WO2015133636A1 - グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤 - Google Patents

グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2015133636A1
WO2015133636A1 PCT/JP2015/056748 JP2015056748W WO2015133636A1 WO 2015133636 A1 WO2015133636 A1 WO 2015133636A1 JP 2015056748 W JP2015056748 W JP 2015056748W WO 2015133636 A1 WO2015133636 A1 WO 2015133636A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagenase
recombinant
grimontia
derived
kda
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/056748
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直子 寺村
克昌 飯嶋
治 林田
啓友 田中
俊治 服部
輝 興津
昌治 竹内
Original Assignee
株式会社ニッピ
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ニッピ, 国立大学法人東京大学 filed Critical 株式会社ニッピ
Priority to JP2016506205A priority Critical patent/JP6661072B2/ja
Priority to CN201580012276.4A priority patent/CN106164269A/zh
Priority to KR1020167026742A priority patent/KR20160131037A/ko
Priority to EP15757886.5A priority patent/EP3115455A4/en
Priority to US15/123,986 priority patent/US10047353B2/en
Priority to CA2941738A priority patent/CA2941738C/en
Publication of WO2015133636A1 publication Critical patent/WO2015133636A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24007—Interstitial collagenase (3.4.24.7), i.e. matrix metalloprotease 1 or MMP1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant collagenase derived from Grimontia horise and an enzyme agent for cell separation.
  • the pancreas includes exocrine glands that secrete digestive enzymes into the duodenum and pancreatic islets of the endocrine glands.
  • a method of isolating and purifying islets that play an important role in regulating blood glucose concentration from the pancreas and transplanting the islets into patients such as type 1 diabetes who are insulin dependent is called islet transplantation.
  • Islet is minimally invasive because it can be injected into the body in the manner of infusion, and the physical burden on the patient is low.
  • pancreas On the other hand, about 90% of the pancreas is an exocrine gland, and the technology for isolating islets is difficult and its success rate is extremely low.
  • a mixture containing the subtypes of collagenase H (ColH) and collagenase G (ColG) derived from Clostridium histolyticum is used in the medical field as an enzyme agent for cell separation in order to separate pancreatic islets from the pancreas.
  • ColH collagenase H
  • ColG collagenase G
  • Non-patent Document 1 Clostridium genus collagenase commonly has a catalytic domain (hereinafter sometimes referred to as CD), a polycystic kidney-like domain (hereinafter sometimes referred to as PKD), It includes three types of collagen binding domains (hereinafter sometimes referred to as CBD), and ColH is a domain structure represented by CD-PKD-PKD-CBD, consisting of one CD, two PKDs, and one CBD.
  • CD catalytic domain
  • PKD polycystic kidney-like domain
  • CBD collagen binding domains
  • ColH is a domain structure represented by CD-PKD-PKD-CBD, consisting of one CD, two PKDs, and one CBD.
  • ColG is a domain structure represented by CD-PKD-CBD-CBD, consisting of one CD, one PKD, and two CBDs.
  • Non-Patent Document 1 states that calcium binds to the N-terminal side of CBD, and that the structure of the N-terminal part of the domain changes due to the removal of calcium, that calcium is important for collagen binding, and that calcium is stable in ColH. Disclose that it contributes to
  • Non-patent Document 2 As a collagenase having a high specific activity, there is Grimontia horiseus-derived collagenase (Non-patent Document 2). It is a collagenase with a molecular weight of 84 kDa that includes a prepro region, a catalytic domain, a linker region, and a prepeptidase C-terminal domain (hereinafter also referred to as PPC). As a result of BLAST search, it is found that it has low homology with ColH and ColG. ing.
  • Patent Document 1 a method for producing bacmid pCC1BAC-2 containing a gene for all coding regions of Grimontia horrisae collagenase, a Brevibacillus choshinensis recombinant using bacmid pCC1BAC-2, A process for producing Grimontia horrisae collagenase is described.
  • Non-patent Document 1 discloses a method for producing Grimontia horrisae-derived collagenase using genetic engineering.
  • the specific activity of Grimontia horrisae collagenase sometimes fluctuated. If the specific activity is different for each production lot, it becomes difficult to use different lots with the same protocol. Furthermore, when the activity decreases with time, the amount used may vary, so that the cell yield may vary, or the cells may be burdened by excessive degradation treatment.
  • the details of the domain of collagenase derived from Grimontia horrisae have not been elucidated, and the cause of the decrease in specific activity is unknown. Therefore, there is a need for the development of recombinant collagenase derived from collagenase derived from Grimontia horise with stable specific activity.
  • the request for cell separation is not limited to islets. Liver, heart, lung, kidney, spleen, adrenal gland, muscle, thyroid gland, salivary gland, parotid gland acinus, glandular tissue such as mammary tissue, bone tissue such as bone, cartilage, endothelial cell, epithelial cell, adipose tissue, etc. May also be used after separating the cells.
  • tissue such as mammary tissue, bone tissue such as bone, cartilage, endothelial cell, epithelial cell, adipose tissue, etc.
  • the success rate of islet transplantation also depends on the amount of enzyme remaining in the isolated islet, and the transplantation rate decreases if the amount of residual enzyme is large. It is also preferable for other organs and cells that the amount of residual enzyme is small after cell washing. Therefore, a novel collagenase is desired that can be separated quickly from tissue after washing or the collagenase activity when remaining in the washed tissue is reduced, and cell damage can be avoided or reduced.
  • an object of the present invention is to provide a novel Grimontia holysei-derived recombinant collagenase having excellent collagenase activity and stable specific activity.
  • an object of the present invention is to provide an enzyme agent for cell separation using the thus-obtained novel Grimontia horsei-derived recombinant collagenase.
  • the present inventors have examined in detail the gene for collagenase derived from Grimontia horrisae.
  • the prepro region is a secretory signal sequence, has a high collagenase activity even when PPC is removed, and connects CD and PPC.
  • the inventors have found that when the third amino acid residue from the C-terminal of the linker region sequence is glycine, stable collagen activity can be maintained, and the present invention has been completed.
  • the present invention is a recombinant collagenase derived from Grimontia horrisae collagenase comprising a collagenase catalytic domain, a linker region sequence, and a prepeptidase C-terminal domain from the N-terminus to the C-terminus
  • the present invention provides a recombinant collagenase derived from Grimontia horisei, characterized in that it does not contain at least the prepeptidase C-terminal domain.
  • the present invention also provides the above-described recombinant collagenase derived from Grimontia horsei, wherein the linker region is a linker fragment cleaved by any amide bond.
  • the present invention also provides the above-mentioned recombinant collagenase derived from Grimontia horsei, wherein the linker fragment is characterized in that the third amino acid residue from the C-terminal is glycine.
  • the linker fragment may be -G 1 -X 1 -Y 1 -G 2 -X 2 -Y 2- (wherein G 1 and G 2 represent glycine, X 1 , Y 1 , X 2 and Y 2 each represent an amino acid residue which may be the same or different.) Is a linker fragment cleaved between Y 1 and G 2 of the amino acid sequence shown by The recombinant collagenase derived from Grimontia horise is provided.
  • the linker fragment is a recombinant collagenase in which the C-terminus of the linker fragment is any one of -Gly-Asp-Ser, -Gly-Asn-Glu, -Gly-Glu-Ser, or -Gly-Asn-Thr.
  • the above-mentioned recombinant collagenase derived from Grimontia horise is provided.
  • the present invention also provides an enzyme agent for cell separation containing the above recombinant collagenase.
  • the present invention also includes islets, liver, heart, lung, kidney, spleen, adrenal gland, muscle, thyroid gland, salivary gland, parotid acinar, mammary tissue, bone, cartilage, endothelial cell, epithelial cell, adipose tissue and fibroblast It is used for the separation of one or more cells selected from the group consisting of the above-mentioned enzyme agents for cell separation.
  • a recombinant collagenase derived from Grimontia horisei with a stable specific activity is provided.
  • the isolated organ is cultured with an enzyme agent for cell degradation containing this recombinant collagenase, cells can be efficiently separated.
  • 74 kDa is a 74 kDa collagenase
  • 62 kDa is a recombinant 62 kDa collagenase
  • 60 kDa is a recombinant 60 kDa collagenase
  • M is a marker.
  • Example 2 it is a figure which shows the result of having measured the time-dependent change of the specific activity from immediately after refinement
  • Example 3 it is a figure which shows a time-dependent change of the specific activity at the time of preserve
  • Example 5 It is a figure which shows the result of Example 5 and Comparative Example 1, and performs the pancreatic digestion experiment using recombinant 62 kDa collagenase or collagenase (Liberase) derived from the genus Clostridium, and the number of pancreatic islets and the result of IEQ obtained by decomposition
  • FIG. 6A The result of the number of islets is shown in FIG. 6A, and the result of IEQ is shown in FIG. 6B.
  • Example 5 it is a figure which shows the optical microscope photograph of the pancreatic islet isolated using the recombinant 62kDa collagenase.
  • FIG. 10A shows the results of Example 8 and Comparative Example 2.
  • FIG. 10A shows the binding ability of recombinant 62 kDa collagenase to collagen fibers, and FIG.
  • FIG. 10B shows the binding of Clostridium genus collagenase (liberase) to collagen fibers. This is a result showing the ability. It is a figure which shows the result of Example 8 and the comparative example 2, and is a figure which shows a mode that the wash
  • a first aspect of the present invention is a recombinant collagenase derived from Grimontia horissey-derived collagenase comprising a collagenase catalytic domain, a linker region sequence, and a prepeptidase C-terminal domain from the N-terminus to the C-terminus, ,
  • Grimontia horise Collagenase producing microorganisms include the genus Chrostridium sp., Vibrio sp., Bacillus sp., Streptomyces sp. However, the collagenase used in the present invention is derived from the genus Grimontia sp. Grimontia Horise, for example, ATCC No. 33564 and ATCC No. Available as 33565.
  • FIG. 1A shows the domain structure of the amino acid sequence of Grimontia horisese-derived collagenase.
  • the domain structure represented by “84 kDa collagenase” is a domain structure corresponding to the entire coating sequence of Grimontia horisae collagenase. From N-terminal to C-terminal, amino acid numbers 1 to 87 are prepro regions, amino acid numbers 88 to 615 are catalytic domain regions (CD), amino acid numbers 616 to 687 are linker regions, and amino acid numbers 688 to 749 are PPC domain regions ( PPC). It consists of 767 amino acids and has a molecular weight of 84 kDa.
  • the amino acid sequence of collagenase of Grimontia horrissei 1706B strain is shown in SEQ ID NO: 1, and the DNA sequence of all coding regions is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the prepro region was found to be a secretory signal sequence. However, it is not clear at which stage of translation the secretory signal sequence is released.
  • both collagenase having a prepro region and collagenase lacking the prepro region are referred to as Grimontia horrisae-derived collagenase.
  • Collagenase derived from Grimontia horisei lacking the prepro region has a molecular weight of 74 kDa. This domain structure is shown in FIG. 1A as “74 kDa collagenase”.
  • the recombinant collagenase derived from Grimontia holyse of the present invention is derived from Grimontia holysee.
  • the domain structure only needs to include at least PPC.
  • the recombinant collagenase is composed of a prepro region, a CD, and a linker region from the N-terminal to the C-terminal, with the sequence after amino acid number 688 deleted. Further, it may be a recombinant collagenase that lacks the prepro region and consists of a CD and a linker region.
