EA005586B1

EA005586B1 - Гибридный белок проинсулина и способ получения из него рекомбинантного инсулина

Info

Publication number: EA005586B1
Application number: EA200101161A
Authority: EA
Inventors: Сусаку Ока; Сейдзи Сато; Наохико Хигасикуни; Масааки Кондо; Тосиюки Кудо; Сигеаки Ватанабе; Йосихиро Ваки; Хиротака Юки
Original assignee: Итохам Фудс Инк.
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2005-04-28
Also published as: DE60037508D1; EP1179593A1; JP3406244B2; ZA200108951B; AU775471B2; KR20020018192A; JP2000316579A; HK1042113A1; DK1179593T3; KR100659671B1; AU4142500A; CN1350584A; EA200101161A1; EP1179593A4; EP1179593B1; DE60037508T2; CA2372221A1; US6841361B1; CN1213146C; WO2000066738A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей гибридный белок проинсулина формулы (I)[Y]-[X1]-[В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь] (I)где Y представляет собой лидерную пептидную последовательность для экспрессии и секреции белка, содержащую по меньшей мере один аминокислотный остаток;X1 представляет собой аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно или химически;В-цепь представляет собой аминокислотную последовательность В-цепи инсулина;Х2 представляет собой аминокислотную последовательность, расщепляемую тромбином;линкер представляет собой линкерную последовательность, содержащую по меньшей мере один аминокислотный остаток;Х3 представляет собой аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно;А-цепь представляет собой аминокислотную последовательность А-цепи инсулина, ик высокоэффективному способу получения инсулина с высоким выходом с использованием ДНК-содержащей экспрессирующей системы.

Description

Предпосылки изобретения Область техники

Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей новый гибридный белок, который используется для получения рекомбинантного инсулина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к использованию ДНК для получения инсулина из указанного гибридного белка, который получают путем экспрессии указанной ДНК, под действием тромбина и карбоксипептидазы В.

Предшествующий уровень техники

Инсулин представляет собой гормон, который секретируется Р-клетками островков Лангерганса в поджелудочной железе при потреблении животным пищи, и является наиболее важным гормоном для накопления или использования сахаров, аминокислот и жирных кислот и для поддержания гомеостаза сахара в крови. Поскольку сахар крови, а именно, глюкоза крови является основным источником энергии для живого организма, однако, отсутствие гомеостаза сахара в крови может приводить к развитию тяжелых состояний. Повышенное содержание сахара в крови вызывает выведение сахара с мочой, что приводит к потере глюкозы, т.е. к возникновению так называемого сахарного диабета. Если это состояние продолжается в течение длительного промежутка времени, то в тканях живого организма могут развиваться серьезные осложнения. С другой стороны, пониженное содержание сахара в крови приводит к недостаточному пополнению источников энергии, что представляет определенную угрозу для жизни. Гомеостаз содержания сахара в крови поддерживается путем обеспечения баланса факторов, повышающих содержание глюкозы в крови (т.е. глюкагона, гормона роста, кортизола, катехоламина) и факторов, снижающих содержание сахара в крови. Инсулин является единственным гормоном, который может снижать содержание сахара в крови. Следовательно, снижение секреторных функций, происходящее по разным причинам, и, как следствие этого, недостаточное снабжение инсулином могут вызывать инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД). Для пациентов, страдающих таким заболеванием, инсулин является незаменимым лекарственным средством.

Человеческий инсулин представляет собой полипептид, содержащий А-цепь из 21 аминокислоты и В-цепь из 30 аминокислот, и имеющий один внутреннюю дисульфидную связь в А-цепи и две дисульфидных связи, которые связывают А-цепь и В-цепь. Инсулин первоначально биологически синтезируется как препроинсулин на рибосомах β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы. Препроинсулин представляет собой линейную молекулу, содержащую сигнальный пептид из 24 аминокислот (8Р), В-цепь (В), С-пептид из 31 аминокислоты (С) и А-цепь (А), присоединенные в порядке, представленном формулой 8Р-В-С-А. После транспорта в эндоплазматический ретикулум, сигнальный пептид отщепляется от препроинсулина с продуцированием проинсулина (В-С-А). Проинсулин образует дисульфидные связи в эндоплазматическом ретикулуме, принимая свою трехмерную структуру. Проинсулин расщепляется прогормон-превращающим ферментом РС1/3 в точке соединения В-С, а затем расщепляется превращающим ферментом РС2 в точке соединения С-А. И наконец, два Ν-концевых основных аминокислотных остатка С-пептида, которые остаются у С-конца В-цепи при расщеплении ферментом РС1/3, вырезаются карбоксипептидазой Н. Таким образом образуется инсулин.

Способы получения лекарственного препарата инсулина были первоначально разработаны с использованием экстрактов из поджелудочной железы животных, таких как крупный рогатый скот и свинья. Однако, по составу аминокислот, человеческий инсулин отличается от бычьего инсулина (по двум положениям А-цепи и по одному положению В-цепи) и свиного инсулина (по одному положению Вцепи). Следовательно, использование бычьего или свиного инсулина для человека неизбежно приводит к нежелательным эффектам (например, к аллергии). Были разработаны способы полусинтеза человеческого инсулина из свиного инсулина, которые предусматривали проведение реакции транспептидирования с трипсином. Однако, получение рекомбинантного инсулина генетическими рекомбинантными методиками является, в настоящее время, главным направлением в этой области благодаря низкой стоимости и высокой эффективности его производства.

Для получения рекомбинантного инсулина был разработан ряд методов. Так, например, известен метод, разработанный Ей Ы11у Согр., который предусматривает экспрессию А-цепи и В-цепи, отдельно, с использованием ЕксйетюЫа сой; и объединение А-цепи и В-цепи ίη νίΐτο с образованием дисульфидных мостиков, т.е. связывания этих цепей дисульфидными связями (1Р-В-63-18960). Однако этот метод является малоэффективным для получения инсулина. Затем, Ей Ы11у Согр. разработали более усовершенствованный метод, который предусматривает экспрессию проинсулина; образование дисульфидных мостиков ίη νίΐτο; а затем отщепление С-пептида от данного продукта трипсином и карбоксипептидазой В с образованием инсулина (1Р-В-1-48278 и патент Японии № 2634176).

Другой метод был разработан Νονο ΝοτάίδΚ Согр., и этот метод предусматривает экспрессию минипроинсулина, содержащего В-цепь и А-цепь, связанные между собой двумя основными аминокислотными остатками, в дрожжах; а затем обработку этого минипроинсулина трипсином ίη νίΐτο с продуцированием инсулина (1Р-В-7-121226 и патент Японии № 2553326). Этот метод имеет те преимущества, что дисульфидные связи образуются в процессе экспрессии и секреции минипроинсулина, и что указанный минипроинсулин может быть легко выделен и очищен вследствие его секреции в культуральную среду.

-1005586

Разработка новых методов получения рекомбинантного инсулина была успешно продолжена. НоесйЧ Сотротайоп разработала метод, предусматривающий экспрессию производного инсулина или препроинсулина нового типа в Е.сой; образование дисульфидных связей ίη νίίτο; а затем обработку данного продукта лизилэндопептидазой или клострипаином/карбоксипептидазой В, в результате чего продуцировался инсулин (1Р-А-2-195896, 1Р-А-2-225498, 1Р-А-2-233698, 1Р-А-3-169895, 1Р-А-4-258296, !РА-228191 и 1Р-А-7-265092). Недавно ВЮ-ТЕСНЫОЕОбУ 6ЕХЕЕАЕ ССЖРСЖАТЮХ был разработан метод, в котором гибридный белок, содержащий супероксиддисмутазу (СОД), связанную с проинсулином, экспрессировали в Е.сой в целях увеличения как эффективности экспрессии, так и эффективности образования дисульфидных связей, после чего проинсулин превращался в инсулин под действием трипсина и карбоксипептидазы В (АО 96/20724). Таким образом, были разработаны различные способы получения рекомбинантного инсулина и, кроме того, была увеличена эффективность экспрессии и эффективность образования дисульфидных связей и превращения в инсулин.

Для получения рекомбинантных белков был использован широкий ряд хозяев, включая микроорганизмы, животные и растения. Из вышеперечисленных хозяев, наиболее часто используются микроорганизмы из-за легкости обращения с ними и высокой промышленной применимости, а наиболее известными являются ЕксйепсЫа сой и дрожжи. Недавно, стала известна применимость ВасШик Ьгс\38 в качестве экспрессирующей системы, для экспрессии рекомбинантных белков (см. патент Японии № 2082727; £РА-62-201583; Уашада1а Н. е! а1., 1. ВасЫиок 169:1239-1245, 1987; Ыхо Шака, №йоп Ыоде1 КадакикЫ 61, 669-676, 1987; Такао М. е! а1., Арр1. Мютойюк Вю!есйпо1. 30:75-80, 1989; УашадаЫ Н. е! а1., Ргос. ИаЙ. Асаб. Зск ИЗА 86:3589-3593, 1989).

Целью настоящего изобретения является разработка экспрессирующей системы и способа получения инсулина с высокими выходами и эффективностью продуцирования, равными или превышающими выходы и эффективность уже существующих систем продуцирования рекомбинантного инсулина. Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка нового способа превращения инсулинового предшественника в инсулин; среды, в которой могут быть образованы дисульфидные связи, необходимые для обеспечения активности инсулина; и высокопродуктивной экспрессирующей системы.

