌組換え体を作成し
た。

組換え体大腸菌内でのアクロモバクター・コラゲナー
ゼ遺伝子産物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法およびウェスターンブロット法によって解析した。ウ
ェスターンブロット法はバーネットの方法［バーネット
・ダブリュウ・エヌ、アナリティカル・バイオケミスト
リー（Burnette,W.N.,Anal.Biochem.）,112,680−685,
（1981）］を改良して行った。コラゲナーゼ遺伝子を含
有する大腸菌組換え体を、IPTGを1mMになるように添加
したＬブロス中で、37℃で17時間培養した。遠心により
菌体を集めた後、超音波処理により菌体を破砕した。こ
の菌体破砕液をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により分画した。ウェスターンブロット法により分画
されたタンパク質をニトロセルロース膜に移したのち、
ウサギより調製した抗コラゲナーゼ抗体およびパーオキ
シダーゼ標識した抗ウサギIgG抗体を用いて、コラゲナ
ーゼのバンドだけを発色させた。第３図に示すように、
pHUC14を持つ大腸菌JM109中には、分子量約85kdのタン
パク質を主成分とする抗コラゲナーゼ抗体と反応する数
多くのバンドが認められた。pLCO−１を持つ大腸菌JM10
9中には、抗コラゲナーゼ抗体と反応するタンパク質が
わずかであるが認められた。一方、対照とした組換えプ
ラスミドを含まない大腸菌JM109中には、抗コラゲナー
ゼ抗体と反応するタンパク質は全く認められなかった。
以上の結果は、コラゲナーゼ遺伝子を含む組換え体プラ
スミドpLCO−１およびpHUC14を持つ大腸菌中では、アク
ロモバクター・コラゲナーゼと免疫学的に同等のタンパ
ク質が生産されていることを示しており、しかもpHUC14
を含む大腸菌中では大量に生産されていることを示して
いる。

実施例６形質転換体のコラゲナーゼ活性アクロモバクター・コラゲナーゼ遺伝子を含有する大
腸菌組換体中のコラゲナーゼ活性を、合成基質４−フェ
ニルアゾ−ベンジオキシ−カルボニル−Ｌ−Pro−Leu−
Gly−Ｌ−Pro−Ｄ−Arg・HCl（PZ−PLGPR）を用いて測
定した。コラゲナーゼ活性の測定法および活性単位
（Ｕ）の定義は、特表昭60−500413号に詳細に開示され
ている。大腸菌の超音波処理菌体破砕液の調製法は、実
施例５に示した。

第１表に示すように、コラゲナーゼ遺伝子pHUC14を含
む大腸菌JM109中には、高いコラゲナーゼ活性が認めら
れた。プラスミドpLCO−１を含む大腸菌JM109およびプ
ラスミドを含まない大腸菌JM109中には、コラゲナーゼ
活性は認められなかった。以上の結果からコラゲナーゼ
遺伝子を含む大腸菌組換体中で発現している遺伝子産物
は、コラゲナーゼ活性を有していることが明らかになっ
た。なお、プラスミドpLCO−１を含む大腸菌中にコラゲ
ナーゼ活性を検出できないのは、発現量が低いためと考
えられる。

プラスミド：表記したプラスミドを含有する大腸菌JM10
9のコラゲナーゼ活性を示した。

（発明の効果）本発明によりビブリオ・アルギノリティカス由来のア
クロモバクター・コラゲナーゼの遺伝子が取得され、そ
のアミノ酸配列が明らかになった。これにより、アクロ
モバクター・コラゲナーゼを遺伝子工学技術を利用する
ことで例えば適当な宿主で大量に生産することや、コラ
ゲナーゼを遺伝子工学的手法により改良することなどの
手段が講じられるようになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、コラゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドpLCO−
１の7.0kb挿入DNA断片の制限酵素地図を示す図面であ
る。図中、下部矢印は、コラゲナーゼ構造遺伝子の領域
および転写の方向を示す。（）内の数字は、塩基番号を
示す。点線は、制限酵素による切断点が２者のうちで特
定できないことを示している。第２図は、コラゲナーゼ遺伝子を含むDNA断片の全塩基
配列および当該塩基配列より推定されるコラゲナーゼの
アミノ酸配列を示す。図中、実線のアンダーラインを付
した領域は、精製コラゲナーゼの部分アミノ酸配列（実
施例３参照）と一致する部分を示している。第３図は、ウェスターンブロット法による大腸菌内での
コラゲナーゼ遺伝子産物の解析を行った結果を示す模式
図であり、図中、矢印は同時に泳動を行った分子量マー
カーの泳動位置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の制限酵素地図を有するビブリオ・ア
ルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）に属する細
菌由来のコラゲナーゼをコードする遺伝子。
【請求項２】少なくとも下記式（ａ）ないし（ｔ）で示
されるペプチド断片を有するビブリオ・アルギノリティ
カス（Vibrio alginolyticus）に属する細菌由来のコラ
ゲナーゼをコードする遺伝子。但し、式（ａ）ないし（ｔ）中のアルファベットは以下
のアミノ酸を示す。 A:アラニン、C:システイン、D:アスパラギン酸、E:グル
タミン酸、F;フェニルアラニン、G;グリシン、H:ヒスチ
ジン、I:イソロイシン、K:リシン、L:ロイシン、M:メチ
オニン、N:アスパラギン、P:プロリン、Q:グルタミン、
R:アルギニン、S:セリン、T:スレオニン、V:バリン、W:
トリプトファン、Y:チロシン。
【請求項３】下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列から
なるビブリオ・アルギノリティカスに属する細菌由来の
コラゲナーゼをコードする遺伝子。式（Ｉ）：但し、式（Ｉ）中、Ｘは、水素原子または次式（II）で
表されるポリペプチドを示す。式（II）：また、式（Ｉ）、（II）中のアルファベットは、請求項
１と同意義である。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項記載のビブリ
オ・アルギノリティカスに属する細菌由来のコラゲナー
ゼ遺伝子または当該遺伝子と生物学的に同等な遺伝子を
含有する組換えベクター。
【請求項５】請求項１〜３いずれか１項記載のビブリオ
・アルギノリティカスに属する細菌由来のコラゲナーゼ
遺伝子または当該遺伝子と生物学的に同等な遺伝子を含
有するプラスミドにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】ビブリオ・アルギノリティカスに属する細
菌由来のコラゲナーゼの製造法において、請求項５記載
の宿主細胞を培養することにより該酵素を発現させ、培
養物より該酵素を回収・精製することを特徴とする該コ
ラゲナーゼの製造法。
【請求項７】下記式（III）で表される塩基配列または
式（III）と生物学的に同等な塩基配列を有する生物学
的に純化されたビブリオ・アルギノリティカスに属する
細菌由来のコラゲナーゼ遺伝子。式（III）：但し、式（III）中、Ｚはなしか、または式（IV）で表
される塩基配列を示す。式（IV）
【請求項８】請求項７記載のビブリオ・アルギノリティ
カスに属する細菌由来のコラゲナーゼ遺伝子を有する組
換ベクター。
【請求項９】請求項７記載のビブリオ・アルギノリティ
カスに属する細菌由来のコラゲナーゼ遺伝子を含有する
プラスミドにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】請求項９記載の組換体宿主細胞を培養
し、その菌体ないしは培養液から酵素を回収することを
特徴とするビブリオ・アルギノリティカスに属する細菌
由来ののコラゲナーゼの製造法。