  • the recombinant collagenase derived from Grimontia horsei of the present invention has reduced collagenase activity after washing and cell damage, as shown in Examples below.
  • the linker region of the recombinant collagenase derived from Grimontia horsei of the present invention may be a linker fragment that lacks a part of its amino acid sequence.
  • the “linker fragment” in the present invention means a fragment obtained by cleaving at any amide bond in the linker region. For example, in the domain structure shown in the 84 kDa collagenase of FIG. 1A, the domain structure is cleaved by any amide bond in the linker region from 616th to 687th.
  • FIG. 1A is an example having a linker fragment consisting of 31 amino acids from 616 to 646, and the “recombinant 60 kDa collagenase” in FIG. 1A consists of 9 amino acids from 616 to 624. This is an example having a linker fragment.
  • the third amino acid residue from the C-terminal is preferably glycine.
  • Recombinant collagenase in which the third amino acid residue from the C-terminal is glycine is excellent in the stability of collagenase activity as shown in the examples described later.
  • the linker region is -G 1 -X 1 -Y 1 -G 2 -X 2 -Y 2- (wherein G 1 and G 2 represent glycine, X 1 , Y 1 , X 2 and Y 2 each represent an amino acid residue which may be the same or different.
  • FIG. 1B For convenience, a part of the amino acid sequence of the linker region of “84 kDa collagenase” shown in FIG. 1A is shown in FIG. 1B.
  • “60 kDa” indicates the C terminus of “recombinant 60 kDa collagenase”
  • “62 kDa” indicates the C terminus of “recombinant 62 kDa collagenase”.
  • the C-terminal of the recombinant 60 kDa collagenase is a fragment obtained by cleaving between S and G of the sequence represented by -GDGSAG- in the linker region, and the recombinant 62 kDa collagenase has T and G of the sequence represented by -GNTGLP-. Is cut between the two.
  • the third amino acid residue from the C-terminal is glycine.
  • the cleavage at -G 1 X 1 Y 1 G 2 X 2 Y 2 -in the linker region is performed between 637 and 638 or between 642 and 643 as shown in FIG. 1B. It may have been cut with
  • the C-terminus of the recombinant collagenase of the present invention is the above-mentioned -G 1 -X 1 -Y 1 -G 2 -X 2 -Y 2- (wherein G 1 and G 2 represent glycine, and X 1 , Y 1 , X 2 and Y 2 each represent an amino acid residue which may be the same or different.
  • the linker fragment cleaved between Y 1 and G 2 of the amino acid sequence represented by This is because the specific activity of the recombinant collagenase having a linker fragment cleaved between Y 1 and G 2 is stable for a long period of time.
  • the C-terminus is preferably any one of -GDS, -GNE, -GES, and -GNT, for example.
  • C-terminal will be the sequence.
  • the amino acid sequence of the recombinant 60 kDa collagenase of the amino acid sequence of amino acid numbers 88 to 624 is deleted in the prepro region and PPC, and has a predetermined linker fragment.
  • SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence of amino acid numbers 88 to 646 The amino acid sequence of the recombinant 62 kDa collagenase is shown in SEQ ID NO: 4.
  • a collagenase having the amino acid sequence of amino acid numbers 88 to 767 from which the prepro region has been deleted from the 84 kDa collagenase is referred to as 74 kDa collagenase, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the reason why the recombinant collagenase of the present invention is excellent in storage stability is not clear.
  • the specific activity and stability of 74 kDa collagenase with PPC and recombinant collagenase without PPC were evaluated, 74 kDa collagenase has higher specific activity, so that PPC itself has collagen binding ability, CD May support the activity of collagenase.
  • the recombinant collagenase of the present invention it is presumed that the collagenase activity is stabilized and the separability from the tissue by washing is increased by deleting the PPC that assists the collagenase activity.
  • the recombinant collagenase of the present invention may be one in which the linker region is deleted as long as PPC is deleted.
  • the transformation DNA for preparing the recombinant collagenase of the present invention encodes at least an amino acid sequence corresponding to CD, more preferably CD and a part of the linker region. Which encodes an amino acid sequence comprising Furthermore, it may have an amino acid sequence corresponding to the prepro region on the N-terminal side.
  • the one cleaved between Y 1 and G 2 in the sequence represented by -G 1 X 1 Y 1 G 2 X 2 Y 2- contained in the linker region sequence is preferably used. be able to.
  • DNA that does not contain PPC and can be used to produce a recombinant collagenase in which the third from the C-terminus is glycine a DNA encoding the amino acid sequence represented by the following (I) can be used.
  • Formula (I): -X X is a polypeptide represented by TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT or TEALAKGDS.
  • SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence when X is TEALAKGDS
  • SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence when X is TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT.
  • the alphabet used by the said formula shows the following amino acids.
  • A Alanine, C: Cysteine, D: Aspartic acid, E: Glutamic acid
  • F Phenylalanine
  • G Glycine
  • H Histidine
  • I Isoleucine
  • K Lysine
  • L Leucine
  • M Methionine
  • N Asparagine
  • P Proline
  • Q glutamine
  • R arginine
  • S serine
  • T threonine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine.
  • a recombinant vector containing DNA encoding the above amino acid sequence is prepared, transformed with the recombinant vector to prepare a host cell having collagenase activity, and the host cell is cultured.
  • a gene product having collagenase activity may be produced.
  • Such a method for producing a recombinant protein can be carried out using genetic engineering techniques.
  • a clone containing a collagenase gene derived from Grimontia horrisae is selected from the genomic library of Grimontia horise, and Nco I is placed on the 5 ′ side of the DNA fragment encoding SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 using the clone as a template.
  • Add a Hind III site to the 3 'side amplify it with Expand High Fidelity PCR System (Roche), treat the amplified fragment with Nco I-Hind III, recover the DNA fragment, plasmid vector, etc.
  • Recombinant plasmids are prepared by inserting them into Brevibacillus choshinensis strains, for example, by transforming Brevibacillus choshinensis strain HPD31-SP3.
  • a 15 base pair sequence homologous to both ends of the linear expression vector to be inserted into both ends of the DNA fragment encoding SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 using a clone containing the collagenase gene derived from Grimontia horsei as a template
  • the amplified DNA fragment and a linear expression vector were mixed, and then introduced into Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 strain etc.
  • the method for collecting and purifying the recombinant collagenase, which is the target substance, from the culture can be performed in accordance with general enzyme collecting and purification means.
  • the cells are separated from the culture by centrifugation or filtration, and column separation is performed using ordinary separation means such as organic solvent precipitation, salting out, concentration by ultrafiltration membrane, etc.
  • purifying by is mentioned.
  • the recombinant collagenase derived from Grimontia horsei of the present invention may produce recombinant collagenase from a host cell previously transformed with a DNA not containing a prepro region, or may be a host cell transformed with a DNA containing a prepro region. Recombinant collagenase may be produced from the prepro region during or after translation.
  • the recombinant collagenase obtained by the production method of the present invention can be used in the same manner as a conventional collagenase, and can be used, for example, as an enzyme agent for cell separation.
  • an enzyme agent for cell separation In addition to islets, liver, heart, lung, kidney, spleen, adrenal gland, muscle, thyroid gland, salivary gland, parotid gland acinar, mammary gland tissue, bone, cartilage, etc.
  • the recombinant collagenase obtained in the present invention has a stable specific activity, it can be suitably used as an enzyme agent for cell separation for isolating pancreatic islets from isolated pancreatic organs. As shown in the examples described later, collagenase activity on the washed tissue is low and cell damage is small.
  • the enzyme agent for cell separation used in the present invention may further contain metalloprotease, serine protease, cysteine protease and other components.
  • metalloproteases include thermolysin, dispase, Clostridium histolyticum-derived neutral protease, and the like.
  • Serine proteases include trypsin and elastase, and cysteine proteases include chymopapain.
  • the cell separation enzyme of the present invention is added to the removed organ or animal tissue and cultured for a predetermined time.
  • the extract is cultured in the above-described enzyme agent for cell separation and a culture solution to which other components are added, the extracellular matrix and intercellular bonds of the extracted tissue can be separated to isolate the cells.
  • the isolated cells may be recovered from the culture solution by filtration or centrifugation.
  • pancreatic organs can be used as isolated organs to isolate islets. Since the islets are linked to other tissues in the pancreas by collagen, the islets can be released from other tissues by culturing with collagenase.
  • the enzyme agent for cell separation of the present invention is injected from the pancreatic duct of the removed pancreatic organ and cultured for a predetermined time. The culture time may be appropriately selected depending on the state of the tissue used, the amount of recombinant collagenase contained in the enzyme agent for cell separation, and the like. Since islets are lighter than other tissues, they can be purified by density gradient centrifugation after culture.
  • pancreatic islets It is not limited to pancreatic islets, but also liver, heart, lung, kidney, spleen, adrenal gland, muscle, thyroid gland, salivary gland, parotid gland, mammary gland tissue such as bone tissue, bone tissue such as bone and cartilage, endothelium It can be suitably used for any cell separation such as cells, epithelial cells, adipose tissue, fibroblasts and the like.
  • Example 1 Bacmid pCC1BAC-2 containing the genes for all coating regions of Collagenase derived from Grimontia horissei (Accession number; NITE BP-00739: Date of deposit (original deposit); April 28, 2009: Name of the depository institution; Independent administrative agency product evaluation National Institute of Technology Patent Microorganism Depositary (NPMD): Name of depositary institution; Japan 2920-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu-shi, Chiba Prefecture 2920-8) as a template for the collagenase gene derived from the peptide sequence of SEQ ID NO: 5 An Nco I site was added to the 5 ′ side of the partial sequence (length 2040 bp), and a Hind III site was added to the 3 ′ side, and amplified by the Expand High Fidelity PCR System (Roche).
  • NITE BP-00739 Date of deposit (original deposit); April 28, 2009: Name of the depository institution; Independent administrative agency product evaluation National Institute of Technology Patent Microorganism Deposit
  • the following primer set was used for the PCR reaction. Of the primer sequences, restriction enzyme sites are underlined. Fwd: AAA CCATGG CTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT (SEQ ID NO: 6) Rvs: AAA AAGCTT TTACTGACGACACTGGTTAC (SEQ ID NO: 7)
  • the DNA fragment recovered by treating the amplified fragment with Nco I-Hind III was inserted into the cloning site of plasmid vector pNY326, and pNY326-Col. 74 was produced. Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 strain was transformed with this recombinant plasmid to produce a recombinant.