Сущность изобретения

В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей гибридный белок формулы (I) [У]-[Х1]-[В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь] (I) где

Υ представляет лидерную пептидную последовательность для экспрессии и секреции белка, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток;

Х1 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно или химически;

В-цепь представляет аминокислотную последовательность В-цепи инсулина;

Х2 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно;

Линкер представляет линкерную последовательность, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток;

Х3 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно; и

А-цепь представляет аминокислотную последовательность А-цепи инсулина, и где Υ, Х1, В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь присоединены в порядке, указанном в формуле (I).

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей гибридный белок формулы (II) [В -цепь] - [Х2] - [линкер] - [Х3] -[ А-цепь] (II) где

А-цепь представляет аминокислотную последовательность А-цепи инсулина, и где В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь присоединены в порядке, указанном в формуле (II).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность Х1, Х2 или Х3, которая используется для ферментативного расщепления гибридного белка, представляет собой последовательность, расщепляемую тромбином. Так, например, аминокислотная последовательность, расщепляемая тромбином, представляет собой следующую последовательность:

Х1=С1уЗегЕеиС1пРгоАгд (ЗЕО ГО N0:1);

Х2=АтдС1уН1кАгдРго (ЗЕО ГО N0:2); или

Х3=РгоАгд.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения линкерная последовательность имеет следующую аминокислотную последовательность:

-2005586

С1иЛ1аС1иЛ8рЬеиС1пУа1С1уС1пУа1С1иЬеиС1уС1уС1уРгоС1уЛ1а С1у8егЬеиС1пРгоЬеиА1аЬеиС1иС1у8егЬеиС1п (8ЕО ΙΌ N0:3).

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения, лидерная пептидная последовательность может содержать 9 ^концевых аминокислотных остатков (т.е., аминокислотные положения 19) белка М\УР. который является одним из белков клеточной стенки (С\УР) бактерии, принадлежащей к роду ВасШик. В этом случае, ДНК может включать участок, кодирующий сигнальный пептид С\УР. присоединенный у 5'-конца этой ДНК.

Примером ДНК по настоящему изобретению является ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0:21. Более конкретно, указанная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0:20.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к ДНК, содержащей последовательность ДНК, которая включает промоторную область, необходимую для экспрессии рекомбинантного белка в прокариотическом или в эукариотическом организме, где указанная последовательность ДНК присоединена у 5'-конца ДНК, определенной выше.

В другом варианте настоящего изобретения последовательность ДНК, которая содержит промоторную область, выделена из бактерии, принадлежащей к роду ВасШик, а предпочтительно она происходит от С\УР бактерии, принадлежащей к роду ВасШик.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему ДНК, определенную выше.

Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной данным вектором. Клеткой-хозяином предпочтительно является бактерия, принадлежащая к роду ВасШик, такая как ВасШик Ьгеу1к.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения инсулина, где указанный способ предусматривает культивирование данной клетки-хозяина или бактерии в культуральной среде для экспрессии гибридного белка, кодируемого интересующей ДНК в указанной клетке-хозяине или в бактерии;

сбор гибридного белка; и обработку данного гибридного белка путем ферментативного расщепления с выделением инсулина.

В этом аспекте, примером указанной ДНК является ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0:20, а примером указанного гибридного белка является белок, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в 8Е0 ΙΌ N0:21.

В данном способе, экспрессированный гибридный белок может быть выделен и очищен из указанной клетки-хозяина или из указанной бактерии, или из указанной культуральной среды. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, ферментативное расщепление может быть осуществлено под действием тромбина и карбоксипептидазы В.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 проиллюстрировано превращение гибридного белка М\УРтр9-С8ЕОРЯ-В-цепь-КСНКРлинкер-РЯ-А-цепь в инсулин.

На фиг. 2 представлены аминокислотная последовательность гибридного белка М\УРтр9-С8ЕОРЯВ-цепь-ЯОНЯР-линкер-РЯ-А-цепь и нуклеотидная последовательность, кодирующая этот белок.

На фиг. 3 схематически представлена диаграмма, на которой показан способ встраивания гибридной ДНК в экспрессирующий вектор ВасШик Ьгеу1к (рХи211К.2Б5).

На фиг. 4 представлена фотография электрофореза среды после культивирования трансформантов: дорожка 1 - маркерный пептид; дорожка 2 - негативный контроль (т.е. трансформанты, полученные только с плазмидой рХШ11К.2Б5 и без чужеродного белка); и дорожка 3 - трансформант М\УРтр968ЕрРЯ-В-цепь-ЯОНЯР-линкер-РЯ-А-цепь.

На фиг. 5 показана хроматограмма гибридного белка М\УРтр9-С8ЕОРЯ-В-цепь-ВСНКР-линкерРЯ-А-цепь, выделенного и очищенного с помощью хроматографии на ХЬ.

На фиг. 6 показана хроматограмма гибридного белка М^Ртр9-О8ЕрРЯ-В-цепь-ЯОНЯР-линкерРЯ-А-цепь, выделенного и очищенного с помощью ВЭЖХ.

На фиг. 7 проиллюстрировано пептидное картирование инсулина ΙΤ0ΗΛΜ (по настоящему изобретению) и Новолина Щоуо1ш 40, который является коммерчески доступным инсулином, поставляемым №уо №гШкк Рйагта).

На фиг. 8 показаны профили элюции инсулина ^0НАМ (по настоящему изобретению) и Новолина.

На фиг. 9 показана временная зависимость содержания глюкозы в плазме после введения инсулина IΤ0НАМ (по настоящему изобретению) и Новолина.

На фиг. 10 показана временная зависимость содержания инсулина в плазме после введения инсулина ^0НАМ (по настоящему изобретению) и Новолина.

Подробное описание изобретения

ДНК по настоящему изобретению имеет структуру, представленную вышеуказанной формулой (Ι) или (ΙΙ). ДНК формулы (Ι) включает лидерную пептидную последовательность для экспрессии и секреции интересующего гибридного белка, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток (Υ);

-3005586 аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно или химически (XI); аминокислотную последовательность В-цепи инсулина (В-цепь); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно (Х2); линкерную последовательность, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток (линкер); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно (Х3); и аминокислотную последовательность А-цепи инсулина (А-цепь), где Υ, XI, В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь соединены в указанном порядке. ДНК формулы (II) включает аминокислотную последовательность В-цепи инсулина (В-цепь); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно (Х2); линкерную последовательность, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток (линкер); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно (Х3); и аминокислотную последовательность А-цепи инсулина (А-цепь), где В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь соединены в указанном порядке. Присутствие лидерной пептидной последовательности позволяет секретировать продукт экспрессии за пределы клетки-хозяина, а ее отсутствие обеспечивает накопление продукта экспрессии в данной клетке-хозяине.

В описанных ниже примерах для осуществления превращения гибридного белка в инсулин под действием тромбина и карбоксипептидазы В был сконструирован новый модифицированный инсулин, в котором сайты расщепления тромбином расположены между В-цепью инсулина и линкерным пептидом и между линкерным пептидом и А-цепью инсулина. Затем модифицированный проинсулин соединяют по Ν-концу с Ν-концевыми 9 аминокислотами белка клеточной стенки (С^Р) ВасШик Ьгеу1к. служащими в качестве линкерного пептида, а третий сайт расщепления тромбином, который позволяет отщеплять модифицированный проинсулин от лидерного пептида, затем присоединяют непосредственно за лидерным пептидом, что обеспечивает соответствующее окружение для образования дисульфидных связей и экспрессию модифицированного проинсулина в ВасШик Ьгеу1к. Таким способом может быть сконструирован линейный искусственный гибридный белок, включающий лидерный пептид, сайт расщепления тромбином, В-цепь инсулина, сайт расщепления тромбином, линкерный пептид, сайт расщепления тромбином и А-цепь инсулина в указанном порядке. Сначала получают ДНК, кодирующую соответствующий гибридный белок, а затем встраивают ее в подходящий экспрессирующий вектор. Затем указанный вектор вводят в подходящую клетку-хозяина. Трасформированную клетку-хозяина культивируют для экспрессии ДНК с последующим продуцированном гибридного белка. Затем гибридный белок ферментативно расщепляют тромбином и карбоксипептидазой В. Таким образом, может быть получен инсулин, имеющий желаемую первичную структуру и биологическую активность, идентичные структуре и активности природного инсулина.

Настоящее изобретение более подробно проиллюстрировано ниже.

Лидерный пептид (Υ), который содержит по крайней мере один аминокислотный остаток, необходимый для экспрессии интересующего белка, включает известный МВР (Маша С.У. е! а1., Сепе 74:365373, 1988), С8Т (8шйй, Ό.Β., е! а1.. Сепе 67:31-40, 1988), ТКХ (ЬаУаШе, Е.К. е! а1. Вю/ТесЬпо1оду 11:187193, 1993), ОкЬА (СоШпк-Кас1е, Ь.А., е! а1., Вю/Тесйпо1оду 13:982-987, 1995) и ЬатВ (Вепкоп 8.А. е! а1., Се11 32:1325-1335, 1983) из Е.сой; и α-фактор. происходящий от дрожжей (Вгаке А.1., Υеак! Сепейс Еп§1пееппд, р.269-280, 1989). В частности, указанный лидерный пептид часто бывает необходим для Е.сой, если интересующий белок секретируется в периплазму, или, для дрожжей, если указанный белок секретируется в культуральную среду. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, предпочтительный лидерный пептид содержит Ν-концевые 9 аминокислот С'\УР бактерии, принадлежащей к роду ВасШик (далее иногда называемой бактерией ВасШик). С\УР. применимый в соответствии с настоящим изобретением, включает, не ограничиваясь С\УР из штамма 47 ВасШик Ьгеу1к (ЕЕКМ Р-7224; 1Р-А-60-58074 и 1Р-А-62-201589), и штамма ΗΡΌ 31 (ЕЕКМ ВР-1087; 1Р-А-4-278091). В частности, могут быть использованы следующие последовательности (где в скобках указаны ссылки).

М\УРшр9: А1аС1иС1иА1аА1аТйгТйгТйгА1а (81Т) ΙΌ N0:4; 1. Вас!епо1., 169:1239-1245, 1989)

0\УРшр9: А1аРгоЬукАкрС1у11еТуг11еС1у (81Т) ΙΌ N0:5; 1. Вас1еио1., 170:176-186, 1988)

Η\νΡιηρ9: А1аС1иАкрТйгТйгТйгА1аРгоЕук (81Т) ΙΌ N0:6; 1. Вас!епо1., 172:1312-1320, 1990).

Число аминокислотных остатков от Ν-конца СVΡ необязательно должно быть равно 9, при условии, что может быть экспрессирован гибридный белок. Так, например, может быть использована последовательность, содержащая Ν-концевые 1-50 аминокислотных остатков СVΡ бактерии ВасШик. Лидерный пептид не всегда является необходимым, если часть гибридного белка, находящаяся за В-цепью инсулина гибридного белка, а именно [В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь], соединена с 3'-концом ДНК, содержащей промоторную область экспрессирующей системы, что позволяет экспрессировать данную часть гибридного белка. Если указанный гибридный белок содержит лидерный пептид СVΡ, то предпочтительно, чтобы указанный лидерный пептид был присоединен к сигнальному пептиду СVΡ (а в частности, МVΡ) у его 5'-конца. Информацию, касающуюся последовательностей МVΡ, можно найти в работах Υатада!а Η. е! а1., 1. Вас!егю1., 169:1239-1245, 1987 или ТкиЬо1 А. е! а1., 1. Вас!епо1., 170:935-945, 1988, и в работах, на которые имеются ссылки. Сигнальный пептид обычно направляет экспрессирован

-4005586 ный и транслированный белок к клеточной мембране и способствует внеклеточной секреции данного белка. Секретированный белок является предпочтительным, поскольку он может быть более легко выделен и очищен по сравнению с несекретированным белком.

Для гибридного белка ферментативное расщепление XI предусматривает использование фермента, который не содержит сайта расщепления в В-цепи инсулина или А-цепи инсулина, такого как фактор Ха, тромбин и энтерокиназа. При присоединении остатка С1у или 8ег к Ν-концу В-цепи инсулина, если такой остаток не влияет на активность полученного инсулина, может быть использована протеаза ТЕУ. С другой стороны, химическое расщепление XI может включать селективное расщепление у С-конца метионина (I. Вю1. Сйет. , 237:1856-1860, 1962) и селективное расщепление у С-конца триптофана (Ме!йобк ίη Еп/утоБ. 91:318-324, 1983). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, каждый из Х1-Х3 может быть расщеплен одновременно, где используемым ферментом является тромбин, а аминокислотными последовательностями Х1-Х3 являются Х1=О1у8етБеиО1пРгоАгд (8ЕО ΙΌ N0:1); Х2=АтдО1уН1кАгдРго (8ЕЦ ГО N0:2); и Х3=РгоАгд. В этом случае, могут быть также использованы Х1, Х2 и Х3 с другими аминокислотными последовательностями, при условии, что может быть осуществлено нужное расщепление тромбином. Так, например, в вышеуказанных аминокислотных последовательностях, для такого расщепления возможны следующие замены: для Х1 и Х3, 8ет=Уа1, О1и, Рйе, Акр, Рго, 11е, О1у, Бук, Агд, А1а, 01η, Акп или Ьеи; Ьеи=Атд, Уа1, Рйе, Акр, 01у, Ьеи, Н1к, 11е, Ме!, Тйг или Бук; О1п=О1и, Рйе, Туг, 01у, 11е, Акп, А1а, Агд, Тйг, 8ет, Ьеи, Уа1 или Сук; Рго=А1а или Уа1; и Атд=Ьук (Сйапд, 1-Υ, Еиг. 1. Вюсйет., 151:217-224, 1985; Ка^аЬа!а 8. е! а1., Еиг. 1. Вюсйет., 172:17-25, 1988); а для Х2, Агд=Ьук; 01у=Тйт, 11е, Н1к, 8ег, А1а, Рйе, Уа1, Акп, Акр, Ьеи или Рго; Н1к=Рго, Тгр, Сук, 01п, Тйг, 8ег, Уа1, Ьеи, А1а, Рйе или 01у; Агд=Уа1, Рго, 01и, Акп, Акр, 8ег, Ме!, Бук, А1а, 01п, 01у, Тгр или Тйг; Рго=Уа1, Тйг, Беи, 8ег, Акр, 01у, Туг, 11е, Акп, Агд, Н1к или 01и (Сйапд Т-Υ. Еиг. 1. Вюейет., 151:217-224, 1985).

Линкер, содержащий по крайней мере один аминокислотный остаток, обычно находится между функциональными доменами в белке и может присоединять указанные домены, не оказывая какого-либо влияния на функции этих доменов. В настоящем изобретении, указанный линкер локализован между Вцепью инсулина и А-цепью инсулина, связанный с ними посредством каждой ферментативно расщепляемой последовательности, и служит для образования дисульфидных связей между В-цепью инсулина и А-цепью инсулина и для облегчения экспрессии данного гибридного белка. Этот линкер может содержать, по крайней мере, один аминокислотный остаток, и, при этом, может быть использована любая аминокислота(ы), при условии, что она несет ту же самую функцию. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанный линкер может предпочтительно содержать С-пептид проинсулина. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, указанный линкер имеет следующую последовательность:

61иА1а61иАкрБеи61пУа161у61пУа161иБеи61у61у01уРго61уА1а61у 8егБеи61пРгоБеиА1аБеи61и61у8егБеиО1п (8Е0 ГО Νθ:3).

В настоящем изобретении ДНК, кодирующая гибридный белок, экспрессируется в форме, присоединенной к 3'-концу ДНК, содержащей промоторную область для используемой экспрессирующей системы. Примерами такого промотора являются промотор бактериофага ХрБ, промотор Т7, промотор !гр1ас Е. сой (Матайк Т. е! а1., Мо1еси1аг С1отпд 2пб еб., А БаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог БаЬота!оту, 1989), промотор РКВ1 дрожжей (В10/ТЕСН\0Б0С1¥ 9:183-187, 1991), промотор САРИН (ΒΙΟ/ΊΈΟΠΝΟΤΟΟΥ 12:381-384, 1994), вирусный промотор БТК, промотор 8У40 (Матайк, Т. е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд 2пб еб., А БаЬота!оту Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог БаЬога!оту, 1989). В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный гибридный белок присоединен к 3'-концу последовательности ДНК, содержащей промоторную область бактерии Вас111ик. Доступные промоторы включают, не ограничиваясь, промотор М\УР из штамма 47 ВасШик Ьтеу1к (1Р-А-1-58950 и 1Р-А-7-108224) и промотор Н\УР из штамма НРБ31 ВасШик Ьтеу1к (1Р-А-4-278091 и 1Р-А-6-133782).

ДНК по настоящему изобретению может быть получена любой комбинацией методов, известных специалистам. Так, например, составляющие последовательности ДНК могут быть получены отдельно методами химического синтеза или методами клонирования и последовательно лигированы с помощью лигазы, а полученная последовательность ДНК целиком может быть подвергнута полимеразной цепной реакции (ПЦР) с получением желаемой ДНК. Детали конкретного способа получения указанной ДНК будут очевидны из приведенных ниже примеров. Для получения ДНК могут быть использованы стандартные методы, например, методы, описанные Матайк Т. е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд 2пб еб., А БаЬота!оту Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог БаЬота!оту, 1989; и 1птк, М.А., е! а1., РСК Рго!осо1к, А дшбе !о те!йобк апб аррйса!юпк. Асабетю Ргекк, 1990.

ДНК, кодирующая человеческий инсулин, содержащий В-цепь, С-пептид и А-цепь, может быть получена с использованием коммерчески доступной мРНК, выделенной из поджелудочной железы человека, с использованием коммерчески доступного набора для синтеза первой цепи кДНК (Рйаттааа) и т.п. Если короткие цепи ДНК (в качестве праймеров) могут быть синтезированы на основе известных последовательностей ДНК с использованием коммерчески доступного ДНК-синтезатора, то ДНК-фрагменты, кодирующие В-цепь, С-пептид и А-цепь, могут быть амплифицированы стандартным ПЦР-методом. В этом случае, ПЦР может быть проведена в 20 или более циклов при следующих условиях: денатурация

-5005586

ДНК (например, при 94°С, 30 с-1 мин); отжиг с праймером (например, приблизительно при 45-60°С, 30 с-1 мин); и реакция удлинения (например, при 72°С, 30 с или более).