  • a partial sequence (length) of the collagenase gene derived from the peptide sequence of SEQ ID NO: 3 using, as a template, bacmid pCC1BAC-2 (NITE BP-00739) containing the gene for the entire coating region of Grimontia horrisae collagenase 1611 bp) was isolated using a PCR reaction using the following primer set: Of the primer sequences, sequences homologous to the sequences at both ends of the linear vector are underlined.
  • a linear expression vector pNY326 was prepared using a PCR reaction using the following primer set. Among the primer sequences, sequences homologous to the sequences at both ends of the DNA fragment to be inserted are underlined.
  • the DNA fragment (1611 bp) encoding the recombinant 60 kDa collagenase of SEQ ID NO: 3 and the linear expression vector pNY326 were mixed at a molar ratio of 2: 1, and then introduced into competent cells by the new Tris-PEG method. Bacillus choshinensis HPD31-SP3 strain was transformed into plasmid pNY326-Col. 60 and recombinants were produced.
  • a partial sequence (length: 1677 bp) of the collagenase gene derived from the peptide sequence of SEQ ID NO: 4 was isolated using a PCR reaction using the following primer set. Of the primer sequences, sequences homologous to the sequences at both ends of the linear vector are underlined.
  • Rvs CATCCTGTTAAGCTT AGGTATTACCACCAGATTCA (SEQ ID NO: 13)
  • a linear expression vector pNY326 was prepared in the same manner as described above, and a plasmid pNY326-Col. Containing a DNA fragment (1677 bp) encoding the recombinant 62 kDa collagenase of SEQ ID NO: 4 was prepared. 62 and recombinants were produced. As described above, three types of Brevibacillus choshinensis recombinants were prepared.
  • the HPLC system was performed by anion exchange column chromatography using DEAE-Sepharose. Each culture supernatant was applied to a column to adsorb collagenase, and then 50 mM Bis-Tris HCl buffer (pH 7) was flowed while the NaCl concentration was continuously increased from 0.2 to 1 M to separate and elute collagenase. 4 ml of eluate was collected in the order of elution and fractionated.
  • FIG. 74 kDa indicates 74 kDa collagenase
  • 62 kDa indicates recombinant 62 kDa collagenase
  • 60 kDa indicates recombinant 60 kDa collagenase.
  • Example 2 The changes over time in the specific activities of 74 kDa collagenase, recombinant 62 kDa collagenase and recombinant 60 kDa collagenase obtained in Example 1 were measured by the following method. The measurement results are shown in FIG. 74 kDa had an activity of 18,000 (U / mg) immediately after purification, but decreased to 11,500 (U / mg) after 24 hours, and the activity decreased with time. On the other hand, both the recombinant 62 kDa collagenase and the recombinant 60 kDa collagenase transitioned around 12,000 (U / mg) immediately after purification until 24 hours, and the collagenase activity was stable.
  • Example 3 The time course of specific activity when the recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1 was stored at a temperature of 4 ° C. was evaluated. The relative value when the specific activity value on the 0th day is taken as 100% is shown in FIG. As shown in FIG. 4, high specific activity could be stably maintained over 100 days. Recombinant 60 kDa collagenase also showed similar stability.
  • Example 4 A pancreatic digestion experiment was performed using the recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1.
  • the pancreas was isolated from a mouse, 0.00625-0.20 mg of recombinant 62 kDa collagenase in 1 ml of HBSS buffer, and 0.012 mg of thermolysin (Roche Applied Science, product name “Liberase C / T”)
  • the enzyme solution containing the solution was injected from the pancreatic duct and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the amount of protein in the fraction (decomposed tissue) that passed through a 1 mm mesh and the fraction (non-decomposed tissue) remaining on the mesh was measured.
  • Example 5 As in Example 4, pancreatic digestion experiments were performed using the recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1, the number of islets obtained by decomposition was measured, and IEQ (Islet Equivalent: 1 is a pancreatic islet having a diameter of 150 ⁇ m. The defined international unit of islet volume was evaluated.
  • FIG. 6A shows the result of the number of islets due to the difference in the concentration of the recombinant 62 kDa collagenase
  • FIG. 6B shows the result of IEQ.
  • the optical micrograph of the isolated islet is shown in FIG.
  • Example 1 (Comparative Example 1) Instead of the recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1, a collagenase derived from the genus Clostridium (Roche Applied Science, trade name “Liberase C / T”) was used in the same manner as in Example 5, The number and IEQ were evaluated. The results are also shown in FIGS. 6A and 6B. The recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1 was able to separate the islets from the pancreatic tissue in the same manner as a conventional commercial product.
  • Example 6 The islets obtained in Example 5 were transplanted under the renal capsule of STZ-induced diabetic mice, and blood glucose levels were measured over time.
  • the kidney transplanted with islets was removed on the 39th day after transplantation, the blood glucose level increased again.
  • FIG. 8A The isolated islet transplanted kidney and a partially enlarged photograph are shown in the upper and lower two stages of the left end of FIG. 8B.
  • Example 7 Liver digestion experiments were performed using the recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1.
  • the liver of anesthetized rats was exsanguinated under HBSS buffer perfusion to remove calcium, and then the liver was perfused with recombinant 62 kDa collagenase 0.05 mg / ml and thermolysin 0.01 mg / ml for 10 minutes to add calcium. Later, the liver was removed.
  • the isolated liver was ice-cooled, minced with a scalpel, and filtered with a gauze and a strainer. After removing dead cells, the liver cells were collected by centrifugation.
  • a phase contrast micrograph of hepatocytes is shown in FIG. When these hepatocytes were cultured for 7 days, the survival rate was 98%.
  • Example 8 The ability of the recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1 to bind to collagen fibers and the collagenase activity remaining in the collagen fibers after washing were evaluated. Place 5 mg of pig skin collagen fiber and 400 ⁇ l of Tris HCl buffer (pH 7.5) containing 0.2 M NaCl and 5 mM CaCl 2 in a spin column containing a filter, and centrifuge at 10,000 rpm for 2 minutes. The collagen fibers were washed with the buffer solution and centrifuged 5 times.
  • Tris HCl buffer pH 7.5
  • the washing solution is discarded, and the enzyme mixture (recombinant 62 kDa collagenase 0.2 mg / ml, ovalbumin 0.2 mg / ml, orthophenanthroline 4 mM, NaCl 0.2 M, CaCl 100 ⁇ l of Tris HCl buffer (pH 7.5) containing 5 mM of 2 was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes to bind the recombinant 62 kDa collagenase to the collagen fibers. Subsequently, centrifugation was performed at 10,000 rpm for 2 minutes to separate the collagen fibers on the filter and the mixed solution that passed through the filter. A part of this mixture was analyzed by SDS-PAGE.
  • collagen fibers bound to collagenase in the spin column were collected in a 2 ml tube, and Tris HCl buffer containing 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , 0.1 mg / ml collagen peptide, 4 mM orthophenanthroline ( pH 7.5) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 10 minutes, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 2 minutes, and the precipitate was washed with the collagen peptide-containing buffer solution, followed by centrifugation 5 times. . Each of the 5 washing supernatants was analyzed by SDS-PAGE.
  • FIG. 11 shows the change over time of the collagen fibers collected at the bottom of the 2 ml tube.
  • the supernatant after standing for 20 hours was analyzed by SDS-PAGE. The result of SDS-PAGE is shown in FIG.
  • Example 2 The same operation as in Example 8 was carried out except that the same amount of collagenase derived from the genus Clostridium (Roche Applied Science, trade name “Liberase C / T”) was used instead of the recombinant 62 kDa collagenase. The results are shown in FIG. 10B and FIG.
  • the liberase band is thin, so that the liberase binds to the collagen fibers, and the washing supernatant when the collagenase-bound collagen fibers are washed with the collagen peptide,
  • the band of liberase was thin over washings 1 to 5, and collagenase remained in the collagen fibers even after washing with collagen peptide.
  • the same tendency as that of recombinant 62 kDa collagenase was exhibited.
  • the enzyme activity of collagenase remaining in the collagen fibers was observed to be different between recombinant 62 kDa collagenase and liberase.
  • the higher the collagenase activity of the residual enzyme the faster the amount of collagen fibers decreases.
  • the extent to which the amount of collagen fibers is reduced is lower for the recombinant 62 kDa collagenase than for the liberase.
  • treatments such as islet isolation cell damage is caused by the residual enzyme. Therefore, it is preferable that the enzyme does not remain after islet isolation or that the collagenase activity is reduced even if the residual enzyme is present.
  • the recombinant 62 kDa collagenase and liberase bind to the collagen fiber, and even if this is washed five times with the collagen peptide, a part remains in the collagen fiber.
  • the activity of the remaining enzyme was different between the two, and the collagenase activity of the recombinant 62 kDa collagenase was lower than that of Liberase.
  • the recombinant 62 kDa collagenase does not have “CBD” that binds to collagen fibers unlike the reberase. Since there is no “CBD”, the binding to collagen fibers is loose, and there may be a difference in collagenase activity due to residual enzyme.
  • Example 9 Fluorescently labeled type I collagen (hereinafter referred to as FITC-collagen) of the recombinant 62 kD collagenase obtained in Example 1 and a collagenase derived from the genus Clostridium (Roche Applied Science, trade name “Liberase C / T”) and The degradation activity against the synthetic substrate N- (3 [2-furyl] acryloyl) -Leu-Gly-Pro-Ala (hereinafter referred to as FALGPA) was evaluated.
  • FITC-collagen Fluorescently labeled type I collagen
  • FITC-collagen uses 50 mM Tris-HCl (pH 7.5, 30 ° C.) buffer containing 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , and FALGPA contains 0.4 M NaCl, 40 mM CaCl 2 . Containing 50 mM Tricine (pH 7.5, 30 ° C.) was used.
  • Tris-HCl pH 7.5, 30 ° C.
  • FALGPA contains 0.4 M NaCl, 40 mM CaCl 2 .
  • Containing 50 mM Tricine pH 7.5, 30 ° C.
  • FALGPA was detected and quantified with a microplate reader, and FALGPA degradation activity was evaluated.
  • the activity of 1 mg of enzyme decomposing 1 ⁇ mole of the peptide per minute was calculated as a specific activity of 1 U / mg.
  • the specific activity obtained is shown in Table 1. It was suggested that the recombinant 62 kD collagenase not only decomposes collagen, but also has excellent degradation activity against the synthetic substrate FALGPA, and therefore has excellent gelatin degradation as well as collagen.
  • Example 10 Using the recombinant 62 kDa collagenase obtained in Example 1, the activity against type I, type II, type III, type IV, type V, and type VI collagen was evaluated. 1 ⁇ g / ml collagenase dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.2 M NaCl and 5 mM CaCl 2 was added to 0.5 mg / ml of the above collagen, and 30 ° C. The sample was collected at the start of incubation, after 1 hour, 3 hours, and 5 hours, and analyzed by electrophoresis.
  • type II, type III, type IV, type V, and type VI collagen This tendency was similarly observed for type II, type III, type IV, type V, and type VI collagen.
  • type IV and type V collagen the band becomes thin when reacted with a recombinant 62 kDa collagenase for 3 hours or 5 hours, whereas the band does not disappear with reberase.
  • the type VI collagen has a thin band when reacted with a recombinant 62 kDa collagenase for 72 hours, whereas the band does not disappear with reberase. It was suggested that the recombinant 62 kDa collagenase can also degrade collagen that is not easily degraded by liberase.
  • a recombinant collagenase having a stable specific activity and an enzyme agent for cell separation containing the recombinant collagenase are provided and useful.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　比活性が安定なリコンビナントコラゲナーゼおよび当該リコンビナントを含む細胞分離用酵素剤を提供する。Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼである。得られたリコンビナントコラゲナーゼは、比活性が高く、かつ安定している。