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему данную ДНК. Необходимо, чтобы вектор, который может быть использован в настоящем изобретении, обладал, по крайней мере, следующими свойствами: чтобы он имел соответствующий сайт инсерции (т.е. сайт рестрикции), в который может быть встроена ДНК по настоящему изобретению; чтобы он мог экспрессировать данную ДНК в клетке-хозяине; и чтобы он автономно реплицировался в данной клетке-хозяине. Указанный вектор обычно содержит промотор, который функционально связан с расположенной ниже интересующей ДНК. Этот вектор может содержать сайт инициации репликации и терминирующую последовательность, а также может содержать отбираемый маркер, такой как ген резистентности к лекарственному средству или ген, придающий ауксотрофию. Предпочтительным вектором по настоящему изобретению является плазмида, которая реплицируется в бактерии ВасШик. Примеры такой плазмиды включают, не ограничиваясь, ρΝυ200, ρΗΥ500 (Ргос. Ыа11. Асаб. 8ск, И8А, 86:3589-3593, 1989), ρΗΥ4831 (1. Вас1еио1. 169:12391245, 1987), ρΝυ100 (Αρρ1. М1стоЫо1. Вю1есЬпо1., 30:75-80, 1989), ρΝυ211 (1. Вюсйет., 112:488-491, 1992), ρΝυ211Κ2Ε5 (выложенная заявка на патент Японии № 7-170984), ρΗΥ700 (выложенная заявка на патент Японии № 4-278091), рНТ210 (выложенная заявка на патент Японии № 6-133782), ρΗΤ110Р2Б5 (Αρρ1. МютоЫоБ Вю1ес1то1.. 42:358-363, 1994). В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, экспрессирующий вектор ρNυ-тРIN8 может быть получен путем конструирования, как проиллюстрировано на фиг. 3.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором, определенным выше. Указанной клеткой-хозяином могут быть прокариотические клетки (например, бактерии) или эукариотические клетки (например, грибы, дрожжи, клетки животных, клетки растений), а предпочтительно бактерия ВасШик. Примеры бактерии ВасШик, используемой в качестве хозяина, включают, не ограничиваясь, штамм 47 ВасШик Ьгеу1к (БЕРМ Р-77224; 1Р-А-60-58074 и 1Р-А-62-201589), штамм 47К (1Р-А-2-257876), штамм 310К (1Р-А-6-296485) и штамм ИРЭ31 (БЕРМ ВР-1087; 1Р-А-4-27809). Рекомбинантный штамм 47-50 бактерии ВасШик Ьгеу1к, трансформированный экспрессирующим вектором ρNυ-тРIN8, был депонирован в соответствии с Будапештским договором 20 апреля 1999 Национальным институтом биологических наук и биотехнологии человека. Управлением промышленных наук и технологии, Япония (1-3, ^дакЫ 1-сНо те, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагад1-кеп, Зацан) с присвоением номера № БЕРМ ВР-6706.

Затем экспрессирующий вектор, полученный как описано выше, вводят в компетентную клеткухозяина, предпочтительно бактериальную клетку ВасШик. Эту бактериальную клетку культивируют в подходящей культуральной среде в условиях, способствующих экспрессии данной ДНК, для внеклеточного или внутриклеточного продуцирования интересующего рекомбинантного гибридного полипептида, предпочтительно, для внеклеточного продуцирования. После этого, рекомбинантный гибридный полипептид собирают и очищают. Введение экспрессирующего вектора в клетку-хозяина может быть осуществлено любым стандартным методом, таким как электропорация (МеШобк ίη Еп/утоЕ 217:23-33, 1993). Очистка данного гибридного полипептида может быть осуществлена путем соответствующей комбинации любых стандартных методов, таких как экстракция растворителем, ультрафильтрация, фракционирование сульфатом аммония, ВЭЖХ, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, гидрофобная хроматография, электрофорез и изоэлектрическое фокусирование.

Гибридный белок может быть обработан протеазой и/или пептидазой, которая может ферментативно расщеплять данный гибридный белок, такой как тромбин и карбоксипептидаза В, используемые в нижеописанных примерах, в результате чего может быть продуцирован инсулин. Как проиллюстрировано на фиг. 1, сначала тромбин расщепляет полипептид на участке между лидерным пептидом (Υ) и Вцепью, между В-цепью и линкером и между линкером и А-цепью, в подходящих условиях. Для специфичного расщепления тромбином предпочтительными являются следующие условия; рН 7,5-8,5 (предпочтительно с использованием трис-буфера); температура - 3-6°С, предпочтительно 4°С; отношение субстрат:фермент=5:1-125:1 (молярное отношение), а более предпочтительно 25:1; период времени 1-24 ч. Затем, карбоксипептидаза В удаляет остаток Агд, присутствующий у С-конца В-цепи, в результате чего продуцируется инсулин (см. фиг. 1). Эти ферменты могут быть использованы в количествах, достаточных для расщепления гибридного белка.

В соответствии с настоящим изобретением инсулин может быть получен путем культивирования трансформированной бактерии ВасШик, полученной как описано выше, с накоплением гибридного белка, содержащего инсулиновую последовательность, за пределами клетки, с последующим расщеплением собранного гибридного белка.

Полученный таким образом рекомбинантный инсулин имеет такую же аминокислотную последовательность, дисульфидные мостики и биологическую активность, как и природный инсулин, а поэтому он может быть использован в качестве лекарственного препарата для лечения инсулинзависимого сахарного диабета.

Примеры

Более подробно настоящее изобретение проиллюстрировано в нижеследующих примерах. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.

-6005586

При получении ДНК, кодирующей гибридный белок, использовался способ, в котором ДНКфрагменты, амплифицированные с помощью ПЦР, лигировали посредством реакции лигирования с ДНК-лигазой. В данном описании, термин М^Ркр означает сигнальный пептид М\УР. а термин 'М\УРтр9 означает 9 Ν-концевых аминокислотных остатков зрелого М\УР.

Пример 1. Конструирование вектора (ршРГО8), содержащего интергированную в нем гибридную ДНК М^Ркр-М^Ртр9-68Е0РК-В-цепь-К6НКР-линкер-РК-А-цепь.

(1) Получение ДНК-фрагмента для М^Ркр-М^Ртр9.

a. ДНК-матрица.

Геномную ДНК экстрагировали из штамма 47-50 ВасШик Ьгеу15 известным методом (Мо1еси1аг С1ошпд 2пб еб., А ЬаЬогаГогу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаГогу, 1989): 800 нг,

b. Праймеры.

Прямой праймер: 5'-6ТС6ТТААСА6Т6ТАТТОСТ-3' (8ЕО ΙΌ N0:7).

Обратный праймер: 5'-А6СТ6ТА6ТА6ТТ6СТОС-3' (8Е0 ГО N0:8).

Эти праймеры были химически синтезированы исходя из нуклеотидной последовательности М\УР, определенной УатадаГа, Н. е! а1. (ГВасбеиок, 169:1239-1245, 1987) и ТкнЬог А. е! а1. (ГВас!епо1., 170:935945, 1988), и добавляли в конечной концентрации 0,1 мкМ.

c. ДНК-полимераза Тад.

Добавляли коммерчески доступный продукт (О1ВС0 ВКЕ) (5 ед.).

б. Другие материалы.

Добавляли Трис-НС1 (конечная концентрация: 20 мМ, рН 8), МдС1₂ (конечная концентрация: 2,5 мМ), б№ГР (бАТР, бОТР, бСТР, бТТР; конечная концентрация: 50 мкМ для каждого).

Материалы а-б смешивали в пробирке емкостью 0,5 мл так, чтобы полный объем реакционного раствора был равным 100 мкл. Затем осуществляли ПЦР-реакцию стандартным способом (Ιηηίκ, М.А., е! а1., РСК. РгоГосок, А дшбе Го теШобк апб аррйсабопк. Асабетк Ргекк, 1990) в следующих условиях: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура отжига: 50°С - 1 мин; температура удлинения ДНКцепи: 72°С - 1 мин; 30 циклов. После завершения ПЦР, реакционный раствор концентрировали фенолом, а затем наносили на 0,8% агарозный гель для проведения электрофореза в стандартных условиях. Указанный агарозный гель обрабатывали с использованием фильтра ийгаГгее С3Н (М1Шроге) для сбора продукта ПЦР (то есть, ДНК-фрагмента для М^Ркр-М^Ртр9). Собранный продукт ПЦР экстрагировали фенолом, осаждали этанолом, а затем сушили в вакууме. Осушенный продукт растворяли в соответствующем объеме дистиллированной воды, а затем подвергали реакции затупления концов с использованием набора для затупления ДНК (Такага 81шхо Со, ЬГб.) в соответствии с инструкциями производителя.

(2) Получение ДНК-фрагмента для проинсулина.

Затупленный по концам ДНК-фрагмент для проинсулина получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями.