Description

グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤
　本発明は、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ、および細胞分離用酵素剤に関する。
　膵臓には、消化酵素を十二指腸内へ分泌する外分泌腺と、内分泌腺の膵島とが含まれる。膵臓から、血糖の濃度調節に重要な役割を果たしている膵島を分離および精製し、インスリン依存状態にある１型糖尿病などの患者に移植する療法を、膵島移植という。膵島は点滴の要領で体内に注入できるため低侵襲であり、患者の身体的負担が低い。
　一方、膵臓の約９割は外分泌腺であり、膵島を分離する技術は難しく、その成功率は極めて低い。現在、細胞分離用の酵素剤として、クロストリジウム・ヒストリチカム由来のコラゲナーゼＨ（ＣｏｌＨ）とコラゲナーゼＧ（ＣｏｌＧ）というサブタイプを含む混合物が膵臓から膵島を分離するために医療現場で使用されている。しかしながら、膵臓の組織構成は年齢や肥満度により異なるため、膵島分離用の酵素剤と提供された膵臓組織とが適合した場合に膵島分離が成功しているに過ぎない。
　前記ＣｏｌＨとＣｏｌＧは、複数のドメイン構造を持つマルチドメインタンパク質であり、その活性は、ドメインの組み合わせと相対的な配置に関連する（非特許文献１）。非特許文献１によれば、クロストリジウム属由来コラゲナーゼは、共通して、触媒ドメイン（以下、ＣＤと称する場合がある。）、多発性嚢胞腎様ドメイン（以下、ＰＫＤと称する場合がある。）、コラーゲン結合ドメイン（以下、ＣＢＤと称する場合がある。）の３種を含み、ＣｏｌＨは、１つのＣＤ、２つのＰＫＤ、１つのＣＢＤからなる、ＣＤ－ＰＫＤ－ＰＫＤ－ＣＢＤで示すドメイン構造であり、ＣｏｌＧは、１つのＣＤ、１つのＰＫＤ、２つのＣＢＤからなる、ＣＤ－ＰＫＤ－ＣＢＤ－ＣＢＤで示すドメイン構造である。非特許文献１は、ＣＢＤのＮ末端側にはカルシウムが結合し、カルシウムが外れることでドメインのＮ末端部が構造変化すること、カルシウムはコラーゲンの結合に重要であること、カルシウムがＣｏｌＨの安定化に寄与していることなどを開示する。
　一方、比活性が高い微生物由来コラゲナーゼとして、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼがある（非特許文献２）。プレプロ領域、触媒ドメイン、リンカー領域、およびプレペプチダーゼＣ末端ドメイン（以下、ＰＰＣとも称する。）を含む、分子量８４ｋＤａのコラゲナーゼであり、ＢＬＡＳＴ検索の結果、ＣｏｌＨやＣｏｌＧとの相同性が低いことがわかっている。また、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは安価な取得が困難であるという問題に鑑みて、遺伝子工学的手法を用いた当該コラゲナーゼ生産のための技術を構築する方法も提案されている（特許文献１）。当該特許文献１には、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーディング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ－２を作製する方法、バクミドｐＣＣ１ＢＡＣ－２を用いてブレビバチルス・チョウシネンシス組み換え体を作製し、これによりグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼを製造する方法が記載されている。
特開２０１０－２６３８８０号公報
大林尚美、村山和隆、"マルチドメインタンパク質コラゲナーゼの分子内コンホメーション変化の解析、生化学、第８５巻、第８号、ｐｐ６９２－６９９、２０１３年 Teramura Naoko etc, Cloning of a Novel Collagenase Gene from the Gram-Negative Bacterium Grimontia (Vibrio) hollisae 1706B and Its Efficient Expression in Brevibacillus choshinensis, Journal of Bacteriology,June 2011 vol.193 no.12 p.3049-3056.
　膵島移植その他の医療現場では、入手が容易なＣｏｌＨとＣｏｌＧとの混合物が使用されている。しかしながら、ＣｏｌＨとＣｏｌＧとはドメイン構造が相違し、ＣｏｌＨとＣｏｌＧの配合比によって性能が変化するため活性が安定しない。一方、配合比を調整することは容易でなく、膵島分離の成功率を低下させる一因となっている。したがって、混合することなく、活性が安定した細胞分離用酵素剤の開発が希求されている。
　一方、前記非特許文献１で開示されるグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは比活性が高く、特許文献１では、遺伝子工学を用いたグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの生産法も開示している。しかしながら、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは比活性が変動する場合があった。製造ロットごとに比活性が異なると、異なるロットのものを同じプロトコルで使用することが困難となる。更に、経時的に活性が低下すると、使用量が変動するため細胞収量が変動し、または過度の分解処理を行うことで細胞に負荷を与える場合がある。一方、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのドメインの詳細は解明されておらず、比活性が低減する原因も不明である。したがって、比活性が安定したグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来する、リコンビナントコラゲナーゼの開発が希求されている。
　更に、細胞分離の要請は、膵島に限定されるものではない。肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉の他、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織などの腺組織、骨、軟骨などの骨組織、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織なども細胞を分離した後に使用されることがある。分離細胞の生着性その他を良好に維持するには、細胞の損傷が少なく生着率が高いことが重要である。したがって、種々の細胞の分離性に優れ、かつ生着率に優れる細胞分離剤の開発が望まれる。
　膵島移植の成功率は、分離された膵島に残留する酵素量にも依存し、残留酵素量が多いと移植率が低下する。細胞洗浄後に残留酵素が少ないことが好ましいことは他の臓器や細胞でも同様である。したがって、組織を洗浄した後に組織から速やかに分離し、または、洗浄組織に残留した際のコラゲナーゼ活性が低減され、細胞障害を回避しまたは低減できる、新規コラゲナーゼが望まれる。
　このような状況下、本発明は、コラゲナーゼ活性に優れかつ比活性が安定した、新規なグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供することを目的とする。
　更に本発明は、このようにして得られた新規グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを用いた細胞分離用酵素剤を提供することを目的とする。
　本発明者等は、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの遺伝子について詳細に検討したところ、プレプロ領域は分泌シグナル配列であること、ＰＰＣを除去しても高いコラゲナーゼ活性を有すること、ＣＤとＰＰＣとを結ぶリンカー領域配列のＣ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであると、安定したコラーゲン活性を維持できることなどを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、
　少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。
　また本発明は、前記リンカー領域は、いずれかのアミド結合で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。
　また本発明は、前記リンカー断片は、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであることを特徴とする、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。
　また本発明は、前記リンカー断片が、前記リンカー領域に含まれる－Ｇ１－Ｘ１－Ｙ１－Ｇ２－Ｘ２－Ｙ２－（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。
　また本発明は、前記リンカー断片のＣ末端は、－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ、－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｕ、－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、または－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｔｈｒのいずれかであるリコンビナントコラゲナーゼである、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。
　また本発明は、前記リコンビナントコラゲナーゼを含む、細胞分離用酵素剤を提供するものである。
　また本発明は、膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織、骨、軟骨、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織および繊維芽細胞からなる群から選択される１以上の細胞の分離に使用されることを特徴とする、前記細胞分離用酵素剤を提供するものである。
　本発明によれば、比活性が安定したグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼが提供される。摘出臓器を、このリコンビナントコラゲナーゼを含む細胞分解用酵素剤で培養すると、効率的に細胞を分離することができる。
グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのドメイン構造と、リンカー領域の配列、並びにリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼをコードするアミノ酸配列を説明する図である。 実施例１の結果を示す図であり、精製酵素のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す図である。７４ｋＤａは、７４ｋＤａコラゲナーゼ、６２ｋＤａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ、６０ｋＤａはリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ、Ｍはマーカーを示す。 実施例２において、７４ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼの精製直後からの比活性の経時変化を測定した結果を示す図である。 実施例３において、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを、温度４℃で保存した際の比活性の経時変化を示す図である。 実施例４の結果を示す図であり、酵素液に含まれるリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度と分解組織量および非分解組織量の変化を示す図である。 実施例５および比較例１の結果を示す図であり、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ、またはクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（リベラーゼ）を用いて膵臓消化実験を行い、分解して得た膵島の個数とＩＥＱの結果を示す図である。膵島の個数の結果を図６Ａに、ＩＥＱの結果を図６Ｂに示す。 実施例５において、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて単離した膵島の光学顕微鏡写真を示す図である。 実施例６の結果を示す図であり、膵島を移植したＳＴＺ誘導糖尿病マウスと移植しなかったマウスの血糖値の推移、および摘出した膵島移植腎、組織染色の結果を示す図である。マウスの血糖値の推移の結果を図８Ａに、摘出した膵島移植腎、組織染色の結果を図８Ｂに示す。 実施例７で分離した肝細胞の位相差顕微鏡写真像を示す図である。 実施例８、比較例２の結果を示す図であり、図１０Ａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのコラーゲン線維に対する結合能を示す結果であり、図１０Ｂはクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（リベラーゼ）のコラーゲン線維に対する結合能を示す結果である。 実施例８、比較例２の結果を示す図であり、洗浄したコラーゲン線維が、残留するコラゲナーゼによって経時的に分解された様子を示す図である。 実施例１０の結果を示す図であり、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼをＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型コラーゲンに作用させた後の電気泳動像を示す図である。
　本発明の第一は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼである。以下、本発明を詳細に説明する。
　（１）グリモンティア・ホリセー
　コラゲナーゼを産生する微生物としてクロストリジウム属（Chrostridium sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、バチルス属（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）などが知られているが、本発明で使用するコラゲナーゼは、グリモンティア属（Grimontia sp.）に由来する。なお、グリモンティア・ホリセーは、例えばＡＴＣＣ　Ｎｏ．３３５６４やＡＴＣＣ　Ｎｏ．３３５６５として入手することができる。
　（２）グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ
　グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのアミノ酸配列のドメイン構造を図１Ａに示す。「８４ｋＤａコラゲナーゼ」で示すドメイン構造は、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング配列に対応するドメイン構造である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、アミノ酸番号１～８７がプレプロ領域、アミノ酸番号８８～６１５が触媒ドメイン領域（ＣＤ）、アミノ酸番号６１６～６８７がリンカー領域、アミノ酸番号６８８～７４９がＰＰＣドメイン領域（ＰＰＣ）である。７６７個のアミノ酸で構成され、分子量は８４ｋＤａである。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの一例として、グリモンティア・ホリセー１７０６Ｂ株のコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に、全コーディング領域のＤＮＡ配列を配列番号２に示す。なお、前記プレプロ領域は、分泌シグナル配列であることが判明した。ただし、翻訳のいずれの段階で分泌シグナル配列が離脱するかは明確ではない。本発明では、プレプロ領域を有するコラゲナーゼおよびプレプロ領域を欠失したコラゲナーゼの双方を、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼとする。プレプロ領域を欠失したグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの分子量は７４ｋＤａである。このドメイン構造を、図１Ａに、「７４ｋＤａコラゲナーゼ」として示す。
　（３）グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ
　本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、グリモンティア・ホリセーに由来する。そのドメイン構造は、少なくともＰＰＣを含まないものであればよい。例えば、前記図１Ａの８４ｋＤａコラゲナーゼに示すドメイン構造において、アミノ酸番号６８８以降の配列が欠失され、Ｎ末端からＣ末端に向かって、プレプロ領域、ＣＤ、リンカー領域で構成されるリコンビナントコラゲナーゼである。更にプレプロ領域を欠失し、ＣＤとリンカー領域とからなるリコンビナントコラゲナーゼであってもよい。後記する実施例に示すように、ＰＰＣを欠失しても高いコラゲナーゼ活性を発揮し、かつコラゲナーゼ活性が安定することが判明した。更に、本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、後記実施例に示すように、洗浄後のコラゲナーゼ活性が低減され、細胞障害が低減される。
　本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼのリンカー領域は、そのアミノ酸配列の一部を欠失するリンカー断片であってもよい。本発明における「リンカー断片」とは、リンカー領域のいずれかのアミド結合で切断されたものを意味する。例えば、図１Ａの８４ｋＤａコラゲナーゼに示すドメイン構造では、第６１６から６８７のリンカー領域のいずれかのアミド結合で切断されたものとなる。図１Ａの「リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ」は、第６１６から６４６の３１個のアミノ酸からなるリンカー断片を有する例であり、図１Ａの「リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ」は、第６１６から６２４の９個のアミノ酸からなるリンカー断片を有する例である。
　前記リンカー断片は、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであることが好ましい。Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンとなるリコンビナントコラゲナーゼは、後記する実施例に示すように、コラゲナーゼ活性の安定性に優れる。前記リンカー領域は、配列番号１に示すように、－Ｇ１－Ｘ１－Ｙ１－Ｇ２－Ｘ２－Ｙ２－（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列を含んでいる。リンカー領域が、前記アミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されると、Ｃ末端から３番目のアミノ酸がグリシンとなる。
　便宜のため、図１Ａに示す「８４ｋＤａコラゲナーゼ」のリンカー領域のアミノ酸配列の一部を図１Ｂに示す。「６０ｋＤａ」は「リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ」のＣ末端を、「６２ｋＤａ」は、「リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ」のＣ末端を示す。リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼのＣ末端は、リンカー領域の－ＧＤＳＧＡＧ－で示される配列のＳとＧとの間が切断されたものであり、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、－ＧＮＴＧＬＰ－で示される配列のＴとＧとの間で切断されたものである。その結果、いずれも、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンとなる。なお、前記リンカー領域における前記－Ｇ１Ｘ１Ｙ１Ｇ２Ｘ２Ｙ２－における切断は、図１Ｂに示すように、第６３７と第６３８との間や、第６４２と第６４３との間で切断されたものであってもよい。
　本発明のリコンビナントコラゲナーゼのＣ末端は、前記－Ｇ１－Ｘ１－Ｙ１－Ｇ２－Ｘ２－Ｙ２－（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片であることが好ましい。Ｙ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片を有するリコンビナントコラゲナーゼの比活性は、長期間に亘り、安定だからである。したがって、Ｃ末端は、例えば、－ＧＤＳ、－ＧＮＥ、－ＧＥＳ、および－ＧＮＴのいずれかであることが好ましい。図１Ｂに示す配列において、前記アミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されると、Ｃ末端は上記配列となる。
　前記プレプロ領域およびＰＰＣを欠失し所定のリンカー断片を有し、アミノ酸番号第８８～第６２４のアミノ酸配列のリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号３に、アミノ酸番号第８８～第６４６のアミノ酸配列のリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号４に示す。更に、８４ｋＤａコラゲナーゼからプレプロ領域が欠失されたアミノ酸番号第８８～第７６７のアミノ酸配列を有するコラゲナーゼを７４ｋＤａコラゲナーゼとし、そのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
　本発明のリコンビナントコラゲナーゼが保存安定性に優れる理由は明確ではない。しかしながら、ＰＰＣを有する７４ｋＤａコラゲナーゼと、ＰＰＣを有しないリコンビナントコラゲナーゼの比活性および安定性を評価したところ、７４ｋＤａコラゲナーゼの方が高い比活性を有することから、ＰＰＣ自体がコラーゲン結合能を有し、ＣＤのコラゲナーゼ活性を補助している可能性がある。本発明のリコンビナントコラゲナーゼは、コラゲナーゼ活性を補助するＰＰＣを欠失することで、コラゲナーゼ活性が安定し、かつ洗浄による組織からの分離性が増加すると推定される。なお、本発明のリコンビナントコラゲナーゼは、ＰＰＣを欠失すれば、リンカー領域を欠失するものであってもよい。
　（４）リコンビナントコラゲナーゼの製造方法
　本発明のリコンビナントコラゲナーゼを調製する際の形質転換用ＤＮＡとしては、少なくともＣＤに対応するアミノ酸配列をコードするものであり、より好ましくはＣＤとリンカー領域の一部とを含むアミノ酸配列をコードするものである。更に、Ｎ末端側に、プレプロ領域に対応するアミノ酸配列を有するものであってもよい。リンカー領域のＣ末端は、リンカー領域配列に含まれる－Ｇ１Ｘ１Ｙ１Ｇ２Ｘ２Ｙ２－で示される配列のＹ１とＧ２との間で切断されたものを好適に使用することができる。ＰＰＣを含まず、Ｃ末端から３番目がグリシンとなるリコンビナントコラゲナーゼを作製するために使用し得るＤＮＡとしては、下記（Ｉ）で示されるアミノ酸配列をコードするものを使用することできる。
　式（Ｉ）：
AVEQCDLSQFQTTSSNQLMAAIRQQGASCVNALFSADTGVQEAAFSSNHMYNVAQYTRTLAQQYAGGGSDELEALYLYLRAGYYAEFYNSNITFLSWVTPAVKGAVDAFVQNAHFYDNGDAHGKVLNEVIITMDSAGLQHAYLDVVTQWLTRWNAQYAEHWYMRNAVNGVFTLLFGGQWNNQYTSLIGEQTALVTALQAFALDRTKVNSPTEFMAANAARELGRLARYTDATIAPKVTEGLTAIFGQYPSYGDGDAIWLGAADTASYYADCSQFNICGFEDALRDAALNQTFICSDTIKIRSQDMSQAQHLAACDKMAYEESFFHTTLETGNQPVADDHNTQLQVNIFNSDTDYGKYAGPIFGIDTNNGGMYLEGNPANVGNIPNFIAYEASYANPDHFVWNLEHEYVHYLDGRFNMYGDFGTPTELVVWWSEGVAEYVSRVNDNPQAIATIQDGSTYTLAQVFDTTYDGFDVDRIYRWGYLAVRFMFERHPDEVQRMLSATRQGRWAEYKAIISGWANQYQSEFAQW-X
　ただし、Ｘは、TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT、またはTEALAKGDSで示されるポリペプチドである。配列番号３は、ＸがTEALAKGDSである場合のアミノ酸配列であり、配列番号４は、ＸがTEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNTである場合のアミノ酸配列である。なお、上記式で使用されるアルファベットは、以下のアミノ酸を示す。A:アラニン、C:システイン、D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸 F：フェニルアラニン、G：グリシン、H:ヒスチジン、I:イソロイシン、K:リシン、L:ロイシン、M:メチオニン、N:アスパラギン、P:プロリン、Q:グルタミン、R:アルギニン、S:セリン、T:スレオニン、V:バリン、W:トリプトファン、Y:チロシン。
　本発明のリコンビナントコラゲナーゼを調製するには、上記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを調製し、前記組み換えベクターで形質転換して、コラゲナーゼ活性を有する宿主細胞を調製し、前記宿主細胞を培養してコラゲナーゼ活性を有する遺伝子産物を産生させればよい。このようなリコンビナント蛋白質の製造方法は、遺伝子工学の技術を使用して行うことができる。例えば、グリモンティア・ホリセーのゲノムライブラリーからグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子を含むクローンを選択し、そのクローンを鋳型として前記配列番号３や配列番号４をコードするＤＮＡ断片の５’側にＮｃｏ　Ｉサイトを、３’側にＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトを付加し、Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）により増幅し、増幅された断片をＮｃｏ　Ｉ－Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで処理して回収した当該ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターなどに挿入して組換プラスミドを調製し、これを用いて例えばブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＳＰ３株などを形質転換し、ブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を作製する。あるいは、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子を含むクローンを鋳型として前記配列番号３や配列番号４をコードするＤＮＡ断片の両端に、挿入する直鎖状発現ベクターの両末端と相同な１５塩基対の配列を付加したＤＮＡ断片を調製および増幅し、当該増幅されたＤＮＡ断片と直鎖状発現ベクターとを混合後、新Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法にてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＳＰ３株などに導入して組換プラスミドおよび組換え体を作製してもよい。このようにして得たブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を培養すれば、培養上清中にグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子産物を産生させることができる。
　培養物中から目的物質であるリコンビナントコラゲナーゼを採取及び精製する方法は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。例えば、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液から通常の分離手段、例えば、有機溶媒沈澱法、塩析、限外濾過膜による濃縮等を用い、カラムクロマトグラフィー等により精製する方法が挙げられる。