В качестве ДНК-матрицы использовали плазмидный вектор, содержащий интегрированную в нем ДНК препроинсулина человека (10 мг). Этот рекомбинантный плазмидный вектор получали следующим образом. кДНК поджелудочной железы человека синтезировали из коммерчески доступной мРНК поджелудочной железы человека (СЬОКГЕСН) с использованием набора для синтеза 1-ой цепи кДНК (Рйагтааа) в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР осуществляли с использованием кДНК в качестве матрицы и прямого праймера: 5'-АТСССССТСТССАТССССС-3' (8Е0 ГО N0:9) и обратного праймера: 5'-СТАСТТСС’АСТАСТТСТСС-3' (8Е0 ГО N0:10), оба из которых были синтезированы на основе нуклеотидной последовательности гена препроинсулина человека, определенного Ве11 Ο.Ι. и др. (№Гиге, 282:525-527, 1979) в следующих условиях: 94°С - 1 мин; 60°С - 1 мин; 72°С - 1 мин; 35 циклов. Продукт ПЦР, т.е. ДНК препроинсулина человека, был клонирован в вектор рОЕМ-Т (Рготеда).

В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-ТТТСТСААССААСАССТС-3' (8Е0 ГО N0:11) и обратный праймер: 5'-СТА6ТТ6СА6ТАОТТСТСС-3' (8Е0 ГО N0:10).

Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура отжига: 47°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.

(3) Получение ДНК-фрагмента для 68Ь0РК-В-цепь-К.

Затупленный по концам ДНК-фрагмент для С8Е0РК-В-цепь-К получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями: Полученный ДНК-фрагмент подвергали реакции фосфорилирования с использованием полинуклеотид-киназы Т4 (№рроп Оепе Со., ЬГб.) в соответствии с инструкциями производителя с получением фосфорилированного ДНК-фрагмента для С8Е0РК-В-цепь-К.

В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР проинсулина, полученный в (2) (10 нг).

В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-ССТТС’С’ТТСС’ААС’С’ТС’СТТГТСТ ОААССААСАССТО-3' (8Е0 ГО N0:12) и обратный праймер: 5'-6С6О6ТСТТ6О6Т6ТОТА-3' (8Е0 ГО N0:13).

(4) Получение ДНК-фрагмента для линкера.

Затупленный по концам ДНК-фрагмент для линкера получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями.

-7005586

В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-САСССАСАССАССТССАС-3' (ЙЕЦ ГО N0:14) и обратный праймер: 5'-СТССАСССАССССТССАС-3' (ЙЕС ГО N0:15).

Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура отжига: 55°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи; 72°С - 30 с; 25 циклов.

(5) Получение ДНК-фрагмента для СНРР-линкера.

Затупленный по концам ДНК-фрагмент для СНРР-линкера получали способом, упомянутым в (4), за следующими исключениями: Полученный ДНК-фрагмент подвергали реакции фосфорилирования с использованием полинуклеотид-киназы Т4 (Νίρροη Сепе Со., Ы6.) в соответствии с инструкциями производителя с получением фосфорилированного ДНК-фрагмента для СНКР-линкера.

В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР (ДНК-фрагмент для линкера), полученный в (4) (10 нг).

В качестве прямого праймера использовали праймер: 5'-ССТСАСССТССАСАСССАСАССАССТС САССТСССС-3' (ЙЕС ГО N0:16).

Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура отжига: 55°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.

(6) Получение ДНК-фрагмента для А-цепи.

Затупленный по концам ДНК-фрагмент для А-цепи получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями.

В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР для проинсулина, полученный в (2) (10 нг).

В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-СССАТТСТССААСААТССТСТ-3' (ЙЕЦ ГО N0:17) и обратный праймер: 5'-СТАСТТССАСТАСТТСТССАССТССТА-3' (ЙЕС ГО N0:18).

(7) Получение ДНК-фрагмента для РР-А-цепи.

Затупленный по концам ДНК-фрагмент для РР-А-цепи получали способом, упомянутым в (6), за следующими исключениями. Полученный ДНК-фрагмент подвергали реакции фосфорилирования с использованием полинуклеотид-киназы Т4 (№ρροη Сспс Со., Ы6.) в соответствии с инструкциями производителя с получением фосфорилированного ДНК-фрагмента для РР-А-цепи.

В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР (т.е. ДНК-фрагмент для А-цепи), полученный в (6) (10 нг).

В качестве прямого праймера использовали праймер: 5'-ССАССТСССАТТСТССААСААТССТСТ3' (8Ер ГО N0:19).

(8) Получение гибридной ДНК для МАР8ρ-МАРтρ9-СЙ^^РР-В-цепь-Р.

Затупленный по концам ДНК-фрагмент для МАР8ρ-МАРтρ9-СЙ^^РР-В-цепь-Р получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями.

В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР, полученный путем смешивания соответствующего количества ДНК-фрагмента для МАР^ц-МАРтцА полученного в (1), и ДНК-фрагмента для СЙЬрРР-В-цепь-Р, полученного в (3), и эту смесь подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Такага Йкпхо Со., Ы6.) при 16°С в течение 30 мин.

В качестве обратного праймера использовали праймер: 5'-СССССТСТТСССТСТСТА-3' (ЙЕЦ ГО N0:13).

Данный продукт ПЦР фосфорилировали с использованием полинуклеотид-киназы Т4 (№ρροη Сепе Со., Ы6.) в соответствии с инструкциями производителя. Этот фосфорилированный продукт ПЦР гидролизовали ферментом Ншс II с использованием набора для лигирования ДНК (Такага Йкпхо Со., Ы6.) и интегрировали в вектор (ЙТРАТАСЕ№, В1ие Йсг1|э( ЙК-). Штамм ЭН5а Е.соН трансформировали данным вектором известным методом (Мо1еси1аг С1ошпд 2п6. е6., А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со 16 Йρπηд НагЬог ЬаЬога1огу, 1989), а затем из указанного трансформанта выделяли вектор (т.е. плазмидную ДНК). Данную плазмидную ДНК секвенировали с использованием прямого праймера (прямой праймер М13) или обратного праймера (обратный праймер М13) для подтверждения присутствия гибридной ДНК для МАР^эМАРптУКСЙЕОРР-В-цепь-И. Второй цикл ПЦР проводили вышеупомянутым способом с использованием вектора, имеющего гибридную ДНК для МАР8ρ-МАРтρ9-СЙ^^РР-В-цепь-Р, интегрированную в нем в качестве ДНК-матрицы, прямого праймера: 5'-СТССТТААСАСТСТАТТССТ-3' (ЙЕЦ ГО N0:7) и обратного праймера: 5'-СССССТСТТСсСтСтСтА-3' (ЙЕЦ ГО N0:13), в результате чего получали затупленную по концам гибридную ДНК для МАР8ρ-МАРтρ9-СЙ^^РР-В-цепь-Р.

(9) Получение гибридной ДНК для белка МАР8ρ-МАРтρ9-СЙ^^РР-В-цепь-РСНРР-линкер.

-8005586

Затупленную по концам гибридную ДНК для белка М^Рзр-М^Ртр9-63ЕрРВ-В-цепь-ВОНВРлинкер получали способом, упомянутым в (8), за следующими исключениями.

В качестве ДНК-матрицы для первого цикла ПЦР использовали продукт, полученный путем смешивания соответствующего количества гибридной ДНК для М^Рзр-М^Ртр9-О3ЕрРВ-В-цепь-В, полученной в (8), и ДНК-фрагмента для гибрида ОНВР-линкер, полученного в (5), а затем полученную смесь подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Такага δΐιιιζο Со., Шб.) при 16°С в течение 30 мин.

В качестве обратного праймера использовали праймер: 5'-СТССАСССАССССТССАС-3' (ЗЕО ΙΌ N0:15).

(10) Получение вектора, содержащего гибридную ДНК для гибрида М\УРзр-М\УРтр9-С3ЕОРВ-Вцепь-ВОНВР-линкер-РВ-А-цепь, интегрированную в этом векторе.

Вектор, содержащий гибридную ДНК для белка М\УРзр-М\УРтр9-С3ЕОРВ-В-цепь-ВСНВРлинкер-РВ-А-цепь, интегрированную в этом векторе (ртРШЗ), получали способом, упомянутым в (8), за следующими исключениями.

В качестве ДНК-матрицы для первого цикла ПЦР использовали продукт, полученный путем смешивания соответствующего количества гибридной ДНК для белка М\УРзр-М\УРтр9-С3ЕОРВ-В-цепьВОНВР-линкер, полученного в (9), и ДНК-фрагмента для гибрида РВ-А-цепь, полученного в (7), а затем полученную смесь подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Такага 31и^о Со., Ыб.) при 16°С в течение 30 мин.

В качестве обратного праймера для первого цикла ПЦР использовали праймер: 5'СТА0ТТ6СА6ТА6ТТСТССА6СТ60ТА-3' (ЗЕО ΙΌ N0:18).

Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура отжига: 50°С - 1 мин; температура удлинения цепи ДНК: 72°С - 1 мин; 25 циклов.

Пример 2. Экспрессия и секреция гибридной ДНК.

(1) Нуклеотидная последовательность гибридной ДНК и аминокислотная последовательность гибридного белка, кодируемая данной гибридной ДНК.

Нуклеотидная последовательность гибридной ДНК, полученной в примере 1, и аминокислотная последовательность гибридного белка, кодируемая этой гибридной ДНК, показаны на фиг. 2.

(2) Экспрессия и секреция гибридной ДНК.

Осуществляли экспрессию гибридного белка, кодируемого данной гибридной ДНК, полученной в примере 1. Указанную гибридную ДНК интегрировали в экспрессирующий вектор, как показано на фиг. 3.