　なお、本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、予めプレプロ領域を含まないＤＮＡで形質転換された宿主細胞からリコンビナントコラゲナーゼを生産してもよく、プレプロ領域を含むＤＮＡで形質転換された宿主細胞からリコンビナントコラゲナーゼを産生し、翻訳中または翻訳後にプレプロ領域を離脱させてもよい。
　（５）細胞分離用酵素剤
　本発明の製造方法で得たリコンビナントコラゲナーゼは、従来のコラゲナーゼと同様に使用することができ、例えば細胞分離用酵素剤として使用することができる。摘出臓器から細胞を分離する対象として、膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉の他、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織などの腺組織、骨、軟骨などの骨組織、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織、繊維芽細胞などがある。摘出組織に限定されず、コラーゲン培地内で培養した培養細胞の分離にも好適である。特に本発明で得たリコンビナントコラゲナーゼは、比活性が安定性しているため、摘出した膵臓臓器から膵島を単離するための細胞分離用酵素剤として好適に使用することができる。後記する実施例に示すように、洗浄組織に対するコラゲナーゼ活性が低く、細胞損傷が少ない。
　本発明で使用する細胞分離用酵素剤には、更にメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼその他の成分を含ませることができる。メタロプロテアーゼとしては、サーモリシン、ディスパーゼ、クロストリジウム・ヒストリチカム由来中性プロテアーゼなどがある。セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、エラスターゼなどが、システインプロテアーゼとしてはキモパパインなどがある。
　（６）細胞分離方法
　摘出した臓器や動物組織に本発明の細胞分離用酵素剤を添加して所定時間培養する。摘出物を上記細胞分離用酵素剤や、更に他の成分を添加した培養液で培養すると、前記摘出組織の細胞外マトリックスや細胞間結合を分離し、細胞を単離することができる。組織から単離された細胞が培養液中に浮遊する場合は、培養液からろ過や遠心などで単離細胞を回収すればよい。
　本発明では、摘出臓器として膵臓臓器を使用し、膵島を分離することができる。膵島はコラーゲンによって膵臓内の他の組織と結合しているため、コラゲナーゼで培養することで膵島を他の組織から遊離することができる。例えば、摘出した膵臓臓器の膵管から本発明の細胞分離用酵素剤を注入し、所定時間培養する。培養時間は、使用する組織の状態や細胞分離用酵素剤に含まれるリコンビナントコラゲナーゼ量などによって適宜選択すればよい。膵島は他の組織よりも軽いため、培養後は密度勾配遠心分離法などにより純化することができる。なお、膵島に限定されず、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉の他、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織などの腺組織、骨、軟骨などの骨組織、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織、繊維芽細胞などのいずれの細胞分離にも好適に使用することができる。
　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
　（実施例１）
　グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ－２（受託番号；ＮＩＴＥ　ＢＰ－００７３９：寄託日（原寄託）；２００９年４月２８：寄託機関の名称；独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）：寄託機関のあて名；日本国２９２０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）を鋳型として、配列番号５のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列（長さ２０４０ｂｐ）の５’側にＮｃｏ　Ｉサイトを、３’側にＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトを付加し、Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）により増幅した。ＰＣＲ反応には、下記プライマーセットを使用した。プライマーの配列のうち、制限酵素サイトを下線で示す。
Fwd:AAACCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT（配列番号６）
Rvs: AAAAAGCTTTTACTGACGACACTGGTTAC（配列番号７）
　増幅された断片をＮｃｏ　Ｉ－Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで処理して回収した当該ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＮＹ３２６のクローニングサイトに挿入して、ｐＮＹ３２６－Ｃｏｌ．７４を作製した。この組換えプラスミドでブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＳＰ３株を形質転換して、組換え体を作製した。
　また、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ－２（ＮＩＴＥ　ＢＰ－００７３９）を鋳型として、前記配列番号３のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列（長さ１６１１ｂｐ）を、下記プライマーセットを使用してＰＣＲ反応を使って単離した。プライマーの配列のうち、直鎖状ベクターの両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー：
Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT（配列番号８）
Rvs:CATCCTGTTAAGCTTACTGTCGCCCTTCGCCAGC（配列番号９）
　また、直鎖状発現ベクターｐＮＹ３２６を、下記プライマーセットを使用してＰＣＲ反応を使って調製した。プライマーの配列のうち、挿入するＤＮＡ断片の両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー：
Fwd: AAGCTTAACAGGATGCGGGG（配列番号１０）
Rvs: AGCGAAAGCCATGGGAGCAA（配列番号１１）
　上記によって配列番号３のリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（１６１１ｂｐ）と直鎖状発現ベクターｐＮＹ３２６とをモル比２：１で混合後、新Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法にてコンピテントセルに導入するとともにブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＳＰ３株を形質転換しプラスミドｐＮＹ３２６－Ｃｏｌ．６０および組換え体を作製した。
　同様にして、以下のプライマーセットを使用して、上記配列番号４のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列（長さ１６７７ｂｐ）を、ＰＣＲ反応を使って単離した。プライマーの配列のうち、直鎖状ベクターの両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー：
Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT（配列番号１２）
Rvs:CATCCTGTTAAGCTTAGGTATTACCACCAGATTCA（配列番号１３）
　次いで、上記と同様にして直鎖状発現ベクターｐＮＹ３２６を調製し、配列番号４のリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（１６７７ｂｐ）を含むプラスミドｐＮＹ３２６－Ｃｏｌ．６２および組換え体を作製した。上記により、３種のブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を作製した。
　前記３種のブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体をそれぞれ１００ｍｌの２ＳＹＮ培地（２０ｇ／Ｌグルコース、４０ｇ／Ｌ　Ｂａｃｔｏ　Ｓｏｙｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１５ｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５０μｇ／ｍＬネオマイシン）中で、３０℃、４８時間培養した。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子産物を含む培養液を遠心し、得られた上清を０．２μｍフィルターで濾過滅菌した。次いで、上清をＨＰＬＣシステムにて精製・分画した。ＨＰＬＣシステムは、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより行った。各培養上清をカラムに供してコラゲナーゼを吸着させた後、ＮａＣｌ濃度を０．２から１Ｍまで連続的に上げながら、５０ｍＭのビストリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）を流し、コラゲナーゼを分離溶出させた。溶出液を溶出順に４ｍｌずつ採取し、分画した。ついで、限外濾過により３０ｋＤａ以下のものを除去し、０．２ＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２を含む４℃の５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で透析し、精製した７４ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼを得た。
　精製酵素のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を図２に示す。７４ｋＤａは、７４ｋＤａコラゲナーゼ、６２ｋＤａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ、６０ｋＤａはリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼを示す。
　（実施例２）
　実施例１で得た７４ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼの比活性の経時変化を下記方法で測定した。測定結果を図３に示す。７４ｋＤａは、精製直後に１８，０００（Ｕ／ｍｇ）の活性であったが２４時間後には１１，５００（Ｕ／ｍｇ）に低減し、活性が経時的に低下した。これに対し、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼは、精製直後から２４時間時に至るまで、いずれも１２，０００（Ｕ／ｍｇ）前後で推移し、コラゲナーゼ活性が安定していた。
　コラゲナーゼの比活性測定：蛍光標識したＩ型コラーゲン（ＦＩＴＣ－コラーゲン）０．０５％、５ｍＭのＣａＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）にコラゲナーゼ０．５μｇを混合して３０℃に加温した。３０分後、ＥＤＴＡを添加して酵素反応を停止した。反応液に等量の７０％のエタノールを含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）を添加して分解物を抽出し、蛍光分光光度計で蛍光強度を測定した。図中１ユニット（Ｕ）はコラーゲン１μｇを３０℃、１分間で分解する活性を意味する。
　（実施例３）
　実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを、温度４℃で保存した際の比活性の経時変化を評価した。０日目の比活性値を１００％とした時の相対値を図４に示す。図４に示すように、１００日間に亘り、高い比活性を安定に維持することができた。なお、リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼも同様の安定性を示した。
　（実施例４）
　実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて膵臓消化実験を行った。マウスより膵臓を単離し、ＨＢＳＳバッファー１ｍｌに、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを０．００６２５～０．２０ｍｇと、サーモリシン（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」の内包品）０．０１２ｍｇとを含む酵素液を膵管より注入し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、目開き１ｍｍメッシュを通過した画分（分解組織）と、メッシュ上に残った画分（非分解組織）のタンパク量を測定した。酵素液に含まれるリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度に依存して、分解組織量が増加し、それに伴い非分解組織量が低減した。結果を図５に示す。図５に示すように、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌで反応はプラトーに達した。
　（実施例５）
　実施例４と同様に、実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて膵臓消化実験を行い、分解して得た膵島の個数を測定し、ＩＥＱ（Ｉｓｌｅｔ　Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ：直径が１５０μｍの膵島を１と規定する、膵島の体積を示す国際単位）を評価した。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度の相違による膵島の個数の結果を図６Ａに、ＩＥＱの結果を図６Ｂに示す。また、単離された膵島の光学顕微鏡写真を図７に示す。