Более конкретно, вектор ртРШЗ. в котором была интегрирована гибридная ДНК, гидролизовали ферментами АраЬ I и Ншб III. Полученный гидролизованный продукт подвергали электрофорезу на 0,8% агарозном геле и часть геля, содержащую данную гибридную ДНК, вырезали. Соответствующее количество вырезанной гибридной ДНК и экспрессирующего вектора для ВасШиз ЬгеПз (рNυ211В2^5; 1Р-А-7170984), который были гидролизованы ферментами АраЬ I и Ншб III, смешивали, и полученную смесь подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Такага 31ιιιζο Со., Ыб.) при 16°С в течение 30 мин, в результате чего эта гибридная ДНК была интегрирована в экспрессирующий вектор. Таким образом, был получен экспрессирующий вектор рNυ-тРIN3, содержащий интегрированную в нем гибридную ДНК. Штамм 47-5 ВасШиз ЬгеОз (ТЕВМ ВР-1664) трансформировали данным экспрессирующим вектором известным методом (МеШобз ίη Еηζутο1., 217:23-33, 1993), а затем высевали на культуральную среду с агаром Т2 [полипептон (1%), мясной экстракт (0,5%), дрожжевой экстракт (0,2%), урацил (0,1 мг/мл), глюкоза (1%), эритромицин (10 мкг/мл), агар (1,5%); рН 7], и трансформанты собирали.

Трансформанты культивировали в культуральной среде Т2 (в среде, имеющей тот же самый состав, что и культуральная среда с агаром Т2 за исключением того, что агар был удален) при 37°С в течение 1 дня, и выделяли плазмидную ДНК известным методом (Мо1еси1аг С1ошпд 2пб.еб, А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬогаЮгу, 1989). Плазмидную ДНК обрабатывали ферментами АраЫ и НшбШ для подтверждения присутствия интегрирований в ней гибридной ДНК. Что касается трансформанта, который, как было подтверждено, содержал интергированную в нем гибридную ДНК, то в нем осуществляли экспрессию и секрецию гибридного белка, кодированного указанной интергрированной гибридной ДНК. Клеточную суспензию, которая была культивирована в культуральной среде Т2 в течение 1 дня при 37°С, добавляли к среде для культивирования [полипептон (3%), дрожжевой экстракт (0,4%), глюкоза (3%), Мд30₄-7Н₂0 (0,01%), Мп30₄-4Н₂О (0,001%), эритромицин (10 мкг/мл); рН 8] в отношении 1/1000 (по объему), а затем культивировали при встряхивании в течение 4 дней при 30°С.

После культивирования культуральную среду центрифугировали при 15000 об./мин в течение 2 мин с получением супернатанта культуры. Это супернатант культуры подвергали электрофоретическому анализу на белок известным методом (ЬаеттЛ, и.В., №Шге, 227:680-685, 1970). То есть к указанному супернатанту культуры (18 мкл) добавляли буфер 1 [125 ММ Трис-НС1 (рН 6,8), 20% глицерин, 4% ДСН, 10% 2-меркаптоэтанол] (2 мкл), и смешанный раствор кипятили в течение 5 мин. К полученному сме

-9005586 шанному раствору добавляли буфер 2 [250 мМ Трис-НС1 (рН 6,5), 50% глицерин, 0,5% ВРВ] (4 мкл). Полученный смешанный раствор подвергали электрофорезу в 15/25% полиакриламидном геле с ДСН (ΌΛΙ1СН1 РИКЕ СНЕМ1САЬ, Со Ыб.) (буфер для электрофореза: 100 мМ Трис, 100 мМ трицина, 0,1% ДСН). После электрофореза, гель подвергали окрашиванию кумасси для определения экспрессии и секреции гибридного белка. Как показано на фиг. 4, для культуральной среды клеток, трансформированных вектором р\и-шР1\5. содержащим гибридную ДНК, была детектирована полоса (отмечена стрелкой), соответствующая данному гибридному белку (дорожка 3); тогда как для культуральной среды клеток, содержащих вектор без указанной гибридной ДНК, такая полоса не была детектирована (дорожка 2).

Пример 3. Превращение в инсулин.

(1) Выделение и очистка гибридного белка, М\УР5р-М\УРтр9-С8ЕОРК-В-цепь-КСНКР-линкер-РКА-цепь.

Клетки, трансформированные ρΝΕ-ιηΡΙΝδ, культивировали при 37°С в течение 1 дня. Аликвоту (50 мкл) клеточной суспензии добавляли к культуральной среде [полипептон (3%), дрожжевой экстракт (0,4%), глюкоза (3%), Мд8О₄-7Н₂О (0,01%), Мп8О₄-4Н₂О (0,001%), эритромицин (10 мкг/мл); рН 8] (50 мл) . Смешанную культуральную среду отдельно загружали в шесть конических колб, емкостью 500 мл, а затем культивировали при встряхивании в течение 4 дней при 30°С. Культуральную среду центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант диализовали против буфера [20 мМ NаРО₄, 150 мМ, рН 8] при 4°С, а затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин. Этот супернатант наносили на Νί-хелатную колонку (Рйаттас1а; 5х10 см) для элюирования нужного гибридного белка буфером, в который был добавлен 60 мМ имидазол. К фракции элюции добавляли ЭДТА и бензамидин (1 мМ каждого) и выдерживали при 4°С. После этого, к данной фракции элюции дополнительно добавляли мочевину (в конечной концентрации: 1 М) и цистеин (в конечной концентрации: 1 мг/мл). Полученный смешанный раствор доводили до рН 10,8 с использованием 1 N №1ОН и перемешивали при той же температуре в течение 1 ч. Раствор диализовали против буфера [20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА; рН 8,0]. К диализату добавляли мочевину (в конечной концентрации: 1 М) и 2-пропанол (в конечной концентрации: 20%), а затем наносили на колонку с β-сефарозой ХЬ (Рйатташа; 1,6х10 см). Колонку в достаточной степени уравновешивали буфером [20 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, 1 М мочевина, 20% 2-пропанол; рН 8], а затем элюировали буфером, в который добавляли градиент 1М №С1. На фиг. 5 показан профиль элюции. Фракции элюции, элюированные 160-200 мМ №1С1 (показано стрелкой), объединяли и доводили до рН 3 путем добавления 1Ν НС1. Раствор концентрировали с использованием ультрафильтра (фракционированная молекулярная масса: 3000), а затем наносили на Уубас 214ТР54 (СУРКЕ88; колонка С4, 4,6х250 мм) для очистки с помощью ВЭЖХ. Колонку уравновешивали 25% ацетонитрилом и 0,1% раствором ТЕЕ, а затем элюировали в градиенте 33% ацетонитрила и 0,1% раствора ТЕЕ. На фиг. 6 показан профиль элюции. Фракции, проэлюированные 30-31% ацетонитрилом (показаны стрелкой), центрифугировали и концентрировали досуха. Полученный продукт использовали в следующем эксперименте по расщеплению.

(2) Превращение в инсулин и его очистка.

Полученный в (1) гибридный белок, М\УР5р-М\УРтр9-С8ЕОРК-В-цепь-КСНКР-линкер-РК-Ацепь, в виде сухого продукта, растворяли в соответствующем количестве 0,1% ТЕА, а затем добавляли 0,1М трис-буфер (рН 8) до конечной концентрации 20 нмоль/мл.

Полученный раствор охлаждали до 4°С, а затем добавляли раствор тромбина (250 мкмоль/мл) в отношении субстрат: фермент 25:1 (молярное отношение). Через 9 ч к реакционному раствору добавляли соответствующее количество 10% ТЕА для доведения до рН 2, а затем реакцию прекращали. Используемым тромбином был тромбин сорта 1Р (1ТОНАМ ЕООЭ8 ШС.), который был повторно очищен с использованием набора Масго Ргер СМ (ВюВаб) и лизина-сефарозы 4В (Рйаттааа).

Для выделения, с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, инсулина-Агд, который имел остаток Агд в С-конце В-цепи, расщепленной тромбином, раствор, в котором была прекращена реакция, наносили, после обработки тромбином, на колонку М1дй1у811 КР4 (С1са-МЕКСК; 20х250 мм), колонку уравновешивали 25% ацетонитрилом и 0,1% раствором ТЕА, а затем элюировали в градиенте 35% ацетонитрила и 0,1% раствора ТЕА. Фракции, проэлюированные 30-31% ацетонитрилом, центрифугировали и концентрировали досуха. Полученный продукт использовали в следующем эксперименте по расщеплению.

Сухой продукт инсулин-Агд растворяли в соответствующем количестве 0,1% ТЕА, а затем добавляли 0,1М трис-буфер (рН 8) до конечной концентрации 1 мг/мл. В полученный раствор добавляли раствор карбоксипептидазы В (81дта; 47 мг/мл) в отношении субстрат:фермент 500:1 (молярное отношение) и реакционный раствор оставляли для реакции на 12 ч при 25°С. Затем к реакционному раствору добавляли соответствующее количество 10% ТЕА для доведения рН до 2, после чего реакцию завершали. Для выделения инсулина из раствора, в котором была прекращена реакция, проводили обращенно-фазовую ВЭЖХ способом, упомянутым выше в связи с выделением инсулина-Агд.