　（比較例１）
　実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼに代えてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した以外は、実施例５と同様に操作し、膵島の個数およびＩＥＱを評価した。結果を図６Ａ、図６Ｂに併せて記載する。実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、従来の市販品と同様に、膵臓組織から膵島を分離することができた。
　（実施例６）
　実施例５で得た膵島を、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスの腎皮膜下に移植し、経時的に血糖値を測定した。膵島を移植しなかったコントロール群（ｎ＝３：ＳＴＺ－１、ＳＴＺ－２、ＳＴＺ－３）では、高血糖値を示したのに対し、膵島移植群（ｎ＝５：ＳＴＺ／ｉｓｌｅｔ－１～ＳＴＺ／ｉｓｌｅｔ－５）では、移植後すぐに血糖値が正常レベルにまで低下した。移植後３９日目に膵島を移植した腎臓を摘出すると、血糖値が再び上昇した。結果を図８Ａに示す。摘出した膵島移植腎とその部分拡大写真を図８Ｂの左端の上下２段に示す。また、摘出した膵島移植腎のヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を行ったところ腎皮膜下に膵島が確認され、さらには抗インシュリン抗体で膵島が染色された(図８Ｂ）。これらは、実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼにより、膵島機能が保持された膵島が単離できたことを示すものである。
　（実施例７）
　実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて肝臓消化実験を行った。麻酔したラットの肝臓をＨＢＳＳバッファー潅流下に脱血してカルシウムを除去し、次いで肝臓内にリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ０．０５ｍｇ／ｍｌとサーモリシン０．０１ｍｇ／ｍｌとを１０分間潅流してカルシウムを添加した後、肝臓を摘出した。摘出肝臓を氷冷し、メスで細切し、ガーゼおよびストレイナーでろ過した。死細胞を除去した後に肝臓細胞を遠心回収した。肝細胞の位相差顕微鏡写真を図９に示す。この肝細胞を７日間培養したところ、生存率は９８％であった。
　（実施例８）
　実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのコラーゲン線維への結合能と、洗浄後コラーゲン線維に残留するコラゲナーゼ活性を評価した。
　豚皮コラーゲン線維５ｍｇと４００μｌの０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２を含むトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）とをフィルターを内蔵するスピンカラムに入れ、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心を行い、コラーゲン線維を前記緩衝液で洗浄して全５回の遠心分離を行った。
　洗浄液を廃棄し、前記スピンカラムのフィルター上のコラーゲン線維に酵素混合液（リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを０．２ｍｇ／ｍｌ、オボアルブミンを０．２ｍｇ／ｍｌ、オルトフェナントロリンを４ｍＭ、ＮａＣｌを０．２Ｍ、ＣａＣｌ２を５ｍＭ含むトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））１００μｌを添加し、４℃で３０分静置し、コラーゲン線維にリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを結合させた。
　次いで、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行い、前記フィルター上のコラーゲン線維とフィルターを通過した混合液とに分離した。この混合液の一部を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。なお、比較のために豚皮コラーゲン線維を添加せず、上記と同様に処理して得た混合液も、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。結果を図１０Ａの「混合液／コラーゲン線維「－」、「＋」」で示す。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのバンドは、「＋」で薄く「－」で濃くなった。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、コラーゲン線維と混合すると、コラーゲン線維に結合することが示された。なお、図１０においてＭはマーカーを示す。
　次いで、スピンカラム内のコラゲナーゼが結合したコラーゲン線維を２ｍｌチューブに回収し、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンペプチド、４ｍＭのオルトフェナントロリンを含むトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、４℃で１０分間静置した後、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心を行い、沈殿物を前記コラーゲンペプチド含有緩衝液で洗浄して全５回の遠心分離を行った。５回の洗浄上清をそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。結果を図１０Ａの「酵素結合コラーゲン線維のコラーゲンペプチド洗浄上清／１，２，３，４，５」で示す。数値は、上清の洗浄回数を示す。洗浄１回目から５回目に亘りいずれもリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのバンドが薄く、コラーゲン線維に結合したリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、コラーゲンペプチドで洗浄してもコラーゲン線維に残留することが示された。
　また、遠心分離によって得たコラゲナーゼが結合したコラーゲン線維に、５００μｌの０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、２μｇ／ｍｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含むトリスＨＣｌ緩衝液を添加し、３７℃で静置した。静置開始時、開始後１時間、３時間、５時間、７時間、１７時間、２０時間後に目視にて観察した。２ｍｌチューブの底部に集められたコラーゲン線維の経時変化を図１１に示す。また、静置２０時間後の上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図１０Ａ、「洗浄後線維上清／２０ｈ」に示す。静置２０時間後の上清はコラーゲン分解物のバンドが濃く出現し、コラーゲン線維に結合したコラゲナーゼは、洗浄してもコラーゲン線維に残留し、コラゲナーゼ活性を発揮することが示された。なお、「洗浄後線維上清／２０ｈ」には、コラーゲン分解物のバンドと共に６２ｋＤａのバンドが濃く出現し、コラーゲン分解後に速やかにコラゲナーゼが分離することが示された。
　（比較例２）
　リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼに代えて同量のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を用いた以外は実施例８と同様に操作した。結果を図１０Ｂおよび図１１に示す。
　図１０Ｂに示すように、コラーゲン線維が存在する「＋」のカラムではリベラーゼのバンドが薄いためリベラーゼがコラーゲン線維と結合すること、コラゲナーゼ結合コラーゲン線維をコラーゲンペプチドで洗浄した際の洗浄上清は、洗浄１～５に亘りリベラーゼのバンドが薄く、コラゲナーゼはコラーゲンペプチドで洗浄してもコラーゲン線維に残留すること等は、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼと同じ傾向を示した。
　一方、図１１に示すように、コラーゲン線維に残留するコラゲナーゼの酵素活性は、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼとリベラーゼとの間に相違が観察された。図１１において、残留酵素のコラゲナーゼ活性が高いほど、コラーゲン線維量が速やかに低減する。コラーゲン線維量が低減する程度は、コンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの方がリベラーゼよりも低い。膵島分離などの処理においては、残留酵素によって細胞障害が生じるため、膵島単離後は、酵素が残留しないことや、残留酵素が存在してもコラゲナーゼ活性が低減されていることが好ましい。図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼとリベラーゼとはコラーゲン線維に結合し、これをコラーゲンペプチドで５回に亘って洗浄しても一部はコラーゲン線維に残存する。しかしながら、残留する酵素の活性は両者間で相違し、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのコラゲナーゼ活性はリベラーゼよりも低減していた。詳細は不明であるが、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、リベラーゼと相違してコラーゲン線維と結合する「ＣＢＤ」を有しないことが一因と推定される。「ＣＢＤ」が存在しないためコラーゲン線維との結合が緩く、残留酵素によるコラゲナーゼ活性に差が生じた可能性がある。
　（実施例９）
　実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤコラゲナーゼおよびクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）の、蛍光標識したＩ型コラーゲン（以下、ＦＩＴＣ－コラーゲンと称す。）および合成基質Ｎ－（３［２－ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ（以下、ＦＡＬＧＰＡと称す。）に対する分解活性を評価した。
　ＦＩＴＣ－コラーゲンは、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、３０℃）緩衝液を使用し、ＦＡＬＧＰＡには０．４ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ　トリシン（ｐＨ７．５、３０℃）を使用した。ＦＩＴＣ－コラーゲンを基質とする場合には上記コラゲナーゼを０．５μｇ添加し、ＦＡＬＧＰＡを基質とする場合には、リコンビナント６２ｋＤコラゲナーゼを１．０μｇ、またはリベラーゼＣ／Ｔを２．５μｇ添加した。マイクロプレートリーダーにてＦＡＬＧＰＡを検出および定量し、ＦＡＬＧＰＡ分解活性を評価した。反応系１ｍｌにおいて、１ｍｇの酵素が１分あたり１μｍｏｌｅの前記ペプチドを分解する活性を比活性１Ｕ／ｍｇとし算出し、得られた比活性を表１に示した。リコンビナント６２ｋＤコラゲナーゼは、コラーゲンを分解できるだけでなく、合成基質ＦＡＬＧＰＡに対する分解活性に優れるため、コラーゲンのみならずゼラチン分解性にも優れることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例１０）
　実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型コラーゲンに対する活性を評価した。０．５ｍｇ／ｍｌの上記コラーゲンに、０．２ＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２とを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１μｇ／ｍｌのコラゲナーゼを添加し、３０℃でインキュベートし、インキュベート開始時、１時間後、３時間後、５時間後にサンプルを分取し、電気泳動で分析した。また、比較のため、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を用いて同様の操作を行った。結果を図１２に示す。なお、図１２において、６２ｋＤａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを使用したカラムを、リベラーゼは、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを用いたカラムを示す。
　Ｉ型コラーゲンでは、α１（Ｉ）およびα２（Ｉ）の３時間後、５時間後のバンドの消失の程度から、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの方がリベラーゼよりも迅速にＩ型コラーゲンを分解していると推定された。この傾向は、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲンでも同様に観察された。特にＩＶ型およびＶ型コラーゲンは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて３時間、または５時間反応させるとバンドが薄くなるのに対し、リベラーゼではバンドが消失していない。ＶＩ型コラーゲンは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて７２時間反応させるとバンドが薄くなるのに対し、リベラーゼではバンドが消失していない。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、リベラーゼで分解が容易でないコラーゲンも分解できる可能性が示唆された。
　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。
　本発明は２０１４年３月６日に出願された日本国特願２０１４－０４４２０５号に基づく。本明細書中に日本国特願２０１４－０４４２０５号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明によれば、比活性が安定なリコンビナントコラゲナーゼおよび当該リコンビナントコラゲナーゼを含む細胞分離用酵素剤が提供され、有用である。
　ＮＩＴＥ　ＢＰ－００７３９

Claims (7)

  1. 　Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、
    　少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
  2. 　前記リンカー領域は、いずれかのアミド結合で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、請求項１記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
  3. 　前記リンカー断片は、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであることを特徴とする、請求項２記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
  4. 　前記リンカー断片は、前記リンカー領域に含まれる－Ｇ１－Ｘ１－Ｙ１－Ｇ２－Ｘ２－Ｙ２－（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、請求項２記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
  5. 　前記リンカー断片のＣ末端は、－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ、－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｕ、－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、または－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｔｈｒのいずれかであるリコンビナントコラゲナーゼである、請求項２記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載のリコンビナントコラゲナーゼを含む、細胞分離用酵素剤。
  7. 　膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織、骨、軟骨、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織および繊維芽細胞からなる群から選択される１以上の細胞の分離に使用されることを特徴とする、請求項６記載の細胞分離用酵素剤。
PCT/JP2015/056748 2014-03-06 2015-03-06 グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤 WO2015133636A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016506205A JP6661072B2 (ja) 2014-03-06 2015-03-06 細胞分離用酵素剤
CN201580012276.4A CN106164269A (zh) 2014-03-06 2015-03-06 源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶和细胞分离用酶剂
KR1020167026742A KR20160131037A (ko) 2014-03-06 2015-03-06 그리몬티아·홀리새 유래 재조합 콜라게나아제 및 세포 분리용 효소제
EP15757886.5A EP3115455A4 (en) 2014-03-06 2015-03-06 Grimontia-hollisae-derived recombinant collagenase and enzyme agent for cell separation
US15/123,986 US10047353B2 (en) 2014-03-06 2015-03-06 Grimonitia-hollisae-derived recombinant collagenase and enzyme agent for cell and tissue dissociation
CA2941738A CA2941738C (en) 2014-03-06 2015-03-06 Grimontia-hollisae-derived recombinant collagenase and enzyme agent for cell and tissue dissociation

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-044205 2014-03-06
JP2014044205 2014-03-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015133636A1 true WO2015133636A1 (ja) 2015-09-11

Family

ID=54055433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/056748 WO2015133636A1 (ja) 2014-03-06 2015-03-06 グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼおよび細胞分離用酵素剤

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10047353B2 (ja)
EP (1) EP3115455A4 (ja)
JP (1) JP6661072B2 (ja)
KR (1) KR20160131037A (ja)
CN (1) CN106164269A (ja)
CA (1) CA2941738C (ja)
WO (1) WO2015133636A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015211655A (ja) * 2014-05-02 2015-11-26 株式会社ニッピ ペプチド組成物の調製方法、細胞培養方法、およびペプチド組成物
JP2019083741A (ja) * 2017-11-07 2019-06-06 株式会社ニッピ コラーゲン結合材、その製造方法、ドラッグデリバリーシステム、および担持体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0870853A (ja) * 1994-09-05 1996-03-19 Nippi:Kk ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用
JP2010263880A (ja) * 2009-04-16 2010-11-25 Nippi:Kk 微生物由来の新規コラゲナーゼ遺伝子
JP2011024439A (ja) * 2009-07-22 2011-02-10 Tokyo Metropolitan Government サンプル核酸の調製方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3022984B2 (ja) * 1989-11-28 2000-03-21 サントリー株式会社 細菌コラゲナーゼ遺伝子
EP0941311B1 (de) * 1996-11-19 2004-07-28 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinante collagenase typ i aus clostridium histolyticum und ihre verwendung zur isolierung von zellen und zellverbänden
US20100159564A1 (en) * 2007-11-30 2010-06-24 Dwulet Francis E Protease resistant recombinant bacterial collagenases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0870853A (ja) * 1994-09-05 1996-03-19 Nippi:Kk ビブリオ属に属する新規な微生物ならびに当該微生物から生産される新規なコラーゲン分解酵素およびその利用
JP2010263880A (ja) * 2009-04-16 2010-11-25 Nippi:Kk 微生物由来の新規コラゲナーゼ遺伝子
JP2011024439A (ja) * 2009-07-22 2011-02-10 Tokyo Metropolitan Government サンプル核酸の調製方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATSUMASA IIJIMA ET AL.: "Rinsho Suito Bunri no Tameno Grimontia hollisae ni Yurai suru Shinki Recombinant Collagenase Seizai no Kaihatsu", THE 41ST ANNUAL CONGRESS OF JAPANESE PANCREAS AND ISLET TRANSPLANTATION ASSOCIATION PROGRAM SHOROKUSHU, February 2014 (2014-02-01), pages 101, O-53, XP008184914 *
KOKI SUZUKI: "Properties of collagenase preparated from the culture of Vibrio hollisae 1706B strain", HIKAKU KAGAKU, vol. 45, no. 4, 2000, pages 272 - 283, XP008185217 *
See also references of EP3115455A4 *
TERAMURA N. ET AL.: "Cloning of a novel collagenase gene from the gram-negative bacterium Grimontia (Vibrio) hollisae 1706B and its efficient expression in Brevibacillus choshinensis", J. BACTERIOL., vol. 193, no. 12, 2011, pages 3049 - 3056, XP055223026 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015211655A (ja) * 2014-05-02 2015-11-26 株式会社ニッピ ペプチド組成物の調製方法、細胞培養方法、およびペプチド組成物
JP2019083741A (ja) * 2017-11-07 2019-06-06 株式会社ニッピ コラーゲン結合材、その製造方法、ドラッグデリバリーシステム、および担持体
JP7045166B2 (ja) 2017-11-07 2022-03-31 株式会社ニッピ コラーゲン結合材、その製造方法、ドラッグデリバリーシステム、および担持体

Also Published As

Publication number Publication date
US20170218352A1 (en) 2017-08-03
CN106164269A (zh) 2016-11-23
EP3115455A1 (en) 2017-01-11
CA2941738A1 (en) 2015-09-11
EP3115455A4 (en) 2017-09-13
CA2941738C (en) 2023-02-28
KR20160131037A (ko) 2016-11-15
US10047353B2 (en) 2018-08-14
JPWO2015133636A1 (ja) 2017-04-27
JP6661072B2 (ja) 2020-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5698536B2 (ja) アフィニティタグが結合した融合コラゲナーゼおよびその製造法
JP2015226547A (ja) 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生
JP2001510331A (ja) クロストリジウム・ヒストリチカム由来の組換えコラゲナーゼタイプ▲ｉ▼および細胞と細胞群の単離へのその使用
US11542489B2 (en) Expression vector encoding a Paenibacillus polymxa neutral protease
US20100159564A1 (en) Protease resistant recombinant bacterial collagenases
JP6661072B2 (ja) 細胞分離用酵素剤
CN109021071B (zh) 肽及其制备方法和用途
JP2010263880A (ja) 微生物由来の新規コラゲナーゼ遺伝子
EA005586B1 (ru) Гибридный белок проинсулина и способ получения из него рекомбинантного инсулина
CN116478969A (zh) 胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用
CN102559645B (zh) 一种人阴离子胰蛋白酶突变体
JP2002541793A (ja) 膵臓プロカルボキシペプチダーゼｂ、そのアイソフォームおよび突然変異タンパク質の製造ならびにそれらの使用
JP2938352B2 (ja) 組換え人マトリライシンの製造方法
JPS61192288A (ja) ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造
JP4564791B2 (ja) スタテリン融合タンパク質
JP2020070293A (ja) 機能性ペプチドの絹糸への結合法
WO2023030562A1 (en) Genetically modified bacterial strain e. coli producing clostripain peptidase
JP2019083741A (ja) コラーゲン結合材、その製造方法、ドラッグデリバリーシステム、および担持体
WO2006137209A1 (ja) Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法
PT107276B (pt) Método para produção de colagenase recombinante para digestão de colagénios
MXPA01009979A (en) Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15757886

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2941738

Country of ref document: CA

Ref document number: 2016506205

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15123986

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20167026742

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015757886

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015757886

Country of ref document: EP