(3) Аминокислотный анализ инсулина.

Сначала анализировали весь аминокислотный состав инсулина. К инсулину, полученному в (2) (около 2 нмоль), добавляли 6Ν НС1 (200 мкл) и 5% фенол (20 мкл). Полученный реакционный раствор подвергали деаэрации и пробирку, содержащую указанный реакционный раствор, герметично закрывали.

-10005586

Реакционный раствор оставляли на 24 ч при 110°С для реакции гидролиза, а затем сушили. Полученный сухой продукт растворяли в 0,01Ν НС1 (100 мкл) и фильтровали на 0,2 мкм-фильтре. Аликвоту (50 мкл) указанного фильтрата анализировали с использованием анализатора аминокислот НйасЫ Мобе1 Ь-8500 (Н1ТАСН1, Ыб.).

Затем проводили анализ на присутствие цистеиновой кислоты в инсулине. Инсулин, полученный в (2) (около 2 нмоль), растворяли в смешанном растворе муравьиной кислоты/метанола (5:1) (40 мкл), а затем охлаждали до -20°С. К охлажденному раствору добавляли смешанный раствор 99% муравьиной кислоты/30% водного пероксида водорода (19:1) (400 мкл), охлажденный до -20°С, а затем оставляли для реакции на 4 ч при -20°С. После завершения реакции, к реакционному раствору добавляли дистиллированную воду (3 мл) и лиофилизовали. Полученный сухой продукт гидролизовали способом, упомянутым выше, а затем анализировали.

Проводили сравнение аналитических значений для Уа1, определенных в анализе всего состава аминокислот и в анализе на цистеиновую кислоту, и аналитическое значение для цистеиновой кислоты преобразовывали в аналитическое значение для цистеина в анализе для всего состава аминокислот. Как показано в таблице, аминокислотное соотношение инсулина настоящего изобретения почти совпадает с аминокислотным соотношением природного инсулина.

Амино-кислота	Анализ ΙΝ8	Вычисление значение для ΙΝ8
Аналитическое значение нмоль	моль %	Число остатков	Остаток нмоль	Число остатков	моль %
Сук-803Н	5,697	12,63%	6,41	0,950
Акр	2,726	6,12%	3,11	0,921	3	5,88%
ТЪг	2,696	5,97%	3,03	0,899	3	5,88%
8ег	2,437	5,40%	2,74	0,812	3	5,88%
О1и	6,271	13,90%	7,05	0,895	7	13,73%
Рго	0,985	2,18%	1,11	0,985	1	1,96%
О1у	3,392	7,52%	3,81	0,848	4	7,84%
А1а	1,000	2,22%	1,12	1,000	1	1,96%
Сук1/2					6	11,76%
Уа1*	3,205	7,10%	3,60	0,801	4	7,84%
Ме!
Не	1,409	3,12%	1,58	0,705	2	3,92%
Ьеи	5,462	12,10%	6,14	0,910	6	11,76%
Туг	3,507	7,77%	3,94	0,877	4	7,84%
РЪе	2,640	5,85%	2,97	0,880	3	5,88%
Бук	0,913	2,02%	1,03	0,913	1	1,96%
Н15	1,822	4,04%	2,05	0,911	2	3,92%
Тгр
Агд	0,924	2,05%	1,04	0,924	1	1,96%
	45,122	100,00%	50,73	0,889	51	100,00%

(4) Пептидное картирование инсулина.

Инсулин, полученный в (2) (называемый далее инсулином 1ТОНАМ) и коммерчески доступный инсулин, Νονοίίη 40 (Νονο Νογ6ι81< РЪагта) (называемый далее 'Новолином) (5 нмоль каждого) отдельно растворяли в 0,1М бикарбонате аммония (50 мкл) и в 2 мМ растворе ЭДТА (рН 7,8; 50 мкл). К полученному раствору добавляли водный раствор протеазы У8 (\ν;·ι1<ο Риге Сйетюа1 1пбий1ек, Иб.; 2 мкг/мл) (1,35 мкл). Реакционный раствор оставляли на 24 ч при 25°С для прохождения реакции, а затем добавляли 1% раствор ТЕА для доведения до рН 2, после чего реакцию завершали. Раствор, в котором была завершена реакция, наносили на колонку с Уубас 214ТР54 (колонка С18, 4,6х250 мм), уравновешенную 5% ацетонитрилом и 0,1% раствором ТЕА, а затем элюировали в градиенте 33% ацетонитрила и 0,1% раствора ТЕЕ. На фиг. 7 показан профиль элюции. Инсулин 1ТОНАМ и Новолин обнаруживали аналогичные профили элюции. Следовательно, можно сделать вывод, что оба вида инсулина имеют аналогичные формы образования дисульфидных мостиков.

Пример 4. Биологическая активность инсулина.

Новолин (1,2 мл) обрабатывали способом, описанным в примере 3 (2) с использованием препарата ^атосй-П 5С18 АН Ргер (\ν;·ι1<ο Риге Сйетюа1 1пбик!пек, Ь!б.; 20x250 мм) и получали инсулиновые фракции. Фракции инсулина 1ТОНАМ, полученного как описано в примере 3(2), и фракции инсулина Новолин анализировали с использованием силикагеля (Уубас 214ТР54; колонка С18, 4,6х250 мм). Для каждого образца инсулина из каждой фракции брали аликвоту, такую, чтобы содержание инсулина обоих видов, вычисленное по площади главного пика, было одинаковым, а затем сушили. Как показано на фиг. 8, профиль элюции Новолина имел субпики, которые предположительно указывали на присутствие поли

-11005586 мерных материалов. Уровень субпиков (то есть, полная площадь субпика) Новолина в 1,23 раза превышал уровень субпиков инсулина ΙΤΟΗΑΜ.

Полученные таким образом инсулин ΙΤΟΗΑΜ и инсулин Новолин отдельно растворяли в растворе, содержащем 0,1% Β8Α, 0,9% ЫаС1 и 0,1% раствора фенола при конечной концентрации 1 ед./мл (вычисленной, исходя из предположения, что содержание каждого инсулина составляло 26 ед./мг). Полученный раствор (0,5 мл) подкожно инъецировали в спину кроликам /арапезе Шь1ег (КЬз:Ж, 2,0-2,5 кг). После инъекции из передней ушной вены кроликов брали кровь через определенные промежутки времени. К каждой пробе крови (0,45 мл) добавляли смесь ингибирующих гликолиз агентов (ЫаР: 12,5 мг/мл, гепарин-Ыа: 125 ед./мл, ЕПТА-2Ыа: 48 мг/мл) (0,05 мл) и полностью смешивали. Смешанный раствор центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин при 5°С и супернатант использовали в качестве пробы плазмы. Для каждой пробы плазмы, содержание глюкозы в плазме определяли с использованием биохимического автоматического анализатора (С1ВА-СОРЫ1ЫС; Ехргезз РЬи8), а содержание инсулина в плазме определяли с использованием набора ΕΙΑ (Шако Риге СЕет1еа1 1пби811е8, Б1б.). Зависимость содержания глюкозы в плазме от времени и зависимость содержания инсулина в плазме от времени показаны на фиг. 9 и 10, соответственно. После инъекции как инсулина ΙΤΟΗΑΜ, так и инсулина Новолин наблюдалось снижение содержания глюкозы в плазме, что свидетельствовало о том, что оба вида инсулина способствуют снижению содержания сахара в крови. Что касается содержания инсулина в плазме, то оба вида инсулина показывали аналогичные временные зависимости. При введении инсулина Новолина наблюдался слегка более низкое содержание глюкозы в плазме и слегка более высокое содержание инсулина в плазме, чем при введении инсулина ΙΤΟΗΑΜ, что, вероятно, было обусловлено увеличением субпиков Новолина, что подтверждено вышеуказанным ВЭЖХ-анализом.

Как было упомянуто выше, в соответствии с настоящим изобретением, новый гибридный белок, превращаемый в инсулин, может быть экспрессирован и секретирован в большом количестве в экспрессирующей системе ВаеШиз. Путем обработки гибридного белка настоящего изобретения тромбином и карбоксипептидазой В может быть получен инсулин, имеющий тот же аминокислотный состав и ту же биологическую активность, что и природный инсулин.

Список последовательностей <110> ΙΤΟΗΑΜ ΡΟΟϋδ 1ИС.

<120> Способы продуцирования рекомбинантного инсулина ив новых гибридных белков <130> РН-776-РСТ <140> РСТ/1Р00/02736 <141> 2000-04-26 <150> ΊΡ 1999-124877 <151> 1999-04-30 <160> 21 <170> Ρβΐβηίΐη Уег.2 <210> 1 <211> 6 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> указанная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность, расцепляемую тромбином <400> 1

С1у Зег Ьеи С1п Рго Аге

5 <210> 2 <211> 5 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> указанная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность, юасошпляемую тромбином <400> 2

Аге С1у Н18 Аге Рго

5 <210> 3 <211> 31 <212> РКТ <213> Ново 8ар1еп8

-12005586

5 <210> 3 <211> 31 <212> РНТ <213> Ново зархепз <400> 3

61и А1а С1и Азр Ьеи С1п Уа1 С1у 1 5

С1у А1а С1у Зег Ьеи С1п Рго Ьеи 20 <210> 4 <211> 9 <212> РКТ <213> ВасШиз Βτβνϊβ <300>

<303> ВасХег1о1.

<304> 169 <306> 1239-1245 <307> 1989 <400> 4

А1а С1и С1и А1а А1а ТЬг ТЬг ТЬг 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> РКТ <213> ВасШиз ΒΓβνΐβ <300>

<303> 1. Васгег1о1.

<304> 170 <306> 176-186 <307> 1988 <400> 5

А1а Рго Ьуз Азр С1у 11е Туг 11е 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> РКТ <213> ВасШиз Ьгехгз <300>

<303> I. Вас(ег1о1.

С1п Уа1 61и Ьеи С1у С1у С1у Рго

15

А1а Ьеи С1и 61у Зег Ьеи 61п

30

А1а

С1у

-13005586 <304> 172 <306> 1312-1320 <307> 1990 <400> 6

А1а С1и Авр ТЬг ТЬг ТЬг А1а Рго Ьуз

5

<210>	7
<211>	20
<212> ДНК
<213>	ВасШиэ Βτβνΐδ
<300>
<301>	Н. Уааава1а е1 а
<303>	I. Вас1ег1о1.
<304>	169
<306>	1239-1245
<ЗО7>	1987
<400>	7
егсеиааса вхвхагцсх
<210>	8
<211>	18
<212>	ДНК
<213>	ВасШиз Ьгеу1з
<300>
<301>	А. ТзиЬо! ех а1.
<303>	Вас1ег1о1.
<304>	170
<306>	935-945
<307>	1988
<400>	8
авс1к1ав!а вхгас1<с
<210>	9
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Ножо зар1еп8
<300>
<301>	С. 1. Ве11 ех а1.
<303>	Природа
<304>	282
<306>	525-527
<307>	1979
<400>	9

-14005586 агввсссхкг екагесвсс 19 <210> 10 <211> 19 <212> ДНК <213> Ново зардела <300>

<301> С. 1. Ве11 ег а1.

<303> Природа <304> 282 <306> 525-527 <307> 1979 <400> 10 ссазивсав гавчсюс 19 <210> 11 <211> 18 <212> ДНК <213> Ново зархепз <400> 11

И1Е1£аасс аасассгя 18 <210> 12 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Указанная последовательность представляет собой прямой праймер для ПЦР-амплификации ДНК-фрагмента, кодирующего ВЗЬОРВ-В-цепь-К

<400> 12 ЕЕИссИес аассЩШ	(Е^ваассаа сасс1в 36
<210> 13 <211> 18 <212> ДНК <213> Ново заргепз
<400> 13 ЕСЕ8С1С11Е ΕΕΐΕΧβίβ	14
<210> 14 <211> 18 <212> ДНК <213> Ново заргепз

-15005586 <400> 15 сЬвсаеввас ссскссае 18 <210> 16 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220> _ _ <223>^{Укааанная} последовательность представляет собой прямой праймер для ПЦР-амплификации ДНК-фрагмента, кодирующего 6ННР-линкер <400> 16 вв1сассв1с савакесава ввассхвсав κΐκββκ 36

<210>	17
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Ново	&βρίепз
<400>	17
евсаивхее	аасаа1<с1е 1
<210>	18
<211>	27
<212>	ДНК
<213>	Ново	ββρϊβηβ
<400>	18
сгавггвсав	хавгхсХсса 8с1й8(а

<210> 19 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223 > Указанная последовательность представляет собой праймер для ПЦР-амплификации кодирующего КР-А-цепь <400> 19 ссас81£8са пвхквааса агвсхв* 27 <210> 20 <211> 372 <212> ДНК <213> искусственная последовательность

-16005586 <220>

<223> Укаввная последоаательностьпредстажпяет собой нуклеотидную последовательностьДНК, кодирующей МУРар-И»Рар9-С8Б0РК-В -цепь-КСНКР -линхер-РК-А-цепь * <400> 20

вгсаггааса	вгвииеес	1ав1всас1с	8сас11ас1{	и<стссаа1	евсШсеса	60
зсакааваав	са<саас1ас	1аса8с1888	1СССХ8С88С	сасвИНе*	ваассаасас	120
С1вТ8СК8С1	сасасс1«в:	8ваавс1с1с	гассгав^в!	всввввааав	аввсисис	180
(асасассса	авасссвсав	гсассегсса	ааввсааава	ассгвсакег	888вса881в	240
яавсгвмсв	8888ССС188	1всав8са8С	С18СВ8ССС1	гввсссгвва	8888гссс18	300
саассасв^в	всапсвва	асааХвсгвс	ассавсагсг	всгсссюга	ссааскаав	360
аасСас<еса	ас					372

<210> 21 <211> 124 <212> РЙТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> Укаваная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность ηη 4^ΙΡ·ρ-“^,ρ·ρθ-⁽ϊ^δΕ5^ρ!’-^Β-4·^ΙΠ·“^κεΗ»Ρ

-линхер-РН-А-цель

<400> 21

Беи А1а Зег А1а

Бои А1а Беи ТЬг 10

Уа1

А1а 15

Рго

Уа1 Уа1 1

Азп

Зег

Уа1 5

Ме1

А1а

РЬе

А1а

С1и

А1а

ТЬт

ТЬг

А1а

61у

Зег

Беи

20

25

30

С1п

Рго

Ага

РЬе

Уа1

Азп

С1п

Ηίβ

Беи

Суз

С1у

Зег

Н18

Беи

Уа1

С1и

35

40

45

А1а

Беи

Туг

Беи

Уа1

Суз

С1у

С1и

Агв

С1у

РЬе

Туг

ТЬг

Рго

Буз

50

55

60

ТЬг

Ага

С1у

Ηίβ

Ага

Рго

61и

А1а

61и

Азр

Беи

С1п

Уа1

С1у

61п

Уа1

65

70

75

80

С1и

Беи

С1у

Рго

61у

А1а

С1у

Зег

Беи

С1п

Рго

Беи

А1а

Беи

85

90

95

С1и

С1у

5ег

Беи

С1п

Рго

Ага

С1 у

Не

Уа1

С1и

С1п

Суз

ТЬг

Зег

100

105

110

Не Суз Зег Ьеи Туг (χΐη Ьеи С1и Азп Туг Суз Азп

120

115

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Гибридный белок проинсулина формулы (I) [¥]-[Х1]-[В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь] (I) где Υ представляет собой лидерную пептидную последовательность для экспрессии и секреции белка, содержащую 9 Ν-концевых аминокислотных остатков белка МАР. который представляет собой один из белков клеточной стенки (САР) бактерии. принадлежащей к роду ВаеШиз;

Х1 представляет собой аминокислотную последовательность. расщепляемую тромбином;

В-цепь представляет собой аминокислотную последовательность В-цепи инсулина;

Х2 представляет собой аминокислотную последовательность. расщепляемую тромбином;

линкер представляет собой линкерную последовательность. содержащую по меньшей мере один аминокислотный остаток;

Х3 представляет собой аминокислотную последовательность. расщепляемую тромбином;

А-цепь представляет собой аминокислотную последовательность А-цепи инсулина. и где Υ. Х1. В-цепь, Х2. линкер. Х3 и А-цепь соединены в порядке. указанном в формуле (I). и где ДНК сигнального пептида САР присоединена к 5'-концу указанной ДНК.
2. Белок по п.1. где аминокислотная последовательность Х1 представляет собой О1у8егРеиСИпРгоАгд (8РО ГО N0:1). аминокислотная последовательность Х2 представляет собой АгдО1уИ1§АгдРго (8РО ГО N0:2). а аминокислотная последовательность Х3 представляет собой РгоАгд.
3. Белок по п.1 или 2. где указанная линкерная последовательность имеет следующую аминокислотную последовательность:

О1иА1аО1иА§рЕеиО1пУаЮ1уО1пУ аЮ1иЕеиО1уО1уО1уРгоО1уА1аО1у8егЕеиО1пРгоЕеиА1аЕеиО1иО1у8егЕеиО1п (8РО ГО N0:3).
4. Белок по любому из пп.1-3. имеющий аминокислотную последовательность. приведенную в 8РО ГО N0:21.

-17005586
5. ДНК, кодирующая белок по любому из пп.1-4.
6. ДНК по п.5, содержащая на 5'-конце промоторную область, необходимую для экспрессии рекомбинантного белка.
7. ДНК по п.6, где промоторная область происходит из бактерии, принадлежащей к роду ВасШик.
8. ДНК по п.7, где промоторная область происходит от гена С\УР.
9. Вектор, содержащий ДНК по любому из пп.5-8.
10. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.9.
11. Клетка-хозяин по п.10, представляющая собой бактерию, принадлежащую к роду ВасШик.
12. Клетка-хозяин по п.11, где указанная бактерия представляет собой ВасШик Ьгеу1к.
13. Способ продуцирования инсулина, где указанный способ предусматривает культивирование указанной клетки-хозяина по любому из пп.10-12 в культуральной среде для экспрессии белка по любому из пп.1-4 в указанной клетке-хозяине;

сбор указанного белка и обработку указанного белка путем ферментативного расщепления с выделением инсулина.
14. Способ по п.13, где указанный экспрессированный гибридный белок выделяют и очищают из указанной клетки-хозяина или из указанной культуральной среды.
15. Способ по п.13 или 14, где указанное ферментативное расщепление осуществляют тромбином и карбоксипептидазой В.